EP2118667A2 - Verfahren und marker zur diagnose von nierenerkrankungen - Google Patents

Verfahren und marker zur diagnose von nierenerkrankungen

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EP2118667A2
EP2118667A2 EP08717730A EP08717730A EP2118667A2 EP 2118667 A2 EP2118667 A2 EP 2118667A2 EP 08717730 A EP08717730 A EP 08717730A EP 08717730 A EP08717730 A EP 08717730A EP 2118667 A2 EP2118667 A2 EP 2118667A2
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EP
European Patent Office
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differential diagnosis
vasculitis
diagnosis
markers
diseases
Prior art date
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Ceased
Application number
EP08717730A
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English (en)
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Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP08717730A priority Critical patent/EP2118667A2/de
Publication of EP2118667A2 publication Critical patent/EP2118667A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis, in particular the differential diagnosis of kidney diseases.
  • kidney disease The number of kidney disease patients has risen sharply in recent years. Therefore, kidney disease is a growing problem for health systems.
  • Kidney disease is irreversible, so early diagnosis and differential diagnosis of kidney disease is very important. Early detection and therapy tailored to the specific condition can reduce the risk of patients being dialysis dependent. In addition, a targeted disease also reduces the high cardiovascular disease risk of such patients.
  • biopsies are currently regarded as the "gold standard" in kidney diagnostics, they have the disadvantage that they are performed as an invasive procedure only for a selection of patients.
  • Urine analyzes are another approach to diagnosing kidney disease. However, only a few parameters in urine are measured today, e.g. Creatinine, urea, albumin, blood cells (especially leucocytes and erythrocytes), bacteria, sugars, urobilinogen, bilirubin and pH. The diagnostic value of these analyzes is limited, as there is a lack of sufficient sensitivity and selectivity, especially for differential diagnosis.
  • the object is achieved by a method for the diagnosis of kidney diseases comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers shown in Table 1 by values for the Molecular masses and the migration time are characterized.
  • the diagnosis according to the invention is a differential diagnosis.
  • the evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence or amplitude of the markers taking into account the following limits:
  • kidney diseases means another kidney disease (of the named diseases) than the above disease.
  • MEAN means the arithmetic mean, i. the sum of all values divided by the number of values.
  • “MEDIAN” is the mean value of a list, i. the smallest value where at least half of the values in the list are not larger. For an odd number of values, the median is the middle value of a list sorted in ascending order. For an even number of values, the median is the sum of the two average values obtained after sorting, divided by 2.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known accurately become. These standards may be, for example, the polypeptides given in the examples (see Example 3).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be.
  • polypeptide markers molecular mass and migration time
  • the polypeptides of the invention are used to diagnose kidney disease.
  • Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is different send.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of the kidney disease.
  • polypeptide markers which are typically present in individuals with kidney disease, but are less common or non-existent in individuals without kidney disease.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • the tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • amplitude markers via an alternative standardization procedure: in this case, all peptide signals of a sample are scaled with a common normalization factor.
  • All groups used consist of at least 20 individual patient or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that kidney disease is present; it corresponds more closely to the mean amplitudes of the control group and is not to be assumed to be a kidney disease.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
  • the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - are included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined may be any individual who may be suffering from renal disease.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • not only three polypeptide markers but a larger combination of markers are used to facilitate differential diagnostics. It is by their presence or absence on the accurate kidney disease closed. By comparing a plurality of polypeptide markers, the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the individual may be analyzed prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s).
  • ker be pretreated by any suitable means and, for example, purified or separated.
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may, for example, be centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by means of a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. For mass spectrometers, an ion-forming unit with a suitable analyzer coupled.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions.
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of UAS. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, ie show their hydrophilic groups on the inside, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to remove the Improve resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for diagnosis.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) and from patients with kidney disease.
  • the proteins also found in urine of higher concentration patients such as albumin and immunoglobulins be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml of ultrafiltrate were obtained.
  • CE-MS measurements were carried out using a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and an Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D). carried out.
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the sheath flow at the MS, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) before injecting the sample, and then injecting a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
  • GIVLY sequence: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min The proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water. "REV”, “ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
  • further proteins from his sample for the assignment, for example ten proteins.
  • migration times are either lengthened or shortened by certain absolute values, or upsets or knocks occur throughout the course. Comigrating peptides also comigrate under such conditions.

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Abstract

Verfahren zur Diagnostik von Nierenerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Verfahren und Marker zur Diagnose von Nierenerkrankunqen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose, insbesondere die Differenzialdiagno- se von Nierenerkrankungen.
Die Anzahl an Patienten mit Nierenerkrankungen ist in den letzten Jahren stark angestiegen. Daher stellen Nierenerkrankungen ein wachsendes Problem für die Gesundheitssysteme dar.
Nierenerkrankungen sind irreversibel, daher ist eine Früherkennung und eine Diffe- renzialdiagnose von Nierenerkrankungen sehr wichtig. Frühe Erkennung und eine Therapie, die genau an die spezielle Erkrankung angepasst ist, können das Risiko verringern, dass die Patienten dialysepflichtig werden. Darüber hinaus reduziert eine zielgerichtete Erkrankung auch das hohe cardiovaskuläre Erkrankungsrisiko solcher Patienten.
Zur Zeit beruht die genaue Diagnose bzw. Differentialdiagnose überwiegend auf Nierenbiopsien. Obwohl Biopsien zur Zeit als "Goldstandard" in der Nierendiagnostik angesehen werden, haben sie den Nachteil, dass sie als invasiver Eingriff nur für eine Auswahl an Patienten durchgeführt werden.
Urinanalysen sind ein weiterer Ansatz zur Diagnose von Nierenerkrankungen. Allerdings werden heutzutage nur wenige Parameter im Urin gemessen, z.B. Kreatinin, Harnstoff, Albumin, Blutzellen (insbesondere Leukozyten und Erythrozyten), Bakterien, Zucker, Urobilinogen, Bilirubin und der pH-Wert. Der diagnostische Wert dieser Analysen ist begrenzt, da es an einer hinreichenden Sensitivität und Selektivität fehlt, insbesondere zur Differentialdiagnostik.
Verschieden Versuche sind unternommen worden, um Proteine im Urin zu charakterisieren.
V. Thongboonkerd et al., Kidney International, Vol. 63 (2001) Seiten 1461-1469 beschreiben zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) in Verbindung mit matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectro- metry (MALDI-TOF) gefolgt von Massenfingerprinting, um Urinproben zu untersuchen. Insgesamt wurden 67 Formen von 47 einzelnen Proteinen identifiziert.
CS. Spahr et al., Proteomics Vol. 1, (2001) Seiten 93-107 haben Proteine aus Urinproben mit Trypsin gespalten und konnten 751 Peptide aus 124 Proteinen mittels Flüssigchromatographie und Tandemmassenspektrometrie ermitteln.
Diese Untersuchung betraf nur gesunde Probanden. Die Untersuchungen haben sich nicht damit befasst, ob Änderungen in der Zusammensetzung von Polypeptiden im Urin zur Diagnose oder Differentialdiagnose von Nierenerkrankungen geeignet sind.
Es ist vorgeschlagen worden, die An- oder Abwesenheit von Polypeptiden im Urin zur Diagnose von Membranglomerulnephritis (MGN) einzusetzen (von Neuhoff et al. Mass Spectrometry for the Detection of Differentially Expressed Proteins: A com- parison of Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization and Capillary Electropho- resis/Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 18, (2004) 149-156). Es wurden jedoch nur acht Patienten in die Studie einbezogen, die sich im Wesentlichen mit verschiedenen Analysemethoden befasste. Aufgrund der kleinen Patientenanzahl ist der tatsächlich diagnostische Wert dieser Marker unklar.
E. M. Weissinger et al. in Kidney International 65 (2004) Seiten 2426-2434, beschreiben eine Analyse von Proteompattern unter Verwendung von Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie. Die Anzahl der identifizierten Peptide zur Unterscheidung von Patienten mit verschiedenen Nierenerkrankungen war klein.
M. Haubitz et al. in Kidney International 67 (2005) Seiten 2313-2320 beschreiben Urin-Proteinpattern als diagnostisches Hilfsmittel für IgA Nephropathie. Die identifizierten Peptide können verwendet werden, um gesunde Probanden von Patienten zu unterscheiden. Die Anzahl der identifizierten Peptide ist jedoch klein.
H. Mischak et al. in Clinical Science 107 (2004) Seiten 485-495 beschreiben die Proteomanalyse zur Bewertung von diabetischen Nierenschäden. Es wurden eine geringe Anzahl an Peptiden identifiziert, die mit dem Fortschreiten der Erkrankung häufiger bzw. mit geringerer Häufigkeit vorkommen. Aufgrund der geringen Anzahl von Proben kann in diesen Arbeiten keine hinreichende Spezifität für die Diagnose, insbesondere Differentialdiagnose von Nierenerkrankungen erreicht werden. Daher ist weiterhin Bedarf an einer schnellen und einfachen Methode zur Diagnose, insbesondere Differentialdiagnose von Nierenerkrankungen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel für die Diagnose von Nierenerkrankungen, insbesondere die Differentialdiagnose von Nierenerkrankungen bereit zu stellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik von Nierenerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptid- marker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.
Insbesondere handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Diagnostik um eine Differentialdiagnostik. Die Auswertung der gemessenen Polypeptide kann anhand der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker unter Berücksichtigung der folgenden Grenzwerte erfolgen :
Differentialdiagnostik zwischen gesund und Nierenerkrankung anhand Tabelle 2 Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierten Schäden und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 3
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 4
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 5
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 6
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 7 Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 8
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 9
Differentialdiagnostik zwischen akuter Vaskulitis und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 10
Differentialdiagnostik zwischen Vaskulitis und anderen Erkrankungen anhand Tabelle 11
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und diabetischer Nephropathie anhand Tabelle 12
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und fokale segmentale Glomerulosklerose anhand Tabelle 13
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und minimal change disease anhand Tabelle 14
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 15
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Normalkontrollen anhand Tabelle 16
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Lupusnephritis anhand Tabelle 17
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 18
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Vaskulitis anhand Tabelle 19
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und fokaler segmentaler Glomerulosklerose anhand Tabelle 20
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und minimal change disease anhand Tabelle 21 Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 22
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Normalkontrollen anhand Tabelle 23
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Lupusnephritis anhand Tabelle 24
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 25
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Vaskulitis anhand Tabelle 26
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und minimal change disease anhand Tabelle 27
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 28
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und Normalkontrollen anhand Tabelle 29
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und Lupusnephritis anhand Tabelle 30
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 31
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und Vaskulitis anhand Tabelle 32
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Calcineurin-Inhibitor- induzierte Schäden anhand Tabelle 33
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und diabetischer Nephropathie anhand Tabelle 34
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und fokaler segmentaler Glomerulosklerose anhand Tabelle 35 Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und minimal change disease anhand Tabelle 36
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 37
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Normalkontrollen anhand Tabelle 38
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Lupusnephritis anhand Tabelle 39
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 40
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Vaskulitis anhand Tabelle 41
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 42
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Normalkontrollen anhand Tabelle 43
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Lupusnephritis anhand Tabelle 44
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 45
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Vaskulitis anhand Tabelle 46
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Normalkontrollen anhand Tabelle 47
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Lupusnephritis anhand Tabelle 48
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 49 Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Vaskulitis anhand Tabelle 50
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und Normalkontrollen anhand
Tabelle 51
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und akuter Vaskulitis anhand
Tabelle 52
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und Vaskulitis anhand Tabelle
53
Differentialdiagnostik zwischen akuter Vaskulitis und Normalkontrollen anhand
Tabelle 54
Differentialdiagnostik zwischen Vaskulitis und Normalkontrollen anhand Tabelle
55.
"Andere Erkrankungen" bedeutet eine andere Nierenerkrankung (von den genannten Erkrankungen) als die vorstehende Erkrankung.
In den Tabellen bedeutet "MEAN" den arithmetrischen Durchschnitt, d.h. die Summe aller Werte geteilt durch die Anzahl an Werte.
"MEDIAN" ist der mittlere Wert einer Liste, d.h. der kleinste Wert, bei dem mindestens die Hälfte der Werte in der Liste nicht größer sind. Bei einer ungeraden Anzahl an Werte ist der Median der mittlere Wert einer nach aufsteigender Reihenfolge sortierten Liste. Bei einer geraden Anzahl an Werten ist der Median die Summe der beiden nach einer Sortierung erhaltenen mittleren Werte geteilt durch 2.
In den Tabellen sind Mean und Median ohne Einbeziehung der 0, d.h. nur auf tatsächlich gemessene Werte berechnet. Unter Einbeziehung der Messwerte 0 verringern sich die Werte entsprechend. Sie können für jeden einzelnen Wert berechnet werden, in dem mit dem Wert der Frequenz multipliziert wird. Beispielsweise ist für den Marker mit der ID 629 in der Tabelle 2 ein Mean von 219,30 angegeben . Da 49% der Messung den Wert 0 ergeben, beträgt unter Berücksichtigung dieser Angabe der "Mean" 111,84. Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch- Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch- Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für jede der angegebenen Erkrankungen, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für jede der angegebenen Erkrankungen, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Mas- senspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alky- lierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um Nierenerkrankungen zu diagnostizieren.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwe- send. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für die Nierenerkrankung ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit Nierenerkrankung vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne Nierenerkrankung seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit Nierenerkrankung vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne Nierenerkrankung nicht oder nur seltener vorhanden sind.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsver- fahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben.
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Refe- renzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.
Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patienten- oder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer Nierenerkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll- Gruppe, ist nicht von einer Nierenerkrankung auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitu- denmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Nierenerkrankungen leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet, um Differentialdiagnostik zu ermöglichen. Dabei wird durch ihre An- oder Abwesenheit auf die genaue Nierenerkrankung geschlossen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von PoIy- peptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine U- rinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmar- ker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifu- gation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D- PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die mas- senspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analy- segerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhan- ced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectro- metry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von UAS zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI- TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere PoIy- peptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.
Besonders bevorzugt werden nicht nur Marker verwendet, die in US 2006/028660211 beschrieben sind.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65 :2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an Nierenerkrankungen leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μl Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultra- filtrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (A- mersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und gegen 2,5 ml 0,01% NH4OH entsalzt und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beck- man Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath- Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI- MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert. Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind:
Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 20,95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind in der folgenden Tabelle angegeben :
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertiggestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im wesentlichen linearer Zusammenhang besteht. In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Comigrierende Peptide comigrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik von Nierenerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmar- ker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnostik eine Differentialdiagnostik ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der
Marker anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
Differentialdiagnostik zwischen gesund und Nierenerkrankung anhand Tabelle 2 Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierten Schäden und andere Erkrankungen anhand Tabelle 3
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und andere Erkrankungen anhand Tabelle 4
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und andere Erkrankungen anhand Tabelle 5 - Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und andere Erkrankungen anhand Tabelle 6
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und andere Erkrankungen anhand Tabelle 7 Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und andere Erkrankungen anhand Tabelle 8
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und andere Erkrankungen anhand Tabelle 9
Differentialdiagnostik zwischen akuter Vaskulitis und andere Erkrankungen anhand Tabelle 10 Differentialdiagnostik zwischen Vaskulitis und andere Erkrankungen anhand Tabelle 11
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und diabetischer Nephropathie anhand Tabelle 12 - Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte
Schäden und fokale segmentale Glomerulosklerose anhand Tabelle 13
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und minimal change disease anhand Tabelle 14 - Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte
Schäden und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 15 Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Normalkontrollen anhand Tabelle 16 Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Lupusnephritis anhand Tabelle 17
Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 18 Differentialdiagnostik zwischen Calcineurin-Inhibitor-induzierte Schäden und Vaskulitis anhand Tabelle 19 - Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und fokaler segmentaler Glomerulosklerose anhand Tabelle 20 Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und minimal change disease anhand Tabelle 21 Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 22
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Normalkontrollen anhand Tabelle 23
Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Lupusnephritis anhand Tabelle 24 - Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 25 Differentialdiagnostik zwischen diabetischer Nephropathie und Vaskulitis anhand Tabelle 26
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und minimal change disease anhand Tabelle 27 - Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 28 Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und Normalkontrollen anhand Tabelle 29 Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomeruloskle- rose und Lupusnephritis anhand Tabelle 30
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 31
Differentialdiagnostik zwischen fokaler segmentaler Glomerulosklerose und Vaskulitis anhand Tabelle 32 - Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Calcineurin-
Inhitor-induzierte Schäden anhand Tabelle 33
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und diabetischer Nephropathie anhand Tabelle 34 Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und fokaler seg- mentaler Glomerulosklerose anhand Tabelle 35
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und minimal change disease anhand Tabelle 36
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 37 - Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Normalkontrollen anhand Tabelle 38
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Lupusnephritis anhand Tabelle 39 Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und akuter Vasku- litis anhand Tabelle 40
Differentialdiagnostik zwischen IgA Nephropathie und Vaskulitis anhand Tabelle 41 Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und membranöser Glomerulonephritis anhand Tabelle 42 Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Normalkontrollen anhand Tabelle 43 - Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Lupus- nephritis anhand Tabelle 44
Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 45 Differentialdiagnostik zwischen minimal change disease und Vaskuli- tis anhand Tabelle 46
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Normalkontrollen anhand Tabelle 47
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Lupusnephritis anhand Tabelle 48 - Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 49
Differentialdiagnostik zwischen membranöser Glomerulonephritis und Vaskulitis anhand Tabelle 50 Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und Normalkontrollen anhand Tabelle 51
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und akuter Vaskulitis anhand Tabelle 52
Differentialdiagnostik zwischen Lupusnephritis und Vaskulitis anhand Tabelle 53 - Differentialdiagnostik zwischen akuter Vaskulitis und Normalkontrollen anhand Tabelle 54
Differentialdiagnostik zwischen Vaskulitis und Normalkontrollen anhand Tabelle 55.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindes- tens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindes- tens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe eines Individuums eine Mittelstrahlurinprobe.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
9. Verwendung von mindestens drei Polypeptidmarker ausgewählt aus den Markern gemäß Tabelle 1, die durch die Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist, zur Diagnostik von Nierenerkrankungen.
10. Verfahren zur Diagnose von Nierenerkrankungen umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens drei, bevorzugt 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens fünf Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmar- kers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und
Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
13. Markerkombination, umfassend mindestens 10 Marker ausgewählt aus den Markern der Tabelle 1, die durch Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 10 bis 12, wobei die Sensitivität mindestens 60% und die Spezifität mindestens
60% beträgt.
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