EP1668163A2 - Procede pour le diagnostic/pronostic du neuroblastome - Google Patents

Procede pour le diagnostic/pronostic du neuroblastome

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Publication number
EP1668163A2
EP1668163A2 EP04805718A EP04805718A EP1668163A2 EP 1668163 A2 EP1668163 A2 EP 1668163A2 EP 04805718 A EP04805718 A EP 04805718A EP 04805718 A EP04805718 A EP 04805718A EP 1668163 A2 EP1668163 A2 EP 1668163A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
expression
specific
target gene
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04805718A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Valérie COMBARET
Alexander Krause
Alain Puisieux
Bruno Lacroix
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Centre Leon Berard
Original Assignee
Biomerieux SA
Centre Leon Berard
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Centre Leon Berard filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1668163A2 publication Critical patent/EP1668163A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the present invention relates to a method for the prognosis of neuroblastoma.
  • Neuroblastoma is in frequency the second cause of solid tumor in children after brain tumors. Neuroblastoma is the most common cancer in children before the age of five and accounts for around 15% of cancers before this age.
  • Neuroblastomas are malignant tumors developed from neuroblasts born from the neural crest and migrating to form the sympathetic glands and the adrenal medulla during the embryonic and fetal period.
  • this assessment includes: examinations by samples (blood, urine),> various radiological examinations which aim to properly locate the tumor, its limits and its size (scintigraphy, ultrasound and / or scanner and / or MRI), microscopic examinations of tumor fragments to find out exactly what type of tumor it is
  • various radiological examinations which aim to properly locate the tumor, its limits and its size (scintigraphy, ultrasound and / or scanner and / or MRI), microscopic examinations of tumor fragments to find out exactly what type of tumor it is
  • loco-regional treatments surgery and radiotherapy
  • chemotherapy general treatments
  • the treatment of the patient can be adapted according to the prognosis of the neuroblastoma and the therapeutic strategy can be very different depending on the stage and the genetic characterization of the tumor cells.
  • the treatment in the localized forms whose tumor cells do not carry any character of bad prognosis, the treatment is essentially critical while in localized forms whose tumor cells have a poor prognosis, treatment should be more aggressive, based on chemotherapy and local radiotherapy.
  • there are at present different classifications of neuroblastoma making it possible to define prognostic groups as precisely as possible. These groups theoretically make it possible to define the therapeutic indications in a manner adapted to the risk of the disease.
  • stage 1 localized tumor completely removed annacroscopically; homo and contralateral nodes examined and negative microscopically> stage 2A: unilateral tumor removed incompletely with homo and contralateral nodes examined and negative. stage 2B: unilateral tumor with homolateral and non-contralateral lymph node involvement. > stage 3: non-operable unilateral tumor showing an overstepping of the midline or unilateral tumor with lymph node involvement or tumor straddling the midline with bilateral extension by infiltration or lymphadenopathy. stage 4: primary tumor with distant dissemination: lymph node, bone, medullary, hepatic.
  • stage 4S local stage 1 or 2 tumor with limited spread to the liver, skin or bone marrow.
  • the 4S stages are children aged less than one year.
  • the prognosis of a neuroblatoma can be established by the study of different factors: 1) the amplification of the N-myc oncogene is considered as a reference tool, and is used by most pediatric oncologists to define , at the time of diagnosis, patients who must receive intensive miotherapy followed by marrow transplant (Seeger et al, N Engl J Med. 1985; 313 (18): III-6; Rubie et al J Clin Oncol. 1997 Mar; 15 (3): 1171-82.).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the level of LDH could also be an independent prognostic factor and predominant for the localized stages I to read in the child of more than one year, and less importantly in the child of less '' one year with stage IV (Berthold et al, Am J Pediatr Hematol Oncol. 1994; 16 (2): 107-15).
  • the correlation between the amplification of the N-myc oncogene and the prognosis of neuroblastoma is not absolute (Maris & Matthay, J Clin Oncol, 1999, 17 (7): 2264-2279).
  • the present invention proposes to solve all the drawbacks of the state of the art by presenting a new neuroblastoma prognosis tool.
  • the inventors have demonstrated that the prognosis of a neuroblastoma can be determined by analysis of the expression of target genes selected from 37 genes as presented in Table 1 below, which are expressed differentially depending on whether the patient has a good or a poor prognosis.
  • the present invention relates to a method for the prognosis of neuroblastoma in a patient suffering from neuroblastoma, characterized in that it comprises the following steps: a. biological material is extracted from a biological sample taken from the patient, b. the biological material is brought into contact with at least one specific reagent chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having any of SEQ ID Nos. 1 to 37, it being understood that when the target gene has a sequence nucleic acid having one of SEQ ID Nos.
  • the biological material is brought into contact with at least two specific reagents chosen from the reagents specific for target genes having a nucleic sequence having any of SEQ ID N ° 1 to 37, c. determining the expression of at least one of said target genes, it being understood that when the target gene has a nucleic sequence having one of SEQ ID No. 11 5 17 or 37, determining the expression of at least two of said target genes
  • the term “biological sample” is understood to mean any sample taken from a patient, and likely to contain biological material as defined below.
  • This biological sample can in particular be a sample of blood, serum, saliva, tissue, tumor, bone marrow, circulating cells of the patient
  • This biological sample is available by any type of sample known to those skilled in the art.
  • the biological sample taken from the patient is a tissue sample, preferably a tumor or bone marrow sample.
  • the term “biological material” means any material making it possible to detect the expression of a target gene.
  • the biological material can in particular comprise proteins, or nucleic acids such as in particular deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • the nucleic acid can in particular be an RNA (ribonucleic acid).
  • the biological material comprises nucleic acids, preferably, RNAs, and even more preferably total RNAs.
  • Total RNA includes transfer RNA, messenger RNA (mRNA), such as mRNA transcribed from the target gene, but also transcribed from any other gene and ribosomal RNA.
  • This biological material comprises material specific for a target gene, such as in particular the mRNAs transcribed from the target gene or the proteins derived from these mRNAs but can also comprise material not specific for a target gene, such as in particular the mRNAs transcribed from a gene other than the target gene, tRNAs, rRNAs derived from genes other than the target gene.
  • the biological material is extracted from a biological sample by all the protocols for the extraction and purification of nucleic acids well known to those skilled in the art.
  • the extraction of nucleic acids can be carried out by: • a step of lysis of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the patient's cells.
  • lysis methods as described in patent applications: o WO 00/05338 on mixed magnetic and mechanical lysis, o WO 99/53304 on electric lysis, o WO 99/15321 on mechanical lysis.
  • Those skilled in the art will be able to use other well-known lysis methods, such as thermal or osmotic shocks or lyses created by chaotropic agents such as guanidium salts (US 5,234,809).
  • a purification step allowing the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step. This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids, and can be adapted to the purification of DNA or RNA.
  • nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in the patent applications: WO-A- 97/45202 and WO-A- 99/35500.
  • Another interesting example of a nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R.
  • Magarose (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344).
  • Another very relevant but not exclusive method for the invention is that of adsorption on a metal oxide support (Xtrana company: Xtra-Bind TM matrix).
  • Xtrana company Xtra-Bind TM matrix.
  • phenol, chloroform and alcohol When it is desired to specifically extract DNA from a biological sample, it is possible in particular to carry out an extraction with phenol, chloroform and alcohol to remove the proteins and precipitate the DNA with 100% tethanol. The DNA can then be pelletized by centrifugation, washed and redissolved.
  • it is desired to specifically extract the RNAs from a biological sample it is possible in particular to carry out an extraction with phenol, chloroform and alcohol to remove proteins and precipitate RNA with 100% ethanol. The RNA can then be pelleted by centrifugation, washed and redissolved.
  • the term “specific reagent” means a reagent which, when it is brought into contact with biological material as defined above, binds with the specific material of said target gene.
  • the specific reagent and the biological material are of nucleic origin, bringing the specific reagent into contact with the biological material allows the specific reagent to hybridize with the specific material of the target gene.
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments are held together with stable and specific hydrogen bonds to form a double stranded complex.
  • hybridization can be partial (we then speak of nucleotide fragments or sufficiently complementary sequences), that is to say that the double-stranded complex obtained comprises A-T bonds and CG bonds making it possible to form the double-stranded complex, but also bases not linked to a complementary base.
  • Hybridization between two nucleotide fragments depends on the operating conditions which are used, and in particular on the stringency. Stringency is defined in particular as a function of the base composition of the two nucleotide fragments, as well as by the degree of mismatch between two nucleotide fragments.
  • the stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by a person skilled in the art. In general, depending on the length of the nucleotide fragments that one wishes hybridize, the hybridization temperature is between approximately 20 and 70 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in a saline solution at a concentration of approximately 0.5 to 1 M.
  • a sequence, or nucleotide fragment, or oligonucleotide, or polynucleotide is a sequence of nucleotide motifs assembled together by phosphoric ester hedges, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, capable of slipping to a nucleotide fragment, the sequence may contain monomers of different structures and be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and or by chemical synthesis.
  • a motif is derived from a monomer which may be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogenous base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thvrnine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; by way of example, the modification can take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethyla ⁇ r ⁇ ino-5-deoxyuridine, diarnino-2,6-purine, bromo -5 deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyribose by
  • the specific reagent comprises at least one amplification primer.
  • the term “amplification primer” is intended to mean a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleic units, preferably from 15 to 30 nucleic units allowing the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular a reaction of enzymatic amplification.
  • the amplification primer comprises a sequence chosen from SEQ ID N ° 38 to 41 and SEQ ID N ° 44 to 45.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a nucleotide fragment by the action of at least one enzyme.
  • Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be mentioned in particular: - PCR (Polymerase Chain Reaction), as described in the US patents
  • the specific reagent comprises at least
  • the specific material of the target gene then preferably comprises a complementary DNA obtained by reverse transcription of messenger RNA derived from the target gene (this is called cDNA specific for the target gene) or a complementary RNA obtained by transcription of the cDNA specific for a gene target (this is called cRNA specific for the target gene).
  • cDNA specific for the target gene messenger RNA derived from the target gene
  • cRNA specific for the target gene a complementary RNA obtained by transcription of the cDNA specific for a gene target
  • the specific reagent of step b) preferably comprises a hybridization probe.
  • hybridization probe is intended to mean a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleic units, in particular from 10 to 35 nucleic units, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with the specific material of a target gene.
  • the specific material of the target gene can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA derived from the target gene (we then speak of mRNA specific for the target gene), a nucleotide sequence included in a complementary DNA obtained by reverse transcription of said messenger RNA (we then speak of cDNA specific for the target gene), or also a nucleotide sequence included in a complementary RNA obtained by transcription of said cDNA as described above (we will then speak of cRNA specific for the target gene).
  • the hybridization probe can comprise a marker allowing its detection. By detection is meant either a direct detection by a physical method, or an indirect detection by a detection method using a marker. Many detection methods exist for the detection of nucleic acids.
  • marker is meant a
  • tracer capable of generating a signal that can be detected.
  • a non-limiting list of these tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groupings detectable by electron microscopy due to their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of contact angle or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc.
  • the hybridization probe can be a so-called detection probe.
  • the so-called detection probe is marked by means of a marker such as as defined above, the hybridization probe can also be a so-called capture probe.
  • the so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption.
  • synthetic materials or natural materials can be used, optionally chemically modified in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose or dextran, polymers, copolymers, in particular based on styrene type monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the balance support can be in the form of a microtitration plate, of a membrane as described in application WO-A-94/12670, of a particle. It is also possible to immobilize on the support several different capture probes, each being specific for a target gene.
  • a biochip can be used as support on which a large number of probes can be immobilized.
  • biochip is meant a solid support of reduced size where a multitude of capture probes are fixed at predetermined positions.
  • the concept of biochip, or DNA chip dates from the early 90s. It is based on a multidisciplinary technology integrating microelectronics, nucleic acid chemistry, image analysis and computer science. The operating principle is based on a foundation in molecular biology: the phenomenon of hybridization, that is to say the complementarity pairing of the bases of two DNA and / or RNA sequences.
  • the biochip method is based on the use of capture probes fixed on a balanced support on which a sample of target nucleotide fragments labeled directly or indirectly with fluorochromes is made to act.
  • the capture probes are positioned specifically on the support or chip and each hybridization gives specific information, in relation to the target nucleotide fragment.
  • the information obtained is cumulative, and makes it possible, for example, to quantify the level of expression of a gene or of several target genes.
  • To analyze the expression of a target gene one can then produce a biochip carrying very many probes which correspond to all or part of the target gene, which is transcribed into mRNA.
  • the cDNAs or cRNAs specific for a target gene which one wishes to analyze on specific capture probes are then hybridized.
  • the support or chip After hybridization, the support or chip is washed, and the labeled cDNA or cRNA complexes / capture probes are revealed by a high affinity ligand linked for example to a fluorochrome type marker.
  • the fluorescence is read for example by a scanner and the analysis of the fluorescence is processed by computer.
  • Affymetrix Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays
  • M. Chee et al. Science, 1996, 274, 610-614.
  • Light -generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis ", A.
  • the main characteristic of the solid support must be to preserve the hybridization characteristics of the capture probes on the target nucleotide fragments while generating a minimum background noise for the detection method.
  • the immobilization of the probes on the support there are three main types of manufacturing. There is, first of all, a first technique which consists of depositing pre-synthesized probes. The probes are fixed by direct transfer using micropipettes, micro-tips or by an ink jet type device.
  • This technique allows the attachment of probes ranging in size from a few bases (5 to 10) to relatively large sizes from 60 bases (printing) to a few hundred bases (microdeposition): • Printing is an adaptation of the process used by inkjet printers. It is based on the propulsion of very small spheres of fluid (volume ⁇ 1 ni) and at a rate of up to 4000 drops / second. Printing does not involve any contact between the system releasing the fluid and the surface on which it is deposited. Microdeposition consists in fixing probes long from a few tens to several hundred bases to the surface of a glass slide. These probes are generally extracted from databases and come in the form of amplified and purified products.
  • Photohthography is a process behind the biochips developed by Affymetrix. It is also an in situ synthesis. PhotoUthography is derived from microprocessor techniques. The surface of the chip is modified by h fixing photolabile chemical groups which can be activated by light. Once illuminated, these groups are likely to react with the 3 'end of an ohgonucleotide. By protecting this surface with masks of defined shapes, it is possible to illuminate and therefore selectively activate areas of the chip where one wishes to fix one or the other of the four nucleotides.
  • the at least one specific reagent from step b) defined above comprises at least one hybridization probe, which is preferably immobilized on a support.
  • This support is preferably a biochip as defined.
  • step c) the determination of the expression of a target gene can be carried out by all the protocols known to those skilled in the art.
  • mRNAs messenger RNAs
  • proteins derived from these mRNAs can be analyzed by the detection of mRNAs (messenger RNAs) which are transcribed from the target gene at a given time or by the detection of proteins derived from these mRNAs.
  • the invention preferably relates to the determination of the expression of a target gene by the detection of mRNAs derived from this target gene according to all the protocols well known to those skilled in the art.
  • the expression of several target genes is simultaneously determined, by the detection of several different mRNAs, each mRNA being derived from a target gene.
  • the specific reagent comprises at least one amplification primer
  • step c) of the method according to the invention determines the expression of a target gene in the following manner: 1) after having extracted as material biological, total RNA (including transfer RNA (tRNA), ribosornal RNA (rRNA) and messenger RNA (mRNA)) of a biological sample as presented above, a reverse transcription step is carried out in order to obtain the Complementary DNA (or cDNA) of said mRNAs.
  • this reverse transcription reaction can be carried out using a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment.
  • the reverse transcriptase enzyme originating from AMV (Avian Myoblastosis Virus) or MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus) can be used.
  • this reverse transcription step is carried out in the presence of nucleotide fragments comprising only thymine bases (polyT), which hybridize by complementarity on the polyA sequence of the mRNAs in order to form a polyT-polyA complex which then serves as a starting point for the reverse transcription reaction carried out by the enzyme reverse transcriptase.
  • polyT thymine bases
  • cDNAs complementary to mRNAs from a target gene cDNA specific for the target gene
  • cDNAs complementary to mRNAs from other genes than the target gene cDNA not specific for the target gene.
  • the specific amplification primer (s) of a target gene hybridize with the cDNAs specific for the target gene and a predetermined region, of known length, is specifically amplified of the cDNAs originating from the mRNAs originating from the target gene.
  • cDNAs not 'specific for the target gene are not amplified, whereas a large amount of cDNA specific for the target gene is then obtained.
  • cDNAs specific for the target gene or “cDNA originating from mRNAs originating from the target gene”. This step can be carried out in particular by an amplification reaction of PCR type or by any other amplification technique as defined above.
  • PCR it is also possible to simultaneously amplify several different cDNAs, each one being specific for a different target gene by using several pairs of different amplification primers, each being specific for a target gene: this is called multiplex amplification.
  • the expression of the target gene is determined by detecting and quantifying the cDNAs specific for the target gene obtained during step 2) above.
  • This detection can be carried out after migration by electrophoresis of the cDNAs specific for the target gene as a function of their size.
  • the gel and the migration medium may include bromide of ethydium in order to allow direct detection of the cDNAs specific for the target gene when the gel is placed, after a given migration time, on a light table with UV (ultra violet) rays by the emission of a light signal. This signal is all the brighter as the quantity of cDNAs specific to the target gene is large.
  • the cDNAs specific for the target gene can also be detected and quantified by the use of a quantification range obtained by an amplification reaction carried out until saturation.
  • the expression of a target gene from different groups of patients can be normalized by simultaneous determination. the expression of a so-called household gene, the expression of which is sirrrilary in the different groups of patients.
  • the expression of a target gene can be determined in the following manner: 1) after having extracted as biological material, the total RNA from a biological sample as presented above a reverse transcription step is carried out, as described above in order to cDNA complementary to the mRNAs derived from a target gene (cDNA specific for the target gene) and cDNAs complementary to the mRNAs derived from genes other than the target gene (non-specific cDNA of the target gene).
  • the hybridization reaction can be carried out on a solid support which includes all the materials as indicated above.
  • the hybridization probe is immobilized on a support.
  • the support is a biochip.
  • the hybridization reaction can be preceded by a step of enzymatic amplification of the cDNAs specific for the target gene as described above in order to obtain a large quantity of cDNAs specific for the dble gene and to increase the probability that a cDNA specific for a target gene hybridizes to a specific target gene capture probe.
  • the hybridization reaction can also be preceded by a step of labeling and / or chvage of the cDNAs specific for the target gene as described above, for example by using a labeled oxyesoxyribonucleotide triphosphate for the amplification reaction. Chvage can be achieved in particular by the action of rimidazole and manganese chloride.
  • the cDNA specific for the target gene can also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in document WO-A-91/19812.
  • Other preferred particular modes of labeling and / or chvage of nucleic acids are described in applications WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319. 3) a step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • the detection can be carried out by bringing the support on which the capture probes specific for the target gene are hybridized with the cDNAs specific for the target gene with a so-called detection probe, marked with a marker, and the signal emitted by the marker.
  • the expression of a target gene can also be determined in the following manner: 1) after having extracted, as biological material, the total RNA from a biological sample as presented above, a reverse transcription step is carried out, as described above in order to obtain the cDNAs of the mRNAs of the biological material.
  • the RNA complementary to the cDNA is then polymerized by the use of a T7 polymerase type polymerase enzyme which operate under the dependence of a promoter and which make it possible to obtain, from a DNA template.
  • RNA complementary RNA.
  • cRNAs of the cDNAs of the mRNAs specific for the target gene we then speak of cRNAs specific to the target gene
  • the cRNAs of the cDNAs of the mRNAs not specific to the target gene are brought into contact with a support, on which are immobilized capture probes specific for the target gene whose expression is to be analyzed, in order to carry out a hybridization reaction between the cRNAs specific for the target gene and the capture probes, the non-specific cRNAs of the target gene not hybridizing on the capture probes.
  • the hybridization reaction can also be preceded by a step of labeling and / or chvaging of the cRNAs specific for the target gene as described above 3) : a step of detecting the hybridization reaction is then carried out. Detection can be carried out by bringing the support on which the capture probes specific for the target gene are hybridized with the cRNA specific for the target gene with a so-called detection probe, marked with a marker, and the signal emitted is detected. by the marker. When the cRNA specific for the target gene has been previously labeled with a marker, the signal emitted by the marker is directly detected.
  • the use of cRNA is particularly advantageous when using a biochip type support on which a large number of probes are hybridized.
  • Analysis of the expression of a target gene chosen from any one of SEQ ID Nos. 1 to 37 provides a tool for the prognosis of the neuroblatoma.
  • step b) the biological material is brought into contact with at least 37 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having any of the SEQ ID Nos. 1 to 37 and the expression of at least 37 of said target genes is determined during step c.
  • step b) the biological material is brought into contact with at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 , at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33 , at least 34, at least 35, or at least 36 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having any of SEQ ID Nos. 1 to 37 and it is determined, during step c , the expression of at least at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least
  • step b) the biological material is brought into contact with at least 19 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having the SEQ ID No.
  • step c) the expression of at least 19 of said target genes.
  • the biological material is brought into contact with at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 , at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least
  • step b) the biological material is brought into contact with at least 16 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having the SEQ ID No.
  • step c) the expression of at least 16 of said target genes.
  • the biological material is brought into contact with at least 12 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having SEQ ID No. 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ Tû N ° 25; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 34; SEQ ID No. 36 or SEQ ID No. 37 is determined, in step c) the expression of at least 16 of said target genes.
  • the biological material is brought into contact with at least 12 specific reagents chosen from the specific reagents of the target genes having a nucleic sequence having SEQ ID No. 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22;
  • step b) the biological material is brought into contact with at least 9 specific reagents chosen from the reagents specific for target genes having a nucleic sequence having SEQ ID No. 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 34; and determining, during step c) the expression of at least 9 of said target genes.
  • Figure 1 presents a dendogram obtained from 23 samples of tumors from patients with good prognosis (BP) or poor prognosis (MP), and the use of a panel of 40 probes allowing the analysis of expression of the 37 genes previously presented in table 1.
  • BP good prognosis
  • MP poor prognosis
  • the level of expression of each gene calculated by the Microarray Suite software (MAS5.0, Affymetrix) is represented by different levels of color.
  • the white color corresponds to a low level of expression
  • the gray color corresponds to an intermediate level of expression
  • the black color corresponds to a high level of expression.
  • the length of the branches of the dendograme is correlated with the expression profile and the dotted line which divides the dendograme makes it possible to distinguish two groups of patients: a first group of patients with poor prognosis "PD" and a second group of patients with good prognosis "BP".
  • FIG. 2 presents a dendogram obtained from 23 samples of tumors from patients with good prognosis or poor prognosis, and analysis of the expression of 19 genes. This dendogram was obtained compared to that described for FIG. 1.
  • FIG. 3 presents a dendogram obtained from 23 samples of tumors from patients good prognosis or poor prognosis, and the analysis of the expression of 16 genes. This dendogram was obtained compared to that described for FIG. 1.
  • FIG. 4 presents a dendogram obtained from 23 samples of tumors from patients with good prognosis or poor prognosis, and the analysis of the expression of 12 genes.
  • FIG. 5 presents a dendogram obtained from 23 samples of tumors from patients with good prognosis or poor prognosis, and analysis of the expression of 9 genes. This dendogram was obtained compared to what is described for FIG. 1.
  • the following examples are given by way of illustration and are in no way limiting.
  • Example 1 Search for an expression profile for the prognosis of neuroblastoma Characteristics of the biological samples (localized tumors or bone marrow punctures): 23 samples of neuroblatoma, obtained from the Center Léon Bérard (CLB) in Lyon, France, have were used in this study. These neuroblastoma samples were taken prior to any therapeutic treatment. Each tumor has been classified according to the INSS (International Neuroblastoma Staging) classification System; Brodeur et al; (1993). Clin. Oncol. 11, 1466-77). A distinction was then made between 12 stage 1/2 tumors, 4 stage 4s tumors and 7 stage 4 samples (2 tumor punctures, 1 biopsy, 4 spinal cord punctures massively invaded.
  • INSS International Neuroblastoma Staging
  • Mstochemical analysis showed in localized tumors the presence of approximately 80% of tumor cells.
  • the immunocytochemical analysis also showed in bone marrow punctures the presence of approximately 80% of tumor cells.
  • the median age of the patients at the time of diagnosis of neuroblastoma was 10 and a half months, and 5 patients died during the median follow-up period of 75 months, patients who died during the study, and patients with stage IV neuroblatoma were classified as poor prognosis (PD) patients, whereas living patients who developed stage 1, 2 and 4s neuroblastoma were classified as good prognosis (BP) patients (qualification according to Brön, 2003, Nat Rev Cancer, 203-216). é carried out on 8 MP patients and 15 BP patients.
  • total RNA was extracted from each tumor or bone marrow puncture according to a protocol well known to those skilled in the art (see in particular Ausubel et al (1997), Current protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiléy and Sons, New York). For this, each biological sample was homogenized in 1 ml of Trizol (Invitrogen, Cergy Pointoise, France), and treated with 300 ⁇ l of chloroform in order to eliminate any protein and hpophile contaminant. The total RNAs were then precipitated with 750 ⁇ l of isopropanol, washed twice with an 80% ethanol solution (vol / vol) and redissolved in DEPC water.
  • Trizol Invitrogen, Cergy Pointoise, France
  • RNAs were then purified on a Qiagen RNeasy column (Qiagen, Hilden, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions except for the final elution which was carried out in 200 ⁇ l of RNAse-free water after 1 in of incubation at 65 ° C. Prior to the reverse transcription step, a precipitation step with ammonium acetate (0.5 vol, 7.5M) and ethanol (2.5 vol) was carried out to guarantee the purification of the RNAs. totals. The quality of total RNA was analyzed by the AGILENT 2100 bio-analyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Total RNAs include transfer RNAs, messenger RNAs (mRNAs) and ribosomal RNAs.
  • mRNAs messenger RNAs
  • ribosomal RNAs ribosomal RNAs.
  • cDNAs complementary DNAs
  • the complementary DNAs (cDNAs) of the mRNAs contained in the total RNAs as purified above have were obtained from 10 ⁇ g of total RNA by the use of 400 units of the reverse transcription enzyme SuperScriptU (Invirrogen) and 100 pmol of poly-T primer containing the promoter of the T7 promoter (T7-ohgo ( dT) 24-primer, Proligo, Paris, France).
  • the cDNAs thus obtained were then extracted with phenol / chloroform, and precipitated as described above with ammonium acetate and ethanol, and redissolved in 24 ⁇ l of DEPC water. A volume of 20 ⁇ l of this purified cDNA solution was then transcribed in vitro by the use of a T7 RNA polymerase which specifically recognizes the promoter of the T7 polymerase as mentioned above. This transcription makes it possible to obtain the cRNA of the cDNA. This transcription was carried out using a Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo).
  • RNAs qualified as biotinylated “control” bioB, bioC, bioD and cre
  • oligonucleotides oligonucleotides
  • hybridization buffer After the hybridization step, the biotinylated and hybridized cRNA solution on the chip was revealed by the use of a stieptavidin-phycoerythrin solution and the signal was amplified by the use of anti- streptavidin.
  • Hybridization was carried out in a “GeneChip Hybridization oven” hybridization oven (Affymetrix), and the Euk GE-WS2 protocol of the Affymetrix protocol was followed.
  • MAS5.0 software Affymetrix
  • MAS5.0 software Affymetrix
  • the results obtained on a chip can then be compared with the results obtained on another chip.
  • MAS5.0 software also made it possible to include a statistical algorithm to consider whether a gene was expressed or not.
  • Each gene represented on the U95Av2 chip was covered by 16 to 20 pairs of 25 ohgonucleotide probes.
  • pair of probes is meant a first probe which hybridizes perfectly (we then speak of PM or perfect match probes) with one of the cRNAs of a target gene, and a second probe, identical to the first probe with the exception of a mismatch (in this case we speak of an MM or mismalched probe) in the center of the probe.
  • Each MM probe was used to estimate the background noise corresponding to a hybridization between two nucleotide fragments of non-complementary sequence.
  • a first step was to exclude genes with a comparable level of expression between all groups of patients [Tibshirani, et al Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6567-6572]. Genes not expressed in all patients were also excluded (MAS5.0 software). Finally, certain genes were excluded if the mean expression of the 2 groups (patients with good prognosis and patient with poor prognosis) was less than 500 or if the ratio of the means of expression between patients with poor and good prognosis was between 0.7 and 1.3. The expression of the 1488 remaining genes was then analyzed (PAM algorithm, Tibshirani, R., Hastie, T., Narasimhan, B. and Chu, G.
  • Jnsulin-hke growth factor binding protein or IGFBP7 (SEQ ID N ° 3; SPARC (SEQ ID N ° 37); EPB41L3 (SEQ ID N ° 34) was then analyzed by PCR (polymerase chain reaction) and the use of '' specific amplification primers (amplification of the PMP22 gene: sense strand: 5-AGGGAGGAAG GGAAAACAGA-3 '(SEQ ID No. 38); antisense strand: 5'-TTAAGGCTCA ACACGAGGCT-3' (SEQ ID No.
  • gene IGFBP7 sense strand: 5'-CTTGAGCTGT GAGGTCATCG-3 '(SEQ ID N ° 40); antisense strand: 5'-TATAGCTCGG CACCTTCACC-3' (SEQ ID N ° 41); SPARC gene: sense strand: 5'-CTGCCTGCCA CTGAGGGTTCC-3 '(SEQ ID N ° 42); antisense strand: 5'-TCCAGGCAGA ACAACAAACC ATCC-3' (SEQ ID N ° 43); EPB41L3 gene: sense strand: 5'-ACCACCACCA CTACCCACAT-3 '(SEQ ID N ° 44); antisense strand: S'-TGGTTTTCCT AACGGTTTGC-3 '(SEQ ID N ° 45); beta actin gene: sense strand: 5'-TGTTGGCGTA CAGGTCTTTG C-3' (SEQ ID N ° 46); antisense strand: 5'- GCTACGAGCT GCCTGACGG-3 '(
  • Table 3 The results of RT-PCR, obtained from 15 BP patients and 8 MP patients, are expressed by the relative quantification ratio between the mRNAs of the target gene and the mRNAs of the ⁇ -actin gene which served as a control. The results are expressed by the average of the reports obtained for each of the patient groups.
  • the correlation of the results obtained on the one hand with the biochip and on the other hand with the RT-PCR technique was established thanks to the Kendah Tau-B correlation test.
  • MP patients had a reduced level of expression for the SPARC, IGFBP7, EPB41L3, and PMP22 genes, confirming the results presented in Table 2.
  • the cDNAs necessary for the analysis of each of these target genes were obtained from a microgram of total RNA (first-strand DNA synthesis kit Amersham France). After a 6-fold dilution, 2.5 ⁇ l of cDNA was used in real-time PCR, in the presence of a primer pair (300 nM) specific to each target gene (see table below) and buffer SYBR-Green Master Mix.
  • SEQ1D N 0 2 SEQ ID N ° 50: 5'-TCCTCACGCC SEQ ID N ° 51: 5'-TTCAGGATGT
  • SEQIDN ° 3 SEQ ID N ° 52: 5'-TGTCCTCATC SEQ ID N ° 53: S'-GGCAGGAGTT
  • SEQID N ° 7 SEQ ID N ° 54: 5'-TTTACATCCA SEQ ID N ° 55: 5'-CACGATGTCA clone GAGGCACGAC-3 'GCAAACAGG-3'
  • SEQ1D N ° 8 SEQ ID N ° 56: S'-CAGGAAGGCT SEQ ID N ° 57: 5'-CCGTTTCACA
  • SEQID N ° 22 SEQ ID N ° 58: 5'-GCTGGACCGG SEQ ID N ° 59: 5'-GCCGCTACCG
  • SEQID N ⁇ SEQ ID N ° 60: 5'-GACCCAGTGC SEQ ID N ° 61: 5'-GTGTGCGCGT
  • SEQIDN 0 34 SEQ ID N ° 64: 5'-GTTGGACCCT SEQ ID N ° 65: 5'-CAGATAGTTG
  • EPB41L3 GCTAAGGAAA-3 'GGCAGGGTCT-3 ,
  • the total reaction volume was 15 ⁇ l.
  • the PCR amplification was carried out in 96-well microplates, using the ABI Prism 7000 Sequence Detection system (Apphed BioSystem USA).
  • the reference gene HPRT1 and the target gene were analyzed simultaneously After 10 min of denaturation at 95 ° C, ramification was carried out according to the following conditions: 40 cycles of 15 seconds at 95 ° C followed by 1 minute at 60 ° C.
  • the experiments were carried out in duphcat
  • the quantification was carried out by the use of the method of the standard curves and the use of the comparative method CT as recommended by the manufacturer. Standard curves were obtained from dilution of cDNA from neuroblastoma cell lines, and performed for each PCR.
  • the expression of the target gene was determined by the use of these standard curves.
  • the relative expression of each target gene was defined by comparison with the expression of the reference gene.
  • the Pearson and Spearman correlation tests were used to calculate the correlation between the results obtained on a chip, and the results obtained by RTPCR The results are presented in the table below.
  • the inventors also defined more restricted gene panels which also make it possible to disramine patients with good and poor prognosis.
  • a first panel included 19 genes which are presented in Table 4. The results are expressed by the ratio obtained between the average expression of the gene in MP patients and the expression of the gene in BP patients (ratio MP / BP). The inventors also studied the simultaneous expression of these 19 genes to obtain an expression profile. The results are presented in FIG. 2. We observe on this dendogram two groups having two different expression profiles: a first group making it possible to classify patients with good prognosis (BP) and a second group making it possible to classify patients with poor prognosis (MP). In order to validate the discriminating power of these 19 genes, 6 tumors of "test” patients were analyzed without prior knowledge of their prognosis. Thus, the six “MP-test” and “BP-test” tumors presented in FIG.
  • a second panel included 16 genes as presented in table 5.
  • the inventors also studied the simultaneous expression of these 16 genes to obtain an expression profile.
  • the results are presented in FIG. 3.
  • BP good prognosis
  • MP poor prognosis
  • a third panel included 12 genes as presented in Table 6.
  • the inventors also studied the simultaneous expression of these 12 genes to obtain an expression profile.
  • the results are presented in FIG. 4.
  • We observe on this dendogram two groups having two different expression profiles: a first group allowing to classify patients with good prognosis (BP) and a second group making it possible to classify patients with poor prognosis (MP).
  • BP good prognosis
  • MP poor prognosis
  • a fourth panel included 9 genes as presented in table 7.
  • the inventors also studied the simultaneous expression of these 9 genes to obtain an expression profile.
  • the results are presented in FIG. 5.
  • We observe on this dendogram two groups having two different expression profiles: a first group making it possible to classify patients with good prognosis (BP) and a second group making it possible to classify patients with poor prognosis (MP).
  • BP good prognosis
  • MP poor prognosis

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblatome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélévé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N° 11, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N° 11, 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles.

Description

Procédé pour le diagnostic/pronostic du neuroblastome
La présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblastome.
Le neuroblastome est en fréquence la deuxième cause de tumeur solide chez l'enfant après les tumeurs cérébrales. Le neuroblastome est le plus fréquent des cancers de l'enfant avant cinq ans et représente environ 15 % des cancers avant cet âge.
Les neuroblastomes sont des tumeurs malignes développées à partir de neuroblastes nés de la crête neurale et migrant pour former les ganglions sympathiques et la médullo- surrénale durant la période embryonnaire et fœtale.
Lorsqu'un premier examen clinique permet de suspecter un neuroblastome (boule, hématome, endroit douloureux, difficulté à bouger les membres, etc...), un bilan complet est réalisé afin de confirmer le diagnostic. Généralement, ce bilan comprend : des examens par prélèvements (sang, urines), > différents examens radiologiques qui ont pour but de bien situer la tumeur, ses limites et sa taille (scintigraphie, échographie et/ou scanner et/ou IRM ), des examens au microscope de fragments de tumeurs afin de découvrir exactement de quel type de tumeur dont il s'agit A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement universel lorsqu'un neuroblastome est diagnostiqué, et un traitement spécifique doit être adapté en fonction de l'âge du patient. On distingue alors principalement les traitements loco-régionaux (chirurgie et radiothérapie) afin d'enlever ou détruire la tumeur directement à l'endroit où elle se trouve et les traitements généraux (chimiothérapie), qui agissent dans tout l'organisme du patient à la fois sur la tumeur et mais aussi là où peuvent se trouver les métastases.
Le traitement du patient peut être adapté selon le pronostic du neuroblastome et la stratégie thérapeutique peut s'avérer très différente selon le stade et la caractérisation génétique des cellules tumorales. Ainsi, dans les formes localisées dont les cellules tumorales ne portent aucun caractère de mauvais pronostic, le traitement est essentiellement crώυrgical alors que dans les formes locaHsées dont les cellules tumorales sont de mauvais pronostic, le traitement doit être plus agressif, reposant sur la chimiothérapie et une radiothérapie locale. D. existe a l'heure actuelle différentes classifications du neuroblastome permettant de définir de la façon la plus précise possible des groupes pronostiques. Ces groupes permettent théoriquement de définir les indications thérapeutiques de façon adaptée au risque de la maladie. On peut citer notamment la classification de lTntemational Neuroblastoma Staging System (Brodeur et al. (1993) J. Clin. Oncol. 11, 1466-77), qui tient compte des données anatomiques actuellement reconnues comme ayant une valeur pronostique. Selon cette classification, on distingue les stades suivants : > stade 1 : tumeur localisée totalement enlevée rnacroscopiquement ; ganglions homo et controlatéraux examinés et négatifs microscopiquement > stade 2A : tumeur unilatérale enlevée incomplètement avec des ganglions homo et controlatéraux examinés et négatifs. stade 2B : tumeur unilatérale avec atteinte ganglionnaire homolatérale et non controlatérale. > stade 3 : tumeur unilatérale non opérable montrant un dépassement de la ligne médiane ou tumeur unilatérale avec atteinte ganglionnaire controlatérable ou tumeur à cheval sur la ligne médiane avec extension bilatérale par infiltration ou par adénopathie. stade 4 : tumeur primitive s'accompagnant d'une dissémination à distance : ganglionnaire, osseuse, médullaire, hépatique. > stade 4S : tumeur de stade local 1 ou 2 avec une dissémination limitée au foie, à la peau ou à la moelle osseuse. Les stades 4S sont des enfants ayant un âge inférieur à l an. Actuellement, le pronostic d'un neuroblatome peut être établi par l'étude de différents facteurs: 1 ) l'amplification de l'oncogène N-myc est considérée comme un outil de référence, et est utilisée par la plupart des oncologues pédiatriques pour définir, au moment du diagnostic, les malades qui doivent recevoir une c miothérapie intensive suivie de greffe de moelle (Seeger et al, N Engl J Med. 1985 ; 313(18):llll-6 ; Rubie et al J Clin Oncol. 1997 Mar;15(3):1171-82.). 2) il existerait également une corrélation entre le pronostic du neuroblastome et le rapport des calécholamines VMA (vanilmandelic acid) / HVA (homovanillic acid), au moment du diagnostic. Dans les stades avancés, une excrétion urinaire élevée d'HVA et basse de VMA, voire normale, signerait un mauvais pronostic (Laug et al Pediatrics. 1978 ; 62(l):77-83). 3) l'augmentation de la ferritine sérique dans les neuroblastomes est également considérée comme un facteur de mauvais pronostic (Evans et al, Cancer. 1987 ; 59(ll):1853-9). 4) le taux de LDH (lactate deshydrogénase) pourrait également être un facteur de pronostic indépendant et prédominant pour les stades localisés I à lu chez l'enfant de plus d'un an, et de façon moins importante chez l'enfant de moins d'un an avec un stade IV (Berthold et al, Am J Pediatr Hematol Oncol. 1994 ; 16(2): 107- 15). Toutefois, la corrélation entre l'amplification de l'oncogène N-myc et le pronostic du neuroblastome n'est pas absolue (Maris & Matthay, J Clin Oncol, 1999, 17(7) : 2264- 2279). De plus la LDH et la ferritine étant deux facteurs corrélés entre eux, la fiabilité de ces facteurs pour le pronostic du neuroblastome reste discutée (Berthold et al, 1992, Am J Pediatr Hamtol Oncol, 14(3) : 207-215). Enfin, l'utilisation du rapport VMA/HVA donne une sensibilité et une spécificité insuffisantes pour le pronostic du neuroblastome.
La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil de pronostic du neuroblastome. D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le pronostic d'un neuroblastome peut être déterminé par l'analyse de l'expression de gènes cibles sélectionnés parmi 37 gènes tel que présenté dans le tableau 1 ci après, qui sont exprimés différentiellement selon que, le patient soit de bon ou de mauvais pronostic. Tableau 1 - liste des 37 gènes cibles selon l'invention
Parmi ces gènes, on peut distinguer des gènes dont la fonction est connue mais qui n'ont jamais été mis en relation avec le neuroblastome ( SEQ ID N°l à 8 ; 12 à 16 ; 18 à 26 ; 28 ; 30 à 34 ; 36) ainsi que des gènes dont la fonction est inconnue (SEQ ID N°9 ; 10 ; 27 ; 29 ; 35). Il est bien entendu que si différentes isoformes de ces gènes existent, toutes les isoformes sont relevantes pour la présente invention, et pas uniquement celles présentées dans le précèdent tableau.
A cet effet, la présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblastome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°ll, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°ll5 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l' échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire, préférentiellement un échantillon de tumeur ou de moelle osseuse.
Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrit du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible. Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : • une étape de lyse des cellules présentes dans réchantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet: o WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO 99/53304 sur la lyse électrique, o WO 99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses crώrdques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO- A- 97/45202 et WO-A- 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., X Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep® Silica, Pro ega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-
Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de Téthanol 100%. L'ADN peut alors être culoté par œntrifugation, lavé et remis en solution . Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement les ARN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter les ARN avec de l'éthanol 100%. Les ARN peuvent alors être culoté par œntrifugation, lavé et remis en solution.
Au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridatioa on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se tient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des haisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de sliybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thvrnine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylaιrιino-5désoxyuridine, la diarnino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID N°38 à 41 et SEQ ID N°44 à 45. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US
4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159, LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO
90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amphfication) avec la demande de brevet WO 91/02818, et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins
2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, et permettent ramplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifique d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque ramplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend préférentiellement une sonde d'hybridation. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, te matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Cl nical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un
' traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les grouperhents à densité électronique détectables par microscopie électronique du par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 12SI. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux rninéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solde peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO- A- 94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro- électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à- dire l'appariement par complémentarité des bases de *deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solde sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), et les complexes ADNc ou ARNc marquées / sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A.
Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemptes de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40-44 ; F. Ginot Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915- 2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A- 5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond rmnimum pour la méthode de détection. Pour l'immobilisation des sondes sur le support on distingue trois grands types de fabrication. Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré- synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (microdéposition) : • L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface sur laquelle il est déposé. La micro- déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques dizaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots, dit zones de reconnaissance, d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois pas oubher l'emploi de membranes de Nylon, dites « macroarrays », qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. On peut toutefois déposer en fond de plaque de microtitration un certain volume d'échantillon dans chaque puits, comme c'est le cas dans les demandes de brevet WO-A-00/71750 et FR 00/14896, ou déposer au fond d'une même boîte de Pétri un certain nombre de gouttes séparées les unes des autres, selon une autre demande de brevet FR00/14691. La deuxième technique de fixation des sondes sur le support ou puce est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ (voir notamment les demandes de brevet WO 89/10977 et WO 90/03382), et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'ohgonucléotides. Elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'ohgonucléotides, le long de la surface de veme. Enfin, la troisième technique est appelée la photohthographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. Il s'agit également d'une synthèse in situ. La photoUthographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par h fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec extrémité 3' d'un ohgonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut ihurniner et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'ohgonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carcé (μm2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs centaines de rnilhers de spots sur une surface de quelques œntimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de Nmères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) définie précédemment comprend au moins une sonde d'hybridation, qui est préférentiellement immobilisée sur un support Ce support est préférentiellement une biopuce telle que définie précédemment
Lors de l'étape c) la détermination de l'expression d'un gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier.
D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.
L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on détermine simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par la détection de plusieurs ARNm différents, chaque ARNm étant issus d'un gène cible.
Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification, on peut lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosornaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact la ou les amorces d'amphfication spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non 'spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient -alors une grande ' quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' «ADNc spécifiques du gène cible » ou d' «ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de ty e PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. En PCR, on peut également amplifier simultanément plusieurs ADNc différents, chacun étant spécifique de différent gène cible par rutilisation de plusieurs couples d'amorces d'amplification différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible: on parle alors d'amplification en multiplex. 3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifique du gène cible est importante. Ces techniques d' électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est sirrrilaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réahsant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23- 39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. ' -
Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqué précédemment Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est irnmobilisée sur un support Préférentiellement le support est une biopuce. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène dble et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifique d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de chvage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment par exemple en utilisant un άesoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le chvage peut être réalisé notamment par l'action de rimidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou chvage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybrides les sondes de capture spécifique du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique telle que présentée précédemment on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type T7 polymérase qui fonctionnent sous la dépendance d'un promoteur et qui permettent d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible. 2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont irnmobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de chvage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment 3): on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utihsation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybrides un grand nombre de sondes.
L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N°l à 37 permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic du neuroblatome. On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le pronostic, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de mauvais pronostic. Ceci permet de déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitement adapté.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 37 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 37 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, ou au moins 36 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins
16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, ou au moins 36 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 19 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°l ; SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°9; SEQ ID N°10; SEQ ID N°14; SEQ ID N°16; SEQ ID N°20; SEQ ID N°21; SEQ ID N°22; SEQ ID N°25; SEQ ID N°27; SEQ ID N°29; SEQ ID N°31; SEQ ID N°34; SEQ ID N°36 ou SEQ ID N°37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 19 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins
14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, ou au moins 19 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°l ; SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°9; SEQ ID N°10; SEQ ID N°14; SEQ ID N°16; SEQ ID N°20; SEQ ID N°21; SEQ ID N°22; SEQ ID N°25; SEQ ID N°27; SEQ ID N°29; SEQ ID N°31;
SEQ ID N°34; SEQ ID N°36 ou SEQ ID N°37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, ou au moins 19 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 16 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°l ; SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°9; SEQ ID N°10; SEQ ID N°20; SEQ ID N°21; SEQ ID N°22; SEQ Tû N°25; SEQ ID N°29; SEQ ID N°31; SEQ ID N°34; SEQ ID N°36 ou SEQ ID N°37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 16 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 12 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°10; SEQ ID N°20; SEQ ID N°22;
SEQ ID N°25; SEQ ID N°29; SEQ ID N°31; SEQ ID N°34; ou SEQ ID N°37 et on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 12 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 9 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°10; SEQ ID N°22; SEQ ID N°25; SEQ ID N°29; SEQ ID N°34; et on déterrnine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 9 desdits gènes cibles. L'utilisation d'un panel de gènes restreint est particulièrement adapté pour obtenir un outil de pronostic. En effet l'analyse de l'expression d'une dizaine de gènes ne nécessite pas la fabrication à façon de puces à ADN, et peut être mise en œuvre directement par des techniques de PCR ou de NASBA, ce qui présente un atout économique important et une mise en œuvre simplifiée. Les figures ci- jointes sont données à titre d'exemples explicatifs et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic (BP) ou de mauvais pronostic (MP), et l'utilisation d'un panel de 40 sondes permettant l'analyse de l'expression des 37 gènes présentés précédemment dans le tableau 1. On retrouve sur ce dendograme 23 colonnes correspondant aux 23 échantillons de tumeurs, et 40 lignes correspondant aux 40 sondes utilisées pour l'analyse de l'expression des 37 gènes. Les échantillons de tumeurs, ainsi que les gènes ayant un profil d'expression comparable, mis en évidence par une corrélation de type Pearson, ont été placés côte à côte. Les échantillons de tumeurs ont été classés selon la méthode de moyenne non-pondérée (Spotfire Décision Site for Functional Genomics
V7.1, manual) alors que les gènes ont été classés selon la valeur moyenne d'expression obtenue dans l'ensemble des échantillons. Le niveau d'expression de chaque gène, calculé par le logiciel Microarray Suite (MAS5.0, Affymetrix) est représenté par différents niveaux de couleur. Ainsi, la couleur blanche correspond à un faible niveau d'expression, la couleur grise correspond à un niveau d'expression intermédiaire, alors que la couleur noire correspond à un fort niveau d'expression. La longueur des branches du dendograme est corrélée au profil d'expression et la ligne en pointillée qui divise le dendograme permet de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe de patients de mauvais pronostic "MP" et un deuxième groupe de patients de bon pronostic "BP". Les six tumeurs "MP- test" et «BP-test » sont des tumeurs qui ont été analysées «en aveugle », c'est à dire sans connaître leur pronostic. La figure 2 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 19 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1. La figure 3 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 16 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1. La figure 4 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 12 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1. La figure 5 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 9 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif.
Us permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 : Recherche d'un profil d'expression pour le pronostic du neuroblastome Caractéristiques des échantillons biologiques (tumeurs localisées ou ponctions de moelles osseuses) : 23 échantillons de neuroblatome, obtenus auprès du Centre Léon Bérard (CLB) de Lyon, France, ont été utilisées dans cette étude. Ces échantillons de neuroblastome ont été prélevés préalablement à tout traitement thérapeutique. Chaque tumeur a été classée suivant la classification INSS (International Neuroblastoma Staging System; Brodeur et al; (1993) . Clin. Oncol. 11, 1466-77). On distinguait alors 12 tumeurs de stade 1/2, 4 tumeurs de stade 4s et 7 échantillons de stade 4. (2 ponctions tumorales, 1 biopsie, 4 ponctions médullaires massivement envahies. L'analyse Mstochimique montrait dans les tumeurs localisées la présence d'environ 80% de cellules tumorales. L'analyse immunocytochimique montrait également dans les ponctions de moelle osseuse la présence d'environ 80% de cellules tumorales. L'âge médian des patients au moment du diagnostic du neuroblastome était de 10 mois et demi, et 5 patients sont décédés au cours de la période de suivi médian de 75 mois. Les patients ayant décédé au cours de l'étude, et les patients présentant un neuroblatome de stade IV étaient qualifiés de patients de mauvais pronostic (MP), alors que les patients en vie, ayant développé un neuroblastome de stade 1, 2 et 4s étaient qualifiés de patients de bon pronostic (BP) (qualification selon Brodeur, 2003, Nat Rev Cancer, 203-216). Cette analyse a ainsi été réalisée sur 8 patients MP et 15 patients BP.
Extraction du matériel biologique (ARN totaux) de l'échantillon biologique : les ARN totaux ont été extraits de chaque tumeur ou ponction de moelle osseuse selon un protocole bien connu de l'homme du métier (Voir notamment Ausubel et al (1997), Current protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiléy and Sons, New York). Pour cela, chaque échantillon biologique a été homogénéisé dans 1 ml de Trizol (Invitrogen, Cergy Pointoise, France), et traité avec 300 μl de chloroforme afin d'éhminer tout ∞ntaminant protéique et hpophile. Les ARN totaux ont ensuite été précipités avec 750 μl d'isopropanol, lavés deux fois avec une solution à 80 % en ethanol (vol/vol) et remis en solution dans de l'eau DEPC. Les ARN totaux ont ensuite été purifiés sur colonne Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) conformément aux instructions du fabriquant à l'exception de l'élution finale qui a été réalisée dans 200 μl d'eau RNAse-free après 1 in d'incubation à 65°C. Préalablement à l'étape de transcription reverse, une étape de précipitation par de l'acétate d'ammonium (0,5 vol, 7.5M) et de l'éthanol (2,5 vol) a été réalisée pour garantir la purification des ARN totaux. La qualité des ARN totaux a été analysée par le bio analyseur AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm) et les ARN ribosomaux.
Synthèse d'ADNc, obtention des ARNc et marquage des ARNc et quantification : Afin d'analyser l'expression des gènes cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux tels que purifiés ci dessus, ont été obtenus à partir de 10 μg d'ARN totaux par l'utilisation de 400 unités de l'enzyme de transcription reverse SuperScriptU (Invirrogen) et 100 pmol d'amorce poly-T contenant le promoteur de la T7 promotor (T7-ohgo(dT)24-primer, Proligo, Paris, France). Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été extraits avec du phénol/chloroforme, et précipités tels que décrit précédemment par de l'acétate d'ammonium et de Féthanol, et remis en solution dans 24 μl d'eau DEPC. Un volume de 20 μl de cette solution purifiée d'ADNc a fait l'objet ensuite d'une transcription in vitro par l'utihsation d'une ARN polymérase T7 qui reconnaît spécifiquement le promoteur de la T7 polymérase tel que mentionné ci dessus. Cette transcription permet d'obtenir l'ARNc de l'ADNc. Cette transcription a été réalisée par l'utilisation d'un kit Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo
Diagnostics, Farmingdale, NY), qui permet non seulement d'obtenir l'ARNc mais également l'incorporation de bases cytidine et ùridine biotinylées lors de la synthèse de l'ARNc . Les ARNc purifiés ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie, et la solution d'ARNc a été ajustée à une concentration de 1 μg μl d'ARNc. L'étape de chvage de ces ARNc a ensuite été réalisée à 94°C pendant 35 min, par l'utihsation d'un tampon de fragmentation (40 mM de Tris acétate, pH 8,1, 100 mM d'acétate de potassium, 30 mM d'acétate de magnésium) afin de provoquer l'hydrolyse des ARNc et obtenir des fragments de 35 à 200 bp. Le succès d'une telle fragmentation a été vérifié par une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%).
Mise en évidence d'un profil d'expres ion différentiel entre les patients BP etMP L'expression d'environ 10 000 gènes a été analysée et comparée entre les patients BP et MP. Pour cela, 10 μg d'ARNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 μl de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à 45°C sur une puce d'expression (Human Génome U95Av2 GeneChip® (Affymetrix), qui comporte 12 625 groupes de sondes représentant environs 10 000 gènes selon le protocole d'Affymetrix tel que décrit sur le site internet d'Affymetrix (voir notamment à l'adresse suivante http://www.affymetrix.∞ιrι/support/dowrioads/rnanuals/expression_s2_manual.p
Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de lavage, des ARN qualifiés de «contrôle » biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (ohgo B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, la solution d'ARNc biotinylée et hybridée sur la puce, a été révélée par l'utilisation d'une solution de stieptavidine-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti-streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation « GeneChip Hybridisation oven » (Affymetrix), et le protocole Euk GE-WS2 du protocole d'Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station «Fluidics Station 400 » (Affymetrix). Chaque puce U95Av2 a ensuite été analysée sur un scanner Agitent G2500A GeneArray Scanner à une résolution de 3 microns afin de repérer les zones hybridées sur la puce. Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité de ARNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel Microarray Suite 5.0 software (MAS5.0, Affymetrix).
Afin de prévenir les variations obtenues par l'utihsation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normahsation globale utilisant le logiciel MAS5.0 (Affymetrix), qui permet de convertir les données brutes obtenues pour chaque puce en un signal moyen d'une intensité de 500. Les résultats obtenus sur une puce peuvent alors être comparés aux résultats obtenus sur une autre puce. Le logiciel MAS5.0 permettait aussi d'inclure un algorithme statistique pour considérer si un gène était exprimé ou non. Chaque gène représenté sur la puce U95Av2 était couvert par 16 à 20 couples de sondes de 25 ohgonucléotides. Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridail parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ARNc issus d'un gène cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariemenl (on parle alors de sonde MM ou mismalched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithms Référence Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat Genêt 1 Suppl., 20-
24). Deux tumeurs de stade IV présentant un faible pourcentage de gènes exprimés, du à un biais soit dans la qualité des ARNc soit dans l'étape d'hybridation, ont été exclues de l'analyse. Les 23 échantillons restant montraient une moyenne de 48 % de gènes exprimés. L'analyse des données d'expression a été réalisée par le logiciel Microsoft Excel, le logiciel Spotfire Décision Site for Functionnal Genomics V7.1 (Spotfire AB, Gothenburg,
Sweden), ainsi que le module PAM (Prédiction Analysis in Microarrays) du logiciel de statistiques R (Thaka & Gentleman (1996) Journal of Computational and Graphical Statistics 5, 299-314. ; Tibshirani, et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6567-6572). A partir des 12625 groupes de sondes, représentant environ 10000 gènes, de la puce, les inventeurs ont sélectionné les gènes pertinents qui étaient corrélés à un mauvais pronostic du neuroblastome.
Pour cela, une première étape a consisté à exclure les gènes présentant un niveau d'expression comparable entre tous les groupes de patients [Tibshirani, et al Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6567-6572]. Les gènes non exprimés chez l'ensemble des patients ont également été exclus (logiciel MAS5.0). Enfin, certains gènes ont été exclus si la moyenne d'expression des 2 groupes (patients de bon pronostic et patient de mauvais pronostic) était inférieur à 500 ou si le rapport des moyennes d'expression entre les patients de mauvais et de bon pronostics étaient compris entre 0,7 et 1,3. L'expression des 1488 gènes restants a ensuite été analysée (algorithme PAM, Tibshirani, R., Hastie, T., Narasimhan, B. and Chu, G. (2002) Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gène expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6567-6572). Résultats obtenus: Dans un premier temps, 37 gènes permettant de différencier les patients de bon et de mauvais pronostic ont été identifiés. L'augmentation ou la diminution d'expression de chacun de ces gènes, observée chez les patients de mauvais pronostic par rapport aux patients de bons pronostics est indiquée dans le tableau 2. Tableau 2 - hste des 37 gènes exprimés différentiehement dans les neuroblatomes patients BP etMP
Ces résultats ont également été validés par l'utilisation d'une autre technique de biologie moléculaire dans laquelle l'analyse de l'expression de gènes tel que présentés dans fe tableau 2 a été réalisée par RT-PCR. Pour cela, une réaction de reverse transcription (RT) a été réalisée à partir d'1 μg d'ARN total tel qu'obtenu précédemment (kit Amersham, First strand cDNA synthesis kit). La transcription reverse a été effectuée pendant 1 h à 37°C. Chaque solution de cDNA a été diluée 6 fois avant la réalisation de la PCR. L'expression des ARNm de gènes du tableau 2 (Peripheral myelin protein ou PMP22 (SEQ K) N°25) ; Jnsulin-hke growth factor binding protein ou IGFBP7 (SEQ ID N°3 ; SPARC (SEQ ID N°37); EPB41L3 (SEQ ID N°34)) a ensuite été analysé par PCR (polymérase chain réaction) et l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amplification du gène PMP22 : brin sens : 5-AGGGAGGAAG GGAAAACAGA-3' (SEQ ID N°38); brin antisens : 5'-TTAAGGCTCA ACACGAGGCT-3' (SEQ ID N°39) ; gène IGFBP7 : brin sens : 5'-CTTGAGCTGT GAGGTCATCG-3' (SEQ ID N°40); brin antisens : 5'-TATAGCTCGG CACCTTCACC-3' (SEQ ID N°41); gène SPARC : brin sens : 5'-CTGCCTGCCA CTGAGGGTTCC-3' (SEQ ID N°42) ; brin antisens : 5'-TCCAGGCAGA ACAACAAACC ATCC-3' (SEQ ID N°43) ; gène EPB41L3 : brin sens : 5'-ACCACCACCA CTACCCACAT-3' (SEQ ID N°44) ; brin antisens : S'-TGGTTTTCCT AACGGTTTGC-3' (SEQ ID N°45); gène beta actine : brin sens : 5'-TGTTGGCGTA CAGGTCTTTG C-3' (SEQ ID N°46); brin antisens : 5'- GCTACGAGCT GCCTGACGG-3' (SEQ ID N°47). L'expression du gène codant la β- actine a été utilisée comme contrôle. Trente cycles de PCR sont ensuite été réalisé en présence des différentes amorces d'amplification (0,2μM); de dNTPs (0,15mM, Euromedex) et d'enzyme polymérase (Taq Polymérase ; 0,027U/μl; Perkin Elmer) (dénaturation 30" à 94 °C, hybridation l' à 60 °C ; polymérisation l' à 72 °C). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci dessous, qui montre la corrélation existant entre les résultats obtenues par l'utilisation d'une biopuce et ceux obtenues par RT-PCR.
Tableau 3 Les résultats de RT-PCR, obtenus à partir de 15 patients BP et 8 patients MP, sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène β-actine qui servait de contrôle. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La corrélation des résultats obtenus d'une part avec la biopuce et d'autre part avec la technique en RT-PCR a été établie grâce au test de corrélation du Tau-B de Kendah. Les patients MP présentaient un niveau d'expression diminuée pour les gènes SPARC , IGFBP7 , EPB41L3, et PMP22, confirmant les résultats présentés dans le tableau 2.
L'expression des ARNm des gènes de SEQ ID N°37: SPARC ; SEQ ID N°2: UBE2C ; SEQ ID N°3: IGFBP7 ; SEQ ID N°8: TRJQ 28 ; SEQ ID N°22: SNRBP; SEQ ID N°25: PMP22; SEQ ID N°29: TRTM2 ; SEQ ID N°34: EPB41L3 ; SEQ ID N°7 : clone FEBRA2000874, a également été analysée par RT-PCR quantitative. Les ADNc nécessaires à l'analyse de chacun de ces gènes cibles ont été obtenus à partir d'un microgramme d'ARN totaux (first-strand DNA synthesis kit Amersham France). Après une dilution de 6 fois, 2,5 μl d'ADNc ont été utihsés en PCR en temps réel, en présence d'un couple d'amorce (300 nM) spécifique de chaque gène cible (cf tableau ci dessous) et du tampon SYBR-Green Master Mix.
SEQ Amorce sens Amorce anlisens
AMPLIFIEE
SEQID N°37: SEQ ID N°48 : 5'-CACATTAGGC SEQ ID N°49 : 5'-CAGGATGCGC
SPARC TGTTGGTTCA AACT-3" TGACCACTT-3'
SEQ1D N02: SEQ ID N°50 : 5'-TCCTCACGCC SEQ ID N°51 : 5'-TTCAGGATGT
UBE2C CTGCTATCA-3' CCAGGCATAT GT-3'
SEQIDN°3: SEQ ID N°52 : 5'-TGTCCTCATC SEQ ID N°53 : S'-GGCAGGAGTT
IGEBP7 TGGAACAAGG-3' CTGTCCTTTG-3'
SEQID N°7: SEQ ID N°54 : 5'-TTTACATCCA SEQ ID N°55 : 5'-CACGATGTCA clone GAGGCACGAC-3' GCAAACAGG-3'
EEBRA2000874
SEQ1D N°8: SEQ ID N°56 : S'-CAGGAAGGCT SEQ ID N°57 : 5'-CCGTTTCACA
TPJM28 ATGGCπTGG-3' CCTGACACAT G-3'
SEQID N°22: SEQ ID N°58 : 5'-GCTGGACCGG SEQ ID N°59 : 5'-GCCGCTACCG
SNRBP AAGTAGGTΓTCT-3' GAAATGC-3'
SEQID N^: SEQ ID N°60 : 5'-GACCCAGTGC SEQ ID N°61 : 5'-GTGTGCGCGT
PMP22 ATCCAACAGA-3' AAAGCTTCAC-3'
SEQK>N°29: SEQ ID N°62 : 5'-CAGTAACAAC SEQ ID N°63 : 5'-TGCCAAAACG ACTTTTGAAC_3,
TRIM2 CAATGTGTGCAG3'
SEQIDN034: SEQ ID N°64 : 5'-GTTGGACCCT SEQ ID N°65 : 5'-CAGATAGTTG
EPB41L3 GCTAAGGAAA-3' GGCAGGGTCT-3,
Gène de ménage SEQ ID N°66 : 5'-CACTGGCAAA SEQ ID N°67 : 5'-CGACCTTGAC
HPRT1 ACAATGCAGA CT-3' CATCπTGGATT-3'
Le volume total de réaction était de 15 μl. L'amplification en PCR a été réalisée en microplaques 96 puits, par l'utilisation du système ABI Prism 7000 Séquence Détection (Apphed BioSystem USA). Le gène de référence HPRT1 ainsi que le gène cible étaient analysés simultanément Après 10 min de dénaturation à 95°C, ramplification a été réalisée selon les conditions suivantes : 40 cycles de 15 secondes à 95°C suivie de 1 minutes à 60°C. Les expériences ont été réalisées en duphcat La quantification a été réalisée par l'utilisation de la méthode des courbes standards et l'utihsation de la méthode comparative CT telle que recommandé par le fabricant. Les courbes standards ont été obtenues à partir de dilution d'ADNc de lignées cellulaires de neuroblastome, et réalisées pour chaque PCR. L" expression du gène cible a été déterminée par l'utilisation de ces courbes standards. L'expression relative de chaque gène cible a été définie par comparaison avec l'expression du gène de référence. Les tests de corrélation de Pearson et Spearman ont été utihsés pour calculer la corrélation entre les résultats obtenus sur puce, et les résultats obtenus par RTPCR. Les résultats sont présentés dans le tableau ci dessous.
Ces résultats montraient une bonne corrélation (p < 0,05) des résultats obtenus sur puce et par RT PCR, concernant en particulier les gènes de SEQ ID N°2, 7, 8, et 25, suggérant que ces 4 gènes sont particulièrement pertinents pour le pronostic du neuroblastome. Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée des 37 gènes du tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 1. On observe sur ce dendograme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination du profil d'expression de ces 37 gènes, 6 tumeurs supplémentaires de patients «test » ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic, et classées comme étant de bon pronostic «BP-test» ou de mauvais pronostic «MP-test » en fonction de l'analyse de leur profil d'expression. Leur bon classement a été vérifié ensuite selon leurs propriétés cliniques : tous les échantillons
« tests » analysés en aveugle par l'analyse de l'expression de 37 gènes avaient été correctement classés dans le groupe de patients de mauvais pronostic « test-MP » ou dans le groupe de patients de bon pronostic « test-BP ». Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 37 gènes est un bon outil pour le pronostic du neuroblastome. A titre indicatif, l'oncogène NMYC a également été utilisée comme outil de pronostic.
L'utihsation de ce gène mettait en évidence 5 patients de mauvais pronostic (MP). Toutefois, 3 patients étaient également de mauvais pronostic alors qu'aucune augmentation de l'expression de l'oncogène N-MYC n'ait été observée, suggérant que l'analyse unique de ce gène n'est pas suffisant pour le pronostic du neuroblastome.
Les inventeurs ont également défini des panels de gènes plus restreint permettant également de disraminer les patients de bon et de mauvais pronostic.
Un premier panel comportait 19 gènes qui sont présentés dans le tableau 4. Les résultats sont exprimés par le ratio obtenu entre l'expression moyenne du gène chez des patients MP et l'expression du gène chez des patients BP (ratio MP / BP). Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 19 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 2. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP). Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination de ces 19 gènes, 6 tumeurs de patients «test » ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic. Ainsi, les six tumeurs "MP-test" et «BP-test » présentées dans la figure 3 sont des tumeurs qui ont été analysés «en aveugle ». Leur bon classement a été vérifié selon leur propriété clinique : tous les patients « MP-test » classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de mauvais pronostic s'avéraient être des patients de mauvais pronostic et tous les patients «BP-test » classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de bon pronostics s'avéraient être des patients de bon pronostic.
D'une façon comparable, un deuxième panel comportait 16 gènes tels que présentés dans le tableau 5. Tableau 5 - hste des 16 gènes exprimés différentiehement dans les neuroblatomes de patients BP et MP
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 16 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 3. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Un troisième panel comportait 12 gènes tels que présentés dans le tableau 6. Tableau 6 - hste des 12 gènes exprimés différentiehement dans les neuroblatomes de patients BP et MP
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 12 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 4. On observe sur ce dendograme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Un quatrième panel comportait 9 gènes tels que présentés dans le tableau 7. Tableau 7 - hste des 9 gènes exprimés différentiehement dans les neuroblatomes de patients BP et MP
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 9 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 5. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Le pouvoir de discrimination de tous ces panels de gènes a été validé avec des tumeurs « tests » tels que décrit précédemment : tous les patients «MP-test » classé en fonction de leur profil d'expression comme patients de mauvais pronostic s'avéraient être des patients de mauvais pronostic et tous les patients «BP-test » classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de bon t pronostics s'avéraient être des patients de bon pronostic.
Ces résultats démontrent que le pronostic d'un neuroblastome peut être cléterrniné par l'analyse de l'expression de tout ou partie des 37 gènes de séquence SEQ ID N°l à 37.
En particulier, l'analyse de l'expression des 9 gènes de SEQ ID N°2 ; 3 ; 7 ; 8 ; 10 ; 22 ; 25 ; 29 ; et 34 permet de ώsc miner très efficacement les patients de bon et de mauvais pronostic.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le pronostic du neuroblatome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°ll, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, c. on ô^termine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°ll, 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles.
2. Procédé pour le pronostic du neuroblatome selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation
5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la au moins une sonde d'hybridation es irnmobilisée sur un support
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support est une biopuce.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 37 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 37 desdits gènes cibles.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 19 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°l ; SEQ K) N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°9; SEQ ID N°10; SEQ ID N°14; SEQ ID N°16; SEQ ID N°20; SEQ ID N°21; SEQ ID N°22; SEQ ID N°25; SEQ ID N°27; SEQ ID N°29; SEQ ID N°31; SEQ ID N°34; SEQ ID N°36 ou SEQ ID N°37 et on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 19 desdits gènes cibles.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 9 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N°2; SEQ ID N°3; SEQ ID N°7; SEQ ID N°8; SEQ ID N°10; SEQ ID N°22; SEQ ID N°25; SEQ ID N°29; SEQ ID N°34; ou SEQ ID N°37 et on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 9 desdits gènes cibles.
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