EP2015772A2 - Mittel zur behandlung von malignen erkrankungen - Google Patents

Mittel zur behandlung von malignen erkrankungen

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EP2015772A2
EP2015772A2 EP07724827A EP07724827A EP2015772A2 EP 2015772 A2 EP2015772 A2 EP 2015772A2 EP 07724827 A EP07724827 A EP 07724827A EP 07724827 A EP07724827 A EP 07724827A EP 2015772 A2 EP2015772 A2 EP 2015772A2
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EP
European Patent Office
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bat3
tumor
cells
protein
malignant diseases
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EP07724827A
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Inventor
Elke Pogge Von Strandmann
Andreas Engert
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Original Assignee
Individual
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Definitions

  • the invention relates to an agent for the treatment of tumor diseases, autoimmune diseases or for use in cellular immunotherapy in the context of allogeneic and autologous transplants by activation or inhibition of BAT3 with a physiologically effective amount of the protein BAT3 (HLA-associated transcript 3) and / or BAT3 in conjunction with a tumor-specific antibody fragment, the DNA (cDNA) and / or RNA coding for the production of such an agent in the case of activation of the BAT3-dependent disease. Furthermore, the invention relates to the use of BAT3 cDNA for ex vivo and in vivo overexpression of BAT3 in tumor cells after viral or non-viral gene transfer, with the aim of eliciting an anti-tumor immune response in tumor patients.
  • a means of inhibiting or activating BAT3 by antagonistic or agonistic antibodies, antisense nucleotides or specific inhibitors By and large, a means of inhibiting or activating BAT3 by antagonistic or agonistic antibodies, antisense nucleotides or specific inhibitors. Furthermore, a diagnostic marker, such as a specific antibody for the diagnosis of the disease and for the follow-up.
  • the invention relates to an agent for the treatment of human diseases using the recombinant protein BAT3, the coding DNA / RNA, an inhibitor / activator of BAT3 in the form of
  • the invention relates to the use of the BAT3 cDNA for ex vivo and in vivo overexpression of BAT3 in human tumor cells after viral or non-viral gene transfer to achieve an NKp30-mediated immune response against the tumor cells in human malignant diseases.
  • NK cells which as a component of the innate immune system recognize malignant cells, combat them directly and contribute to the formation of an adaptive immune response against the tumor cells, have recently been increasingly used for the immunotherapy of malignant diseases.
  • NK cells against tumor cells are controlled via activating receptors, which include the natural cytotoxic receptors (NCRs) with the important NKp30.
  • the stimulation of the receptors, as well as that of NKp30, is based on the interaction with the corresponding ligands on malignant cells and leads to the lysis of the target cells (Pende, D., et al., J Exp Med 190, 1505 (Nov 15, 1999)).
  • the ligand (or possibly the ligands) of NKp30 is basically suitable for tumor therapy. So far, however, the cellular ligand has been described only indirectly with the aid of masking antibodies, and the molecular identification of the ligand was still pending (L. Moretta, A.
  • NKp30 is a membrane protein of tumor cells
  • a nuclear protein as a cellular ligand of the NKp30 receptor.
  • BAT3 the first cellular tumor-associated ligand of the surface receptor NKp30, one of the important activating immune receptors of NK cells.
  • this nuclear protein arrives at the surface of the cells and is also released from the cells as soon as the cells receive a "stress signal.” This may be a heat shock or contact with NK cells.
  • BAT3 may lead to inhibition or activation of NK cells, which is mainly mediated through the Natural Cytotoxicity Receptors (NCRs).
  • NCRs Natural Cytotoxicity Receptors
  • BAT3 can lead to activation (cytotoxicity, cytokine secretion) on the cell surface or associated with exosomes in the supernatant of tumor cells.
  • the recombinant, purified protein inhibits NK cell activity.
  • the addition of BAT3-specific cross-linking antibodies in combination with purified BAT3 leads to a dramatic increase in NK cell activity.
  • NKp30, NCR NKp30, NCR
  • BAT3 nuclear protein
  • NKp30-specific ligands on tumor cells correlates directly with their sensitivity to NK cells, so that the loss of ligands represents a strategy of the tumor cells to escape control by the immune system.
  • NKp30 not only applies to NKp30, but also to the already known ligands of a second activating receptor of NK cells, the NKG2D receptor.
  • Genherapeutic pre-clinical data are already available, showing that the overexpression of NKG2D ligands leads to the successful control of the corresponding tumor by the immune system.
  • This activation is independent of the activity of the inhibiting NK receptors, which normally prevent NK cells from attacking the body's own cells (eg A. Cerwenka, JL Baron, LL Lanier, Proc Natl Acad. USA 98, 11521 (Sep 25, 2001 A. Diefenbach, ER Jensen, AM Jamieson, DH Raulet, Nat ⁇ re 413, 165 (Sep 13, 2001)).
  • NKG2D ligand-based recombinant constructs also show promising anti-tumoral activity, as has been demonstrated in various preclinical studies (Germain, C. et al., Clin Cancer Res 11, 7516 (Oct. 15, 2005); E. Pogge, Strandmann et al., Blood (Oct 6, 2005)).
  • Our identification of BAT3 as a cellular ligand of NKp30 and our studies on the function of BAT3 show that this new ligand BAT3 is suitable for tumor therapy targeting NKp30 / NCR-mediated NK cell stimulation.
  • the invention therefore also provides an agent for the treatment of patients with malignant diseases, in which a physiologically effective amount of the protein BAT3 is contained as active ingredient in a pharmaceutically acceptable carrier material.
  • BAT3 in tumor therapy is the use as a fusion protein with an antibody fragment that binds specifically to
  • a BAT3 / anti-CD138 is to be used therapeutically to support an anti-tumor immune response in patients with multiple myeloma, similar to that already described for the bispecific
  • CD138 Protein ULBP2 / CD138 (Pogge et al., 2006).
  • the used B-B4 single chain antibody fragment with specificity for CD138 (Syndecan 1) is basically very well suited for this application.
  • CD138 is a member of Syndecan family, heparan sulfate proteoglycans, play a role in cell adhesion, differentiation and proliferation and are often overexpressed on malignant multiple myeloma cells while lacking on other hematopoietic cells (Dhodapkar MV, Sanderson RD et al., Leuk Lymphoma 1999; 34: 35-43).
  • Another example is the inhibition of BAT3 in autoimmune diseases to modulate a hyperreactive immune system.
  • Antagonist and agonistic BAT3-specific antibodies and recombinantly produced BAT3 protein can be used for the therapy of malignant diseases and immunological diseases.
  • NK cells activation of NK cells in the context of cellular immunotherapy by recombinant BAT3 or derivatives / antibodies within the culture phase of these cells before transplantation, as well as systemic administration after transplantation, is a novel approach that improves therapy.
  • Another example is the diagnosis of diseases and therapy by detecting BAT3 on the cells and in the serum. This can be done by antibody-based techniques, for example ELISA, Fig. 2), but also other specific detection methods.
  • the invention thus relates to an agent for the treatment of patients with multiple myeloma, in which a physiologically effective amount of the protein BAT3 / antiCD138 or BAT3 and derivatives of BAT3 or BAT3-specific antibodies is contained as active ingredient in a pharmaceutically acceptable carrier material.
  • a physiologically effective amount of the protein BAT3 / antiCD138 or BAT3 and derivatives of BAT3 or BAT3-specific antibodies is contained as active ingredient in a pharmaceutically acceptable carrier material.
  • Other possible uses are malignant diseases and immunological diseases (allergies, autoimmune diseases).
  • the agent according to the invention contains the anti-tumor immune response modulating protein BAT3 and derivatives of BAT3, BAT3 / antiCD138 fusion constructs or BAT3-specific antibodies as active ingredient for the therapy and diagnosis of malignant diseases and for the modulation of the immune system.
  • the agent of the invention for the treatment of malignant diseases contains the active ingredient in a conventional pharmaceutically acceptable and acceptable carrier material. It may be useful to administer the drug systemically, as it is known for example in the interferon therapy of multiple sclerosis or for the treatment of diabetes.
  • the protein or the DNA and / or RNA coding for it or the specific BAT3 antibodies can be stabilized for storage and for the prevention of premature reduction of activity. Stabilization can be achieved by incorporation of conventional additives, e.g. Buffer substances, salts of other proteins as well as DNA and RNA can be achieved. Examples are albumin, herring sperm, DNA, tRNA and detergents such as Triton, alkali and alkaline earth ions and the like. Storage of the agent and / or active ingredient in dried or freeze-dried form or after
  • Shock freezing in liquid nitrogen may also be useful.
  • the agent according to the invention may of course contain the active ingredient in modified form, i. as a protein in which individual amino acids are exchanged or missing.
  • the prerequisite is that the thus-modified active substance still provides the effect it requires in stimulating the immune effector cells for the treatment of patients with malignant diseases.
  • Reasons for such modifications may be the stabilization of the active ingredient, technical or formulation-technical reasons or also an improvement of the effect or the spectrum of action. In question are mutation and fusion after chemical or genetic engineering
  • the protein can be obtained in a conventional manner after cloning the gene into suitable vectors recombinant from bacteria or eukaryotes according to standard methods.
  • the agent according to the invention for the treatment of malignant diseases by the activation of the immune effector cells contains the active ingredient in a pharmaceutically acceptable carrier material, which on the one hand can consist of several conventional constituents.
  • the carrier material expediently contains a transfer medium suitable for the active ingredient.
  • the agent is intended primarily for systemic administration and ex vivo therapy in the context of cellular immunotherapies.
  • BAT3 cDNA for overexpression of BAT3 in tumor cells by viral and non-viral methods of gene transfer of the invention, since BAT3 overexpimating tumor cells are suitable, via the stimulation of NCR Receptors to support an NK cell-mediated anti-tumor immune response.
  • the invention is further illustrated by the following examples in which experimentally the effectiveness of BAT3 ligand is detected. For a further explanation of the examples and further examples, reference is made to the accompanying manuscript.
  • NK cells Increased cytotoxicity against tumor cells
  • NK cells isolated from the blood of healthy donors were used lo as effector cells in europium release assays.
  • Target cells human tumor cell lines labeled with europium and incubated with NK cells in the indicated devisequently, the amount of europium released is determined in the supernatant, which is used as a measure of the
  • NK-mediated cell lysis is used.
  • the value for a 100% lysis results after incubation of the cells with a detergent which leads to lysis.
  • the spontaneous lysis is taken into account, which is determined in batches without NK cells.
  • NK cells effector were incubated for the europium release assay in the ratios indicated with the human colon carcinoma line LS175T, which with an expression construct for BAT3 (BAT3) or the
  • BAT3 BAT3
  • CD3 ⁇ -BAT3-CT membrane-bound BAT3 5 derivative
  • control vectors without BAT3 cDNA were introduced into LS175T cells. After 36 hours, the tumor cells were mixed with primary NK cells from peripheral blood of healthy donors (see above) in the ratio 1: 1 and incubated for a further 48 hours.
  • the NK cells were previously stimulated overnight with interleukin 2 (10U) alone or in combination with interleukin 15 (10 ng ml -1 ) Interferon ⁇ in the supernatants were assayed for interferon g secretion of the NK cells using a IFN ⁇ ELISA kits (human interferon ⁇ ELISA Kit (R & D Systems)) .
  • IFN ⁇ ELISA kits human interferon ⁇ ELISA Kit (R & D Systems)
  • BAT3 upper part of the figure
  • BAT3 which is released from the tumor cells into the supernatant (detected in the i5 Western blot, see attached manuscript) and also that of a membranous variant (lower part of the figure) stimulates the interferon g secretion of NK cells (see Figure 2).
  • BAT3 is for the detection and elimination of tumors (multiple
  • Myeloma essential: in vivo experiment (mouse xenograft model)
  • mice Human multiple myeloma cells (line RPMI8226) were injected into nude mice. This leads to the formation of subcutaneous tumors in 8 out of 10 mice. The tumor volume on day 13 and day 20 is indicated (circles). If the mice additionally receive human peripheral blood lymphocytes (PBL), the tumor cells are eliminated and tumor formation does not occur in any case. In addition, the mice were given control antibodies (control antibodies) that do not interfere with tumor cell recognition (black cross). However, when the mice receive BAT3-specific antibodies that deplete the endogenous BAT3 protein, tumor cell recognition and elimination are inhibited (yellow triangles, tumors in 6 out of 10 mice).
  • control antibodies control antibodies

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Abstract

Die Erfindung ist ein Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen wie zum Beispiel dem multiplen Myelom, das durch die Aktivierung einer anti-Tumor-Immunantwort nach Stimulierung des NKp30 Rezeptors und der Natural Cytotoxicity Receptors (NCR) auf NK Zellen wirkt. Es handelt sich um eine physiologisch wirksame Menge des Proteins BAT3, BAT3/antiCD138 oder BAT3-spezifischen Antikörpern oder Derivaten dieser Stoffe in einem annehmbaren Trägermaterial. Außerdem kann die Erfindung auch zur Behandlung CD138 negativer Tumore nach dem identischen Prinzip des BAT3/antiCD138 Proteins verwendet werden. Hierzu wird der antiCD138 Anteil mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen ausgetauscht und das entsprechende Mittel wird zur Therapie von Tumoren eingesetzt, die dieses Tumorantigen exprimieren. Die Erfindung beinhaltet außerdem auch den Einsatz von rekombinanten BAT3 Protein oder einen BAT3 Fragment ohne antikörper-basierten Fusionsanteil zur Behandlung maligner Erkrankungen über die Aktivierung von NKp30 und NCR auf NK-Zellen. Schließlich beinhaltet die Erfindung die Verwendung der BAT3 cDNA zur in vivo und/oder ex vivo Einführung von BAT3 in Tumorzellen, die zu einer verbesserten Erkennung durch NK-Zellen führt, für die Immuntherapie von malignen Erkrankungen.

Description

Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder zur Verwendung bei der zellulären Immuntherapie im Rahmen von allogenen und autologen Transplantationen durch Aktivierung oder Hemmung von BAT3 mit einer physiologisch wirksamen Menge des Proteins BAT3 (HLA-assoziiertes Transkript 3) und/oder BAT3 in Verbindung mit einem tumorspezifischen Antikörperfragment, der dafür codierenden DNA (cDNA) und/oder RNA zur Herstellung solch eines Mittels im Falle einer Aktivierung der BAT3 abhängigen Erkrankung. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der BAT3 cDNA zur ex vivo und in vivo Überexpression von BAT3 in Tumorzellen nach viralem oder nicht viralem Gentransfer, mit dem Ziel eine Anti-Tumor-Immunantwort in Tumorpatienten hervorzurufen. Des weitem ein Mittel zur Hemmung oder Aktivierung von BAT3 durch antagonistische oder agonistische Antikörper, anti- sense Nukleotide oder spezifische Inhibitoren. Des Weiteren ein diagnostischer Marker, wie zum Beispiel ein spezifischer Antikörper zur Diagnose der Erkrankung und zur Verlaufskontrolle.
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen unter Verwendung des rekombinanten Proteins BAT3, der codierenden DNA/RNA, eines Inhibitors/Aktivators von BAT3 in Form von
Antikörpern oder anti- sense Nukleotiden oder anderen spezifischen Inhibitoren und unter Verwendung von BAT3, das über einen geeigneten Linker in
Verbindung mit einem Single chain Antikörperfragment des monoklonalen Mausantikörpers B-B4, der gegen das tumorspezifische Antigen CD138 gerichtet ist, synthetisiert wird.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der BAT3 cDNA zur ex vivo und in vivo Überexpression von BAT3 in humanen Tumorzellen nach viralem oder nicht viralem Gentransfer, um eine NKp30-vermittelte Immunantwort gegen die Tumorzellen bei malignen Erkrankungen des Menschen zu erreichen.
NK-Zellen, die als Bestandteil des innaten Immunsystems maligne Zellen erkennen, direkt bekämpfen und zur Bildung einer adaptiven Immunantwort gegen die Tumorzellen beitragen , werden in jüngster Zeit zunehmend für die Immuntherapie maligner Erkrankungen genutzt.
Die Aktivität von NK-Zellen gegen Tumorzellen wird über aktivierende Rezeptoren gesteuert, zu denen die natürlichen zytotoxischen Rezeptoren (NCR) mit dem wichtigen Vertreter NKp30 zählen. Die Stimulierung der Rezeptoren, wie auch die von NKp30, beruht auf der Interaktion mit den korrespondierenden Liganden auf malignen Zellen und führt zur Lyse der Zielzellen (D. Pende et al., J Exp Med 190, 1505 (Nov 15, 1999)). So ist der Ligand (oder möglicherweise die Liganden) von NKp30 grundsätzlich für die Tumortherapie geeignet. Bislang war der zelluläre Ligand jedoch nur indirekt mit Hilfe maskierender Antikörper beschrieben, die molekulare Identifizierung des Liganden stand noch aus (L. Moretta, A. Moretta, Embo J 23, 255 (Jan 28, 2004)). Entgegen der Erwartungen, dass ein Ligand von NKp30 ein Membranprotein von Tumorzellen ist, haben wir ein nukleares Protein als zellulären Liganden des NKp30 Rezeptors identifiziert. Im beiliegenden Manuskript beschreiben wir die Klonierung von BAT3, dem ersten zellulären tumor-assoziierten Liganden des Oberflächenrezeptors NKp30, einem der wichtigen aktivierenden Immunrezeptoren von NK-Zellen (L. Moretta, A. Moretta, Embo J 23, 255 (Jan 28, 2004)). Überraschender weise gelangt dieses nukleare Protein an die Oberfläche der Zellen und wird darüber hinaus von den Zellen ausgeschleust, sobald die Zellen ein „Stresssignal" erhalten. Dies kann ein Hitze-Schock oder Kontakt mit NK-Zellen sein.
Je nach Kontext kann BAT3 zu einer Inhibition oder Aktivierung von NK-Zellen führen, die im Wesentlichen über die Natural Cytotoxicity Receptors (NCR) vermittelt wird.
So kann BAT3 auf der Zelloberfläche oder assoziiert mit Exosomen im Überstand von Tumorzellen zu einer Aktivierung (Zytotoxizität, Zytokinsekretion) führen. Das rekombinante, gereinigte Protein hemmt die NK-Zellaktivität hingegen. Die Zugabe von BAT3-spezifischen quervernetzenden Antikörpern in Kombination mit gereinigtem BAT3 führt wiederum zu einem dramatischen Anstieg der NK-Zellaktivität.
Insgesamt zeigen unsere Daten, dass die immobilisierte Form von BAT3, sei es auf der Zelloberfläche, auf Exosomen oder durch Antikörper zu einer NK- Aktivierung führt, während die lösliche Form eine Hemmung bewirkt. Diese lösliche Form kann beispielsweise durch Shedding des Moleküls entstehen und somit ein Mechanismus von Tumor- und virusinfizierten Zellen sein, um der Erkennung durch das Immunsystem zu entkommen. Diese Interpretation wird durch den Nachweis der signifikanten Zunahme von BAT3 im Serum von Tumorpatienten im Vergleich zu gesunden Spendern belegt (Beispiel Hodgkin- Lymphom Vergleich von 40 Patientenseren mit 40 Normalseren). Dies ist ein bisher nicht bekannter oder auch in keiner Hypothese beschriebener Mechanismus, über den wichtige Oberflächenrezeptoren von NK-Zellen (NKp30, NCR) durch ein nukleares Protein (BAT3) reguliert werden, wobei die Translokalisation von BAT3 an die Zelloberfläche und die Zellumgebung induzierbar ist.
Bezüglich aller relevanten Strukturdaten wird auf die Veröffentlichungen und darin zitierte Arbeiten verwiesen (NKp30: D. Pende et al., J Exp Med 190, 1505 (Nov 15, 1999); L. Moretta, A. Moretta, Embo J 23, 255 (Jan 28, 2004) und BAT3: J. Banerji, J. Sands, J. L. Strominger, T. Spies, Proc Natl Acad Sei U S A 87, 2374 (Mar, 1990)).
Es ist bekannt, dass die Expression der NKp30 spezifischen Liganden auf Tumorzellen direkt mit ihrer Empfindlichkeit gegenüber NK-Zellen korreliert, so dass der Verlust der Liganden eine Strategie der Tumorzellen der Kontrolle durch das Immunsystem zu entkommen, darstellt.
Dies gilt jedoch nicht nur für NKp30, sondern auch für die bereits bekannten Liganden eines zweiten aktivierenden Rezeptors von NK-Zellen, dem NKG2D Rezeptor. Hier liegen bereits gentherapeutische prä-klinische Daten vor, die zeigen dass die Überexpression von NKG2D Liganden zur erfolgreichen Bekämpfung des entsprechenden Tumors durch das Immunsystem führt. Diese Aktivierung ist unabhängig von der Aktivität der inhibierenden NK-Rezeptoren, die normalerweise einen Angriff der NK-Zellen auf körpereigene Zellen verhindern (z.B. A. Cerwenka, J. L. Baron, L. L. Lanier, Proc Natl Acad Sei U S A 98, 11521 (Sep 25, 2001 ); A. Diefenbach, E. R. Jensen, A. M. Jamieson, D. H. Raulet, Natυre 413, 165 (Sep 13, 2001 )).
NKG2D-liganden-basierte rekombinante Konstrukte vermitteln ebenso vielversprechende anti-tumorale Aktivität gezeigt, wie in verschiedenen präklinischen Studien gezeigt wurde (C. Germain et al., Clin Cancer Res 11 , 7516 (Oct 15, 2005); E. Pogge von Strandmann et al., Blood (Oct 6, 2005)). Unsere Identifizierung von BAT3 als zellulären Liganden von NKp30 und unsere Untersuchungen zur Funktion von BAT3, zeigen, dass dieser neue Ligand BAT3 für die Tumortherapie, die auf eine NKp30/NCR vermittelte Stimulierung von NK-Zellen abzielt, geeignet ist.
Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Überexpression von BAT3 in Tumorzellen nach Induktion über Hitze-Schock oder den Kontakt mit NK-Zellen zur Ausschüttung von BAT3 führt und eine Aktivierung von NK-Zellen messbar ist. Ebenso sekretieren humane Tumorzelllinien wie 293T und RPMI-Zellen endogenes BAT3, während Kolonkarzinomlinien wie LS175T hierzu nicht in der Lage sind (siehe beiliegendes Manuskript). So ist davon auszugehen, dass BAT3 auch ohne Targeting an Tumorzellen über ein Antikörperfragment oder über einen Antikörper funktionell ist und zur NK-Zellaktivierung führen kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Mittel zur Therapie von Patienten mit maligenen Erkrankungen, bei dem eine physiologisch wirksame Menge des Proteins BAT3 als Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthalten ist.
Es besteht ein großer Bedarf an Therapien, die geeignet sind eine Anti-Tumor- Immunantwort des Patienten auszulösen. Aber auch Therapien, die Transplantationen beinhalten oder Erkrankungen die aus dem immunologischen Formenkreis kommen sind derzeit bei weitem nicht ausgereift. So sind in den letzten Jahren eine Vielzahl von immuntherapeutischen Strategien, vorwiegend basierend auf dem Einsatz von Antikörpern, entwickelt worden oder befinden sich derzeit in der klinischen Prüfung.
Ein Beispiel für den Einsatz von BAT3 in der Tumortherapie ist der Einsatz als Fusionsprotein mit einem Antikörperfragment, das eine spezifische Bindung an
Tumorzellen ermöglicht. Ein BAT3/anti-CD138 soll beispielsweise therapeutisch eingesetzt werden, um eine Anti-Tumor-Immunantwort bei Patienten mit multiplem Myelom zu unterstützen, ähnlich wie es bereits für das bispezifische
Protein ULBP2/CD138 gezeigt ist (Pogge et al., 2006). Das eingesetzte B-B4 Single chain Antikörperfragment mit Spezifität für CD138 (Syndecan 1) ist grundsätzlich für diese Anwendung sehr gut geeignet. CD138 ist ein Mitglied der Syndecan Familie, Heparan-Sulfat-Proteoglycane, die eine Rolle für die Zelladhäsion, Differenzierung und Proliferation spielen und ist vielfach auf den malignen multiplen Myelomzellen überexprimiert, während es auf anderen hämotopoetischen Zellen fehlt (Dhodapkar MV, Sanderson RD. et al., Leuk Lymphoma. 1999;34:35-43).
Außerdem gibt es bisher noch keine befriedigende Therapieoption zur Behandlung des multiplen Myeloms. Die Lebenserwartung für betroffene Patienten beträgt nach Erstdiagnose nur wenige Monate.
Ein weiteres Beispiel ist die Hemmung von BAT3 bei Autoimmunerkrankungen, um ein überreaktives Immunsystem zu modulieren.
Antagonistische und agonistische BAT3-spezifische Antikörper und rekombinant hergestelltes BAT3 Protein können für die Therapie von malignen Erkrankungen und immunologischen Erkrankungen eingesetzt werden.
Weiterhin ist eine Aktivierung von NK-Zellen im Rahmen der zellulären Immuntherapie durch rekombinates BAT3 oder Derivate/Antikörper innerhalb der Kulturphase dieser Zellen vor der Transplantation, aber auch als systemische Gabe nach der Transplantation ein neuartiger Ansatz, der die Therapie verbessert.
Als weiteres Beispiel steht die Diagnostik der Erkrankungen und der Therapie durch einen Nachweis von BAT3 auf den Zellen und im Serum, im Focus. Dies kann durch antikörper-basierte Techniken, beispielsweise ELISA, Abb. 2), aber auch andere spezifische Nachweismethoden geschehen.
Gegenstand der Erfindung ist also ein Mittel zur Therapie von Patienten mit multiplen Myelom, bei dem eine physiologisch wirksame Menge des Proteins BAT3/antiCD138 oder BAT3 und Derivate von BAT3 oder BAT3-spezifische Antikörper als Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthalten ist. Weitere mögliche Einsatzbereiche sind maligne Erkrankungen und immunologische Erkrankungen (Allergien, Autoimmunerkrankungne). Das erfindungsgemäße Mittel enthält das eine Anti-Tumor-Immunantwort modulierende Protein BAT3 und Derivate von BAT3, BAT3/antiCD138 Fusionskonstrukte oder BAT3-spezifische Antikörper als Wirkstoff für die Therapie und Diagnose von malignen Erkrankungen und zur Modulation des Immunsystems.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen enthält den Wirkstoff in einem üblichen pharmazeutisch annehmbaren und verträglichen Trägermaterial. Es kann sinnvoll sein, den Wirkstoff systemisch zu verabreichen, wie es beispielsweise bei der Interferon-Therapie der multiplen Sklerose oder auch zur Behandlung von Diabetes bekannt ist.
Weiter ist auf die Möglichkeit einer ex-vivo Anwendung im Rahmen von zellulären Immuntherapien verwiesen.
Es versteht sich, dass das Protein bzw die dafür codierende DNA und/oder RNA oder die spezifischen BAT3 Antikörper zur Lagerung und zur Vermeidung von vorzeitiger Wirkungsminderung stabilisiert werden können. Die Stabilisierung kann durch Beimischung üblicher Zusätze erreicht werden, so z.B. Puffersubstanzen, Salze anderer Proteine wie auch von DNA und RNA erreicht werden. Beispiele sind Albumin, Heringsperma, DNA, tRNA und Detergentien wie Triton, Alkali- und Erdalkaliionen und dergleichen. Eine Lagerung des Mittels und/oder Wirkstoffs in getrockneter oder gefriergetrockneter Form oder nach
Schockfrieren im flüssigen Stickstoff kann ebenfalls sinnvoll sein..
Das erfindungsgemäße Mittel kann den Wirkstoff selbstverständlich in modifizierter Form enthalten, d.h. als Protein, in dem einzelne Aminosäuren ausgetauscht sind oder fehlen. Voraussetzung ist, dass der so modifizierte Wirkstoff die von ihm verlangte Wirkung bei der Stimulierung der Immuneffektorzellen zur Behandlung von Patienten mit malignen Erkrankungen nach wie vor liefert. Gründe für solche Modifikationen können die Stabilisierung des Wirkstoffes, produkttechnische oder formulierungstechnische Gründe oder auch eine Verbesserung der Wirkung oder des Wirkungsspektrums sein. In Frage kommen Mutation und Fusion nach chemischen oder gentechnischen
Methoden und Fusionierungen mit N- und C-terminalen Proteinen oder Peptiden. Dies kann beispielsweise zu einer Verbesserung der Halbwertszeit des Proteins führen. Aus Gründen einer besseren Reinigung mittels Affinitätschromatographie können z.B. Histidintags oder Gst-Fusionen vorgenommen werden. Durch Phosphorylierung oder Glykosilierung an geeigneten Resten können Modifikationen vorgenommen werden, die dem Abbau durch körpereigene Proteasen vorbeugen.
Zur Stabilisierung des Proteins kann es sinnvoll sein Änderungen vorzunehmen etwa auf der Ebene der DNA um beispielsweise Restriktionsstellen, chemische Instabilität oder Angriffspunkte von Nukleasen zu beseitigen.
Das Protein kann auf übliche Weise nach Klonierung des Gens in geeignete Vektoren rekombinant aus Bakterien oder Eukaryonten nach Standardmethoden erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch die Aktivierung der Immuneffektorzellen enthält den Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial, das einerseits aus mehreren üblichen Bestandteilen bestehen kann. Zweckmäßigerweise enthält das Trägermaterial wiederum ein für den Wirkstoff geeignetes Transfermedium. Das Mittel ist in erster Linie für die systemische Verabreichung und die ex-vivo Therapie im Rahmen von zellulären Immuntherapien vorgesehen.
Ebenso wie ein rekombinantes BAT3 Protein oder BAT3 Fusionsprotein oder BAT3 spezifischen Antikörpern ist der Einsatz der BAT3 cDNA zur Überexpression von BAT3 in Tumorzellen nach viralen und nicht viralen Methoden des Gentransfers Gegenstand der Erfindung, da BAT3 überexpimierende Tumorzellen geeignet sind, über die Stimulierung von NCR- Rezeptoren eine NK-ZeII vermittelte Anti-Tumor-Immunantwort zu unterstützen. Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher erläutert, in denen experimentell die Wirksamkeit von BAT3 Ligand nachgewiesen wird. Für eine weitere Erläuterung der Beispiele und weitere Beispiele wird auf das beiliegende Manuskript verwiesen.
5 Beispiele
1. Die BAT3 Überexpression in Tumorzellen führt zur Aktivierung von
NK-Zellen: Erhöhte Zytotoxizität gegen Tumorzellen
NK-Zellen, die aus dem Blut von gesunden Spendern isoliert wurden, wurden lo als Effektorzellen in Europium Release Assays eingesetzt. Hierbei werden
Targetzellen (humane Tumorzelllinien) mit Europium markiert und mit NK-Zellen in den angegebenen EffektorTarget Verhältnissen inkubiert. Anschließend wird im Überstand die Menge freigesetztes Europium bestimmt, die als Maß für die
NK-vermittelte Zelllyse dient. Der Wert für eine 100% Lyse ergibt sich nach i5 Inkubation der Zellen mit einem Detergenz, das zur Lyse führt. Zusätzlich wird die Spontanlyse berücksichtigt, die in Ansätzen ohne NK-Zellen ermittelt wird.
(A) Die NK-Zellen (Effektor) wurden für den Europium Release Assay in den angegebenen Verhältnissen mit der humanen Kolonkarzinomlinie LS175T inkubiert, die mit einem Expressionskonstrukt für BAT3 (BAT3) oder zum
20 Vergleich mit dem Expressionsplasmid (Vektor) transfiziert wurde. Es zeigt sich für alle Messpunkte eine erhöhte Lyse der BAT3 exprimierenden Zellen, die über NKp30 vermittelt wird, da ein rekombinanter NKp30-Rezeptor diesen Effekt hemmt (BAT3+NKp30-lg).
(B) Die NK-Zellen (Effektor) wurden für den Europium Release Assay im 25 Verhältnis 5:1 mit der humanen Nierenkarzinomlinie 293T inkubiert, die mit einem Expressionskonstrukt für BAT3 (BAT3) oder zum Vergleich mit dem Expressionsplasmid (Vektor) transfiziert wurde. Es zeigt sich eine erhöhte Lyse der BAT3 exprimierenden Zellen, die über NKp30 vermittelt wird, da der Effekt durch Zugabe eines maskierenden NKp30 Antikörpers
30 gehemmt wird (BAT3+α-NKp30).
(siehe Figur 1) 2. Die BAT3 Überexpression in Tumorzellen führt zur Aktivierung von NK-Zellen: Stimulierung der Inteferonγ Sekretion
Expressionsvektoren für BAT3 (BAT3) oder für ein membranständiges BAT3 5 Derivat (CD3ζ-BAT3-CT) beziehungsweise Kontrollvektoren ohne BAT3 cDNA wurden in LS175T Zellen eingebracht. Nach 36 Stunden wurden die Tumorzellen mit primären NK-Zellen aus peripheren Blut gesunder Spender (s.o.) im Verhältnis 1:1 gemischt und weitere 48 Stunden inkubiert. Die NK- Zellen wurden zuvor über Nacht mit Interleukin 2 (10U) allein oder in lo Kombination mit Interleukin 15 (10 ng ml"1) stimuliert. Um die Interferon g Sekretion der NK-Zellen zu bestimmen wurden Interferonγ in den Überständen unter Einsatz eines IFNγELISA Kits (human lnterferonγ ELISA Kit (R&D Systems) bestimmt. Die Überexpression von BAT3 (oberer Teil der Abbildung), das von den Tumorzellen in den Überstand abgegeben wird (nachgewiesen im i5 Western Blot, siehe beiliegendes Manuskript) und auch die einer membranständigen Variante (unterer Teil der Abbildung) stimuliert die Interferon g Sekretion der NK-Zellen. (siehe Figur 2)
20
3. BAT3 ist für die Erkennung und Elimination von Tumoren (multiples
Myelom) essentiell: In vivo Experiment (Maus Xenograft Modell)
Humane multiple Myelomzellen (Linie RPMI8226) wurden Nacktmäusen injiziert. Das führt zur Bildung von subkutanen Tumoren in 8 von 10 Mäusen. Das Tumorvolumen am Tag 13 und Tag 20 ist angegeben (Kreise). Erhalten die Mäuse zusätzlich humane periphere Blutlymphozyten (PBL), so werden die Tumorzellen eliminiert und es kommt in keinem Fall zur Tumorbildung. Zusätzlich wurden den Mäusen Kontrollantikörper (control: Kontrollantikörper) verabreicht, die die Tumorzellerkennung nicht beeinträchtigen (schwarzes Kreuz). Erhalten die Mäuse jedoch BAT3-spezifische Antikörper, die das endogene BAT3 Protein deputieren, so ist die Tumorzellerkennung und Elimination gehemmt (gelbe Dreiecke, Tumoren in 6 von 10 Mäusen).
Diese Experiment zeigt, dass BAT3 in vivo für die Erkennung und Elimination von Tumorzellen notwendig ist. (siehe Figur 3)

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Behandlung und oder Diagnose von Tumorerkrankungen, zum Beispiel dem multiplen Myelom, durch die Aktivierung einer anti- 5 Tumor-Immunantwort nach Stimulierung des NKp30 Rezeptors und der Natural Cytotoxicity Receptors, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine physiologisch wirksame Menge des Proteins BAT3 und/oder BAT3/antiCD138 und/oder einem BAT3-Fragment und/oder BAT3-spezifische Antikörper in einem annehmbaren Trägermaterial enthält.
lo 2. Mittel nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das
Trägermaterial ein den wirkstofftransportierendes Transfermedium enthält.
3. Mittel nach einen der Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass es als Injektionsformulierung vorliegt und eingesetzt wird.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, i5 dass es als Formulierung für eine ex-vivo Anwendung im Rahmen einer zellulären Immuntherapie bei Tumorpatienten vorliegt und eingesetzt wird.
5. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Therapie von CD138 exprimierenden Tumoren eingesetzt wird, wie zum Beispiel Colon-, Lungen- oder Prostatakarzinom.
20 6. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nach Austausch des antiCD138 Anteils mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen, zur Therapie von Tumoren eingesetzt wird, die dieses Antigen exprimieren.
7. Verwendung des Proteins BAT3 als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
8. Verwendung des Proteins BAT3/antiCD138 als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
9. Verwendung von BAT3 spezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmente als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
10. Verwendung der BAT3 DNA und/oder RNA zur Herstellung von BAT3/antiCD138 analogen Konstrukten, in denen der CD138 bindende Anteils mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen fusioniert ist, als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen, die das betreffende Tumorantigen exprimieren.
11. Verwendung der BAT3 cDNA zur in vivo oder ex vivo Überexpression von BAT3 in Tumorzellen nach viralem oder nicht-viralem Gentranfer nach dem Stand der Technik zur Immuntherapie von malignen Erkrankungen.
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