EP1931992A2 - Vorrichtung zur analyse von flüssigen proben - Google Patents
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- EP1931992A2 EP1931992A2 EP06804339A EP06804339A EP1931992A2 EP 1931992 A2 EP1931992 A2 EP 1931992A2 EP 06804339 A EP06804339 A EP 06804339A EP 06804339 A EP06804339 A EP 06804339A EP 1931992 A2 EP1931992 A2 EP 1931992A2
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Definitions
- the present invention relates to a device for the analysis of liquid samples.
- high-through-put technologies Due to the enormous variety of different biomolecules and their different manifestations (chemical modifications) or variants (DNA sequences), high-through-put technologies (“high-through-put technologies”) are increasingly being used.
- high-through-put technologies In addition to the classical methods of Northern and Southern blotting, in situ hybridization and any type of Western Blot techniques, multi-analyte detection systems have been increasingly developed in the last 15 years. The most important of these systems mostly use microtiter plates (eg as standard carriers for ELISA) with several hundred analyzes per run and on microarrays with more than 100 analysis points per cm 2 .
- microtiter plates eg as standard carriers for ELISA
- microarrays with more than 100 analysis points per cm 2 .
- the binding partners are arranged, for example, in a specific pattern distributed over the carrier ("array"), wherein the carrier itself always has a planar geometry (eg US 5,800,992 and US 5,744,305) .
- the respective analyte detection is based on a molecular binding of sample components Whether certain constituents are present in a sample can thus be recognized from the fact whether such components have entered into a bond with the immobilized binding partners.
- the recognition of such a molecular bond takes place, for example, by means of an optical (eg fluorescence, luminescence, surface plasmon Resonance Spectrosco- py), an electrochemical or the measurement of a mass change of the molecules on the sensor.
- incubation chambers are, inter alia, from the following suppliers: Corning, Genomic Solution, BioRad, Takara Bio, Advalytix, Genetix, Gesim, the incubation chambers are usually reusable and shell-shaped, with a planar support inside the chamber closed with sealing webs) can not be continued without serious consequences.
- the result is an end point measurement, ie the measurement takes place after all incubation steps and provides one measured value per binding partner.
- the situation is comparable to the application of the polymerase chain reaction and the subsequent analysis of the products and the corresponding further development of the real-time polymerase chain reaction.
- This system is similar to the use of spatial supports that are used in a spherical shape as a stationary phase. Furthermore, it is known from WO 03/100401, WO 00/40334 and WO 02/08457 that a carrier in cylindrical form has immobilized binding partners in defined areas (spots) on its surface, and incubation of the sample liquid under immersion in a complementary sample container can perform tempered conditions.
- the sample container is associated with a measuring device that can detect any interactions.
- the devices described have, inter alia, the disadvantage that contaminations can be introduced into the sample container itself, or that it comes in the course of the investigation due to the usually small sample volumes that are used in an investigation, for the evaporation of the introduced into the device liquids. This results in changes in the concentration of the individual sample components, which can affect the measurements.
- Another disadvantage of such devices in particular a device as described in WO 03/100401, is the unstable and not axially centered mounting of the rotor during its rotational movement.
- a further object is to provide a device for analyzing samples which consist of a sample container and a rotor insertable therein, which enables improved storage of the rotor in the sample container.
- This object is achieved by providing a device for analyzing liquid samples, with a rotationally symmetrical rotor insertable into a sample container, wherein an annular gap is provided between the sample container and the rotor, and the rotor has at least one flow channel for conveying liquids and / or gases into and / or from the interior of the sample container, wherein means for centering the rotor are provided on the rotor and optionally on the sample container.
- the device disclosed herein comprises a rotor and a sample container. Between the rotor and the inner wall of the sample container, a radial annular gap is provided which defines the incubation space (the space in which binding partner and ligand can react or interact).
- the rotor has a flow channel through which liquids can be conveyed into the sample container or removed from the sample container.
- the means on the rotor and in the sample container for centered storage of the rotor in the sample container make it possible for the rotor to be stored in the sample container in a stable and centered manner. Thus, it is prevented that during the rotation of the rotor or the sample container, the rotor comes into contact with the sample container.
- the centered bearing means on the rotor and sample container may be positively connected (e.g., bump-in, journal bearing sleeve, etc.).
- At least one elevation is provided on the lateral surface of the rotor or on the inner wall of the sample container.
- the arrangement of at least one elevation on the lateral surface of the rotor or on the inner wall of the sample container causes an improved mixing due to turbulence of the solutions present in the device according to the invention in the course of the rotation of the rotor or the sample container.
- the survey may have various forms, but it is preferred to make the surveys so that a good mixing, without affecting the detection of binding between binding partner and ligand, is possible.
- the rotor according to the invention has means for transmitting a torque to the rotor.
- the sample container In order to set the rotor in rotation by a suitable device, means are provided on the rotor for enabling the transmission of torque to the rotor.
- the sample container according to means which fix this radially. This prevents that during rotation of the rotor due to frictional effects and the sample container is set in rotation.
- it is also to fix the rotor radially and to put the sample container itself in rotation.
- the sample container has means for transmitting a torque to the sample container, and the means for transmitting a torque to the rotor serve as a fixing means.
- radially fix means the provision of means used to prevent the rotor or sample container from rotating.
- the means for transmitting a torque to the rotor is preferably an axially extending to the rotor longitudinal body.
- the longitudinal body can have an arbitrary geometric plan, but an n-corner plan (n is selected, for example, selected from 3, 4, 5 and 6) is preferably used.
- means may be provided on the longitudinal body, which facilitate the positive and / or non-positive connection with a torque-generating device (eg, the longitudinal body axial projections or projections or recesses or indentations have).
- a cover for covering the interior of the sample container is provided on the rotor or on the sample container
- a lid for closing or covering the sample container has many advantages. On the one hand, it is possible to keep the inside of the sample container contamination-free (for example, excluding dust and microorganisms), on the other hand, it is possible to minimize or completely eliminate evaporation processes within the sample container.
- the lid may be provided such that it has at least or substantially a diameter as the opening of the sample container. If the diameter of the lid is greater than this opening, the lid protrudes beyond the edge of the sample container, the diameter is smaller or essentially the same as the sample container, the lid closes off the sample container within the container.
- Another aspect of the present invention relates to a device for analyzing liquid samples, with a usable in a sample container rotationally symmetric rotor, wherein between the sample container and the rotor an annular gap is provided, the rotor at least one flow channel for the transport of liquids and / or gases in and / or from the interior of the sample container and at least one elevation is provided on the lateral surface of the rotor or on the inner wall of the sample container, wherein a lid for covering the interior of the sample container is provided on the rotor or on the sample container.
- This device comprises a rotor, a sample container and a lid, which is the interior of the sample container in which the rotor in the inventive _ -j_
- the upper portion of the rotor may either be itself a lid (e.g., by providing a protrusion on the rotor which can be inserted into the sample container or resting on the sample container) or the lid is attached to the rotor.
- the rotor is provided with a flow channel through which the sample liquid and other liquids or gases required in the course of an analysis (for example incubation solutions, buffers, detection solutions, wash solutions, inert gas) are introduced into the interior of the sample container.
- the flow channel thus provides a connection between the environment and the sample container interior.
- the flow channel can be advantageously connected to a feed device (e.g., pipetting robot) for gases and liquids.
- a feed device e.g., pipetting robot
- the device according to the invention is also suitable for use in high-throughput screening.
- the device can also be used as a disposable analysis device.
- At least one elevation is provided on the rotor or on the inside of the sample container.
- This survey serves to efficiently mix the solutions which are located in the radial annular gap between the rotor and sample container, since in the course of the radial movement of the rotor, the solution itself is set in radial motion and the proposed survey to Verwirbelun- gene in this solution leads, resulting in an efficient mixing of one or more solutions.
- these surveys can be provided in a variety of arrangements.
- the elevations may for example be arranged axially, spirally or in any other way along the rotor or the sample container.
- Suitable analysis devices which can be provided with a lid according to the invention are disclosed, for example, in WO 03/100401.
- a cover is applied to the device disclosed above according to the invention.
- the "lid” (as a chanical barrier) the boundary of the sample container which closes off its opening on the side opposite the sample container bottom.
- the lid comprises a material inert to the gases or liquids used in the apparatus and is substantially liquid and gas impermeable.
- the lid has a diameter which is designed to introduce the lid into the sample container or to store it on the edge of the opening of the sample container.
- the lid has a radial recess on the side of the lid facing the sample container, which has the same diameter as the sample container at the contact surface lid / sample container. This allows the lid to be stored on the sample container.
- At least one opening may be provided on the lid. Without such an opening would be within the sample container during the introduction of liquids, if no suitable openings on the sample container or rotor are provided and the sample container interior air and liquid-tight configuration, form such a large pressure, thereby introducing more liquids is hardly possible , By an opening preferably provided on the lid, this can be prevented without significantly impairing the protective function of the lid.
- the appropriate solutions e.g., sample solution, incubation solution, detection solution
- means for centering the rotor in the sample container are provided on the sample container and on the rotor.
- the sample container according to the invention and the rotor according to the invention have means for centered storage.
- the invention relates to the means for centered mounting of the rotor in the sample container a directed into the interior of the sample container on the sample container bottom survey or indentation and the rotor a complementary recess.
- This collection or indentation is used for radially movable bearings of the rotor in the sample container according to the invention, whereby a secure centering or positioning of the rotor in the sample container is made possible.
- the protrusions may be of any shape (e.g., trunnion bushings). It is also quite possible to provide in the indentation or collection additional bearing elements, so that the rotor is mounted in the sample container by means of a ball bearing. Alternatively, it is also possible to introduce into the sample container bottom an insert which has a complementary indentation or elevation which is complementary to the elevation or indentation on the rotor. In such an embodiment, the sample container bottom could have no elevations or indentations.
- a recess can be provided on the sample container bottom into which a complementary elevation located on the rotor or a complementary journal located on the rotor can be introduced for centered storage.
- the elevation or indentation has a cylindrical shape, conical shape, truncated cone shape or a combined shape thereof.
- the flow channel of the rotor is preferably connected to the means for centering the rotor connection, i. the storage means itself serves in this preferred embodiment itself as a flow channel.
- Rotor On the inside of the means for centered storage of the Rotor is preferably provided at least one extending along the means and / or the flow channel recess.
- the provision of such depressions along the means for centered storage and the flow channel is particularly advantageous when using the apparatus according to the invention for the analysis of small amounts of sample. Because of this depression, it is possible that the sample liquid can flow along this recess in the sample container. Furthermore, such a depression is advantageous if, for example, an elevation for supporting the rotor is provided within the sample device and on this elevation the complementary means on the rotor, rests in its function as a flow channel of the rotor. Without such a depression, this survey would make it difficult or prevent the sample liquid or other liquids from flowing into the sample container.
- the receiving means or the flow channel can have at least one but also several such depressions (for example at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least ten).
- At least one recess is preferably provided, which permits a passage of liquid from the receiving means or flow channel of the rotor into the sample space (radial gap between the rotor and sample container) when the rotor is introduced entirely into the sample container.
- This recess is vorzusgweise part of at least one recess in the flow channel of the rotor.
- thermocouple can be used in the indentation provided in the sample container, the indentation must be designed accordingly to receive such elements
- This thermocouple preferably consists of a cooling system (eg Peltier element) and a heating system (eg infrared radiator , Microwave radiator or Peltier element).
- thermocouple can preferably der- be executed, that it allows the positioning of the device according to the invention in a measuring device or in a cartridge.
- the indentation is thus preferably designed to accommodate a cooling and / or heating device.
- the advantage of such an embodiment is further that in addition to the regulation of the temperature of the sample liquid and the device or the sample container according to the invention can be positioned.
- the temperature regulation can also take place via the side wall or the bottom of the sample container (see for example WO 03/100401).
- the indentation preferably has means for transmitting a torque to the sample container and / or means for fixing / positioning the sample container.
- Such means for fixing the sample container or for transmitting a torque to the sample container is preferably a longitudinal body (e.g., pin or pin) provided axially in the recess, with a radial gap between the longitudinal body and the outside of the recess.
- This longitudinal body can be inserted in a corresponding complementary part (e.g., recess, gripping device) in another device which can receive the device according to the invention.
- a torque can not only be applied to the analysis device via the cover, but it is also possible to fix the cover together with the rotor and to set the sample container itself in rotation.
- a detection system can be incorporated into the sample container or the receiving element (for example the means for centering the rotor in the sample container) of the container can include a detection system.
- the receiving element for example the means for centering the rotor in the sample container
- the means for centered storage is a magnetic bearing, wherein the magnetic bearing is preferably shown that magnets are provided on the rotor and optionally on the sample container.
- Magnetic bearings allow the storage of the rotor in the sample container substantially without material contact by magnetic force.
- a first magnet may be provided on the rotor, and the second magnet on the sample container or in another Vorrich- tion (eg, in which the device according to the invention is introduced for the measurement) or holder.
- the magnets located on the rotor are preferably mounted annularly on the rotor bottom or its vicinity.
- the magnets used in the rotor are preferably permanent magnets, and the magnets provided in the sample container or in the further apparatus may be not only permanent magnets but also electromagnets.
- the sample container is preferably at least partially transparent.
- the detection of the forming interactions between the binding partners and the ligands to be bound within the device according to the invention can take place in various ways.
- the most frequently used principle for the determination of such interactions is the measurement of electromagnetic waves, in particular fluorescence, chemoluminescence, bioluminescence, fluorescence resonance energy transfer (FRET), which generates by binding corresponding marker molecules (eg labeled binding partners) to the ligands immobilized on the rotor by means of binding partners become.
- FRET fluorescence resonance energy transfer
- the molecules to be detected or with the molecules to be detected in competition with a corresponding substance are labeled (eg with a fluorophore or a quencher or groups of molecules that interfere with electromagnetic waves). If, for example, a DNA molecule is used, this can be done directly by incorporation of fluorophore-labeled nucleotides. On the other hand, if the detection is to take place indirectly via further secondary binding partners, it is also possible to label the molecules with markers such as, for example, biotin, digoxigenin (DIG).
- DIG digoxigenin
- the device according to the invention is preferably suitable for the measurement of chemiluminescence reactions in which the light emission of a substrate soluble in a corresponding enzyme (eg peroxidase) is measured.
- a corresponding enzyme eg peroxidase
- the detection of such a reaction can take place in different ways.
- so-called CCD charge coupled device
- CCD charge coupled device
- the measurement can be carried out, for example, using the so-called TDI mode (Time Delayed Integration This mode requires a synchronization of the read-out speed of the CCD used and the movement of the object to be observed (eg microarray, biochip or rotor of the device according to the invention) (see WO 03/014400)
- TDI mode Time Delayed Integration
- the binding partners Preferably coupled to the rotor surface
- these are synchronously rotated past the measuring system via the rotational speed as apparent lateral movement
- photomultiplier arrays eg PMT ("photo multiplier tube"), APD ("avalanche photo diode"
- PMT photo multiplier tube
- APD avalanche photo diode
- the measuring system eg photodiode array
- the measuring system can be designed as a disposable product in combination with the sample container or can be a fixed component of the heating system located on the sample container. Since the rotor (binding partner carrier) and thus also the sample container preferably have a cylindrical shape, the requirement of a curved design of the photon sensor is of particular importance.
- amorphous silicon diodes or photosensitive polymer layers as described for example in WO 03/015189 and WO 01/84644, are suitable.
- silicon photodiodes in spatial proximity to the sample container surface is advantageous, above all, for the use of chemiluminescence detection methods, since these are used without an additional light source for exciting the light emission for the detection of the interactions between binding partner and ligands in the sample liquid can be.
- Another possibility is, for example, the use of light sources, for example, in the interior of a recess which projects into the sample container.
- the type of light source can Here, a direct, ie represent a unit with the carrier, or be an external light source, which is used for illumination or excitation of marker molecules in the sample liquid.
- the detection systems described in US 2002/177144, WO 00/79326, WO 00/62549, WO 00/25113, WO 00/12759, WO 97/12030, US 5,585,639, US 2002/066865 and EP 0 947 824 are described, used for the device according to the invention.
- the object of the continuous or stepwise (after changing time, liquid or temperature) optical representation of a mantle surface through a liquid film, which in turn is generated by the filling of the radial annular gap (see present invention and eg WO 03100401 A1), is solved according to the invention so that the observation (preferably the measurement of electromagnetic radiation emitted from the surface of said lateral surface) takes place through a transparent container, wherein the measuring system consists for example of a CCD camera or an APD (avalanche photo diode) or a comparable detection system , which is aligned substantially normal to the lateral surface and a strip surface of said lateral surface maps.
- the measuring system is connected to the rotation unit in such a way that the rotation speed and the exposure time can be matched to one another.
- the thus synchronized representation may optionally be incorporated into the use of the so-called TDI mode.
- the stepwise rotation is synchronized in time with the integration time of the CCD chip.
- the result is the line-dependent addition of the signal strength.
- the measuring system may additionally include a lighting unit, which preferably consists of an opto-semiconductor (LED) and alternatively of at least one laser, a white light lamp, a gas discharge lamp, UV or IR lamp.
- the measuring system can further be associated with a lens system consisting of at least one convergent lens, at least one filter set and / or an infrared filter.
- the sample container can consist entirely of a material that is suitable and transparent for, for example, photometric measurement, or only partially (for example, providing viewing windows).
- This viewing window (or the area in which the analyzer measures) may take the form of a lens (or lens structures) to optimize the optical properties. As a result, a focusing of the incoming and outgoing light and thus an increased yield of the measurement signal can be achieved.
- the flow channel of the rotor is arranged axially.
- the rotor In order to introduce sample or washing and incubation solutions into the sample container, the rotor has a flow channel through which liquids can be introduced into the device from outside.
- the flow channel is preferably arranged axially on the rotor. It is of course also possible to provide the flow channel with an arbitrary course and any branches within the rotor and any exit point into the sample container.
- an outlet opening In the lower region of the rotor, an outlet opening is preferably further provided.
- the diameter of the flow channel of the rotor in the region of the sample container bottom is greater than in the region of the sample container opening.
- the diameter of the flow channel of the rotor can increase in the direction of the sample container bottom (eg linear or stepped).
- a linear or stepped enlargement can increase the storage area accordingly, which improves the concentric storage and consequently the measuring accuracy can.
- increasing the diameter of the flow channel from initially, for example, 1-2 mm to 10-15 mm allows the introduction, such as described above, of a heating and / or cooling system in the storage means of the sample container.
- the reduced wall thickness of the rotor reduces on the one hand the cost of materials and on the other hand can simplify and improve the manufacturing process (eg injection molding process: better injection and faster cooling).
- the lid is detachably arranged.
- the lid may be removably attached to the rotor, thereby making it possible, for example, to reuse the lid.
- the cover fixed to the rotor or to provide the rotor and the cover in one piece.
- the cover preferably has a flow channel of the rotor arranged in series and connected thereto flow channel.
- the device After filling the device according to the invention with sample liquid or other liquids, the device can be closed by means of a lid which is applied to the rotor.
- the lid of the rotor itself has a flow channel, which is in communication with the flow channel of the rotor. This makes it possible to prepare the device together with rotor and cover first and then introduce the introduced into the device liquids directly through the lid into the device.
- the provision of a flow channel in the lid is particularly advantageous when using the device according to the invention as a flow cell.
- the flow channel of the lid has a smaller diameter than the flow channel of the rotor.
- the lid has a sealing lip at the edge.
- the lid In order to efficiently seal the interior of the device, the lid has a sealing lip.
- This sealing lip which extends over the entire outer edge of the lid, prevents the escape of liquid through the radial gap between the rotor and the sample container and additionally serves as a gas barrier which prevents the contact of sample liquid and e.g. Can prevent atmospheric oxygen.
- This is particularly advantageous when examining samples which are sensitive to gases such as e.g. Oxygen, react and thus can falsify the measurement result.
- the provision of a sealing lip on the cover allows a certain atmosphere to be provided within the device. For example, nitrogen may be introduced into the sample container, thereby making it possible to conduct analyzes under a protective atmosphere. Such studies are of particular interest when it comes to e.g. Analyze oxygen-sensitive samples.
- the lid according to the invention which can be placed on a rotor according to the invention or is produced in one piece with it, has advantages in particular in contamination protection, in evaporation protection and in oxidation protection.
- means are provided on the cover for transmitting a torque to the rotor connected to the cover.
- a torque-generating device e.g., electric motor (stepping motor, DC motor, AC synchronous motor, AC induction motor), internal combustion engines, gas turbines, etc.
- a torque-generating device e.g., electric motor (stepping motor, DC motor, AC synchronous motor, AC induction motor), internal combustion engines, gas turbines, etc.
- the means for transmitting a torque to the rotor is preferably formed by an axially extending to the rotor longitudinal body.
- the means which is responsible for the transmission of the torque to the rotor, may be designed differently, wherein preferably the means for transmitting a longitudinal body is.
- a longitudinal body has the advantage that the device for generating a torque receives a point of attack on the lid, wherein the longitudinal body preferably has a polygonal shape (n is preferably selected from 3, 4, 5, 6 or 7).
- n is preferably selected from 3, 4, 5, 6 or 7.
- the rotor has fastening means for fastening the lid.
- the rotor In order to fasten the cover both axially and radially on the rotor, the rotor has a fastening means on its upper area.
- the fastening means can either be made in one piece with the rotor or the fastening means is applied to the rotor.
- the fastening means are preferably formed by at least one radially arranged elevation.
- the survey may have a tapering towards the free end diameter.
- the elevation is provided with a helical groove (thread), with a radial recess or with a radial projection.
- the cover preferably has a recess for receiving the fastening means, wherein according to a preferred embodiment, the recess itself has a helical groove (thread), a radial projection or a radial recess for fixing the fastening means of the rotor in the recess of the lid.
- the recess itself has a helical groove (thread), a radial projection or a radial recess for fixing the fastening means of the rotor in the recess of the lid.
- the elevation of the rotor which is used for fixing the lid, has a helical notch, a radial recess or a radial projection.
- This makes it possible in a simple manner to provide a cover with a recess for receiving the fastening means of the rotor, wherein the indentation represents the counterpart of the survey and thus also has a helical notch, a radial recess or a radial projection.
- the cover can preferably be fixed detachably on the rotor.
- the lid is fixed to the rotor by a latching device.
- the lid which has elevations or recesses on the contact surface with the rotor, engages on this, since corresponding complementary elevations or recesses are formed on the rotor.
- At least one binding partner for binding at least one ligand is provided on the rotor and / or on the inside of the sample container, the at least one binding partner preferably having a biomolecule, in particular an antibody, antigen, hapten, peptide, polypeptides with various prosthetic groups, enzymes, hormones, a nucleic acid or derivatives thereof, such as peptide nucleic acids.
- the device according to the invention is primarily suitable for the analysis of interactions between proteins, nucleic acids and other biological molecules, such as e.g. Membrane components, lipids, hydrocarbons and their derivatives, carbohydrates, haptens, hormones and synthetic agents (eg growth inhibitors such as antibiotics, pesticides, herbicides or fungicides, or inhibitors or activators of biochemical metabolic reactions), wherein at least one of the binding partners on a stationary phase in covalent or non-covalent form, or is bound as a sandwich via a general molecular adapter and brought into contact with the sample components to be analyzed via a liquid control system and their interactions are detected by means of a detection device.
- proteins e.g. Membrane components, lipids, hydrocarbons and their derivatives, carbohydrates, haptens, hormones and synthetic agents (eg growth inhibitors such as antibiotics, pesticides, herbicides or fungicides, or inhibitors or activators of biochemical metabolic reactions)
- growth inhibitors such as antibiotics, pest
- biomolecules detected in a sample allow, for example, unambiguous conclusions as to the presence of viral, bacterial, eukaryotic, in particular animal and human DNA, or the occurrence of different forms of proteins (phosphorylations, glycosylations) or nucleic acids (methylation). or lipids with any glycosylations too.
- binding partners are immobilized on the rotor or on the sample container.
- the binding partners used in this case are selected according to the ligands to be bound.
- biomolecules such as antibodies, nucleic acids, sugar chains, lectins or other proteins can be immobilized on the rotor in order to bind ligands (which likewise constitute binding partners) to the immobilized binding partners.
- the ligand can also be bound to the rotor or sample container, so that in this case the ligand is by definition (in the context of the present invention) referred to as a binding partner.
- the device according to the invention is suitable not only for the detection of certain substances in a sample, but also for the conversion of substances, which can record, for example, enzyme kinetics. Furthermore, the device of the invention can be used to carry out enzyme reactions, e.g. DNA polymerase reactions ("solid phase amplification", "APEX"), DNA ligase reactions, DNA methyltransferase reactions, restriction endo and exonuclease reactions, oxidoreductases, hydrolases, Ligase, lyase, isomerase, phosphatase, kinase, methylase and transferase reactions.
- enzyme reactions e.g. DNA polymerase reactions ("solid phase amplification", "APEX"), DNA ligase reactions, DNA methyltransferase reactions, restriction endo and exonuclease reactions, oxidoreductases, hydrolases, Ligase, lyase, isomerase, phosphatase, kinase
- the rotor preferably has at least one outwardly directed and / or the inner jacket of the sample container at least one inwardly directed radial projection as a spacer element.
- the rotor may have at least one, preferably at least two, more preferably at least three, most preferably at least four, in particular at least five, radially outward. have directional spacers. Preferably, at least one radially outwardly directed spacer element at the bottom and / or top of the rotor.
- a radial projection which may also comprise continuously the lateral surface of the rotor, is particularly well suited to be used as a spacer element.
- the spacer also serves to limit the sample or incubation space.
- the radial projection preferably has, in particular along the recess in the interior of the flow channel, at least one recess.
- the recess on the radial projection makes it possible for the solutions introduced through the flow channel to flow outward from the interior of the rotor into the reaction space between the rotor and the sample container wall.
- the recess may also be such that the diameter of the radial projection is reduced.
- radial projections can also be provided on the inside of the sample container.
- the protrusions on the sample container perform the same job as the radial protrusions on the rotor.
- the radial projections are preferably provided on the sample container.
- the projections can also serve as a "bubble slide", which can take any resulting or introduced air bubbles or dirt particles from the projections. The result is a distance up or down, or a uniform load on the entire surface and not just an area, as is the case with planar carriers.
- the radial projection of the sample container has at least one recess, in particular an opening.
- the sample container has means for its radial fixation in a cartridge.
- lent rotor or in a cartridge (eg for transport) to fix can be provided on the sample container, for the radial fixation, a means.
- the means for radial fixation of the sample container in the holder or cartridge is preferably at least one projection provided on the sample container bottom, in particular a knob.
- the provision of a projection on the sample container bottom makes it possible in a simple manner to fix the sample container in a cartridge or device holder if these have corresponding means which can receive this projection.
- the cartridge according to the invention which may or may not be part of a measuring device, thus serves to receive the analytical device according to the invention (sample container, rotor and lid).
- the cartridge is thus a transport and / or storage unit for the analysis device.
- the rotor, the sample container and / or lid is formed from a plastic, this preferably a cyclo-olefin copolymer, polystyrene, polypropylene, polyethylene, Acetatpo- lymer, acrylonitrile butadiene styrene, polymethyl methacrylate, PVC , Polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene or a combination thereof.
- plastic preferably a cyclo-olefin copolymer, polystyrene, polypropylene, polyethylene, Acetatpo- lymer, acrylonitrile butadiene styrene, polymethyl methacrylate, PVC , Polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene or a combination thereof.
- plastic this preferably a cyclo-olefin copolymer, polystyrene, polypropylene, polyethylene, Acetatpo- lymer, acryl
- the surface of the rotor is preferably coated with a metal, preferably a semiconducting metal, a polymer, silicon or a silicon compound with carbon, preferably with graphite, DLC (diamond-like-carbon) or diamond, or a combination thereof, the metal preferably being gold , Palladium, silver or a combination thereof and the silicon compound is silica.
- a metal preferably a semiconducting metal, a polymer, silicon or a silicon compound with carbon, preferably with graphite, DLC (diamond-like-carbon) or diamond, or a combination thereof, the metal preferably being gold , Palladium, silver or a combination thereof and the silicon compound is silica.
- a metal preferably a semiconducting metal, a polymer, silicon or a silicon compound with carbon, preferably with graphite, DLC (diamond-like-carbon) or diamond, or a combination thereof, the metal preferably being gold , Palladium, silver or a combination thereof
- SoIGeI Dissolved cathalytic Si-oxide particles harden to a glass layer over the plastic surface
- Chemical modification by introduction of chemically reactive groups, epoxy, aldehydes or plasma treatment to activate the surface layer of the plastic and introduction of reactive chemical groups (amino, hydroxyl, epoxy, aldehyde, carboxy groups) are preferred surface coating methods or modification.
- molecules are bound to the surface via sulfur compounds (Au-S-R) in combination with a second reactive group as the residue, preferably an NHS ester or maleimide or similar reactive groups.
- a second reactive group as the residue, preferably an NHS ester or maleimide or similar reactive groups.
- the corresponding modification of the surface occurs via a chemical immersion process in a solution of dissolved DMSO solution. It is then washed with water or apolar solvent, MeOH or acetone or preferably with isopropanol. After drying, the biological binding partners (e.g., antibodies, proteins, peptides, modified DNA, or generally organic molecules which themselves carry reactive groups for covalent immobilization) are bound to the surface.
- Another aspect of the present invention relates to a cartridge for receiving an analysis device according to the invention, wherein the cartridge has an opening for introducing the sample container and a side boundary provided with a recess, wherein the recess for axial fixing of the rotor is formed.
- a cartridge can serve to protect the sample container including the rotor and lid from mechanical stress and at the same time serve as packaging.
- the cartridge can be designed such that it can be used for automatic filling, for example via a magazine with a plurality of cartridges, and for unambiguous positioning in a device in which the device according to the invention can be used. position (eg by means of a gripper arm).
- the cartridge also preferably has a side boundary provided with a recess, wherein the recess is designed to receive the upper region of the rotor or the means provided on the cover for transmitting a torque to the rotor and to support it in a radially immovable manner.
- the side boundary provided in the cartridge with a recess has the advantage that this recess can either receive the upper region of the rotor and the cover is thus located above the lateral boundary, or that this recess can receive the means for transmitting the torque provided on the cover but without disturbing the radially movable bearing.
- This makes it possible to provide the rotor in different positions within the sample container. Such positioning is advantageous, for example, in an ideal incubation.
- the sample liquid may be brought to a certain temperature (e.g., for hybridization) prior to use in the apparatus of the present invention, or a sample conditioning step is accomplished, which is accomplished by temperature differences (e.g., PCR). At this time, no contact with the binding partners on the rotor surface may take place.
- the side boundary of the cartridge (as a horizontal plate) is preferably provided over the entire depth with a recess which tapers at the edges such that the radial groove of the rotor can be inserted with some pressure and a proposed constriction.
- the boundary (bottom of the cartridge) opposite the side boundary provided with the recess preferably has a recess for receiving the means for radial fixation of the sample container in the cartridge.
- this recess / depression which is substantially complementary to the means provided on the sample container bottom means for radial fixation, the radial movement of the sample container is prevented.
- the recess may be formed as a guide rail, which allows the recording of the means for radial fixation of the sample container.
- Another aspect of the present invention relates to a rotor for a device according to the invention.
- Another aspect of the present invention relates to a sample container for a device according to the invention.
- kits for analyzing samples comprising:
- the kit according to the invention is particularly well suited for the analysis of samples, i. for the determination of ligands in samples, or for carrying out chemical and biochemical reactions in the interior of the devices according to the invention.
- Another aspect of the present invention relates to a flow cell for analyzing samples comprising:
- the devices of the invention are also particularly well suited for use as flow cells.
- Flow cells are used in many areas of analysis.
- flow cells are suitable when it comes in the course of an analysis to a repeated change of sample liquids, incubation liquids, washing liquids and detection fluids.
- the flow channel of the rotor serves as Einströmungsort, which is located at the upper end of the rotor according to the invention.
- the outflow location at which the liquids located in the sample container can be removed therefrom can be provided on the sample container or on the lid.
- the flow cell itself, as well as the measuring cell of a device according to the invention, not as Flow cell is adapted, defined by the annular gap between the rotor and the sample container. In such an embodiment, it is quite possible to dispense with the lid according to the invention.
- a flow cell according to the invention can be used for example for the investigation of larger amounts of sample liquid such as water or other samples (eg waste water, cell culture supernatants), which is moved through the flow cell and thus brought into contact with the preferably attached to the rotor binding partners.
- sample liquid such as water or other samples (eg waste water, cell culture supernatants)
- the measurement can take place in real time, ie, during the flow through the sample liquid through the flow cell, the sample is examined by detecting the binding between the substance to be detected and its binding partner, which is immobilized in the device.
- Another field of application of the flow cell according to the invention is the flow of culture medium through this cell to provide nutrients to growing cells on the rotor and to monitor their response to changes in the culture medium and optionally to analyze, fix and stain the cells.
- At least one opening for the discharge of liquid is provided on the rotor, preferably in a spacer element or in the lid, preferably adjacent to the sealing lip, or on the sample container.
- the liquid introduced through the flow channel can be efficiently removed from the device. It is thus not necessary to use the flow channel both for the introduction and for the removal of liquids into or out of the sample container.
- the device according to the invention can be used for numerous uses, methods and methods. These uses include the detection of substances in a sample, the performance of enzymatic reactions in the device (e.g., amplifications of nucleic acids), etc.
- One particular method for which the device of the present invention is particularly useful is the detection of substances in saliva.
- the aim of such a method is the detection of eg illicit substances (drugs) in saliva. In doing so, additional next a saliva decrease in a withdrawal liquid. The removed saliva undergoes no purification (filtration, centrifugation or similar methods). The saliva-containing fluid thus obtained is used directly in the device according to the invention.
- the following steps are preferably carried out, it being understood that the number can be varied according to the type of steps.
- the antibody to the desired substance e.g., antigen
- a labeled antigen o. in dried form after spraying onto the inner surface of the sample container
- the bound antibodies can be detected by their fluorescence labeling.
- the collected light intensity is linearly proportional to the amount of fluorophores and thus proportional to the amount of bound antibodies.
- a quantitative statement about the amount of competitors (drugs) is thus possible. It has surprisingly been found that non-purified (ie not centrifuged and filtered) saliva in combination with the microarrays located on the rotor can be used directly. It is advantageous that thus eliminating purification steps and thus a mobile use (eg in traffic control, directly in the infirmary) is possible because mobile centrifuges with the required G-number (of more than 2000g) are hardly feasible.
- the variation of the measurement results can be minimized within the device (about 2-7%).
- the detection of nucleic acids can be carried out in a sample.
- the sample is pretreated after collection (e.g., blood) and the nucleic acid pre-purified.
- the detection takes place via the fluorescence intensity measurement of the array on the carrier (rotor).
- the signal comes from fluorophores that are in adsorbent or covalent contact with the immobilized molecules of the rotor array. Two signal generation methods are used:
- Fluorescence Enegrie Transfer to quenching dyes, or other fluorophores
- Both methods have in common that they require an enzymatic reaction to reach a detectable measurand.
- this will be the DNA dependent DNA polymerase (preferably Taq polymerase).
- the process is commonly referred to as Solid Phase PCR (Polymerase Chain Reaction) or Solid Phase Amplification.
- Solid Phase PCR Polymerase Chain Reaction
- Solid Phase Amplification The whole process of a Analysis is planned as follows (example infection diagnostics, pathogen-specific DNA primers are spotted on the rotor surface as an array)):
- the sample e.g., blood
- the sample is taken from the patient.
- the DNA of the sample (s) is prepared accordingly.
- the sample is denatured (94 0 C), while the double strands separate into single DNA strands.
- the device is rotated at 72 0 C and incubated: this involves the polymerization (chain extension) of the primer due to the hybridized DNA sample molecules.
- the sample is again denatured (94 0 C), the double strands separate again.
- This duplex formation is measured by fluorescence measurement (e.g., FRET or CYBRgreen).
- Steps 4-9 are repeated cyclically until a meaningful signal can be expected.
- the above illustration of the analysis process makes it clear that on the one hand a spatially resolved measurement is required to implement a CIS-PCR array and on the other hand it must be able to repeat this measurement any number of times without changing the analytical conditions (eg by drying the solid phase). Moreover, the measuring system must be able to change the temperature of the sample according to an adjustable profile at any time.
- the device according to the invention is the only technology known to us which meets all these requirements. corresponds gen and thus makes the ansich known method the first time safely applicable.
- the device according to the invention is suitable for the direct reverse transcriptase PCR on a solid support (eg US Pat. No. 6,844,158), determination of DNA polymorphisms (eg DE 10 160 983), determination of DNA sequences by means of parallel amplification (eg EP 1 186 669), solid-phase PCR (eg JP 2001 299 346, US Pat. No.
- the analysis device in which the device according to the invention can be used to analyze samples may comprise a plurality of components, wherein in particular at least one rotation and detection device are required.
- the analyzer may include a light source (e.g., laser box), an incubation chamber, a fluid change device (optionally coupled to a rotating device), a plurality of fluid reservoirs, and a cartridge.
- a typical analyzer may have the following components:
- a laser box Place the laser (up to 3 different laser types in parallel) or light sources that come out of the box bundled and centered
- An incubation chamber location of temperature control, rotation, fluid change and measurement
- a rotation and fluid exchange device serves to accommodate the device according to the invention on the lid, ensures the rotation, the transport in the device thus also the positioning, the liquid exchange (supply and discharge)
- a detector e.g. a CCD camera, alternatively also avalanche photodiodes (APD)
- Liquid reservoirs they are under controlled positive and negative pressure, which, in combination with point 3. and valves placed there, enables the supply and discharge of liquids.
- a magazine location of the device according to the invention, before and after the measurement to eg 8 pieces per magazine from the device can be managed.
- FIGS. 1A and 1B show two spatial views of a rotor according to the invention.
- Figs. 2A and 2B show a side view of the rotor.
- Fig. 3 shows a plan view of the rotor.
- Fig. 4 shows a cross section of the rotor (section A-A of Fig. 3).
- Fig. 5 shows a perspective view of a sample container according to the present invention.
- Fig. 6 shows a side view of the sample container.
- Fig. 7 shows a cross section of the sample container (section A-A of Fig. 6).
- Fig. 8 shows a bottom view of the sample container.
- Fig. 9 shows a three-dimensional view of a lid according to the invention.
- Fig. 10 shows a side view of the lid.
- Fig. 11 shows a cross section of the lid (section A-A of Fig. 10).
- FIG. 12 shows the enlargement of detail B from FIG. 10.
- Fig. 13 shows a top view of the lid.
- Fig. 14 shows a perspective view of a cartridge according to the invention.
- Fig. 15 shows a side view of the cartridge.
- Fig. 16 shows a cross section of the cartridge (section A-A of Fig. 15).
- Fig. 17 shows a cross section of the cartridge (section B-B of Fig. 15).
- Fig. 18 shows a cross section of the cartridge (section C-C of Fig. 15).
- Fig. 19 shows a plan view of the kart search.
- Fig. 20 shows a perspective view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid.
- Fig. 21 shows a side view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid, wherein the broken lines represent edges not visible from the outside.
- Fig. 22 shows a cross section of a device according to the invention with sample container, rotor and cover (section AA of Fig. 21).
- Fig. 23 shows a side view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid.
- Fig. 24 shows a further side view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid.
- Fig. 25 shows a perspective view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid.
- FIG. 26 shows a three-dimensional view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention.
- FIG. 27 shows a further spatial view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention.
- Fig. 28 shows a side view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention, wherein the broken lines represent edges not visible from the outside.
- Fig. 29 shows a cross section of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention (section A-A of Fig. 28).
- FIG. 30 shows a further side view of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention.
- Fig. 31 shows a cross section of a device according to the invention with sample container, rotor and lid in a cartridge according to the invention (section A-A of Fig. 30).
- FIG. 32 shows the coefficients of variation of measurements with the device according to the invention, in which the rotor surface was spotted with antibody (specifically against mouse antibodies) and incubated with mouse monoclonal antibodies (fluorescently labeled with Dylight 547). After incubation, the rotors were washed with PBS 0.5% Tween 20 and scanned.
- FIGS. 33 and 34 show the maximum signal level of measurements with the device according to the invention, in which the rotor surface was spotted with antibody (specifically against mouse antibodies) and incubated with mouse monoclonal antibodies (fluorescently labeled with Dylight 547). After incubation, the rotors were washed with PBS 0.5% Tween 20 and scanned. The measurement series corresponds to individual measurements with different incubation times. The maximum reached after about 30 minutes becomes clear in the measurement series with rotating incubation. The static incubation does not reach the signal level or a stagnation of the signal increase even after 90 minutes, ie 3 times the incubation time. Reproducible measurements, especially for single measurements, which are currently common, depend on the achievement of an equilibrium (stagnating, flattening signal height).
- FIG. 35 shows the dependence of the signal height on the incubation period during a rotating incubation.
- FIG. 36 shows the recording of a marked spot located on the rotor with rotating centered (A) and uncentered (B) mounting of the rotor.
- Fig. 37 shows the relative focusing errors in a rotary incubation with the device according to the invention in comparison with a device which has no means for centric storage.
- Fig. 38 shows the recording of the signals as a function of time (binding kinetics).
- a cylindrical rotor 1 according to the invention with a fastening means 2 comprising a radial recess 3 for fixing a lid is shown.
- the rotor 1 has an outwardly directed radial projection 4 at the upper 3a and 3b lower region.
- elevations 6 are provided, which serve for better mixing of the sample container located between the rotor 1 and the sample liquid.
- the rotor 1 also has a flow channel 7, which has a smaller diameter in the upper region 3a of the rotor 1 in the attachment means 2 than in the lower region 3b of the rotor 1.
- two recesses 8 extending along the flow channel 7 are provided Transport of a liquid along the flow channel 7 serve.
- Figs. 2A and 2B show another side view of the rotor
- a recess 10 is provided, which is a liquid passage from the flow channel 7 in the sample space (radial gap between the rotor 1 and sample container 11) at wholly in the sample container
- 3 is a plan view of the rotor 1, in which the inner boundary 9 of the flow channel 7 in the rotor 1 is shown by broken lines.
- Fig. 4 is a cross section (section A-A, Fig. 3) of the rotor 1 is shown.
- the flow channel 7 of the rotor 1 has a wider diameter in the lower region 3b than in the upper region 3a. Furthermore, the flow channel 7 in the lower region 3b is cylindrical and in the region of the diameter taper truncated cone-shaped. In the fastening means, the flow channel is again cylindrical.
- FIG. 5 shows the spatial representation of a sample container 11 which is designed to receive the rotor 1.
- the sample container 11 has on the side boundary 12 a transparent viewing window 13, through which the signals generated in the device according to the invention can pass substantially unhindered.
- the transparent viewing window 13 can be adapted according to the measuring system used and, for example, have a curvature.
- two projections 15 for example in the form of buttons
- the sample container 11 has a radial projection 16 at its opening for receiving the rotor 1.
- Fig. 6 shows a side view of the sample container 11 (see Fig. 5). The broken lines indicate elements in the interior of the sample container, which are shown in more detail in Fig. 7.
- Fig. 7 the cross section (section A-A) of the sample container 11 is shown.
- a cylindrical recess 17 is provided with a conical end portion 18, the shape of which is formed so as to support the rotor 1 according to the invention radially movable.
- a cylindrical longitudinal body 19 is provided in the indentation 17, which can serve to position the sample container 11.
- a cooling and / or heating device can also be introduced.
- FIG. 9 shows a cover 20 according to the invention, which can be fixed to the rotor 1, in particular to its attachment means 2 (see FIGS. 2A and 2B).
- the lid 20 has a sealing lip 21, which serves to seal the interior of the sample container liquid and gas-tight. Further, an opening provided with an opening indentation 22 for receiving the fastening means 2 of the rotor 1 is applied to the lid.
- a cylindrical hollow body 23 is provided, which can be used both as a flow channel for introducing liquids into the sample container 11 and for transmitting a torque from a torque-generating device to the rotor 1.
- axially extending elevations 24 may be provided which improve the grip of the hollow body 23.
- Fig. 10 shows a side view of the lid 20, whose cross-section is shown in Fig. 11.
- a radial projection 25 is provided, which can engage in the recess 3 of the fastening means 2 of the rotor 1.
- a thread is also provided in the indentation 22 in order to enable the fixing of the cover 20 to the rotor 1.
- the detail B from FIG. 11, which comprises the sealing lip 21, is shown enlarged in FIG. 12.
- the lid 20 has immediately adjacent to the sealing lip 21 at least one opening 26 through which either escaping gas or, in the case of a flow cell, leaking liquid can be removed from the sample container.
- Fig. 13 illustrates a plan view of the lid 20.
- Fig. 14 is a perspective view of the cartridge 27 according to the invention, which is designed to receive the device according to the invention comprising rotor 1, sample container 11 and lid 20 is shown.
- the cartridge has a horizontal plate 28 (side boundary), which is provided over the entire depth with a slot which is designed around the upper portion 3a of the rotor 1 or provided on the cover 20 means 23 for transmitting a torque to the rotor take up and store radially movable.
- a guide groove (recess) 30 is inserted, which is substantially complementary to the elevations 15 located on the sample container 11 and prevents the radial rotation of the sample container 11 when the device is inserted.
- the horizontal plate 28 is designed so that the pressure, which must be automatically expended by the placement of the lid 20 by hand or later, is recorded. Also provided on the bottom 29 of the cartridge is an outwardly directed projection 31 which serves to stabilize the cartridge 27 on a support surface.
- FIGS. 15 to 19 show various sectional views of the cartridge 27.
- FIG. 20 shows the spatial view of a device according to the invention comprising a rotor 1, a cover 20 and a sample container 11.
- the rotor 1 is in this figure entirely in the sample container 11 (so-called "measuring position") - To a measurement using To perform the device according to the invention, the rotor 1 must be in this position during the measurement.
- Fig. 21 shows a side view of the device according to the invention, in which the edges not visible from the outside are shown with broken lines.
- Fig. 22 shows a cross section of the device according to the invention.
- the sealing lip 21 of the lid 20 presses in the "measuring position" against the inner wall of the sample container 11 and thereby forms a closed measuring space, which may be separated by one or more openings, e.g.
- the supply and the discharge of liquids or gases for example, sample liquid, buffer, detection liquid, washing liquid
- a radial annular gap 32 is provided between the inner wall of the sample container 11 and the outer wall of the rotor 1.
- FIGS. 23 and 24 show further side views of the device according to the invention.
- Fig. 25 is another spatial view of the device according to the invention.
- the indentation 17 of the sample container 11 is visible, which may optionally at least partially serve as a bearing surface for the rotor 1.
- the elevations 15 on the sample container bottom serve for radially fixing the sample container 11 in a cartridge 27.
- FIGS. 26 and 27 spatially illustrate the device according to the invention in a cartridge 27.
- the elevations 15 on the sample container bottom are located in the guide groove 30th in the bottom 29 of the cartridge.
- the position in which the device according to the invention is located in the cartridge 27, can be referred to as "storage position", since the rotor 1 is not completely in this position in the sample container 11 and thus no annular gap 32 can be formed for a measurement would be needed.
- the rotor 1 due to the friction of the upper portion 3a of the rotor 1, the Befest Trentsgffens 2 and / or the cover 29 with the slot of the horizontal plate 28 and with the horizontal plate 28 itself, for fixing the device according to the invention is used in the cartridge 27, the rotor 1 is not offset with a sufficient torque.
- the slot of the horizontal plate 28 serves to receive the fastening means 2 of the rotor 1.
- the horizontal plate 28 is thus surrounded by the cover 20 on one side and the rotor 1 on the other side.
- Example 1 Variation coefficient of measurements with: the device according to the invention with static and rotating incubation
- Table 1 Scanning settings were 0.9 7 300. The devices were incubated for 5 min with 1 ⁇ l of antibody (1 mg / ml) labeled with Dylight 547 nm rotatingly or statically incubated, evaluation took place with a diameter of 200 ⁇ m.
- test protocol which serves for the detection and quantification of morphine in saliva with the device according to the invention:
- Example 2 Comparison of the signal height of measurements with the device according to the invention in static and rotating incubation
- Table 2 Scanning settings were 0.9,7,300. The devices were rotary or static incubated with 1 ⁇ l of antibody ( ⁇ g / ml) labeled with Dylight 547nm. Evaluation was done with 200 ⁇ m diameter. The morphine BSA signal was evaluated.
- FIGS. 36A and B it can clearly be seen that problems arise with the recording of the measurements in the case of a noncentric bearing of the rotor in the sample container.
- the course of the focusing error over the cylinder jacket is shown in FIG. It can be seen that the image of the markings change depending on the pendulum movement over the circumference from sharp to blurred.
- the centric storage of the device according to the invention shows a regular sharpness with a small fluctuation range (calculation tolerance).
- FIG. 38 clearly shows an increase of the signal (average of 9 identical spots on the rotor surface of the device according to the invention) as a function of the incubation time.
- the experiment was carried out according to the protocol of Example 1, wherein measurements were taken during incubation with the labeled antibody without removal of the unbound antibody by washing were carried out. The uniformly elevated background (labeled antibody in the solution) was subtracted from the signal level. The remaining signal was included as a value in the table. The signal height reaches the maximum after 13 minutes. The experiment was ended.
- binding kinetics or dissociation events can be created but also competitions
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Analyse von flüssigen Proben, mit einem in einen Probenbehälter (11) einsetzbaren rotationssymmetrischen Rotor (1), wobei zwischen dem Probenbehälter (11) und dem Rotor (1) ein Ringspalt (32) vorgesehen ist und der Rotor (1) mindestens einen Strömungskanal (7) zur Beförderung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und/oder aus dem Innenraum des Probenbehälters (11) aufweist, wobei am Rotor (1) und gegebenenfalls am Probenbehälter (11) Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) und/oder am Rotor (1) ein Deckel (20) vorgesehen sind.
Description
Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben.
Aufgrund der enormen Vielzahl an verschiedenen Biomolekülen und deren unterschiedliche Erscheinungsformen (chemische Modifikationen) bzw. Varianten (DNA Sequenzen) kommen verstärkt Hochdurchsatznachweistechniken ("high-through-put technologies") zum Einsatz. Neben den klassischen Verfahren, Northern- und Southern-Blotting, In-situ Hybridisierungen und jeglicher Art ' von Western-Blot-Techniken wurden in den letzten 15 Jahren zunehmend Multi-Analyten-Nachweissysteme entwickelt. Die wichtigsten dieser Systeme bedienen sich zumeist Mikrotiterplatten (z.B. als Standardträger für ELISA) mit mehreren Hundert Analysen pro Durchlauf und an Mikroarrays mit über 100 Analysepunkten pro cm2. Bekannt sind die in der US 5,800,992 und der US 5,744,305 von Fodor et al . beschriebenen auf Oligonukleotiden basierenden DNA-Arrays und die in der US 5,807,522 offenbarten auf cDNA-ba- sierenden Mikroarrays. Die derzeitigen Mikroarrays arbeiten mit auf festen Trägern bereichsweise aufgebrachten Bindungspartnern (Sensormolekülen) , die zumindest eine Bindungsstelle für Be- ■ standteile (Analyten) einer zu analysierenden Probe darstellen oder mit Bestandteilen der Probe in Wechselwirkung treten. Die Bindungspartner sind dabei beispielsweise in einem bestimmten Muster über den Träger verteilt angeordnet („Array") , wobei der Träger selbst stets eine planare Geometrie aufweist (z.B. US 5,800,992 und US 5,744,305). Der jeweilige Analyt-Nachweis basiert auf einer molekularen Bindung von Probenbestandteilen mit den Sensormolekülen. Ob gewisse Bestandteile in einer Probe enthalten sind, lässt sich somit daran erkennen, ob derartige Bestandteile eine Bindung mit den immobilisierten Bindungspartnern eingegangen sind. Die Erkennung einer derartigen molekularen Bindung erfolgt beispielsweise mittels einer optischen (z.B. Fluoreszenz, Lumineszenz, Surface Plasmon Resonance Spectrosco- py) , einer elektrochemischen oder der Messung einer Massenänderung der am Sensor befindlichen Moleküle.
Die derzeitigen Mikroarrays finden beinahe ausschließlich in der Forschung und Entwicklung Verwendung, wobei aber auch diagnostische Anwendungen wachsendes Interesse finden.
Allen Anwendungen gemeinsam obliegt die Aufgabe unbekannte,
in einer meist wässerigen Probenflüssigkeit gelöste Stoffe mit bekannten, auf einem festen Träger immobilisierten Bindungspartnern in Kontakt zu bringen. Eine wesentliche Voraussetzung für eine brauchbare Interpretation der nach dem Kontakt entstandenen Signale ist die gleichmäßige Behandlung aller am Träger aufgebrachten Bindungspartner. Dieser Aufgabe kommt erhöhte Bedeutung zu, wenn die Konzentration der Probenbestandteile sehr niedrig ist und/oder wenn zur Signalgenerierung in unterschiedlicher Reihenfolge verschiedene Temperaturen mit unterschiedlicher Zeitdauer auf das Nachweissystem einwirken müssen. Speziell im letzteren Fall ergeben sich durch Temperaturen bis an die 1000C ungelöste Probleme mit Gasblasenbildung, Temperaturunterschieden entlang der Inkubationsfläche, Verdunstungsproblematiken und damit auftretende Konzentrationsunterschiede. Bei der Untersuchung von Proteinen, die mit bestimmten Gasen eine Reaktion einzugehen vermögen, womit deren Aktivität derart beeinträchtigt wird, dass eine sinnvolle Messung nicht mehr möglich ist, ergibt sich bei den derzeitigen Systemen (z.B. herkömmlichen Protein-Arrays) die Gefahr von temporärem unerwünschtem Kontakt mit Umgebungsluft bzw. nicht definierten Gasgemischen. Nur ein geschlossener Inkubationsraum könnte für kontrollierbare und gleichmäßige Inkubationsbedingungen sorgen. Weiters lässt der Großteil der bestehenden Systeme keine kontinuierliche Messung der Wechselwirkung zwischen den Bindungspartner- und Probenmolekülen zu, ohne dafür die Testvorrichtung zu öffnen. Erfolgt eine Öffnung, wird die Ausbildung jener Wechselwirkungen unterbrochen und die Untersuchung kann durch erneuten Zusammenbau (Inkubationskammern siehe u.a. von folgenden Anbietern: Corning, Genomic Solution, BioRad, Takara Bio, Advalytix, Genetix, Gesim; die Inkubationskammern sind meist wiederverwendbar und schalenförmig aufgebaut, wobei sich innerhalb der mit Dichtungsstegen geschlossenen Kammer ein planarer Träger befindet) nicht ohne schwerwiegende Folgen weitergeführt werden. Die Folge ist eine Endpunktmessung, d.h. die Messung erfolgt nach allen Inkubationsschritten und liefert einen Messwert pro Bindungspartner. Die Situation ist vergleichbar mit der Anwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion und der nachfolgenden Analyse der Produkte und der entsprechenden Weiterentwicklung der Real-Time Polymerase-Ketten-Reaktion. Erst die Verlaufsmessung (kontinuierliche Messung) erfüllt die Voraussetzungen für eine ausreichend genaue Mengenmessung und zum
Einsatz in der In-vitro Diagnostik. Eine Ausnahme stellt die Vorrichtung, die in der WO 01/25759 und WO 01/53822 beschrieben ist, dar. Dieses Array System erlaubt eine kontinuierliche Messung von Wechselwirkungen, die sich an der Oberfläche eines pla- naren Trägers ereignen, ohne die Anordnung der Inkubationseinheit zu öffnen. Die Nachteile dieses Systems sind jedoch eine aufwendige Mikrofluidik mittels externer Pumpen, die nach jeder Probe gereinigt werden müssen, die die Probenflüssigkeit in einem externen Kreislauf über die Trägeroberfläche wälzen und damit keine gleichmäßige Temperatur der Probenflüssigkeit bewerkstelligen können und die durch den asymmetrischen Strahlengang verursachte ungleichmäßige Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen (Anregungslicht) . Eine weitere Vorrichtung ist der so genannte Minihohlzylinder (DE 198 28 837 Al) . Dieses System ähnelt der Verwendung von räumlichen Trägern, die in sphärischer Gestalt als stationäre Phase zum Einsatz kommen. Weiters ist aus der WO 03/100401, WO 00/40334 und WO 02/08457 bekannt, dass ein Träger in zylindrischer Form an seiner Oberfläche Bindungspartner in definierten Arealen (Spots) immobilisiert hat und im Tauchverfahren in einem komplementären Probenbehälter die Inkubation der Probenflüssigkeit unter temperierten Bedingungen durchführen kann. Dem Probenbehälter ist eine Messeinrichtung zugeordnet, die etwaige Wechselwirkungen detektieren kann.
Die beschriebenen Vorrichtungen weisen u.a. den Nachteil auf, dass in den Probenbehälter selbst Kontaminationen eingebracht werden können, oder dass es im Zuge der Untersuchung aufgrund der zumeist geringen Probenvolumina, die bei einer Untersuchung eingesetzt werden, zur Verdampfung der in die Vorrichtung eingebrachten Flüssigkeiten kommt. Daraus resultieren Konzentrationsänderungen der einzelnen Probenbestandteile, wodurch die Messungen beeinträchtigt werden können. Ein weiterer Nachteil derartiger Vorrichtungen, insbesondere einer Vorrichtung wie in der WO 03/100401 beschrieben, ist die instabile und nicht axial zentrierte Lagerung des Rotors während dessen Rotationsbewegung. Diese Lagerschwierigkeiten können dazu führen, dass der Rotor zeitweise die Innenwand des Probenbehälters berührt und dadurch der zwischen Rotor und Probenbehälter vorgesehen Ringspalt während der Messung variiert (führt zu einer Verfälschung der Messergebnisse) und die Bindungspartner, die sich auf dem Rotor oder an der Innenwand des Probenbehälters befinden können,
mechanischer Beanspruchung ausgesetzt sind und dadurch deren Bindungseigenschaften verändern können.
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen zur Analyse von Proben, welche aus einem Probenbehälter und einem darin einsetzbaren Rotor bestehen, derart zur Verfügung zu stellen, dass kleine Probenvolumina eingesetzt werden können und die Kontaminationsgefahr bzw. das Problem etwaiger Verdampfungsvorgänge reduziert bzw. beseitigt wird. Eine weitere Aufgabe ist es, eine Vorrichtung zur Analyse von Proben, welche aus einem Probenbehälter und einem darin einsetzbaren Rotor bestehen, zur Verfügung zu stellen, die eine verbesserte Lagerung des Rotors im Probenbehälter ermöglicht.
Dieses Ziel wird durch das Vorsehen einer Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben, mit einem in einen Probenbehälter einsetzbaren rotationssymmetrischen Rotor, wobei zwischen dem Probenbehälter und dem Rotor ein Ringspalt vorgesehen ist und der Rotor mindestens einen Strömungskanal zur Beförderung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und/oder aus dem Innenraum des Probenbehälters aufweist, wobei am Rotor und gegebenenfalls am Probenbehälter Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors vorgesehen sind.
Die hierin offenbarte Vorrichtung umfasst einen Rotor und einen Probenbehälter. Zwischen dem Rotor und der Innenwand des Probenbehälters ist ein radialer Ringspalt vorgesehen, der den Inkubationsraum (der Raum, in dem Bindungspartner und Ligand reagieren bzw. interagieren können) definiert. Erfindungsgemäß weist der Rotor einen Strömungskanal auf, durch den Flüssigkeiten in den Probenbehälter befördert oder aus dem Probenbehälter entfernt werden können. Die Mittel am Rotor und im Probenbehälter zur zentrierten Lagerung des Rotors im Probenbehälter ermöglichen es, dass der Rotor im Probenbehälter stabil und zentriert gelagert werden kann. Somit wird verhindert, dass während der Rotation des Rotors oder des Probenbehälters der Rotor mit dem Probenbehälter in Berührung kommt. Eine derartige unwuchtige Rotation führt dazu, dass es einerseits zu einem raschen Verschleiß der Vorrichtungsteile kommt, andererseits wird dadurch die Bindung zwischen Bindungspartner und Ligand beeinträchtigt. Durch den sich ändernden Ringspalt (Abstand zwischen Rotor und Probenbehälter) , der das Ergebnis einer unwuchtigen Rotation ist, wird außerdem das Messergebnis der Detektion der Bindung
zwischen Bindungspartner und Ligand beeinträchtigt, da sich das Volumen des Ringspaltes und somit des Inkubationsraumes entsprechend ändert.
Die Mittel zur zentrierten Lagerung am Rotor und Probenbehälter können formschlüssig verbunden sein (z.B. Erhebung-Einbuchtung, Lagerzapfen-Lagerhülse usw. ) .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist an der Mantelfläche des Rotors oder an der Innenwand des Probenbehälters mindestens eine Erhebung vorgesehen.
Die Anordnung mindestens einer Erhebung an der Mantelfläche des Rotors bzw. an der Innenwand des Probenbehälters bewirkt eine aufgrund von Verwirbelungen verbesserte Durchmischung der in der erfindungsgemäßen Vorrichtung befindlichen Lösungen im Zuge der Rotation des Rotors oder des Probenbehälters. Die Erhebung kann dabei verschiedene Formen aufweisen, wobei es aber bevorzugt ist, die Erhebungen derart zu gestalten, dass eine gute Durchmischung, ohne die Detektion der Bindung zwischen Bindungspartner und Ligand zu beeinträchtigen, ermöglicht wird.
Um ein Drehmoment an den Rotor weiter zu geben, weist der erfindungsgemäße Rotor Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor auf.
Um den Rotor durch eine geeignete Vorrichtung in Drehung zu versetzen, sind am Rotor Mittel vorgesehen, die die Übertragung eines Drehmoments an den Rotor ermöglichen. Dabei weist der Probenbehälter entsprechend Mittel auf, die diesen radial fixieren. Dadurch wird verhindert, dass bei der Rotation des Rotors aufgrund von Reibungseffekten auch der Probenbehälter in Rotation versetzt wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es auch, den Rotor radial zu fixieren und den Probenbehälter selbst in Rotation zu versetzen. In diesem Fall weist der Probenbehälter Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Probenbehälter auf und die zur Übertragung eines Drehmoments vorgesehenen Mittel am Rotor dienen als Fixierungsmittel.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter "radial fixieren" das Vorsehen von Mitteln verstanden, die dazu verwendet werden den Rotor bzw. den Probenbehälter an dessen Rotationsbewegung zu hindern.
Das Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor ist vorzugsweise ein axial zum Rotor verlaufender Längskörper.
Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass sich zur Übertra-
gung eines Drehmoments an den Rotor besonders gut ein axial zum Rotor verlaufender Längskörper eignet. Der Längskörper kann dabei einen beliebigen geometrischen Grundriss aufweisen, wobei aber ein n-eckiger Grundriss (n ist beispielsweise ausgewählt aus 3, 4, 5 und 6) bevorzugt eingesetzt wird. Weiters können am Längskörper Mittel vorgesehen sein, die das form- und/oder kraftschlüssige Verbinden mit einer Drehmoment-erzeugenden Vorrichtung erleichtern (z.B. kann der Längskörper axiale Erhebungen bzw. Vorsprünge oder Ausnehmungen bzw. Einbuchtungen aufweisen) .
Gemäß einer bevorzugten Ausführunsgform ist am Rotor oder am Probenbehälter ein Deckel zum Abdecken des Innenraums des Probenbehälters vorgesehen
Ein Deckel zum Verschließen bzw. Abdecken des Probenbehälters weist vielerlei Vorteile auf. Einerseits wird es ermöglicht das Innere des Probenbehälters kontaminationsfrei (z.B. unter Ausschluss von Staub und Mikroorganismen) zu halten, andererseits wird es ermöglicht Verdampfungsprozesse innerhalb der Probenbehälters zu minimieren bzw. zur Gänze auszuschließen. Erfindungsgemäß kann der Deckel derart vorgesehen sein, dass dieser mindestens oder im Wesentlichen einen Durchmesser aufweist wie die Öffnung des Probenbehälters. Ist der Durchmesser des Deckels größer als diese Öffnung ragt der Deckel über den Rand des Probenbehälters, ist der Durchmesser kleiner bzw. im Wesentlichen gleich wie der Probenbehälter schließt der Deckel den Probenbehälter innerhalb des Behälters ab.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben, mit einem in einen Probenbehälter einsetzbaren rotationssymmetrischen Rotor, wobei zwischen dem Probenbehälter und dem Rotor ein Ringspalt vorgesehen ist, der Rotor mindestens einen Strömungskanal zur Beförderung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und/oder aus dem Innenraum des Probenbehälters aufweist und an der Mantelfläche des Rotors oder an der Innenwand des Probenbehälters mindestens eine Erhebung vorgesehen ist, wobei am Rotor oder am Probenbehälter ein Deckel zum Abdecken des Inneren des Probenbehälters vorgesehen ist.
Diese erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst einen Rotor, einen Probenbehälter und einen Deckel, der das Innere des Probenbehälters, in dem sich der Rotor bei der erfindungsgemäßen
_ -j _
Verwendung der Vorrichtung befindet, gegenüber der Umgebung abgrenzt. Der obere Bereich des Rotors kann entweder selbst als Deckel ausgebildet sein (z.B. durch Vorsehen eines Vorsprungs am Rotor, der in den Probenbehälter eingeführt werden kann oder auf dem Probenbehälter aufliegt) oder aber der Deckel wird an den Rotor angebracht. Der Rotor ist mit einem Strömungskanal versehen, durch den in das Innere des Probenbehälters die Probenflüssigkeit und sonstige Flüssigkeiten oder Gase, die im Zuge einer Analyse benötigt werden (z.B. Inkubationslösungen, Puffer, De- tektionslösungen, Waschlösungen, inertes Gas) , eingebracht werden. Der Strömungskanal stellt somit eine Verbindung zwischen Umgebung und Probenbehälterinnerem dar. Der Strömungskanal kann vorteilhafterweise mit einer Aufgabevorrichtung (z.B. Pipettier- roboter) für Gase und Flüssigkeiten verbunden werden. Durch die Verwendung einer entsprechenden Aufgabevorrichtung eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung auch für den Einsatz für High- Throughput-Screening. Ferner kann die Vorrichtung auch als Ein- weganalysenvorrichtung eingesetzt werden.
Am Rotor oder an der Innenseite des Probenbehälters ist mindestens eine Erhebung vorgesehen. Diese Erhebung dient dazu, die Lösungen, die sich im radialen Ringspalt zwischen Rotor und Probenbehälter befinden, effizient zu durchmischen, da im Zuge der radialen Bewegung des Rotors die Lösung selbst in radiale Bewegung versetzt wird und die vorgesehene Erhebung zu Verwirbelun- gen in dieser Lösung führt, wodurch es zu einer effizienten Durchmischung einer oder mehrerer Lösungen kommt. Ist mehr als eine Erhebung am Rotor oder an der Innenseite des Probenbehälters vorgesehen, so können diese Erhebungen in verschiedensten Anordnungen vorgesehen sein. Die Erhebungen können beispielsweise axial, spiralförmig oder in einer sonstigen beliebigen Weise entlang des Rotors oder des Probenbehälters angeordnet sein.
Geeignete Analysenvorrichtungen, die erfindungsgemäß mit einem Deckel versehen werden können, sind beispielsweise in der WO 03/100401 geoffenbart.
Um insbesondere Kontaminationen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu verhindern bzw. eine Verdampfung der Probenflüssigkeit aus der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu reduzieren oder gar zu unterbinden wird erfindungsgemäß ein Deckel auf die oben geoffenbarte Vorrichtung aufgebracht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der „Deckel" (als me-
chanische Barriere) jene Begrenzung des Probenbehälters, der dessen Öffnung an der dem Probenbehälterboden gegenüberliegenden Seite abschließt. Der Deckel umfasst ein gegenüber den in der Vorrichtung verwendeten Gasen bzw. Flüssigkeiten inertes Material und ist im Wesentlichen flüssigkeits- und gasundurchlässig. Der Deckel weist dabei einen Durchmesser auf, der derart ausgebildet ist den Deckel in den Probenbehälter einzubringen oder auf dem Rand der Öffnung des Probenbehälters zu lagern. Bei letzterer Ausführungsform weist der Deckel eine radiale Ausnehmung an der dem Probenbehälter zugewandten Seite des Deckels auf, die denselben Durchmesser aufweist wie der Probenbehälter an der Kontaktfläche Deckel/Probenbehälter. Dadurch kann der Deckel am Probenbehälter gelagert werden.
Um bei einem geschlossenen System umfassend Rotor, Probenbehälter und Deckel aufweisend einen Strömungskanal zum Einbringen von Flüssigkeiten in den Probenbehälter das Austreten der durch die Flüssigkeit verdrängten Gase zu ermöglichen, kann am Deckel zumindest eine Öffnung vorgesehen sein. Ohne eine derartige Öffnung würde sich innerhalb des Probenbehälters beim Einbringen von Flüssigkeiten, sofern keine geeigneten Öffnungen am Probenbehälter oder Rotor vorgesehen sind und das Probenbehälterinnere luft- und flüssigkeitsdicht ausgestaltet ist, ein derartig großer Druck bilden, dass dadurch das Einbringen weiterer Flüssigkeiten kaum mehr möglich ist. Durch eine vorzugsweise am Deckel vorgesehen Öffnung kann dies verhindert werden, ohne dabei die Schutzfunktion des Deckels wesentlich zu beeinträchtigen. Selbstverständlich ist es auch möglich den Probenbehälter vor der Analyse mit den entsprechenden Lösungen (z.B. Probenlösung, Inkubationslösung, Detektionslösung) zu befüllen und anschließend den Rotor in Messposition zu bringen (durch Eintauchen des Rotors in den Probenbehälter) .
Vorzugsweise sind am Probenbehälter und am Rotor Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors im Probenbehälter vorgesehen.
Um den Rotor gemeinsam mit dem Deckel stabil im Probenbehälter zu lagern und eine zentrierte unwuchtige Rotation zu ermöglichen, weisen der erfindungsgemäße Probenbehälter und der erfindungsgemäße Rotor Mittel zur zentrierten Lagerung auf.
Die folgenden Ausführungen betreffen im Wesentlichen alle Aspekte der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er-
findung sind die Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors im Probenbehälter eine in den Innenraum des Probenbehälters gerichtete am Probenbehälterboden befindliche Erhebung oder Einbuchtung und am Rotor eine dazu komplementäre Ausnehmung.
Diese Erhebung bzw. Einbuchtung dient zum radial beweglichen Lagern des Rotors im erfindungsgemäßen Probenbehälter, wodurch eine gesicherte Zentrierung bzw. Positionierung des Rotors im Probenbehälter ermöglicht wird. Die Erhebungen bzw. Einbuchtungen können jeglicher Gestalt sein (z.B. Lagerzapfen- Lagerhülsen) . Es ist auch durchaus möglich in der Einbuchtung bzw. Erhebung weitere Lagerelemente vorzusehen, so dass der Rotor im Probenbehälter mittels eines Kugellagers gelagert wird. Alternativ ist es auch möglich, in den Probenbehälterboden einen Einsatz einzubringen, der eine komplementäre Einbuchtung oder Erhebung aufweist, die zu der Erhebung oder Einbuchtung am Rotor komplementär ist. Bei einer derartigen Ausführungsform könnte der Probenbehälterboden keine Erhebungen bzw. Einbuchtungen aufweisen.
Ferner kann am Probenbehälterboden eine Ausnehmung vorgesehen sein, in die eine am Rotor befindliche komplementäre Erhebung bzw. ein am Rotor befindlicher komplementärer Zapfen zur zentrierten Lagerung eingebracht werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Erhebung oder Einbuchtung eine Zylinderform, Kegelform, Kegelstumpfform oder eine kombinierte Form davon auf.
Insbesondere diese geometrischen Formen haben sich als besonders geeignet erwiesen. Selbstverständlich kann erfindungsgemäß auch mindestens eine am Probenbehälterboden vorgesehene radiale Erhebung oder Ausnehmung (symmetrisch um die Rotationsachse des Rotors) und ein entsprechendes am Rotor vorgesehenenes Komplement als Mittel zur zentrierten Lagerung dienen.
Der Strömungskanal des Rotors steht vorzugsweise mit dem Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors Verbindung, d.h. das Lagerungsmittel selbst dient bei dieser bevorzugten Ausführungsform selbst als Strömungskanal. Die Lösungen, die bei einer derartigen Vorrichtung in den Probenbehälter eingebracht werden, werden somit zwischen dem Lagerungsmittel des Probenbehälters und dem Lagerungsmittel des Rotors (= Strömungskanals) transportiert werden.
An der Innenseite des Mittels zur zentrierten Lagerung des
Rotors ist vorzugsweise mindestens eine entlang des Mittels und/oder des Strömungskanals verlaufende Vertiefung vorgesehen.
Das Vorsehen von derartigen Vertiefungen entlang des Mittels zur zentrierten Lagerung und des Strömungskanals ist insbesondere bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Analyse von geringen Probenmengen von Vorteil. Denn durch diese Vertiefung wird es ermöglicht, dass die Probenflüssigkeit entlang dieser Vertiefung in den Probenbehälter fließen kann. Weiters ist eine derartige Vertiefung vorteilhaft, wenn innerhalb der Probenvorrichtung beispielsweise eine Erhebung zum Lagern des Rotors vorgesehen ist und auf dieser Erhebung das dazu komplementäre Mittel am Rotor, in seiner Funktion als Strömungskanal des Rotors anliegt. Ohne eine derartige Vertiefung würde diese Erhebung ein Einfließen der Probenflüssigkeit oder sonstigen Flüssigkeiten in den Probenbehälter erschweren bzw. verhindern. Erfindungsgemäß kann das Aufnahmemittel bzw. der Strömungskanal mindestens eine aber auch mehrere derartige Vertiefungen aufweisen (z.B. mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens zehn) .
Im unteren Bereich des Rotors ist vorzugsweise mindestens eine Ausnehmung vorgesehen, die einen Flüssigkeitsdurchtritt vom Aufnahmemittel bzw. Strömungskanal des Rotors in den Probenraum (radialer Spalt zwischen Rotor und Probenbehälter) bei gänzlich in den Probenbehälter eingebrachtem Rotor ermöglicht. Diese Ausnehmung ist vorzusgweise Teil der mindestens einen Vertiefung im Strömungskanal des Rotors.
Für einige chemische Nachweisverfahren und biochemische Umsetzungsreaktionen (wie z.B. "Polymerase chain reaction", "liga- se chain reaction", "primer extension", Nukleinsäureverdau mit thermostabilen Nukleasen) ist eine wiederholte Temperaturänderung der inkubierten Flüssigkeiten notwendig. Die Genauigkeit dieser Temperaturänderungen ist dabei von essentieller Bedeutung. Um die Flüssigkeit innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu regulieren, kann in der im Probenbehälter vorgesehenen Einbuchtung ein Thermoelement eingesetzt werden, wobei die Einbuchtung entsprechend ausgebildet sein muss, derartige Elemente aufzunehmen Dieses Thermoelement besteht vorzugsweise aus einem Kühlsystem (z.B. Peltierelement) und einem Heizsystem (z.B. Infrarotstrahler, Mikrowellenstrahler oder Peltierelement) . Das Thermoelement kann dabei vorzugsweise der-
art ausgeführt werden, dass es die Positionierung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Messvorrichtung oder in einer Kartusche ermöglicht. Die Einbuchtung ist somit vorzugsweise zur Aufnahme einer Kühl- und/oder Heizvorrichtung ausgebildet. Der Vorteil einer derartigen Ausführungsform besteht ferner darin, dass neben der Regulierung der Temperatur der Probenflüssigkeit auch die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. der Probenbehälter positioniert werden kann. Die Temperaturregulierung kann selbstverständlich auch über die Seitenwand oder den Boden des Probenbehälters erfolgen (siehe beispielsweise WO 03/100401) .
Die Einbuchtung weist vorzugsweise Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Probenbehälter und/oder Mittel zur Fixierung/Positionierung des Probenbehälters auf.
Derartige Mittel zur Fixierung des Probenbehälters bzw. zur Übertragung eines Drehmoments an den Probenbehälterist vorzugsweise ein in der Einbuchtung vorgesehener axial zum Rotor befindlicher Längskörper (z.B. Zapfen oder Bolzen), wobei zwischen dem Längskörper und der Außenseite der Einbuchtung ein radialer Spalt vorgesehen ist. Dieser Längskörper kann in einem entsprechenden komplementären Teil (z.B. Vertiefung, Greifvorrichtung) in eine weitere Vorrichtung eingebracht werden, die die erfindungsgemäße Vorrichtung aufnehmen kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Drehmoment auf die Analysenvorrichtung nicht nur über den Deckel erfolgen, sondern es ist durchaus auch möglich den Deckel gemeinsam mit dem Rotor zu fixieren und den Probenbehälter selbst in Drehung zu versetzen. Dabei kann erfindungsgemäß ein Detektionssystem in den Probenbehälter eingearbeitet sein bzw. kann das Aufnahmeelement (z.B. das Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors im Probenbehälter) des Behälters ein Detektionssystem beinhalten. Selbstverständlich ist es auch möglich den Rotor selbst mit einem Detektionssystem zu versehen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel zur zentrierten Lagerung ein Magnetlager, wobei das Magnetlager vorzugsweise dargestellt ist, dass am Rotor und gegebenenfalls am Probenbehälter Magneten vorgesehen sind.
Magnetlager ermöglichen die Lagerung des Rotors im Probenbehälter im Wesentlichen ohne Materialkontakt mittels Magnetkraft. Dabei kann ein erster Magnet am Rotor vorgesehen sein, und der zweite Magnet am Probenbehälter oder in einer weiteren Vorrich-
tung (z.B. in der die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Messung eingebracht wird) oder Halterung vorgesehen sein. Die am Rotor befindlichen Magneten sind vorzugsweise ringförmig am Rotorboden oder dessen Nähe angebracht. Die im Rotor verwendeten Magneten sind vorzugsweise Permanentmagnete und die im Probenbehälter bzw. in der weiteren Vorrichtung vorgesehenen Magneten können nicht nur Permanentmagneten sondern auch Elektromagnete sein.
Um die im Probenbehälter von statten gehenden Bindungsreaktionen zu messen bzw. zu detektieren, ist der Probenbehälter vorzugsweise zumindest teilweise transparent.
Die Detektion der sich ausbildenden Wechselwirkungen zwischen den Bindungspartnern und den zu bindenden Liganden innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Das am häufigsten benutzte Prinzip der Bestimmung derartiger Wechselwirkungen ist die Messung von elektromagnetischen Wellen insbesondere von Fluoreszenz, Chemolumines- zenz, Biolumineszenz, Fluoreszenz Resonanzenergietransfer (FRET), die durch Bindung entsprechender Markermoleküle (z.B. markierte Bindungspartner) an die am Rotor mittels Bindungspartnern immobilisierten Liganden erzeugt werden. Es soll dabei auch möglich sein Wechselwirkungen zwischen Bindungspartnern und in der Probenflüssigkeit befindlichen Liganden kontinuierlich zu messen. Bei den am Probenbehälter durchgeführten Messungen ist es wichtig, dass der Inkubationsprozess selbst durch die Messung nicht gestört wird und auch bei aufeinander folgenden Schritten unterschiedlicher Art keine Unterbrechung des Messvorgangs (z.B. durch Lösungsmittelaustausch, Temperaturänderung) auftreten darf.
Soll die Detektion von Molekülen auf der Oberfläche des Rotors mit Hilfe von Fluoreszenz erfolgen, ist es von Vorteil, wenn die zu detektierenden Moleküle oder die mit den zu detek- tierenden Molekülen in Konkurrenz stehen mit einer entsprechenden Substanz markiert sind (z.B. mit einem Fluorophor oder einem Quencher bzw. Molekülgruppen, die mit elektromagnetischen Wellen interferieren). Wird z.B. ein DNA-Molekül eingesetzt, so kann dieses direkt durch Einbau von Fluorophor markierten Nukleotiden erfolgen. Andererseits besteht auch die Möglichkeit, falls die Detektion indirekt über weitere sekundäre Bindungspartner erfolgen soll, die Moleküle mit Markern, wie z.B. Biotin, Digoxigenin (DIG), zu markieren.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich vorzugsweise zur Messung von Chemolumineszenz-Reaktionen, bei der die Lichtemission eines durch ein entsprechendes Enzym (z.B. Peroxidase) löslichen Substrats gemessen wird. Die Detektion einer derartigen Umsetzung kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen. Beispielsweise können so genannte CCD („Charge Coupled Device") -Kameras eingesetzt werden, wie diese in der US 5 173 748, WO 03/014400 beschrieben sind. Die Messung kann beispielsweise unter Einsatz des sog. TDI-Modus ("Time Delayed Integration") erfolgen. Dieser Modus verlangt eine Synchronisation der Auslesegeschwindigkeit des verwendeten CCD und der Bewegung des zu beobachtenden Objekts (z.B. Microarray, Biochip oder Rotor der erfindungsgemäßen Vorrichtung) (s. WO 03/014400). Gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der die Bindungspartner vorzugsweise an der Rotoroberfläche gekoppelt sind, werden diese über die Rotationsgeschwindigkeit als scheinbare Lateralbewegung synchronisiert am Messsystem vorbeigedreht. Alternativ zu CCD-Kameras können Photomultiplier-Arrays (z.B. PMT ("photo multiplier tube") , APD („avalanche photo diode") ) eingesetzt werden.
Neben dem oben beschriebenen optischen Messsystem mit Linsen können erfindungsgemäß auch optische Sensoren ohne Linsen eingesetzt werden. Das Messsystem (z.B. Photodioden-Array) kann in dieser Ausführungsform als Kombination mit dem Probenbehälter als Einwegprodukt konzipiert oder ein fixer Bestandteil des am Probenbehälter befindlichen Heizsystems sein. Da der Rotor (Bindungspartner-Träger) und somit auch der Probenbehälter vorzugsweise eine zylindrische Form aufweisen, kommt der Anforderung einer gekrümmten Ausführung des Photonensensors eine besondere Bedeutung zu. Dazu sind insbesondere amorphe Silizium-Dioden oder photosensitive Polymerschichten, wie diese beispielsweise in der WO 03/015189 und WO 01/84644 beschrieben sind, geeignet. Die Verwendung von Silizium-Photodioden in räumlicher Nähe zur Probenbehälteroberfläche ist vor allem für den Einsatz von Che- molumineszenz-Detektionsverfahren von Vorteil, da diese ohne eine zusätzliche Lichtquelle zur Anregung der Lichtemission für die Detektion der erfolgten Wechselwirkungen zwischen Bindungspartner und Liganden in der Probenflüssigkeit eingesetzt werden können. Eine weitere Möglichkeit ist beispielsweise der Einsatz von Lichtquellen, beispielsweise im Inneren einer Einbuchtung, die in den Probenbehälter ragt. Die Art der Lichtquelle kann
hierbei eine direkte, d.h. eine Einheit mit dem Träger darstellen, oder eine externe Lichtquelle sein, die zur Ausleuchtung bzw. Anregung von Markermolekülen in der Probenflüssigkeit herangezogen wird. Ferner können so genannte „Light Emitting Phot- sensitve Dioden" verwendet werden. In dieser Ausführungsform kommt eine Kombination von Beleuchtung und Detektion zum Tragen. Der Vorteil gegenüber herkömmlichen Messsystemen ist der völlige Wegfall von externe Lichtquellen, optischen Bestandteilen und externen Detektionssystemen, wie beispielsweise CCD-Kameras. Die räumliche Anordnung des Messsystems in der Vorrichtung würde sich entsprechend ändern. Die Dioden werden dabei vorzugsweise so nahe wie möglich am Probenbehälter positioniert. Die Detektion erfolgt dabei ohne optische Linsen und andere Systeme direkt durch das Auftreffen der Photonen in unmittelbarer Nähe des Entstehungsorts .
Vorzugsweise werden die Detektionssysteme, die in der US 2002/177144, WO 00/79326, WO 00/62549, WO 00/25113, WO 00/12759, WO 97/12030, US 5,585,639, US 2002/066865 und EP 0 947 824 beschrieben sind, für die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet.
Die Aufgabe des kontinuierlichen bzw. schrittweisen (nach Änderung von Zeit, Flüssigkeit oder Temperatur) optischen Dar- stellens einer Manteloberfläche durch einen Flüssigkeitsfilm hindurch, der wiederum durch die Befüllung des radialen Ringspalts (s. vorliegende Erfindung und z.B. WO 03100401 Al) erzeugt wird, wird erfindungsgemäß so gelöst, dass die Beobachtung (vorzugsweise die Messung von elektromagnetischer Strahlung ausgesendet von der Oberfläche der besagten Mantelfläche) durch einen transparenten Behälter erfolgt, wobei das Messsystem beispielsweise aus einer CCD Camera oder einer APD (avalanche photo diode) oder einem vergleichbaren Detektionssystem besteht, das im Wesentlich normal auf die Mantelfläche ausgerichtet ist und eine Streifenfläche besagter Mantelfläche abbildet. Das Messsystem ist mit der Rotationseinheit derart verbunden, dass die Rotationsgeschwindigkeit und die Belichtungszeit aufeinander abgestimmt werden können. Die so synchronisierte Darstellung kann gegebenenfalls in die Verwendung des so genannten TDI Modes einfließen. Dabei ist die schrittweise Rotation zeitlich mit der Integrationszeit des CCD Chips synchronisiert. Das Ergebnis ist die zeilenabhängige Addition der Signalstärke.
Dem Messsystem kann zusätzlich eine Beleuchtungseinheit zugehören, das vorzugsweise aus einem opto-semiconductor (LED) und alternativ aus zumindest einem Laser, einer Weißlichtlampe, einer Gasentladungslampe, UV- oder IR-Lampe besteht. Dem Messsystem kann weiters ein Linsensystem, bestehend aus zumindest einer Sammellinse, zumindest einem Filterset und/oder einem Infrarot- Filter zugeordnet werden.
Der Vorteil derartiger Vorrichtungen liegt im jederzeitigen Messen ohne die Reaktionsbedingungen zu ändern, eine Unterbrechung bzw. ein Öffnen des Inkubationsraums zu bedingen.
Der Probenbehälter kann erfindungsgemäß zur Gänze aus einem für eine beispielsweise photometrische Messung geeigneten und transparenten Material bestehen oder nur teilweise (z.B. Vorsehen von Sichtfenstern) .
Dieses Sichtfenster (oder der Bereich in dem die Analyseneinrichtung misst) , kann zur Optimierung der optischen Eigenschaften die Form einer Linse (oder von Linsenstrukturen) annehmen. Dadurch kann eine Fokusierung des ein- und ausfallenden Lichts und damit eine erhöhte Ausbeute des Messsignals erreicht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Strömungskanal des Rotors axial angeordnet.
Um in den Probenbehälter Proben- bzw. Wasch- und Inkubationslösungen einzubringen, weist der Rotor einen Strömungskanal auf, durch den von außen in die Vorrichtung Flüssigkeiten eingeführt werden können. Dabei ist der Strömungskanal vorzugsweise axial am Rotor angeordnet. Es ist selbstverständlich auch möglich den Strömungskanal mit einem beliebigen Verlauf und beliebige Verzweigungen innerhalb des Rotors und einem beliebigen Austrittsort in den Probenbehälter vorzusehen. Im unteren Bereich des Rotors ist vorzugsweise weiter eine Austrittsöffnung vorgesehen.
Vorzugsweise ist der Durchmesser des Strömungskanals des Rotors im Bereich des Probenbehälterbodens größer als im Bereich der Probenbehälteröffnung.
Der Durchmesser des Strömungskanals des Rotors kann sich in Richtung des Probenbehälterbodens vergrößern (z.B. linear oder stufenförmig) . Eine lineare bzw. stufenförmige Vergrößerung kann die Lagerfläche entsprechend vergrößern, wodurch die konzentrische Lagerung und folglich die Messgenauigkeit verbessert werden
kann. Weiters ermöglicht die Vergrößerung des Durchmessers des Strömungskanals von anfänglich z.B. 1-2 mm auf 10-15 mm die Einbringung, wie beispielsweise oben beschrieben, eines Heiz- und/oder Kühlsystems in das Lagerungsmittel des Probenbehälters. Die verringerte Wandstärke des Rotors reduziert einerseits den Materialaufwand und kann andererseits das Herstellungsverfahren vereinfachen und verbessern (z.B. Spritzgussverfahren: bessere Einspritzung und schnellere Auskühlung) .
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Deckel abnehmbar angeordnet .
Erfindungsgemäß kann der Deckel am Rotor abnehmbar aufgebracht sein, wodurch es beispielsweise ermöglicht wird, den Deckel wiederzuverwenden. Selbstverständlich ist es aber durchwegs möglich und auch im Sinne der Erfindung den Deckel am Rotor fixiert vorzusehen bzw. den Rotor und den Deckel einstückig zur Verfügung zu stellen.
Der Deckel weist vorzugsweise einen zum Strömungskanal des Rotors seriell angeordneten und damit verbundenen Strömungskanal auf.
Nach der Befüllung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenflüssigkeit oder sonstigen Flüssigkeiten kann die Vorrichtung mittels eines Deckels, der auf den Rotor aufgebracht wird, verschlossen werden. Um diesen Vorgang zu vereinfachen und effizienter zu gestalten und um weiters das Kontaminationsrisiko noch mehr zu reduzieren, weist der Deckel des Rotors selbst einen Strömungskanal auf, der mit dem Strömungskanal des Rotors in Verbindung steht. Dadurch wird es ermöglicht die Vorrichtung samt Rotor und Deckel zunächst vorzubereiten und anschließend die in die Vorrichtung einzubringenden Flüssigkeiten direkt durch den Deckel hindurch in die Vorrichtung einzubringen. Das Vorsehen eines Strömungskanals im Deckel ist insbesondere bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Durchflusszelle von Vorteil.
Vorzugsweise weist der Strömungskanal des Deckels einen geringeren Durchmesser auf als der Strömungskanal des Rotors.
Durch eine derartige Durchmesserverringerung des axialen Strömungskanals (Rotor und Deckel) kombiniert mit einer druckdichten Verbindung kann ein Rückfluss der Probenflüssigkeit in die Flüssigkeitsaufgabevorrichtung im Wesentlichen ausgeschlossen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Deckel randseitig eine Dichtlippe auf.
Um das Innere der Vorrichtung effizient abzudichten, weist der Deckel eine Dichtlippe auf. Diese Dichtlippe, die über den gesamten äußeren Rand des Deckels verläuft, verhindert das Austreten von Flüssigkeit über den radialen Spalt zwischen Rotor und Probenbehälter und dient zusätzlich als Gasbarriere, die den Kontakt von Probenflüssigkeit und z.B. Luftsauerstoff verhindern kann. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn Proben untersucht werden sollen, die auf Gase wie z.B. Sauerstoff, reagieren und somit das Messergebnis verfälschen können. Ferner ermöglicht das Vorsehen einer Dichtlippe am Deckel, dass eine gewisse Atmosphäre innerhalb der Vorrichtung vorgesehen werden kann. So kann beispielsweise Stickstoff in den Probenbehälter eingebracht werden, wodurch es ermöglicht wird, Analysen unter Schutzatmosphäre durchzuführen. Derartige Untersuchungen sind vor allem dann von Interesse, wenn es darum geht z.B. Sauerstoffempfindliche Proben zu analysieren. Somit weist der erfindungsgemäße Deckel, der auf einen erfindungsgemäßen Rotor aufgesetzt werden kann bzw. einstückig mit diesem hergestellt wird, vor allem Vorteile im Kontaminationsschutz, im Verdunstungsschutz und im Oxidationsschutz auf.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind am Deckel Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den mit dem Deckel verbundenen Rotor vorgesehen.
Um den Rotor im Probenbehälter radial zu bewegen, ist es notwendig ein Drehmoment entweder auf den Rotor selbst oder den Probenbehälter zu übertragen. Es hat sich gezeigt, dass es von Vorteil ist, diese Übertragung über den Rotor durchzuführen. Daher ist vorzugswise am Deckel ein Mittel zur Übertragung des von einer Drehmoment-erzeugenden Vorrichtung (z.B. Elektromotor (Schrittmotor, Gleichstrommotor, Wechselstrom-Synchronmotor, Wechselstrom-Asynchronmotor) , Verbrennungsmotoren, Gasturbinen, usw.) erzeugten Drehmoments an dem Rotor vorgesehen.
Das Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor ist vorzugsweise durch einen axial zum Rotor verlaufenden Längskörper gebildet.
Das Mittel, welches für die Übertragung des Drehmoments an den Rotor verantwortlich ist, kann unterschiedlich ausgebildet sein, wobei vorzugsweise das Mittel zur Übertragung ein Längs-
körper ist. Ein Längskörper weist den Vorteil auf, dass die Vorrichtung zur Erzeugung eines Drehmoments einen Angriffspunkt am Deckel erhält, wobei der Längskörper vorzugsweise einen eckige Form (n ist vorzugsweise ausgwählt aus 3, 4, 5, 6 oder 7) aufweist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es auch vorteilhaft, einen Längskörper vorzusehen, der axial (entlang des Langskörpers) verlaufende Erhebungen (zumindest eine Erhebung) aufweist, die als Angriffs- bzw. Befestigungspunkt für die Dreh- moment-erzeugende Vorrichtung dienen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der Rotor Befestigungsmittel zur Befestigung des Deckels auf.
Um den Deckel am Rotor sowohl axial als auch radial zu befestigen, weist der Rotor an seinem oberen Bereich ein Befestigungsmittel auf. Dabei kann das Befestigungsmittel entweder einstückig mit dem Rotor hergestellt sein oder das Befestigungsmittel ist am Rotor aufgebracht.
Die Befestigungsmittel sind vorzugsweise durch zumindest eine radial angeordnete Erhebung gebildet.
Um den Deckel am Rotor zu fixieren, hat sich herausgestellt, dass es von Vorteil ist, ein Befestigungsmittel in Form einer Erhebung am Rotor vorzusehen. Die Erhebung kann einen sich zum freien Ende hin verjüngenden Durchmesser aufweisen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Erhebung mit einer spiralförmigen Kerbe (Gewinde) , mit einer radialen Ausnehmung oder mit einem radialen Vorsprung versehen.
Entsprechend dazu weist der Deckel vorzugsweise eine Einbuchtung zur Aufnahme des Befestigungsmittels auf, wobei gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Einbuchtung selbst eine spiralförmige Kerbe (Gewinde) , einen radialen Vorsprung oder eine radiale Ausnehmung zum Fixieren des Befestigungsmittels des Rotors in der Einbuchtung des Deckels aufweist.
Es ist von Vorteil, wenn die Erhebung des Rotors, welche zur Fixierung des Deckels verwendet wird, eine spiralförmige Kerbe, eine radiale Ausnehmung oder einen radialen Vorsprung aufweist. Dadurch wird es in einfacher Weise ermöglicht einen Deckel mit einer Einbuchtung zur Aufnahme des Befestigungsmittels des Rotors vorzusehen, wobei die Einbuchtung das Gegenstück der Erhebung darstellt und somit ebenfalls eine spiralförmige Kerbe, eine radiale Ausnehmung oder einen radialen Vorsprung aufweist.
Durch das Vorsehen von spiralförmigen Kerben bzw. radialen Vorsprüngen und radialen Ausnehmungen kann der Deckel am Rotor vorzugsweise abnehmbar fixiert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es besonders bevorzugt, wenn der Deckel am Rotor durch eine Rastvorrichtung fixiert wird. Dabei rastet der Deckel, der Erhebungen bzw. Ausnehmungen an der Kontaktfläche zum Rotor aufweist, an diesem ein, da am Rotor entsprechende komplementäre Erhebungen bzw. Ausnehmungen ausgebildet sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am Rotor und/oder an der Innenseite des Probenbehälters mindestens ein Bindungspartner zum Binden von mindestens einem Liganden vorgesehen, wobei der mindestens eine Bindungspartner vorzugsweise ein Biomolekül, insbesondere ein Antikörper, Antigen, Hapten, Peptid, Polypeptide mit diversen prosthetischen Gruppen, Enzyme, Hormone, eine Nukleinsäure oder Derivate davon, wie Peptid-Nukleinsäuren, ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich vorrangig für die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, Nukleinsäuren und anderen biologischen Molekülen, wie z.B. Membranbestandteilen, Lipiden, Kohlenwasserstoffen und deren Derivate, Kohlenhydraten, Haptenen, Hormonen und synthetischen Wirkstoffen (z.B. Wachstumshemmer wie Antibiotika, Pestizide, Herbizide oder Fungizide, oder Inhibitoren bzw. Aktivatoren von biochemischen Stoffwechselreaktionen) , wobei mindestens einer der Bindungspartner an einer stationären Phase in kovalenter oder nicht ko- valenter Form, oder als Sandwich über einen allgemeinen molekularen Adapter gebunden ist und mit den zu analysierenden Probenbestandteilen über ein Flüssigkeitsleitsystem in Kontakt gebracht wird und deren Wechselwirkungen mittels einer Detektions- vorrichtung nachgewiesen werden. Art und Anzahl der in einer Probe nachgewiesenen Biomoleküle lassen beispielsweise eindeutige Rückschlüsse auf das Vorhandensein viraler, bakterieller, eu- karyotischer, insbesondere tierischer und menschlicher DNA, oder auf das Vorkommen unterschiedlicher Formen von Proteinen (Phosphorylierungen, Glykosylierungen) oder Nukleinsäuren (Methylie- rungen) oder auch Lipiden mit etwaigen Glykosylierungen zu.
Um mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung Proben zu analysieren und deren Inhaltsstoffe zu bestimmen bzw. um Liganden an den Rotor bzw. an die Innenseite des Probenbehälters zu binden und
zu isolieren, sind am Rotor bzw. am Probenbehälter entsprechende Bindungspartner immobilisiert. Die dabei verwendeten Bindungspartner werden entsprechend den zu bindenden Liganden ausgewählt. So können z.B. Biomoleküle, wie Antikörper, Nukleinsäuren, Zuckerketten, Lektine oder sonstige Proteine am Rotor immobilisiert werden, um Liganden (welche ebenfalls Bindungspartner darstellen) an die immobilisierten Bindungspartner zu binden. Alternativ dazu kann auch der Ligand an den Rotor bzw. Probenbehälter gebunden werden, so dass in diesem Fall der Ligand per definitionem (im Sinne der vorliegenden Erfindung) als Bindungspartner bezeichnet wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich nicht nur zum Nachweis von bestimmten Substanzen in einer Probe, sondern auch zur Umsetzung von Substanzen, wodurch sich beispielsweise Enzymkinetiken aufnehmen lassen. Weiters kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung von Enzymreaktion, wie z.B. DNA-Po- lymerase-Reaktionen („solid phase amplification", „arrayed primer extension" (APEX) ) , DNA-Ligase-Reaktionen, DNA-Methyltrans- ferasen-Reaktionen, Restriktionsendo- und exonuklease Reaktionen, Oxidoreduktasen-, Hydrolasen-, Ligasen-, Lyasen-, Isomera- sen-, Phosphatase-, Kinase-, Methylase- und Transferasereaktio- nen.
Der Rotor weist vorzugsweise mindestens einen nach außen gerichteten und/oder der Innenmantel des Probenbehälters mindestens einen nach innen gerichteten radialen Vorsprung als Abstandselement auf.
Durch das Vorsehen mindestens eines Abstandselements ist es möglich, einen Reaktionsraum zwischen Rotor und Probenbehälterwand zu schaffen, wobei dieser Reaktionsraum entsprechend dem Durchmesser des Rotors und des Abstandselements eine unterschiedliche Größe aufweisen kann. Ferner werden durch eine derartige Ausführungsform die vorzugsweise am Rotor gebundenen Bindungspartner vor mechanischer Reibung mit der Wand des Probenbehälters geschützt. Ein weiterer Vorteil eines derartigen Elements ist die verbesserte Führung des Rotors bei dessen radialer Bewegung im Probenbehälter ("Rotorführung") . In diesem Fall dient das Abstandselement als eine Art Führung. Erfindungsgemäß kann der Rotor mindestens ein, vorzugsweise mindestens zwei, noch bevorzugter mindestens drei, am meisten bevorzugt mindestens vier, insbesondere mindestens fünf, radial nach außen ge-
richtete Abstandselemente aufweisen. Vorzugsweise befindet sich mindestens ein radial nach außen gerichtetes Abstandselement am unteren und/oder oberen Bereich des Rotors.
Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass ein radialer Vorsprung, der auch durchgehend die Mantelfläche des Rotors umfassen kann, besonders gut geeignet ist, als Abstandselement verwendet zu werden. In einer derartigen Ausführungsform dient das Abstandselement auch dazu den Proben- bzw. Inkubationsraum zu begrenzen.
Der radiale Vorsprung weist vorzugsweise, insbesondere entlang der Vertiefung im Inneren des Strömungskanals, mindestens eine Ausnehmung auf.
Durch die Ausnehmung am radialen Vorsprung wird es ermöglicht, dass die durch den Strömungskanal eingebrachten Lösungen vom Inneren des Rotors nach außen in den Reaktionsraum zwischen Rotor und Probenbehälterwand fließen können. Die Ausnehmung kann auch dergestalt sein, dass der Durchmesser des radialen Vorsprungs reduziert wird.
Alternativ zur Vorsehung mindestens eines radialen Vorsprungs am Rotor, können erfindungsgemäß auch an der Innenseite des Probenbehälters radiale Vorsprünge vorgesehen sein. Im Grunde erfüllen die Vorsprünge am Probenbehälter dieselbe Aufgabe wie die radialen Vorsprünge am Rotor. Sind an der Innenseite des Probenbehälters Bindungspartner immobilisiert, sind die radialen Vorsprünge vorzugsweise am Probenbehälter vorgesehen. Die Vorsprünge können auch als "Luftblasenschieber" dienen, die etwaig entstandene oder eingebrachte Luftblasen oder Schmutzpartikel von den Vorsprüngen mitnehmen können. Die Folge ist eine Entfernung nach oben oder unten oder eine gleichmäßige Belastung der gesamten Fläche und nicht nur eines Areals, wie dies bei plana- ren Trägern der Fall ist.
Um einen Flüssigkeitsaustausch innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu ermöglichen, weist der radiale Vorsprung des Probenbehälters mindestens eine Vertiefung, insbesondere eine Öffnung, auf.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Probenbehälter Mittel zu dessen radialen Fixierung in einer Kartusche auf.
Um den Probenbehälter radial in einer Vorrichtungshalterung eines Analysengeräts bei Rotation des im Probenbehälter befind-
liehen Rotors oder in einer Kartusche (z.B. zum Transport) zu fixieren, kann am Probenbehälter, zu dessen radialer Fixierung, ein Mittel vorgesehen sein. Das Mittel zur radialen Fixierung des Probenbehälters in der Halterung oder Kartusche ist vorzugsweise mindestens ein am Probehälterboden vorgesehener Vorsprung, insbesondere eine Noppe. Das Vorsehen eines Vorsprungs am Probenbehälterboden ermöglicht in einfacher Weise die Fixierung des Probenbehälters in einer Kartusche bzw. Vorrichtungshalterung, wenn diese entsprechende Mittel aufweisen, die diesen Vorsprung aufnehmen können. Die erfindungsgemäße Kartusche, die Teil einer Messvorrichtung sein oder nicht sein kann, dient somit zur Aufnahme der erfindungsgemäßen Analysenvorrichtung (Probenbehälter, Rotor und Deckel) . Die Kartusche ist somit eine Transport- und/oder Lagerungseinheit für die Analysenvorrichtung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rotor, der Probenbehälter und/oder Deckel aus einem Kunststoff gebildet, wobei dieser bevorzugt ein Cyclo-Ole- fin-Copolymer, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Acetatpo- lymer, Acrylnitril Butadienstyrol, Polymethylmetacrylat, PVC, Polyethylenterephthalat, Polytetrafluorethylen oder eine Kombination davon ist. Selbstverständlich ist es möglich, alle oder bestimmte Teile der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Kunststoff aber auch anderen Materialien wie Metallen (z.B. Stahl) und Keramik auszugestalten. Als besonders geeignet haben sich thermoplastische Kunststoffe wie Cyclo-Olefin-Copolymere erwiesen. Die Besonderheit von Cyclo-Olefin-Copolymeren liegt in der Tatsache, dass diese einen geringen Ausdehnungskoeffizienten, hohe chemische Beständigkeit, gute optische Eigenschaften (geringe Fluoreszenz, hohe Transparenz) und besonders gute Formbarkeit (z.B. beim Spritzguss) aufweisen.
Die Oberfläche des Rotors ist vorzugsweise mit einem Metall, vorzugsweise einem Halbleitermetall, einem Polymer, Silizium oder einer Siliziumverbindung mit Kohlenstoff, vorzugsweise mit Graphit, DLC (diamond-like-carbon) oder Diamant, oder eine Kombination davon beschichtet, wobei das Metall vorzugsweise Gold, Palladium, Silber oder eine Kombination davon und die Siliziumverbindung Siliziumdioxid ist. Derartige Modifikationen ermöglichen die Oberflächendefinierung mit z.B. Biomolekülen (siehe z.B. „Bioconjugate Techniques", G. T. Hermanson (1996), Academic Press Inc., ISBN 0123423368). Gold oder ähnliche Metallbeschich-
tungen können mit PVD (physikalische Gasphasenabscheidung oder physical vapour deposition) erzeugt oder mittels Kathodenzerstäubung (Sputtern) oder PLD (Pulsed laser deposition) auf eine Oberfläche aufgebracht werden.
Gelöste kathalytische Si-Oxid Partikel härten zu einer Glasschicht über der KunststoffOberfläche aus (sog. SoIGeI Technologie) .
Chemische Modifizierung durch Einbringen von chemisch reaktiven Gruppen, Epoxy, Aldehyde oder Plasmabehandlung zur Aktivierung der Oberflächenschicht des Kunststoffs und Einbringen von reaktiven chemischen Gruppen (Amino-, Hydroxy-, Epoxy-, Aldehyd-, Carboxy-Gruppen) sind bevorzugte Verfahren zur Oberflä- chenbeschichtung bzw. -modifizierung.
Bevorzugt werden Moleküle über Schwefelverbindungen (Au-S-R) in Kombination mit einer zweiten reaktiven Gruppe als Rest, bevorzugt ein NHS Ester oder Maleimide oder ähnlich reaktive Gruppen, an die Oberfläche gebunden. Die entsprechende Modifikation der Oberfläche geschieht über einen chemischen Tauchprozess in einer DMSO Lösung mit gelöstem Reagent. Danach wird mit Wasser oder apolarem Lösungsmittel gewaschen, MeOH oder Aceton oder bevorzugt mit Isopropanol. Nach der Trockung werden die biologischen Bindungspartner (z.B. Antikörper, Proteine, Peptide, modifizierte DNA, oder allgemein organische Moleküle, die selbst reaktive Gruppen für die kovalente Immobilisierung tragen) an die Oberfläche gebunden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kartusche zur Aufnahme einer erfindungsgemäßen Analysen-Vorrichtung, wobei die Kartusche eine Öffnung zum Einbringen des Probenbehälters und eine mit einer Ausnehmung versehene Seitenbegrenzung aufweist, wobei die Ausnehmung zur axialen Fixierung des Rotors ausgebildet ist.
Die Verwendung einer Kartusche weist vor allem beim automatisierten Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung entscheidende Vorteile auf. So kann eine Kartusche dazu dienen, den Probenbehälter samt Rotor und Deckel vor mechanischer Beanspruchung zu schützen und gleichzeitig als Verpackung dienen. Ferner kann die Kartusche derart ausgebildet werden, dass sie für die automatische Befüllung, z.B. über ein Magazin mit mehreren Kartuschen, und eine eindeutige Positionierung in einer Vorrichtung, in der die erfindungsgemäße Vorrichtung eingesetzt werden kann, zu po-
sitionieren (z.B. mittels eines Greifarms) .
Die Kartusche weist vorzugsweise auch eine mit einer Ausnehmung versehenen Seitenbegrenzung auf, wobei die Ausnehmung derart ausgebildet ist, den oberen Bereich des Rotors oder das am Deckel vorgesehene Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor aufzunehmen und radial unbewegbar zu lagern.
Die in der Kartusche mit einer Ausnehmung versehene Seitenbegrenzung weist den Vorteil auf, dass diese Ausnehmung entweder den oberen Bereich des Rotors aufnehmen kann und der Deckel sich somit oberhalb der Seitenbegrenzung befindet, oder dass diese Ausnehmung das am Deckel vorgesehene Mittel zur Übertragung des Drehmoments aufnehmen kann, ohne jedoch die radial bewegbare Lagerung zu stören. Dadurch wird es ermöglicht den Rotor in unterschiedlichen Positionen innerhalb des Probenbehälters vorzusehen. Eine derartige Positionierung ist beispielsweise bei einer idealen Inkubation von Vorteil. Für eine Inkubation von bestimmten Proben kann die Probenflüssigkeit vor der Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung (z.B. zur Hybridisierung) auf eine bestimmte Temperatur gebracht werden oder es erfolgt noch ein Probenaufbereitungsschritt, der durch Temperaturunterschiede bewerkstelligt wird (z.B. PCR). Zu diesem Zeitpunkt darf noch kein Kontakt mit den Bindungspartnern an der Rotoroberfläche stattfinden. Dies wird dadurch bewirkt, dass der erfindungsgemäße Rotor noch nicht vollständig in den Probenbehälter, in dem sich die Probenflüssigkeit befindet, eingetaucht wird. Die Seitenbegrenzung der Kartusche (als horizontale Platte) ist vorzugsweise über die ganze Tiefe mit einer Ausnehmung versehen, die sich an den Kanten derart verjüngt, dass die radiale Nut des Rotors mit etwas Druck und einer vorgesehene Verengung eingelegt werden kann. Durch die mit der Ausnehmung versehenen Seitenbegrenzung (Platte) ist es möglich, wie bereits oben erwähnt, den Rotor in seinen relativen axialen Positionen zum Probenbehälter zu fixieren und ein Absinken des Rotors in den Probenbehälter zu verhindern und somit einen beispielsweise für die Vorinkubation nötigen Raum zu definieren. Eine derartige Position ist auch beim Transport der Vorrichtung von Vorteil.
Die der mit der Ausnehmung versehenen Seitenbegrenzung gegenüberliegende Begrenzung (Boden der Kartusche) weist vorzugsweise eine Vertiefung zur Aufnahme des Mittels zur radialen Fixierung des Probenbehälters in der Kartusche auf.
Mit dieser Ausnehmung/Vertiefung, die im Wesentlichen zu den am Probenbehälterboden vorgesehenen Mitteln zur radialen Fixierung komplementär ist, wird die radiale Bewegung des Probebehälters verhindert. Alternativ kann die Vertiefung als Führungsschiene ausgebildet sein, die die Aufnahme der Mittel zur radialen Fixierung des Probenbehälters ermöglicht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Rotor für eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Probenbehälter für eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Analyse von Proben, umfassend:
- einen erfindungsgemäßen Rotor,
- einen erfindungsgemäßen Probenbehälter, gegebenenfalls
- einen erfindungsgemäßen Deckel und gegebenenfalls
- eine erfindungsgemäße Kartusche.
Das erfindungsgemäße Set eignet sich besonders gut zur Analyse von Proben, d.h. zur Bestimmung von Liganden in Proben, bzw. zur Durchführung von chemischen und biochemischen Reaktionen im Inneren der erfindungsgemäßen Vorrichtungen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Durchflusszelle zur Analyse von Proben umfassend:
- einen erfindungsgemäßen Rotor,
- einen erfindungsgemäßen Probenbehälter, gegebenenfalls
- einen erfindungsgemäßen Deckel und gegebenenfalls
- eine erfindungsgemäße Kartusche.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen eigen sich auch besonders gut zur Verwendung als Durchflusszellen. Durchflusszellen finden in vielen Bereichen der Analytik Anwendung. Insbesondere eignen sich Durchflusszellen dann, wenn es im Zuge einer Analyse zu einem mehrmaligen Wechsel der Probenflüssigkeiten, Inkubationsflüssigkeiten, Waschflüssigkeiten und Detektionsflüssigkeiten kommt.
Bei dieser Vorrichtung dient der Strömungskanal des Rotors als Einströmungsort, der sich am oberen Ende des erfindungsgemäßen Rotors befindet. Der Ausströmungsort hingegen, an dem die in dem Probenbehälter befindlichen Flüssigkeiten aus demselben entfernt werden können, kann am Probenbehälter oder am Deckel vorgesehen sein. Die Durchflussmesszelle selbst wird, wie auch die Messzelle einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die nicht als
Durchflusszelle adaptiert ist, durch den Ringspalt zwischen dem Rotor und dem Probenbehälter definiert. In einer derartigen Ausführungsform ist es durchaus möglich, auf den erfindungsgemäßen Deckel zu verzichten. Eine erfindungsgemäße Durchflusszelle kann beispielsweise zur Untersuchung von größeren Mengen an Probenflüssigkeit wie z.B. Wasser oder sonstigen Proben (z.B. Abwasser, Zellkulturüberstände) verwendet werden, die durch die Durchflussmesszelle bewegt wird und dadurch in Kontakt mit den vorzugsweise am Rotor aufgebrachten Bindungspartnern gebracht wird. Die Messung kann dabei in Echtzeit erfolgen, d.h. während dem Durchfließen der Probenflüssigkeit durch die Durchflusszelle wird die Probe durch Detektion der Bindung zwischen der zu de- tektierenden Substanz und dessen Bindungspartner, welcher in der Vorrichtung immobilisiert ist, untersucht. Ein weiteres Einsatzgebiet der erfindungsgemäßen Durchflusszelle ist der Durchfluss von Kulturmedium durch diese Zelle, um auf dem Rotor wachsende Zellen mit Nährstoffen zu versorgen und ihre Reaktion auf Änderungen im Kulturmedium zu beobachten und die Zellen gegebenenfalls zu analysieren, zu fixieren und zu färben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am Rotor, vorzugsweise in einem Abstandselement, oder im Deckel, vorzugsweise der Dichtlippe benachbart, oder am Probenbehälter mindestens eine Öffnung für den Austritt von Flüssigkeit vorgesehen.
Durch das Bereitstellen weiterer Öffnungen in der Vorrichtung kann die durch den Strömungskanal eingebrachte Flüssigkeit effizient aus der Vorrichtung entfernt werden. Es ist somit nicht notwendig den Strömungskanal sowohl für das Einbringen als auch für das Entfernen von Flüssigkeiten in bzw. aus dem Probenbehälter zu gebrauchen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann für zahlreiche Verwendungen, Verfahren und Methoden eingesetzt werden. Diese Verwendungen umfassen die Detektion von Substanzen in einer Probe, die Durchführung von enzymatischen Reaktionen in der Vorrichtung (z.B. Amplifikationen von Nukleinsäuren) usw.. Ein spezielles Verfahren für das sich die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung insbesondere eignet ist der Nachweis von Substanzen im Speichel .
Ziel einer derartigen Methode ist der Nachweis von z.B. unerlaubten Substanzen (Drogen) im Speichel. Dabei erfolgt zu-
nächst eine Speichelabnahme in eine Entnahmeflüssigkeit. Der abgenommene Speichel erfährt dabei keinerlei Aufreinigung (Filtration, Zentrifugation oder ähnliche Verfahren) . Die so gewonnene speichelenthaltende Flüssigkeit wird direkt in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt. Dabei werden vorzugsweise folgende Schritte durchgeführt, wobei selbstverständlich die Anzahl nach Art der Schritte variiert werden kann.
• Bereitstellen des Antikörpers gegen die gesuchte Substanz (z.B. Antigen) (oder eines markierten Antigens) o Z.B. in getrockneter Form nach Aufsprühung auf die Innenfläche des Probenbehälters
• Lösen des Antikörpers (oder des markierten Antigens) in der zugeführten Speichelentnahmelösung
• Durch Rotation der Flüssigkeit in der Vorrichtung wird der aufgesprühte Antikörper gelöst
• Inkubation des Gemisches o Dabei reagieren die Anti-Drogen Antikörper mit den im Speichel befindlichen Drogen (soweit vorhanden) und sättigen einen Teil des Antikörpers ab.
• Inkubation mit dem erfindungsgemäßen Rotor o Die noch nicht abgesättigten Antikörper binden nach ihrer Spezifität an die arraymäßig aufgetragenen Antigene am Rotor (Zylinder, Träger) .
• Waschen o Entfernen der nicht am Array gebundenen Antikörper und Speichelflüssigkeiten durch Austausch der Flüssigkeiten (Waschlösung) im Reaktionsraum der erfindungsgemäßen Vorrichtung
• Scannen o Die gebundenen Antikörper können über ihre Fluores- zenzmarkierung detektiert werden. Die aufgefangene Lichtintensität ist linear proportional der Menge an Fluorophore und somit proportional der Menge an gebundenen Antikörpern. Eine quantitative Aussage über die Menge an Kompetitoren (Drogen) ist somit möglich. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass unauf- gereinigter (d.h. nicht zentrifugierter und filtrierter) Speichel in Kombinaiton mit den am Rotor befindlichen Microarrays direkt eingesetzt werden können. Vorteilhaft ist, dass somit Aufreinigungsschritte entfallen und dadurch ein mobiler Einsatz
(z.B. bei Verkehrskontrollen, direkt in der Krankenstation) möglich ist, da mobile Zentrifugen mit der erforderlichen G-Zahl (von mehr als 2000g) kaum realisierbar sind.
Aufgrund der gleichmäßigen Durchmischung (Temperatur, Konzentrationen, Störeinflüsse) in der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Variation der Messergebnisse innerhalb der Vorrichtung minimiert werden (ca. 2-7%).
Durch das Vorsehen von Erhöhungen bzw. Erhebungen vorzugsweise am Rotor können Schleim- und Schwebstoffe durch die Drehbewegung in die gleiche Richtung in den Bereichen der Rotorbzw. Probenbehälter-Oberfläche gesammelt werden, die nicht mit Detektormolekülen bestückt sind.
Das Vorsehen eines zentralen Kanals ermöglicht es Probenflüssigkeit durch Waschlösung zu wechseln (z.B. Absaugung über den Deckel) , ohne dass dabei die Detektormoleküle „trocken" werden und ohne dass sich die Temperatur sprunghaft ändert (Lösungen weisen im Wesentlichen die selbe Temperatur auf wie die in der Vorrichtung befindliche Flüssigkeit) . Dadurch können möglichst konstante Verhältnisse auch zwischen einzelnen erfindungsgemäßen Vorrichtungen und damit geringe Variationen zwischen einzelnen Vorrichtungen erzielt werden (unter 10%) .
Mit einem weiteren Verfahren mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der Nachweis von Nukleinsäuren (DNA, RNA) in einer Probe erfolgen. Die Probe wird nach der Entnahme (z.B. Blut) vorbehandelt und die Nukleinsäure vorgereinigt. Der Nachweis erfolgt über die Fluoreszenzintensitätsmessung des Arrays auf dem Träger (Rotor) . Das Signal stammt von Fluorophoren, die in ad- sorbtiven oder auch kovalenten Kontakt mit den immobilisierten Molekülen des Rotorarrays stehen. Dabei kommen zwei Signalgene- rierungsmethoden zum Einsatz:
1. Nukleinsäure Interkalatoren (Sybr Green, Boxto, Ethidium- bromid)
2. Fluoreszenz Enegrie Transfer (auf Quenching Farbstoffe, bzw. andere Fluorophore)
Beiden Methoden ist gemeinsam, dass sie eine enzymatische Reaktion benötigen um eine detektierbare Messgröße zu erreichen.
Im ersten Anwendungsfall wird dies die DNA abhängige DNA Polymerase (vorzugsweise Taq Polymerase) sein. Der Vorgang wird allgemein als Solid Phase PCR (Polymerase Chain Reaction) bzw. Solid Phase Amplification bezeichnet. Der gesamte Vorgang einer
Analyse ist dabei folgendermaßen angedacht (Beispiel Infektionsdiagnostik; Erreger-spezifische DNA-Primer werden auf die Rotoroberfläche als Array gespotted) ) :
1. Die Probe (z.B. Blut) wird dem Patienten entnommen.
2. Die DNA der Probe (n) wird entsprechend präpariert.
3. Ein Teil dieser Präparation wird für die Ursachendiagnose verwendet und gemeinsam mit dem Enzym für die Polymerase und sonst notwendigen Reagenzien (z.B. Buffer, etc.) in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingefüllt.
4. Die Probe wird denaturiert (940C), dabei trennen sich die Doppelstränge in DNA-Einzelstränge auf.
5. Die Probe wird anschließend abgekühlt (Annealing Temperatur 7O0C). Auf der Rotoroberfläche bilden sich mit den immobilisierten Primern Doppelstränge auf jedem Spot aus (CIS-PCR) .
6. Die Vorrichtung wird bei 720C gedreht und inkubiert: dabei erfolgt die Polymerisation (Kettenverlängerung) der Primer aufgrund der hybridisierten DNA-Probenmoleküle.
7. Die Probe wird neuerlich denaturiert (940C), die Doppelstränge trennen sich wieder auf.
8. Beim neuerlichen Abkühlen auf die Annealing Temperatur (7O0C) bilden sich mit den durch den Schritt 5 und 6 verlängerten Primern Doppelstränge mit in der Nachbarschaft ^gleicher Spot) liegenden zweiten Primern (die sich vom ersten Primer in der Art unterscheiden, dass sie in der DNA-Sequenz gegenläufig sind und somit eine Sequenz umfassen, die als Ampli- kon bezeichnet wird) .
9. Diese Doppelstrangbildung wird mit Hilfe einer Fluoreszenzmessung (z.B. FRET oder CYBRgreen) gemessen.
10. Die Schritte 4-9 werden zyklisch wiederholt, bis mit einem aussagekräftigen Signal gerechnet werden kann.
Die obige Darstellung des Analysenvorgangs verdeutlicht, dass man zur Umsetzung eines CIS-PCR Arrays einerseits eine ortsaufgelöste Messung benötigt und anderseits in der Lage sein muss, diese Messung beliebige Male zu wiederholen, ohne die Analysenbedingungen zu verändern (z.B. durch Abtrocknung der festen Phase) . Überdies muss das Messsystem in der Lage sein, die Temperaturen der Probe entsprechend eines einstellbaren Profils jederzeit ändern zu können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist die einzige uns bekannte Technologie, die all diesen Anforderun-
gen entspricht und somit die ansich bekannte Methode das erste mal sicher anwendbar macht.
Weitere Verfahren, die im Stand der Technik unter statischen Bedingungen durchgeführt werden, können ohne weiteres auf die erfindungsgemäße Vorrichtung angewendet werden. So eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung für die direkte reverse Trans- criptase-PCR auf einem festen Träger (z.B. US 6,844,158), Bestimmung von DNA-Polymorphismen (z.B. DE 10 160 983), Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels Parallel-Amplifikation (z.B. EP 1 186 669), Fest-Phasen-PCR (z.B. JP 2001 299 346, US 5,641,658, WO 93/09250, WO 96/26291), qualitative und quantitative Bestimmung von Nukleinsäure-Molekülen in einer Probe (z.B. WO 94/09156, WO 90/06042), Fest-Phasen-Nukleinsäuresequenzierung (z.B. WO 98/44152) und Fest-Phasen-Primer Extension (z.B. EP 0 370 694) .
Das Analysegerät, in dem die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet werden kann um Proben zu analysieren, kann mehrere Komponenten umfassen, wobei insbesondere zumindest eine Rotations- und Detektionsvorrichtung erforderlich sind. Ferner kann das Analysegerät eine Lichtquelle (z.B. Laserbox), eine Inkubationskammer, eine Flüssigkeitswechselvorrichtung (gegebenenfalls gekoppelt mit einer Rotationsvorrichtung) , mehrere Flüssigkeitsreservoirs und ein Magazin umfassen. Somit kann ein typisches Analysegerät folgende Komponenten aufweisen:
1. Eine Laserbox; Ort der Laser- (bis 3 unterschiedliche Lasertypen parallel) oder Lichtquellen, die aus der Box gebündelt und zentriert austreten
2. Eine Inkubatinoskammer : Ort der Temperaturregelung, Rotation, Flüssigkeitswechsel und Messung
3. Eine Rotations- und Flüssigkeitswechselvorrichtung: dient der Aufnahme der erfindungsgemäßen Vorrichtung am Deckel, sorgt für die Rotation, den Transport im Gerät somit auch die Positionierung, den Flüssigkeitsaustausch (Zufuhr und Abfuhr)
4. Einen Detektor: z.B. eine CCD-Kamera, alternativ auch Avalan- che Photodioden (APD)
5. Flüssigkeitsreservoirs: sie stehen unter kontrolliertem Über- und Unterdruck, wodurch in Kombination mit Punkt 3. und dort platzierden Ventilen eine Zufuhr und Abfuhr von Flüssigkeiten ermöglicht wird.
6. Ein Magazin: Ort der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die vor und nach der Messung zu z.B. 8 Stück pro Magazin vom Gerät
verwaltet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher beschrieben, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. IA und IB zeigen zwei räumliche Ansichten eines erfindungsgemäßen Rotors .
Fig. 2A und 2B zeigen eine Seitenansicht des Rotors.
Fig. 3 zeigt eine Draufsicht des Rotors.
Fig. 4 zeigt einen Querschnitt des Rotors (Schnitt A-A von Fig. 3) .
Fig. 5 zeigt eine räumliche Ansicht eines Probenbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 6 zeigt eine Seitenansicht des Probenbehälters.
Fig. 7 zeigt einen Querschnitt des Probenbehälters (Schnitt A-A von Fig. 6) .
Fig. 8 zeigt eine Unteransicht des Probenbehälters.
Fig. 9 zeigt eine räumliche Ansicht eines erfindungsgemäßen Deckels .
Fig. 10 zeigt eine Seitenansicht des Deckels.
Fig. 11 zeigt einen Querschnitt des Deckels (Schnitt A-A von Fig. 10) .
Fig. 12 zeigt die Vergrößerung von Detail B aus Fig. 10.
Fig. 13 zeigt eine Draufansieht des Deckels.
Fig. 14 zeigt eine räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Kartusche.
Fig. 15 zeigt eine Seitenansicht der Kartusche.
Fig. 16 zeigt einen Querschnitt der Kartusche (Schnitt A-A von Fig. 15) .
Fig. 17 zeigt einen Querschnitt der Kartusche (Schnitt B-B von Fig. 15) .
Fig. 18 zeigt einen Querschnitt der Kartusche (Schnitt C-C von Fig. 15) .
Fig. 19 zeigt eine Draufsicht der Kartsuche.
Fig. 20 zeigt eine räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel.
Fig. 21 zeigt eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel, wobei die unterbrochenen Linien von außen nicht sichtbare Kanten darstellen.
Fig. 22 zeigt einen Querschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel (Schnitt A-A von
Fig . 21 ) .
Fig. 23 zeigt eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel.
Fig. 24 zeigt eine weitere Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel.
Fig. 25 zeigt eine räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel.
Fig. 26 zeigt eine räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche .
Fig. 27 zeigt eine weitere räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche.
Fig. 28 zeigt eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche, wobei die unterbrochenen Linien von außen nicht sichtbare Kanten darstellen.
Fig. 29 zeigt einen Querschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche (Schnitt A-A von Fig. 28).
Fig. 30 zeigt eine weitere Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche.
Fig. 31 zeigt einen Querschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Probenbehälter, Rotor und Deckel in einer erfindungsgemäßen Kartusche (Schnitt A-A von Fig. 30) .
Fig. 32 zeigt die Variationskoeffizienten von Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der die Rotoroberfläche mit Antikörper (spezifisch gegen Mausantikörper) bespottet wurde und mit monoklonalen Mausantikörpern (fluoreszenzmarkiert mit Dylight 547) inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Rotoren mit PBS 0,5% Tween 20 gewaschen und gescannt.
Fig. 33 und 34 zeigen die maximale Signalhöhe von Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der die Rotoroberfläche mit Antikörper (spezifisch gegen Mausantikörper) bespottet wurde und mit monoklonalen Mausantikörpern (fluoreszenzmarkiert mit Dylight 547) inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Rotoren mit PBS 0,5% Tween 20 gewaschen und gescannt. Die Messreihe entspricht Einzelmessungen mit unterschiedlicher Inkubationszeit. Deutlich wird das nach ca. 30 min erreichte Maximum
bei der Messreihe mit rotierender Inkubation. Die statische Inkubation erreicht auch nach 90 min also die 3fache Inkubationszeit weder die Signalhöhe noch eine Stagnation des Signalanstiegs. Reproduzierbare Messungen, vor allem bei Einzelmessungen, wie sie derzeit üblich sind, sind auf das Erreichen eines Gleichgewichts (stagnierende, abflachende Signalhöhe) angewiesen.
Fig. 35 zeigt die Abhängigkeit der Signalhöhe von der Inkubationsdauer bei einer rotierenden Inkubation.
Fig. 36 zeigt die Aufnahme eines am Rotor befindlichen markierten Spots bei rotierender zentrierter (A) und unzentrierter (B) Lagerung des Rotors.
Fig. 37 zeigt die relativen Fokussierfehler bei einer rotierenden Inkubation mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Vergleich mit einer Vorrichtung, die keine Mittel zur zentrischen Lagerung aufweist.
Fig. 38 zeigt die Aufnahme der Signale in Abhängigkeit der Zeit (Bindungskinetik) .
In Fig. IA und Fig. IB ist ein erfindungsgemäßer zylinderförmiger Rotor 1 mit einem Befestigungsmittel 2 aufweisend eine radiale Ausnehmung 3 zum Fixieren eines Deckels abgebildet. Der Rotor 1 weist am oberen 3a und unteren 3b Bereich einen nach außen gerichteten radialen Vorsprung 4 auf. An der Außenfläche 5 des Rotors 1 sind Erhebungen 6 vorgesehen, .welche zur besseren Durchmischung der zwischen dem Probenbehälter und dem Rotor 1 befindlichen Probenflüssigkeit dienen. Der Rotor 1 weist ferner einen Strömungskanal 7 auf, der im oberen Bereich 3a des Rotors 1 im Befestigungsmittel 2 einen geringeren Durchmesser aufweist als im unteren Bereich 3b des Rotors 1. Im Strömungskanal 7 sind zwei entlang dem Strömungskanal 7 verlaufende Vertiefungen 8 vorgesehen, welche zum Transport einer Flüssigkeit entlang des Strömungskanals 7 dienen.
Fig. 2A und 2B zeigen eine weitere Seitenansicht des Rotors
I (wie in Fig. IA und IB) , wobei in Fig. 2A die innere Begrenzung 9 des Strömungskanals 7 mit einer unterbrochenen Linie dargestellt ist. Am unteren Bereich 3b des Rotors 1 ist eine Ausnehmung 10 vorgesehen, die einen Flüssigkeitsdurchtritt vom Strömungskanal 7 in den Probenraum (radialer Spalt zwischen Rotor 1 und Probenbehälter 11) bei gänzlich in den Probenbehälter
II eingeführtem Rotor 11 ermöglicht.
Fig. 3 ist eine Draufsicht des Rotors 1, bei der mittels unterbrochenen Linien die innere Begrenzung 9 des Strömungskanals 7 im Rotor 1 gezeigt wird.
In Fig. 4 ist ein Querschnitt (Schnitt A-A, Fig. 3) des Rotors 1 abgebildet. Der Strömungskanal 7 des Rotors 1 weist im unteren Bereich 3b einen breiteren Durchmesser auf als im oberen Bereich 3a. Ferner ist der Strömungskanal 7 im unteren Bereich 3b zylindrisch und im Bereich der Durchmesserverjüngung Kegelstumpf-förmig ausgebildet. Im Befestigungsmittel ist der Strömungskanal wiederum zylinderförmig.
Fig. 5 zeigt die räumliche Darstellung eines Probenbehälters 11, der zur Aufnahme des Rotors 1 ausgebildet ist. Der Probenbehälter 11 weist an der Seitenbegrenzung 12 ein transparentes Sichtfenster 13 auf, durch welches die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzeugten Signale im Wesentlichen ungehindert durchtreten können. Das transparente Sichtfenster 13 kann entsprechend dem verwendeten Messsystem adaptiert sein und beispielsweise eine Krümmung aufweisen. Am Probenbehälterboden 14 sind zwei Erhebungen 15 (z.B. in Form von Knöpfen) vorgesehen, die geeignet sind, wenn in einer entsprechenden Vertiefung einer planaren Fläche eingebracht, den Probenbehälter 11 radial zu fixieren. Der Probenbehälter 11 weist an seiner Öffnung zur Aufnahme des Rotors 1 einen radialen Vorsprung 16 auf.
Fig. 6 zeigt eine Seitenansicht des Probenbehälters 11 (siehe Fig. 5) . Die unterbrochenen Linien weisen auf Elemente im Inneren des Probenbehälters hin, die in Fig. 7 näher dargestellt sind.
In Fig. 7 ist der Querschnitt (Schnitt A-A) des Probenbehälters 11 abgebildet. Im Inneren des Probenbehälters 11 ist eine zylinderförmige Einbuchtung 17 mit einem kegelförmigen Endteil 18 vorgesehen, deren Form derart ausgebildet ist, um den erfindungsgemäßen Rotor 1 radial bewegbar zu lagern. An der Außenseite des Probebehälters 11 ist in der Einbuchtung 17 ein zylinderförmiger Längskörper 19 vorgesehen, der zur Positionierung des Probenbehälters 11 dienen kann. In die Einbuchtung 17 kann ferner eine Kühl- und/oder Heizvorrichtung eingebracht werden.
Fig. 8 zeigt eine Unteransicht des Probenbehälters 11.
In Fig. 9 ist ein erfindungsgemäßer Deckel 20 abgebildet, der am Rotor 1, insbesondere an dessen Befestigungsmittel 2 (siehe Fig. 2A und 2B) , fixiert werden kann. Der Deckel 20 weist
eine Dichtlippe 21 auf, die dazu dient das Innere des Probenbehälters flüssigkeits- und gasdicht abzudichten. Ferner ist am Deckel eine mit einer Öffnung versehene Einbuchtung 22 zur Aufnahme des Befestigungsmittels 2 des Rotors 1 aufgebracht. An der Einbuchtung 22 ist ein zylinderförmiger Hohlkörper 23 vorgesehen, der sowohl als Strömungskanal zum Einbringen von Flüssigkeiten in den Probenbehälter 11 verwendet werden kann als auch zum Übertragen eines Drehmoments von einer Drehmoment-erzeugen- den Vorrichtung auf den Rotor 1 dienen kann. An dem zylinderförmigen Hohlkörper 23 können axial verlaufende Erhebungen 24 vorgesehen sein, die die Griffigkeit des Hohlkörpers 23 verbessern.
Fig. 10 zeigt eine Seitenansicht des Deckels 20, dessen Querschnitt in Fig. 11 dargestellt ist. In der Einbuchtung 22 ist ein radialer Vorsprung 25 vorgesehen, der in die Ausnehmung 3 des Befestigungsmittels 2 des Rotors 1 einrasten kann. Ist an Stelle der Ausnehmung 3 ein Gewinde vorgesehen, ist auch in der Einbuchtung 22 ein Gewinde vorzusehen, um die Fixierung des Deckels 20 an den Rotor 1 zu ermöglichen.
Das Detail B aus Fig. 11, welches die Dichtlippe 21 umfasst, ist in Fig. 12 vergrößert dargestellt. Der Deckel 20 weist unmittelbar neben der Dichtlippe 21 mindestens eine Öffnung 26 auf, durch die entweder entweichendes Gas oder, im Falle einer Durchflusszelle, austretende Flüssigkeit aus dem Probenbehälter entfernt werden kann.
Fig. 13 stellt eine Draufsicht des Deckels 20 dar.
In Fig. 14 ist eine räumliche Ansicht der erfindungsgemäßen Kartusche 27, die zur Aufnahme der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend Rotor 1, Probenbehälter 11 und Deckel 20 ausgebildet ist, dargestellt. Die Kartusche weist eine horizontalen Platte 28 (Seitenbegrenzung) auf, die über die ganze Tiefe mit einem Schlitz versehen ist, der derart gestaltet ist um den oberen Bereich 3a des Rotors 1 oder das am Deckel 20 vorgesehene Mittel 23 zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor aufzunehmen und radial bewegbar zu lagern. Im Boden 29 der Kartusche ist eine Führungsfurche (Ausnehmung) 30 eingelassen, die im Wesentlichen zu den am Probenbehälter 11 befindlichen Erhebungen 15 komplementär ist und bei eingesetzter Vorrichtung das radiale Verdrehen des Probenbehälters 11 verhindert. Da der Rotor 1 durch die Platte in seiner relativen Position zum Probenbehälter 11 fixiert ist, wird das Absinken des Rotors 1 verhindert und ein
Vorinkubationsraum definiert. Die horizontale Platte 28 ist so konzipiert, dass der Druck, der durch das Aufsetzen des Deckels 20 per Hand oder später automatisch aufgewandt werden muss, aufgenommen wird. Am Boden 29 der Kartusche ist ferner ein nach außen gerichteter Vorsprung 31 vorgesehen, der dazu dient die Kartusche 27 auf einer Auflagefläche zu stabilisieren.
Die Fig. 15 bis 19 zeigen verschiedene Schnittansichten der Kartusche 27.
Die Fig. 20 zeigt die räumliche Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend einen Rotor 1, einen Deckel 20 und einen Probenbehälter 11. Der Rotor 1 befindet sich in dieser Figur zur Gänze im Probenbehälter 11 (sog. "Messposition")- Um eine Messung mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführen zu können, muss sich der Rotor 1 während der Messung in dieser Position befinden.
Fig. 21 zeigt eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der die von außen nicht sichtbaren Kanten mit unterbrochenen Linien dargestellt werden.
Fig. 22 zeigt einen Querschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Dichtlippe 21 des Deckels 20 drückt in der "Messbzw. Analysenposition" an die Innenwand des Probenbehälters 11 und bildet dadurch einen geschlossenen Messraum, der gegebenenfalls durch eine oder mehrere Öffnungen, z.B. im Deckel 20, die Zufuhr und den Ablauf von Flüssigkeiten bzw. Gasen (z.B. Probenflüssigkeit, Puffer, Detektionsflüssigkeit, Waschflüssigkeit) ermöglicht, wodurch die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Durchflusszelle ausbilden kann. Zwischen der Innenwand des Probenbehälters 11 und der Außenwand des Rotors 1 ist ein radialer Ringspalt 32 vorgesehen.
In den Fig. 23 und 24 sind weitere Seitenansichten der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt.
Fig. 25 ist eine weitere räumliche Ansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Dabei ist die Einbuchtung 17 des Probenbehälters 11 sichtbar, die gegebenenfalls zumindest teilweise als Lagerungsfläche für den Rotor 1 dienen kann. Die Erhebungen 15 am Probenbehälterboden dienen zum radialen Fixieren des Probenbehälters 11 in einer Kartusche 27.
In den Fig. 26 und 27 ist räumlich die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer Kartusche 27 dargestellt. Die Erhebungen 15 am Probenbehälterboden befinden sich dabei in der Führungsfurche 30
im Boden 29 der Kartusche. Die Position, in der sich die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Kartusche 27 befindet, kann als "Lagerungsposition" bezeichnet werden, da sich der Rotor 1 in dieser Position nicht zur Gänze im Probenbehälter 11 befindet und somit auch kein Ringspalt 32 ausgebildet werden kann, der für eine Messung benötigt würde. Ferner kann in dieser Position der Rotor 1 aufgrund der Reibung des oberen Bereichs 3a des Rotors 1, des Befestigungsgmittels 2 und/oder des Deckels 29 mit dem Schlitz der horizontalen Platte 28 bzw. mit der horizontalen Platte 28 selbst, die zur Fixierung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in der Kartusche 27 dient, der Rotor 1 nicht mit einem ausreichenden Drehmoment versetzt werden. Der Schlitz der horizontalen Platte 28 dient zur Aufnahme des Befestigungsmittels 2 des Rotors 1. Die horizontale Platte 28 ist somit vom Deckel 20 auf der einen und dem Rotor 1 auf der anderen Seite umgeben.
In den Fig. 28 bis 31 wird diese "Lagerungsposition" nochmals verdeutlicht.
Beispiel 1 : Variationenskoeffizient von Messungen mit: der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei statischer und rotierender Inkubation
Um den positiven Effekt der rotierenden Antikörperinkubation von der erfindungsgemäßen Vorrichtung („Hybcell") auf den Inter- variationskoeffizient also den Variationskoeffizienten zwischen verschiedenen Vorrichtungen zu zeigen, wurden zwei mal drei Au- Pd beschichtete und aktivierte (DSP: Dithiobis (succinimidylpro- pionate oder auch Lomant's Reagent) Vorrichtungen entweder statisch oder rotierend mit Fluoreszenz-markiertem Antikörper inkubiert. Dabei kommt es zur Ausbildung von Wechselwirkungen mit dem spezifischen Antigen (Morphin) , welches an der Zylindermanteloberfläche in Form von runden Spots immobilisiert wurde. Wie in Fig. 32 und Tabelle 1 ersichtlich ist, reduziert sich der In- tervariationskoeffizient bei rotierender Inkubation um den Faktor 9, was eine ganz deutliche Verbesserung gegenüber statischer Inkubation darstellt.
Tabelle 1: Scaneinstellunqen waren 0,9 7 300. Die Vorrichtungen wurden 5 min mit lμl Antikörper (lmg/ml) markiert mit Dy- light 547nm rotierend oder statisch inkubiert, Auswertung erfolgte mit 200μm Durchmesser.
Statische Inkubation Rotierende Inkubation
Mittelwert intra 813 1646
Standardabw. intra 373 110
Ratio intra 46% 7%
In diesem Beispiel wird ein Versuchsprotokoll angewendet, das zur Detektion und Quantifizierung von Morphium im Speichel mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung dient:
1. Vorbehandlung der Träger (Rotor mit einer Au/Pd-Beschich- tung) a. Waschen in NH3/H2O2/H2O im Verhältnis 1:1:5 (5min) b. Waschen mit H2O c. Trocknen 30min bei 5O0C d. Inkubation mit DSP in DMSO (lmg/ml) für 30min bei Raumtemperatur e. Waschen des Trägers mit Aceton f. Trocknen für 30min bei 500C
2. Print in NaHCO3 Buffer
3. Immobilisierung über Nacht
4. Blocken mit 0,5% Tween 20 in PBS
5. Inkubation mit speichelenthaltender Lösung (50%) und lng/ml Morphin sowie lμl markiertem anti Morphin Antikörper (Dylight 547 Cyanin-basierter Farbstoff)
6. Speichelmischung zur erfindungsgemäßen Vorrichtung (Rotor Au/Pd-beschichtet) zugeben und 5min bei 700 rpm rühren
7. Dreimal mit 0,5% Tween 20 in PBS waschen
8. Detektieren
Beispiel 2 : Vergleich der Signalhöhe von Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei statischer und rotierender Inkubation
In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen der Inkubationszeit auf die Signalhöhe bei statischer und bei rotierender Inkubation untersucht. Experimentell wurde wieder Antikörper in Lösung und Antigen an die stationäre Phase ausgetestet (siehe Beispiel 1) . Wie man in Fig. 33 sieht, hat die rotierende Inkubation bei fortlaufender Zeit in Bezug auf die Höhe der einzelnen Messungen einen eindeutigen Vorteil gegenüber der statischen Inkubation.
Tabelle 2: Scaneinstellunqen waren 0, 9 7 300. Die Vorrichtungen wurden mit lμl Antikörper (lmg/ml) markiert mit Dylight 547nm rotierend oder statisch inkubiert. Auswertung erfolgte mit 200μm Durchmesser. Ausgewertet wurde das Morphin-BSA-Signal .
Statische Inkubation Rotationsinkubation
1 Minute 5Minuten 15Minuten 30Minuten 90Minuten 1 Minute SMinuten 15Minuten 30Minuten 90Minuten
63 73 579 771 1424 215 2019 3163 1865 2741
71 267 1000 850 2011 356 2037 3930 2071 3552
90 456 1274 858 2149 362 2048 4208 2147 4406
98 625 1437 1461 2360 370 2048 4262 2862 4463
120 650 1489 165? 2372 406 2117 4269 4166 4635
125 653 1870 2097 2426 430 2120 4271 4692 4643
133 660 1927 2704 2791 439 2186 4461 4947 4691
140 675 2142 2706 3426 459 2273 4472 5321 4840
152 678 2243 2824 3579 460 2313 4548 5324 5002
166 682 2261 3058 3757 472 2325 4552 5487 5177
190 686 2300 3093 4025 473 2335 4567 5884 5190
199 697 2465 3329 4199 479 2497 4603 5978 5270
263 711 2496 4106 4202 595 2599 5026 6704 6107
278 717 2807 4157 4357 597 2635 5158 7622 6621
281 834 2828 4402 5629 618 3238 5339 9044 9690
Beispiel 3 : Foktissierfehler bei der Messung von Proben in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
Um die Bedeutung der zentrischen Rotation (Lagerung) bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu testen, wurden Messungen von Zylinderoberflächen mit Markierungen um den gesamten Umfang vermessen. Die Messung A = zentrische Rotation erfolgte in der hierin beschriebenen und verwendeten Vorrichtung. Die Messung B = pendelnde Rotation erfolgte unter den selben Bedingungen aber ohne eine zentrische Lagerung mit einer Vorrichtung, die zwar einen in einem Behälter befindlichen Rotor aufweist, bei der
Mittelwert 152 652 1991 2535 3208 450 2260 4476 4865 4948
Standardabw. 50 69 427 935 803 63 179 233 1356 486
Ratio 33% 11% 21% 37% 25% 14% 8% 5% 28% 10%
aber keine Mittel zur Zentrierung vorhanden sind (siehe Fig. 36) . Damit konnte ein Auspendeln aus dem optischen Fokus nicht verhindert werden. Die Grenzlinien an den Markierungen wurden als Maß für die Schärfe der Abbildung herangezogen.
Wie in Fig. 36 A und B gekennzeichnet, ist deutlich zu erkennen, dass es bei einer unzentrierten Lagerung des Rotors im Probenbehälter zu Problemen bei der Aufnahme der Messungen kommt. Der Verlauf der Fokussierfehler über den Zylindermantel ist in Fig. 37 wiedergegeben. Dabei wird sichtbar, dass sich die Abbildung der Markierungen je nach Pendelbewegung über den Umfang von scharf zu unscharf ändern. Die zentrische Lagerung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt dagegen eine regelmäßige Schärfe mit geringem Schwankungsbereich (Berechnungstoleranz) .
Beispiel 4 : Messung von Bindungskinetik
In diesem Beispiel wurde gezeigt, dass durch die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Messung über einen Zeitverlauf ermöglicht wird. Damit ist die Inkubation und somit die Signalhöhe in Abhängigkeit von der Inkubationszeit bestimmbar. Dies bedeutet eine Aufzeichnung der Bindungskinetik unter den gewählten Bedingungen ohne den Versuch unterbrechen zu müssen.
Fig. 38 zeigt deutlich einen Anstieg des Signals (Mittel aus 9 identischen Spots an der Rotoroberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung) in Abhängigkeit zur Inkubationszeit. Der Versuch wurde nach dem Protokoll von Beispiel 1 durchgeführt, wobei während der Inkubation mit dem markierten Antikörper ohne Entfernung des ungebundenen Antikörpers durch Waschen die Messungen
durchgeführt wurden. Der gleichmäßig erhöhte Hintergrund (in der Lösung befindlicher markierter Antikörper) wurde von der Signalhöhe abgezogen. Das verbleibende Signal wurde als Wert in die Tabelle aufgenommen. Die Signalhöhe erreicht nach 13 Minuten das Maximum. Der Versuch wurde beendet.
Damit können nicht nur Bindungskinetiken oder Dissoziationsereignisse (DNA-DNA Hybridisierungen bzw. Dissoziierungen bzw. Schmelzkurven) erstellt werden sondern auch Kompetitionen
(kompetitive und nicht kompetitive) gemessen werden.
Als mobile Phase diente Fluoreszenz-markierter Antikörper
(lμg/ml) , als stationäre Phase, Spots :Antigen (lmg/ml Spotting Konzentration Morphin) . Es erfolgte keine Waschung zwischen den Scans. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur (20-240C) durchgeführt.
Claims
1. Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben, mit einem in einen Probenbehälter (11) einsetzbaren rotationssymmetrischen Rotor (1) , wobei zwischen dem Probenbehälter (11) und dem Rotor
(I) ein Ringspalt (32) vorgesehen ist und der Rotor (1) mindestens einen Strömungskanal (7) zur Beförderung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und/oder aus dem Innenraum des Probenbehälters
(II) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) und gegebenenfalls am Probenbehälter (11) Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) vorgesehen sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an der Mantelfläche des Rotors (1) oder an der Innenwand des Probenbehälters (11) mindestens eine Erhebung (6) vorgesehen ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor (1) vorgesehen sind.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor (1) ein axial zum Rotor (1) verlaufender Längskörper ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) oder am Probenbehälter (11) ein Deckel (20) zum Abdecken des Innenraums des Probenbehälters vorgesehen ist.
6. Vorrichtung zur Analyse von flüssigen Proben, mit einem in einen Probenbehälter (11) einsetzbaren rotationssymmetrischen Rotor (1) , wobei zwischen dem Probenbehälter (11) und dem Rotor
(I) ein Ringspalt (32) vorgesehen ist, der Rotor mindestens einen Strömungskanal (7) zur Beförderung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und/oder aus dem Innenraum des Probenbehälters
(II) aufweist und an der Mantelfläche des Rotors (1) oder an der Innenwand des Probenbehälters (11) mindestens eine Erhebung (6) vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) oder am Probenbehälter ein Deckel (20) zum Abdecken des Inneren des Probenbehälters vorgesehen ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) und gegebenenfalls am Probenbehälter (11) Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) im Probenbehälter (11) vorgesehen sind.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) im Probenbehälter (11) eine in den Innenraum des Probenbehälters (11) gerichtete, am Probenbehälterboden (14) befindliche Erhebung oder Einbuchtung (17, 18) und am Rotor eine dazu komplementäre Ausnehmung sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhebung oder Einbuchtung und die Ausnehmung eine Zylinderform, Kegelform, Kegelstumpfform oder eine kombinierte Form davon aufweisen.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Strömungskanal (7) mit den Mitteln zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) in Verbindung steht.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass an der Innenseite des Mittels zur zentrierten Lagerung des Rotors (1) mindestens eine entlang des Mittels und/oder des Strömungskanals (7) verlaufende Vertiefung (8) vorgesehen ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbuchtung (17) zur Aufnahme einer Kühl- und/oder Heizvorrichtung ausgebildet ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbuchtung (17) Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Probenbehälter und/oder Mittel zur Fixierung des Probenbehälters aufweist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Übertragung des Drehmoments und/oder Mittel zur Fixierung ein in der Einbuchtung (17) vorgesehener axial zum Ro- tor (1) verlaufender Längskörper (19) ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zentrierten Lagerung ein Magnetlager ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor und gegebenenfalls am Probenbehälter mindestens ein Magnet vorgesehen ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Magnet ein Permanentmagnet ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenbehälter (11) zumindest teilweise transparent ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Strömungskanal (7) des Rotors (1) axial angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser des Strömungskanals (7) des Rotors (1) im Bereich des Probenbehälterbodens (14) größer ist als im Bereich der Probenbehälteröffnung.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (20) abnehmbar angeordnet ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (20) einen mit dem Strömungskanal (7) des Rotors (1) verbundenen Strömungskanal aufweist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Strömungskanal des Deckels (20) einen geringeren Durchmesser aufweist als der Strömungskanal (7) des Rotors.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (20) randseitig eine Dichtlippe (21) aufweist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass am Deckel (20) Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor vorgesehen ist.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Übertragung eines Drehmoments an den Rotor (1) durch einen axial zum Rotor (1) verlaufenden Längskörper gebildet (23) ist.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Rotor (1) Mittel zum Befestigen des Deckels (20) aufweist.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Befestigungsmittel durch zumindest eine radial angeordneten Erhebung gebildet sind.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhebung (2) mit einer spiralförmigen Kerbe, mit einer radialen Ausnehmung (3) oder mit einem radialen Vorsprung versehen ist.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (20) eine Einbuchtung (22) zur Aufnahme des Befestigungsmittels (2) aufweist.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbuchtung (22) eine spiralförmige Kerbe, einen radialen Vorsprung (25) oder eine radiale Ausnehmung zum Fixieren des Befestigungsmittels (2) des Rotors (1) in die Einbuchtung (22) des Deckel aufweist.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) und/oder an der Innenseite des Probenbehälters (11) mindestens ein Bindungspartner zum Binden von mindestens einem Liganden vorgesehen sind.
33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Bindungspartner ein Biomolekül, insbesondere ein Antikörper, ein Antigen oder eine Nukleinsäure, ist.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Rotor (1) mindestens einen nach außen gerichtetes und/oder der Innenmantel des Probenbehälters (11) mindestens einen nach innen gerichteten radialer Vorsprung als Abstandselement (4) aufweist.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenbehälter (11) Mittel zur radialen Fixierung (15) in einer Kartusche (27) aufweist.
36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur radialen Fixierung des Probenbehälters (11) in der Kartusche (27) mindestens ein am Probenbehälterboden (14) vorgesehener Vorsprung (15), insbesondere mindestens eine Noppe, ist.
37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Rotor (1) und/oder der Probenbehälter (11) und/oder der Deckel (20) aus einem Kunststoff, vorzugsweise aus einem Cyclo-Olefin-Copolymer (COC) , Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Acetatpolymer, Acrylnitril Butadienstyrol, Po- lymethylmetacrylat, PVC, Polyethylenterephthalat, Polytetrafluo- rethylen oder eine Kombination davon , gebildet ist.
38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Rotors (1) mit einem Metall, vorzugsweise einem Halbleitermetall, einem Polymer, Silizium oder einer Siliziumverbindung mit Kohlenstoff, vorzugsweise mit Graphit, DLC oder Diamant, oder eine Kombination davon beschichtet ist.
39. Vorrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Palladium, Silber und Kombinationen davon.
40. Vorrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Siliziumverbindung Siliziumoxid ist.
41. Kartusche (27) zur Aufnahme einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass eine Öffnung zum Einbringen des Probenbehälters (11) und eine mit einer Aus- nehmung versehene Seitenbegrenzung (28) vorgesehen ist, wobei die Ausnehmung zur axialen Fixierung des Rotors (1) ausgebildet ist .
42. Kartusche (27) nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass eine der mit einer Ausnehmung versehenen Seitenbegrenzung gegenüberliegende Begrenzung (29) der Kartusche eine Vertiefung
(30) zur Aufnahme des Mittels zur radialen Fixierung des Probenbehälters (15) in der Kartusche (27) aufweist.
43. Rotor für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 37.
44. Probenbehälter für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40.
45. Set zur Analyse von Proben umfassend:
- einen Rotor (1) für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40,
- einen Probenbehälter (11) für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40, gegebenenfalls
- einen Deckel (20) wie in einem der Ansprüche 5 bis 40 definiert und gegebenenfalls
- eine Kartusche (27) wie in Anspruch 41 oder 42 definiert.
46. Durchflusszelle zur Analyse von Proben umfassend:
- einen Rotor (1) für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40 definiert,
- einen Probenbehälter (11) für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40 definiert, gegebenenfalls
- einen Deckel (20) wie in einem der Ansprüche 5 bis 37 und gegebenenfalls
- eine Kartusche (27) wie in Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, dass am Rotor (1) , vorzugsweise in einem Abstandselement (4), oder im Deckel (20), vorzugsweise der Dichtlippe (21) benachbart, oder am Probenbehälter (11) mindestens eine Öffnung für den Austritt von Flüssigkeit vorgesehen ist.
47. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 37 zur Detektion von Substanzen in einer Probe und zur Durchführung enzymatischer Reaktionen.
48. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40 zur Amplifikation von Nukleinsäuren.
49. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 40 zur qualitativen und/oder quantitativen Detektion von Substanzen in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Blut oder Speichel .
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