EP1885846A2 - Système et procédé de traitement génétique et epigénétique - Google Patents

Système et procédé de traitement génétique et epigénétique

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EP1885846A2
EP1885846A2 EP06794400A EP06794400A EP1885846A2 EP 1885846 A2 EP1885846 A2 EP 1885846A2 EP 06794400 A EP06794400 A EP 06794400A EP 06794400 A EP06794400 A EP 06794400A EP 1885846 A2 EP1885846 A2 EP 1885846A2
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cell
nucleus
treated
cells
mrg
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EP06794400A
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Fred Zacouto
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer

Definitions

  • the present invention provides systems and methods for genetically and epigenetically treating cells.
  • Such systems and methods are particularly useful in the field of cellular treatments, in particular for producing autografts from differentiated cells or embryonic or fetal strains.
  • Cellular treatments are currently practiced to repair damaged tissue suffering from a disease, cell deficit or necrosis.
  • This technique generally involves taking a few healthy cells of the tissue concerned, to cell culture these cells to form a cell stock or tissue and to re-implant these cells in the tissue to be treated. These reprogrammed cells can then allow the tissue concerned to recover its original morphological and functional capabilities.
  • this technique is used for the repair of articular cartilage.
  • Joint cartilage has limited repair potential and lesions of a certain volume rarely heal well.
  • chondrocytes bathed in an extracellular matrix, are removed, removed from the matrix, for example by enzymatic digestion and then cultured, generally on sera of fetal calf or preferably in the patient's serum, and in three-dimensional matrices (for example an agarose, collagen or globin matrix).
  • three-dimensional matrices for example an agarose, collagen or globin matrix.
  • the disadvantage of these multiplication techniques is that generally the cells removed are cells that have already undergone numerous mitotic divisions.
  • cell culture for their multiplication causes a slight decrease in telomeres at each mitosis and this multiplication is often done on cells already aged, close to their end of life and their end of functions, and whose DNA is in besides likely to be altered.
  • cellular aging results in a gradual gnawing of telomeres (end of chromosomes). Now these telomeres condition the remaining number of mitotic divisions.
  • culturing mother cells that have already undergone numerous mitoses may result in a large colony of aged daughter cells with shortened survival that may also exhibit alterations in gene functionality.
  • the object of the present invention is to provide systems and methods for genetic and epigenetic treatment overcoming the aforementioned drawbacks.
  • the present invention aims to provide systems and methods of cell processing for rapid mass production of healthy cells with improved gene functionality and / or capable of being genetically and epigenetically rejuvenated, aged and / or repaired to a desired degree.
  • Still another object of the present invention is to provide systems and methods for cell processing resulting in both reconstitution of missing, failing, enhancing or modifying autologous tissue, and genetic rejuvenation of tissue in which cells have been implanted.
  • the subject of the present invention is therefore a system for the genetic and epigenetic treatment of cells to be treated, comprising: at least one cell to be treated,
  • MRG genetic reprogramming medium
  • CCG genetic reprogramming cell
  • the subject of the present invention is also a method of genetic and epigenetic treatment of cells to be treated, comprising the following steps:
  • MRG genetic reprogramming medium
  • the invention relates in particular to the modification of the environment of a cell nucleus with or without extracellular or intra-oocyte transfer, so as to put the nucleus under the influence of a medium inducing its partial genetic reprogramming, but without causing a return of the nucleus to the development of embryonic cells.
  • This medium will cause better repair of cellular DNA during division and aggression and / or genetic rejuvenation by the action of an inverting medium of biological time, such as an oocyte.
  • the present invention relates in particular to systems and methods applicable to the field of treatment and / or repair and / or functional and / or morphological cellular enhancement intended to open many perspectives for the fight against a large number of diseases but also against Tissue senescence is largely due to the loss of their functional and morphological capacity for proliferation, regeneration and repair.
  • the present invention relates to a system and methods capable of treating cells of a tissue, in particular for rejuvenating, aging and / or repairing these cells.
  • the cells are then cultured in a suitable medium so as to create a stock or tissue of genetically and epigenetically treated cells capable of being implanted in the tissue in question, or at a distance from it, where these cells can emit particular proteins and and / or signaling peptides and / or stimulation of metabolism, and / or DNA repair enzymes, for the tissue in question.
  • the systems and methods of the invention comprise contacting at least a portion of a nucleus of at least one cell to be treated with a genetic reprogramming medium (MRG).
  • MRG genetic reprogramming medium
  • This MRG comprises at least the natural cytoplasm of at least one genetic reprogramming cell (CRG) and / or synthetic cytoplasm.
  • a reconstituted and / or synthetic cytoplasm can be composed in particular of embryonic serum extracts, cicatrization and / or cells subjected to metabolic activation.
  • a completely synthetic cytoplasm for example made by physical and chemical reconstitution of active substances, is possible. It is also conceivable to produce a MRG in the form of a "slurry" of CRG, with or without cores.
  • cell extracts or cytoplasm and / or other substances known to be capable of activating nuclear metabolism such as cells or cell extracts appearing during healing and / or signaling or metabolism-stimulating proteins or peptides and / or growth factors and / or cells or extracts of cancer cells.
  • the cell or cytoplasmic extracts can be obtained by well-known physical or chemical treatments.
  • the advantage of using cancer cells, and in particular the cytoplasm thereof, is explained by the fact that metabolic activation, signaling and mitosis factors are particularly intense and may induce a temporary metabolic or nuclear reactivation of a cell to be treated. Cancer contagion is unlikely because cancers are usually not transmissible to a different tissue, and their cytoplasm remains normal.
  • the use of cytoplasm of selected cancer cells is possible to temporarily treat nuclei or cells, adult or otherwise, that are insufficiently capable of dividing spontaneously or in culture, to repair their poorly copied DNA, or which are functionally deficient.
  • cancer Since cancer is not directly contagious for non-cancer cells, even if they are ill, the selective regenerative application of cancer cells can be done, for example, in two ways: intracellular treatment: a nucleus is taken from a cancer cell and introduced into the cytoplasm of a tissue cell to treat; this nucleus preferably remains separated from the normal nucleus by a tongue or membrane of a porous biocompatible fabric possibly impregnated with antibodies, said tissue permitting the signaling proteins but preventing any passage of genes or chromosomes. Under these conditions, the signaling proteins emitted by the cancerous nucleus will cause a partial genetic reprogramming of the cell nucleus to be treated, especially in its defective functions.
  • intracellular treatment a nucleus is taken from a cancer cell and introduced into the cytoplasm of a tissue cell to treat; this nucleus preferably remains separated from the normal nucleus by a tongue or membrane of a porous biocompatible fabric possibly impregnated with antibodies, said tissue permitting the signaling proteins but preventing
  • the cancerous nucleus will be removed, and the reprogrammed cell may be multiplied in a suitable cell culture.
  • extracellular treatment selected cancer cells are approximated with a few cells to be treated in a cell culture bath adapted to include at least one factor capable of increasing the permeability of cell membranes, particularly to signaling proteins. This can be done until the observation or genetic, proteomic, biochemical or biophysical tests allow to note the induction of a functional reactivation of the nuclear deficiency (s) to be corrected.
  • selective biochips will make it possible to target the signaling proteins emitted from the cancerous nucleus and selectively reprogram the nucleus to be treated in its intended and programmed functions.
  • Three main types of treatment can be considered, namely the rejuvenation of the biological age of a cell, the aging of the biological age of a cell and the repair of a cell.
  • Rejuvenation of the biological age of a cell also promotes self-repair capacity of this cell, especially at the level of its DNA.
  • MRG includes all or part of one or more CRGs.
  • a CRG is advantageously an oocyte, an embryonic cell, an embryonic or adult stem cell, a fetal cell, or a cellular container reconstituted from these cells, or synthesized.
  • the systems, methods and applications for achieving such rejuvenation will be described in more detail below.
  • the aging of a cell is particularly conceivable for treating fetal diseases or in the newborn, due in particular to cancers of embryonic origin, such as glioblastoma.
  • these cancerous cells can be artificially aged by replacing the cancerous nucleus with a healthy nucleus of the same autologous or homologous but older tissue, preferably HLA (Human Lymphocyte Antigen) compatible.
  • HLA Human Lymphocyte Antigen
  • the interaction between the older nucleus and the young cytoplasm promotes some aging temporarily accelerated at least the cytoplasm of the young cell. Aging can then be increased by multiplication of cells in a culture bath, the young cytoplasm causing accelerated mitoses of the older nucleus, inducing a decrease in telomeres.
  • healthy cell sorting is possible to re-implant healthy tissue in place of the original diseased tissue.
  • Another possible application is to repair a cell, in particular in its chromosomal constitution, by treating only a part of a nucleus, for example a chromosome.
  • the chromosome particularly the "Philadelphia" chromosome
  • the chromosomes may be destroyed during the metaphase where the chromosomes are deployed, for example by means of an ultrathin laser beam, preferably diameter equal to or less than 1 micron.
  • a healthy equivalent chromosome in the metaphase of an equivalent cell of the patient or a compatible HLA donor and is implanted in the cancer cell, especially during its mitosis.
  • the treatment could be considered in particular for a large number of cancers, for example glioblastoma, cancer of the breast or rectum.
  • Another possible application is to repair only part of the chromosome.
  • a specific part of a chromosome for example the part whose genes are responsible for graft rejection. This can be done using an ultrathin laser beam.
  • the equivalent part of the equivalent chromosome in the recipient of the graft which can also be done by laser cutting using an ultrathin laser beam.
  • This part of the chromosome is then reintroduced into the original chromosome, which can be done using plasmids, phagemids, synthetic vectors, or micromanipulations in nanotechnology. Synthetic vectors are made in the laboratory and consist of structures called "copolymer blocks" that bind to DNA or RNA. More generally, this type of repair is conceivable to repair any deficiency or dysfunction of a cell part, especially due to age.
  • Various embodiments and applications of cellular rejuvenation will now be described in more detail.
  • nucleus in order to rejuvenate or regenerate a differentiated cell, its nucleus (with or without its attached cytoplasm) is removed and transferred to the MRG, advantageously in a CRG of the oocyte, embryonic, fetal cell or cancerous. This core is left in the MRG for a predetermined time and then removed.
  • the nucleus is removed before the end of the nucleus telophase, that is to say that the nucleus is extracted from the MRG before its division into two cells, that is to say before the end of its first mitosis.
  • the inventor It has been observed that this temporary introduction of a nucleus into an MRG, especially in a CRG, results in a rapid and important lengthening of the telomeres, often synonymous with rejuvenation of the chromosomal material.
  • the regenerated nucleus can then be introduced into a differentiated recipient cell, strain or embryo, preferably enucleated, preferably autologous with respect to said nucleus, preferably of identical tissue, advantageously in the cell of origin of the nucleus or a neighboring cell, in which mitotic division can continue and thus lead to the birth of two daughter cells whose nucleic material is regenerated.
  • these cells may be subjected to a multiplication culture and reach such quantities that at least millions of cells sufficiently differentiated to be functionally and morphologically able to be implanted in the original tissue concerned.
  • the nucleus can be removed from the MRG after one or more mitoses, then one (or more) of the rejuvenated nuclei thus obtained is (are) reintroduced into a differentiated receptor cell, advantageously autologous with respect to the nucleus. preferably in the cell of origin of the nucleus or a neighboring cell.
  • the step of collecting and transferring the nucleus of the differentiated cell comprises taking, in addition to the nucleus, at least a part of the cytoplasm contained in the differentiated cell, in order to find in the MRG, particularly in CRG, some cytoplasmic components initially present in the cell differentiated, such as endoplasmic reticulum, golgy apparatus, ribosomes and / or mitochondria.
  • the bringing into contact of at least the nucleus of a differentiated cell with said MRG may consist of transferring MRG into a differentiated cell, for example by means of a pipette or by induced transfer. by a pressure difference. This can be accomplished by creating at least one slit or aperture in the membrane of the differentiated cell, and transferring MRG into said differentiated cell through said at least one slit or aperture.
  • a CRG and a differentiated cell side by side, to make an opening in the CRG membrane and an opening in the membrane of the differentiated cell, then to compress the CRG to at least partially transfer the cytoplasm of CRG in the differentiated cell.
  • This compression can be obtained by placing a pipette or the like above the membrane of the cell to be compressed, preferably locked against a wall, and exerting a suitable pressure.
  • This pressure could also be exerted by means of a fluid, preferably viscous, which can overflow the pipette without detaching it.
  • MAF can be removed before or after the first mitosis of the differentiated cell nucleus.
  • means may be provided for closing the differentiated cell with at least a portion of the remaining MRG included therein.
  • the oocyte used may possibly be a mammalian oocyte.
  • a rabbit or sheep oocyte could be used.
  • Oocytes derived from differentiation induced from embryonic stem cells (OPCE) can also be created in vitro. These OPCEs, obtained for example by cloning, can come from the recipient of the grafts and the treated nuclei thus become particularly autologous because the cytoplasm of the OPCs will comprise only a part of its foreign DNA and / or RNA, especially in the mitochondria and ribosomes.
  • nucleus which is, for example, in early, spontaneous or induced mitosis, or else chromosomes or genes or parts of nuclei to be treated in an embryonic-type cell.
  • Embryo-like cells that may be artificially activated by proteins or peptides of genetic signaling or cell activation or regulation may also be used, providing an environment capable of inducing some neighborhood genetic reprogramming.
  • removal of the nucleus from the differentiated cell can be advantageously done in anaphase or during telophase depending on the degree of genetic rejuvenation desired.
  • optical means such as a microscope, may be used.
  • a CRG will then preferably come from the same tissue, for example, cartilage, myocardial, etc., preferably partially pitted and cultivable in vitro, in vivo or in situ.
  • This or these cell (s) will be cultured for propagation preferably a sufficient time in vivo in embryonic tissues to obtain a partial dedifferentiation.
  • the nuclei thus treated can be left either in the embryonic-type cells to constitute a graftable tissue in the organism of origin of the nucleus, or extracted from their receptor cells to become inducer of local cellular or trans-membrane local regeneration at the level of the nucleus.
  • a differentiated tissue preferably autologous and identical.
  • the implantation of the nucleus or nuclear part can also be carried out inside a stem cell, preferably of embryonic or fetal type.
  • Such partially and selectively dedifferentiated cells can then be introduced into differentiated cells, such as chondrocytes, immune function, endocrine, cardiac cells, tissue cells that have undergone anti-cancer treatment, ⁇ cells and ⁇ islets of Langerhans, cells of the same origin as a graft to be transplanted, hepatocytes, etc., in order to regenerate the corresponding tissue.
  • differentiated cells such as chondrocytes, immune function, endocrine, cardiac cells, tissue cells that have undergone anti-cancer treatment, ⁇ cells and ⁇ islets of Langerhans, cells of the same origin as a graft to be transplanted, hepatocytes, etc.
  • This function also comprises the ability of these genetically activated cells to act remotely by secretion, release or induction of peptides and / or genetic signaling proteins, in particular, by specific biochemical molecules. This trans-membrane and / or trans-humoral genetic activation gives these cells the ability to actively and continuously stimulate other senescent deficient cells or to inhibit carcinogenic factors.
  • the system according to the invention and the cell regeneration methods used preferably comprise four successive stages, namely a preparation of the nuclear material, a genetic reprogramming, a multiplication in culture and a reimplantation in the organism of origin of the nucleus.
  • the preparation of the nuclear material consists in taking the nucleus of the cell, preferably differentiated with more or less cytoplasm, in order to preserve, if possible, the cytoplasmic components, such as the mitochondria, the ribosomes, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, lysosomes, peroxisomes, etc., of the initial differentiated cell at the level of the oocyte hosting this sample.
  • this step ensures synchronous reprogramming of the various vital structures around the nucleus and a probable conservation of the cellular "morpho-temporal field". Moreover, it is possible that certain constituents of the nuclear material such as chromosomes, a set of genes, one or more isolated genes (natural, recombined, semi-synthetic or synthetic) have previously been subjected to such a regeneration process. In this way, some elements of the preparation will have a different biological age.
  • a segment including plant DNA or synthetic vectors such as copolymer blocks, coding for example for vitamin C, E, folic acid, essential amino acids, unsaturated lipids essential peptides such as natriuretic (BNP) or atrial natriuretic (ANP) brain peptides, peptides C and Y, glutathione, peptide hormones such as glucagon, insulin, ACTH, peptides antibiotics, proteins such as globulins, immunoglobulins and albumins, DNA and RNA repair, restriction, replication and transcription enzymes, as well as cytochromes, cytokines, etc.
  • BNP natriuretic
  • ADP atrial natriuretic
  • a gene or a chromosome expressing for example erythropoietin or various albumin for example during metaphase, or the nuclear membrane to anaphase, telophase or a corresponding interphase.
  • the inventor estimates that the increase in cell biological age results in a decrease in the high elasticity of chromosomes, in particular metaphase chromosomes. This, in turn, leads in particular to a decrease in the accessibility of DNA polymerases, endo- and exonucleases and chromosomal DNA enzymes and thus constitutes an epigenetic and genetic cause of aging which can be combated by the genetic rejuvenation of the genome. 'invention.
  • the membranocytoplasmic container (oocyte) for treating the cytoplasmic reprogramming elements may sometimes be too small for the cellular elements to be treated.
  • oocyte membranocytoplasmic container
  • the membranocytoplasmic container (oocyte) for treating the cytoplasmic reprogramming elements may sometimes be too small for the cellular elements to be treated.
  • nucleus with a part of its cytoplasm, or of several sometimes different nuclei such as in a nephron, a muscle cell, a myocardial autorythmic cell, a hair follicle, a unit epidermal melanization, an epidermal-dermal unit, a glandular unit, a hepatobiliary unit, a retinal functional unit (such as a pigmented epithelium: cones, rods, bipolar cells, horizontal cells and M ⁇ ller cells), a vascular unit (cell endothelial and myoarterial), a hematopoietic
  • RAF membranocytoplasmic vessel with preserved oocyte function
  • Such an RAF can be made by gluing the membranes respective mammalian autologous or autologous oocytes, for example by manual or robotic micromanipulations, preferably preserving each respective cytoplasm within their respective membrane and creating a spherical, ovoid or cylindrical type volume. Such manipulation requires preserving the vital environment for each oocyte.
  • This membrane bonding may for example be achieved by means of a micro laser beam, a small heating light ray, a biological adhesive, etc.
  • the in vitro multiplication is preceded by the introduction of the nucleo-cytoplasmic material into a preferably enucleated cell, identical to that from which the nucleus originates, and with at least recoverable vitality.
  • Current multiplication techniques allow, for example, in two weeks to obtain about half a billion cells from tens.
  • the regeneration method according to the invention ensures a rapid and significant increase in the length of the telomeres in less than a day, thus making it possible to counterbalance their shortening resulting from so many successive replications.
  • This multiplication can also be done in vivo but is generally much slower and often requires sufficient initiation in vitro. This decreases the amount of cells required as well as the significant elongation of the telomeres and probably allows for better functional adaptation as well as greater genetic influence at a distance.
  • a cellular micromanipulation can be envisaged to produce an enlarged enclosure with a genetic and epigenetic reprogramming function capable of reversing temporally the evolution of the biological age of the nuclei and / or multiple cytoplasm that are introduced there.
  • cells with an oocyte function are, for example, cut into two parts, preferably by a cold-light laser micro-ray.
  • Both of these portions are open, and their membranes may be attached to a protein layer, such as globin, which has preferably been applied to a flexible surface.
  • This carpet of oocyte or embryonic membranes presents the cytoplasm upwards.
  • a sufficient surface of such a cytoplasmic velvet (VC) is formed, several differentiated cell nuclei can be placed there, with or without their cytoplasm, and then roll the VC around them as close as possible.
  • This interactive cell sandwich will preferably remain in the conventional cell culture nutrient liquid for the desired time to achieve the desired mitosis phase.
  • This cell regeneration is applicable to many cell types and can therefore create controlled regeneration tissues to treat many organic and tissue lesions.
  • this remote inductive cellular rejuvenation in particular by signaling proteins, may, in some cases, oppose the development of a local cancer, slow down its extension or even destroy all its metastases.
  • an autologous or even homologous ophthalmic retina including a functional cellular unit, for example consisting of a few cells of the pigmented epithelium, cones, rods, bi-polar cells and / or Muller cells, which has taken and regenerated, may be of great interest in the case of AMD.
  • Severe renal insufficiency can be combated by the implantation of partially dedifferentiated cells obtained, for example after transfer into and out of oocytes, of nuclei of different nephron cells.
  • Osteoarthritis can be treated by implantation of chondrocytes from cell regeneration.
  • oocytes preferably one or more nuclei or parts of cell nuclei.
  • hair follicle, melanocytes and keratinocytes for regeneration of the hair and / or its color.
  • Yet another application of the invention may consist in reinforcing or recreating the thymic functions by genetic rejuvenation of homologous or, if possible autologous, sufficiently dedifferentiated thymic cells to actively resuscitate the immunoprotective functions of the body.
  • a kidney can be regenerated in vitro from the various nephron cells (CNE) obtained for example by surgical or endoscopic renal biopsy under visual control.
  • CNE nephron cells
  • the CNEs will be treated by the treatment of the invention in order, for example, to reduce their biological age by three quarters, and the CNEs thus obtained will be amplified.
  • BNE nephrons
  • this BNE in function makes it possible to detect the different diseased cell segments that will be sampled and replaced, by in vitro microsurgery by rejuvenated and geometrically reconstituted identical cell segments.
  • this part of the kidney (which may even be a whole kidney) will be reimplanted into the patient with resumption of the vascular and urinary connections.
  • a particularly advantageous biomedical application for this method of cell regeneration generally concerns degenerative diseases of the joints (osteoarthritis).
  • Cartilage chondrocytes which often degenerate with age, can be removed by biopsy, endoscopy, local surgery, or arthroscopy. separated from their surrounding cartilage.
  • the reimplantation of the regenerated cells in the original joint should preferably be done in the vicinity, but outside the surfaces of the mobile articular cavity that supports the mechanical loads in order to avoid any crevices in its moving surfaces.
  • a defect of indirect blood supply of chondrocytes which is mainly by imbibition, must be corrected.
  • an autologous vascular functional tissue comprising small arteries - arterioles - capillaries - venules - and small veins, these vascular functional units can advantageously come from a post-regeneration autologous cell culture according to the invention.
  • This implantation of rejuvenated cells may be in the form of preformed three-dimensional lamellae layers according to the local geometry of the previously measured articular cavity, or in the form of a swarming in order to cause the durable emission in particular of signaling proteins.
  • the post-regeneration chondrocytes will progressively reconstitute a thicker, smooth, well lubricated cartilage.
  • Osteoporosis is a degenerative disease of bone tissue that occurs with age. To fight against this disease, it is advisable to regenerate autologous osteoblasts (and possibly osteocytes) and to re-implant them, preferably, at several levels of the bone. Osteoblasts are preferably propagated in culture with artificial geometric solicitations, in particular by imposing mechanical stresses, for example using a support frame.
  • This support frame may comprise at least one mobile side for movements in a plane.
  • two moving sides are used in the culture support frame and / or the possibility of performing motor rotations. dimensional.
  • the present invention can also be applied to subjects who have undergone serious inflammation, in particular by reaction weakenings of the various antibody-producing lymphocytes and pro-cytokines. anti-inflammatories.
  • the regeneration method according to the invention can then allow to revive these lymphocytes in number and function.
  • these lymphocytes can be subjected to the method according to the invention by placing a lymphocyte nucleus in an oocyte in the presence or absence of traces of antigens created by the infection in question in the oocyte cytoplasm.
  • the lymphocytes will be rejuvenated and multiplied and then reimplanted into the organism where they will have already "memorized” the dangerous antigens and produce or cause to be made to produce the corresponding antibodies. in large quantity.
  • the presence of specific antigens during the cell regeneration process may allow to "memorize” or exteriorize the antigens on the cell membranes and to optimize the reaction of production of the antigens. antibodies by their immediate appearance as rejuvenated lymphocyte functions recur.
  • the present invention also applies to cancer control.
  • the treatment of the invention makes it possible to create a method of personalizing cancer control. It is possible to proceed in the following manner: hematopoietic, lymphocyte, dendritic cells are collected at the level of the bone marrow or at the periphery, and different categories are isolated which are subjected to the treatment of the invention. After amplification of these cells in vitro, they are cultured in a nutrient bath in the vicinity of cancer cells taken from the tumor of the patient. It may then be useful to limit the nutrients and oxygen in the culture bath to stimulate competition and survival struggle between the two categories of cells.
  • the genetically rejuvenated lymphocytes of the patient will naturally develop specific antibodies against the antigens cancer cells and against certain substances and biological factors necessary for the metabolism and secretion of cancer cells. It is for example anti-sense or guide RNAs, often small, previously transfected in the DNA, in particular lymphocyte, by plasmids carrying the genes selected or constructed for this purpose. If the lymphocytes succeed in destroying the cancerous cells, they can be reinjected, preferably after their multiplication, into the organism of the patient from which they come. If, on the other hand, the lymphocyte cells fail in the destruction of the cancerous cells, the former must be reinforced, in particular by the injection of plasmids and / or cosmids and / or selected synthetic vectors.
  • DNA polymerases or DNA segments comprising synthetic or natural genes producing new antibodies or specific toxic substances against the cells to be combated.
  • a greater capacity is thus provided to produce antibodies and / or to stimulate lymphocyte metabolisms and mitoses, either by the selection of preferably highly immunogenic cells, such as so-called "memory effectors" with enhanced anti-tumor potential.
  • memory effectors for example by strengthening the genetic rejuvenation treatment of lymphocytes using the treatment of the invention.
  • cancer cells are autologous, genotypic and differential epigenotypic examination reveals the small part of the genome of cancer cells that differs from autologous normal cells of the same tissue (PGD).
  • PGD autologous normal cells of the same tissue
  • the genes involved can produce different m RNAs including editing (editing) or differential splicing. It is therefore necessary to know the biological and biochemical behaviors of the specific PGD each patient may, in part, vary in response to a therapy, for example biological, of the type of the present invention. In vitro, one can then try to find known innocuous viruses or bacteria such as certain bacteriophages and colifacts selected and / or genetically manipulated.
  • an adult homologous foreign cytoplasm EH
  • genetic reprogramming of the mitochondrial DNAs and ribosomal RNAs of the CEH is possible. This possibility can be used to protect an adult nucleus placed in an active oocyte against subsequent transfections by the oocyte cytoplasm as they occur during conventional cloning. Partial cloning removes the nucleus to be treated (NT) from the oocyte before its first cell division and places this reprogrammed nucleus in a cell preferably enucleated identical to its original cell.
  • NT nucleus to be treated
  • the oocyte cytoplasm is distant from the NT nucleus at the time of division of the nucleus, and this division takes place within an original cytoplasm (CO) of the NT nucleus. It is necessary to reprogram the CO genetically and to increase the quantity. To this end, we can take a second oocyte identical to the first and suck part of its cytoplasm and replace it with a cytoplasm of a cell identical to that of the NT core (CCINT).
  • CO original cytoplasm
  • the CCINT is removed from this oocyte and surrounded by the NT nucleus, which has kept some of its cytoplasm of CO origin, with the, or if necessary, several CCINT reprogrammed and recovered, before introducing the NT nucleus, thus re-packaged in a cell of origin of the NT nucleus, preferably enucleated and emptied of a part of its cytoplasm. If necessary, this cell can be enlarged according to one of the membrane manipulations previously described.
  • the present invention may advantageously also be applied to ulcers. Chronic ulcers, especially in the legs, often very long before healing, and this healing often leaves a significant cutaneous and subcutaneous sequelae. Other ulcers never heal.
  • the CRG (s) intended to accommodate this unit can be quite bulky and can therefore be for example artificially enlarged by the method previously described.
  • the cell may for example be chosen from a keratinocyte, Langerhans, Merkel and / or melanocyte cell, taken alone or in combination, while at the dermal level, cutaneous fibroblasts may be taken.
  • the cells of the epidermis and dermis can be placed in separate oocytes.
  • the epidermodermal cells collected after regeneration should as far as possible be positioned and fixed in the culture bath in a reciprocal conformation close to that naturally observed, so as to promote functional cell growth and simplify the implantation of the layer.
  • tissue regenerated on the receiving skin When culturing the regenerated cells, it may be possible to rearrange the respective position of the different categories of cells, or even to cultivate several variants of assembly intended for grafts at different locations or having a different morphology or function.
  • a device of the invention can provide for locally removing the epidermis and / or the damaged dermis, treating it with the regeneration according to the invention, and then manufacturing from this regenerated tissue.
  • genetically an extract of these cells which may be fixed for example in a cream, solution or the like for an external cutaneous application.
  • This extract can also be used to create a solution for injection in subcutaneous, intradermal or intra epidermal. It thus becomes possible to quickly and temporarily restore the repair functions of the epidermal and / or dermal DNA.
  • the invention makes it possible to fight genetically against the senescence of the skin, by modifying the collagens, in particular by rejuvenating them, to restore elasticity to the skin.
  • necrotic, fibrotic or inactive tissue areas are also an application of the present invention.
  • Such damaged tissue areas appear, for example, at the level of a myocardium, particularly following an infarction or heart failure, or for example at a body that has developed a tumor targeted by a destructive anticancer treatment.
  • the invention also applies to heart valves. These can be organic, with a limited lifespan (around 15 years). They can also be artificial, with a longer lifespan
  • the invention makes it possible to create a biological, artificial, mixed, or repaired cardiac valve, and to coat the surface of this substrate which is in contact with the blood of the patient. less a regenerated autologous cell layer.
  • This coating can be made from a treatment of cardiovascular endothelial autologous cells previously removed by cardiac or vascular catheterization, treated according to the present invention, and then implanted on the valve. In the case of a plasty, this implantation can be done intraoperatively, that is to say during the operation, covering at least a portion of the valve and the valve ring. In this way, anticoagulant therapy may become unnecessary.
  • the present invention also makes it possible to perform cardiac autografting instead of homologous grafts and mechanical artificial hearts with pneumatic or electrical transcutaneous supply.
  • the inventor was the first in the fifties to implant a totally artificial heart in a dog, allowing him to survive a short time while his natural heart was in a jar (R. Monod, F. Zacouto, E. Coraboeuf and R. Saumont: "Cardiopulmonary bypass allowing the temporary exclusion of the heart and its replacement by an intrathoracic mechanical device", Compt Rend Soc Biol., 150, No. l, 48 (1956)).
  • 3D echocardiography can advantageously be used to accurately reconstruct the geometries of the heart in order to best adapt to the thoracic volume specific to each patient (N. Mirochnik, A. Hagège, F. Zacouto and C. Guérot, "Physical reproduction of cardiac structures: a new avenue of exploration in cardiology.” Heart and Vessel Diseases Archives, Volume 93, No. 10, October 2000, pp. 1203-1209).
  • the present invention can also assist in the determination of the mechanism responsible for a disorder of the health status of a mammal. Indeed, the root cause of an impairment of the vital balance is sometimes difficult to find.
  • Langerhans taken for example by endoscope, will show an induced secretion of insulin or normal glucagon in contrast to the equivalent cells not subject to cell regeneration.
  • the origin of disease states occurring after a certain age is likely to be revealed by the functional comparison of existing or present suspicious tissue with respect to its now genetically rejuvenated tissue ancestor at a given biological age.
  • the present invention is also useful for diseases characterized by cell deficiency.
  • the present invention may allow regeneration and multiplication of ⁇ and ⁇ cells of islets of
  • Langerhans that can be re-implanted in the pancreas or elsewhere in order to restore the secretion of insulin or glucagon in an organism.
  • the implantation of regenerated hepatocytes can ensure healing of liver disorders.
  • Still another application of the present invention is, for example, the maintenance of an implant in a bone using a simple envelope or framework or support of regenerated cells.
  • This application comprises regenerating bone cells, in particular osteoblasts, preferably taken at an early stage of their spontaneous or induced mitosis in a CRG and then placing these regenerated osteoblasts before the end of their mitosis in a receptor cell preferably of osteoblasts, to cultivate osteoblasts in a suitable culture medium in order to obtain appropriate numbers and mechanical behavior and then to distribute the osteoblasts in the form of a sleeve, pedestal, framework, or envelope between an artificial bone implant and the bone.
  • the genetically rejuvenated layer of osteoblasts then ensures a good bonding of the bone implant and the bone by the osteoblastic thrust, and thus reinforces the maintenance of the implant in the bone and strengthens the bone structure itself.
  • the use of such regenerated cells ensures the long-term maintenance of the implant in the bone and can have a lasting, increased and curative efficacy compared to protein creams based on different BMPs (Bone Morphogenic Proteins) usually implemented.
  • Another possible use of the present invention is to ensure good histocompatibility between a donor graft and the immune system of a recipient.
  • a healthy cell of the graft member of the recipient can be removed and regenerated according to the described process and then transferred to a suitable receptor cell so as to cause the proliferation of these cells.
  • These cells can then be placed around the donor graft so that the recipient's immune system recognizes the critical molecules on the graft surface as self molecules and thus does not generate a strong immune response in the presence of the graft. .
  • the creation of histocompatibility can in particular be carried out in the following ways:
  • the present invention is also of particular interest in the field of dental stomatology.
  • the absence of teeth must often be compensated by ceramic, plastic, etc. metal implants. These implants require a sufficient maxillary bone support base to ensure strong fixation of the implant.
  • this bone regeneration is combined with the maxillary bone, which can be done by local injections of regenerated cells into, in contact with, or near the bone, a coating of the implant with at least one layer of bone cells. and / or regenerated periodontal, which will improve the fixation, the viscoelastic strength and the corresponding strength of the implant in the bone, as well as the strength of the bone itself.
  • Another example of application of the cell regeneration method according to the invention relates to fractures and bone surgery.
  • Some bone fractures and malformations require surgery that sometimes requires extra bone mass graftable and solid. This can be achieved by genetic rejuvenation of local cells with multiplication each time the final surgery can be delayed by at least two weeks. This is particularly the case for interventions for pseudarthrosis, vertebral bone deformities of children or degenerative, arthritis or deforming arthrosis.
  • In vitro cell multiplication of osteoblast cells should preferably be carried out taking into account, as soon as they are cultured, the mechanical stresses they must withstand, for example after implantation in the femur, maxillary, vertebrae, etc.
  • the inventor has developed an original adjustable vertebral fixator (US-6,835,207) and an original adjustable vertebral disc (US-6,692,495), both of which can advantageously be combined with vertebral tissue resulting from such cellular regeneration, and for example serve as a pedestal base for fixation pedicle screws or for filling crowded or fractured vertebrae, or as a supporting framework.
  • Another application of the invention relates to non-autologous grafts. Indeed, a major problem concerns the rejection of transplants by the recipient. However, it is known that the fetal cells or near embryonic cells are less rejected. Sufficiently rejuvenated cells, for example by several successive treatments according to the invention, would make it possible to reduce the problem of rejections of non-autologous grafts. It should be noted that changing the biological age of a cell
  • the nucleus of a cell is transferred into an oocyte, will divide and become able to reproduce in utero or artificially in vitro the original tissue of said nucleus.
  • this means that the nucleus is in contact with a cytoplasm containing mitochondria and ribosomes capable of influencing the function and / or evolution of the nucleus, in particular via foreign DNAs and / or RNAs, because oocytes they contain.
  • a cytoplasm containing mitochondria and ribosomes capable of influencing the function and / or evolution of the nucleus, in particular via foreign DNAs and / or RNAs, because oocytes they contain.
  • the oocyte comes from the mother, it is possible that it has different characteristics due in particular to the influence of the environment, therapies, diseases, age, etc. To obtain a purely autologous tissue, it would be necessary to use an oocyte of the mother obtained at the time of the birth of origin, which is rarely feasible.
  • partial cloning which consists in temporarily introducing a nucleus into an oocyte for a short time, then retransferring it to an autologous recipient cell, preferably identical to its cell of origin
  • the tissue obtained is purely autologous, whatever the oocyte (or CRG or equivalent MRG cell) used.
  • This can make it possible to use an oocyte of a mammal not necessarily identical while ensuring maximum genetic purity.
  • the methods according to the invention can also be used to obtain embryonic cells from an adult nucleus. For this, one surrounds the previously reprogrammed nucleus preferably with additional cytoplasm autologous to the nucleus, as previously described.
  • the treated nucleus thus packaged is placed in an oocyte (or MRG), enlarged if necessary according to the invention, and the embryonic cell divisions are allowed to develop.
  • oocyte or MRG
  • embryonic or fetal cells from a younger nucleus are created and the differences in biological age between this nucleus and the embryonic or fetal cells created are reduced.

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Abstract

L'invention permet notamment de rajeunir un noyau cellulaire adulte sans passer par un stade embryonnaire et d'obtenir un tissu génétiquement rajeuni et autologue par rapport au noyau d'origine. Ceci peut être réalisé par l'introduction temporaire d'un noyau dans un ovocyte énuclée (rajeunissement génétique) suivit de son extraction ovocytaire avant sa division cellulaire. Le noyau traité peut ensuite être introduit dans un cytoplasme adulte originaire du noyau. Ainsi les divisions cellulaires à partir de ce noyau rajeuni se feront dans un cytoplasme autologue et adulte et les cellules qui en résultent seront immédiatement adultes, différentiées et fonctionnelles. Le tissu autologue rajeuni ainsi crée pourra être greffé sans rejet au niveau du tissu adulte de l'organisme de provenance du noyau traité. Au cours de la procédure de l'invention, les noyaux et cytoplasmes traités restent constamment à l'état adulte et aucune différentiation cellulaire artificielle n'est nécessaire. L'invention se différencie donc du clonage classique total qui exige un retour à l'état embryonnaire des cellules traitées et une différentiation cellulaire artificielle. En outre les tissus qui dérivent du clonage classique ne sont pas immunologiquement compatibles avec les tissus adultes d'origine du noyau traité car sa division cellulaire a eu lieu dans l'ovocyte qui est un cytoplasme étranger au noyau. En outre le clonage classique permet la création d'organismes entiers contrairement à l'invention qui ne permet de traiter qu'un seul et unique tissu. Les possibilités de l'invention comprennent, par exemple, la réparation de tissus nécrosés, tel qu'un infarctus du myocarde, et de tissus lésés, tels que la rétine (DMLA), l'insuffisance cardiaque, rénale, hépatique et l'ostéoporose, le traitement des cancers survenants avec l'âge tels que ceux de la prostate, du rectum, colon, etc. L'implantation anodine d'un petit volume de cellules encore saines, rajeunis et autologues de l'organe atteint devrait permettre d'inhiber ces cancers avec leurs métastases.

Description

Système et procédé de traitement génétique et épigénétique.
La présente invention concerne des systèmes et des procédés destinés à génétiquement et épigénétiquement traiter des cellules.
De tels systèmes et de tels procédés sont notamment utiles dans le domaine des traitements cellulaires, notamment pour la réalisation d'autogreffes à partir de cellules différenciées ou souches embryonnaires ou foetales.
Les traitements cellulaires, et en particulier les autogreffes, sont à ce jour pratiquées dans l'optique de réparer un tissu endommagé souffrant d'une maladie, d'un déficit cellulaire ou d'une nécrose. Cette technique consiste généralement à prélever quelques cellules saines du tissu concerné, à mettre en culture de multiplication cellulaire ces cellules afin de constituer un stock ou tissu de cellules et de réimplanter ces cellules dans le tissu à traiter. Ces cellules reprogrammées peuvent permettre alors au tissu concerné de recouvrir ses capacités morphologiques et fonctionnelles d'origine.
Par exemple, cette technique est employée pour la réparation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire présente un potentiel de réparation limité et les lésions d'un certain volume ne cicatrisent bien que rarement. Afin de réparer de telles lésions et prévenir l'apparition de l'arthrose chez les malades, des chondrocytes, baignant dans une matrice extracellulaire, sont prélevés, débarrassés de la matrice par exemple par digestion enzymatique puis mis en culture, généralement sur des sérums de veau foetal ou de préférence dans du sérum du patient, et dans des matrices tridimensionnelles (par exemple une matrice d'agarose, de collagène ou de globine). Une telle mise en culture permet alors aux cellules prélevées de se multiplier par division mitotique et aboutit alors à l'obtention de millions de chondrocytes. Ces chondrocytes peuvent ensuite être réimplantés dans le tissu cartilagineux afin de restaurer les cellules et le cartilage déficitaire.
Toutefois, l'inconvénient de ces techniques de multiplication est que généralement les cellules prélevées sont des cellules ayant déjà subi de nombreuses divisions mitotiques. Or, la culture de cellules pour leur multiplication provoque une légère diminution des télomères à chaque mitose et cette multiplication se fait souvent sur des cellules déjà vieillies, proches de leur fin de vie et de leur fin de fonctions, et dont l'ADN est en outre susceptible d'être altéré. Notamment, il est connu que le vieillissement cellulaire se traduit par un rongement progressif des télomères (extrémité des chromosomes). Or, ces télomères conditionnent le nombre restant de divisions mitotiques. Ainsi, le fait de cultiver des cellules mères ayant déjà subi de nombreuses mitoses peut donner lieu à une importante colonie de cellules filles vieillies et à survie raccourcie pouvant présenter par ailleurs des altérations de fonctionnalité génique.
Le but de la présente invention est de fournir des systèmes et des procédés de traitement génétique et épigénétique surmontant les inconvénients susmentionnés.
En particulier, la présente invention a pour but de fournir des systèmes et des procédés de traitement cellulaire permettant une production rapide et de masse de cellules saines présentant des fonctionnalités géniques améliorées et/ ou capables d'être génétiquement et épigénétiquement rajeunies, vieillies et/ ou réparées à un degré désiré.
La présente invention a encore pour but de fournir des systèmes et des procédés de traitement cellulaire aboutissant à la fois à une reconstitution d'un tissu autologue manquant, défaillant, à renforcer ou à modifier, et à un rajeunissement génétique du tissu dans lequel les cellules ont été implantées. La présente invention a donc pour objet un système de traitement génétique et épigénétique de cellules à traiter, comprenant : - au moins une cellule à traiter,
- un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique, et - des moyens pour mettre en contact au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter avec ledit MRG pour modifier l'âge biologique et/ ou réparer ladite au moins une cellule à traiter.
La présente invention à aussi pour objet un procédé de traitement génétique et épigénétique de cellules à traiter, comprenant les étapes suivantes :
- fournir au moins une cellule à traiter,
- fournir un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique, et - mettre en contact au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter avec ledit MRG pour modifier l'âge biologique et/ ou réparer ladite au moins une cellule à traiter.
Divers modes de réalisation et applications sont décrits dans les revendications dépendantes. Des avantages, caractéristiques et applications de l'invention apparaîtront plus clairement au cours de la description détaillée suivante, de plusieurs modes de réalisation et variantes de l'invention.
L'invention concerne en particulier la modification de l'environnement d'un noyau cellulaire avec ou sans transfert extracellulaire ou intra-ovocytaire, de manière à mettre le noyau sous l'influence d'un milieu induisant sa reprogrammation génétique partielle, mais sans provoquer un retour du noyau au développement de cellules embryonnaires. Ce milieu provoquera une meilleure réparation de l'ADN cellulaire lors des divisions et agressions et/ou un rajeunissement génétique par l'action d'un milieu inverseur du temps biologique, tel qu'un ovocyte.
La présente invention concerne notamment des systèmes et des procédés s' appliquant au domaine du traitement et/ ou réparation et/ou amélioration cellulaire fonctionnelle et/ ou morphologique destinés à ouvrir de nombreuses perspectives pour la lutte contre un grand nombre de maladies mais également contre la sénescence des tissus due dans une très large mesure à la perte de leur capacité fonctionnelle et morphologique de prolifération, de régénération et de réparation. En particulier, la présente invention a pour objet un système et des procédés aptes à traiter des cellules d'un tissu, notamment pour rajeunir, vieillir et/ ou réparer ces cellules. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu adéquat de manière à créer un stock ou tissu de cellules génétiquement et épigénétiquement traitées capables d'être implantées dans le tissu considéré, ou à distance de celui-ci, où ces cellules pourront émettre notamment des protéines et/ ou peptides de signalisation et/ ou de stimulation du métabolisme, et/ ou des enzymes de réparation de l'ADN, pour le tissu considéré.
Plus précisément, les systèmes et les procédés selon l'invention consistent à mettre en contact au moins une partie d'un noyau d'au moins une cellule à traiter avec un milieu de reprogrammation génétique (MRG).
Ce MRG comprend au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique. Un cytoplasme reconstitué et/ou synthétique peut être notamment composé d'extraits de sérums embryonnaires, de cicatrisation et/ ou de cellules soumises à une activation métabolique. Un cytoplasme totalement synthétique, par exemple réalisé par reconstitution physique et chimique de substances actives, est possible. Il est aussi envisageable de réaliser un MRG sous la forme d'une « bouillie » de CRG, avec ou sans noyaux. Il est aussi possible d'ajouter des extraits de cellules ou de cytoplasme et/ ou d'autres substances connues pour leur capacité d'activation du métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ ou des protéines ou peptides de signalisation ou de stimulation du métabolisme et/ ou des facteurs de croissance et/ou des cellules ou extraits de cellules cancéreuses.
Les extraits de cellules ou de cytoplasme peuvent être obtenus par des traitements physiques ou chimiques bien connus. L'intérêt d'utiliser des cellules cancéreuses, et en particulier du cytoplasme de celles-ci, s'explique par le fait que les facteurs d'activation métabolique, de signalisation et de mitoses y sont particulièrement intenses et susceptibles d'induire temporairement une réactivation métabolique ou nucléaire d'une cellule à traiter. La contagion cancéreuse est improbable car les cancers ne sont en général pas transmissibles à un tissu différent, et leurs cytoplasmes restent normaux. L'usage de cytoplasmes de cellules cancéreuses sélectionnées est possible pour traiter temporairement des noyaux ou des cellules adultes ou non qui sont insuffisamment capables de se diviser spontanément ou en culture, de réparer leur ADN mal recopié, ou qui sont fonctionnellement déficientes. On sait qu'une cellule cancéreuse agrandit rapidement ses télomères, accélère et prolonge indéfiniment ses mitoses, accroît ses enzymes de réparation de son ADN et augmente ses performance auto- para- et endocrines. Il s'agit donc de transférer sélectivement un fonctionnement choisi de la cellule cancéreuse sur la cellule à traiter, sans risquer une contamination néoplasique tératogène. Le cancer n'étant pas directement contagieux pour des cellules non cancéreuses, même malades, l'application sélective régénératrice de cellules cancéreuses peut se faire par exemple de deux façons : traitement intracellulaire : un noyau est prélevé d'une cellule cancéreuse et introduit dans le cytoplasme d'une cellule du tissu à traiter ; ce noyau reste de préférence séparé du noyau normal par une languette ou membrane d'un tissu biocompatible poreux éventuellement imprégné d'anticorps, ledit tissu laissant passer les protéines de signalisation mais empêchant tout passage de gènes ou de chromosomes. Dans ces conditions, les protéines de signalisation émises par le noyau cancéreux vont provoquer une reprogrammation génétique partielle du noyau cellulaire à traiter, spécialement dans ses fonctions défaillantes. Après une ou plusieurs mitoses, le noyau cancéreux sera enlevé, et la cellule reprogrammée pourra être multipliée dans une culture cellulaire adaptée. traitement extracellulaire : des cellules cancéreuses choisies sont rapprochées de quelques cellules à traiter dans un bain de culture cellulaire adapté de façon à comporter au moins un facteur capable d'augmenter la perméabilité des membranes cellulaires, notamment aux protéines de signalisation. Ceci peut se faire jusqu'à ce que l'observation ou des tests génétiques, protéomiques, biochimiques ou biophysiques permettent de constater l'induction d'une réactivation fonctionnelle de la ou des déficience(s) nucléaire(s) à corriger. Notamment des biopuces sélectives vont rendre possible de cibler les protéines de signalisation émises du noyau cancéreux et de reprogrammer sélectivement le noyau à traiter dans ses fonctions voulues et programmées. Trois types de traitement principaux peuvent notamment être envisagés, à savoir le rajeunissement de l'âge biologique d'une cellule, le vieillissement de l'âge biologique d'une cellule et la réparation d'une cellule. Le rajeunissement de l'âge biologique d'une cellule favorise également la capacité d'auto-réparation de cette cellule, notamment au niveau de son ADN.
Dans le cadre d'un traitement génétique et épigénétique pour rajeunir une cellule, le MRG comprend tout ou partie d'une ou plusieurs CRG. Dans ce cas, une telle CRG est avantageusement un ovocyte, une cellule embryonnaire, une cellule souche embryonnaire ou adulte, une cellule foetale, ou un récipient cellulaire reconstitué à partir de ces cellules, ou synthétisé. Les systèmes, procédés et applications pour réaliser un tel rajeunissement seront décrits plus en détail ci-après. Le vieillissement d'une cellule est notamment envisageable pour traiter des maladies foetales ou chez le nouveau-né, dues notamment à des cancers d'origine embryonnaire, tel que le glioblastome. Pour reprogrammer ces cellules cancéreuses, on peut les vieillir artificiellement en remplaçant le noyau cancéreux par un noyau sain du même tissu autologue ou homologue mais plus âgé, de préférence HLA (Human Lymphocyte Antigen) compatible. Ainsi, l'interaction entre le noyau plus âgé et le cytoplasme jeune favorise un certain vieillissement temporairement accéléré au moins du cytoplasme de la cellule jeune. Le vieillissement peut alors être augmenté par multiplication de cellules dans un bain de culture, le cytoplasme jeune provoquant des mitoses accélérées du noyau plus âgé, induisant une diminution des télomères. Après culture, un tri des cellules saines est possible pour réimplanter un tissu sain à la place du tissu malade d'origine.
Une autre application possible consiste à réparer une cellule, notamment dans sa constitution chromosomique, en traitant seulement une partie d'un noyau, par exemple un chromosome. Par exemple dans le cadre d'une leucémie, le chromosome malade, notamment le chromosome « Philadelphie », peut, lors de la métaphase où les chromosomes sont déployés, être détruit, par exemple au moyen d'un rayon laser ultramince, de préférence de diamètre égal ou inférieur à 1 micron. Ensuite, on prélève un chromosome sain équivalent lors de la métaphase d'une cellule équivalente du patient ou d'un donneur HLA compatible, et on l'implante dans la cellule cancéreuse, notamment durant sa mitose. Le traitement pourrait être envisagé notamment pour un grand nombre de cancers, par exemple le glioblastome, le cancer du sein ou du rectum.
Une autre application possible est de réparer seulement une partie du chromosome. Ainsi, on peut supprimer une partie spécifique d'un chromosome, par exemple la partie dont les gènes sont responsables du rejet des greffes. Ceci peut se faire au moyen d'un rayon laser ultramince. Ensuite on prend la partie équivalente du chromosome équivalent chez le receveur de la greffe, ce qui peut également se faire par découpe laser au moyen d'un rayon laser ultramince. On réintroduit ensuite cette partie de chromosome dans le chromosome d'origine, ce qui peut se faire au moyen de plasmides, de phagémides, de vecteurs synthétiques, ou de micromanipulations en nanotechnologies. Les vecteurs synthétiques sont fabriqués en laboratoire et sont formés de structures appelées « blocs copolymères » qui se lient à l'ADN ou à l'ARN. De manière plus générale, ce type de réparation est envisageable pour réparer toute déficience ou dysfonctionnement d'une partie de cellule, notamment due à l'âge. Divers modes de réalisation et applications du rajeunissement cellulaire vont maintenant être décrits plus en détails.
Selon un premier aspect de l'invention, pour rajeunir ou régénérer une cellule différenciée, on prélève son noyau (avec ou sans son cytoplasme attaché) et on le transfère dans le MRG, avantageusement dans une CRG du type cellule ovocytaire, embryonnaire, foetale ou cancéreuse. Ce noyau est laissé dans le MRG pendant un temps prédéterminé, puis retiré. Selon une première variante, le noyau est retiré avant la fin de la télophase du noyau, c'est-à-dire que le noyau est extrait du MRG avant sa division en deux cellules, autrement dit avant la fin de sa première mitose. L'inventeur a observé que cette introduction temporaire d'un noyau dans un MRG, notamment dans une CRG, aboutit à un allongement rapide et important des télomères, souvent synonyme de rajeunissement du matériel chromosomique. Le noyau régénéré peut alors être introduit dans une cellule réceptrice différenciée, souche ou embryonnaire, de préférence énuclée, de préférence autologue par rapport audit noyau, de préférence de tissu identique, avantageusement dans la cellule d'origine du noyau ou une cellule voisine, dans laquelle la division mitotique pourra se poursuivre et ainsi aboutir à la naissance de deux cellules filles dont le matériel nucléique est régénéré. Ensuite, ces cellules pourront être soumises à une culture de multiplication et atteindre des quantités telles qu'au moins des millions de cellules assez différenciées pour être fonctionnellement et morphologiquement aptes à être implantées au niveau du tissu d'origine concerné. En variante, le noyau peut être retiré du MRG après une ou plusieurs mitoses, puis un (ou plusieurs) des noyaux rajeunis ainsi obtenu(s) est (sont) réintroduit(s) dans une cellule réceptrice différenciée, avantageusement autologue par rapport au noyau, de préférence dans la cellule d'origine du noyau ou une cellule voisine.
Il est à noter que dans le cadre de ce premier aspect de l'invention, il peut être souhaitable d'ouvrir ou de retirer au moins partiellement la membrane de la CRG, pour éviter tout risque de division cellulaire de celle- ci. En effet, la membrane est nécessaire au phénomène de division cellulaire, alors que c'est le cytoplasme qui est le lieu privilégié de la reprogrammation génétique. Selon un aspect avantageux de l'invention, l'étape de prélèvement et de transfert du noyau de la cellule différenciée comprend de prélever, outre le noyau, au moins une partie du cytoplasme contenu dans la cellule différenciée, afin de retrouver dans le MRG, notamment dans la CRG, quelques composants cytoplasmiques initialement présents dans la cellule différenciée, tels que le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgy, les ribosomes et/ ou les mitochondries.
Selon un second aspect de l'invention, la mise en contact d'au moins le noyau d'une cellule différenciée avec ledit MRG peut consister à transférer du MRG dans une cellule différenciée, par exemple au moyen d'une pipette ou par transfert provoqué par une différence de pression. Ceci peut être réalisé en créant au moins une fente ou ouverture dans la membrane de la cellule différenciée, et de transférer du MRG dans ladite cellule différenciée à travers ladite au moins une fente ou ouverture. Avantageusement, on prévoit de pouvoir séparer ou retirer ledit MRG transféré après un certain laps de temps prédéterminable ou observable, suffisant pour reprogrammer génétiquement le noyau de la cellule différenciée. Par exemple, il est envisageable de disposer côte à côte une CRG et une cellule différenciée, de réaliser une ouverture dans la membrane de la CRG et une ouverture dans la membrane de la cellule différenciée, puis de comprimer la CRG pour transférer au moins partiellement le cytoplasme de la CRG dans la cellule différenciée. Cette compression peut être obtenue en plaçant une pipette ou similaire au dessus de la membrane de la cellule à comprimer de préférence bloquée contre une paroi, et en exerçant une pression adaptée. On pourrait aussi exercer cette pression au moyen d'un fluide, de préférence visqueux, pouvant déborder de la pipette sans s'en détacher. Cette compression est maintenue le temps nécessaire à la reprogrammation génétique du noyau de la cellule différenciée, puis la compression sur la CRG est supprimée, avec pour effet que le cytoplasme de la CRG transféré dans la cellule différenciée est au moins partiellement ré-aspiré dans la CRG. Il est à noter que le MRG peut être retiré avant ou après la première mitose du noyau de la cellule différenciée. En variante, on peut prévoir des moyens pour refermer la cellule différenciée avec au moins une partie du MRG restant inclus en elle. Les exemples d'applications décrits ci-après font référence plus généralement au premier aspect de l'invention décrit ci-dessus (transfert temporaire d'un noyau de cellule différenciée dans un MRG, notamment dans une CRG), mais il est entendu qu'ils pourraient tous être mis également en œuvre avec le second aspect de l'invention décrit précédemment (transfert de MRG dans une cellule différenciée). Par ailleurs, la plupart des exemples font référence à l'utilisation d'ovocyte, mais toute CRG, et plus généralement tout MRG peut être utilisé pour mettre en œuvre ces exemples.
Tout d'abord, il est à noter que l'ovocyte utilisé peut possiblement être un ovocyte de mammifère. Par exemple, un ovocyte de lapin ou de mouton pourrait être utilisé. On peut aussi créer in vitro des ovocytes provenant d'une différenciation induite à partir de cellules souches embryonnaires (OPCE). Ces OPCE, par exemple obtenus par clonage, peuvent provenir du receveur des greffes et les noyaux traités devenir ainsi particulièrement autologues car le cytoplasme des OPCE ne comportera plus qu'une partie de son ADN et/ ou ARN étranger, notamment dans les mitochondries et les ribosomes. On peut également introduire dans l'ovocyte, un noyau, qui soit par exemple en mitose débutante, spontanée ou provoquée, ou par ailleurs des chromosomes ou gènes ou parties de noyaux à traiter dans une cellule de type embryonnaire. On peut aussi utiliser des cellules de type embryonnaires qui peuvent être artificiellement activées par des protéines ou des peptides de signalisation génétique ou d'activation ou régulation cellulaire, constituant un environnement capable d'induire une certaine reprogrammation génétique de voisinage. Ainsi, le retrait du noyau de la cellule différenciée peut se faire de façon avantageuse en anaphase ou en cours de télophase selon le degré de rajeunissement génétique souhaité. Afin d'observer la période mitotique en cours, des moyens optiques, tels qu'un microscope, peuvent êtres utilisés. Si une CRG est ensuite utilisée, elle proviendra alors de préférence du même tissu, par exemple, cartilagineuse, myocardique, etc., de préférence partiellement dénoyautée et cultivable in vitro, in vivo ou in situ. Cette ou ces cellule(s) seront cultivées pour multiplication de préférence un temps suffisant in vivo dans des tissus embryonnaires pour obtenir une dédifférenciation partielle. Les noyaux ainsi traités peuvent être laissés, soit dans les cellules de type embryonnaire pour constituer un tissu greffable dans l'organisme de provenance du noyau, soit extrait de leurs cellules réceptrices pour devenir inducteur de régénération cellulaire locale intra ou trans-membranaire au niveau d'un tissu différencié, de préférence autologue et identique. L'implantation du noyau ou partie nucléaire peut également se faire à l'intérieur d'une cellule souche, de préférence de type embryonnaire ou foetale.
De telles cellules partiellement et sélectivement dédifférenciées peuvent ensuite être introduites dans des cellules différenciées, tels que des chondrocytes, des cellules à fonction immunitaires, endocriniennes, des cellules cardiaques, des cellules issues de tissus ayant subit un traitement anti-cancéreux, des cellules β et α des îlots de Langerhans, des cellules de même origine qu'un greffon à transplanter, des hépatocytes, etc., afin de régénérer le tissu correspondant. Une telle invention peut ainsi être appliquée sans limitation à la régénération de toute cellule assez différenciée, telle que des cellules cardiaques, rénales, osseuses, tendineuses, cartilagineuses, cutanées, dermiques, épidermiques, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, glandulaires, hématopoïétiques, nerveuses, vasculaires, rétiniennes, dentaires, desmodontales, spléniques, parathyroïdiennes, surrénaliennes, des tuyaux digestifs et respiratoires, etc. A partir d'un certain degré de dédifférenciation, ces cellules perdent leur pouvoir immunogène et peuvent parfois être utilisées pour régénérer des tissus non autologues. Cette fonction comporte aussi la capacité de ces cellules génétiquement activées d'agir à distance par sécrétion, libération ou induction de peptides et/ ou protéines de signalisation génétique, notamment, par molécules biochimiques spécifiques. Cette activation génétique trans-membranaire et/ ou trans-humorale donne la capacité à ces cellules de stimuler activement et continuellement d'autres cellules déficientes sénescentes ou d'inhiber des facteurs cancérigènes. Le système selon l'invention et les procédés de régénération cellulaires mis en œuvre comportent de préférence quatre stades successifs, à savoir une préparation du matériel nucléaire, une reprogrammation génétique, une multiplication en culture et une réimplantation dans l'organisme de provenance du noyau. La préparation du matériel nucléaire consiste à prélever le noyau de la cellule assez différenciée de préférence avec plus ou moins de cytoplasme afin de conserver si possible les composants cytoplasmiques, tels que les mitochondries, les ribosomes, le réticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, les lysosomes, les péroxysomes, etc., de la cellule différenciée initiale au niveau de l'ovocyte accueillant ce prélèvement. L'inventeur suppose que cette étape permet d'assurer une reprogrammation synchrone des diverses structures vitales autour du noyau et une conservation probable du « champ morpho-temporel » cellulaire. Par ailleurs, il est possible que certains constituants du matériel nucléaire tels que les chromosomes, un ensemble de gènes, un ou plusieurs gènes isolés (naturels, recombinés, semi synthétiques ou synthétiques) aient été préalablement soumis à un tel procédé de régénération. De cette façon, certains éléments de la préparation auront un âge biologique différent. En outre, il peut être prévu d'accoler un segment notamment d'ADN végétal ou de vecteurs synthétiques tels que des blocs copolymères, codant par exemple pour la vitamine C, E, l'acide folique, les acides aminés indispensables, les lipides insaturés indispensables, les peptides tels que des peptides cérébraux natriurétiques (BNP) ou auriculaires natriurétiques (ANP), les peptides C et Y, le glutathion, les hormones peptidiques tels que le glucagon, l'insuline, l'ACTH, les peptides antibiotiques, les protéines telles que les globulines, les immunoglobulines et les albumines, les enzymes de réparation de l'ADN et de TARN, de restriction, de réplication et de transcription, ainsi que les cytochromes, les cytokines, etc. à un gène ou un chromosome, exprimant par exemple l'érythropoïétine ou diverses albumines par exemple lors de la métaphase, ou à la membrane nucléaire à l'anaphase, à la télophase ou à une interphase correspondante. L'inventeur estime que l'augmentation de l'âge biologique cellulaire entraîne une diminution de la grande élasticité des chromosomes notamment métaphasiques. Ceci entraîne à son tour notamment une baisse de l'accessibilité des ADN-polymérases, des endo- et exonucléases et des enzymes de l'ADN chromosomique et constitue ainsi une cause épigénétique et génétique du vieillissement qui pourra être combattue par le rajeunissement génétique de l'invention.
Le récipient membrano-cytoplasmique (ovocyte) pour traiter les éléments cytoplasmiques de reprogrammation peut se révéler parfois trop petit pour les éléments cellulaires que l'on désire traiter. A titre d'exemple, on peut penser au traitement simultané d'un noyau avec une partie de son cytoplasme, ou de plusieurs noyaux parfois différents tels que dans un néphron, une cellule musculaire, une cellule autorythmique myocardique, un follicule pileux, une unité épidermique de mélanisation, une unité épiderme- derme, une unité glandulaire, une unité hépatobiliaire, une unité fonctionnelle rétinienne (tel qu'un épithélium pigmenté : cônes, bâtonnets, cellules bipolaires, cellules horizontales et cellules de Mϋller), une unité vasculaire (cellule endothéliale et myoartérielle), une unité hématopoïétique, une unité neuro-glio-dendritique, une unité ovarienne de follicules de Graaf, etc. Afin de traiter une unité à plusieurs noyaux par un système ou un procédé de régénération selon l'invention, il peut être nécessaire de disposer d'un récipient membrano-cytoplasmique agrandi à fonction ovocytaire préservé (RAF). Un tel RAF peut être réalisé par collage des membranes respectives de plusieurs ovocytes de préférence homo ou autologue de mammifères, par exemple par micromanipulations manuelles ou robotiques, en préservant de préférence chaque cytoplasme respectif au sein de leur membrane respective et en créant un volume du type sphérique, ovoïde ou cylindrique. Une telle manipulation exige de préserver l'environnement vital pour chaque ovocyte. Cet accolement membranaire peut par exemple être réalisé au moyen d'un micro rayon laser, d'un petit rayon lumineux chauffant, d'un collant biologique, etc.
La multiplication in vitro est précédée par l'introduction du matériel nucléo-cytoplasmique dans une cellule de préférence énuclée, identique à celle dont provient le noyau, et à vitalité au moins récupérable. Les techniques actuelles de multiplication permettent, par exemple, en deux semaines d'obtenir environ un demi milliard de cellules à partir de dizaines. Dans le cas présent, l'inventeur a observé que le procédé de régénération selon l'invention assure un accroissement rapide et important de la longueur des télomères en moins d'une journée permettant ainsi de contrebalancer leur raccourcissement résultant des si nombreuses réplications successives. Cette multiplication peut également se faire in vivo mais est généralement beaucoup plus lente et nécessite souvent un amorçage suffisant in vitro. Ceci diminue la quantité de cellules nécessaires ainsi que le rongement important des télomères et permet probablement une meilleure adaptation fonctionnelle ainsi qu'une plus grande influence génétique à distance.
Il peut être souhaitable de régénérer ensemble une pluralité de cellules représentant une unité fonctionnelle organique, telle que par exemple un néphron, des cellules rétiniennes pigmentaires des différentes catégories ou des alvéoles pulmonaires, pour former une unité fonctionnelle organique génétiquement rajeunie. Par exemple, on peut envisager une micromanipulation cellulaire pour réaliser une enceinte agrandie à fonction de reprogrammation génétique et épigénétique capable d'inverser temporellement l'évolution de l'âge biologique des noyaux et/ou cytoplasmes multiples qui y sont introduits. A cette fin, les cellules à fonction ovocytaire sont, par exemple, coupées en deux parties, de préférence par un micro-rayon laser à lumière froide. Ces deux parties sont ouvertes, et leurs membranes peuvent être fixées sur une couche protéique, tel que de la globine, laquelle a de préférence été appliquée sur une surface flexible. Ce tapis de membranes ovocytaires ou embryonnaires présente les cytoplasmes vers le haut. Lorsqu'une surface suffisante d'un tel velours cytoplasmique (VC) est constituée, on peut y poser plusieurs noyaux de cellules différenciées, avec ou sans leur cytoplasme, et rouler ensuite le VC autour d'eux le plus près possible. Ce sandwich cellulaire interactif restera, de préférence, dans le liquide nutritif classique de culture cellulaire le temps choisi pour obtenir la phase de mitose désirée. On peut ainsi obtenir le rajeunissement simultané de plusieurs noyaux appartenant à une unité fonctionnelle organique qui pourra être multipliée soit à l'état de cellules isolées, ce qui exige un réarrangement des cellules multipliées selon leur ordre fonctionnel, soit à l'état d'un ensemble de cellules déjà placées dans leur ordre fonctionnel.
Le procédé de régénération selon l'invention est notamment approprié pour les maladies caractérisées par un déficit ou une défaillance cellulaire
(diabète, infarctus du myocarde, hépatite, insuffisance rénale, baisse de la fonction rétinienne, ou encore maladies génétiques responsable d'une déficience immunologique) ainsi que pour les cancers survenant après un certain âge, tel que celui de la prostate, des seins et du colon. Cette régénération cellulaire est applicable à de nombreux types cellulaires et peut donc créer des tissus de régénération contrôlée permettant de soigner de nombreuses lésions organiques et tissulaires. Ainsi, par exemple, en prélevant, sous contrôle échographique, par une aiguille transrectale ou transdermique, ou par une sonde endoscopique, des cellules prostatiques qui seront totalement ou partiellement traitées et en les réimplantant par exemple dans la prostate, ce rajeunissement cellulaire inducteur à distance, notamment par des protéines de signalisations, pourra, dans certains cas, s'opposer au développement d'un cancer local, freiner son extension ou même détruire toutes ses métastases. Ainsi également, une rétine ophtalmique autologue, voire homologue, dont une unité cellulaire fonctionnelle, par exemple constituée de quelques cellules de l'épithélium pigmenté, de cônes, de bâtonnets, de cellules bi-polaires et/ ou de cellules de Muller, qui a été prélevée et régénérée, pourra avoir un grand intérêt en cas de DMLA. L'insuffisance rénale grave pourra être combattue par l'implantation de cellules partiellement dédifférenciées obtenues, par exemple après transfert dans puis hors d'ovocytes, de noyaux de différentes cellules de néphron. L'arthrose peut être traitée par l'implantation de chondrocytes provenant d'une régénération cellulaire. Il en va de même pour des surfaces cutanées et les follicules pileux, et notamment pour régénérer et/ ou colorer une chevelure blanchie, par exemple en transférant dans un ou plusieurs ovocyte(s) de préférence un ou des noyaux ou parties de noyaux de cellules de follicule pileux, de mélanocytes et de kératinocytes, pour une régénération de la chevelure et/ou de sa couleur. Encore une autre application de l'invention peut consister à renforcer ou recréer les fonctions thymiques par rajeunissement génétique de cellules thymiques homologues ou si possible autologues suffisamment dédifférenciées pour réanimer activement les fonctions immuno-protectrices du corps.
Diverses applications du système et du procédé selon l'invention vont maintenant être décrites de façon plus détaillée. L'ensemble des étapes nécessaires à la régénération cellulaire ne sera par la suite pas répété, le principe d'ensemble restant le même et pouvant être adapté à chaque cas par l'homme du métier. Il est rappelé aussi que les deux aspects de l'invention, à savoir d'une part le transfert provisoire d'un noyau de cellule différenciée dans un MRG (notamment une CRG), et d'autre part le transfert de MRG dans une cellule différenciée, sont utilisables.
Ainsi, on sait que le vieillissement entraîne une insuffisance rénale avec anémie progressive, ces deux facteurs apportant une grande fatigue chronique chez ces personnes. Il convient ici de favoriser la régénération rénale, notamment en reconstituant quelques néphrons ainsi que des cellules productrices d'érythropoïétine.
On peut régénérer un rein in vitro à partir des différentes cellules de néphrons (CNE) obtenues par exemple par biopsie rénale chirurgicale ou endoscopique sous contrôle visuel. Les CNE seront traitées par le traitement de l'invention afin par exemple de réduire leur âge biologique de trois quart, et les CNE ainsi obtenues seront amplifiées. Simultanément, on a prélevé un bloc de néphrons (BNE) entier comportant notamment les vascularisations, les glomérules avec leurs capsules, les petits tubes urinifères et les petits canaux collecteurs urinaires. Le BNE sera maintenu en survie par raccord de ses artères et veines principales à une circulation artificielle oxygénée de plasma sanguin ou de sang total compatible. L'observation visuelle de ce BNE en fonction permet de détecter les différents segments cellulaires malades que l'on va prélever et substituer, par microchirurgie in vitro par des segments de cellules identiques rajeunies et géométriquement reconstituées. Après vérification de la bonne intégration histologique et fonctionnelle des nouveaux segments cellulaires sur le BNE, on réimplantera cette partie du rein (qui peut même être un rein entier) dans le patient avec reprise des raccords vasculaires et urinaires. Une application biomédicale particulièrement avantageuse pour ce procédé de régénération de cellules concerne de manière générale les maladies dégénératives des articulations (arthrose). Les chondrocytes des cartilages, qui souvent dégénèrent avec l'âge, peuvent être prélevés par biopsie, endoscopie, intervention chirurgicale locale ou arthroscopie et séparés de leur cartilage environnant. Leur noyau peut être alors soumis au procédé de régénération selon l'invention. Après multiplication, la réimplantation des cellules régénérées dans l'articulation d'origine doit se faire de préférence à proximité, mais en dehors des surfaces de la cavité articulaire mobile qui supporte les charges mécaniques afin d'éviter toute anfractuosité au niveau de ses surfaces mobiles. Parfois, un défaut d'alimentation sanguine indirecte des chondrocytes, qui se fait majoritairement par imbibition, doit être corrigé. On peut alors envisager la greffe autour ou pénétrant dans le cartilage périphérique par rapport à la cavité articulaire, d'un tissu fonctionnel vasculaire autologue comprenant petites artères - artérioles - capillaires - veinules - et petites veines, ces unités fonctionnelles vasculaires peuvent avantageusement provenir d'une culture cellulaire autologue post-procédé de régénération selon l'invention. Cette implantation de cellules rajeunies peut se faire sous forme de couches de lamelles préformées en trois dimensions selon la géométrie locale de la cavité articulaire préalablement mesurée, ou sous forme d'un essaimage afin de provoquer l'émission durable notamment de protéines de signalisation. Les chondrocytes post- procédé de régénération vont progressivement reconstituer un cartilage plus épais, lisse et bien lubrifié. L'ostéoporose est une maladie dégénérative du tissu osseux survenant avec l'âge. Pour lutter contre cette maladie, il convient de procéder à la régénération d'ostéoblastes (et éventuellement d'ostéocytes) autologues et de les réimplanter, de préférence, à plusieurs niveaux de l'os. Les ostéoblastes sont de préférence multipliés en culture avec des sollicitations géométriques artificielles, en particulier en imposant des contraintes mécaniques, par exemple à l'aide d'un cadre support. Ce cadre support peut comporter au moins un côté mobile pour des mouvements dans un plan. Avantageusement, on utilise deux côtés mobiles dans le cadre de support de culture et/ ou la possibilité de réaliser des rotations motrices tridimensionnelles. Au niveau du col du fémur, par exemple, on peut effectuer aisément, sous anesthésie locale, des biopsies espacées en introduisant un trocart à travers le massif trochantérien du fémur qui se trouve proche de la peau. Le traitement des ostéoblastes et ostéocytes locaux ainsi recueillis suite au procédé de régénération de cellules et la réimplantation de ces cellules rajeunies, par exemple, par la même voie transtrochantérienne, pourra permettre la création locale d'un remodelage osseux qui réalise ainsi alors un renforcement fondamental des travées osseuses de sustentation dans la direction des contraintes mécaniques du col et de la tête fémorale vers le haut ainsi que vers le bas en direction du corps du fémur. Au niveau des vertèbres, principales victimes de l'ostéoporose par fractures et aplatissements, un procédé équivalent de régénération des cellules à celui du fémur peut être mis en œuvre, éventuellement en association avec des fixateurs et articulations artificielles développés par l'inventeur dans les brevets US-6,835,207 et US-6,692,495. En effet, la cause principale ou aggravante de l'ostéoporose est le vieillissement, et le traitement de l'invention est, ici aussi, une solution préférentielle. Au niveau de la colonne vertébrale, les tassements ou fractures rendent la marche et les mouvements des membres inférieurs difficiles. Dans ce cas, il convient de prélever, par exemple par ponction transcutanée postérieure, notamment quelques ostéoblastes et ostéocytes au niveau des principales vertèbres atteintes, de les soumettre à un traitement selon l'invention et de les réimplanter, de préférence dans la vertèbre d'origine, dans le lieu le plus proche possible de la provenance de la cellule à traiter, de préférence avec amplification préalable in vitro. Au niveau des os longs on peut procéder de manière équivalente.
La présente invention peut également être appliquée à des sujets ayant subi des inflammations graves, notamment par affaiblissements réactionnels des différents lymphocytes producteurs d'anticorps et de cytokines pro et anti-inflammatoires. Le procédé de régénération selon l'invention peut alors permettre de raviver ces lymphocytes en nombre et en fonction. Pour se faire, ces lymphocytes peuvent être soumis au procédé selon l'invention en plaçant un noyau lymphocytaire dans un ovocyte en présence ou non de traces d'antigènes crées par l'infection en cause dans le cytoplasme ovocytaire. En présence de traces d'antigènes crées par l'infection placés dans le cytoplasme ovocytaire, les lymphocytes seront rajeunis et multipliés et ensuite réimplantés dans l'organisme où ils auront déjà « mémorisé » les antigènes dangereux et produire ou faire produire ensuite les anticorps correspondant en quantité importante. Dans le cas où des antigènes sont placés dans le cytoplasme de la CRG, la présence d'antigènes spécifiques lors du procédé de régénération cellulaire peut permettre de « mémoriser » ou extérioriser les antigènes sur les membranes cellulaires et d'optimiser la réaction de production des anticorps par leur apparition immédiate au fur et à mesure de la réapparition des fonctions lymphocytaires rajeunies.
La présente invention s'applique aussi à la lutte anticancéreuse. Afin de perfectionner les traitements traditionnels anticancéreux qui ne tiennent pas compte des réactions biologiques individuelles, le traitement de l'invention permet de créer une méthode de personnalisation de la lutte anticancéreuse. On peut procéder de la manière suivante : on prélève notamment des cellules hématopoïétiques, lymphocytaires, dendritiques au niveau de la moelle osseuse ou de la périphérie, on en isole différentes catégories que l'on soumet au traitement de l'invention. Après amplification de ces cellules in vitro on cultive celles-ci dans un bain nutritif au voisinage de cellules cancéreuses prélevées au niveau de la tumeur du patient. Il peut alors être utile de limiter les nutriments et l'oxygène du bain de culture afin de stimuler une lutte de compétition et de survie entre les deux catégories de cellules. Les lymphocytes génétiquement rajeunis du patient vont développer par voie naturelle des anticorps spécifiques contre les antigènes des cellules cancéreuses et contre certaines substances et facteurs biologiques nécessaires aux métabolismes et sécrétions des cellules cancéreuses. Il s'agit par exemple des ARN anti-sens ou guides, souvent petits, préalablement transfectés dans l'ADN, notamment lymphocytaire, par des plasmides porteurs des gènes sélectionnés ou construits à cet effet. Si les lymphocytes réussissent à détruire les cellules cancéreuses on peut réinjecter ceux-ci, de préférence après leur multiplication, dans l'organisme du patient dont ils proviennent. Si au contraire, les cellules lymphocytaires échouent dans la destruction des cellules cancéreuses, il faut renforcer les premières, notamment par l'injection de plasmides et/ ou de cosmides et/ ou de vecteurs synthétiques sélectionnés. Ceux-ci permettent par exemple d'apporter des ADN polymérases ou segments d'ADN comportant des gènes synthétiques ou naturels produisant de nouveaux anticorps ou substances toxiques spécifiques contre les cellules à combattre. On apporte ainsi une capacité plus grande à produire des anticorps et/ ou de stimuler les métabolismes et les mitoses lymphocytaires, soit par la sélection de cellules de préférence très immunogènes, telles que des lymphocytes T dits « effecteurs de mémoire à potentiel anti-tumoral renforcé », soit par exemple en renforçant le traitement de rajeunissement génétique des lymphocytes en utilisant le traitement de l'invention.
Les cellules cancéreuses étant autologues, l'examen génotypique et épigénotypique différentiel permet de connaître la petite partie du génome des cellules cancéreuses qui diffèrent des cellules normales autologues du même tissu (PGD). L'identification du PGD par rapport aux PGD connus d'autres cellules cancéreuses, de préférence de même tissu d'autres personnes, permet une classification à but thérapeutique. Cependant à égalité de PGD les gènes concernés peuvent produire des ARNm différents notamment par editing (édition) ou épissages différentiels. Il faut donc connaître les comportements biologiques et biochimiques du PGD spécifique cancéreux de chaque patient qui peut même, en partie, varier en réaction à une thérapie, par exemple biologique, du type de la présente invention. On peut alors in vitro essayer de trouver des virus ou bactéries connus anodins tels que certains bactériophages et colibacilles sélectionnés et/ ou génétiquement manipulés.
Si on introduit dans un ovocyte énuclée un cytoplasme étranger homologue adulte (CEH), une reprogrammation génétique au niveau des ADN mitochondriaux et des ARN ribosomiques du CEH est possible. On peut utiliser cette possibilité pour protéger un noyau adulte placé dans un ovocyte actif contre des transfections ultérieures par le cytoplasme ovocytaire telles qu'elles se produisent au cours des clonages classiques. Le clonage partiel retire le noyau à traiter (NT) de l'ovocyte avant sa première division cellulaire et replace ce noyau reprogrammé dans une cellule de préférence énuclée identique à sa cellule d'origine. Ainsi, le cytoplasme ovocytaire est éloigné du noyau NT au moment de la division de ce dernier, et cette division a lieu à l'intérieur d'un cytoplasme d'origine (CO) du noyau NT. Il convient de reprogrammer génétiquement le CO et d'en augmenter la quantité. A cette fin, on peut prendre un deuxième ovocyte identique au premier et aspirer une partie de son cytoplasme et remplacer celui-ci par un cytoplasme d'une cellule identique à celle du noyau NT (CCINT). Après un délai voulu, on retire le CCINT de cet ovocyte et on en entoure le noyau NT, qui a gardé un peu de son cytoplasme d'origine CO, avec le, ou au besoin plusieurs, CCINT reprogrammés et récupérés, avant d'introduire le noyau NT, ainsi ré-empaqueté dans une cellule d'origine du noyau NT, de préférence énuclée et vidée d'une partie de son cytoplasme. Au besoin, on peut agrandir cette cellule selon une des manipulations membranaires précédemment décrites.
La présente invention peut avantageusement aussi être appliquée aux ulcères. Les ulcères chroniques, notamment au niveau des jambes, mettent souvent très longtemps avant de cicatriser, et cette cicatrisation laisse bien souvent une séquelle cutanée et sous-cutanée importante. D'autres ulcères ne cicatrisent même jamais. Dans ce cas, il convient de traiter par le procédé de régénération selon l'invention au moins une unité fonctionnelle épidermo- dermique du patient prélevée de préférence au niveau de la peau saine proche de l'ulcère et, après multiplication, de l'implanter au niveau de l'ulcère. L'implantation peut se faire directement au niveau de l'ulcère lorsqu'une irrigation sanguine locale suffisante existe sans infection grave, ou dans la négative, être réalisée autour de l'ulcère en région cutanée saine. Afin de réaliser par exemple une telle unité fonctionnelle épidermo- dermique en reprogrammation simultanée, la (ou les) CRG destiné à accueillir cette unité peut être assez volumineux et donc peut être par exemple agrandie artificiellement via la méthode précédemment décrite. Au niveau épidermique, la cellule peut par exemple être choisie parmi une cellule de kératinocyte, de Langerhans, de Merkel et/ ou de mélanocyte, prise seule ou en combinaison tandis qu'au niveau dermique, des fibroblastes cutanés peuvent être prélevés. Les cellules de l'épiderme et du derme peuvent être placées dans des ovocytes distincts. Les cellules épidermo- dermiques recueillies après régénération devront dans la mesure du possible être positionnées et fixées dans le bain de culture dans une conformation réciproque proche de celle naturellement observée, de façon à favoriser une croissance cellulaire fonctionnelle et à simplifier l'implantation de la couche tissulaire régénérée sur la peau réceptrice. Lors de la culture des cellules régénérées, il peut être possible de réarranger la position respective des différentes catégories de cellules, voire même de cultiver plusieurs variantes d'assemblage destinées à des greffes à des emplacements distincts ou ayant une morphologie ou fonction différente.
Il est aussi connu qu'avec l'âge, les défauts de recopiage de l'ADN deviennent plus importants et que les mécanismes naturels de réparation de ces défauts deviennent moins efficaces. Afin de parer à cette insuffisance, un dispositif de l'invention peut prévoir de prélever localement de l'épiderme et/ ou du derme lésé, de le traiter par la régénération selon l'invention, et ensuite de fabriquer à partir de ce tissu régénéré génétiquement un extrait de ces cellules, qui pourra être fixé par exemple dans une crème, solution ou similaire pour une application externe cutanée. Cet extrait pourra aussi être utilisé pour créer une solution injectable en sous-cutané, intradermique ou intra épidermique. Il devient ainsi possible de rétablir rapidement et temporairement les fonctions de réparation de l'ADN épidermique et/ ou dermique. Par ailleurs, dans une application épidermique, l'invention permet de lutter génétiquement contre la sénescence de la peau, en modifiant les collagènes, notamment en les rajeunissant, pour redonner de l'élasticité à la peau.
La régénération de zones tissulaires nécrosées, fibrosées ou inactives constitue également une application de la présente invention. De telles zones tissulaires lésées apparaissent par exemple, au niveau d'un myocarde, notamment suite à un infarctus ou à une insuffisance cardiaque, ou par exemple au niveau d'un organe ayant développé une tumeur visée par un traitement anti-cancéreux destructeur. Dans une application myocardique, il peut être nécessaire de contrôler les phases réfractaires électriques et mécaniques des cellules se contractant de manière synchrone afin d'éviter, lors de leur implantation dans le cœur receveur, des troubles du rythme cardiaque. L'invention s'applique aussi aux valves cardiaques. Celles-ci peuvent être biologiques, avec une durée de vie limitée (environ 15 ans). Elles peuvent aussi être artificielles, avec une durée de vie plus importante
(environ 30 ans), mais dans ce cas le sujet est soumis à une thérapie d'anticoagulant à vie, très contraignante. L'invention permet de créer une valve cardiaque à substrat biologique, artificiel, mixte, ou réparé par plastie, et de revêtir la surface de ce substrat qui est en contact avec le sang d'au moins une couche cellulaire autologue régénérée. Ce revêtement peut être réalisé à partir d'un traitement de cellules autologues endothéliales cardiovasculaires prélevées antérieurement par cathétérisme cardiaque ou vasculaire, traitées selon la présente invention, puis implantées sur la valve. Dans le cas d'une plastie, cette implantation peut se faire en peropératoire, c'est-à-dire pendant l'opération, en recouvrant au moins une partie de la valve et de l'anneau valvulaire. De cette manière, la thérapie d'anticoagulant pourra devenir inutile. La présente invention permet aussi de réaliser une autogreffe cardiaque en remplacement des greffes homologues et des cœurs artificiels mécaniques à alimentation transcutanée pneumatique ou électrique. L'inventeur a été le premier dans les années cinquante à implanter un cœur totalement artificiel dans un chien, lui permettant de survivre une courte durée alors que son cœur naturel était dans un bocal (R. Monod, F. Zacouto, E. Coraboeuf et R. Saumont ; « Circulation extracorporelle permettant l'exclusion temporaire du cœur et son remplacement par un dispositif mécanique intrathoracique » ; Compt. Rend. Soc. Biol., 150, n°l, 48 (1956)).
Dans le cas d'une telle autogreffe, on peut avantageusement utiliser l'échocardiographie 3D pour reconstituer avec précisions les géométries du cœur afin de s'adapter au mieux au volume thoracique spécifique à chaque patient (N. Mirochnik, A. Hagège, F. Zacouto et C. Guérot ; « Reproduction physique des structures cardiaques. Une nouvelle voie d'exploration en cardiologie. » ; Archives des Maladies du Cœur et des Vaisseaux, Tome 93, n°10, octobre 2000, p. 1203-1209). La présente invention peut également aider à la détermination du mécanisme responsable d'un trouble de l'état de santé d'un mammifère. En effet, la cause première d'une atteinte de l'équilibre vital est parfois difficile à trouver. Il est alors possible d'effectuer une régénération cellulaire d'au moins une cellule des tissus suspects et si les tissus reprogrammés résultants diffèrent du tissu normal dans sa composition intracellulaire ou dans ses sécrétions de protéines et de peptides d'une manière critique ou spécifique la responsabilité causale intrinsèque de ce tissu est démontrable. A titre d'exemple on peut citer chez certains diabétiques dont la pathologie a un âge avancé qu'une régénération cellulaire d'une cellule pancréatique de
Langerhans, prélevée par exemple par endoscope, va montrer une sécrétion provoquée d'insuline ou de glucagon normale contrairement aux cellules équivalentes non soumises à la régénération cellulaire. L'origine des états pathologiques apparaissant après un certain âge est susceptible d'être révélée par la comparaison fonctionnelle du tissu suspect existant ou présent par rapport à son ancêtre tissulaire maintenant génétiquement rajeuni à un âge biologique déterminé.
La présente invention est également utile pour des maladies se caractérisant par un déficit cellulaire. En particulier, la présente invention peut permettre une régénération et multiplication de cellules β et α d'îlots de
Langerhans qui peuvent être réimplantées dans le pancréas ou ailleurs de manière à rétablir la sécrétion d'insuline ou de glucagon au niveau d'un organisme. Dans certains cas de destruction du tissu hépatique (tel que cancers, intoxications ou cirrhose), l'implantation d'hépatocytes régénérés peut assurer une guérison des troubles hépatiques.
Encore une autre application de la présente invention est, par exemple, le maintien d'un implant dans un os à l'aide d'une enveloppe ou charpente simple ou de soutien de cellules régénérées. Cette application comprend de régénérer des cellules osseuses, en particulier des ostéoblastes, de préférence prélevées à un stade précoce de leur mitose spontanée ou provoquée dans une CRG puis de placer ces ostéoblastes régénérés avant la fin de leur mitose dans une cellule réceptrice de préférence d'ostéoblaste, de cultiver les ostéoblastes dans un milieu de culture adéquat afin d'en obtenir un nombre et un comportement mécanique appropriés puis de répartir les ostéoblastes sous forme de manchon, de socle, de charpente, ou d'enveloppe entre un implant osseux artificiel et l'os. La couche d' ostéoblastes génétiquement rajeunie assure alors une bonne solidarisation de l'implant osseux et de l'os par la poussée ostéoblastique, et renforce ainsi le maintien de l'implant dans l'os et renforce la structure osseuse elle-même. De plus, l'utilisation de telles cellules régénérées assure le maintien à long terme de l'implant dans l'os et peut présenter une efficacité durable, accrue et curative par rapport aux crèmes protéiques à base de différents BMP (Bone Morphogenic Proteins) habituellement mises en œuvre. Une autre utilisation possible de la présente invention est d'assurer une bonne histocompatibilité entre un greffon d'un donneur et le système immunitaire d'un receveur. Pour ce faire, une cellule saine de l'organe à greffer du receveur peut être prélevée et régénérée selon le processus décrit puis être transférée dans une cellule réceptrice adéquate de manière à entraîner la prolifération de ces cellules. Ces cellules peuvent alors ensuite être placées autour du greffon du donneur de manière à ce que le système immunitaire du receveur reconnaisse les molécules critiques portées à la surface du greffon comme molécules du soi et n'engendre ainsi pas de forte réaction immunitaire en présence du greffon. La création d'histocompatibilité peut notamment être réalisée des manières suivantes :
1) Echange de chromosomes ou de segments de chromosomes par micromanipulation génétique durant une phase choisie de la mitose, ce qui est à ce jour difficile à réaliser car leur micromanipulation n'est pas encore suffisamment précise ; la nanomécanique permet actuellement de réaliser des instruments à l'échelle chromosomique pour réaliser par exemple des ponctions, des greffes, des aspirations, des transferts, des coupes et des rotations ; un progrès à ce niveau est attendu et envisageable dans un futur proche. 2) Destruction sélective d'un segment de chromosome porteur des gènes responsables de l'incompatibilité tissulaire, par exemple durant une phase de mitose, par exemple à l'aide d'un micro rayon laser de diamètre égal ou inférieur à 1 micron, entouré d'un cylindre de rayons plus larges de lumière visible permettant de guider le rayon laser par simple contrôle optique microscopique, qui peut être avantageusement robotisé.
La présente invention présente également un intérêt tout particulier dans le domaine de la stomatologie dentaire. L'absence dentaire doit souvent être compensée par des implants métalliques céramiques, plastiques etc. Ces implants exigent une base de soutien osseux maxillaire suffisante afin d'assurer la fixation solide de l'implant. En cas d'insuffisance du volume ou de la qualité de la région sollicitée du maxillaire il est avantageux de prélever, par exemple par voie buccale, quelques cellules de ce lieu de l'os, de les soumettre à une régénération cellulaire et à une multiplication adéquate afin de disposer d'une petite greffe osseuse locale qui non seulement va fournir un socle osseux solide mais qui pourra par exemple, par la voie des protéines de signalisations, des cytokines locales et des molécules de régulation de l'activité cellulaire et celles des expressions génétiques, renforcer progressivement l'ensemble de l'arcade maxillaire. Avantageusement, on combine à cette régénération osseuse de l'os maxillaire, qui peut se faire par injections locales de cellules régénérées dans, en contact, ou près de l'os, un revêtement de l'implant avec au moins une couche de cellules osseuses et/ ou desmodontales régénérées, qui vont améliorer la fixation, la tenue viscoélastique et la solidité correspondante de l'implant dans l'os, ainsi que la solidité de l'os lui-même.
Un autre exemple d'application du procédé de régénération cellulaire selon l'invention concerne les fractures et la chirurgie osseuse. Certaines fractures et malformations osseuses exigent une intervention chirurgicale nécessitant parfois de disposer d'une masse osseuse supplémentaire greffable et solide. Ceci peut être obtenu par rajeunissement génétique des cellules locales avec multiplication chaque fois que la chirurgie définitive peut être retardée d'au moins deux semaines. Cela est notamment le cas des interventions pour des pseudarthroses, déformations osseuses vertébrales des enfants ou dégénératives, arthrites ou arthroses déformantes. La multiplication cellulaire in vitro des cellules d'ostéoblastes est à réaliser de préférence en tenant compte, dès leur culture, des contraintes mécaniques qu'elles doivent supporter, par exemple après leur implantation dans le fémur, le maxillaire, les vertèbres, etc. En pratique, il s'agit d'organiser cette culture cellulaire si possible physiologiquement confluente et dans un bain nourricier adapté, mais à l'intérieur d'un cadre support dont au moins un côté est mobile dans un plan, ou dans deux plans simultanément, ce qui rend une rotation motrice possible. Les mouvements et forces mécaniques périodiquement imposés au tissu en croissance dans sa solution nourricière adaptée seront d'une amplitude, soudaineté et force progressivement croissante, mais toujours dans une orientation principale similaire afin de provoquer des structures minérales et trabiculaires dans la bonne direction. Les lignes de forces et de résistances mécaniques de ces structures, dans une ou plusieurs directions, correspondent aux forces, amortissements et viscoélasticités que le tissu osseux régénéré devra supporter après son implantation. L'inventeur a développé un fixateur vertébral ajustable original (US-6,835,207) et un disque vertébral ajustable original (US-6,692,495) qui, tous les deux peuvent avantageusement être combinés avec du tissu vertébral résultant d'une telle régénération cellulaire, et par exemple servir de socle pour les vis pédiculaires de fixation ou servir au remplissage de vertèbres tassées ou fracturées, ou servir de charpente de soutien.
Une autre application de l'invention concerne les greffes non autologues. En effet, un problème majeur concerne le rejet des greffes par le receveur. Or, on sait que les cellules foetales ou proches embryonnaires sont moins rejetées. Des cellules suffisamment rajeunies, par exemple par plusieurs traitements successifs selon l'invention, permettraient d'atténuer le problème des rejets des greffes non autologues. II est à noter que la modification de l'âge biologique d'une cellule
(rajeunissement ou vieillissement) peut être mesurée par différents procédés. Ainsi, les temps ou vitesses que met une cellule pour récupérer son potentiel de membrane et son potentiel d'action après avoir été soumise à une contrainte (telle qu'un manque d'oxygène ou un excès de potassium) peuvent être comparés avant et après traitement. Si le temps de récupération est plus court, alors la cellule est fonctionnellement rajeunie. D'autres procédés consistent à comparer, avant et après traitement, les vitesses de répétition des mitoses ou des mitoses elles-mêmes, les vitesses de cicatrisation, ou les modifications des dimensions (volume) des télomères. II est aussi à remarquer que le procédé selon un aspect de l'invention, désigné par l'appellation « clonage partiel », se distingue du clonage classique. En effet, dans le clonage classique, le noyau d'une cellule est transféré dans un ovocyte, va se diviser et devient capable de reproduire in utero ou artificiellement in vitro le tissu d'origine dudit noyau. Or, ceci signifie que le noyau est en contact avec un cytoplasme contenant des mitochondries et des ribosomes susceptibles d'influencer la fonction et/ ou l'évolution du noyau, notamment par l'intermédiaire des ADN et/ ou des ARN étrangers, car ovocytaires, qu'ils contiennent. Ceci signifie qu'à moins que l'ovocyte soit issu de la mère de la cellule d'origine rapidement après l'accouchement, le clonage classique ne produit pas des cellules et tissus purement autologues. D'ailleurs, même si l'ovocyte provient de la mère, il est possible que celui-ci présente des caractéristiques différentes en raison notamment de l'influence de l'environnement, de thérapies, de maladies, de l'âge, etc. Pour obtenir un tissu purement autologue, il faudrait donc utiliser un ovocyte de la mère obtenu au moment de la naissance d'origine, ce qui est rarement réalisable.
Au contraire, dans le clonage partiel qui consiste à introduire provisoirement et pendant une courte durée un noyau dans un ovocyte, puis de le retransférer dans une cellule réceptrice autologue et de préférence identique à sa cellule de provenance, le tissu obtenu est purement autologue, quel que soit l'ovocyte (ou cellule CRG ou MRG équivalent) utilisé. Ceci peut permettre d'utiliser un ovocyte d'un mammifère pas forcément identique tout en garantissant une pureté génétique maximale. On peut aussi utiliser les procédés selon l'invention pour obtenir des cellules embryonnaires à partir d'un noyau adulte. Pour cela, on entoure le noyau préalablement reprogrammé de préférence avec du cytoplasme supplémentaire autologue au noyau, comme décrit précédemment. Ensuite on replace le noyau traité ainsi empaqueté dans un ovocyte (ou MRG), au besoin agrandi selon l'invention, et on y laisse se développer les divisions cellulaires embryonnaires. Ainsi, on crée des cellules embryonnaires ou foetales provenant d'un noyau plus jeune et on diminue les différences d'âge biologique entre ce noyau et les cellules embryonnaires ou foetales créées.
Bien que la présente invention ait été décrite en référence à divers aspects de celle-ci, et aux moyens de divers exemples d'application, il est entendu qu'elle n'y est pas limitée, le cadre de l'invention étant donné par les revendications annexées.

Claims

Revendications
1.- Procédé de traitement génétique et épigénétique de cellules à traiter, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- fournir au moins une cellule à traiter,
- fournir un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique, et
- mettre en contact au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter avec ledit MRG pour modifier l'âge biologique et/ ou réparer ladite au moins une cellule à traiter.
2.- Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre les étapes de :
- séparer dudit MRG au moins ladite partie d'au moins un noyau de la cellule à traiter, - introduire au moins ladite partie d'au moins un noyau de la cellule à traiter ainsi séparée dans une cellule réceptrice, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue par rapport au noyau de la cellule à traiter, avantageusement voisine ou identique à la cellule à traiter, ladite cellule réceptrice pouvant alors se multiplier.
3.- Procédé selon la revendication 2, dans lequel ladite multiplication de cellules autologues forme un tissu purement autologue par rapport à l'organisme et/ ou au tissu dont est issu ledit noyau de la cellule à traiter, sans interférence d'ADN et/ ou d'ARN étrangers, notamment mitochondriaux et/ ou ribosomiques provenant dudit MRG.
4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel ladite étape de mettre en contact au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter avec ledit MRG comprend de prélever et transférer au moins ladite partie dudit au moins un noyau à partir de ladite au moins une cellule à traiter dans ledit MRG.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel ladite étape de séparer dudit MRG au moins le noyau de la cellule à traiter est réalisée avant la fin de la première mitose dudit noyau.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel ladite étape de séparer dudit MRG au moins le noyau de la cellule à traiter est réalisée après une ou plusieurs mitoses dudit noyau.
7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel ladite au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter comprend au moins un chromosome.
8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel l'âge biologique de ladite au moins une cellule à traiter est modifié.
9.- Procédé selon la revendication 8, dans lequel ladite au moins une cellule à traiter est rajeunie.
10.- Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite au moins une cellule à traiter est rajeunie plusieurs fois de manière successive, de sorte que son âge biologique est ramené à un âge très jeune, notamment fœtal ou proche embryonnaire.
11.- Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel après rajeunissement de l'âge biologique d'une cellule, le noyau rajeuni est enlevé et remplacé par un noyau du tissu d'origine non rajeuni, de sorte que ledit noyau non rajeuni est en contact d'un cytoplasme rajeuni, l'interaction entre eux provoquant un rajeunissement dudit noyau non rajeuni.
12.- Procédé selon la revendication 8, dans lequel ladite au moins une cellule à traiter est vieillie.
13.- Procédé selon la revendication 12, dans lequel on supprime au moins une partie d'un noyau d'une cellule jeune, notamment foetale ou embryonnaire, malade, tel qu'un chromosome, et on la remplace par au moins une partie équivalente d'un noyau sain plus âgé du même tissu, de préférence HLA compatible, l'interaction entre le cytoplasme jeune avec au moins la partie du noyau plus âgé favorisant une accélération temporaire du vieillissement au moins du cytoplasme de la cellule jeune.
14.- Procédé selon la revendication 13, dans lequel le vieillissement est réalisé par multiplication de cellules dans une culture cellulaire.
15.- Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel, lors du déploiement de chromosomes de préférence en métaphase, au moins une partie d'un chromosome malade est détruite, au moins une partie équivalente d'un chromosome équivalent d'une cellule saine plus âgée, de préférence HLA compatible, étant prélevée et implantée dans le noyau malade.
16.- Procédé selon la revendication 15, dans lequel la destruction d'au moins une partie d'un chromosome malade est réalisée avec un rayon laser ultramince, de préférence de diamètre égal ou inférieur à 1 micron.
17.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 16, dans lequel la modification de l'âge biologique d'une cellule est mesurable par la comparaison avant et après traitement de la vitesse que met une cellule à récupérer son potentiel de membrane et son potentiel d'action après avoir été soumise à une contrainte, telle qu'un manque d'oxygène ou un excès de potassium, et/ ou par comparaison avant et après traitement de la vitesse de répétition des mitoses ou des mitoses elles-mêmes, et/ ou par comparaison avant et après traitement de la vitesse de cicatrisation et/ ou par comparaison avant et après traitement du volume des télomères.
18.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel ladite au moins une cellule à traiter est réparée, notamment dans sa constitution chromosomique.
19.- Procédé selon la revendication 18, dans lequel une partie d'un chromosome à traiter est supprimée, notamment au moyen d'un rayon laser ultramince, puis une partie saine équivalente d'un chromosome équivalent est prélevée, notamment par découpe au laser, et réintroduite dans le chromosome à traiter, notamment au moyen de plasmides, de phagémides, de vecteurs synthétiques, ou de micromanipulations, pour réparer ledit chromosome à traiter.
20.- Procédé selon la revendication 19, dans lequel ladite partie supprimée du chromosome à traiter est la partie dont les gènes sont responsables du rejet des greffes.
21.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 20, dans lequel ledit MRG comprend en outre des substances capables d'activer le métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ou des protéines ou peptides de signalisation ou de stimulation du métabolisme et/ ou des facteurs de croissance et/ ou des cellules ou extraits de cellules cancéreuses.
22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 21, dans lequel au moins une cellule à traiter est soumise à un traitement temporaire par cellules cancéreuses sélectionnées, par voie intracellulaire ou extracellulaire.
23.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 22, comprenant les étapes de :
- transférer provisoirement du cytoplasme d'une cellule identique à la cellule à traiter dans un MRG, - séparer ledit cytoplasme transféré dudit MRG après sa reprogrammation,
- entourer ledit noyau de la cellule à traiter séparée dudit MRG avec ledit cytoplasme reprogrammé avant l'introduction de l'ensemble dans la cellule réceptrice.
24.- Procédé de traitement contre le cancer, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- prélever au moins une cellule hématopoïétique au niveau de la moelle osseuse ou de sa périphérie,
- fournir un milieu de reprogrammation génétique (MRG) comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique,
- mettre en contact au moins une partie d'un noyau d'une cellule hématopoïétique prélevée avec ledit MRG,
- séparer dudit MRG au moins ladite partie d'un noyau d'une cellule hématopoïétique prélevée,
- introduire au moins ladite partie d'un noyau d'une cellule hématopoïétique ainsi séparée dans une cellule hématopoïétique réceptrice, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue par rapport au noyau de la cellule hématopoïétique, avantageusement voisine ou identique, pour génétiquement reprogrammer et/ ou rajeunir ladite cellule hématopoïétique réceptrice,
- multiplier in vitro ladite cellule réceptrice reprogrammée et/ ou rajeunie,
- réinjecter lesdites cellules reprogrammées et/ ou rajeunies pour combattre le cancer.
25.- Procédé selon la revendication 24, dans lequel lesdites cellules hématopoïétiques reprogrammées et/ou rajeunies sont, avant réinjection, mises en contact in vitro avec des cellules cancéreuses prélevées au niveau de la tumeur, notamment pour que lesdites cellules hématopoïétiques reprogrammées et/ou rajeunies développent des anticorps spécifiques contre les antigènes des cellules cancéreuses.
26.- Procédé selon la revendication 25, dans lequel, avant réinjection, lesdites cellules hématopoïétiques reprogrammées et/ou rajeunies sont renforcées, par exemple par injection de plasmides et/ou de cosmides et/ ou des vecteurs synthétiques, tels que des blocs copolymères, sélectionnés pour augmenter la capacité de production d'anticorps et/ ou pour stimuler les métabolismes et/ ou les mitoses desdites cellules hématopoïétiques et/ ou pour renforcer le pouvoir antibiotique ou destructeur contre des bactéries, des champignons ou des virus ciblés, et/ ou par sélection de cellules de préférence immunogènes, telles que des lymphocytes T, et/ ou en renforçant le rajeunissement génétique desdites cellules hématopoïétiques reprogrammées et/ ou rajeunies.
27.- Système de traitement génétique et épigénétique de cellules à traiter, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une cellule à traiter,
- un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ ou du cytoplasme synthétique, et des moyens pour mettre en contact au moins une partie d'au moins un noyau d'au moins une cellule à traiter avec ledit MRG pour modifier l'âge biologique et/ ou réparer ladite au moins une cellule à traiter.
28.- Système selon la revendication 27, dans lequel ledit système est de système de régénération génétique de cellules différenciées, notamment pour leur rajeunissement génétique, ladite au moins une cellule à traiter étant une cellule différenciée, et ledit milieu de reprogrammation génétique (MRG) comprenant au moins du cytoplasme d'au moins une cellule ovocytaire, embryonnaire, foetale ou cancéreuse, et/ ou du cytoplasme synthétique.
29.- Système selon la revendication 27 ou 28, comprenant en outre :
- des moyens pour séparer dudit MRG au moins le noyau de la cellule à traiter avant la fin de sa première mitose,
- des moyens pour introduire le noyau de la cellule à traiter ainsi séparé dans une cellule réceptrice, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue par rapport au noyau de la cellule à traiter, avantageusement voisine ou identique à la cellule à traiter, ladite cellule réceptrice étant alors une cellule génétiquement rajeunie apte à se multiplier.
30.- Système selon la revendication 29, dans lequel lesdits moyens pour mettre en contact au moins le noyau d'une cellule à traiter avec ledit MRG comprennent des moyens pour prélever et transférer au moins ledit noyau à partir de ladite cellule à traiter dans ledit MRG.
31.- Système selon la revendication 30, dans lequel lesdits moyens pour prélever et transférer au moins ledit noyau dans ledit MRG sont adaptés à prélever et transférer ledit noyau de la cellule à traiter ensemble avec au moins une partie de son cytoplasme afin de retrouver dans le MRG quelques composants cytoplasmiques initialement présents dans la cellule différenciée, tels que le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgy, les ribosomes et/ ou les mitochondries.
32.- Système selon la revendication 30 ou 31, dans lequel le noyau de la cellule à traiter à transférer dans le MRG est prélevé à un stade précoce de mitose, tel que la prophase, la pro-métaphase ou la métaphase.
33.- Système selon l'une quelconque des revendications 30 à 32, dans lequel le noyau de la cellule à traiter transféré dans le MRG est séparé du MRG au stade de la métaphase, de l'anaphase ou au cours de la télophase.
34.- Système selon la revendication 27 ou 28, dans lequel lesdits moyens pour mettre en contact au moins le noyau d'une cellule à traiter avec ledit MRG comprennent des moyens pour transférer du MRG dans la cellule à traiter.
35.- Système selon la revendication 34, dans lequel lesdits moyens pour transférer du MRG dans une cellule à traiter comprennent des moyens pour créer au moins une fente ou ouverture dans la membrane de ladite cellule à traiter, et des moyens, tels qu'une pipette, pour transférer du MRG dans ladite cellule à traiter à travers ladite au moins une fente ou ouverture.
36.- Système selon la revendication 34 ou 35, dans lequel lesdits moyens pour transférer du MRG dans une cellule à traiter comprennent des moyens pour séparer au moins partiellement ledit MRG de ladite cellule à traiter.
37.- Système selon la revendication 34, 35 ou 36, comprenant des moyens pour refermer définitivement la cellule à traiter avec au moins une partie du MRG restant inclus en elle.
38.- Système selon la revendication 36 ou 37, dans lequel lesdits moyens pour transférer du MRG dans une cellule à traiter comprennent des moyens pour ouvrir la membrane d'une cellule ovocytaire, embryonnaire ou foetale, des moyens pour ouvrir la membrane d'une cellule à traiter, des moyens pour mettre lesdites ouvertures en contact, des moyens pour comprimer ladite cellule ovocytaire, embryonnaire ou foetale pour transférer au moins partiellement son cytoplasme dans la cellule à traiter.
39.- Système selon la revendication 38, dans lequel lesdits moyens pour transférer du MRG dans une cellule à traiter comprennent en outre des moyens pour renvoyer au moins partiellement ledit cytoplasme transféré dans sa cellule d'origine après un laps de temps prédéterminable, notamment par décompression de ladite cellule ovocytaire, embryonnaire ou fœtale.
40.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 39, dans lequel ledit MRG comprend au moins de l'extrait de cytoplasme d'au moins une cellule ovocytaire, embryonnaire ou fœtale, ledit extrait étant obtenu par traitement du cytoplasme.
41.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 40, dans lequel ledit MRG comprend au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), pouvant être une cellule embryonnaire, ovocytaire ou foetale, dont le noyau a de préférence été extrait.
42.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 41, dans lequel ledit MRG comprend en outre des substances capables d'activer le métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ ou des protéines de signalisation et/ ou des facteurs de croissance et de stimulation.
43.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 42, comprenant des moyens d'injection et/ ou d'implantation, tels que par endoscopie, des cellules traitées, aptes à distribuer lesdites cellules au sein, à proximité ou à distance d'un tissu à traiter.
44.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 43, dans lequel le système est adapté au traitement de cellules à traiter telles que des cellules cardiaques, rénales, osseuses, dentaires, desmodontales, cartilagineuses, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, pulmonaires, artérielles, rétiniennes, cutanées, dermiques, épidermiques, glandulaires, tendineuses, vasculaires, spléniques, parathyroïdiennes, surrénaliennes et/ou des tuyaux digestifs et respiratoires.
45.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 44, dans lequel une pluralité de cellules représentant une unité fonctionnelle organique sont traitées ensemble et/ ou ré-assemblées après traitement génétique isolé pour former une unité fonctionnelle organique génétiquement traitée, notamment rajeunie.
46.- Système de régénération génétique de cellules différenciées, selon la revendication 28, comprenant :
- au moins une cellule différenciée,
- des moyens de reprogrammation cellulaire, comprenant au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), formée notamment d'un ovocyte ou d'une cellule embryonnaire,
- des moyens pour supprimer, de préférence complètement, le noyau de la au moins une CRG,
- des moyens pour prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans une CRG respective,
- des moyens pour extraire de la CRG, le noyau transféré de la cellule différenciée avant la fin de sa première mitose,
- des moyens pour introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule réceptrice différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue par rapport au noyau de la cellule différenciée, avantageusement voisine ou identique à la cellule différenciée, ladite cellule réceptrice étant alors une cellule régénérée apte à se multiplier, le tissu résultant étant destiné à réparer et/ ou remplacer et/ ou à être positionné dans un tissu à régénérer.
47.- Système selon la revendication 46, comprenant en outre :
- des moyens pour prélever au moins un chromosome déterminé sur le noyau d'origine de la CRG extrait de ladite CRG,
- des moyens pour implanter ce ou ces chromosome(s) dans le noyau de la cellule différenciée transféré dans et/ ou extrait de ladite
CRG.
48.- Système selon la revendication 47, comprenant en outre des moyens pour supprimer du noyau de la cellule différenciée transféré dans ladite CRG, le ou les chromosomes correspondants au(x) chromosomes prélevé(s) sur le noyau d'origine de la CRG.
49.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 48, comportant des moyens de multiplication cellulaire in vitro des cellules traitées, comprenant un cadre support recevant un bain nourricier contenant lesdites cellules traitées en culture, ledit cadre support étant soumis à des mouvements et/ ou forces mécaniques pendant ladite multiplication.
50.- Système selon la revendication 49, dans lequel ledit cadre support comporte au moins un côté mobile dans un plan, de préférence au moins deux côtés mobiles dans deux plans différents et notamment apte à réaliser une rotation motrice tridimensionnelle.
51.- Système selon l'une quelconque des revendications 27 à 50, comprenant des moyens de support mécaniques et/ ou biologiques de croissance in vitro des cellules traitées, tel qu'un implant ayant une surface non lisse agrandie adaptée à cet effet, lesdits moyens de support étant aptes à être positionnés dans le tissu à traiter, lesdites cellules traitées formant alors un ciment cellulaire entre ledit tissu à traiter et lesdits moyens de support.
52.- Système selon la revendication 51, dans lequel lesdits moyens de support de croissance des cellules traitées comportent un implant osseux artificiel ou biologique.
53.- Procédé de traitement génétique et épigénétique, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un cellule différenciée pour la fabrication d'au moins une cellule différenciée régénérée apte à être réimplantée pour traiter diverses pathologies, maladies, et/ ou insuffisances tissulaires, comprenant les étapes suivantes : - fournir au moins une cellule de reprogrammation génétique
(CRG), formée d'un ovocyte ou d'une cellule embryonnaire,
- fournir au moins une cellule différenciée,
- supprimer, de préférence complètement, le noyau de la CRG,
- prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans la CRG,
- extraire le noyau de la cellule différenciée transférée dans la CRG, avant la fin de sa première mitose,
- introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue par rapport au noyau de la cellule différenciée, avantageusement voisine ou identique à la cellule différenciée, de manière à former une cellule différenciée régénérée,
- multiplier ladite cellule différenciée régénérée.
54.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un chondrocyte pour la fabrication de chondrocytes régénérés aptes à être implantés, de préférence par endoscopie, ponction transcutanée sous contrôle échographique, ou arthroscopie, dans un cartilage osseux ou articulaire préparé à cet effet, en particulier hors de sa surface articulaire, pour traiter une arthrose en régénérant ledit cartilage.
55.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule cardiaque pour la fabrication d'un tissu cardiaque régénéré apte à être implanté dans le tissu myocardique pour régénérer une zone lésée notamment suite à un infarctus du myocarde ou une insuffisance cardiaque.
56.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule saine issue d'un tissu à soumettre à un traitement anticancéreux, pour la fabrication de cellules saines régénérées aptes à être implantées dans le tissu visé par le traitement anti-cancéreux pour régénérer ledit tissu après la fin du traitement anti-cancéreux.
57.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule β et/ ou α de Langerhans pour la fabrication de cellules régénérées aptes à être implantées dans l'organisme, notamment en sous-cutané, et/ ou dans le pancréas, afin de reconstituer un stock de cellules β et/ ou α rajeunies et à fonction endocrine normalisée, et d'accroître la quantité d'insuline et/ou de glucagon produite, pour régénérer la fonction de sécrétion d'insuline et/ ou de glucagon.
58.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une unité épidermo-dermique de tissu autologue rajeuni, notamment pour la fabrication d'unités épidermo-dermique fonctionnelles régénérées aptes à être implantées dans ou près d'un tissu ulcéreux pour le traitement d'un ulcère ou de toute lésion ou anomalie cutanée irréversible.
59.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un ostéoblaste pour la fabrication d'ostéoblastes régénérés aptes à être implantés dans un os victime d'ostéoporose pour régénérer ledit os.
60.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule osseuse pour la fabrication de cellules osseuses régénérées aptes à être implantées dans un os recevant un implant pour favoriser la solidarisation dudit implant dans ledit os, en formant au cours de leur croissance un ciment cellulaire, solidarisant l'os et l'implant.
61.- Procédé selon la revendication 53, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule épidermique et/ ou dermique pour la fabrication d'extrait de cellules épidermiques et/ ou dermiques régénérées pour traiter l'épiderme et/ ou le derme lésé et rétablir ses fonctions de réparation de l'ADN épidermique et/ ou dermique.
62.- Procédé selon la revendication 61, dans laquelle l'extrait de cellules est fixé dans une crème pour une application externe cutanée.
63.- Procédé selon la revendication 61, dans laquelle l'extrait de cellules est réalisé sous la forme d'une solution injectable en sous- cutané, en intradermique ou en intra épidermique.
64.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 53 à 63, dans lequel ladite multiplication cellulaire in vitro des cellules régénérées est réalisée au moyen d'un cadre support recevant un bain nourricier contenant lesdites cellules régénérées en culture, ledit cadre support étant soumis à des mouvements et/ ou forces mécaniques pendant ladite multiplication.
65.- Procédé selon la revendication 64, dans lequel ledit cadre support comporte au moins un côté mobile dans un plan, de préférence au moins deux côtés mobiles dans deux plans différents et notamment apte à réaliser une rotation motrice tridimensionnelle.
66.- Utilisation d'un système et/ ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour revêtir au moins partiellement une valve cardiaque biologique, artificielle ou réparée par plastie d'au moins une couche cellulaire autologue régénérée.
67.- Utilisation d'un système et/ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 65, pour régénérer au moins partiellement la partie d'un os maxillaire et les tissus desmodontaux destinés à recevoir un implant dentaire.
68.- Utilisation d'un système et/ ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 65, pour régénérer au moins partiellement l'épiderme par régénération de fibroblastes, provoquant une modification des collagènes.
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