EP1604206A2 - Methode de detection et d`analyse d`organelles immobilises sur biopuce et leurs applications - Google Patents

Methode de detection et d`analyse d`organelles immobilises sur biopuce et leurs applications

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Publication number
EP1604206A2
EP1604206A2 EP04720039A EP04720039A EP1604206A2 EP 1604206 A2 EP1604206 A2 EP 1604206A2 EP 04720039 A EP04720039 A EP 04720039A EP 04720039 A EP04720039 A EP 04720039A EP 1604206 A2 EP1604206 A2 EP 1604206A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biochip
organelles
organelle
sample
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04720039A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christian Leveque
Raymond Miquelis
Michael Seagar
Géraldine FERRACCI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite de la Mediterranee Aix Marseille II filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1604206A2 publication Critical patent/EP1604206A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and analyzing organelles, in particular synaptic vesicles, immobilized on biochips.
  • the invention also relates to a method for detecting a bond between an analyte and a membrane constituent of an organelle.
  • the applications of the present invention relate in particular to the detection of neurotoxins, such as botulinum toxins or tetanus toxin, the functional characterization of organelles, the detection of tumor markers or the screening of new molecules interacting with specific membrane constituents of organelles .
  • the present invention relates in particular to the fields of medical diagnosis, pharmacology and toxicology.
  • the eukaryotic cell contains different structures delimited by a membrane forming intracellular compartments, called organelles.
  • organelles can either remain localized in the cells or, for physiological or physiopathological reasons, be secreted or released in the extracellular media.
  • organelles that may be mentioned include mitochondria, chloroplasts, vesicles or secretory granules, lysosornes, peroxisomes, exosomes, dexosomes, or synaptic vesicles.
  • organelles strongly depend on their function in the cell, but also on the cell types in which they are found and on the physiological state of the cell.
  • the assay or analysis of the structural and functional characteristics of specific organelles obtained from cells in culture or from cells taken from a biological organism is a means of obtaining information on these cells and in some cases identify physiological or pathological states of these cells.
  • synaptic vesicle An example of organelle whose structural characteristics are dependent or cell type analyzed and the physiological state of the cell is the synaptic vesicle.
  • Synaptic vesicles are organelles found in large quantities in the nerve endings of neurons.
  • Related vesicles known as SLivlV (synaptic like microvesicle), are found in lesser amounts in endocrine and neuroendocrine tissues and in certain types of tumors.
  • these synaptic vesicles carry neuromediators and can be considered as real functional units of communication. They are around 50 nm in size and have between 20 and 40 proteins on their surface, some of which are specific to these organelles (Femandez-Chacon and Sudhôf, 1999).
  • synaptophysin constitute markers of choice for identifying differentiated neurons within a tissue, and are studied in fields as varied as neuronal degeneration / regeneration, synaptic plasticity or oncology. Some of these proteins are also the targets of neurotoxins, and in particular botulinum and tetanus toxins.
  • the present invention provides a method for purifying, detecting and analyzing on a biochip, in a single step, organelles such as synaptic vesicles extracted from neuronal cells.
  • Biochips are tools that allow chemical or biochemical analysis of molecules previously immobilized.
  • the immobilization method chosen must be appropriate to allow the maintenance of the conformation of the proteins immobilized on the biochip and their stability.
  • various detection methods are known using sensors of the spectrometer, photometer, fluorimeter or luminometer type detecting molecular interactions revealed by enzymatic reaction or fluorescent labeling of a potential ligand, pharmacological, natural or synthetic.
  • a method coupling a biochip to a biosensor capable of detecting a fluorescent signal will be cited, the method developed by the company Zyomix (Hayward CA) (Nat. Biotechnol., 2002, 20: 225-229).
  • optical detection methods capable of detecting variations in mass or molecular conformation of an analyte immobilizing on a biochip are known and include piezoelectric, optical, thermo-optical, surface acoustic wave (surface acoustic wave) methods. SAW), as well as electrochemical methods (voltametric, conductometric, potentiometric, amperometric, ).
  • optical detection methods we can retain, without being exhaustive, those which detect variations in mass or molecular conformation on the surface of biochips such as optical reflection methods such as ellipsometry or spectroscopy of evanescent waves.
  • optical reflection methods such as ellipsometry or spectroscopy of evanescent waves.
  • the latter method includes methods based on surface plasmon resonance, also called SPR methods.
  • Evanescent wave spectroscopy methods have given rise to several types of biosensors on the market, including those based on the use of surface plasmon resonance and produced by different companies including
  • BIACORE AB such as Biacore X, Biacore 3000
  • Texas Instruments such as the Spreeta biosensor
  • Quantec DP and those based on frustrated angle reflection (FTR) and produced by IASYS.
  • optical detection or “detection of variation of optical signal” means any method allowing the detection of an optical signal, including variation of chemiluminescence, of fluorescence , or even the detection of a variation in mass or molecular conformation by optical reflection, for example by surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • biochip any solid surface suitable for coupling with a biochemical molecule, and in particular a DNA molecule or a polypeptide, said solid surface coupled to a biological molecule, being suitable for its use in a method optical detection method, said optical detection method aimed in particular at detecting an interaction between the molecule coupled to a biochip and an analyte.
  • biochip for biosensors by optical reflection is meant a biochip usable in a device for detecting mass variation or molecular conformation by optical reflection.
  • biochips usable in an optical detection method in particular by optical reflection, essentially concerned the analysis of simple molecules such as ADi, proteins, even lipids or lipid structures such as liposomes.
  • organelles and in particular the synaptic vesicles, are particularly robust structures, remaining intact for long periods (several weeks), even after having undergone various physicochemical treatments (freezing, sonication, lyophilization ) and biochemical. This stability is also observed for the vast majority of their membrane constituents. It follows from these observations that it may in particular be envisaged to carry out an assay of the synaptic vesicles and their constituents from normal or pathological tissues, using an optical detection method.
  • the invention provides in particular a method of preparing organelles which can be used as an enzyme substrate, capable of being incubated over a long period, more than 2 hours, or even more than 24 hours and up to at least 30 hours. incubation.
  • the invention further provides a method for storing organelle for long-term use.
  • the protein constituents of organelles when analyzed directly on the intact organ, have the advantage of retaining their native structure within the biological membrane, while being analyzable on a biochip, according to the methods of the invention.
  • the invention also results from the observation that it is possible to immobilize organelles in a stable and specific manner on biochips for biosensors by optical reflection and to obtain an extremely sensitive quantification of these immobilized organelles, using a method of detecting mass variation or molecular conformation by optical reflection.
  • organelle means in the following text, unless otherwise specified, an intracellular structure of a eukaryotic cell, delimited by a membrane.
  • Organelles are generally prepared by lysis of cells containing them.
  • these are unpurified organelles.
  • intact organelle is meant an organelle whose structure has not been altered by the preparation process. In particular, the membrane protein content was not changed.
  • these are organelles of a size less than 360 nm.
  • the organelles can be in the native form or, where appropriate, reconstituted.
  • the term “reconstituted organelle” means any proteolipid structure containing any one or more of the specific constituents of these organelles, and in particular a membrane protein of an organelle.
  • the reconstituted organelles are prepared by physicochemical methods, including biochemical methods, or from cells expressing them, naturally or not, originating from sonication. of a cell expressing on its surface a recombinant protein of a native organelle, in particular a membrane protein of a native organelle.
  • device for detecting variation in mass or molecular conformation by optical reflection is meant within the meaning of the invention any device making it possible to detect variations in mass or molecular conformation at the surface of a biochip appropriate, based on optical reflection methods, internal or external, and in particular ellipsometry or spectroscopy of evanescent waves.
  • a first aspect of the invention therefore relates to a method of identifying or assaying organelles in a liquid sample, said method being characterized in that it comprises: a) coupling, to the surface of a biochip usable in an optical detection device, for example of detection of variation in mass or of molecular conformation by optical reflection, of a ligand capable of specifically binding to a membrane constituent of the organelles to be identified or to be measured, b) bringing into contact of the liquid sample with the surface of the biochip containing the coupled ligand, for example by injecting the sample into a device allowing this contacting, c) detecting a variation of an optical signal, and in particular a variation in mass or molecular conformation at the surface of the biochip by optical reflection, said detection allowing the identification and / or the determination of the organelles bound to the surface d e the biochip.
  • the term “identification” means that the method at least makes it possible to determine whether the sample contains the organelles sought or not.
  • assay means that the method at least makes it possible to determine whether the sample contains more or less organelles than a control sample, hereinafter indicated by the term “relative quantity organelles ”or“ relative organelle rate ”, and where appropriate, to determine the mass of organelles immobilized on the biochip and its concentration in a sample.
  • the first step of the method consists in preparing a biochip allowing the fixation of the organelles to be detected or measured.
  • the biochip chosen will naturally be adapted to the optical detection device chosen.
  • it will be a biochip adapted to a device chosen to detect a variation in mass or molecular conformation by optical reflection.
  • the detection of mass variation or molecular conformation by optical reflection is based on spectroscopy of evanescent waves, in particular on surface plasmon resonance.
  • the biochip preferably comprises a solid metallic support, for example gold or silver.
  • a solid metallic support for example gold or silver.
  • biochips for optical biosensors by surface plasmon resonance are described in patents EP044922, US 5,242,828 and US 5,436,161. Such biochips are marketed by BIACORE AB.
  • the ligand can be any type of molecule, and in particular a polypeptide, a polysaccharide, a polynucleotide or a lipid, or a natural or synthetic physiological or pharmacological ligand.
  • the ligand is an antibody or antibody fragment directed against an antigen expressed on the surface of the organelle to be identified.
  • Step (a) of the method involves coupling the chosen ligand to the biochip.
  • the term “coupling” means within the meaning of the invention any method aiming to allow a physical association between the ligand and the solid support constituted by the biochip. It is preferable, however, that the interaction be sufficiently stable so that the ligand does not dissociate during the implementation of the method. Preferably, the interaction is stable enough to allow repeated use of the biochip without loss of detection sensitivity.
  • the coupling can be direct or indirect.
  • direct coupling is meant a covalent bond between the ligand and the biochip support.
  • a first ligand is covalently linked to the chip, a second ligand reversibly to this first ligand.
  • the second ligand can be preincubated with the preparation containing the organelles before they are brought into contact with the first ligand.
  • the first ligand, covalently attached to the biochip is an anti-Fc or anti-IgG mouse antibody which specifically binds to a second antibody capable of recognizing the organelle to be identified in the sample.
  • the first ligand is advantageously not very sensitive to pH shock, so as to regenerate the biochip after use by acid shock while allowing successive and reproducible immobilizations of the second ligand.
  • An example of anti-Fc antibody not very sensitive to pH shock is sold in particular by the company BIACORE AB under the name of anti-mouse Fc ⁇ Ref. BR-1000-50.
  • the indirect coupling will be sufficiently stable so as to perform organelle binding measurements over a 24 hour period.
  • ligands capable of being coupled to the biochip the antibodies or fragments of antibodies specifically recognizing the antigens expressed on the surface of these organelles.
  • a non-exhaustive list of antibodies recognizing antigens of synaptic vesicles includes for example the anti: -VAMP, -synaptophysin, - synaptotagmine, -SV2, the vesicular transporter of glutamate.
  • anti-synaptophysin or anti-VAMP antibodies or one of their functional fragments will be used. These antibodies have already been described in the state of the art.
  • the biochip could also be regenerated, after use, by means of a concentrated detergent solution, for example octylglucoside.
  • a concentrated detergent solution for example octylglucoside.
  • octylglucoside is used in a 100 mM solution. This allows in particular to completely regenerate the synaptophysin / anti-synaptophysin interaction while solubilizing the membrane of the organelles. At least 40 regeneration / immobilization cycles are then possible on the same antibody coupled to the biochip, preferably from 10 to 100 regeneration / immobilization cycles.
  • the alternative use of regeneration procedures by variation of pH and by octylglucoside allows a theoretical capacity of several hundred analyzes.
  • the biochip contains a biocompatible porous matrix, for example a hydrogel (formed of polysaccharide such as dextran).
  • a hydrogel formed of polysaccharide such as dextran.
  • Such a hydrogel may suitably contain hydroxyl, carboxyl, amino, aldehyde, carbonyl, epoxy, or vinyl groups for covalent attachment of the ligand.
  • Step (b) therefore consists in bringing the liquid sample into contact with the surface of the biochip containing the coupled ligand, for example by injecting the liquid sample to be analyzed into a device allowing this contacting.
  • a preferred example of a device is a device allowing the flow of a flow of the liquid sample to the surface of the biochip, for example by means of microfluidic circuits. Such devices are described in particular in US patent 5,313,264.
  • Organelles likely to be present in the sample specifically bind to ligands coupled to the biochip.
  • the quantity of immobilized organelles is thus determined according to the method of the invention by detection of variation in mass or of molecular conformation by optical reflection, naturally using the appropriate controls to deduce from the detected interaction, the non-specific interactions (noise background).
  • the liquid sample can be any type of sample prepared either from cells capable of containing organelles, or from a biological medium in which they have been released, or by any process consisting in generating proteolipid structures containing proteins synaptic vesicles, in particular proteins of the membrane of synaptic vesicles, for example by induction of expression of a protein of the membrane of synaptic vesicles in non-neuroendocrine cells.
  • the preparation generally consists of a lysis of the cells so as to obtain a release of the organelles.
  • the organelles released into the solution are not purified after lysis of the cells.
  • the solution containing the organelles for the implementation of the methods of the invention is a very dilute solution, in particular in comparison with the organelle solutions conventionally prepared in the prior art.
  • the solution containing the organelles comprises between 1 ng and 1 ⁇ g of total proteins, preferably between 10 ng and 200 ng of total proteins, for example between 30 ng and 80 ng.
  • it may be a sample prepared from cells of a biological organism, and in particular a sample of tissues or biological fluids such as blood, cerebrospinal fluid, urine or saliva.
  • the sample can be taken from an animal (in particular a mammal and preferably a man) or a plant.
  • the sample can in particular be carried out on a healthy individual or a patient suffering from a pathology.
  • the pathology can in particular be cancer, a neurodegenerative pathology, an infectious pathology and in particular a viral, bacterial or parasitic pathology.
  • the ligand coupled to the biochip is chosen so as to be specific for the membrane of the organelles to be detected. in particular to avoid interactions, for example, with constituents of the plasma membrane of cells.
  • the liquid sample can also be prepared from a cell culture.
  • the analyzed sample can be prepared for storage, for example, by freezing or freeze-drying.
  • the organelles contained in the sample are vesicles of exocytosis.
  • exocytosis vesicles means any organelle containing constituents intended to be secreted outside the cell, or comprising membrane constituents intended to be incorporated into the plasma membrane.
  • organelles include in particular synaptic vesicles, secretory granules (or vesicles with dense hearts) or even SLMVs.
  • the liquid sample is prepared from neural tissues for the identification and / or determination of synaptic vesicles.
  • a calibration line can be established to correlate the concentration of one of the components of the synaptic vesicle membrane (or the concentration of synaptic vesicles) with the signal measured on the biosensor.
  • synaptic vesicles The proteins in the membrane of synaptic vesicles are well-studied synaptic markers. In certain neurodegenerative diseases of the Alzheimer type (Terry et al., 1991; Sze et al., 2000), amyotrophic lateral sclerosis (Ikemoto, Acta neuro, 2002), degeneration begins with the presynaptic compartment where the vast majority are located. synaptic vesicles. In Alzheimer's disease, a good correlation has been observed between the loss of functions cognitive and decreased synaptophysin (Mucke et al., 2000, US2002040032).
  • the present method can therefore be used for the diagnosis and / or prognosis of a patient suffering from neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease. It relates in particular to the dosage of synaptophysin or other proteins of synaptic vesicles contained in the sampling of tissues or biological fluids from patients suffering from neurodegenerative diseases (see in particular US2002040032).
  • the sensitivity and the speed of implementation of the method according to the invention can be used to demonstrate a loss (neurodegenerative disease, infection with neurotropic viruses, effect associated with the presence of synapto-toxic molecules, see patent US6 , 444,201 ”) or synaptic gain (study on neuronal regeneration, synaptogenesis, screening of anti-neurodegenerative agents ...) in cell culture systems (in particular neuron / target cell co-cultures), slices of neurons kept alive or in animals.
  • the method of the invention is also useful in all research aimed at demonstrate synaptic changes in particular regions of the nervous system (Sze et al., 2000).
  • the method can more particularly be used for the screening of molecules capable of modulating the growth or the stability of cells containing synaptic vesicles, in particular neurotrophic or anti-neurodegenerative molecules. It can be used for the study of active molecules on axon formation, synaptogenesis or the maintenance of synapses (US2002644433). It can also be used to detect the presence of synaptic vesicles within an embryonic stem cell culture as well as to determine their phenotype, for example by means of anti-vesicular neurotransmitter transporter antibodies.
  • the liquid sample is extracted from cells isolated from an individual for the purpose of identifying or assaying vesicles containing neuroendocrine markers.
  • the present method advantageously makes it possible to detect and quantify in a sample containing cells originating from tumors, the neuroendocrine markers present in the synaptic vesicles, such as for example synaptophysin or a VAMP, for example VAMP2 or their isoforms.
  • the method lends itself to the detection of synaptophysin from sections of lung tumors, for example frozen sections with a thickness of 40 ⁇ m.
  • the present invention more preferably relates to any use of the method according to the invention, for the positive and differential diagnosis of tumors.
  • the method according to the invention can be used to detect any variation in the relative quantity of organelles in a biological sample correlated to a treatment with a physiological or pharmacological agent or a genetic manipulation of the biological organism from which the analyzed sample comes.
  • the method according to the invention can be applied for the screening of molecules capable of modifying the quantity of a membrane constituent of an organelle or of modifying the capacity of a membrane constituent to bind with its natural ligand.
  • the method according to the invention can be used for the detection of toxins in a sample likely to contain them.
  • the term “toxin” is intended to mean any molecule capable of affecting cell functions and / or viability and directed against a membrane target of an organelle, resulting in a modification of the quantity of the targeted membrane constituent or of its interaction with its natural ligand.
  • the method of the invention applies to the detection of neurotoxins whose targets are the membrane constituents of synaptic vesicles.
  • Botulinum and tetanus toxins are the subject of major challenges in the medical sector (treatment of severe neurotoxic disorders which they cause, increasing use in local treatments for dystonia), the food industry (detection / research of the presence of toxins botulinum), the biotechnology sectors (tetanus vaccine is one of the main products in this sector) and the military, insofar as these neurot ⁇ xins are likely to be used in a biological weapon.
  • These neurotoxins target the proteins of the SNAREs family (syntaxins, VAMPs, and for example SNAP23 or SNAP25), in particular syntaxin 1, VAMP2 and
  • the method according to the invention is applied to the detection of a botulinum toxin or tetanus toxin in a sample capable of containing it.
  • a sample capable of containing it for the detection of neurotoxins, anti-VAMP, anti-SNAP25 or anti-syntaxin antibodies are coupled to the biochip.
  • a sample likely to contain a neurotoxin is brought into contact with a preparation containing organelles comprising targets of botulinum and tetanus toxins on their surface, in particular synaptic vesicles, and the variation, or disappearance, of SNARE proteins, is analyzed. by bringing this treated sample into contact with these antibodies coupled to a biochip.
  • the experiment can also be carried out using a supernatant of a lyophilized cell extract in the homogenization buffer and rehydrated.
  • the present method makes it possible to quickly and simply obtain a quantification of the effect of these toxins on cell cultures, in particular hippocampal neurons in culture or grain cells of the cerebellum.
  • the method can also be used to determine the presence of these toxins in a medium supposed to contain them, to determine the safety of batches of vaccines, to screen for molecules potentially antagonistic to these toxins or to detect a titer of neutralizing antibodies in the serum from patients treated with these toxins or from immunized animals.
  • Biochips containing a determined quantity of organelles immobilized on their surface can, because of their remarkable stability, be themselves used as starting materials for the implementation of a method for detecting a bond between an analyte and a membrane constituent of an organelle by methods of detecting mass variation or molecular conformation by optical reflection.
  • a second object of the invention therefore relates to a method of preparing a biochip usable for the detection of a bond between a analyte and a membrane constituent of an organelle, said method comprising: a) coupling, on the surface of a biochip usable in an optical detection device, for example for detection of variation in mass or of molecular conformation by optical reflection, a ligand capable of specifically binding to a membrane constituent of an organelle, b) bringing a liquid sample containing organelles into contact with the surface of the biochip containing the coupled ligand, for example by injection of the liquid sample in a device allowing this contacting, for obtaining a biochip containing organelles immobilized on its surface, c) if necessary, freezing the biochip obtained in step b) and keeping it cold , followed by thawing, or lyophilization followed by rehydration, for use.
  • Steps (a) and (b) are implemented similarly to steps
  • the biochip and the device chosen for the implementation of steps (a) and (b) are suitable for use of the biochips in an optical detection device, in particular in a mass variation detection device or molecular conformation by optical reflection based on spectroscopy of evanescent waves, in particular on surface plasmon resonance.
  • the device used in step b) allows, after injection of the sample into it, the passage of a flow of the liquid sample to the surface of the biochip, for example by means of microfluidic circuits.
  • the organelles contained in the sample and then immobilized on the biochip are native organelles the membrane of which has remained intact after the extraction of the cells containing them, in particular retaining the same proteolipid content as the intracellular organelle before extraction.
  • the organelles contained in the sample are secretion vesicles.
  • the organelles contained in the sample are synaptic vesicles.
  • the ligand coupled to the surface of the biochip is then chosen, for example, from the group consisting of anti-synaptophysin antibodies and anti-VAMP antibodies.
  • the invention naturally relates to a biochip usable for the detection of a bond between an analyte and a membrane constituent of an organelle, characterized in that it is capable of being obtained by the preparation method defined above.
  • a biochip according to the invention which can be used for the detection of a bond between an analyte and a membrane constituent of an organelle, is characterized in that it comprises: a) a suitable support for detecting a variation in optical signal, by example to detect a variation in mass or molecular conformation on its surface by optical reflection, b) ligands coupled to said support, said ligands being capable of specifically binding to the membrane constituent of an organelle, c) of organelles immobilized on the surface of the biochip by specific binding with said ligands.
  • the support suitable for measuring a change in mass or molecular conformation by optical reflection at the surface of the biochip is chosen from a support of gold or silver.
  • the the biochip can also comprise a layer of dextran allowing the coupling of the ligands on its surface. Preferred examples of biochips for surface plasmon resonance biosensors have been previously described.
  • the organelles immobilized on the surface of the biochips according to the invention are synaptic vesicles.
  • the synaptic vesicles are immobilized on the surface of the biochip by specific binding with ligands chosen from the group consisting of anti-synaptophysin antibodies and anti-VAMP antibodies.
  • a third object of the invention relates to a method for detecting a bond between an analyte and a membrane constituent of an organelle, comprising a) obtaining a biochip usable in an optical detection device, for example of detection of variation in mass or molecular conformation by optical reflection and comprising organelles immobilized on its surface, b) bringing the analyte into contact with the surface of the biochip containing immobilized organelles, for example by injection of a liquid sample containing the analyte in a device allowing the analyte to come into contact with the surface of the biochip containing immobilized organelles, c) measuring a variation in optical signal, for example a variation in mass or of molecular conformation on the surface of the biochip- by optical reflection, said measurement allowing the detection of the quantity of analytes bound to the organelles immobilized on the surface of the biochip.
  • the biochip obtained in step (a) is a biochip according to the invention as defined above.
  • the biochip is produced by the immobilization of a sufficient quantity of organelles necessary for the subsequent analysis sought. Since the quantity of organelles can be quantified by the implementation of the first method according to the invention described above, the level of immobilization of organelles can be controlled precisely according to the type of application desired.
  • the measurement of a change in mass or molecular conformation by optical reflection is based on spectroscopy of evanescent waves, in particular on surface plasmon resonance.
  • the device used in step b) allows a flow of the liquid sample to pass over the surface of the biochip, for example by means of microfluidic circuits. Examples of such devices have been given above.
  • the method makes it possible in particular to measure the affinity of any molecule on a membrane constituent of the immobilized organelle. It makes it possible to quantify any molecule present in a sample which specifically binds to a membrane constituent of an organelle. It also makes it possible to determine the presence or absence of a specific membrane constituent of an organelle by detection of a bond between said membrane constituent and a known ligand thereof.
  • analyte can be studied. It may in particular be a molecule or a supramolecular complex.
  • the analyte can be a protein, DNA, a lipid, a sugar, and in particular an antibody or antibody fragment, an enzyme, a hormone, a neuromediator, a receptor, a substrate for enzyme, lectin, toxin or pharmacological agent.
  • the analyte can also be included in a biological sample. More particularly, it may be a sample from a tissue or biological fluid sample such as blood, cerebrospinal fluid, urine or saliva. The sample can be taken from an animal (in particular a mammal and preferably a man) or a plant.
  • the sample can in particular be carried out on a healthy individual or a patient suffering from a pathology.
  • the pathology can in particular be cancer, a neurodegenerative pathology, an infectious pathology and in particular a viral, bacterial or parasitic pathology.
  • the analyte can in particular be antibodies directed against membrane constituents present on the surface of synaptic vesicles. They may in particular be anti-phospholipid antibodies. These antibodies can be generated during an autoimmune reaction.
  • the analyte can also be included in a culture of eukaryotic or prokaryotic cells, bacteria, fungi or yeasts.
  • the analyte can also be included in an agrifood product, and in particular seeds, fruits, cereals or cooked foods.
  • the analyte can be complexed with high molecular weight complexes so as to increase the mass of the injected molecule and thus increase the sensitivity of the measurement.
  • the analyte can be integrated into artificial liposomes.
  • steps (b) and (c) it is possible to repeat steps (b) and (c) with different concentrations of the same analyte making it possible to obtain the binding affinities of different analytes on the same organelle.
  • the method of the invention as defined above can therefore be applied to the screening of molecules capable of specifically binding to a membrane constituent of an organelle, in particular agonists or antagonists of ligands of membrane receptors.
  • a sample containing various candidate molecules capable of specifically binding to a membrane constituent will be injected followed by a ligand known to bind specifically to said membrane constituent. Partial inhibition of ligand binding will significant of the presence of a new ligand among the candidate molecules injected.
  • the present method also allows the purification of new ligands specifically immobilized on an organelle and their subsequent analysis, for example by mass spectrometry.
  • the method targets in particular the screening of new ligands of neuroendocrine markers for the molecular diagnosis of these markers.
  • the analytes tested are antibodies or antibody fragments directed against a membrane constituent of an organelle, preferably of a secretion vesicle and in particular of synaptic vesicles. In particular, these are monoclonal antibodies.
  • the method described above relates to the screening of molecules capable of modifying the quantity of a membrane constituent of an organelle or of modifying the capacity of a membrane constituent to bind with its natural ligand.
  • the molecules sought may, for example, be compounds capable of modifying the post-translational structure of the membrane constituents, such as kinases or phosphatases.
  • the method makes it possible to compare the binding affinity of a natural ligand with a membrane constituent of the organelle immobilized on the biochip and the affinity of the same ligand injected with or after the injection of a molecule capable of modifying the interaction of said ligand with the membrane constituent of the organelle.
  • the method comprises, prior to the injection of a ligand of a membrane constituent (the analyte), the injection of a compound capable of modifying the interaction of said ligand with the membrane constituent- of
  • the repetition of the binding measurements of different analytes can be applied to the characterization of the organelles contained in a sample, said analytes being chosen from known ligands of constituents. organelle membranes.
  • characterization is meant the determination of the presence on the same organelle of different known membrane constituents and, where appropriate, the evaluation of the relative proportion of each constituent analyzed.
  • This characterization can make it possible to identify, if necessary, pathological conditions, induced or natural genetic modifications or pharmacological treatments. Examples of modifications of the membrane constituent content of synaptic vesicles are described for example by Shimohama et al., 1998.
  • analytes which can be used for the characterization of organelles, in particular synaptic vesicles, use may be made of:
  • lipid ligands for example, annexin V
  • a preferred application of the present method relates to the detection of toxins in a sample likely to contain them.
  • the method of the invention applies to the detection of neurotoxins whose targets are the membrane constituents of synaptic vesicles.
  • the method according to the invention is applied to the detection of a botulinum toxin or a tetanus toxin.
  • These neurotoxins target the SNARE proteins (syntaxin 1, VAMP2 and SNAP25) present in the membrane of synaptic vesicles.
  • neurotoxins on synaptic vesicles can be analyzed by the detection according to the method of the invention of the binding of an anti-syntaxin 1, anti-VAMP2 or anti-SNAP25 antibody on immobilized synaptic vesicles brought into contact or not with a sample likely to contain said neurotoxins.
  • biochips containing the organelles immobilized on their surface are also targeted in the present invention.
  • toxins in a sample likely to contain them, preferably botulinum or tetanus toxin.
  • Figure 1 illustrates the specific capture of approximately 2000 RU of synaptic vesicles on a biochip by means of anti-synaptophysin antibody 171B5.
  • Sn10 subcellular fraction
  • Figure 2 illustrates the ability of a 100 mM octylglucoside solution to regenerate synaptic vesicles immobilized on an anti-synaptophysin 171B5 antibody. Each cycle consists of an injection of diluted Sn10 fraction, followed by an injection of 100 mM octylglucoside (40 ⁇ l to 5 ⁇ l / min).
  • Figure 3 illustrates the capture of synaptic vesicles from lysates of cultured hippocampal neurons, seeded at different densities. Lysate of 28,800 cells Lysate of 9,000 cells
  • Figure 4 23 samples from lung tumor samples were analyzed for the presence of neuroendocrine markers.
  • the horizontal line represents the signal level above which the detection is considered to be positive (4 resonance units value below which the signal is no longer considered reliable).
  • Small cell tumors represented by diamonds.
  • Non-small cell tumors represented by squares.
  • Healthy samples (control) represented by a triangle.
  • Figure 5 illustrates the demonstration of a variation in the amount of synaptic vesicles in neurons in culture treated with a neurotrophic factor
  • hippocampal neurons (20,000 cells / cm 2 ) treated after 7 days of culture with 37.5 ng / ml of BDNF (Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) for 7 days.
  • Untreated cells hippocampal neurons grown under the same untreated conditions.
  • Figure 6 illustrates the effect of botulinum toxin B (Bont / B) on the immobilization of synaptic vesicles on a biochip.
  • Sn10 previously incubated with a toxin concentration range for 20 hours is analyzed on a biochip coupled with an anti-VAMP, anti-synaptophysin or anti-synaptogyrin antibody.
  • the biochip comprises two to four analysis tracks placed in series: a non-specific antibody is captured on the control track (700 pg) and an anti-VAMP antibody on the test track (700 pg).
  • Analysis of Sn10 allows the determination of synaptic vesicles on the biochip.
  • the presence of BoNT / B toxin abolishes the signal on the anti-VAMP2 antibody.
  • the sensitivity is 3fM, which makes it possible to detect an amount of 0.04 pg of toxin (experiment representative of three independent experiments analyzed in triplicate).
  • Figure 7 Example of characterization of synaptic vesicles from cultured neurons whether or not treated with tetanus toxin.
  • the culture is treated (treated cells) or untreated (untreated cells) with tetanus toxin (100 ng / ml) for 39 hours.
  • tetanus toxin 100 ng / ml
  • Figure 8 illustrates a calibration curve for the assay of synaptophysin.
  • a dilution range of Sn10 (containing a known concentration of synaptophysin) is injected into an anti-synaptophysin antibody.
  • the samples are injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min.
  • the binding speed of the synaptic vesicles is constant and proportional to the amount of synaptophysin present in the sample.
  • the inset shows that linearity is observed over a wide range of synaptophysin concentrations. Estimating that there are approximately 20 copies of synaptophysin per synaptic vesicle, a second abscissa axis makes it possible to relate the amplitude of the SPR signal to the concentration of synaptic vesicles present in the medium.
  • the anti-synaptophysin antibody used to capture synaptic vesicles is the 1 1 B5 antibody (Lévêque et al. 2000).
  • anti-syntaxinl 3 are sold by the company Stressgen.
  • anti-VAMP2 Nter polyclonal antibody directed against the Nter part of the VAMP, Léveque et al. 2000
  • anti-VAMP 60-88 polyclonal antibody directed against the rat VAMP2 peptide 60-88
  • Antibodies 1 H7 and 3D10 (monoclonal anti VAMP2 whose epitopes are located in region 19-59 of rat VAMP2), as well as the anti SNAP 25 antibody (BR05, Lévêque et al, 2000) were provided by the Dr Kosaki (Department of Veterinary Science, College of Agriculture, Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka, Japan).
  • the anti-syntaxin monoclonal antibodies: 6D2, 9H1, 4D4, 10F5, 6H1 were also provided by the laboratory of Dr Takahashi as well as the anti-synaptotagmin antibodies (1 D12 and anti Nterminal region of synaptotagmin I), anti-CSP ( Lévêque et al. 2000), anti-Rab3A, Munc 18, NSF, sortillin, complexin, GluR2, Neurexin, alpha-beta SNAP and synaptophysin (6H2 directed against a luminal region)
  • the anti-synapsin IIa monoclonal antibody is sold by the company Translaboratories.
  • the Developmental Studies Hybridoma Bank anti-SV2A antibody was developed by NICHD and stored by the University of Iowa, Department of biological Sciences, lowa City, IA 52242.
  • Non-immune IgGNIS mouse IgGNIS (non-specific IgG) were obtained from Interchim.
  • the fractionation procedure is based on the work of Lévêque et al. 2000.
  • a fresh rat brain is homogenized with a Teflon homogenizer in 10 ml of a cold sucrose buffer (10 mM HEPES, NaOH, 0.32 M sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride, pH 7.4).
  • the homogenized sample is centrifuged at 10000xg for 15 minutes.
  • the supernatant (Sn10) (containing approximately 3 mg of protein / ml) is filtered and used immediately or stored at -20 ° C or lyophilized for later use.
  • the characterization experiments were carried out on a microchip (CMS sensor chip.
  • the immobilization protocol is the same as that used for the CMS biochip.
  • the surface of the biochip is saturated with 50 ⁇ l of a IgGNIS antibodies (50 ⁇ g / ml) at 15 ⁇ l / min before contacting specific antibodies.
  • Example 1 Control of the specificity of the immobilization of synaptic vesicles on biochips
  • Figure 1 illustrates the specific capture of synaptic vesicles immobilized on biochips.
  • a Sn10 fraction containing synaptic vesicles is diluted in a TBS buffer to a protein concentration of 0.15 mg / ml, and preincubated or not with an excess of anti-synaptophysin antibodies (100 ⁇ g / ml).
  • the samples are then injected (50 ⁇ l to 5 ⁇ l / min) on a biochip on which 0.5 ng of anti-synaptophysin antibody have been immobilized beforehand in the test track and 0.5 ng of non-immune antibody in the control track .
  • FIG. 1 illustrates the specific capture of approximately 2 ng of protein equivalent of synaptic vesicles on a biochip by means of anti-synaptophysin antibodies 171B5.
  • the analysis of the immobilization rate of each preparation makes it possible to measure an inhibition of 88% of the immobilization of synaptic vesicles when the Sn10 fraction has been pre-incubated with the antibody 171B5.
  • the signal generated by the immobilization of the synaptic vesicles is specific with regard to the following criteria: • the passage of the biological sample on a “control” track on which a non-specific antibody is coupled generates a signal which represents only 5 to 10 % of the signal collected on the "experimental" track.
  • the inventors have selected an anti-synaptophysin monoclonal antibody having a dissociation rapid kinetics, atypical compared to most anti-synaptic vesicles antibody.
  • Prolonged injection of a concentrated detergent solution (such as 100 mM octylglucoside) completely regenerates the synaptophysin / antisynaptophysin interaction while dissolving the vesicle membrane.
  • the inventors also immobilized a monoclonal antibody against synaptic vesicles) with an anti-Fc antibody. While retaining the immobilization properties described above, this procedure also has the advantage of orienting the anti-synaptic vesicle antibody in a functional manner. By selecting an anti-Fc antibody little sensitive to pH shock, the biochip containing the immobilized organelles can be regenerated several tens of times at an acidic pH.
  • Example 3 Detection of synaptic vesicles from different amounts of neurons in culture and analysis of the sensitivity of the method according to the invention
  • hippocampal neurons Primary cultures of hippocampal neurons are prepared from 18-day rat embryos according to the method described in Garrido et al., 2001. Four coverslips per culture dish are seeded with different densities of dissociated cells. On day D14, the cells are washed three times with PBS buffer. The cells are then lysed for 3 minutes with 500 ⁇ l (per culture dish) of lysis buffer (5 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7.4) and resuspended by scraping. The lysed cells are passed 9 times through a 27G needle and centrifuged for 15 minutes at 12,000 x g at 4 ° C. The cell supernatants are injected (100 ⁇ l to 1 ⁇ l / min) on the biochip functionalized with an anti-synaptophysin antibody (171 B5).
  • the sensitivity of the organelle detection method according to the invention is thus illustrated by the following experiment: by diluting a neuron culture lysate to 20,000 cells / cm2 and by extrapolation, it has indeed been determined that it was possible to detect the presence of vesicles from an equivalent of two neurons.
  • the method according to the invention rapid and sensitive, is therefore particularly well suited to detection organelles in biopsies or samples of biological fluids, including blood samples.
  • the 23 samples were analyzed. The results are presented in FIG. 4.
  • the 9 samples from small cell tumors (the characteristic of which is to contain neuroendocrine markers) are positive as well as 3 samples of “non-small cell” tumors. However, it is expected that 10 to 30% of non-small cell samples nevertheless also contain neuroendocrine markers (Camaghi C. et al., 2001).
  • the horizontal line represents the signal level above which the detection is considered positive (4 resonance units value below which the signal is no longer considered reliable).
  • the results demonstrate that the method of the invention is suitable for the detection and quantification of neuroendocrine markers, in particular for the positive and differential diagnosis of tumors.
  • Example 5 Detection of a modification in the number of synaptic vesicles originating from neurons treated with a neurotrophic factor
  • Hippocampal neurons (20,000 cells / cm 2 ) are treated after 7 days of culture with 37.5 ng / ml of BDNF (Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) for 7 days.
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems
  • the lysis supernatants are injected (100 ⁇ l to 1 ⁇ l / min) onto 0.7 ng of anti-synaptophysin antibody or of non-specific antibodies.
  • the experiment consists in measuring a loss of binding of synaptic vesicles of rat brain, on an anti-VAMP antibody, following the incubation with botulinum toxin B.
  • the monoclonal anti-VAMP antibody used to capture the vesicles is directed against the Nterminal part of the. VAMP (Cl 69.1).
  • Purified Botulinum toxins B and E were supplied by the laboratory of Dr. Kosaki (Department of Veterinary Science, College of
  • the biochip comprises two to four analysis tracks placed in series: a non-specific antibody is captured on the control track (700 pg) and an anti-VAMP antibody on the test track (700 pg).
  • a non-specific antibody is captured on the control track (700 pg)
  • an anti-VAMP antibody on the test track (700 pg).
  • anti-synaptophysin (171B5) or anti-synaptogyrin (1D12) antibodies were also placed in series on the following two tracks in order to verify the integrity of the vesicular preparation for prolonged incubation times.
  • the concentrated toxin (0.6 ⁇ M) is incubated 45 min at 37 ° C in a buffer
  • the Sn10 fraction is diluted 3000 times in the cleavage buffer: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 20 mM ZnCI 2 , 0.02% BSA, 0.16 mM DTT, pH 7.4 and then incubated in the presence or absence of varying concentrations of toxin. At the end of the incubation, the NaCI concentration is adjusted to 0.4 M and part of the sample is injected onto the biochip.
  • the race buffer consists of 10 mM HEPES-NaOH, 0.15 M NaCl, pH 7.4.
  • botulinum toxin B 600 pM heated to 80 ° C or else not reduced as well as the botulinum toxin E (600 pM), used as a negative control, are inactive in this test (experiments carried out over time short).
  • the detection limit is of the order of 3 fM of botulinum toxin B (approximately 0.04 pg of toxin), ie 0.45 pg / ml.
  • the presence of DTT and the significant dilution of the Sn10 fraction are two important parameters making it possible to measure an immobilization of synaptic vesicles incubated at 37 ° C. for several hours.
  • the botulinum toxin B activity assay is currently performed very often in vivo by LD50 in mice (US20030143651). It has a higher sensitivity to in vitro tests.
  • the tetanus toxin was supplied by Dr Boquet (INSERM U452, Nice).
  • the hippocampal neurons are cultured as described in Figure 3.
  • the culture is treated or not with tetanus toxin (100 ng / ml) for 39 hours.
  • the synaptic vesicles (approximately 2 ng of protein equivalent) are immobilized on an anti-synaptophysin antibody.
  • the biochip is then saturated with a non-mouse specific antibody.
  • the specific antibodies of the synaptic vesicles are then injected successively (20 ⁇ l to 30 ⁇ g / ml, 15 ⁇ l / min). Each injection is preceded by an injection of non-specific antibodies at the same concentration.
  • the percentages of inhibition of binding of anti-VAMP antibodies by the action of tetanus toxin are 94%, 87%, 87% and 89% respectively as illustrated in FIG. 7.
  • Example 8 Linearity of the dose-response curve for the detection of synaptophysin and or synaptic vesicles from Sn10.
  • Different dilutions of Sn10 containing known concentrations of synaptophysin are made in TBS buffer. These dilutions are injected at 5 ⁇ l / min onto a biochip on which 0.8 ng of anti-synaptophysin antibody on the test track and 0.8 ng of non-immune antibody on the control track have been immobilized beforehand. The injections are carried out at a slow rate and under conditions which are not saturating for the specific antibody (use of 1 to 2% of the capacity for capturing the antibody). The speed of binding of the synaptic vesicles is then a straight line whose slope is calculated and reported as a function of the concentration of synaptophysin contained in the sample.
  • synaptophysin Based on the estimate that there are approximately 20 copies of synaptophysin per synaptic vesicle (Fernandez Chacon and Sudhof 1999), it is also possible to determine the concentration of synaptic vesicles in the injected sample. A calibration curve is thus obtained for the assay of synaptophysin and / or synaptic vesicles.
  • the detection limit is 50 attomoles (2pg) of synaptophysin (2.5 attomoles of synaptic vesicles), which corresponds to a gain in sensitivity of 60 compared to the assay of this protein in ELISA (Schiaf ef a /, 1996) .

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et d'analyse d'organelles, notamment de vésicules synaptiques, immobilisés sur des biopuces. L'invention vise également une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle. Les applications de la présente invention concernent en particulier la détection de neurotoxines, comme les toxines botuliques ou la toxine tétanique, la caractérisation fonctionnelle d'organelles, la . détection de marqueurs tumoraux, ou le criblage de nouvelles molécules interagissant avec des constituants membranaires spécifiques d'organelles.

Description

METHODE DE DETECTION ET D'ANALYSE D'ORGANELLES
IMMOBILISES SUR BIOPUCE ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention se rapporte à une méthode de détection et d'analyse d'organelles, notamment de vésicules synaptiques, immobilisés sur des biopuces. L'invention vise également une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle. Les applications de la présente invention concernent en particulier la détection de neurotoxines, comme les toxines botuliques ou la toxine tétanique, la caractérisation fonctionnelle d'organelles, la détection de marqueurs tumoraux ou le criblage de nouvelles molécules interagissant avec des constituants membranaires spécifiques d'organelles.
La présente invention concerne en particulier les domaines du diagnostic médical, de la pharmacologie et de la toxicologie.
La cellule eucaryote contient différentes structures délimitées par une membrane formant des compartiments intracellulaires, appelées organelles.
Ces organelles peuvent soit, rester localisés dans les cellules, soit, pour des raisons physiologiques ou physiopathologiques, être sécrétés ou libérés dans les milieux extracellulaires. A titre d'exemples d'organelles, on peut citer les mitochondries, les chloroplastes, les vésicules ou les granules de sécrétion, les lysosornes, les peroxisomes, les exosomes, les dexosomes, ou encore les vésicules synaptiques.
Les caractéristiques structurales et la composition des organelles dépendent fortement de leur fonction dans la cellule, mais aussi des types cellulaires dans lesquels ils se trouvent et de l'état physiologique de la cellule. Le dosage ou l'analyse des caractéristiques structurales et fonctionnelles d'organelles déterminés issus de cellules en culture ou de cellules prélevées d'un organisme biologique est un moyen d'obtenir des informations sur ces cellules et dans certains cas d'identifier des états physiologiques ou pathologiques de ces cellules.
Un exemple d'organelle dont les caractéristiques structurales sont dépendantes ou type cellulaire analysé et de l'état physiologique de la cellule est la vésicule synaptique. Les vésicules synaptiques sont des organelles présents en grande quantité dans les terminaisons nerveuses des neurones. Des vésicules apparentées, connues sous le terme SLivlV (synaptic like microvesicle), se trouvent en moindre quantité dans des tissus endocrines et neuroendocrines et dans certains types de tumeurs. Dans le système nerveux, ces vésicules synaptiques véhiculent les neuromédiateurs et peuvent être considérées comme de véritables unités fonctionnelles de la communication. Elles sont d'une taille d'environ 50 nm et présentent à leur surface entre 20 et 40 protéines, dont certaines sont spécifiques de ces organelles (Femandez-Chacon and Sudhôf, 1999). Ces protéines spécifiques, comme par exemple la synaptophysine ou la VAMP, constituent des marqueurs de choix pour identifier des neurones différenciés au sein d'un tissu, et sont étudiées dans des domaines aussi variés que la dégénérescence/régénération neuronale, la plasticité synaptique ou la cancérologie. Certaines de ces protéines sont par ailleurs les cibles des neurotoxines, et notamment des toxines botuliques et tétanique.
La détection des protéines des vésicules synaptiques est réalisée couramment par des méthodes conventionnelles en immunopathologie (immunohistochimie). De façon plus rare, ces protéines ont été analysées après solubilisation des tissus, qualitativement et quantitativement, par des techniques comme le Western Blot ou l'ELISA (Schlaf et al., 1996). Un exemple de méthode d'analyse des protéines des vésicules.synaptiques par Western Blot après purification est par exemple décrit par Lévêque et al., 2000 ou encore Quetglas et al. 2000. Le résultat de telles analyses n'est en général obtenu qu'au-delà de 24 heures et nécessite l'utilisation de plusieurs types d'appareillages non adaptés pour des applications de dosage en routine. De plus, les contraintes liées à la préparation d'échantillons contenant des protéines membranaires en particulier les étapes de solubilisation et de centrifugation, rendent peu accessibles la technique ELISA pour un dosage de routine.
La présente invention fournit une méthode permettant de purifier, détecter et analyser sur une biopuce, en une seule étape, des organelles tels que des vésicules synaptiques extraites de cellules neuronaiës.
Les biopuces sont des outils qui permettent une analyse chimique ou biochimique de molécules préalablement immobilisées. Lorsque les molécules préalablement immobilisées sont des protéines, le procédé d'immobilisation choisi doit être approprié pour permettre le maintien de la conformation des protéines immobilisées sur la biόpuce et leur stabilité. Pour l'analyse biochimique des molécules immobilisées, on connaît diverses méthodes de détection utilisant des capteurs de type spectromètre, photomètre, fluorimètre ou luminomètre détectant des interactions moléculaires révélées par réaction enzymatique ou marquage fluorescent d'un ligand potentiel, pharmacologique, naturel ou synthétique. On citera à titre d'exemple d'une méthode couplant une biopuce à un biocapteur capable de détecter un signal fluorescent, la méthode développée par la société Zyomix (Hayward CA) (Nat. Biotechnol., 2002, 20 : 225-229).
Lorsqu'elles sont couplées à un capteur détectant des variations de signal optique résultant de variations de masse ou de conformation moléculaire à leur surface, elles permettent l'analyse d'interactions entre les molécules immobilisées et des ligands pharmacologiques, naturels ou synthétiques. Diverses méthodes de détection optique susceptibles de détecter des variations de masse ou de conformation moléculaire d'un analyte s'immobilisant sur une biopuce sont connues et incluent des méthodes piézoélectriques, optiques, thermo-optiques, d'ondes acoustiques de surface (surface acoustic wave SAW), ainsi que des méthodes électrochimiques (voltamétriques, conductométriques, potentiométriques, ampérométriques, ...). Parmi les méthodes de détection optique, on peut retenir, sans être exhaustif, celles qui détectent des variations de masse ou de conformation moléculaire à la surface de biopuces telles les méthodes de réflexion optique comme l'ellipsométrie ou la spectroscopie des ondes évanescentes. Cette dernière méthode inclut les méthodes fondées sur la résonance plasmonique de surface, encore appelées méthodes SPR. Les méthodes de spectroscopie des ondes évanescentes ont donné lieu à plusieurs types de biocapteurs commercialisés, dont ceux fondés sur l'utilisation de la résonance plasmonique de surface et produits par différentes sociétés dont
BIACORE AB (comme les biocapteurs Biacore X, Biacore 3000), Texas Instruments (comme le biocapteur Spreeta), Windsor Scientific IBIS.ou Quantec DP, et ceux fondés sur la réflexion d'angle frustré (frustrated angle reflection, FTR) et produit par la société IASYS. Ces techniques sont décrites en détail dans l'état de la technique (Biotechniques, 1991, 11 : 620-627 ;
Methods, 2000, 22 : 77-91 ; Nature Biotechnology, 2002, 20 : 225-229).
Dans le texte qui suit, sauf précisions spécifiques, par le terme « détection optique » ou « détection de variation de signal optique », on entend toute méthode permettant la détection d'un signal optique, incluant la variation de la chemiluminescence, de la fluorescence, ou bien encore la détection d'une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, par exemple par résonance plasmonique de surface (SPR).
Par le terme « biopuce », on entend toute surface solide appropriée pour le couplage avec une molécule biochimique, et en particulier une molécule d'ADN ou un polypeptide, ladite surface solide couplée à une molécule biologique, étant appropriée pour son utilisation dans une méthode de détection optique, ladite méthode de détection optique visant en particulier à détecter une interaction entre la molécule couplée à biopuce et un analyte. Par le terme « biopuce pour biocapteurs par réflexion optique », on entend une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.
A ce jour, le développement des biopuces utilisable dans une méthode de détection optique, notamment par réflexion optique, concernait essentiellement l'analyse de molécules simples comme l'ADi , les protéines, voire des lipides ou des structures lipidiques comme des liposomes.
Les inventeurs ont maintenant constaté que les organelles, et notamment les vésicules synaptiques, sont des structures particulièrement robustes, demeurant intactes sur des longues périodes (plusieurs semaines), et ce, même après avoir subi divers traitements physico-chimiques (congélation, sonication, lyophilisation) et biochimiques. Cette stabilité est également observée pour la grande majorité de leurs constituants membranaires. Il résulte de ces observations qu'il peut en particulier être envisagé de réaliser un dosage des vésicules synaptiques et de leurs constituants à partir de tissus normaux ou pathologiques, à l'aide d'une méthode de détection optique.
A la connaissance de la demanderesse, le développement de biopuces contenant des organelles immobilisés à leur surface, n'a jamais été décrit. En particulier, le développement de biopuces pour biocapteurs par réflexion optique, contenant des organelles immobilisés à leur surface, n'a jamais été décrit.
En outre, à la connaissance de la demanderesse, l'utilisation en routine d'organelles tels que des vésicules synaptiques comme réactif de laboratoire, par exemple, comme substrat d'enzyme, n'a jamais été suggérée. L'invention fournit en particulier une méthode de préparation d'organelles utilisables comme substrat d'enzyme, susceptibles d'être incubés sur une longue période, plus de 2 heures, voire plus de 24 heures et jusqu'à au moins 30 heures d'incubation. L'invention fournit en outre une méthode permettant de conserver i'organelle en vue de son utilisation sur le long terme. Les constituants proteiques des organelles, lorsqu'ils sont analysés directement sur I'organelle intact, présentent l'avantage de conserver leur structure native au sein de la membrane biologique, tout en étant analysables sur biopuce, selon les procédés de l'invention.
L'invention résulte également de la constatation qu'il est possil d'immobiliser de manière stable et spécifique des organelles sur des biopuces pour biocapteurs par réflexion optique et d'obtenir une quantification extrêmement sensible de ces organelles immobilisés, à l'aide d'une méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.
Au sens de l'invention, le terme « organelle » signifie dans le texte qui suit, sauf précision spécifique, une structure intracellulaire d'une cellule eucaryote, délimitée par une membrane.
Les organelles sont en général préparés par lyse de cellules les contenant.
De préférence, pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, il s'agit d'organelles non purifiés. Par « organelle intact », on entend un organelle dont la structure n'a pas été altérée par le procédé de préparation. En particulier, le contenu en protéines membranaires n'a pas été modifié.
De préférence, il s'agit d'organelles d'une taille inférieure à 360 nm.
Les organelles peuvent être sous la forme native ou le cas échéant reconstitués. On entend par « organelle reconstitué » toute structure protéolipidique contenant l'un quelconque ou plusieurs des constituants spécifiques de ces organelles, et notamment une protéine membranaire d'un organelle. Les organelles reconstitués sont préparés par des méthodes physico-chimiques, incluant des méthodes biochimiques, ou à partir de cellules les exprimant, naturellement ou non, provenant de la sonication d'une cellule exprimant à sa surface une protéine recombinante d'un organelle natif, en particulier une protéine membranaire d'un organelle natif.
Par « dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique », sauf précision spécifique, on entend au sens de l'invention tout dispositif permettant de détecter des variations de masse ou de conformation moléculaire à la surface d'une biopuce appropriée, fondé sur les méthodes de réflexion optique, interne ou externe, et notamment l'ellipsométrie ou la spectroscopie des ondes évanescentes.
Un premier aspect de l'invention concerne donc une méthode d'identification ou de dosage d'organelles dans un échantillon liquide, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, par exemple de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire des organelles à identifier ou à doser, b) la mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, par exemple par l'injection de l'échantillon dans un dispositif permettant cette mise en contact, c) la détection d'une variation d'un signal optique, et notamment d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce par réflexion optique, ladite détection permettant l'identification et/ou le dosage des organelles liés à la surface de la biopuce.
Au sens de l'invention, le terme « identification » signifie que la méthode permet au moins de déterminer si l'échantillon contient les organelles recherchés ou non. Le terme « dosage » signifie que la méthode permet au moins de déterminer si l'échantillon contient plus ou moins d'organelles qu'un échantillon contrôle, ci-après indiqué par le terme « quantité relative d'organelles » ou « taux relatif d'organelles », et le cas échéant, de déterminer la masse d'organelles immobilisés sur la biopuce et sa concentration dans un échantillon.
La première étape de la méthode consiste à préparer une biopuce permettant la fixation des organelles à détecter ou à doser.
La biopuce choisie sera naturellement adaptée au dispositif de détection optique choisi. En particulier, il s'agira d'une biopuce adaptée à un dispositif choisi pour détecter une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique. Dans un mode de réalisation particulier, la détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.
Dans ce cas, la biopuce comprend de préférence un support métallique solide, par exemple d'or ou d'argent. Des exemples de biopuces pour biocapteurs optiques par résonance plasmonique de surface sont décrits dans les brevets EP044922, US 5,242,828 et US 5,436,161. De telles biopuces sont commercialisées par la société BIACORE AB.
L'homme du métier sélectionnera un ligand approprié en fonction de I'organelle à identifier, le ligand devant présenter une affinité suffisante avec un constituant membranaire spécifique de I'organelle afin d'immobiliser
I'organelle à la surface de la biopuce lorsque le ligand est couplé à la biopuce. Le ligand peut être tout type de molécules, et notamment un polypeptide, un polysaccharide, un polynucléotide ou un lipide, ou un ligand physiologique ou pharmacologique naturel ou synthétique.
Dans un premier mode de réalisation, le ligand est un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un antigène exprimé à la surface de I'organelle à identifier. L'étape (a) de la méthode comprend le couplage du ligand choisi sur la biopuce. Le terme « couplage » signifie au sens de l'invention toute méthode visant à permettre une association physique entre le ligand et le support solide constitué par la biopuce. Il est préférable cependant que l'interaction soit suffisamment stable pour que le ligand ne se dissocie pas lors de la mise en œuvre de la méthode. De manière préférée, l'interaction est suffisamment stable pour permettre une utilisation répétée de la biopuce sans perte de sensibilité de la détection.
Le couplage peut être direct ou indirect. Par « couplage direct », on entend une liaison covalente entre le ligand et le support de la biopuce. Par
« couplage indirect », un premier ligand est lié de manière covalente à la puce, un deuxième ligand de manière réversible à ce premier ligand. Selon une procédure alternative, le second ligand peut être préincubé avec la préparation contenant les organelles avant leur mise en contact avec le premier ligand.
A titre d'exemple de couplage indirect, le premier ligand, fixé à la biopuce de manière covalente est un anticorps anti-Fc ou anti-lgG souris se liant spécifiquement à un deuxième anticorps capable de reconnaître I'organelle à identifier dans l'échantillon. Le premier ligand est avantageusement peu sensible au choc de pH, de manière à régénérer la biopuce après utilisation par choc acide tout en permettant des immobilisations successives et reproductibles du deuxième ligand. Un exemple d'anticorps anti-Fc peu sensible au choc de pH est commercialisé notamment par la société BIACORE AB sous le nom d'anti-mouse Fcγ Réf. BR-1000-50.
De préférence, le couplage indirect sera suffisamment stable de façon à réaliser des mesures de liaison d'organelles sur une période de 24 heures.
Dans un mode de réalisation particulier visant à détecter des vésicules synaptiques ou vésicules apparentées exprimant des marqueurs neuroendocrines, on citera à titre d'exemples de ligands susceptibles d'être couplés à la biopuce, les anticorps ou fragments d'anticorps reconnaissant spécifiquement les antigènes exprimés à la surface de ces organelles. Une liste non exhaustive d'anticorps reconnaissant des antigènes de vésicules synaptiques inclut par exemple les anti : -VAMP, -synaptophysine, - synaptotagmine, -SV2, le transporteur vésiculaire du glutamate.
De façon avantageuse, dans l'objectif de détecter des vésicules synaptiques ou tout organelle exprimant la VAMP ou la synaptophysine, on utilisera des anticorps anti-synaptophysine ou anti-VAMP ou l'un de leurs fragments fonctionnels. Ces anticorps ont déjà été décrits dans l'état de la technique.
Lorsque l'un de ces anticorps est utilisé comme ligand, il a été avantageusement constaté par les inventeurs que la biopuce pouvait aussi être régénérée, après utilisation, au moyen d'une solution de détergent concentré, par exemple l'octylglucoside. De préférence, l'octylglucoside est utilisé en solution à 100 mM. Cela permet notamment de régénérer totalement l'interaction synaptophysine/anti-synaptophysine tout en solubilisant la membrane des organelles. Au moins 40 cycles de régénération/immobilisation sont alors possibles sur le même anticorps couplé à la biopuce, de préférence, de 10 à 100 cycles de régénération/immobilisation. L'utilisation alternative des procédures de régénération par variation de pH et par l'octylglucoside permet une capacité théorique de plusieurs centaines d'analyses.
Différentes méthodes de couplages de molécules, et notamment de couplage de polypeptides à des supports solides de type biopuces, comme les silanes, les films de polymères, les alcanethiols et les hydrogels, sont bien connues de l'homme du métier. De façon avantageuse, la biopuce contient une matrice poreuse biocompatible, par exemple un hydrogel (formé de polysaccharide tel que le dextran). Un tel hydrogel peut contenir de manière appropriée des groupes hydroxyl, carboxyl, amino, aldéhyde, carbonyl, époxy, ou vinyl pour la fixation covalente du ligand. Dans l'application particulière des méthodes de réflexion optique, le changement de composition à la surface d'une biopuce, par adsorption, désorption, fixation d'un analyte ou relargage d'un analyte, est associé à un changement de l'angle de réflexion d'une lumière atteignant la surface de la biopuce. L'étape (b) consiste donc à mettre en contact l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, par exemple par l'injection de l'échantillon liquide à analyser dans un dispositif permettant cette mise en contact.
Le dispositif choisi sera naturellement adapté à la méthode de détection optique choisie, par exemple à une méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique. Pour la mise en œuvre de l'étape b), un exemple préféré de dispositif est un dispositif permettant le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques. De tels dispositifs sont décrits notamment dans le brevet US 5,313,264.
Des dispositifs appropriés permettant une détection de variation de masse par résonance plasmonique de surface et utilisant un circuit microfluidique pour la mise en contact de l'échantillon sur la biopuce sous forme de flux, sont des dispositifs commercialement disponibles.
Les organelles susceptibles d'être présents dans l'échantillon se lient spécifiquement aux ligands couplés à la biopuce. La quantité d'organelles immobilisés est ainsi déterminée selon la méthode de l'invention par détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, en utilisant naturellement les contrôles appropriés pour déduire de l'interaction détectée, les interactions non spécifiques (bruit de fond).
L'échantillon liquide peut être tout type d'échantillon préparé soit à partir de cellules susceptibles de comporter des organelles, soit à partir d'un milieu biologique dans lequel elles ont été libérées, soit par tout procédé consistant à générer des structures protéolipidiques contenant des protéines des vésicules synaptiques, en particulier des protéines de la membrane des vésicules synaptiques, par exemple par induction d'expression d'une protéine de la membrane des vésicules synaptiques dans des cellules non- neuroendocrines. Dans le premier cas, la préparation consiste en général en une lyse des cellules de manière à obtenir une libération des organelles. Afin d'obtenir une meilleure stabilité des organelles, de préférence, les organelles libérés dans la solution ne sont pas purifiés après lyse des cellules. De façon avantageuse, la solution contenant les organelles pour la mise en œuvre des procédés de l'invention est une solution très diluée, en particulier en comparaison avec les solutions d'organelles classiquement préparées dans l'état de la technique. A titre d'exemple, la solution contenant les organelles comprend entre 1 ng et 1μg de protéines totales, de préférence entre 10ng et 200ng de protéines totales, par exemple entre 30 ng et 80 ng. Plus particulièrement, comme dans le second ou le troisième cas, il peut s'agir d'un échantillon préparé à partir de cellules d'un organisme biologique, et notamment d'un prélèvement de tissus ou de fluides biologiques tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive. Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire. Dans un échantillon préparé à partir de cellules d'un organisme biologique et notamment d'un prélèvement de tissus, ou d'une culture de cellules, le ligand couplé à la biopuce est choisi de manière à être spécifique de la membrane des organelles à détecter afin d'éviter en particulier des interactions, par exemple, avec des constituants de la membrane plasmique des cellules. L'échantillon liquide peut être également préparé à partir d'une culture de cellules. L'échantillon analysé peut être préparé pour sa conservation, par exemple, par congélation ou lyophilisation. Dans un mode de mise en œuvre particulier, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules d'exocytose. On entend par « vésicules d'exocytose », tout organelle contenant des constituants destinés à être sécrétés à l'extérieur de la cellule, ou comprenant des constituants membranaires destinés à être incorporés à la membrane plasmique. Ces organelles incluent notamment les vésicules synaptiques, les granules de sécrétion (ou vésicules à cœur dense) ou encore les SLMV.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon liquide est préparé à partir de tissus neuronaux en vue de l'identification et/ou du dosage de vésicules synaptiques.
Après une mise en œuvre de la méthode par une détection SPR, il apparaît, que le phénomène de capture des vésicules synaptiques sur la biopuce est irréversible (moins de 5% de dissociation en 24 heures par exemple sur un anticorps anti-synaptophysine). Cette très forte affinité permet de quantifier les vésicules synaptiques sur une très large gamme de concentration, ce qui est particulièrement important pour des méthodes utilisant les biopuces à protéines. Une droite de calibration peut être établie pour corréler la concentration de l'un des composants de la membrane de la vésicule synaptique (ou la concentration des vésicules synaptiques) au signal mesuré sur le biocapteur.
Les protéines de la membrane des vésicules synaptiques constituent des marqueurs synaptiques très étudiés. Dans certaines maladies neurodégénératives de type Alzheimer (Terry et al., 1991 ; Sze et al., 2000), la sclérose latérale amyotrophique (Ikemoto, Acta neuro, 2002), la dégénérescence commence par le compartiment présynaptique où sont localisées la très grande majorité des vésicules synaptiques. Dans la maladie d'Alzheimer, une bonne corrélation à été observée entre la perte de fonctions cognitives et la diminution de synaptophysine (Mucke et al., 2000, US2002040032). Sur des modèles de rats épileptiques, il a été montré une diminution sélective du nombre de vésicules synaptiques associées à une population neuronale (Hirsh et al., 1999). A l'inverse, des études de synaptogénèse montrent que les éléments présynaptiques se mettent en place avant les complexes post-synaptiques.
La présente méthode peut donc être utilisée pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un patient atteint de maladies neuro-dégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer. Elle vise en particulier le dosage de synaptophysine ou d'autres protéines de vésicules synaptiques contenues dans le prélèvement de tissus ou de fluides biologiques de patients atteints de maladies neurodégénératives (voir en particulier US2002040032).
D'autre part, il est bien connu que des molécules comme les neurotrophines jouent un rôle prépondérant dans la survie et la différenciation neuronale dans de nombreux systèmes. Il a été montré par exemple, sur des neurones d'hippocampe en culture, que ces molécules augmentent significativement le nombre de vésicules synaptiques (Yamada et al., 2002, Collin et al., 2001). La recherche de nouvelles molécules ayant un effet comparable à la neurotrophine est une voie majeure pour la découverte de nouveaux traitements contre les maladies neuro-dégénératives (voir par exemple
US20020210837). La sensibilité et la rapidité de mise en œuvre de la méthode selon l'invention peuvent être utilisées pour mettre en évidence une perte (maladie neurodégénérative, infection par des virus neurotropes, effet associé à la présence de molécules synapto-toxiques, voir le brevet US6,444,201...) ou un gain synaptique (étude sur la régénération neuronale, la synaptogénèse, criblage d'agents anti-neurodégénératifs...) dans des systèmes de culture cellulaire (en particulier de co-cultures neurones/cellules cibles), des tranches de neurones maintenus en survie ou chez l'animal. La méthode de l'invention est aussi utile dans toutes les recherches visant à démontrer des modifications synaptiques dans des régions particulières du système nerveux (Sze et al., 2000).
La méthode peut plus particulièrement être utilisée pour le criblage de molécules susceptibles de moduler la croissance ou la stabilité de cellules contenant des vésicules synaptiques, notamment de molécules neuro- trophiques ou anti-neurodégénérafives. Elle peut être utilisée pour l'étude de molécules actives sur la formation d'axones, la synaptogénèse ou le maintien de synapses (US2002644433). Elle peut être aussi utilisée pour détecter la présence de vésicules synaptiques au sein d'une culture de cellules souches embryonnaires ainsi que pour déterminer leur phénotype par exemple au moyen d'anticorps anti-transporteur vésiculaire des neurotransmetteurs.
Dans un autre mode de mise en œuvre de la méthode selon l'invention, l'échantillon liquide est extrait de cellules isolées d'un individu en vue de l'identification ou du dosage de vésicules contenant des marqueurs neuro- endocrines.
La détection de marqueurs neuro-endocrines, parmi lesquels figure la synaptophysine, par des méthodes conventionnelles d'histologie et d'immuno-histochimie occupe une place essentielle dans le diagnostic positif et différentiel de tumeurs. La présente méthode permet avantageusement de détecter et quantifier dans un échantillon contenant des cellules issues de tumeurs, les marqueurs neuroendocrines présents dans les vésicules synaptiques, comme par exemple la synaptophysine ou une VAMP, par exemple la VAMP2 ou leurs isoformes. En particulier, la méthode se prête à la détection de la synaptophysine à partir de coupes de tumeurs de poumon, par exemple des coupes congelées d'une épaisseur de 40μm. Aussi, la présente invention vise plus préférentiellement toute utilisation de la méthode selon l'invention, pour le diagnostic positif et différentiel de tumeurs.
De manière plus générale, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour détecter toute variation de la quantité relative d'organelles dans un échantillon biologique corrélée à un traitement par un agent physiologique ou pharmacologique ou une manipulation génétique de l'organisme biologique dont est issu l'échantillon analysé.
En outre, la méthode selon l'invention peut être appliquée pour le criblage de molécules capables de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel.
En particulier, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir. Au sens de l'invention, on entend par toxine, toute molécule susceptible d'affecter les fonctions et/ou la viabilité cellulaire et dirigée contre une cible membranaire d'un organelle, entraînant une modification de la quantité du constituant membranaire ciblé ou de son interaction avec son ligand naturel. De préférence, la méthode de l'invention s'applique à la détection de neurotoxines dont les cibles sont les constituants membranaires des vésicules synaptiques. Les toxines botuliques et tétanique sont l'objet d'enjeux majeurs dans le secteur médical (traitement de troubles neurotoxiques sévères qu'elles entraînent, utilisation croissante dans les traitements locaux de dystonies), le secteur agroalimentaire (détection/recherche de la présence de toxines botuliques), les secteurs des biotechnologies (le vaccin anti-tétanique est l'une des principales productions de ce secteur) et militaires, dans la mesure où ces neurotόxines sont susceptibles d'être utilisées dans une arme biologique. Ces neurotoxines ont pour cibles les protéines de la famille SNAREs (syntaxines, VAMPs, et par exemple SNAP23 ou SNAP25), en particulier la syntaxine 1 , la VAMP2 et la
SNAP25 présentes dans la membrane des vésicules synaptiques. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est appliquée à la détection d'une toxine botulique ou de la toxine tétanique dans un échantillon susceptible d'en contenir. De préférence, pour la détection de neurotoxines, des anticorps anti-VAMP, anti-SNAP25 ou anti-syntaxine sont couplés à la biopuce. Un échantillon susceptible de contenir une neurotoxine est mis au contact d'une préparation contenant des organelles comprenant des cibles des toxines botuliques et tétanique à leur surface, en particulier des vésicules synaptiques, et la variation, ou la disparition, de protéines SNARE, est analysé en mettant au contact cet échantillon traité sur ces anticorps couplés à une biopuce. L'expérience peut être également réalisée à partir de surnageant d'un extrait cellulaire lyophilisé dans le tampon d'homogénéisation et réhydraté.
II n'existe pas, à l'heure actuelle, de méthode simple pour mesurer l'activité des toxines botuliques et tétanique sur des systèmes de culture cellulaire. La présente méthode permet d'obtenir de façon rapide et simple une quantification de l'effet de ces toxines sur des cultures cellulaires, en particulier des neurones d'hippocampes en culture ou des cellules à grains du cervelet. La méthode peut également être utilisée pour déterminer la présence de ces toxines dans un milieu supposé les contenir, pour déterminer l'innocuité de lots de vaccins, pour cribler des molécules potentiellement antagonistes de ces toxines ou pour détecter un titre d'anticorps neutralisants dans le sérum de patients traités par ces toxines ou d'animaux immunisés.
Les biopuces contenant une quantité déterminée d'organelles immobilisés à leur surface peuvent, en raison de leur stabilité remarquable, être elles- mêmes utilisées comme matériaux de départ pour la mise en œuvre d'une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle par des méthodes de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.
Un deuxième objet de l'invention concerne par conséquent une méthode de préparation d'une biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, ladite méthode comprenant : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, par exemple de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, b) la mise en contact d'un échantillon liquide contenant des organelles avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, par exemple par injection de l'échantillon liquide dans un dispositif permettant cette mise en contact, pour l'obtention d'une biopuce contenant des organelles immobilisés à sa surface, c) le cas échéant, la congélation de la biopuce obtenue à l'étape b) et sa conservation au froid, suivi d'une décongélation, ou sa lyophilisation suivie d'une réhydratation, en vue de son utilisation.
Les étapes (a) et (b) sont mises en œuvre de manière similaire aux étapes
(a) et (b) de la méthode d'identification et de dosage d'organelles décrite précédemment. De préférence, la biopuce et le dispositif choisis pour la mise en œuvre des étapes (a) et (b) sont adaptés pour une utilisation des biopuces dans un dispositif de détection optique, en particulier, dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.
De façon avantageuse, le dispositif utilisé à l'étape b) permet après injection de l'échantillon dans celui-ci le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.
Des exemples de tels dispositifs ont été décrits précédemment.
Dans un mode de réalisation préféré, les organelles contenus dans l'échantillon et ensuite immobilisés sur la biopuce sont des organelles natifs dont la membrane est restée intacte après l'extraction des cellules les contenant, conservant en particulier le même contenu protéo-lipidique que I'organelle intracellulaire avant extraction.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules de sécrétion.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules synaptiques. Comme décrit précédemment, le ligand couplé à la surface de la biopuce est alors choisi par exemple dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.
L'invention vise naturellement une biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la méthode de préparation définie ci-dessus.
Une biopuce selon l'invention, utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, est caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un support approprié pour détecter une variation de signal optique, par exemple pour détecter une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, b) des ligands couplés audit support, lesdits ligands étant susceptibles de se lier spécifiquement au constituant membranaire d'un organelle, c) des organelles immobilisés à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec lesdits ligands.
Dans un mode de réalisation particulier, le support approprié pour mesurer une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique à la surface de la biopuce est choisi parmi un support d'or ou d'argent. La biopuce peut comprendre en outre une couche de dextran permettant le couplage des ligands à sa surface. Des exemples préférés de biopuces pour biocapteurs par résonance plasmonique de surface ont été décrits précédemment.
Dans un mode de réalisation préféré, les organelles immobilisés à la surface des biopuces selon l'invention sont des vésicules synaptiques.
Dans un mode de réalisation particulier, les vésicules synaptiques sont immobilisées à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec des ligands choisis dans le groupe constitué par les anticorps anti- synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.
Un troisième objet de l'invention porte sur une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, comprenant a) l'obtention d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, par exemple de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, b) la mise en contact de l'analyte avec la surface de la biopuce contenant des organelles immobilisés, par exemple par l'injection d'un échantillon liquide contenant l'analyte dans un dispositif permettant la mise en contact de l'analyte avec la surface de la biopuce contenant des organelles immobilisés, c) la mesure d'une variation de signal optique, par exemple d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce- par réflexion optique, ladite mesure permettant la détection de la quantité d'analytes liés aux organelles immobilisés à la surface de la biopuce.
Avantageusement, la biopuce obtenue à l'étape (a) est une biopuce selon l'invention telle que définie plus haut. La biopuce est réalisée par l'immobilisation d'une quantité suffisante d'organelles nécessaires à l'analyse subséquente recherchée. Etant donné que la quantité d'organelles peut être quantifiée par la mise en oeuvre de la première méthode selon l'invention décrite plus haut, le niveau d'immobilisation d'organelles peut être contrôlé précisément selon le type d'application souhaité.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, la mesure d'une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface. De préférence, le dispositif utilisé à l'étape b) permet le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques. Des exemples de tels dispositifs ont été donnés plus haut.
La méthode permet notamment de mesurer l'affinité de toute molécule sur un constituant membranaire de I'organelle immobilisé. Elle permet de quantifier toute molécule présente dans un échantillon se liant spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle. Elle permet en outre de déterminer la présence ou non de constituant membranaire spécifique d'un organelle par détection d'une liaison entre ledit constituant membranaire et un ligand connu de celui-ci.
Tout type d'analyte peut être étudié. Il peut s'agir notamment d'une molécule ou d'un complexe supramoléculaire. A titre d'exemples, l'analyte peut être une protéine, un ADN, un lipide, un sucre, et en particulier un anticorps ou fragment d'anticorps, une enzyme, une hormone, un neuromédiateur, un récepteur, un substrat d'enzyme, une lectine, une toxine ou un agent pharmacologique. L'analyte peut également être compris dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, il peut s'agir d'un échantillon issu d'un prélèvement de tissus ou de fluide biologique tel que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive. Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou d'un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire. L'analyte peut en particulier être des anticorps dirigés contre des constituants membranaires présents à la surface des vésicules synaptiques. Il peut s'agir en particulier d'anticorps anti-phospholipides. Ces anticorps peuvent être générés lors d'une réaction auto-immune.
L'analyte peut être également compris dans une culture de cellules eucaryotes ou procaryotes, de bactéries, de champignons ou de levures.
L'analyte peut aussi être compris dans un produit agro-alimentaire, et notamment des graines, des fruits, des céréales ou des aliments cuisinés.
De préférence, l'analyte peut être complexé à des complexes de haut poids moléculaires de façon à accroître la masse de la molécule injectée et ainsi augmenter la sensibilité de la mesure. Par exemple, l'analyte peut être intégré dans des liposomes artificiels.
En particulier, il est possible de répéter les étapes (b) et (c) avec différentes concentrations d'un même analyte permettant d'obtenir les affinités de liaison de différents analytes sur un même organelle.
La méthode de l'invention telle que définie ci-dessus peut par -conséquent être appliquée au criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, notamment d'agonistes ou d'antagonistes de ligands de récepteurs membranaires.
A titre d'exemples, on injectera un échantillon contenant différentes molécules candidates susceptibles de se lier spécifiquement à un constituant membranaire suivi d'un ligand connu pour se lier spécifiquement audit constituant membranaire. Une inhibition partielle de la liaison du ligand sera significative de la présence d'un nouveau ligand parmi les molécules candidates injectées.
En outre, la présente méthode permet également la purification de nouveaux ligands spécifiquement immobilisés sur un organelle et leur analyse subséquente, par exemple par spectrométrie de masse.
La méthode vise en particulier le criblage de nouveaux ligands de marqueurs neuro-endocrines pour le diagnostic moléculaire de ces marqueurs. Dans un mode de mise en œuvre préféré, les analytes testés sont des anticorps ou fragment d'anticorps dirigés contre un constituant membranaire d'un organelle, de préférence d'une vésicule de sécrétion et notamment de vésicules synaptiques. En particulier, il s'agit d'anticorps monoclonaux.
Une autre utilisation de la méthode décrite ci-dessus concerne le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel. Les molécules recherchées peuvent par exemple être des composés capables de modifier la structure post-traductionnelle des constituants membranaires, tels que des kinases ou des phosphatases. A titre d'exemple, la méthode permet de comparer l'affinité de liaison d'un ligand naturel avec un constituant membranaire de I'organelle immobilisé sur la biopuce et l'affinité du même ligand injecté avec ou après l'injection d'une molécule susceptible de modifier l'interaction dudit ligand avec le constituant membranaire de I'organelle. Ainsi dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode comprend, préalablement à l'injection d'un ligand d'un constituant membranaire (l'analyte), l'injection d'un composé susceptible de modifier l'interaction dudit ligand avec le constituant membranaire- de
I'organelle.
La répétition des mesures de liaison de différents analytes peut être appliquée à la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, lesdits analytes étant choisis parmi des ligands connus de constituants membranaires d'organelles. Par « caractérisation », on entend la détermination de la présence sur un même organelle de différents constituants membranaires connus et le cas échéant l'évaluation de la proportion relative de chaque constituant analysé. Ces profils différentiels sont établis par exemple dans le cadre du développement d'une médecine personnalisée en particulier en vue de traitements spécifiques des cancers et des maladies neurodégénératives. L'invention permet en particulier d'établir une telle caractérisation, à partir d'organelles lyophilisés, et notamment de vésicules synaptiques lyophilisées.
Cette caractérisation peut permettre d'identifier le cas échéant des affections pathologiques, des modifications génétiques induites ou naturelles ou des traitements pharmacologiques. Des exemples de modifications du contenu en constituant membranaire de vésicules synaptiques sont décrits par exemple par Shimohama et al., 1998.
A titre d'exemple d'analytes utilisables pour la caractérisation d'organelles, en particulier de vésicules synaptiques, on pourra utiliser :
- des anticorps spécifiques dirigés contre chaque constituant membranaire de I'organelle, voire des anticorps dirigés contre différents épitopes d'un même constituant membranaire afin d'identifier des changements de conformation dudit constituant résultant par exemple d'altérations liées à une pathologie,
- des ligands spécifiques des lipides (par exemple, l'annexine V),
- tout type de ligands naturels, recombinants ou synthétiques, et notamment la calmoduline, la complexine ou l'alpha-SNAP pour la caractérisation de vésicules synaptiques.
Une application préférée de la présente méthode concerne la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir. De préférence, la méthode de l'invention s'applique à la détection de neurotoxines dont les cibles sont les constituants membranaires des vésicules synaptiques. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est appliquée à la détection d'une toxine botulique ou d'une toxine tétanique. Ces neurotoxines ont pour cibles les protéines SNARE (syntaxine 1, VAMP2 et SNAP25) présentes dans la membrane des vésicules synaptiques. L'effet de ces neurotoxines sur des vésicules synaptiques peut être analysé par la détection selon la méthode de l'invention de la liaison d'un anticorps anti- syntaxine 1, anti-VAMP2 ou anti-SNAP25 sur des vésicules synaptiques immobilisées mises en contact ou non avec un échantillon susceptible de contenir lesdites neurotoxines.
Sont également visées dans la présente invention les utilisations des biopuces contenant les organelles immobilisées à leur surface, telles que décrites plus haut,
- pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel,
- pour le criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle,
- pour la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, ou encore
- pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d|en contenir, de préférence de toxine botulique ou tétanique.
Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples présentés ci-après. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 illustre la capture spécifique d'environ 2000 RU de vésicules synaptiques sur une biopuce par le moyen d'anticorps anti- synaptophysine 171B5. Sn10 : fraction subcellulaire Sn10 diluée au 1/20 non pré-incubée avec l'anticorps 171 B5 et injectée sur une biopuce à laquelle est couplé l'anticorps 171B5
Sn10 en présence d'un excès d'anticorps anti-synaptophysine : fraction subcellulaire Sn10 diluée au 1/20 et pré-incubée avec l'anticorps 1.71 B5 injectée sur une biopuce à laquelle est couplé l'anticorps 171 B5
Figure 2 : La Figure 2 illustre la capacité d'une solution d'octylglucoside 100 mM à régénérer les vésicules synaptiques immobilisées sur un anticorps anti-synaptophysine 171B5. Chaque cycle est constitué par une injection de fraction Sn10 diluée, suivi par une injection d'octylglucoside 100 mM (40 μl à 5 μl/mn).
Figure 3 :
La Figure 3 illustre la capture de vésicules synaptiques à partir de lysats de neurones d'hippocampe en culture, ensemencées à différentes densités. Lysat de 28800 cellules Lysat de 9000 cellules
Lysat de 4500 cellules.
Figure 4 : 23 échantillons issus de prélèvements de tumeurs pulmonaires ont été analysés pour la présence de marqueurs neuro-endocrines.
La ligne horizontale représente le niveau de signal au-delà duquel la détection est considérée comme positive (4 unités de résonance valeur en dessous de laquelle le signal n'est plus considéré comme fiable). Tumeurs à petites cellules représentées par des losanges. Tumeurs non petites cellules représentées par des carrés. Prélèvements sains (contrôle) représentés par un triangle.
Figure 5 : La figure 5 illustre la mise en évidence d'une variation de la quantité de vésicules synaptiques dans des neurones en culture traités par un facteur neurotrophique
Cellules traitées : neurones d'hippocampe (20000 cellules/cm2) traités après 7 jours de mise en culture avec 37.5 ng/ml de BDNF (Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) durant 7 jours. Cellules non traitées : neurones d'hippocampe cultivés dans les mêmes conditions non traités.
Figure 6 : La figure 6 illustre l'effet de la toxine botulique B (Bont/B) sur l'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuce.
Le Sn10 préalablement incubé avec une gamme de concentration de toxine durant 20 heures est analysé sur une biopuce couplée avec un anticorps anti-VAMP, anti-synaptophysine ou anti-synaptogyrine.
La biopuce comprend deux à quatre pistes d'analyse placées en série : un anticorps non spécifique est capturé sur la piste contrôle (700 pg) et un anticorps anti-VAMP sur la piste test (700 pg). L'analyse du Sn10 (après 20 heures d'incubation à 37°C) permet de doser des vésicules synaptiques sur la biopuce. La présence de toxine BoNT/B abolie le signal sur l'anticorps anti-VAMP2. La sensibilité est de 3fM, ce qui permet de détecter une quantité de 0.04 pg de toxine (expérience représentative de trois expériences indépendantes analysées en triplicate). Figure 7 : Exemple de caractérisation de vésicules synaptiques issues de neurones en culture traités ou non à la toxine tétanique.
La culture est traitée (cellules traitées) ou non traitée (cellules non traitées) avec la toxine tétanique (100 ng/ml) pendant 39 heures. Les anticorps spécifiques des vésicules synaptiques sont ensuite injectés successivement :
1 : anti-CSP (Cysteine String Protein)
2 : anti-pompe à proton
3 : anti-transporteur vésiculaire du glutamate
4 : anti-SNAP25 5 : anti-synapsine
6 : anti-SV2A
7 : anti-synaptotagmine
8 : anti-synaptogyrine
9 : anti-synaptophysine 10 : anti-VAMP Nt polyclonal
11 : anti-VAMP 1H7 12 : anti-VAMP 60-88 13 : anti-VAMP 3D10
Figure 8 : La figure 8 illustre une courbe de calibration pour le dosage de la synaptophysine.
Une gamme de dilution de Sn10 (contenant une concentration connue de synaptophysine) est injectée sur un anticorps anti-synaptophysine. Les échantillons sont injectés à un débit de 5 μl/mn. La vitesse de liaison des vésicules synaptiques est constante et proportionnelle à la quantité de synaptophysine présente dans l'échantillon. L'encart montre que la linéarité est observée sur une gamme étendue de concentration de synaptophysine. En estimant qu'il existe environ 20 copies de synaptophysine par vésicule synaptique, un deuxième axe des abscisses permet de relier l'amplitude du signal SPR à la concentration de vésicules synaptiques présentes dans le milieu. EXEMPLES
1. Matériels et méthodes
1.1 Anticorps
L'anticorps anti-synaptophysine utilisé pour la capture des vésicules synaptiques est l'anticorps 1 1 B5 (Lévêque et al. 2000).
Les anticorps monoclonaux anti-synaptotagrnine I CL 41.1 , anti-synaptogyrine Cl 80.1 , anti-synapsine I Cl 46.1 and anti-Rab5 Cl 621.3 et anti-VAMP2 : Cl 69.1 sont commercialisés par la société Synaptic Systems.
Les anticorps polyclonaux anti-bassoon et l'anticorps monoclonal . anti- syntaxinl 3 sont commercialisés par la société Stressgen.
L'anticorps polyclonal anti VAMP2 Nter (dirigé contre la partie Nter de la VAMP, Léveque et al. 2000) et anti-VAMP 60-88 (anticorps polyclonal dirigé contre le peptide 60-88 de la VAMP2 de rat) ont été fournis par le laboratoire du Dr Takahashi (Mitsubishi Kasei Institute of Life Science, Tokyo, Japan). Les anticorps 1 H7 et 3D10 (monoclonaux anti VAMP2 dont les épitopes sont localisés dans la région 19-59 de la VAMP2 de rat), ainsi que l'anticorps anti SNAP 25( BR05, Lévêque et al, 2000) ont été fournis par le Dr Kosaki ( Department of Veterinary Science, Collège of Agriculture, Osaka Préfecture University, Sakai, Osaka, Japan). Les anticorps monoclonaux anti-syntaxine : 6D2, 9H1 , 4D4, 10F5, 6H1 ont aussi été fournis par ie laboratoire du Dr Takahashi ainsi que les anticorps anti-synaptotagmine (1 D12 et anti région Nterminales de la synaptotagmine I), anti-CSP (Lévêque et al. 2000), anti-Rab3A, Munc 18, NSF, sortilline, complexine, GluR2, Neurexine,alpha-beta SNAP et synaptophysine (6H2 dirigé contre une région luminale)
L'anticorps monoclonal anti-synapsine lia est commercialisé par la société Translaboratories. L'anticorps anti-SV2A de la Developmental Studies Hybridoma Bank a été développé par le NICHD et conserve par l'université de l'Iowa, Department of biological Sciences, lowa City, IA 52242. Les IgG non immun de souris IgGNIS (IgG non spécifiques) ont été obtenus auprès d'Interchim.
1.2 Préparation des vésicules synaptiques issues de cerveau de rai
La procédure de fractionnement est basée sur les travaux de Lévêque et al. 2000.
Un cerveau de rat frais est homogénéisé avec un homogénéisateur Teflon dans 10ml d'un tampon de sucrose froid (10 mM HEPES, NaOH, 0.32 M sucrose,1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride, pH 7.4). L'échantillon homogénéisé est centrifugé à 10000xg pendant 15 minutes. Le surnageant (Sn10) (contenant environ 3 mg de protéines/ml) est filtré et utilisé immédiatement ou conservé à -20°C ou lyophilisé pour une utilisation ultérieure.
1.3 Méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique Toutes les expériences décrites ci-après ont été réalisées sur un biocapteur de type Biacore (Biacore X ou Biacore 3000). La température du biocapteur est contrôlée à 25°C. Toutes les expériences ont été effectuées avec une piste contrôle placée en série et une piste test ou expérimentale. Tous les résultats présentés correspondent à des mesures spécifiques (signal de la piste contrôle soustrait du signal de la piste test) exprimées en unités de résonance (RU): une unité de résonance correspond à une masse de 1 pg d'équivalent protéique avec la technologie Biacore.
Les expériences de caractérisation ont été réalisées sur une biopuce (sensor chip CMS. Le protocole d'immobilisation est le même que celui utilisé pour la biopuce CMS. Après immobilisation des vésicules synaptiques, la surface de la biopuce est saturée avec 50 μl d'un anticorps IgGNIS (50μg/ml) à 15 μl/min avant la mise en contact des anticorps spécifiques. Exemple 1 : Contrôle de la spécificité de l'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuces
La figure 1 illustre la capture spécifique de vésicules synaptiques, immobilisées sur biopuces. Une fraction Sn10 contenant des vésicules synaptiques est diluée dans un tampon TBS à une concentration en protéines de 0.15 mg/ml, et préincubée ou non avec un excès d'anticorps anti-synaptophysine (100 μg/ml). Les échantillons sont ensuite injectés (50 μl à 5μl/min) sur une biopuce sur laquelle ont été préalablement immobilisés 0,5 ng d'anticorps anti- synaptophysine dans la piste test et 0,5 ng d'anticorps non immun dans la piste contrôle.
La figure 1 illustre la capture spécifique d'environ 2 ng d'équivalent protéique de vésicules synaptiques sur une biopuce par Je moyen d'anticorps anti- synaptophysine 171B5. L'anayse du taux d'immobilisation de chaque préparation permet de mesurer une inhibition de 88% de l'immobilisation de vésicules synaptiques lorsque la fraction Sn10 a été pré-incubée avec l'anticorps 171B5. Le signal généré par l'immobilisation des vésicules synaptiques est spécifique au regard des critères suivants : • le passage de l'échantillon biologique sur une piste « contrôle » sur laquelle est couplée un anticorps non spécifique génère un signal qui ne représente que 5 à 10% du signal recueilli sur la piste « expérimentale ».
Les analyses immunologiques et morphologiques démontrent que ce signal non-spécifique mesuré sur la piste contrôle ne correspond pas à des protéines des vésicules synatiques, • la préincubation de la fraction Sn10 avec un excès de l'anticorps spécifique inhibe largement la liaison des vésicules sur la piste expérimentale, l'utilisation d'anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiques d'autres organelles ne génère aucun signal spécifique alors qu'une majorité d'anticorps spécifique des vésicules synaptiques génère un signal positif comme le montre le tableau 1 ci-après. Tableau 1: Caractérisation immunologique sur biopuce du matériel immobilisé avec mAb anti-synaptophysine (171B5) couplée avec un anticorps anfiFcγ.
- signal < 0 RU
+ signal 0-10 RU ** ivi : monoclonal
++ signal 10-50 RU P : polyclonal
+++ signal > 50 RU * Produits commercialisés En outre, l'analyse en microscopie électronique permet d'observer des vésicules sphériques de diamètre voisin de 50 nm immunomarquees par un anticorps anti-VAMP (résultats non présentés).
Exemple 2 : Régénération de la biopuce
Plusieurs immobilisations consécutives de faible quantité peuvent être réalisées sur la même biopuce. Néanmoins, les inventeurs ont développé des procédés de régénération des biopuces permettant de mettre en œuvre les méthodes selon l'invention sur une même biopuce plusieurs centaines de fois.
Les inventeurs ont sélectionné un anticorps monoclonal anti-synaptophysine présentant une cinétique de dissociation' rapide, atypique par rapport à la plupart des anticorps anti-vésicules synaptiques. Une injection prolongée d'une solution de détergent concentrée (comme par exemple l'octylglucoside à 100 mM) permet de régénérer totalement l'interaction synaptophysine/anti- synaptophysine tout en solubilisant la membrane des vésicules.
Après immobilisation d'un anticorps de souris non spécifique (1 ,4 ng) sur la piste contrôle, et d'un anticorps anti-synaptophysine sur la piste expérimentale (1 ,4 ng), 6 μl de la fraction Sn10 (0,5 mg/ml ) sont injectés. Chaque cycle est constitué par une injection de l'échantillon Sn10, suivi par une injection d'octylglucoside 100 mM (40 μl à 5 μl/mn). Comme le montre la figure 8, la décroissance de capture est limitée (23% de perte sur 40 cycles) et linéaire dans le temps ce qui permet de la prendre en compte dans un programme d'injections/ régénérations.
Une quarantaine de cycles régénération/immobilisation est donc possibl avec l'octylglucoside sur le même anticorps couplé à la biopuce.
Les inventeurs ont également immobilisé un anticorps monoclonal anti- vésicules synaptiques) par un anticorps anti-Fc. Tout en conservant les propriétés d'immobilisation décrites ci-dessus, cette procédure présente en outre l'avantage d'orienter de façon fonctionnelle l'anticorps anti-vésicules synaptiques. En sélectionnant un anticorps anti-Fc peu sensible au choc de pH, la biopuce contenant les organelles immobilisés peut être régénérée plusieurs dizaines de fois à un pH acide.
L'utilisation alternée de ces deux protocoles permet de réaliser plusieurs centaines de dosage sur une seule biopuce.
Exemple 3 : Détection de vésicules synaptiques issues de quantités différentes de neurones en culture et analyse de la sensibilité de la méthode selon l'invention
Des cultures primaires de neurones d'hippocampe sont préparées à partir d'embryons de rat de 18 jours selon la méthode décrite dans Garrido et al., 2001. Quatre lamelles par boîte de culture sont ensemencées avec différentes densités de cellules dissociées. Au jour J14, les cellules sont lavées trois fois avec du tampon PBS. Les cellules sont ensuite lysées 3 minutes avec 500 μl (par boîte de culture) de tampon de lyse (5 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,4 ) et remises en suspension par grattage. Les cellules lysées sont passées 9 fois au travers d'une aiguille 27G et centrifugées 15 minutes à 12000 x g à 4°C. Les surnageants cellulaires sont injectés (100 μl à 1μl/min) sur la biopuce fonctionnalisée avec un anticorps anti-synaptophysine (171 B5).
La sensibilité de la méthode de détection d'organelles selon l'invention est ainsi illustrée par l'expérience suivante : en effectuant des dilutions d'un lysat de culture de neurones à 20000 cellules /cm2 et par extrapolation, il a en effet été déterminé qu'il était possible de détecter la présence de vésicules issues d'un équivalent de deux neurones. La méthode selon l'invention, rapide et sensible, est ainsi particulièrement bien adaptée à la détection d'organelles dans des biopsies ou des prélèvements de fluides biologiques, notamment des prélèvements sanguins.
Exemple 4 : Utilisation de la méthode de détection d'organelles au diagnostic de tumeurs de poumon à petites cellules
21 prélèvements de tumeurs de poumon (xénogreffes) et 2 de poumons sains ont été fournis par le laboratoire de M. F. Poupon (Institut Curie). Chaque prélèvement est homogénéisé dans un tampon 5mM HEPES-NaOH, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH7,4 (10 mg de tumeur par ml de tampon). Les échantillons sont ensuite centrifugés 30 min à 10000 x g. Le surnageant est dilué 40 fois dans un tampon 10 mM HEPES-NaOH, 0.4 M NaCI, pH 7.4, contenant de la spermine 1 mM avant d'être injecté (40μl à 5μl/min). La biopuce est couplée avec un anticorps anti-synaptophysine (171B5). Les 23 prélèvements ont été analysés. Les résultats sont présentés à la figure 4.. Les 9 échantillons provenant de tumeurs à petites cellules (dont la caractéristique est de contenir des marqueurs neuroendocrines) sont positifs ainsi que 3 échantillons de tumeurs « non petites cellules ». Il est cependant attendu que 10 à 30% d'échantillons non petites cellules contiennent néanmoins aussi des marqueurs neuro-endocrines (Camaghi C. et al., 2001). La ligne horizontale représente le niveau de signal au-delà duquel la détection est considérée comme positive (4 unités de résonance valeur au dessous de laquelle le signal n'est plus considéré comme fiable). Les résultats démontrent que la méthode de l'invention est adaptée à la détection et la quantification des marqueurs neuro-endocrines, notamment pour le diagnostic positif et différentiel des tumeurs.
Eîiemple 5 : Détection d'une modification du nombre de vésicules synaptiques issues de neurones traités par un facteur neurotrophique
Les neurones d'hippocampe (20000 cellules/cm2) sont traités après 7 jours de mise en culture avec 37.5 ng/ml de BDNF (Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) durant 7 jours. Après lyse hypotonique des neurones, les surnageants de lyse sont injectés (100μl à 1 μl /min) sur 0.7 ng d'anticorps anti-synaptophysine ou d'anticorps non spécifiques. Comme le montre la figure 5, le traitement par le BDNF induit une modification du signal de détection des vésicules synaptiques, dès le départ de l'injection, confirmée par l'obtention d'un plateau plus élevé (% d'augmentation : 29% +/- 4.8, n = 3 ).
Exemple S : Détection de la toxine botulique B par perte d'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuces
L'expérience consiste à mesurer une perte de liaison de vésicules synaptiques de cerveau de rat, sur un anticorps anti-VAMP, consécutivement à l'incubation avec la toxine botulique B. L'anticorps monoclonal anti-VAMP utilisé pour capturer les vésicules est dirigé contre la partie Nterminale de la. VAMP (Cl 69.1). Les toxines Botuliques B et E purifiées ont été fournies par le laboratoire du Dr Kosaki (Department of Veterinary Science, Collège of
Agriculture, Osaka Préfecture University, Sakai, Osaka, Japan).
La biopuce comprend deux à quatre pistes d'analyse placées en série : un anticorps non spécifique est capturé sur la piste contrôle (700 pg) et un anticorps anti-VAMP sur la piste test (700 pg). Dans certaines expériences, des anticorps anti-synaptophysine (171B5) ou anti-synaptogyrine (1D12) ont également été placés en série sur les deux pistes suivantes afin de vérifier l'intégrité de la préparation vésiculaire pour des temps d'incubation prolongés.
Il a été constaté qu'il est possible de détecter la présence de toxine (1-10 pM), après des temps d'incubation de 0,5 - 1,5 heures (80% de clivage à 10 pM 30min à 37°C) (résultats non montrés). Cependant une meilleure sensibilité a été obtenue pour des temps d'incubation plus longs par exemple de 12 à 20 heures comme dans l'exemple de la figure 6. Seul l'épitope de VAMP disparaît. Il n'y a pas de diminution de capture de ces mêmes vésicules sur un anticorps anti-synaptophysine ou anti-synaptogyrine. La fraction Sn10 (3 mg/ml) a été préparée en présence de DTT 5 mM sans autres inhibiteurs de protéases.
La toxine concentrée (0,6 μM) est incubée 45 min à 37°C dans un tampon
HEPES-NaOH 10 mM, DTT 10mM, NaCI 0,15M, pH 7,4. La fraction Sn10 est diluée 3000 fois dans le tampon de clivage : 50 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 20 mM ZnCI2, 0,02% BSA, 0,16mM DTT, pH 7,4 puis incubée en présence ou non de concentrations variables de toxine. A la fin de l'incubation, la concentration en NaCI est ajustée à 0,4 M et une partie de l'échantillon est injectée sur la biopuce.
Sur un appareil de type Biacore, l'échantillon (50 μl ) est injecté à un débit de 2 μl/min. Le tampon de course est constitué par 10 mM HEPES-NaOH, 0,15 M NaCI, pH 7,4.
11 a été observé que la toxine botulique B (600 pM) chauffée à 80°C ou bien non réduite ainsi que la toxine botulique E (600 pM), utilisée comme un contrôle négatif, sont inactives dans ce test (expériences effectuées sur des temps courts).
La limite de détection est de l'ordre de 3 fM de toxine botulique B (environ 0,04 pg de toxine) soit 0,45 pg/ml. La présence de DTT et la dilution importante de la fraction Sn10 sont deux paramètres importants permettant de mesurer une immobilisation de vésicules synaptiques incubées à 37°C durant plusieurs heures. Le dosage d'activité de la toxine botulique B est à l'heure actuelle, effectué très souvent in vivo par DL50 chez la souris (US20030143651). Il possède une sensibilité supérieure aux- tests in vitro. La méthode de la présente invention appliquée au dosage de la toxine botulique telle que décrite ci-dessus s'avère 250 fois plus sensible que le test de détection d'activité de la toxine botulique B in vivo. Exemple 7 : Caractérisation de vésicules synaptiques provenant de neurones en culture traitées ou non à la toxine tétanique
Pour cette expérience, la toxine tétanique a été fournie par le Dr Boquet (INSERM U452, Nice). Les neurones d'hippocampe sont cultivés comme décrit dans la figure 3. La culture est traitée ou non avec la toxine tétanique (100 ng/ml) pendant 39 heures. Après lyse hypotonique, les vésicules synaptiques (environ 2 ng d'équivalent protéique) sont immobilisées sur un anticorps anti- synaptophysine. La biopuce est alors saturée avec un anticorps non spécifique de souris.
Les anticorps spécifiques des vésicules synaptiques sont ensuite injectés successivement (20 μl à 30 μg/ml, 15 μl/min). Chaque injection est précédée par une injection d'anticorps non spécifique à la même concentration. Les pourcentages d'inhibition de liaison des anticorps anti-VAMP par l'action de la toxine tétanique sont respectivement de 94%, 87%, 87% et 89% comme illustré par la figure 7.
Exemple 8 : Linéarité de la courbe dose-réponse pour la détection de la synaptophysine et ou des vésicules synaptiques à partir de Sn10.
Différentes dilutions de Sn10 contenant des concentrations connues de synaptophysine sont réalisées dans un tampon TBS. Ces dilutions sont injectées à 5 μl/min sur une biopuce sur laquelle ont été préalablement immobilisées 0,8 ng d'anticorps anti- synaptophysine sur la piste test et 0,8 ng d'anticorps non immun sur la piste contrôle. Les injections sont réalisées à débit lent et dans des conditions non saturantes pour l'anticorps spécifique (utilisation de 1 à 2% de la capacité de capture de l'anticorps). La vitesse de liaison des vésicules synaptiques est alors une droite dont la pente est calculée et reportée en fonction de la concentration de synaptophysine contenue dans l'échantillon. En se basant sur l'estimation qu'il existe environ 20 copies de synaptophysine par vésicule synaptique (Fernandez Chacon et Sudhof 1999), il est également possible de déterminer la concentration de vésicules synaptiques de l'échantillon injecté. On obtient ainsi une courbe de calibration pour le dosage de la synaptophysine et/ou des vésicules synaptiques. La limite de détection est de 50 attomoles (2pg) de synaptophysine (2,5 attomoles de vésicules synaptiques), ce qui correspond à un gain de sensibilité de 60 par rapport au dosage de cette protéine en ELISA (Schiaf ef a/, 1996).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'identification ou de dosage d'organelles dans un échantillon liquide caractérisée en ce qu'elle comprend : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire des organelles à identifier ou à doser, b) la mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, c) la détection d'une variation de signal optique, ladite détection permettant l'identification et/ou le dosage de la quantité d'organelles liés à la surface de la biopuce.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la méthode de détection optique est une méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce est obtenue par injection de l'échantillon liquide dans un dispositif permettant cette mise en contact , par exemple au moyen de circuits microfluidiques.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon liquide est extrait de cellules neuronales en vue de l'identification et/ou du dosage de vésicules synaptiques.
5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps dirigés contre un constituant de la membrane des vésicules synaptiques.
6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.
7. Méthode selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que la biopuce est régénérée au moyen d'une solution de détergent concentré, par exemple l'octylglucoside.
8. Méthode selon l'une quelconque des, revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon liquide est extrait de cellules isolées ou d'un fluide biologique prélevé d'un individu en vue de l'identification ou du dosage de vésicules contenant des marqueurs neuro-endocrines.
9. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la détection d'une variation de la quantité relative d'organelles dans un échantillon biologique corrélée à un traitement par un agent physiologique ou pharmacologique ou une manipulation génétique de l'organisme biologique dont est issu l'échantillon biologique analysé.
10. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour le criblage de molécules capables de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec un ligand naturel.
11. Utilisation de la méthode selon la revendication 4, pour le criblage de molécules susceptibles de moduler la croissance de cellules contenant des vésicules synaptiques, notamment de molécules neuro- trophiques ou anti-neurodégénératives.
12. Utilisation de la méthode selon la revendication 7 ou 8, pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un patient atteint de maladies neuro- dégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
13. Utilisation de la méthode selon la revendication 7, pour le diagnostic positif et différentiel de tumeurs.
14. Méthode de préparation d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, ladite méthode comprenant : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, b) la mise en contact d'un échantillon liquide contenant des organelles avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, permettant ainsi l'obtention d'une biopuce contenant des organelles immobilisés à sa surface, c) le cas échéant, la congélation de la biopuce obtenue à l'étape b) et sa conservation au froid, suivi d'une décongélation, ou sa lyophilisation suivie d'une réhydratation, en vue de son utilisation.
15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que le dispositif de détection optique choisi est un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique fondé sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.
16. Méthode selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que la mise en contact d'un échantillon liquide avec la surface de la biopuce est obtenu par un dispositif permettant le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules d'exocytose ou de sécrétion.
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules synaptiques.
19. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.
20. Biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par une méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 19.
21. Biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un support approprié pour détecter une variation de signal optique, par exemple une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, b) des ligands couplés audit support, lesdits ligands étant susceptibles de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, c) des organelles immobilisés à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec lesdits ligands.
22. Biopuce selon la revendication 21 , caractérisée en ce que les organelles immobilisés à sa surface sont des vésicules synaptiques.
23. Biopuce selon la revendication 21 , caractérisée en ce que les vésicules synaptiques sont immobilisées à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec des ligands choisis dans le groupe constitués par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti- VAMP2.
24. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce que le support approprié pour détecter une variation de signal optique est un support approprié pour mesurer une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, choisi parmi un support d'or ou d'argent.
25. Méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle comprenant : a) l'obtention d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection optique, par exemple de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, b) la mise en contact de l'analyte avec la surface de la biopuce contenant des organelles immobilisés, c) la mesure d'une variation de signal optique, ladite mesure permettant la détection de la quantité d'analytes liés aux organelles immobilisés à la surface de la biopuce.
26. Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que la biopuce obtenue à l'étape (a) est une biopuce selon l'une quelconque des revendications 19 à 24.
27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, caractérisée en ce que la mesure d'une variation de signal optique est une mesure de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.
28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisée en ce que la mise en contact dé l'analyte avec la surface de la biopuce est obtenu avec l'injection de l'échantillon liquide dans un dispositif permettant le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.
29. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 28 pour le criblage de molécules capables de se lier, spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, notamment d'agonistes ou d'antagonistes de ligands de récepteurs membranaires.
30. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 28 pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel.
31. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 28 pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir.
32. Utilisation selon la revendication 31, dans laquelle la toxine à détecter est une toxine botulique ou la toxine tétanique.
33. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 28 à la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, lesdits analytes étant choisis parmi des ligands connus de constituants membranaires d'organelles.
34. Utilisation d'une biopuce selon l'une quelconque des revendications
19 à 24,
- pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaires à se lier avec son ligand naturel,
- pour le criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle,
- pour la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, ou, - pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir, notamment de toxine botulique ou tétanique.
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