EP1708993A2 - Nouveaux tensio-actifs et leurs applications - Google Patents
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- EP1708993A2 EP1708993A2 EP04817291A EP04817291A EP1708993A2 EP 1708993 A2 EP1708993 A2 EP 1708993A2 EP 04817291 A EP04817291 A EP 04817291A EP 04817291 A EP04817291 A EP 04817291A EP 1708993 A2 EP1708993 A2 EP 1708993A2
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Definitions
- the present invention relates to new telomer type surfactants, their use for the preparation of metastable supramolecular systems.
- These metastable supramolecular systems or nanoparticles can be liposomes, or micellar systems.
- the subject of the invention is also the atypical liposomes and nanoparticles obtained from these surfactants and their use as vectors of active principles, in particular therapeutic active principles.
- Certain amphiphilic molecules, the natural phospholipids have the property of associating in water by forming metastable supramolecular organizations of spherical forms called liposomes which contain an internal aqueous compartment.
- liposomes are capable of containing therapeutic active agents within this internal compartment and can thus be used to transport these active agents to target cells or tissues.
- the study of these particulate vectors has been the subject of an abundant literature in which the problems as well as the potentialities of their use have been widely discussed (Barenholz, Curr. Opin. In Coll. And Int. Sci. 6 (2001 ) 66-77).
- the use of liposomes for the transport of therapeutic active principles has some major drawbacks: These nanostructures generally have a relatively low stability over time, because in the medium in which they are dispersed, they fuse to form larger objects which then rush quickly. This behavior severely limits their capacity for preservation and storage.
- the biological stability of these vectors i.e.
- liposome protection systems In order to reduce their rapid elimination by the reticuloendothelial system, liposome protection systems have been put in place. The most effective consists in using phospholipids substituted by polyethylene glycols of molecular weight between 1000 and 5000 in a proportion of 5 to 10% of the total mixture of phospholipids.
- the “invisible”, so-called stealthy liposomes thus formed (marketed under the brand name Stealth liposomes®) have longer blood retention times than conventional liposomes (45 hours versus a few minutes to a few hours).
- Active targeting of these vectors may be carried out by covering their surface with target molecules such as antibodies, peptides, lectins, sugars, hormones or specific synthetic compounds.
- target molecules such as antibodies, peptides, lectins, sugars, hormones or specific synthetic compounds.
- the literature cites a large number of polymers of amphiphilic nature. These are generally di-block type polymers made up of different hydrophilic and hydrophobic monomers (M. Jones et al, Eur. J. Pharm. Biopharm., 48 (1999) 101-111, VP Torchilin, J. Control. Release, 73 (2001) 137-172).
- Other amphiphiles derived from phospholipids and polymers of polyethylene glycol and polyvinyl pyrrolidone have also been studied (AN Lukyanov et al, Adv. Drug Deliver.
- a first objective of the present invention is the development of nanoparticulate vectors at very low production cost and having the capacity to transport within their internal aqueous cavity a very large family of hydrophilic active agents.
- the nanoparticulate vectors of the invention allow the encapsulation, the retention and the release of dosable substances.
- Targeted applications include the transport of active ingredients, in particular therapeutic active ingredients, epidermal delivery of cosmetic substances, medical diagnosis.
- active ingredients in particular therapeutic active ingredients, epidermal delivery of cosmetic substances, medical diagnosis.
- anticancer active ingredients, active ingredients for vaccine use genetic material, enzymes, hormones, vitamins, sugars, proteins and peptides, lipids, organic and inorganic molecules.
- a second objective of the present invention is the development of nanoparticulate vectors at very low production cost and having the capacity to transport within their hydrophobic cavity or their lipid sheet a very large family of hydrophobic active agents.
- the nanoparticulate vectors of the invention allow the encapsulation, the retention and the release of dosable substances.
- the targeted applications include the transport of active principles, in particular therapeutic active principles, the epidermal delivery of cosmetic substances, medical diagnosis.
- the subject of the present invention is the compounds corresponding to the formula
- R ' represents H or a hydrophilic group, such as for example a C 4 -C 2 polyhydroxylated hydrocarbon compound; in particular R 'can be chosen from sugars such as for example galactose, glucose, mannose, sialic acid, linked by its anomeric carbon; • R represents a group chosen from: C 4 -C 24 hydrocarbon radicals; C 4 -C 4 fluorinated hydrocarbon radicals; the C - C 24 thioalkyl radicals.
- the group R can in particular be chosen from the following radicals:
- the thiooctyl radical The C -C 24 hydrocarbon radicals such as n-butyl, tert-butyl, isobutyl, n-pentyl, isopentyl, n -hexyl, n-heptyle, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl, n-tetradecyl, n-pentadecyl, n -hexadecyl, n- heptadecyl, n-octadecyl, the phytyl radical
- C 4 -C 2 fluorinated hydrocarbon radicals such as those corresponding to the formula - (CH 2 ) r (CF 2 ) r F, in which r and t represent two integers with: 24> r + t> 4, as for example: - (CF 2 ) 4 F; - (CF 2 ) 5 F; - (CF 2 ) 6 F; - (CF 2 ) 7 F; - (CF 2 ) 8 F; - (CF 2 ) 9 F; -
- the preferred R chains are those which contribute to giving the surfactant of formula (I) a phase transition temperature greater than 37 ° C.
- these surfactants having a crystal structure at physiological temperature, provide the liposome membrane with greater rigidity and a greater degree of retention of the solutes encapsulated in the internal aqueous compartment.
- R represents a C ⁇ -C 2 hydrocarbon chain or a C 8 -C 24 fluorinated hydrocarbon chain.
- A1 represented below:
- Another object of the invention consists in the use of molecules of formula (I), advantageously molecules of formula (IA) for the manufacture of liposomes.
- the liposomes of the prior art have their walls generally made up of phospholipids. Liposomes are made from surfactants of formula (I), preferably of formula (IA) very easily by the film method (Liposomes, a practical approach, RRC New, Ed., Oxford University Press, New York, 1990) .
- a double sonication and extrusion treatment can also be provided.
- Other conventional methods for preparing liposomes can be used for the preparation of the liposomes of the invention.
- S. Vemuri and CTRhodes Pharmaceutica Acta Helvetiae 70, (1995), 95-111.
- tubular vesicles because of their size, which is of the order of a few tens of nanometers, and of their shape which recalls that of a tube closed at its two ends. .
- the size and mechanical stability over time of the particles obtained in the solution were measured after filtration by dynamic light diffraction. (High Performance Particle Sizer, Malvern).
- a surfactant of formula (IA) given the particle size is substantially homogeneous: it varies in a range of value of + 10%, preferably + 5%, around a central value of length and diameter.
- These tubular vesicles have a relatively high stability since no change in particle size is observed after one year of storage, while liposomes formed from phosphatidyl choline from egg yolk show an evolution after only 5 days of storage.
- the detection of the aqueous internal cavity has been indirectly proven by spectrofluorimetric measurements of the encapsulation and the release kinetics of a hydrophilic fluorescent probe, carboxyfioresoresin.
- the invention further relates to liposomes, or aqueous dispersions of vesicles, characterized in that they comprise one or more compounds of formula (I), advantageously of formula (IA) as constituents of their walls.
- These liposomes have original structural characteristics which give them unexpected properties, in particular improved stability compared to the liposomes of the prior art.
- the liposomes of the invention have also shown an ability to release an active principle over a longer period of time compared to the liposomes of the prior art.
- the subject of the invention is the compounds corresponding to the formula (IB):
- Ri represents a group chosen from the following radicals: in which R ′ represents H or a hydrophilic group, such as for example a C 4 -C 24 polyhydroxy hydrocarbon compound.
- R ' can be chosen from sugars such as for example galactose, glucose, mannose, sialic acid, linked by its anomeric carbon.
- R represents a group chosen from: the hydrocarbon radicals in
- R chains are those which contribute to giving the surfactants of formula (IB) a Critical Micellar Concentration (CMC) of less than 10 "5 M.
- CMC Critical Micellar Concentration
- a low CMC in fact provides the nanoparticle with greater thermodynamic stability as well as a capacity greater retention of the solutes encapsulated in the internal hydrophobic compartment.
- R represents a C 1 -C 2 hydrocarbon chain or a C 8 -C 4 fluorinated hydrocarbon chain.
- the molecules of formula (IB) can be synthesized in a simple way using the conventional methods of organic synthesis. Several examples of synthesis are illustrated in the experimental part.
- the preferred compounds of formula (IB) are those for which Y represents S.
- Another preferred variant is that in which p represents an integer ranging from 5 to 15.
- Another subject of the invention consists in the use of the compounds of formula (I), advantageously of the compounds of formula (IB) for the preparation of nanoparticles with hydrophobic cavity and the nanoparticles thus obtained.
- the particles are made from surfactants of formula (I) or (IB) very easily by the film method which is well known to those skilled in the art and which is described in the work Liposomes, a practical approach, RRC New , Ed., Oxford University Press, New York, 1990. The procedure is described above for the compounds of formula (IA).
- the size and mechanical stability over time of the particles obtained in the solution were measured after filtration by dynamic light diffraction (High Performance Particle Sizer, Malvern).
- the nature of the particles obtained was studied by transmission electron microscopy after negative staining of the sample or after cryofracture.
- the Critical Aggregation Concentration of these surfactants was determined by tensiometry and spectrofluorimetry by the fluorescent marker method.
- the tensiometry technique of Wilhelmy made it possible to determine the limit surface tensions and the area of the pole head at the water-air interface (FIG. 8).
- These compounds have relatively low CMCs of the order of 10 ⁇ 5 M.
- the CMC of these surfactants hardly changes as a function of p (FIG. 8).
- These ellipsoidal particles have original structural characteristics and their average hydrodynamic diameter can be easily modulated by the variation of p, that is to say of the number of monomeric units constituting the polymeric hydrophilic part.
- the particles of the invention have also shown an ability to encapsulate hydrophobic active agents. This incorporation can be carried out using techniques well known to those skilled in the art. For example, the encapsulation can be carried out by dissolving the active ingredient in a preformed solution of ellipsoids or micelles, by the oil-in-water procedure or by dialysis.
- the therapeutic compounds which can be encapsulated are all the compounds, preferably hydrophobic, which can be stably incorporated into these micellar or ellipsoid structures.
- Different families of active ingredients that are not very hydrophilic or hydrophobic can be encapsulated or dissolved via these objects, including anticancer drugs, antibiotics, immunomodulators, steroids, anti-inflammatories or nucleotides.
- Hydrophilic compounds liable to complex with the polar part of the nanoparticles can also be encapsulated or vectorized.
- the dose of active ingredient effectively encapsulated in these nanoparticles is determined after filtration of the active ingredient not encapsulated by HPLC, by UN or fluorescence spectrometry as well as by RM ⁇ 1H.
- the nanoparticles, micellar, ellipsoidal or liposomes, of the invention may preferably also comprise at least one compound corresponding to formula (II) below:
- - Y represents a sulfur atom or the group -NH-CO- (CH 2 ) nX- in which X represents a sulfur atom S or a group -CH 2 -, n is an integer ranging from 0 to 10; - represents a group -NH- or -CH 2 - - x represents 0 or an integer ranging from 1 to 30; - y represents 0 or an integer ranging from 1 to 10; - R !
- R ' represents a hydrophilic group chosen from the following radicals in which R 'represents H or a hydrophilic group, such as for example a C 4 -C 2 polyhydroxylated hydrocarbon compound; in particular R 'can be chosen from sugars such as for example galactose, glucose, mannose, sialic acid, linked by its anomeric carbon; - R represents a recognition group which is chosen as a function of the cell target, preferably it is chosen from groups having a pronounced affinity for the biological target of the active principle carried in the nanoparticle.
- R 2 can be saccharide in nature (targeting specific membrane lectins which are found in particular tissues and which selectively recognize either galactose - cases of the liver, bones, certain cancerous tumors - or mannose - in the case of macrophages, heart-, ie sialic acid- case of erythrocytes -%), of a hormonal nature (such as steroids), of a synthetic nature such as gleevek to target kinases, specific antibodies, biotin which binds to certain specific proteins, and more generally any substrate whose previous research has demonstrated the specificity of recognition.
- saccharide in nature targeting specific membrane lectins which are found in particular tissues and which selectively recognize either galactose - cases of the liver, bones, certain cancerous tumors - or mannose - in the case of macrophages, heart-, ie sialic acid- case of erythrocytes -
- a hormonal nature such as steroids
- a synthetic nature such as gleevek to
- the RGD sequence known for its affinity for the ⁇ N ⁇ 3 integrins. It is possible to provide that the same molecule of formula (II) comprises one or more identical recognition groups R 2 or several different recognition groups R 2 , which makes it possible to direct the particles towards several distinct biological targets.
- the group R obeys the same rules as those previously defined for the structure of the compound of formula (I).
- - Z is a spacer arm which connects the recognition group R to the polymer chain.
- the spacer arm Z may consist of a peptide chain.
- This spacer arm comprises 1 to 5 amino acids, preferably 1 to 3 amino acids.
- the amino acids constituting the spacer arm Z are chosen from natural amino acids such as alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, or unnatural amino acids such as hydroxyproline, norleucine , ornithine, citrulline, cyclohexylalanine.
- This spacer arm Z can consist of a tyrosine residue allowing in vivo monitoring of the vector after labeling with 125 I OR 131 I. It is also possible to use as group Z ⁇ -amino acids such as 3- aminopropionic and 4-amino-butyric acid, but also ethanolamine, 3-propanolamine or diamines of formula -NH- (CH 2 ) r -
- -ZR 2 is constituted by an NTA group of formula:
- the preferred compounds of formula (II) are those of formula
- the nanoparticles (liposomes, tubular vesicles, micelles or ellipsoidal particles) of the invention comprise from 1 to 5% of one or more compounds of formula (II) which makes it possible to promote the targeting of these nanoparticles towards their target. biological without altering their organization.
- lipid telomeres of formula (II) have the advantage thanks to their hydrophilic oligomeric part of being able to distance the grafted recognition agents from the surface of the tubular vesicles, thus promoting their recognition by the target cells or tissues.
- the other advantage linked to the use of these targeting lipids (II) is the possibility of multiplying the recognition patterns on a single compound thanks to the telomerization technique.
- Factors x and y are indeed easy to control and will depend quite closely on the proportion of monomers and telogen agent reacted.
- the ligation of the recognition agents can be carried out before the telomerization of the hydrophilic head if there is compatibility with the reaction conditions.
- the recognition agents can also be attached to the oligomeric polar head after formation of the tubular vesicles.
- the telomerized hydrophilic part is then functionalized by groups capable of ensuring coupling with these recognition agents.
- the different coupling techniques that can be used are well known to those skilled in the art and they are described in particular in: Allen et al, Biochim. Biophys. Acta, 1237 (1995) 99-108; Sapra, Prog. Lipids Res., 42 (2003) 439-462, Hansen et al, Biochim. Biophys. Acta, 1239 (1995) 133-144.
- the compounds of formula (II) constitute another object of the invention.
- the compounds of formula (I) and of formula (II) described above can be grouped under the same formula (III):
- R 3 represents a group chosen from:
- the liposomes or tubular vesicles of the invention formed from the compounds of formula (IA), and optionally (IIA) are stabilized by telomerization or polymerization of a monomer of acrylic type contained in their internal watery cavity.
- oligomeric or polymeric matrix is produced after encapsulation of the constituent monomer (s) in the tubular vesicles and elimination of the nonencapsulated monomers by separation techniques on size exclusion gel.
- Telomerization which consists of forming the polymer in the presence of a chain transfer agent, provides access to small polymers of controlled size. The reduced molecular weight of this polymer promotes its elimination via the kidneys. By avoiding the accumulation of polymer in the lysosome, problems of toxicity are also avoided.
- Nanoparticles, liposomes or tubular vesicles, comprising, in addition to the surfactants of formula (IA), at least one oligomer or telomer as described below constitute another object of the invention.
- the oligomer or telomer consists of monomeric, hydrophilic, ionic or nonionic building blocks, chosen from acrylic acid, methacrylic acid, methacrylamide derivatives, as well as the acrylate, methacrylate, acrylamide and methacrylamide derivatives of C ⁇ alcohols.
- sugars can be simple sugars such as: glucose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, mannose, galactose, fructose, talose.
- Disaccharides such as maltose, sucrose, or lactose
- Amino acids can be chosen from natural amino acids such as alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, acid glutamic, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, or unnatural amino acids such than hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulline, cyclohexylalanine.
- Tris (hydroxy) methyl acrylamidomethane sodium acrylate, hydroxyethyl acrylate, glucose monoacrylate, glucose-1 - (N -methyl) acrylamide, 2-acrylamide glucose, 1-acrylamide maltose, sorbitol monoacrylate.
- telomer In order to modify the retention and stabilization capacities of the telomer, it is possible to use, in the manufacture of the telomer, water-soluble crosslinking agents such as: glucose-1,2-diacrylami, sorbitol diacrylate, sucrose diacrylate, sucrose di (ethylenediamine acrylamide), kanamycin tetracrylamide, kanamycin diacrylamide, or other sugars di or polyfunctionalized with acrylates or acrylamides.
- water-soluble crosslinking agents such as: glucose-1,2-diacrylami, sorbitol diacrylate, sucrose diacrylate, sucrose di (ethylenediamine acrylamide), kanamycin tetracrylamide, kanamycin diacrylamide, or other sugars di or polyfunctionalized with acrylates or acrylamides.
- all hydrophilic compounds capable of receiving at least two acrylate or acrylamide groups can be used. This is the case for example of the tris (hydroxymethyl) acrylamidomethane
- crosslinking agents are used in proportions ranging from 1 to 5% by weight relative to the weight of the monomer (s).
- the size of the telomer is controlled using one or more hydrophilic or hydrophobic transfer agents which are inserted into the membrane or the internal aqueous cavity of nanoparticles and particularly tubular vesicles.
- the chain transfer agent can be hydrophilic or hydrophobic, of thiol or phosphite type.
- the chain transfer agents used are chosen from hydrophilic thiols such as thiol acetic acid, mercaptopropionic acid, thioethylene glycol, cystamine, cysteine or hydrophobic thiols such as alkane thiols from C 2 to C 30 , such as compound D (derived from cholesterol) which is known for its ability to integrate in phospholipid membranes.
- hydrophilic thiols such as thiol acetic acid, mercaptopropionic acid, thioethylene glycol, cystamine, cysteine or hydrophobic thiols such as alkane thiols from C 2 to C 30 , such as compound D (derived from cholesterol) which is known for its ability to integrate in phospholipid membranes.
- compound D derived from cholesterol
- the chain transfer agent can also be chosen from the double-stranded thiols previously described.
- the phosphites can, for their part, be hydrophilic such as diethyl phosphite or hydrophobic such as dioctyl, didodecyl, dihexadecyl phosphites.
- hydrophobic structure of these hydrophobic thiols approximate that of the surfactants constituting it.
- the common motif of these telogen agents advantageously consists of an aminoglycerol motif onto which fatty chains are grafted by carbamate bonds according to formula (VI):
- the internal aqueous cavity of the tubular vesicles comprises a hydrophilic telomer, optionally provided with a hydrogenic phogenous part integrated into the internal membrane sheet.
- the physico-chemical description of these stabilized tubular vesicles is dominated in the experimental part and their superior retention capacity of an encapsulated solute and their increased mechanical stability are demonstrated.
- the targeted applications include the transport of active principles, in particular therapeutic active principles, the epidermal delivery of cosmetic substances, medical diagnostic agents. In particular the transport of anticancer active ingredients, vaccines, genetic material, enzymes, hormones, vitamins, sugars, proteins and peptides, lipids, organic and inorganic molecules.
- the epitopes and peptides may be incorporated into the internal aqueous matrix or expressed on the surface of the tubular vesicles by a covalent binding system in order to improve the immune response of the epitopes.
- the present invention therefore further relates to any composition, in particular any therapeutic, vaccine or cosmetic diagnostic composition comprising at least one active principle in association with a nanoparticle, liposome, tubular vesicle, ellipsoid or micelle, as described above, and in particular any composition comprising at least one active principle encapsulated in a liposome or tubular vesicle, ellipsoid or micelle according to the present invention.
- FIG. 1 illustrates the release kinetics of the carboxyfluorescein encapsulated in phosphatidyl choline (+) liposomes and tubular vesicles consisting of the compound Al (•) measured by spectrofluorimetry.
- FIG. 2 represents the infrared spectrum in the liquid phase of a 9 -A solution of compound Al in CC1 4 at different concentrations (1.10 " to 2.5.10 M).
- FIG. 3 represents the distribution curve in size by volume of tubular vesicles, measured by electron microscopy
- Figure 4 is a photograph obtained by electron microscopy by phase transmission after negative staining with uranyl acetate 2% of tubular vesicles formed by dispersion of the compound Al (2.5 mg.ml "1 ) in the water.
- FIG. 5 is a photograph obtained by electron microscopy by phase transmission after cryofracture of a sample of tubular vesicles formed by dispersion of the compound Al (2.5 mg.ml "1 ) in water.
- FIG. 1 represents the distribution curve in size by volume of tubular vesicles, measured by electron microscopy
- Figure 4 is a photograph obtained by electron microscopy by phase transmission after negative staining with uranyl acetate 2% of tubular vesicles formed by dispersion of the compound Al (2.5 mg.ml "1 ) in the water.
- FIG. 5 is a photograph obtained by electron microscopy by phase
- FIG. 6 is a photograph obtained by electron transmission phase microscopy after negative staining with 2% uranyl acetate of a sample of tubular vesicles formed by dispersion of the compound of structure B (2.5 mg.ml "1 ) in water.
- Figure 7 shows pictures of electron microscopy by
- FIG. 9 represents the phase transition temperatures measured by light scattering and recall of the values measured in spectrofluorimetry
- Example 1 synthesis of the Al derivative The synthesis of the Al derivative is summarized in scheme 1 • Trityl mercaptopropionic acid (1): available molecule commercially.
- the crude reaction product is then washed with a saturated sodium bicarbonate solution and then with a normal hydrochloric acid solution, saturated with sodium chloride before being dried over sodium sulfate. After filtration on sintered glass, the product is purified by chromatography on silica gel with elution with a gradient of pure ethyl acetate to ethyl acetate / methanol 9: 1 (v: v)). The pure product is obtained in the form of a white powder (2.12 g, Yield: 87%). The product can also be obtained pure, with an identical yield, by crystallization at room temperature of the reaction crude in an ethyl acetate / methanol mixture 8: 2 (v: v) in 8 days.
- the reaction medium is brought to reflux and a tip of a spatula of 1,4-diaza bicyclo- [2,2,2] -octane (DABCO) (cat.) Is added to the mixture. After 6 hours, the crude is evaporated to dryness and taken up in a minimum of ether where the product crystallizes at room temperature. After filtration, the product is obtained pure in the form of a white powder (4.04 g, Yield: 86%).
- DABCO 1,4-diaza bicyclo- [2,2,2] -octane
- the medium is then neutralized by adding formic acid, evaporated to dryness and purified by chromatography on silica gel using an elution gradient of ethyl acetate / cyclohexane 7: 3 to 5: 5.
- the pure product is obtained in the form of a yellow oil (1.1 g, Yield: 87%).
- Synthesis diagram of the targeting G lipid telomer • Synthesis of the telomerized lipid G 0.767 g of tris- (acetoxymethyl) acrylamidomethane 6 monomer (2.55 mmol, 12 eq) and 0.2 g of monomer 5 are dissolved in a 100 ml two-necked flask surmounted by a condenser. 0.63 mmol, 3 eq) in 20 mL of freshly distilled acetonitrile. Tris- (acetoxymethyl) acrylamidomethane 6 was prepared in accordance with the teaching of the document A.Polidori et al, New J. Chem., 1994, 18, 839-848.
- the reaction medium is degassed under argon and brought to reflux. 7 mg of AIBN (4.29.10 " mmol, 0.2 eq) and 0.157 g of thiol 4 (0.21 mmol, 1 eq) dissolved in 5 ml of freshly distilled and degassed acetonitrile are added. The reaction is maintained at reflux for 4 hours until total consumption of the monomers (detected by TLC). The reaction medium is concentrated under reduced pressure and the crude reaction product is filtered through a sephadex column (MeOH / CH 2 Cl2 1: 1).
- the product is then dissolved in 100 ml of methanol in the presence of a catalytic amount of sodium methylate After 5 hours of stirring, the reaction medium is neutralized by addition of acid resin IRC 50. The resin is removed by filtration and the solvent removed under reduced pressure. product is then reacted cold in an acid mixture TFA CH 2 C1 (20%) for 3 hours The reaction medium is concentrated under reduced pressure The oil obtained is taken up several times in ether until precipitation of the telomeres under the has the form of a white powder The product is dissolved in water and lyophilized until compound G is obtained in the form of a white powder.
- the average degree of polymerization (DPn) and the concentration ratio of each monomer in the macromolecule (x and y) was determined by 1 H NMR by comparing the integrations of the signals of the methyls of the two alkyl chains at 1.1 ppm with that of Tris ( ⁇ H? OH) signals at 4.3 ppm and lysine (CH? NH) at 3.37 ppm.
- x and y x: 30 and y: 10
- 6-Acryloylamino-2- [bis- (2-carboxy-ethyl) -amino] -hexanoic acid 8 In a 50 mL flask, 1.9 g of compound 7 (6.33 mmol) are dissolved in 20 mL of '' a 1: 1 trifluoroacetic acid - dichloromethane mixture. After 2 hours of stirring the solvent is evaporated under reduced pressure and the oil obtained is taken up several times in chloroform and evaporated until a powder is obtained. In a 25 mL flask, 1.94 g of bromoacetic acid (12.66 mmol) are dissolved in 7 mL of 2N sodium hydroxide. The solution is cooled to 0 ° C.
- Example 5 Preparation of tubular vesicles from the derivative Al Material used. • Measurement of the size of tubular vesicles. The particle size distribution was measured by photon correlation spectroscopy of the sample light diluted in water using a device
- the film obtained is then dried under reduced pressure using a vane pump.
- the lipid film is rehydrated with distilled water at 65 ° C (10 ° C above the phase transition temperature of the lipid) at a concentration of 2.5 mg.mL "1.
- the mixture is homogenized using a vortex for 5 minutes then subjected to ultrasound for 30 minutes at 70 ° C.
- Tm 54 ° C.
- tubular vesicles have a high stability since no change in particle size is observed after one year of storage, while under the same conditions, liposomes formed from phosphatidyl choline from egg yolk evolve after only 5 days. .
- the detection of the aqueous internal cavity has been indirectly proven by spectrofluorimetric measurements of the encapsulation and the kinetics of release of a hydrophilic fluorescent probe, carboxyfluorescein (FIG. 1). The measurements clearly show a slower release kinetics of the fluorescent probe compared to traditional encapsulation in a mixture of phosphatidyl choline from egg yolk.
- Example 6 Encapsulation of Carboxyfluorescein in Tubular Vesicles Manufactured from the Al Derivative
- the encapsulation power of the various compounds is determined by spectrofluorimetry using a fluorescent probe: 5 (6) -carboxyfluorescein.
- the release of this fluorescent marker is measured from the vesicles prepared according to standardized methods. This study requires the preparation of a Tris buffer (15 mM and 150 mM
- the non-encapsulated fluorescent probe is eliminated by passage over a Sephadex G25 column previously equilibrated with Tris buffer.
- the fraction of vesicle collected is immediately studied by spectrofluorimetry.
- the fluorescence measurements were carried out using a Jobin-Yvon spectrofluorimeter (spectrofluoromax 2), equipped with a 150 W Xenon lamp. All the measurements were carried out in a quartz tank, thermostatically controlled at 25 ° C.
- the samples were analyzed at an excitation wavelength of 480 nm, and an emission wavelength of 530 nm for 4 hours.
- the bandwidths were set at 0.5 nm for both the excitation and the emission.
- the initial fluorescence intensity (F 0 ) is determined 30 seconds after column filtration.
- the release is studied over a period of 4 hours and the fluorescence intensity (F t ) is measured at regular intervals.
- the maximum fluorescence intensity (F max ) which corresponds to 100%> of salting out, is obtained after the lysis of the tubular vesicles obtained by adding Triton XI 00 (10% v / v).
- Example 7 Polymerization of a monomer encapsulated in tubular vesicles obtained from the lipid Al The composition of the solutions used is summarized in Table 1.
- Table 1 Preparation of the film 20 mg of lipids Al are dissolved in 2 mL of a solution of Cumene hydroperoxide in dichloromethane freshly distilled and degassed by bubbling with argon (2.5.10 " M), in a heart-shaped flask The solution is evaporated to dryness on a rotary evaporator (the bath temperature does not exceed 40 ° C) then the film is dried with a vane pump (1 hour) and placed under an inert atmosphere until use.
- the film in the case of priming with sodium dithionite, the film is prepared in freshly distilled dichloromethane and degassed by bubbling with Argon • Dispersion 2 mL of monomer solution in distilled water (0.1 M), previously deoxygenated by bubbling Argon are added The mixture is stirred for 1 minute then placed in an ultrasonic bath for 60 minutes at 70 ° C.
- the preparation is deposited on a Sephadex G50 column (2 cm in diameter for a height of 10 cm of gel) previously equilibrated with a 0.1 M NaCl buffer deoxygenated for 30 minutes by bubbling Argon. 2 ml of bluish fraction corresponding to an elution of 25 to 27 ml are recovered in a flask. 2 mL of sodium meta bisulfite solution in NaCl buffer (2.5.10 "4 M) are then added to initiate the polymerization which takes place under an inert atmosphere, at 37 ° C.
- Table 2 • Preparation of the film 18 mg of lipid Al and 2 mg of telogen compound D are dissolved in 2 ml of a solution of Cumene hydroperoxide in dichloromethane freshly distilled and degassed by bubbling of Argon (2.5 ⁇ 10 ⁇ 4 M), in a heart flask. The solution is evaporated to dryness on a rotary evaporator (the bath temperature does not exceed 40 ° C) then the film is dried with a vane pump (1 hour) and placed under an inert atmosphere until use. In the case of priming with sodium dithionite, the film is prepared in freshly distilled dichloromethane and degassed by bubbling with Argon.
- NaCl (2.5.1G “4 M) are then added to initiate the telomerization which takes place under an inert atmosphere, at 37 ° C. and for 16 to 20 hours.
- Triethylamine TEA
- 27.07 g 97.23 mmol, 1.05 equ.
- triphenylmethyl chloride dissolved in 10 ml of THF are added dropwise to the mixture at a temperature below 30 ° C.
- the reaction medium is left under stirring, cold, maintaining the pH at 8-9 by adding TEA.
- the excess triphenylmethyl chloride is eliminated by adding a saturated NaHCO 3 solution before evaporating the THF under reduced pressure.
- the crude product is taken up in CH 2 C1 2 before being washed with a normal solution of HCl then NaHCO 3 and being dried over Na 2 SO 4 .
- the product is finally purified by chromatography on silica gel column eluted by gradient (cyclohexane / AcOEt 7: 3 to "1: 1) 28.8 g of pure product are obtained in the form of white powder Rfpr o d u i.. t : 0.4 (TLC - AcOEt / cyclohexane 7: 3). Yield: 89%.
- TE 17-20 compound 1.09 g (6.25 mmol, 5 equ.) Of Tris (hydroxymethyl) acrylamidomethane is dissolved in 15 ml of freshly distilled MeOH. The mixture is stirred and bubbled with argon and then heated. As soon as it boils, a solution containing 0.04 g (0.25 mmol, 0.2 equ.) Of AIBN and 0.8 g (1.25 mmol) of Compound 12 in a minimum of freshly distilled THF (approximately 1 mL ) and previously degassed with a stream of argon is injected.
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Abstract
Nouveaux composés tensioactifs, leur utilisation pour la préparation de systèmes supramoléculaires métastables, ou nanoparticules. Ces nanoparticules peuvent être utilisées comme vecteurs de principes actifs, notamment de principes actifs thérapeutiques.
Description
NOUVEAUX TENSIO-ACTIFS ET LEURS APPLICATIONS La présente invention a pour objet de nouveaux tensioactifs de type télomère, leur utilisation pour la préparation de systèmes supramoléculaires métastables. Ces systèmes supramoléculaires métastables ou nano particules peuvent être des liposomes, ou des systèmes micellaires. L'invention a également pour objet les liposomes et les nanoparticules atypiques obtenus à partir de ces tensio-actifs et leur utilisation comme vecteurs de principes actifs, notamment de principes actifs thérapeutiques. Certaines molécules amphiphiles, les phospholipides naturels, ont la propriété de s'associer dans l'eau en formant des organisations supramoléculaires métastables de formes sphériques appelées liposomes qui renferment un compartiment aqueux interne. Ces liposomes sont capables de renfermer des actifs thérapeutiques au sein de ce compartiment interne et peuvent ainsi servir à véhiculer ces actifs vers des cellules ou des tissus cibles. L'étude de ces vecteurs particulaires a fait l'objet d'une littérature abondante dans laquelle les problèmes ainsi que les potentialités de leur utilisation ont été largement abordés (Barenholz, Curr. Opin. In Coll. and Int. Sci. 6 (2001) 66-77). Toutefois, l'utilisation des liposomes pour le transport de principes actifs thérapeutiques présente quelques inconvénients majeurs : Ces nanostructures ont généralement une stabilité relativement faible dans le temps, car dans le milieu dans lequel elles sont dispersées, elles fusionnent pour former des objets plus larges qui précipitent ensuite rapidement. Ce comportement limite fortement leur capacité de conservation et de stockage. La stabilité biologique de ces vecteurs, c'est-à-dire leur temps de rétention dans la circulation sanguine, est étroitement associée à leur taille qui doit être inférieure à 200 nm pour leur permettre d'atteindre une cible potentielle (Nagayasu et al, Adv. Drug Del. Rev. 40 (1999) 75-87). Toutefois, les candidats les plus efficaces de ce point de vue : les liposomes uni lamellaires de petites tailles, présentent l'inconvénient d'être dotés d'un rapport médicament encapsulé / lipides plus faible que les liposomes uni lamellaires de grandes tailles (Vemuri et al., Pharm. Acta Helv. 70 (1995) 95-111). Les lipides formant ces nanostructures présentent généralement un coût de production élevé. La faible capacité d'encapsulation de principes actifs de certains de ces liposomes représente alors un problème économique. Enfin, il est indispensable de pouvoir disposer d'un vecteur qui puisse libérer son contenu de manière progressive et continue. De telles propriétés nécessitent d'avoir recours à des membranes hautement organisées et imperméables qui sont constituées de formulations de lipides complexes et coûteuses. Malgré ces difficultés un certain nombre de préparations pharmaceutiques à base de liposomes sont disponibles actuellement sur le marché ou sont en phase clinique. L'avantage le plus appréciable de ces préparations est leur excellente
tolérance par rapport à l'utilisation d'un principe actif libre. Leur efficacité à dose équivalente est cependant à peine supérieure. C'est le cas de l'amphotéricine B encapsulée en liposome (Ambisome®). Son encapsulation dans des formulations lipidiques augmente considérablement son index thérapeutique (Andres et al., Rev. Méd. Interne, 22 (2001) 141-150). Afin de diminuer leur élimination rapide par le système réticuloendothélial, des systèmes de protection des liposomes ont été mis en place. Le plus efficace consiste à utiliser des phospholipides substitués par des polyéthylène glycols de masse moléculaire comprise entre 1000 et 5000 dans une proportion de 5 à 10% du mélange total de phospholipides. Les liposomes « invisibles », dits furtifs, ainsi formés (commercialisés sous le nom de marque Stealth liposomes®) ont des temps de rétention sanguins supérieurs aux liposomes conventionnels (45h contre quelques minutes à quelques heures). L'augmentation du temps de circulation sanguine de ces liposomes favorise leur accumulation dans les tissus cancéreux qui sont particulièrement irrigués, et leur utilisation pour le transport de composés anticancéreux est particulièrement appropriée (Gabizon et al, Cancer Res. 54 (1994) 987-992). Une formulation de Stealth liposomes® à base de dauxorubicine (Doxil®, Alza Corp.) est actuellement commercialisée pour lutter contre le syndrome de Kaposi. Cependant certaines formulations constituées de liposomes de très petites tailles (50 nm) peuvent aussi être considérées comme des préparations à longue circulation. C'est le cas de la formulation anticancéreuse de daunorubicine commercialisée par eXstar (DaunoXome®). Afin d'assurer la stabilité mécanique des liposomes que ce soit lors de leur stockage ou de leur utilisation in vivo, plusieurs stratégies impliquant l'utilisation de polymères peuvent être envisagées : La polymérisation des tensioactifs constitutifs de la membrane du liposome après sa formation (Bader et a , Adv. Polym. Sci. 64 (1985) 1-62) et Hotz et a , Adv. Mater. 10 (1998) 1387-1390). L'interaction de polymères ioniques amphiphiles ou non à la surface de la membrane externe des liposomes (Hayashi et a , Biochim. Biophys. Acta, 1280 (1996) 120-126, Ishihara et al, Coll. and Surf., B : Biointerfaces 25 (2002) 325-333). Enfin, la polymérisation d'un monomère hydrophile à l'intérieur de la cavité aqueuse interne du liposome est une méthode qui a été peu étudiée et qui a été décrite sommairement par Torchilin et al. (Makromol. Chem., Rapid communication, 8 (1987) 457-460). Elle a été utilisée comme outil de fabrication d'empreinte moléculaire polymérisée dans un brevet américain (Perrot et a , US patent n° 6217901, 17 avril 2001). La limitation essentielle liée à l'utilisation de polymères pour stabiliser les liposomes est la toxicité potentielle induite par leur accumulation dans le lysosome ou par la toxicité propre du monomère hydrophile non polymérisé (cas de l'acrylamide). Afin
de limiter ce phénomène il est crucial d'utiliser des polymères de bas poids moléculaires plus facilement biodégradables. L'utilisation de micelles stabilisées à partir de composés amphiphiles polymérisés combinant des blocs hydrophiles et hydrophobes pour le transport d'actifs thérapeutiques peu solubles dans l'eau a fait l'objet d'un travail de recherche abondant (G.S. Kwon et al, Adv. Drug Deliver. Rev., 16 (1995) 295-309, M. Jones et al, Eur. J. Pharm. Biophar ., 48 (1999) 101-111, V.P. Torchilin. J. Control. Release, 73 (2001) 137- 172). Ces systèmes de vectorisation permettent notamment le transport et la solubilisation d'un certain nombre d'actifs anticancéreux, particulièrement les dérivés poly cycliques. Ceux-ci présentent en règle générale une très faible biodisponibilité par voie orale et leur injection par voie intraveineuse entraîne par agrégation des embolies des vaisseaux sanguins ainsi qu'une toxicité locale par dépôt solide (A.N. Lukyanov et al, Adv. Drug Deliver. Rev., (2004) disponible sur internet Science Direct). L'utilisation de liposomes, de microémulsions ou de cyclodextrines sont des solutions prometteuses mais qui présentent encore trop de limitations notamment une variabilité trop importante de la solubilisation de ces actifs peu solubles qui dépend en grande partie de leur structure. La mise au point de systèmes micellaires polymériques de petites tailles représente donc une alternative intéressante à ces technologies à laquelle nous nous sommes intéressés. Grâce à une CMC particulièrement basse, les tensioactifs polymériques constituant ces micelles leur confèrent une stabilité thermodynamique particulièrement élevée et une capacité de rétention des actifs encapsulés très importante. La taille très faible des ces nanoparticules (inférieure à 100 nm) leur apporte une excellente stabilité in vivo ainsi qu'un ciblage passif des sites tumoraux particulièrement irrigués. Un ciblage actif de ces vecteurs peut-être réalisé par recouvrement de leur surface par des molécules cibles tels que des anticorps, des peptides, des lectines, des sucres, des hormones ou des composés synthétiques spécifiques. La littérature cite un nombre important de polymères à caractère amphiphile. Ce sont généralement des polymères de type di-block constitués de différents monomères hydrophiles et hydrophobes (M. Jones et al, Eur. J. Pharm. Biopharm., 48 (1999) 101-111, V.P. Torchilin, J. Control. Release, 73 (2001) 137-172). D'autres amphiphiles dérivés de phospholipides et de polymères de polyéthylène glycol et de polyvinyl pyrrolidone ont également été étudiés (A.N. Lukyanov et al, Adv. Drug Deliver. Rev., (2004) disponible sur internet Science Direct). Un premier objectif de la présente invention est la mise au point de vecteurs nano particulaires à très faible coût de production et ayant la capacité de transporter à l'intérieur de leur cavité aqueuse interne une famille très large d'actifs hydrophiles. Les vecteurs nano particulaires de l'invention permettent l'encapsulation, la rétention et la libération de substances dosables. Les applications visées incluent le
transport de principes actifs, notamment de principes actifs thérapeutiques, la délivrance épidermique de substances cosmétiques, le diagnostic médical. Notamment le transport d'actifs anticancéreux, d'actifs à usage vaccinal, de matériel génétique, d'enzymes, d'hormones, de vitamines, de sucres, de protéines et de peptides, de lipides, de molécules organiques et inorganiques. Cet objectif a été atteint grâce à la conception et à la synthèse de nouveaux tensioactifs qui permettent de préparer des vecteurs nano particulaires ou liposomes dotés de propriétés avantageuses par rapport aux liposomes de l'art antérieur. Un second objectif de la présente invention est la mise au point de vecteurs nano particulaires à très faible coût de production et ayant la capacité de transporter à l'intérieur de leur cavité hydrophobe ou de leur feuillet lipidique une famille très large d'actifs hydrophobes. Les vecteurs nano particulaires de l'invention permettent l'encapsulation, la rétention et la libération de substances dosables. Les applications visées incluent le transport de principes actifs, notamment de principes actifs thérapeutiques, la délivrance épidermique de substances cosmétiques, le diagnostic médical. Notamment le transport d'actifs anticancéreux, d'actifs à usage vaccinal, de matériel génétique, d'enzymes, d'hormones, de vitamines, de sucres, de protéines et de peptides, de lipides, de molécules organiques et inorganiques. Cet objectif a été atteint grâce à la conception et à la synthèse de nouveaux tensioactifs de type télomère qui permettent de préparer des micelles et nanoparticules ellipsoïdales ou liposomes dotées de propriétés avantageuses par rapport aux micelles polymériques de l'art antérieur.
La présente invention a pour objet les composés répondant à la formule
dans laquelle : « Y représente un atome de soufre ou un groupement O — NH — (CH2 )n X ^ ^tant choisi parmi les groupements S et CH2, n est un entier allant de 0 à 10, tel que par exemple 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ;
• m est un entier allant de 0 à 9, tel que par exemple 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et lorsque X=CH2 alors 0<m+n<6 • W représente un groupement -NH- ou un groupement -CH2- • p représente un entier allant de 1 à 50 • Ri représente un groupement choisi parmi les radicaux suivants :
dans lesquels R' représente H ou un groupement hydrophile, comme par exemple un composé hydrocarboné polyhydroxylé en C4-C2 ; notamment R' peut être choisi parmi les sucres comme par exemple le galactose, le glucose, le mannose, l'acide sialique, lié par son carbone anomère ; • R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C 4 ; les radicaux thioalkyls en C - C24. Le groupement R peut notamment être choisi parmi les radicaux suivants : Le radical thiooctyl Les radicaux hydrocarbonés en C -C24 tels que le n-butyle, le ter- butyle, l'isobutyle, le n-pentyle, l'isopentyle, le n-hexyle, le n-heptyle, le n-octyle, le n- nonyle, le n-décyle, le n-undécyle, le n-dodécyle, le n-tridécyle, le n-tétradécyle, le n- pentadécyle, le n-hexadécyl, le n- heptadécyle, le n-octadécyle, le radical phytyl
(CH3[CH(CH3)(CH2)3]3CH(CH3)CH2CH2)), Les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C2 tels que ceux répondant à la formule -(CH2)r(CF2)rF, dans laquelle r et t représentent deux entiers avec : 24 > r+t > 4, comme par exemple : -(CF2)4F ; -(CF2)5F ; -(CF2)6F ; -(CF2)7F ; -(CF2)8F ; -(CF2)9F ; -
(CF2)10F ; -(CF2)„F ; -(CF2)12F ; -(CF2)13F ; -(CF2)14F ; -CH2-(CF2)3F ; -CH2-(CF2)4F ; - CH2-(CF2)5F ; -CH2-(CF2)6F ; -CH2-(CF2)7F ; -CH2-(CF2)8F ; -CH2-(CF2)9F ; -CH2- (CF2)10F ; -CH2-(CF2)nF ; -CH2-(CF2)12F ; -CH2-(CF2)13F ; -(CH2)2-(CF2)2F ; -(CH2)2- (CF2)3F ; -(CH2)2-(CF2)4F ; -(CH2)2-(CF2)5F ; -(CH2)2-(CF2)6F ; -(CH2)2-(CF2)7F ; -(CH2)2- (CF2)8F ; -(CH2)2-(CF2)9F ; -(CH2)2-(CF2)10F ; -(CH2)2-(CF2)„F ; -(CH2)2-(CF2)12F ; - (CH2)3-(CF2)1F ;; -(CH2)13-(CF2)F . ; -(CH2)4(CF2)6F ; -(CH2)4(CF2)8F ; (CH2)4(CF2)10F ; - (CH2)10(CF2)6F ; -(CH2)10(CF2)8F ; -(CH2)10(CF2)10F....
Selon une première variante préférée, la présente invention a pour objet les composés répondant à la formule (IA) :
(IA) dans laquelle : X représente un atome de soufre S ou un groupement -CH - ; n est un entier allant de 0 à 10, tel que par exemple 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ; m est un entier allant de 0 à 9, tel que par exemple 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ; lorsque X=CH2 alors 0<m+n<6 ; R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C2 ; les radicaux thioalkyls en C4-C 4. Les chaînes R préférées sont celles qui contribuent à donner au tensioactif de formule (I) une température de transition de phase supérieure à 37°C. En effet, lorsque de tels tensioactifs sont utilisés pour la fabrication de liposomes, ces tensioactifs, possédant une structure cristalline à température physiologique, apportent à la membrane des liposomes une rigidité supérieure et un degré de rétention plus important des solutés encapsulés dans le compartiment aqueux interne. De préférence R représente une chaîne hydrocarbonée en Cι -C2 ou une chaîne hydrocarbonée fluorée en C8-C24. Préférentiellement l'une ou plusieurs des conditions suivantes sont vérifiées : X=S ; n=2, m=l. Les composés de formule (IA) préférés sont ceux répondant à la formule A dans laquelle R a la même définition que ci-dessus n=2, X=S, m=l :
Formule A Parmi ceux-ci, un composé particulièrement préféré est Al représenté ci- dessous :
La synthèse des molécules de formule (I) peut être faite de façon simple en utilisant les méthodes classiques de la synthèse organique. Plusieurs exemples de synthèse sont illustrés dans la partie expérimentale. Un autre objet de l'invention consiste dans l'utilisation des molécules de formule (I), avantageusement des molécules de formule (IA) pour la fabrication de liposomes. Les liposomes de l'art antérieur ont leurs parois généralement constituées de phospholipides. Les liposomes sont fabriqués à partir des tensioactifs de formule (I), préférentiellement de formule (IA) très facilement par la méthode du film (Liposomes, a practical approach, R.R.C. New, Ed., Oxford University Press, New- York, 1990). Ce procédé peut être résumé de la façon suivante : Une solution de tensioactif (I) ou (IA) dissous dans du méthanol ou du chloroforme est évaporée lentement dans un ballon afin de former un film fin sur la paroi du ballon. De l'eau distillée à 65°C est additionnée afin de réhydrater le film, à une concentration de 2,5 mg/ml. La solution obtenue est ensuite soumise aux ultrasons pendant 30 minutes dans un bain de sonication à une température supérieure à la température de transition de phase du tensioactif dispersé jusqu'à obtention d'une solution translucide bleutée. On peut également pour cette dernière étape remplacer la sonication par une extrusion répétée de la solution au travers de deux filtres de polycarbonate de porosité 200nm, montés en série. Un double traitement de sonication et d' extrusion peut également être prévu. D'autres méthodes classiques de préparation de liposomes peuvent être utilisées pour la préparation des liposomes de l'invention. On peut à cet effet se reporter à S. Vemuri et C.T.Rhodes, Pharmaceutica Acta Helvetiae 70, (1995), 95-111. De façon étonnante on observe la formation de vésicules de forme allongée, désignées vésicules tubulaires en raison de leur taille, qui est de l'ordre de quelques dizaines de nanomètre, et de leur forme qui rappelle celle d'un tube fermé à ses deux extrémités. La taille et la stabilité mécanique dans le temps des particules obtenues dans la solution ont été mesurées après filtration par diffraction dynamique de la lumière
(High Performance Particle Sizer, Malvern). La nature des particules obtenues a été étudiée par microscopie électronique par transmission après coloration négative de l'échantillon ou après cryofracture (figure 4). Les mesures de forme et de taille établies par l'observation des clichés de microscopie électronique ont permis de mettre en évidence la formation de liposomes de forme allongée dénommés vésicules tubulaires, refermés à leurs extrémités, dont la section moyenne est comprise entre 20 et 80 nm et la longueur moyenne est comprise entre 200 et 500 nm (figure 3). Les analyses en cryofracture ont confirmé la formation de ces vésicules tubulaires et leurs caractéristiques morphologiques à savoir la présence d'une cavité aqueuse interne isolée du milieu extérieur (figure 5). Pour un tensioactif de formule (IA) donné la taille des particules est sensiblement homogène : elle varie dans une fourchette de valeur de + 10%, préférentiellement de + 5%, autour d'une valeur centrale de longueur et de diamètre. Ces vésicules tubulaires ont une stabilité relativement élevée puisque l'on n'observe aucune évolution de la taille des particules après un an de stockage tandis que des liposomes formés de phosphatidyl choline de jaune d'œuf montrent une évolution après seulement 5 jours de stockage. La mise en évidence de la cavité interne aqueuse a été prouvée indirectement par des mesures spectrofluorimétriques de l'encapsulation et des cinétiques de relargage d'une sonde fluorescente hydrophile, la carboxyfiuorescéine. Les mesures montrent clairement une cinétique de relargage plus lente de la sonde fluorescente comparée à une encapsulation traditionnelle dans un mélange de phosphatidyl choline de jaune d'œuf (figure 1). Nous avons pu mettre en évidence que les liaisons hydrogène intermoléculaires entre les tensioactifs constituant les vésicules tubulaires étaient à l'origine de leur morphologie et de leur stabilité particulière. En effet, les fonctions alcool du tris(hydroxyméthyl) aminométhane ainsi que les fonctions carbamate ont la propriété de pouvoir générer un réseau de liaisons hydrogène entre les tensioactifs constituant la membrane, stabilisant ainsi les vésicules tubulaires. Ceci a pu être mis en évidence par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier en phase liquide (dans CC14). On note en effet, sur le spectre une augmentation de l'intensité de la bande à 1691 cm"1 caractéristique des fonctions carbonyles liées à un atome d'hydrogène, lorsque la concentration en tensioactif dans la solution augmente au détriment de son homologue non lié (figure 2). II est à noter que la substitution dans le tensioactif de formule (IA) des liaisons carbamate par des liaisons ester entre les chaînes grasses et le motif glycérol, comme illustré dans la structure B, conduit à la formation dans l'eau de liposomes de structures traditionnelles dont la stabilité mécanique est seulement de quelques heures,
confirmant ainsi l'hypothèse émise de stabilisation et d'organisation des vésicules tubulaires par l'établissement de liaisons hydrogène particulières (figure 6).
Structure B
L'invention a en outre pour objet des liposomes, ou dispersions aqueuses de vésicules, caractérisés en ce qu'ils comportent un ou plusieurs composés de formule (I), avantageusement de formule (IA) comme constituants de leurs parois. Ces liposomes présentent des caractéristiques de structure originales qui leurs confèrent des propriétés inattendues, en particulier une stabilité améliorée par rapport aux liposomes de l'art antérieur. Les liposomes de l'invention ont également montré une capacité à libérer un principe actif sur une plus longue durée par rapport aux liposomes de l'art antérieur. Selon une seconde variante préférée, l'invention a pour objet les composés répondant à la formule (IB) :
(IB) dans laquelle : Y représente un atome de soufre ou le groupement — NH-CO-CH CH2S- W représente un groupement -NH- ou un groupement -CH2- p représente un entier allant de 1 à 50 Ri représente un groupement choisi parmi les radicaux suivants :
dans lesquels R' représente H ou un groupement hydrophile, comme par exemple un composé hydrocarboné polyhydroxylé en C4-C24. Notamment R' peut être choisi parmi les sucres comme par exemple le galactose, le glucose, le mannose, l'acide sialique, lié par son carbone anomère. R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en
C -C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C 4 ; les radicaux thioalkyls en C4-C24. Les chaînes R préférées sont celles qui contribuent à donner aux tensioactifs de formule (IB) une Concentration Micellaire Critique (CMC) inférieure à 10"5 M. Une CMC basse apporte en effet à la nanoparticule une stabilité thermodynamique plus importante ainsi qu'une capacité de rétention plus importante des solutés encapsulés dans le compartiment hydrophobe interne. De préférence R représente une chaîne hydrocarbonée en C1 -C2 ou une chaîne hydrocarbonée fluorée en C8-C 4. La synthèse des molécules de formule (IB) peut être faite de façon simple en utilisant les méthodes classiques de la synthèse organique. Plusieurs exemples de synthèse sont illustrés dans la partie expérimentale. En résumé, lorsque la molécule de formule (IB) est synthétisée avec un groupement R de type thioalkyle, celle ci est utilisée comme agent de transfert dans une réaction de télomérisation en présence du réactif polymérisable hydrophile (de type Tris(hydroxymethyl) acrylamidométhane ou ses dérivés ou vinylpyrolidonne) et d'un amorceur radicalaire tel que Tα,α'azobisbutyronitrile (AIBN) en solution dans le méthanol, le THF ou l'acétonitrile portés à l'ébullition. La proportion initiale de monomère polymérisable et d'agent de transfert permet de contrôler le degré de polymérisation du télomère et donc la solubilité du produit. Ces derniers sont obtenus par précipitation dans l'éther. Les composés de formule (IB) préférés sont ceux pour lesquels Y représente S. Une autre variante préférée est celle dans laquelle p représente un entier allant de 5 à 15. De façon encore plus avantageuse, on préfère les composés répondant à la formule C ci-dessous dans laquelle R a la même définition que ci-dessus, p représente un entier allant de 5 à 15, W=CH2 :
Composé C Parmi ceux-ci un composé particulièrement préféré est Cl représenté ci- dessous :
Composé Cl
Un autre objet de l'invention consiste dans l'utilisation des composés de formule (I), avantageusement des composés de formule (IB) pour la préparation de nanoparticules à cavité hydrophobe et les nanoparticules ainsi obtenues. Les particules sont fabriquées à partir des tensioactifs de formule (I) ou (IB) très facilement par la méthode du film qui est bien connue de l'homme du métier et qui est décrite dans l'ouvrage Liposomes, a practical approach, R.R.C. New, Ed., Oxford University Press, New- York, 1990. On procède comme exposé ci-dessus pour les composés de formule (IA). De façon étonnante, à partir des composés de formule générale (IB), dont la valeur de p est inférieure à 15 et lorsque R représente une chaîne hydrocarbonée comprenant au moins 12 atomes de carbone, on observe la formation de nanoparticules de forme allongée, désignées ellipsoïdes en raison de leur forme en grain de riz (figure 7a). Etude des particules ellipsoïdes obtenues à partir des composés de structure (IB) En effet, à partir des dérivés de formule générale (IB), lorsque p est compris entre 5 et 15, on observe la formation de particules originales dont la forme évoque un grain de riz et dont la taille diminue lorsque p augmente (figure 8). Lorsque p est supérieur à 15 la taille des objets obtenus est inférieure à 10 nm et la nature des agrégats formés est essentiellement micellaire. La taille et la stabilité mécanique dans le temps des particules obtenues dans la solution ont été mesurées après filtration par diffraction dynamique de la lumière (High Performance Particle Sizer, Malvern). La nature des particules obtenues a été étudiée par microscopie électronique par transmission après coloration négative de l'échantillon ou après cryofracture. La Concentration d'Agrégation Critique de ces tensioactifs a été déterminée par tensiométrie et par spectrofluorimétrie par la méthode du marqueur fluorescent. En outre la technique de tensiométrie de Wilhelmy a permis de déterminer les tensions superficielles limites et l'aire de la tête polaire à l'interface eau-air (figure 8). Ces composés présentent des CMC relativement basses de l'ordre de 10"5 M. La CMC de ces tensioactifs n'évolue quasiment pas en fonction de p (figure 8). Pour faire évoluer cette
valeur à la baisse ou à la hausse il faut respectivement augmenter ou diminuer la longueur des chaînes hydrocarbonées. La température de transition de phase de ces tensioactifs a été déterminée par spectrofluorimétrie de polarisation et par diffusion de la lumière (figure 9). La température de transition de phase n'évolue quasiment pas pour des longueurs de chaînes constante lorsque p augmente (41°C<Tm<44°C) Le diamètre hydrodynamique (DH) des édifices supramoléculaire suit une loi inverse à la variation du degré de polymérisation moyen des télomères : au plus le volume relatif de la partie polaire est important, au plus la courbure des membranes est importante (figure 8). Ce résultat a été confirmé par microscopie électronique. Au delà de p^O, tous les clichés montrent des solutions micellaires (figure 7b). En revanche, en deçà de cette valeur, ils présentent des édifices supramoléculaires ressemblant à des objets oblongs en forme de grain de riz qui ne présentent pas de cavité aqueuse interne en MET après coloration négative (figure 7a). Par granulométrie, il apparaît que pour le composé de structure (C) avec p = 5 et R = C1 H35, le diamètre hydrodynamique des particules obtenues est de 148 nm.
Ces objets présentent une stabilité très grande dans le temps qui augmente proportionnellement à la valeur de p (de 2 semaines pour p=5 à plusieurs mois pour p=25). Ces particules ellipsoïdales présentent des caractéristiques de structure originales et leur diamètre hydrodynamique moyen peut être modulé aisément par la variation de p, c'est-à-dire du nombre de motifs monomériques constituant la partie hydrophile polymérique. Les particules de l'invention ont également montré une capacité à encapsuler des actifs hydrophobes. Cette incorporation peut être réalisée en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, l'encapsulation peut être réalisée par dissolution de l'actif dans une solution préformée d'ellipsoïdes ou de micelles, par la procédure huile dans l'eau ou par dialyse. Les composés thérapeutiques qui peuvent être encapsulés sont tous les composés, de préférence hydrophobes, qui peuvent être incorporés de manière stable à ces édifices micellaires ou ellipsoïdes. Différentes familles de principes actifs peu hydrophiles ou hydrophobes peuvent être encapsulés ou dissous par l'intermédiaire de ces objets incluant les anticancéreux, des antibiotiques, des immunomodulateurs, des stéroïdes, des antiinflammatoires ou des nucléotides. Les composés hydrophiles susceptibles de se complexer à la partie polaire des nanoparticules peuvent également être encapsulés ou vectorisés. La dose d'actif effectivement encapsulée dans ces nanoparticules est déterminée après filtration de l'actif non encapsulé par CLHP, par spectrométrie UN ou de fluorescence ainsi que par RMΝ 1H. Outre les composés de formule (I), les nanoparticules, micellaires, ellipsoïdales ou liposomes, de l'invention peuvent comporter en outre de préférence au moins un composé répondant à la formule (II) ci-dessous :
(n) dans laquelle : - Y représente un atome de soufre ou le groupement -NH-CO-(CH2)n-X- dans lequel X représente un atome de soufre S ou un groupement -CH2-, n est un entier allant de 0 à 10 ; - représente un groupement -NH- ou -CH2- - x représente 0 ou un nombre entier allant de 1 à 30 ; - y représente 0 ou un nombre entier allant de 1 à 10 ; - R! représente un groupement hydrophile choisi parmi les radicaux suivants
dans lesquels R' représente H ou un groupement hydrophile, comme par exemple un composé hydrocarboné polyhydroxylé en C4-C2 ; notamment R' peut être choisi parmi les sucres comme par exemple le galactose, le glucose, le mannose, l'acide sialique, lié par son carbone anomère ; - R représente un groupement de reconnaissance qui est choisi en fonction de la cible cellulaire, de préférence il est choisi parmi les groupements ayant une affinité prononcée pour la cible biologique du principe actif véhiculé dans la nanoparticule. R2 peut être de nature saccharidique (ciblage des lectines membranaires spécifiques qui se retrouvent dans des tissus particuliers et qui reconnaissent sélectivement soit le galactose -cas du foie, des os, de certaines tumeurs cancéreuses-, soit le mannose - cas des macrophages, du cœur-, soit l'acide sialique- cas des érythrocytes -...), de nature hormonale (tels que des stéroïdes), de nature synthétique tel que le gleevek pour cibler les kinases, des anticorps spécifiques, la biotine qui se lie à certaines protéines spécifiques, et plus généralement tout substrat dont les recherches antérieures ont démontré la spécificité de reconnaissance. On peut citer, par exemple, parmi les peptides utilisables dans la présente invention : la séquence RGD, connue pour son affinité pour les intégrines αNβ3.
On peut prévoir qu'une même molécule de formule (II) comporte un ou plusieurs groupements R2 de reconnaissance identiques ou plusieurs groupements de reconnaissance R2 différents, ce qui permet de diriger les particules vers plusieurs cibles biologiques distinctes. - Le groupement R obéit aux mêmes règles que celles précédemment définies pour la structure du composé de formule (I). - Z est un bras espaceur qui relie le groupement de reconnaissance R à la chaîne polymérique. Z est lié à R2 au moyen d'une liaison qui peut être choisie parmi les fonctions -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-O-, O-CO-O-, -O-, -CH=N-, -S- ou par complexation d'un atome de nickel (WoodleChikh et Lasical, Biochim. Biophys. Acta, 1113 (1992) 171-1999).Acta, 1567 (2002) 204-212). Celui ci peut se lier d'une part à un tag de polyhistidine fixé sur l'agent de ciblage et d'autre part à un polyacide de type NTA fixé sur la chaîne polymérique. Le bras espaceur Z peut être constitué d'une chaîne peptidique. Celle-ci peut être fixée sur la chaîne oligomérique par l'intermédiaire de la chaîne latérale ou principale de l'aminoacide situé en extrémité. Ce bras espaceur comprend 1 à 5 acides aminés, préférentiellement 1 à 3 acides aminés. Les acides aminés constituant le bras espaceur Z, sont choisis parmi les acides aminés naturels comme l'alanine, l'arginine, l'asparagine, l'acide aspartique, la cystéine, la glutamine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine, la valine, ou les acides aminés non naturels tels que l'hydroxyproline, la norleucine, l'ornithine, la citrulline, la cyclohexylalanine. Ce bras espaceur Z peut être constitué d'un résidu tyrosine permettant le suivi in vivo du vecteur après marquage à 125I OU 131I. On peut également envisager d'employer comme groupement Z des acides Ω-aminés tels que l'acide 3-aminopropionique et l'acide 4-amino-butyrique, mais également l'éthanolamine, la 3-propanolamine ou des diamines de formule -NH-(CH2)r-
NH- dans laquelle r représente un entier allant de 2 à 6. Lors d'une liaison par complexation d'un atome de nickel, le groupement
-Z-R2 est constitué par un groupement NTA de formule :
Selon la première variante de l'invention qui concerne les liposomes formés à partir de molécules de formule (IA), les composés de formule (II) préférés sont ceux de formul
(IIA) dans laquelle X, n, x, y, R, Ri et R2 ont la même définition que ci-dessus dans la formule (II). - de préférence x et y ne sont pas nuls simultanément ; - de préférence X représente S ; - de préférence n=2. Selon la seconde variante de l'invention qui concerne les liposomes formés à partir de molécules de formule (IB), les composés de formule (II) préférés sont ceux de formule (IIB) ci-dessous :
(IIB) dans laquelle : - Y représente un atome de soufre ou le groupement -NH-CO-CH2CH2S- - W, x, y , Z, R, Ri, R2 ont la même définition que dans la formule (II) ci- dessus. De préférence, les nanoparticules (liposomes, vésicules tubulaires, micelles ou particules ellipsoïdales) de l'invention comportent de 1 à 5% d'un ou plusieurs composés de formule (II) ce qui permet de favoriser le ciblage de ces nanoparticules vers leur cible biologique sans altérer leur organisation.
Ces télomères lipidiques de formule (II) présentent l'avantage grâce à leur partie hydrophile oligomérique de pouvoir éloigner les agents de reconnaissance greffés de la surface des vésicules tubulaires, favorisant ainsi leur reconnaissance par les cellules ou les tissus cibles. L'autre avantage lié à l'utilisation de ces lipides de ciblage (II) est la possibilité de multiplier les motifs de reconnaissance sur un seul composé grâce à la technique de télomérisation. Les facteurs x et y sont en effet faciles à contrôler et vont dépendre assez étroitement de la proportion de monomères et d'agent télogène mis en réaction. La ligation des agents de reconnaissance peut être réalisée avant la télomérisation de la tête hydrophile si il y a compatibilité avec les conditions réactionnelles. Les agents de reconnaissance peuvent également être fixés sur la tête polaire oligomérique après formation des vésicules tubulaires. La partie hydrophile télomérisée est alors fonctionnalisée par des groupements susceptibles d'assurer le couplage avec ces agents de reconnaissance. Les différentes techniques de couplage susceptibles d'être utilisées sont bien connues de l'homme du métier et elles sont notamment décrites dans : Allen et al, Biochim. Biophys. Acta, 1237 (1995) 99-108 ; Sapra, Prog. Lipids Res., 42 (2003) 439-462, Hansen et al, Biochim. Biophys. Acta, 1239 (1995) 133-144. Les composés de formule (II) constituent un autre objet de l'invention. Les composés de formule (I) et de formule (II) décrits ci-dessus peuvent être regroupés sous une même formule (III) :
dans laquelle R, W, m et Y ont la même définition que dans les formules
(I) et (II) ci-dessus et R3 représente un groupement choisi parmi :
(IV) (V)
Ri ayant la même définition que dans les formules (I) et (II), p ayant la même définition que dans la formule (I), x, y, Z, R2 ayant la même définition que dans la formule (II). En particulier, les composés de formule (IA) et de formule (IIA) peuvent être regroupés sous une formule commune (IIIA) :
(IIIA) dans laquelle X, n et R ont la même définition que dans les formules (IA) et (IIA) et R3 représente un groupement choisi parmi :
(V)
m ayant la même signification que dans la formule (IA) Ri, R , Z, x et y ayant la même signification que dans la formule (IIA) Les composés de formule (IB) et de formule (IIB) définis ci-dessus peuvent être regroupés sous une formule commune (IIIB) :
(IIIB)
dans laquelle R, W et Y ont la même définition que dans les formules (IB) et (IIB) et R3 représente un groupement choisi parmi :
(IN) (V) Ri ayant la même définition que dans les formules (IB) et (IIB), p ayant la même définition que dans la formule (IB), x, y, Z, R2 ayant la même définition que dans la formule (IIB). Selon une variante préférée de l'invention, les liposomes ou vésicules tubulaires de l'invention formés à partir des composés de formule (IA), et éventuellement (IIA) sont stabilisés par télomérisation ou polymérisation d'un monomère de type acrylique contenu dans leur cavité aqueuse interne. De manière à limiter le relargage des solutés encapsulés dans ces vésicules tubulaires et à augmenter leur stabilité mécanique il est possible d'introduire à l'intérieur du compartiment aqueux interne des vésicules tubulaires une matrice oligomérique ou polymérique. La matrice oligomérique est fabriquée après encapsulation du ou des monomères constitutifs dans les vésicules tubulaires et élimination des monomères non encapsulés par des techniques de séparation sur gel d'exclusion de taille. La télomérisation, qui consiste à former le polymère en présence d'un agent de transfert de chaîne, permet d'accéder à des petits polymères de taille contrôlée. La masse moléculaire réduite de ce polymère favorise son élimination par voie rénale. En évitant l'accumulation de polymère dans le lysosome on évite également des problèmes de toxicité. Les nanoparticules, liposomes ou vésicules tubulaires, comprenant, outre les tensioactifs de formule (IA), au moins un oligomère ou télomère tel que décrit ci- dessous constituent un autre objet de l'invention. L' oligomère ou le télomère est constitué de blocs de construction monomériques, hydrophiles, ioniques ou non ioniques, choisis parmi les dérivés acide acrylique, acide méthacrylique, méthacrylamide, ainsi que les dérivés acrylate, méthacrylate, acrylamide et méthacrylamide d'alcools en Cι-C6, de polyols en C -Cι2j de sucres et d'aminoacides.
Ces sucres peuvent être Des sucres simples tels que : le glucose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, mannose, galactose, fructose, talose.
Des disaccharides tels que le maltose, le saccharose, ou le lactose Les aminoacides peuvent être choisis parmi les acides aminés naturels comme l'alanine, l'arginine, l'asparagine, l'acide aspartique, la cystéine, la glutamine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine, la valine, ou les acides aminés non naturels tels que l'hydroxyproline, la norleucine, l'ornithine, la citrulline, la cyclohexylalanine. Parmi les monomères commercialement disponibles utilisables dans le procédé de l'invention, on peut mentionner par exemple : Le Tris(hydroxy)méthyl acrylamidométhane, l'acrylate de sodium, l'hydroxyéthyl acrylate, le glucose monoacrylate, le glucose- 1 -(N-méthyl)acrylamide, le glucose 2-acrylamide, le maltose 1- acrylamide, le monoacrylate de sorbitol. Afin de modifier les capacités de rétention et de stabilisation du télomère il est possible d'utiliser dans la fabrication du télomère des agents de réticulation hydrosolubles tels que : le glucose- 1,2-diacrylami de, le sorbitol diacrylate, le saccharose diacrylate, le saccharose di(éthylènediamine acrylamide), le kanamycin tétracrylamide, le kanamycin diacrylamide, ou d'autres sucres di ou polyfonctionnalisés par des acrylates ou des acrylamides. En règle générale tous les composés hydrophiles susceptibles de recevoir au moins deux groupements acrylate ou acrylamide peuvent être utilisés. C'est le cas par exemple du dérivé acrylate de tris(hydroxyméthyl) acrylamidométhane (composé E):
Composé E Ces agents de réticulation sont utilisés dans des proportions allant de 1 à 5% en poids par rapport au poids du ou des monomères. La taille du télomère est contrôlée en utilisant un ou plusieurs agents de transfert hydrophiles ou hydrophobes qui sont insérés dans la membrane ou la cavité aqueuse interne des nanoparticules et particulièrement des vésicules tubulaires. L'agent de transfert de chaîne peut être hydrophile ou hydrophobe, de type thiol ou phosphite. Les agents de transfert de chaîne employés sont choisis parmi les thiols hydrophiles tels que l'acide thiol acétique, l'acide mercaptopropionique, le thioéthylene glycol, la cystamine, la cystéine ou les thiols hydrophobes tels que les alcane thiols de C2 à C30, comme par exemple le composé D (dérivé du cholestérol) qui est connu pour sa capacité à s'intégrer
dans les membranes phospholipidiques. La synthèse du composé D est décrite notamment dans M. Wathier et al, Chem. Phys. Lipids (2002), 115, 17-37.
L'agent de transfert de chaîne peut encore être choisi parmi les thiols bicatenaires précédemment décrits. Les phosphites peuvent quant à eux être hydrophiles tels que le phosphite de diéthyle ou hydrophobes tels que les phosphites de dioctyle, didodécyle, dihexadécyle. Afin d'éviter de désorganiser la membrane des vésicules tubulaires il est préférable que la structure hydrophobe de ces thiols hydrophobes se rapproche de celle des tensioactifs la constituant. Le motif commun de ces agents télogènes est avantageusement constitué d'un motif aminoglycérol sur lequel sont greffées des chaînes grasses par des liaisons carbamate suivant la formule (VI) :
(VI) dans laquelle R a la même signification que dans les formules (I) (II) et (III) ci-dessus. Afin de moduler le degré de polymérisation il est possible de faire varier la proportion d'agent de transfert de chaîne incorporée dans la membrane par rapport à la quantité de monomères encapsulés. Le rapport de l'agent de transfert de chaîne / tensioactif lipidique (I) varie préférentiellement de 1 à 10% en poids/poids. Le rapport agent de transfert de chaîne / monomère varie de 0,1 à 10 % en poids/poids. La polymérisation peut être initiée de façon connue par irradiation ultraviolette ou par des photoinitiateurs, par des couples d'initiateurs redox, par la chaleur ou par des initiateurs radicalaires thermiques et plus généralement par toutes les techniques classiques décrites dans la littérature (G. Odian, Principles of polymerization, 3.sup.rd Ed,
Wiley, New York, 1991).
A la fin de la polymérisation, la cavité aqueuse interne des vésicules tubulaires comporte un télomère hydrophile muni éventuellement d'une partie hydrophobe télogène intégrée dans le feuillet membranaire interne. La description physico-chimique de ces vésicules tubulaires stabilisées est dom ée dans la partie expérimentale et leur capacité de rétention supérieure d'un soluté encapsulé et leur stabilité mécanique accrue sont démontrées. Les applications visées incluent le transport de principes actifs, notamment de principes actifs thérapeutiques, la délivrance épidermique de substances cosmétiques, les agents de diagnostic médical. Notamment le transport d'actifs anticancéreux, de vaccins, de matériel génétique, d'enzymes, d'hormones, de vitamines, de sucres, de protéines et de peptides, de lipides, de molécules organiques et inorganiques. Dans le cadre d'une utilisation vaccinale, les épitopes et peptides pourront être incorporés dans la matrice aqueuse interne ou exprimés à la surface des vésicules tubulaires par un système de liaison covalente afin d'améliorer la réponse immunitaire des épitopes. La présente invention a donc en outre pour objet toute composition, notamment toute composition thérapeutique, de diagnostic vaccinale ou cosmétique comprenant au moins un principe actif en association avec une nanoparticule, liposome, vésicule tubulaire, ellipsoïde ou micelle, telle que décrite ci-dessus, et en particulier toute composition comprenant au moins un principe actif encapsulé dans un liposome ou vésicule tubulaire, ellipsoïde ou micelle selon la présente invention.
PARTIE EXPERIMENTALE FIGURES : La figure 1 illustre la cinétique de libération de la carboxyfluorescéine encapsulée dans des liposomes de phosphatidyl choline (+) et des vésicule tubulaires constituées du composé Al (•) mesurée en spectrofluorimétrie. La figure 2 représente le spectre infra rouge en phase liquide d'une 9 -A solution du composé Al dans CC14 à différentes concentrations (1.10" à 2,5.10 M). La figure 3 représente la courbe de distribution en taille par volume des vésicules tubulaires, mesurée par microscopie électronique. La figure 4 est une photographie obtenue par microscopie électronique par transmission de phase après coloration négative à l'acétate d'uranyle 2% de vésicules tubulaires formées par dispersion du composé Al (2,5 mg.ml"1) dans l'eau. La figure 5 est une photographie obtenue par microscopie électronique par transmission de phase après cryofracture d'un échantillon de vésicules tubulaires formées par dispersion du composé Al (2,5 mg.ml"1) dans l'eau.
La figure 6 est une photographie obtenue par microscopie électronique par transmission de phase après coloration négative à l'acétate d'uranyle 2% d'un échantillon de vésicules tubulaires formées par dispersion du composé de structure B (2,5 mg.ml"1) dans l'eau. La figure 7 représente des clichés de Microscopie Electronique par
Transmission de phase (coloration négative à l'acétate d'uranyle 20 %) de dispersions aqueuses de composés de formule C avec R=Cι H35 et p=5 (a) et R=Cι H35 et p=20 (b), et de microscopie électronique après cryofracture du composé de formule C avec R=Cι H35 et
P=8 (c) La figure 8 est un tableau rassemblant les résultats d'étude physicochimique et granulométrique de dispersions aqueuses des composés de structure C avec R=Cι H35, et p variable. La figure 9 représente les températures de transition de phase mesurées par diffusion de lumière et rappel des valeurs mesurées en spectrofluorimétrie Exemple 1 : synthèse du dérivé Al La synthèse du dérivé Al est résumée dans le schéma 1 • Acide trityl mercaptopropionique (1) : molécule disponible commercialement. • rac-N-(2,3-Dihydroxy-propyl)-3-(tr/ty/mercapto) propionamide (2) 2 g d'acide 3-(tr/t >/mercapto) propanoique (5,75 mmol), 0,523 g d'aminopropane diol (1 éq) et 1,7 g de N-(Ethoxycarbonyl)-2-ethoxy-l,2-dihydroquinoline (EEDQ) (6,9 mmol, 1,2 éq) sont solubilisés dans 50 mL de dichlorométhane. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux durant 16 heures. Le brut réactionnel est ensuite lavé avec une solution de bicarbonate de sodium saturée puis avec une solution d'acide chlorhydrique normale, saturée en chlorure de sodium avant d'être séché sur sulfate de sodium. Après filtration sur verre fritte, le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice avec élution par un gradient d'acétate d'éthyle pur à acétate d'éthyle/méthanol 9 :1 (v :v)). Le produit pur est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (2,12 g, Rdt : 87%). Le produit peut aussi être obtenu pur, avec un rendement identique, par cristallisation à température ambiante du brut réactionnel dans un mélange acétate d'éthyle/méthanol 8 :2 (v :v) en 8 jours. RMΝ ]H(/CDC13) : δ (ppm) 7,40-7,25 (15H, m, aromatiques du trityle) ; 5,86 (1H, t, ΝH) ; 3,7 (1H, m, CHOH) ; 3,51 (2H, m, CHzOH) ; 3,31 (2H, m, CH2ΝH) ; 3,09 (2H, m, OH) ; 2,50 (2H, t, CHzS) ; 2,04 (2H, m, SCH2CH2CO). RMN 13C(/CDC13) : δ (ppm) 172,9 (CH2ÇONH) ; 144,6 (SCÇ phényl) ; 129,6 (Cpara phényl) ; 128,0 (Cortho phényl) ; 126,8 (Cméta phényl) ; 70,9 (ÇHOH) ; 66,9 (SCPh3) ; 63,6 (CH2OH) ; 42,1 (NHÇH2CH) ; 35,3 (SCH2ÇΗ2CO) ; 27,6 (CH2S).
• Rac-2,3-di[N-(heptadécyl)carbamoyloxy-propyl]-3-(t/7*ty/mercapto) propionamide (3) 2 g de rac-N-(2,3-Dihydroxy-propyl)-3-(tr/ty mercapto) propionamide (4,75 mmol) et 2,8 g de 1-Isocyanato-heptadecane (9,97 mmol, 2,1 éq) sont solubilisés dans 50 mL de toluène fraîchement distillé, à température ambiante et sous bullage d'argon. Le milieu réactionnel est porté au reflux et une pointe de spatule de 1,4-diaza bicyclo-[2,2,2]-octane (DABCO) (cat.) est ajoutée au mélange. Au bout de 6 heures, le brut est évaporé à sec et repris dans un minimum d'éther où le produit cristallise à température ambiante. Après filtration, le produit est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche (4,04 g, Rdt : 86 %). RMΝ 1H (CDC13) : δ (ppm) 7,47-7,23 (15H, m, aromatiques du trityle) ; 6,02 (1H, t, ΝH) ; 4,95-4,74 (3H, m, CHO, CîfcO) ; 4,18 (2H, m, ΝH) ; 3,44 (2H, t, CH2ΝH) ; 3,12 (4H, q, CH2NH) ; 2,51 (2H, t, CH^S) ; 2,06 (2H, t, SCH2CH2CO) ; 1,49 (4H, m, NHCH2CH2) ; 1,28 (54H, m, CH2 chaînes) ; 0,91 (6H, t, CH3). RMN 13C (CDCI3) : δ (ppm) 171,2 (CH2ÇONH) ; 156,1-155,9
(OÇONH) ; 144,7 (SCÇ phényl) ; 129,6 (Cpara phényl) ; 127,9 (Cortho phényl) ; 126,7 (Cméta phényl) ; 71,2 (CHO) ; 66,8 (SÇPh3) ; 63,4 (ÇH2O) ; 41,2 (NÇH2CH2) ; 40,0 (NHÇH2CH) ; 35,5 (SCH2ÇH2CO) ; 31,9 (NCH2Ç_H2) ; 29,9-29,3 (chaînes) ; 27,6 (CH2S) ; 22,7 (ÇH2CH3) ; 14,1 (ÇH3) • Rac-2,3-di[N-(heptadécyl)carbamoyloxy-propyl]-3-mercapto propionamide (4) 2 g du composé 3 (2,03 mmol) et 0,236 g de triéthylsilane (2,03 mmol, 1 éq) sont solubilisés dans un minimum de dichlorométhane et refroidis à 0° C par un bain de glace. Une solution à 10 % d'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane est ajoutée, à froid, goutte à goutte, par l'intermédiaire d'une ampoule à brome. Dès la fin de l'addition, le milieu est ramené à température ambiante et laissé sous agitation durant 3 heures. Après évaporation à sec, reprise dans le dichlorométhane et lavages à l'eau distillée saturée en chlorure de sodium puis avec une solution saturée en bicarbonate de sodium, le brut est évaporé à sec et repris dans l'acétate d'éthyle où il cristallise à froid. Le produit pur est récupéré sous la forme d'une poudre blanche (1,3 g, Rdt : 86 %). RMΝ 1H (CDC13) : δ (ppm) 6,46 (1H, t, ΝH) ; 4,97-4,95 (3H, m, CHO, CH2O) ; 4,21 (2H, m, ΝH) ; 3,50 (2H, t, CH2ΝH) ; 3,16 (4H, q, CH2NH) ; 2,81 (2H, q, CH2S) ; 2,51 (2H, t, SCTbCH^CO) ; 1,64 (1H, t, SH) ; 1,50 (4H, m, NHCH2CH2) ; 1,27 (54H, m, CH2 chaînes) ; 0,89 (6H, t, CH3). RMN 13C (CDCI3) : δ (ppm) 170,9 (CH2ÇONH) ; 156,1-156,0
(OÇONH) ; 71,3 (CHO) ; 63,5 (ÇH2O) ; 41,2 (NÇH2CH2) ; 40,4 (NHÇH2CH) ; 35,5 (SCH2ÇH2CO) ; 31,9 (NCH2ÇH2) ; 29,9-29,4 (chaînes) ; 22,7 (ÇH2CH3); 20,4 (ÇH2S) ; 14,1 (ÇH3).
• Composé Al acétylé 0,5 g de composé 4 (0,67 mmol) et 1,01 g de THAM triacétylé (3,37 mmol, 5 éq) sont solubilisés dans 30 mL de triéthylamine fraîchement distillée. Le mélange est porté à 50°C sous bullage d'Argon durant 2 heures puis ramené à température ambiante et évaporé à sec. Le brut est repris dans l'acétate d'éthyle pour être lavé avec une solution aqueuse normale d'acide chlorhydrique puis avec une solution aqueuse saturée en bicarbonate de sodium. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur gel de silice sur colonne éluée à l'acétate d'éthyle pur. Après evaporation et séchage, le produit est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche (0,33 g, Rdt : 46 %). RMN 1H(/CDC13) : δ (ppm) 6,48 (1H, t, CONHCH2) ; 6,37 (1H, s,
CONHC) ; 5,05-4,96 (3H, m, CHO, CïfcO) ; 4,45 (6H, s, CH2O) ; 4,22 (2H, m, NH) ; 3,48 (2H, t, CH2NH) ; 3,17 (4H, q, CH^NH) ; 2,81 (2H, q, CH∑S) ; 2,49 (4H, t, SCH2CH2CO) ; 2,10 (9H, s, CH3) ; 1,44 (4H, m, NHCH2CH2) ; 1,27 (54H, m, CH2 chaînes) ; 0,90 (6H, t, CH3). RMN 13C(/CDC13) : δ (ppm) 171,7-171,5 (CH2ÇONH) ; 170,6 (OÇO) ;
156,2-156,0 (OÇONH) ; 71,2 (CHO) ; 63,6 (ÇH2O) ; 62,5 (ÇH2O) ; 41,2 (NÇH2CH2) ; 40,2 (NHÇH2CH) ; 37,1-36,6 (SCH2ÇH2CO) ; 31,9 (NCH2ÇH2) ; 29,8-29,3 (chaînes) ; 26,8 (ÇH3) ; 22,6 (ÇH2CH3) ; 20,8 (ÇH2S) ; 14,1 (ÇH3).
2) MeONa/MeOH/88%
Schéma 1 : synthèse du dérivé Al
• Composé Al 0,3 g de dérivé acétylé (0,28 mmol) sont solubilisés dans un minimum de méthanol puis une pointe de spatule de méthylate de sodium (cat.) est ajoutée. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante durant 30 minutes en maintenant le pH entre 8 et 9 par ajout de méthylate de sodium si nécessaire. Le milieu réactionnel est ensuite neutralisé par ajout de quelques gouttes d'une solution aqueuse normale d'acide
chlorhydrique. Après evaporation à sec, le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice éluée avec un mélange acétate d'éthyle/méthanol 95:5 (v:v). Le produit est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche (0,233 g, Rdt : 88 %). Pf : 129 °C. RMN 1H(CDC13) : δ (ppm) 7,00 (1H, s, CONHC) ; 6,72 (1H, t, CONHCH2) ; 5,00 (3H, m, CHO, CLbO) ; 4,47 (3H, m, OH x3) ; 4,44 (6H, s, CH2O x3) ;
4,19 (2H, m, NH x2) ; 3,48 (2H, t, CH^NH) ; 3,16 (4H, q, CHbNH x2) ; 2,85 (2H, q,
CHjS) ; 2,65-2,50 (4H, t, SCH2CH2∞ x2) ; 1,44 (4H, m, NHCH2CH2 x2) ; 1,28 (54H, m,
CH2 chaînes) ; 0,91 (6H, t, CH3 x2). RMN 13C(CDC13) : δ (ppm) 171,1 (CH2ÇONH); 156,2-156,0 (OÇONH); 71,2 (CHO); 63,6 (ÇH2O); 61,0 (CH2OH); 41,2 (NÇH2CH2); 40,2 (NHÇH2CH); 37,1-36,6 (SCH2ÇH2CO); 31,9 (NCH2ÇH2); 29,9-29,3 (chaînes); 22,6 (ÇH2CH3); 20,41 (ÇH2S); 14,1 (ÇH3). Exemple 2 : Synthèse de l'agent de réticulation E : l'acide 2- acryloylamino-3-hydroxy-2-hydroxyméthyl-propyl ester acrylique
Composé E • Acide 5-acryloylamino-2,2-diméthyl-[l,3]-dioxan-5-yl méthyl ester acrylique lg (4,65 mmol) de THAM isopropylidène est solubilisé dans un minimum de dichlorométhane. Le pH est ajusté et maintenu à 9 par ajout de quelques gouttes de triéthylamine puis une solution contenant 0,378 mL de chlorure d'acryloyle (4,65 mmol, 1 éq.) dans 4 mL de dichlorométhane est additionnée goutte à goutte. La réaction est suivie en CCM (acétate d'éthyle/ cyclohexane 7:3) avec la disparition du THAM isopropylidène (Rf : 0,3). Le milieu est ensuite neutralisé par ajout d'acide formique, évaporé à sec et purifié par chromatographie sur gel de silice à l'aide d'un gradient d'élution acétate d'éthyle/cyclohexane 7:3 à 5:5. Le produit pur est obtenu sous la forme d'une huile jaune (1,1 g, Rdt : 87 %). RMN 1H (CDCI3) : δ (ppm) 6,50 (m, 1H, CHCONH), 6.43 (d, 1H, CH , ester acrylique), 6.30 (s, 1H, NH), 6.22 (d, 1H, CH^ acrylamide), 6.14 (d, 1H, CHCOO),
5.93 (d, 1H, CH^ ester acrylique), 5.65 (d, 1H, CTba acrylamide), 4.62 (s, 2H, CH2OCO), 4.42 (d, 2H, CH2O), 3.80 (d, 2H, CH2O), 1.49 (d, 6H, CH3x2) • Acide 2-acryloylamino-3-hydroxy-2-hydroxyméthyl-propyl ester acrylique 1,1 g (4,08 mmol) d'acide 5-acryloylamino-2,2-diméthyl-[l,3]-dioxan-5- yl méthyl ester acrylique et 5,45 g de Montmorillonite KIO sont mélangé dans du dichlorométhane et laissés sous agitation à température ambiante durant 4 jours. Ce mélange est ensuite filtré sur célite et lavé au méthanol. Le gâteau de célite est repris plusieurs fois dans le méthanol sous forte agitation avant d'être à nouveau filtré. Après evaporation à sec, le produit est obtenu pur sous la forme d'une huile jaune (0,766 g, Rdt : 82 %). RMN 1H (CDC13) : δ (ppm) 6.73 (s, 1H, NH), 6.42 (d, 1H, CH» ester acrylique), 6.21 (d, 1H, CH2b acrylamide), 6.14 (d, 1H, CHCOO), 5.88 (d, 1H, CΗ∑a ester acrylique), 5.69 (d, 1H, CH^ acrylamide), 4.70 (m, 2H, OH x2), 4.39 (d, 2H, CH O), 3.70 (dd, 4H, CH2OH). Exemple 3 : Synthèse d'un télomère lipidique de ciblage G Cette synthèse est illustrée par le schéma 2.
• Ester méthylique de l'acide 5 -Acryloylamino-2-tert- butyloxycarbonylamino-pentanoique (5) 4,00 g du sel d'acétate de la L-(Boc)LysOMe (12,50 mmol - 1 équiv.) sont dissous dans 30 mL de dichlorométhane anhydre. Le pH de la solution est amené à 9 par addition de DIEA puis refroidi à 0°C. 1,87 mL de chlorure d'acryloyle (23 mmol - 1,85 équiv.) sont ajoutés goutte à goutte au mélange réactionnel en maintenant le pH de la solution basique par addition de DIEA. Après 24 heures d'agitation, le milieu est lavé à l'eau puis la phase organique est séchée sur Na2SO4. Les solvants sont évaporés sous pression réduite et la purification par chromatographie flash sur gel de silice (éluant : acétate d'éthyle/cyclohexane 8:2) permet d'obtenir le composé 5 (3,67 g, Rdt : 76 %) sous forme d'une huile incolore translucide. [α]o - + 7,5 (c, 1, CHCI3). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) : δ 8.08 (1H, t, J = 5.6 Hz, NH-CO-O), 7.22 (1H, d, J = 7.7 Hz, NH-CO), 6.20 (1H, dd, J cis = 9.7 Hz et J trans = 17.1 Hz, Hc), 6.05 (1H, dd, J gem= 2.7 Hz et J tιans = 17.1 Hz, Hb), 5.56 (1H, dd, J gern= 2.7 Hz et J cis = 9.7 Hz,
Ha), 3.92 (IH, m, CH), 3.62 (3H, s, CH3-O), 3.10 (2H, q, J = 6.3 Hz, CH2-NH), 1.60 (6H, m, CH2 de la lysine), 1.38 (9H, s, CH3 du Boc). RMN 13C (62.86 MHz, CDC13) : δ 169.3, 161.3 (CO), 136.8 (CIV arom), 130.7 (CH arom.), 128.6 (C1V arom), 128.6 (CH arom.), 125.5 (CH=N(O)), 72.2 (CIV), 28.4 (CH2-CO), 25.7 (CH3 du tert-butyl).
Schéma de synthèse du télomère lipidique de ciblage G
• Synthèse du lipide télomèrisé G Dans un ballon bicol de 100 mL surmonté d'un réfrigérant, sont dissous 0,767 g de monomère tris-(acétoxyméthyl) acrylamidométhane 6 ( 2,55 mmoles, 12 éq) et 0,2 g de monomère 5 (0,63 mmole, 3 éq) dans 20 mL d'acétonitrile fraîchement distillé. Le tris-(acétoxyméthyl) acrylamidométhane 6 a été préparé conformément à l'enseignement du document A.Polidori et al, New J. Chem., 1994, 18, 839-848. Le milieu réactionnel est dégazé sous argon et porté à reflux. 7 mg d'AIBN (4,29.10" mmole, 0,2 éq) et 0,157 g de thiol 4 (0,21 mmole, 1 éq) dissous dans 5 mL d'acétonitrile fraîchement distillé et dégazé sont additionnés. La réaction est maintenue au reflux pendant 4h jusqu'à consommation totale des monomères (détectée par CCM). Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite et le brut réactionnel est filtré sur colonne sephadex (MeOH/CH2Cl2 1 :1). Le produit est ensuite dissous dans 100 mL de méthanol en présence d'une quantité catalytique de méthylate de sodium. Après 5h d'agitation le milieu réactionnel est neutralisé par addition de résine acide IRC 50. La résine est éliminée par filtration et le solvant éliminé sous pression réduite. Le produit est ensuite mis en réaction à froid dans un mélange acide TFA CH2C1 (20%) pendant 3h. Le mileu réactionnel est concentré sous pression réduite. L'huile obtenue est reprise plusieurs fois dans de l'éther jusqu'à précipitation du télomère sous la forme d'une poudre blanche. Le produit est dissous dans l'eau et lyophilisé jusqu'à obtention du composé G sous la forme d'une poudre blanche. Le degré de polymérisation moyen (DPn) et le rapport des concentration de chaque monomère dans la macromolécule (x et y) a été déterminé par RMN IH en comparant les intégrations des signaux des méthyls des deux chaînes alkyle à 1,1 ppm à celle des signaux du Tris (ÇH?OH) à 4,3 ppm et de la lysine (CH?NH) à 3,37 ppm. Nous avons pu déterminer les valeurs suivantes pour x et y : x : 30 et y : 10
Acide 5-Acryloylamino-2-tert-butoxycarbonylamino-pentanoique 7
2 g de Boc Lysine (8,13 mmoles) sont dissous dans lOmL d'un mélange acétonitrile - soude 2N 1 : 1. Le milieu réactionnel est refroidi à 10°C . Le chlorure d'acryloyle (1,1 g, 12,19 mmoles) dissous dans 10 mL d'acétonitrile est additionné goutte à goutte. Le pH est maintenu à 8 par addition de soude 2N. A la fin de l'addition le milieu réactionnel est agité 2h à température ambiante puis acidifié avec une solution d'HCl 2N, extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x20mL). La phase organique est séchée puis concentrée sous pression réduite. Le produit final est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche par recristallisation dans l'éthanol (1,9 g, 78%>). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) : δ 8.02 (IH, t, NH-CO-O), 7.18 (IH, d, J = 7.4 Hz, NH-CO), 6.25 (IH, dd, J cis = 9.4 Hz et J trans = 17.1 Hz, Hc), 6.05 (IH, dd, J gem
= 2.7 Hz et J trans = 17.1 Hz, Hb), 5.6 (IH, dd, J gsm = 2.7 Hz et J cis = 9.4 Hz, Ha), 3.92 (IH, m, CH), 3.10 (2H, q, J = 6.3 Hz, CH2-NH), 1.60 (6H, m, CH2 de la lysine), 1.38 (9H, s,
CH3 du Boc). RMN 13C (62.86 MHz, DMSO-d6) : δ 169.3, 161.3 (CO), 155.8 (CO urethane), 130.7 (CH2=), 128.6 (-CH≈), 80.5 (C tBu), 53.7 (CH Lys), 40.3 (CεLys), 33.2 (CβLys), 29.8 (CδLys), 28.4 (CH2-CO), 25.7 (CH3 du tert-butyl). • Acide 6-Acryloylamino-2-[bis-(2-carboxy-éthyl)-amino]-hexanoique 8 Dans un ballon de 50 mL, 1,9 g de composé 7 (6,33 mmoles) sont dissous dans 20 mL d'un mélange acide trifluoroacétique - dichlorométhane 1 :1. Après 2h d'agitation le solvant est évaporé sous pression réduite et l'huile obtenue est reprise plusieurs fois dans du chloroforme et évaporé jusqu'à obtention d'une poudre. Dans un ballon de 25 mL, 1,94 g d'acide bromoacétique (12,66 mmoles) sont dissous dans 7 mL de soude 2N. La solution est refroidie à 0°C dans un bain de glace et la poudre obtenue après déprotection, dissoute dans 11 mL d'une solution aqueuse de soude 2N est additionnée goutte à goutte. Après 2h de réaction à température ambiante, une solution aqueuse d'HCl 2N est additionnée jusqu'à l'obtention d'un pH acide. Le produit précipite. Le précipité est filtré et essoré puis séché sous pression réduite. Le produit 8 est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche après recristallisation dans l'éthanol (1,6 g, 57%). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) : δ 8.02 (IH, t, NH-CO-O), 7.18 (IH, d,
J = 7.4 Hz, NH-CO), 6.25 (IH, dd, J cis = 9.4 Hz et J tra„s = 17.1 Hz, Hc), 6.05 (IH, dd, J gem ≈ 2.7 Hz et J trans = 17.1 Hz, Hb), 5.6 (IH, dd, J gem = 2.7 Hz et J cis = 9.4 Hz, Ha), 3.5 (4H, s, N-CH2-COOH), 3.3 (IH, t, J=7.1 Hz, CH2-CH-N), 2.9 (2H, m, CH2NH), 1-1.5 (6H, m, CH2CH2CH2). RMN 13C (62.86 MHz, DMSO-d6) : δ 174.8, 173.6 (COOH), 168.4
(CONH), 130.4 (CH2=), 128.2 (-CH≈), 64.8 (CH Lys), 53.8 (N-CHz-COOH), 40.3 (CεLys), 30.5 (CβLys), 29.8 (CδLys). • Synthèse du lipide F
2,56 g de composé 4 (3,6 mmol) et 1,6 g de composé 8 (3,6 mmol) sont solubilisés dans 30 mL de triéthylamine fraîchement distillée. Le mélange est porté à 50°C sous bullage d'Argon durant 2 heures puis ramené à température ambiante et évaporé à sec sous pression réduite. Le produit est obtenu pur sous la forme d'une poudre blanche après recristallisation successive dans l'acétate d'éthyle (2,29 g, Rdt : 55 %>). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) : δ (ppm) 7.12 (IH, t, NH-CO-O), 6,48
(IH, t, CONHCH2) ; 6,37 (IH, s, CONHC) ; 5,05-4,96 (3H, m, CHO, CH2O) ; 4,45 (6H, s,
CH2O) ; 4,22 (2H, m, NH) ; 3,48 (6H, s + 1, N-CH^-COOH, CBbNH) ; 3.25 (IH, t, J=7.1
Hz, CH2-CH-N), 3,17 (2H, m, CHîNH) ; 2,81 (4H, t, CH2S) ; 1,44 (4H, m, NHCHzCH ) ; 1,27 (60H, m, CH2 Lys, CH2 chaînes) ; 0,90 (6H, t, CH3). RMN 13C(250 MHz, DMSO-d6) : δ (ppm) 171,7-171,5 (COOH,
CH2ÇONH) ; 156,2-156,0 (OÇONH) ; 71,2 (CHO) ; 64.5 (CH Lys), 63,6 (ÇH2O) ; 62,5
(ÇH2O) ; 53.2 (N-CH2-COOH), 41,2 (NÇH2CH2) ; 40,2, 40.1 (CεLys, NHÇH2CH) ; 37,1-
36,6 (SCH2 H2CO) ; 31,9 (CβLys) ; 29,8-29,3 (chaînes et CβLys) ; 26,8 (ÇH3) ; 22,6 (ÇH2CH3) ; 20,8 (ÇH2S) ; 14,1 (ÇH3).
schéma de synthèse du lipide de ciblage F Exemple 5 : Préparation des vésicules tubulaires à partir du dérivé Al Matériel utilisé. • Mesure de la taille des vésicules tubulaires.
La distribution en taille des particules a été mesurée par spectroscopie de corrélation photonique de la lumière d'échantillon dilués dans l'eau en utilisant un appareil
Malvern HPPS/NIBS équipé d'un laser He/Ne de 3 m et d'un corrélateur à 288 canaux muni d'une avalanche de photodiodes. Le traitement mathématique de la courbe d'autocorrélation fait appel à la méthode Contin. • Dispersion des lipides Les lipides A sont dispersés dans l'eau selon la méthode film dans un bain de sonication Bransonic thermostaté type 2510 E (100 W, 42 Hz) au dessus de leur température de transition de phase pendant une demi heure. • Formation des dispersions de vésicules tubulaires Les vésicules tubulaires sont préparées dans un premier temps en solubilisant le lipide Al dans le chloroforme. La solution est concentrée lentement sous pression réduite dans un ballon forme cœur de 20 mL à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le film obtenu est ensuite séché sous pression réduite à l'aide d'une pompe à palette. Le film de lipide est réhydraté avec de l'eau distillé à 65 °C (10°C au dessus de la température de transition de phase du lipide) à une concentration de 2.5 mg.mL"1. Le mélange est homogénéisé au vortex pendant 5 minutes puis soumis aux ultrasons pendant 30 minutes à 70°C. La solution bleutée translucide obtenue est filtrée à travers un filtre de 0,45 μm puis analysée au spectromètre de corrélation photonique et en microscopie électronique par transmission (figures 3, 4 et 5). Avec R=Cι7H35 (dérivé Al). La température de transition de phase a été mesurée par détection de la polarisation d'une sonde fluorescente, le DPH en spectrofluorimétrie : Tm = 54°C Nous obtenons des vésicules tubulaires dont le diamètre hydrodynamique moyen mesuré par diffraction de la lumière est de 132 nm (IP : 0,35).
Les mesures de forme et de taille établies par observation des clichés de microscopie électronique (figures 4 et 5) ont permis de mettre en évidence la formation de vésicules tubulaires refermées à leurs extrémités dont la section moyenne est de 38 nm et la longueur moyenne de 247 nm. Les analyses en cryofracture ont confirmé la formation de
ces vésicules tubulaires et leurs caractéristiques morphologiques, à savoir la présence d'une cavité aqueuse interne isolée du milieu extérieur.
Ces vésicules tubulaires ont une stabilité élevée puisqu'on n'observe aucune évolution de la taille des particules après un an de stockage tandis que dans les mêmes conditions, des liposomes formés de phosphatidyl choline de jaune d'œuf évoluent au bout de seulement 5 jours. La mise en évidence de la cavité interne aqueuse a été prouvée indirectement par des mesures spectrofluorimétriques de l'encapsulation et des cinétiques de libération d'une sonde fluorescente hydrophile, la carboxyfluorescéine (figure 1). Les mesures montrent clairement une cinétique de libération plus lente de la sonde fluorescente comparée à une encapsulation traditionnelle dans un mélange de phosphatidyl choline de jaune d'œuf. Exemple 6 : Encapsulation de carboxyfluorescéine dans des vésicules tubulaires fabriquées à partir du dérivé Al Le pouvoir d'encapsulation des différents composés est déterminé par spectrofluorimétrie à l'aide d'une sonde fluorescente : la 5 (6)-carboxyfluorescéine. On mesure la libération de ce marqueur fluorescent à partir des vésicules préparées selon les méthodes standardisées. Cette étude nécessite la préparation d'un tampon Tris (15 mM et 150 mM
NaCl) à pH 7,4, ainsi que d'une solution de carboxyfluorescéine à 120 mM et pH 7,4 également. Les composés étudiés sont pesés (2,5 mg/mL) et sont dissous dans un minimum de méthanol. Le solvant est évaporé sous pression réduite au rotavapor et le film ainsi obtenu est séché par un flux d'azote. On ajoute la solution de carboxyfluorescéine 120 mM dans le tampon Tris de manière à obtenir une dispersion de lipides de concentration égale à 2,5 mg/mL. La suspension obtenue est agitée au vortex pendant 1 minute puis soumise aux ultrasons dans un bain de sonication pendant 1 heure à 70°C. La sonde fluorescente non encapsulée est éliminée par passage sur colonne Séphadex G25 préalablement équilibrée avec le tampon Tris. La fraction de vésicule récoltée est immédiatement étudiée par spectrofluorimétrie. Les mesures de fluorescence ont été réalisées à l'aide d'un spectrofluorimètre Jobin-Yvon (spectrofluoromax 2), équipé d'une lampe Xénon 150 W. Toutes les mesures ont été effectuées dans une cuve en quartz, thermostatée à 25°C. Les échantillons ont été analysés à une longueur d'onde d'excitation de 480 nm, et une longueur d'onde d'émission de 530 nm pendant 4 heures.
Les bandes passantes ont été fixées à 0,5 nm aussi bien pour l'excitation que pour l'émission. Pour chaque mesure, l'intensité de fluorescence initiale (F0) est déterminée 30 secondes après la filtration sur colonne. La libération est étudiée sur une période de 4h et l'intensité de fluorescence (Ft) est mesurée à intervalle régulier. L'intensité maximum de fluorescence (Fmax) qui correspond à 100%> de relargage, est obtenue après la lyse des vésicules tubulaires obtenue par ajout de Triton XI 00 (10% v/v). Le pourcentage de libération est obtenu à l'aide de l'équation suivante (figure 1) : %R = (Ft- F0)/ Fmax
Exemple 7 : Polymérisation d'un monomère encapsulé dans des vésicules tubulaires obtenues à partir du lipide Al La com osition des solutions utilisées est résumée dans le Tableau 1.
Tableau 1 • Préparation du film 20 mg de lipides Al sont solubilisés dans 2 mL d'une solution d'hydropéroxyde de Cumène dans le dichlorométhane fraîchement distillé et dégazé par bullage d'argon (2,5.10" M), dans un ballon forme cœur. La solution est évaporée à sec à l'évaporateur rotatif (la température du bain ne dépassant pas 40°C) puis le film est séché à la pompe à palette (1 heure) et placé sous atmosphère inerte jusqu'à utilisation. Dans le cas d'un amorçage par le dithionite de sodium, le film est préparé dans du dichlorométhane fraîchement distillé et dégazé par bullage d'Argon. • Dispersion 2 mL de solution de monomère dans l'eau distillée (0,1 M), préalablement désoxygénée par bullage d'Argon sont ajoutés. Le mélange est agité pendant 1 minute puis placé dans un bain d'ultrasons durant 60 minutes à 70 °C.
Séparation - Polymérisation
La préparation est déposée sur colonne Sephadex G50 (2 cm de diamètre pour une hauteur de 10 cm de gel) préalablement équilibrée avec un tampon NaCl 0,1 M désoxygéné pendant 30 minutes par bullage d'Argon. 2 mL de fraction bleutée correspondant à une élution de 25 à 27 mL sont récupérés dans un ballon. 2 mL de solution de meta bisulfite de sodium dans le tampon NaCl (2,5.10"4 M) sont alors ajoutés pour amorcer la polymérisation qui se déroule sous atmosphère inerte, à 37°C et durant 1 (acrylamide) à 3 heures (THAM). Dans le cas d'un amorçage par le dithionite de sodium, 2 mL d'une solution de l'amorceur dans le tampon NaCl 0,1 M (2.10" M) sont ajoutés après séparation sur colonne Sephadex. Exemple 8 : Télomérisation d'un monomère encapsulé dans des vésicules tubulaires obtenues à partir du lipide Al La com osition des solutions utilisées est résumée dans le tableau 2.
Tableau 2 • Préparation du film 18 mg de lipide Al et 2 mg de composé télogène D sont solubilisés dans 2 mL d'une solution d'hydropéroxyde de Cumène dans le dichlorométhane fraîchement distillé et dégazé par bullage d'Argon (2,5.10"4 M), dans un ballon cœur. La solution est évaporée à sec à l'évaporateur rotatif (la température du bain ne dépassant pas 40°C) puis le film est séché à la pompe à palette (1 heure) et placé sous atmosphère inerte jusqu'à utilisation. Dans le cas d'un amorçage par le dithionite de sodium, le film est préparé dans du dichlorométhane fraîchement distillé et dégazé par bullage d'Argon. • Dispersion 2 mL de solution de monomère dans l'eau distillée (0,1 M), préalablement désoxygénés par bullage d'Argon sont ajoutés. Le mélange est agité 1 minute puis placé dans un bain d'ultrasons durant 60 minutes à 70°C. • Séparation - Polymérisation
La préparation est déposée sur colonne Sephadex G50 (2 cm de diamètre pour une hauteur de 10 cm de gel) préalablement équilibrée avec un tampon NaCl 0,1 M désoxygéné 30 minutes par bullage d'Argon. 2 mL de fraction bleutée correspondant à une élution de 25 à 27 mL sont récupérés dans un ballon. 2 mL de solution de métabisulfite de sodium dans le tampon
NaCl (2,5.1G"4 M) sont alors ajoutés pour amorcer la télomérisation qui se déroule sous atmosphère inerte, à 37°C et durant 16 à 20 heures. Dans le cas d'un amorçage par le dithionite de sodium, 2 mL d'une solution de l'amorceur dans le tampon NaCl 0,1 M (2.10"
3 M) sont ajoutés après séparation sur colonne Sephadex. Exemple 9 : Synthèse d'un tensioactif de formule générale (IB)
Composé TE 17-20
• rac 3-(trz'ty/mercapto) propane- 1,2-diol (Composé 10) 10 g (92,6 mmol) de 3-mercapto-l,2-propane diol et 13,54 mL
(97,23 mmol, 1,05 équ.) de Triéthylamine (TEA) sont solubilisés dans 100 mL de THF. 27,07 g (97,23 mmol, 1,05 équ.) de chlorure de triphénylméthyle dissous dans 10 mL de THF sont additionnés goutte à goutte au mélange à une température inférieure à 30 °C. A la fin de l'addition, le milieu réactionnel est laissé sous agitation, à froid, en maintenant le pH à 8-9 par ajout de TEA. L'excès de chlorure de triphénylméthyle est éliminé par ajout d'une solution de NaHCO3 saturée avant d'évaporer le THF sous pression réduite. Le produit brut est repris dans CH2C12 avant d'être lavé avec une solution normale de HC1 puis de NaHCO3 et d'être séché sur Na2SO4. Le produit est finalement purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice éluée en gradient (cyclohexane/AcOEt 7 :3 à" 1 :1). 28,8 g de produit pur sont obtenus sous forme de poudre blanche. Rfproduit : 0,4 (CCM - AcOEt/cyclohexane 7 :3). Rendement : 89%. Pf : 97-98 °C RMN 1H(/CDC13) : δ (ppm) 7,42-7,27 (m, 15H, aromatiques du trityle) ; 3,50 (m, 3H, CHOH, CH^OH) ; 2,80 (m, IH, OH) ; 2,50 (t, 3H, OH, CH2S) RMN 13C (CDC13) : δ (ppm) 144,6 (SCÇ phényl x3) ; 129,6 (Cpara phényl x3) ; 128,0 (Cortho phényl x6) ; 126,8 (Cméta phényl x6) ; 70,6 (ÇHOH) ; 67,0 (SÇPh3) ; 65,5 (CH2OH) ; 35,4 (ÇH2S)
• rac 3-(trz'ty/mercapto)propane-l,2-diyl diheptadécanoate (composé
H) 0,5 g (1,43 mmol) de Composé 10 et 0,523 g (4,28 mmol, 3 équ.) de Diméthyl aminiptridine (DMAP) sont solubilisés dans 10 mL de CH2C12 et refroidis par un bain de glace. 0,952 g (3,14 mmol, 2,2 équ.) de chlorure de stéaroyle solubilisé dans 5 mL de CH2CI2 est alors ajouté goutte à goutte par l'intermédiaire d'une ampoule à brome. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation 2 heures après la fin de l'addition. Les sels de DMAP formés sont éliminés par filtration puis le brut réactiom el est évaporé à sec et finalement repris dans un mélange MeOH/Et2O dans lequel le produit cristallise. 1,07 g de produit pur sont obtenus sous forme d'une poudre blanche. Rfproduit : 0,3 (CCM - AcOEt/cyclohexane 7 :3). Rendement : 85 %. Pf : 52-53 °C
RMN 1H (CDCI3) : δ (ppm) 7,30-7,15 (m, 15H, aromatiques du trityle) ; 5,16 (quint, 1/3H, CHO) ; 4,78 (quint, 2/3H, CHO) ; 4,1 (dddd, 2H, CH2O) ; 3,10 (t, 2/3H, CH2S) ; 2,48 (t, 4/3H, CH2S) ; 2,21 (m, 4H, CH2CO x2) ; 1,30 (m, 60H, (CH^is) ; 0,88 (t, 6H, CH3) RMN 13C(/CDC13) : δ (ppm) 172,2 (OÇOCH2 x2) ; 144,4 (SCÇ phényl x3) ; 129,7 (Cpara phényl x3) ; 128,2 (Cortho phényl x6) ; 127,1 (Cméta phényl x6) ; 70,2 (CHO) ; 67,4 (SÇPh3) ; 64,1 (CH2O) ; 34,2 (ÇH2COO x2) ; 32,6 (ÇH2S) ; 29,5 ((ÇH2)„ x2) ; 24,9 (ÇH2CH2COO x2) ; 22,7 (ÇH2CH3 x2) ; 14,1 (ÇH3 x2)
• rac 3-Mercaptopropane-l,2-diyl diheptadécanoate (Composé 12) A partir de 0,5 g (0,56 mmol) de composé 11, et 0,066 g (0,56 mmol,
1 équ.) de triéthylsilane, après ajout d'une solution à 5 %> en TFA dans le CH2C12 et lavages usuels, le brut est évaporé à sec et purifié par cristallisation dans un mélange
Et2O/MeOH. 0,326 g de produit pur est ainsi récupéré sous forme d'une poudre blanche.
Rfproduit : 0,5 (CCM - acétate d'éthyle/cyclohexane 7:3). Rendement : 90 %. Pf : 49-51 °C. RMN 1H(/CDC13) : δ (ppm) 5,1 (m, IH, CHO) ; 4,31 (ddd, 2H, CH2O) ;
3,10 (t, 2/3H, CH^S) ; 2,73 (t, 4/3H, CH2S) ; 2,30 (m, 4H, CEbCO x2) ; 1,47 (SH) ; 1,25
(m, 60H, (CHJ IS X2) ; 0,88 (t, 6H, CH3 x2) RMN 13C(/CDC13) : δ (ppm) 172,5 (CH2OÇO, CHOÇO) ; 71,8 (ÇHO) ;
62,4 (CH2O) ; 34,2 (ÇH2COO x2) ; 32,4 (ÇH2SH) ; 29,5 ((ÇH2)„ x2) ; 24,9 (ÇH2CH2COO x2) ; 22,7 (ÇH2CH3 x2) ; 14,1 (ÇH3 x2)
Composé TE 17-20
1,09 g (6,25 mmol, 5 équ.) de Tris(hydroxymethyl)acrylamidomethane est solubilisé dans 15 mL de MeOH fraîchement distillé. Le mélange est placé sous agitation et barbotage d'argon puis mis en chauffe. Dès ébullition, une solution contenant 0,04 g (0,25 mmol, 0,2 équ.) d'AIBN et 0,8 g (1,25 mmol) de Composé 12 dans un minimum de THF fraîchement distillé (approximativement 1 mL) et préalablement dégazée par un flux d'argon est injectée. La réaction est suivie par chromatographie sur couche mince avec la disparition du thiol (AcOEt/cyclohexane 7:3). Après retour à température ambiante, le brut réactionnel est plongé dans de l'Et2O froid sous vive agitation où le télomère précipite. 1,2 g de produit est obtenu sous forme de poudre blanche. Rendement : 70 %
RMN 1H(/DMSO) : δ (ppm) 7,23 (m, 19,8H, NH xDPN) ; 4,78 (m, 60H, OH x3xDPn) ; 0,86 (m, 6H, CH3 x2) DPn : 20
Claims
REVENDICATIONS 1. Composé de formule (III) :
(III) dans laquelle R représente un groupement choisi parmi
(IV) (V)
- Y représente un atome de soufre ou un groupement — NH-CO-(CH2)n-X, X représente un atome de soufre S ou un groupement -CH2- ; n est un entier allant de 0 à 10 ; - R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C2 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C24 ; les radicaux thioalkyls en C4- C2 ; - m est un entier allant de 0 à 9 et lorsque X=CH2 alors 0<m+n<6 ; - x représente 0 ou un entier allant de 1 à 30 ; - y représente 0 ou un entier allant de 1 à 10 ; - Ri représente un groupement hydrophile ; - R2 représente un groupement de reconnaissance ayant une affinité pour une cible biologique ; - Z est un bras espaceur ; Z est lié à R au moyen d'une liaison qui peut être choisie parmi les fonctions -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-O-, O-CO-O-, -O-, -CH=N-, -S- ou par complexation d'un atome de nickel ; Z est choisi parmi une chaîne peptidique, un acide Ω-aminé, l'éthanolamine, la 3-propanolamine, une diamine de formule -NH-(CH2)P-NH- dans laquelle p représente un entier allant de 2 à 6, ou -Z-R2 représente un groupement NTA de formule suivante :
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupement R est choisi parmi les radicaux suivants : le radical thiooctyl le n-butyle, le ter-butyle, l'isobutyle, le n-pentyle, l'isopentyle, le n- hexyle, le n-heptyle, le n-octyle, le n-nonyle, le n-décyle, le n-undécyle, le n-dodécyle, le n-tridécyle, le n-tétradécyle, le n-pentadécyle, le n-hexadécyl, le n- heptadécyle, le n- octadécyle, le radical phytyl (CH3[CH(CH3)(CH2)3]3CH(CH3)CH2CH2), les radicaux hydrocarbonés fluorés répondant à la formule -(CH )t-(CF2)rF, dans laquelle r et t représentent deux entiers avec : 14 > r+t > 4.
3. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, répondant à la formule (I) :
(I) dans laquelle : • Y représente un atome de soufre ou un groupement O — NH (CH2)n X armi l s groupements S et
CH2, n est un entier allant de 0 à 10 ; • m est un entier allant de 0 à 9 ; et lorsque X=CH2 alors 0<m+n<6 • représente un groupement -NH- ou un groupement -CH2- • p représente un entier allant de 1 à 50 • Ri représente un groupement choisi parmi les radicaux suivants : dans lesquels R' représente H ou un groupement hydrophile ; • R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C24 ; les radicaux thioalkyls en C - C24.
4. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (IA) :
(IA) dans laquelle : - X représente un atome de soufre S ou un groupement -CH2- ; - n est un entier allant de 0 à 10 ; - m est un entier allant de 0 à 9 ; - lorsque X=CH2 alors 0<m+n<6 ; - R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C24 ; les radicaux thioalkyls en C4-
C24.
5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R est choisi de façon à ce que (IA) ait une température de transition de phase supérieure à 37°C.
6. Composé selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule A :
Formule A
7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il répond à la formule Al :
8. Composé selon la revendication 3 répondant à la formule (IB)
(IB) dans laquelle : Y représente un atome de soufre ou le groupement -NH-CO-CH2CH S- W représente un groupement -NH- ou un groupement -CH2- p représente un entier allant de 1 à 50 Ri représente un groupement choisi parmi les radicaux suivants dans lesquels R' représente H ou un composé hydrocarboné polyhydroxylé en C4-C2 ; R représente un groupement choisi parmi : les radicaux hydrocarbonés en C4-C24 ; les radicaux hydrocarbonés fluorés en C4-C24 ; les radicaux thioalkyls en C4-C24.
9. Composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R est choisi de façon à ce que (IB) ait une Concentration Micellaire Critique inférieure à 10"5M.
10. Composé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce qu'il vérifie une ou plusieurs des conditions ci-dessous : - p représente un entier allant de 1 à 5 ; - Y représente S.
11. Composé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il répond à la formule C dans laquelle p représente un entier allant de 5 à 15 :
Composé C
12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il répond à la formule Cl
H Composé Cl
13. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (II) :
(n) dans laquelle : - Y représente un atome de soufre ou le groupement -NH-CO-(CH2)n-X- dans lequel X représente un atome de soufre S ou un groupement -CH2-, n est un entier allant de 0 à 10 ; - W représente un groupement -NH- ou -CH2- - x représente 0 ou un nombre entier allant de 1 à 30 ; - y représente 0 ou un nombre entier allant de 1 à 10 ; - Ri représente un groupement hydrophile ; - R2 représente un groupement de reconnaissance ayant une affinité pour une cible biologique ; - Z est un bras espaceur ; Z est lié à R2 au moyen d'une liaison qui peut être choisie parmi les fonctions -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-O-, O-CO-O-, -O-, -CH=N-, -S- ou par complexation d'un atome de nickel ; Z est choisi parmi une chaîne peptidique, un acide Ω-aminé, l'éthanolamine, la 3-propanolamine, une diamine de formule -NH-(CH2)P-NH- dans laquelle p représente un entier allant de 2 à 6, ou -Z-R2 représente un groupement NTA de formule :
14. Composé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (IIA) :
(HA)
15. Composé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'une ou plusieurs des conditions suivantes sont vérifiées : - X=S - n=2 - Ri est choisi parmi les radicaux suivants : dans lesquels R' représente H ou un composé hydrocarboné polyhydroxylé en C4-C 4, - R est choisi parmi les radicaux suivants : le radical thiooctyl, le n-butyle, le ter-butyle, l'isobutyle, le n-pentyle, l'isopentyle, le n-hexyle, le n-heptyle, le n-octyle, le n-nonyle, le n-décyle, le n-undécyle, le n-dodécyle, le n-tridécyle, le n-tétradécyle, radical phytyl
(CH3[CH(CH3)(CH2)3]3CH(CH3)CH2CH2), les radicaux hydrocarbonés fluorés répondant à la formule -
(CH2)t-(CF2)rF, dans laquelle r et t représentent deux entiers avec : 14 > r+t > 4. R2 est choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des petites molécules effectrices permettant l'interaction avec des récepteurs de surface cellulaires, des antigènes, des sucres, des peptides.
16. Composé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il répond à la formule F :
Formule F
17. Composé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (IIB) :
(IIB) dans laquelle : - Y représente un atome de soufre ou le groupement -NH-CO-CH CH2S-
18. Nanoparticule caractérisée en ce qu'elle comporte un ou plusieurs composés de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 3 à 12 comme constituant de ses parois.
19. Nanoparticule selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comporte en outre de 1 à 5% d'un ou plusieurs composés de formule (II) selon l'une quelconque des revendications 13 à 17.
20. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 18 et 19, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un télomère ou polymère d'un monomère de type acrylique contenu dans sa cavité aqueuse interne.
21. Association d'une nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 avec un composé choisi parmi : les principes actifs thérapeutiques, les substances cosmétiques, les agents de diagnostic, les vaccins.
22. Composition thérapeutique, de diagnostic, vaccinale ou cosmétique comprenant au moins un principe actif en association avec un liposome selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
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