EP2217362A2 - Verkapselte mikropartikel mit einem virenhaltigen kern und verfahren zur herstellung der mikropartikel - Google Patents

Verkapselte mikropartikel mit einem virenhaltigen kern und verfahren zur herstellung der mikropartikel

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Publication number
EP2217362A2
EP2217362A2 EP08854538A EP08854538A EP2217362A2 EP 2217362 A2 EP2217362 A2 EP 2217362A2 EP 08854538 A EP08854538 A EP 08854538A EP 08854538 A EP08854538 A EP 08854538A EP 2217362 A2 EP2217362 A2 EP 2217362A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microparticles
microparticle
viruses
range
bar
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08854538A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Robert Schatz
Stefan Schwab
Eberhard Schlücker
Andreas Scheurer
Detlef Freitag
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AGROLYTIX GmbH
Original Assignee
Friedrich Alexander Universitaet Erlangen Nuernberg
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Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich Alexander Universitaet Erlangen Nuernberg filed Critical Friedrich Alexander Universitaet Erlangen Nuernberg
Publication of EP2217362A2 publication Critical patent/EP2217362A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages

Definitions

  • the invention relates to encapsulated microparticles having a core containing viruses in free or carrier-bound form and a shell enclosing the core.
  • the invention further relates to an associated manufacturing method for the microparticles.
  • the encapsulation serves in particular to improve the UV stability and increase the rate of uptake of baculoviruses by a host organism used for pest control.
  • viruses for pest control is sought in organic and integrated agriculture.
  • the commercial use of viral particles necessitates the finding of formulations which permit a practicable handling of the viruses, that is to say the particular preparations to be used must have sufficient stability in the field of use, a sufficient dosage of viral particles and, if appropriate, satisfy existing safety regulations.
  • baculovirus-based biological insecticides combine positive ecological and economic aspects.
  • Baculoviruses against cotton bollworm, sponge moth, codling moth and apple peel winder In Germany, only baculoviruses of the genus granulovirus currently have a license. These are the apple peel worm granulovirus and codling granulovirus.
  • Granuloviruses generally have the property that they attack only the larval stages of their host (insects). In order to develop their pathogenicity, they must be actively taken up by the host and then endocytosed into the intestinal epithelial cells in the digestive tract, where they pass into their virulent form. As a result, the infected larvae are killed within 5 to 9 days and cause no damage to the apple. In practice, however, it has been found that the uptake rate of the virus is too low, with the consequence that the codling moth does not die shortly after eating and / or boring into the apple.
  • Arthurs et al. describe first the preparation and use of spray-dried, lignin-encapsulated formulations of the granulovirus CpGV for controlling Cydia pomonella, wherein the formulation TiC> 2 is used as UV stabilizer and sugar as Frausslockstoff (Evaluation of spray-dried lignin-based formulations and adjuvant as solar protectants for the granulovirus of the codling moth, Cydia pomonella (L) - Arthurs, SP; Lacey, LA; Behle, RW; Yakima Agricultural Research Laboratory, USA; Journal of Invertebrate Pathology (2006), 93 (2), 88-95 ).
  • the invention is based on encapsulated microparticles having a core which contains viruses in free or carrier-bound form and a shell which encloses the core.
  • the microparticles according to the invention are characterized in that the shell to at least 50% by weight of one or more triacylglycerides having a chain length of the fatty acids of C10 to C24.
  • the invention is based on the finding that saturated or unsaturated triacylglycerides having a chain length of the fatty acids with a length of 10 to 24 carbon atoms allow the encapsulation of viruses in free or carrier-bound form without their viral activity being inhibited.
  • the choice of material for the shell has, inter alia, the advantage that they allow rapid resorption of the virus after ingestion by the host, because it is precisely these fats happen easily epithelial cells in the digestive tract of the pests.
  • the triacylglyceride shell is particularly suitable for serving as a matrix for further additives, especially if they have a hydrophobic character. Kern within the meaning of the invention is understood to mean all components of the microparticle encompassed by the shell.
  • the core need not be compact as a singulated particle, but may contain multiple, separate fragments. It is therefore conceivable to encapsulate several carrier fragments for the viruses with a common shell.
  • the shell consists of at least 70% by weight of triacylglycerides.
  • Triacylglycerides are esters of the trivalent alcohol glycerol with three fatty acid molecules. Natural fats consist for the most part of triacylglycerides with three long-chain fatty acids, which usually consist of unbranched chains having 4 to 26, typically 12 to 22 carbon atoms. For the purposes of the invention are particularly suitable fatty acids having 10 to 24 carbon atoms.
  • the triacylglyceride preferably has a melting point in the range of 10 to 100 0 C, in particular in the range of 25 to 80 0 C, particularly preferably in the range of 25 to 65 ° C.
  • the triacylglyceride is tripalmitin or a tripalmitin-containing mixture of triacylglycerides, in particular palm fat.
  • Palm fat is characterized on the one hand by its low production costs and on the other contains carotene, which, as will be explained in more detail below, can serve as a UV stabilizer to protect the biological agent.
  • tripalmitin or tripalmitin-containing mixtures, such as palm oil are the main ingredients of apple cores and leaf adults and thus act as feed attractants for the codling moth, and are therefore particularly preferred in connection with the use of codling granulovirus.
  • the microparticles preferably have an average diameter in the range from 500 nm to 500 ⁇ m, in particular from 1 to 50 ⁇ m. Microparticles of this size can be discharged in particular with the already existing in agriculture conventional spray devices.
  • the number of viruses per microparticle should preferably be 1 to 10, more preferably 1 to 2 viruses per particle.
  • the shell contains an emulsifier as an additive.
  • the emulsifier is a mono- and diacylglyceride, lecithin, pectin, a sugar ester or mixtures thereof.
  • a proportion of the emulsifier in the total weight of the microparticle is preferably between 0.1 and 15% by weight.
  • the emulsifier serves primarily to facilitate the preparation of an aqueous suspension containing the microparticles.
  • a further preferred embodiment which can again be implemented in combination with all of the aforementioned embodiments, provides that the shell contains a UV stabilizer as an additive.
  • the UV stabilizer serves to improve the stability of the viruses to natural UV radiation.
  • the UV stabilizer used is preferably TiC> 2 , carotenoids, flavonoids, skimmed milk powder, mycosporine-like amino acids (MAA), scytonemin or mixtures thereof.
  • the use of UV stabilizers is particularly advantageous in the codling granulovirus.
  • the shell may contain a Frriblockstoff as an additive.
  • the Frriblockstoff is preferably a pheromone, in particular 2 (E), 4 (Z) - Ethyldecadienoat, glutamate or sugar, in particular sucrose, glucose or fructose.
  • Many pheromones are highly volatile, so that their biological effect no longer exists shortly after delivery. However, many of these pheromones are lipophilic, so incorporation into a lipophilic matrix delays the release behavior to the desired extent. This applies in particular to the aforementioned attractant of codling granulovirus.
  • the compound mentioned serves as a pheromone for adult females as well as Frriblockstoff for codling larvae.
  • baculoviruses in particular from the genus granulovirus.
  • the microparticles very particularly advantageously contain apple peel winder granuloviruses or codling granuloviruses.
  • a particularly preferred microparticle for the latter two viruses contains as triacylglyceride tripalmitin and / or a tripalmitin-containing mixture, in particular palm fat.
  • this microparticle contains 2 (E), 4 (Z) - Ethylenedecadienoate as Frausslockstoff and a UV stabilizer.
  • the viruses can be used in ring form or else bound to a carrier. Other, the stabilization of the virus serving additives are possible.
  • Another aspect of the invention is to provide a method of making an encapsulated microparticle.
  • the method according to the invention comprises the steps:
  • PGSS plant Providing a capsule material which consists of at least 50% by weight of one or more triacylglycerides having a chain length of the fatty acids of C10 to C24 in a pressure vessel of a high pressure particulate generation plant (PGSS plant);
  • Spraying the melt through a nozzle or capillary Spraying the melt through a nozzle or capillary.
  • the so-called PGSS process is a high-pressure method for producing particles.
  • any number of liquefiable solids can be mixed and processed into free-flowing powder.
  • supercritical fluids are used as auxiliaries. Melting is homogenized and pulverized by mixing the liquefied individual components with compressed carbon dioxide and subsequently depressurizing them, for example via a nozzle. The melt is thereby torn into tiny droplets. It forms the finest powder, which opens up new applications due to its specifically adjustable size (nanometer to micrometer), morphology and composition.
  • the PGSS process can be operated both continuously and batchwise.
  • the compressed gas is preferably selected from the group consisting of carbon dioxide, nitrous oxide, alkanes having a boiling point of less than 50 0 C at 1 bar, alkenes having a boiling point of less than 50 0 C at 1 bar, hydrofluorocarbons having a boiling point less than 50 ° C at 1 bar and mixtures the said gases.
  • Particularly preferred are carbon dioxide, ethane, propane or butane.
  • the compressed gas is carbon dioxide or propane.
  • Propane and carbon dioxide have a particularly favorable for the purposes of the invention Joule-Thompson effect and evaporate well from the shell, so that at most only small contaminants remain.
  • spray-drying may also be carried out, precipitation from suitable solvents or alternative high-pressure spraying processes may be used.
  • the method according to the invention has the advantage that no solvent is used which subsequently has to be separated off or contaminates the particles. Compared with spray drying, lower working temperatures result since, for example, the use of carbon dioxide lowers the melting temperature of the mixture and its viscosity.
  • Other high-pressure processes usually work with higher carbon dioxide and energy requirements, so they are less economical in this case.
  • the step of charging the melt with gas is preferably carried out at a pressure in the range of 100 to 200 bar. Further, the temperature in this step is preferably in the range of 25 to 80 0 C.
  • the nozzles or capillaries of the PGSS system preferably have a diameter in the range of 50 ⁇ m to 1500 ⁇ m.
  • the capsule material and the additives are melted and the viruses are dispersed in the melt.
  • the melt is charged with carbon dioxide, the pressure between 20 and 500 bar (preferably 100-200 bar) is selected and the temperature between 10 0 C and 100 0 C (preferably 25 ° C to 65 ° C) is set , but at least so high that the capsule material melts. Temperature and dwell time are chosen so that the viruses are not deactivated.
  • the capsule material is sprayed with the dissolved carbon dioxide through a nozzle or capillary (diameter between 50 microns and 1500 microns, preferably 200 - 500 microns). The resulting particles are collected.
  • 150 g capsule material (.. 80 wt% tripalmitin, 20% by weight of palmitic) are melted at 60 0 C and (4 ml of a glycerol-containing codling moth Granulovirus suspension available under the trade name Madex; virus concentration about 3 x 10 13 viruses per liter ).
  • the mixture is introduced in a pressure vessel with stirrer.
  • the temperature of the melt is maintained at 60 ° C and it is added via a compressor carbon dioxide, so that a pressure of 100 bar sets and stirred for 30 min.
  • a nozzle connected to the container 60 ° hollow cone nozzle, 400 microns
  • the mean size of the capsules obtained is 15 ⁇ m.
  • the calculated load is 1, 25 viruses per capsule.
  • Viruses heated to 65 ° C for 1 h have an efficiency of 95% compared to thermally untreated viruses. At 70 0 C heated viruses still have an efficiency of about 88%, at 80 0 C heated viruses kill only 30% of the larvae.
  • microparticles prepared by the above method showed in animal experiments an efficiency of over 88%, based on unencapsulated viruses.
  • the encapsulated viruses showed an improved efficiency compared to untreated viruses, indicating both improved UV stabilization and increased uptake rates.

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Abstract

Die Erfindung betrifft verkapselte Mikropartikel mit einem Kern, der Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form enthält, und einer Hülle, die den Kern umschließt. Die Mikropartikel zeichnen sich dadurch aus, dass die Hülle zu mindestens 50 Gew.% aus einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht.

Description

Verkapselte Mikropartikel mit einem virenhaltigen Kern und Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel
Die Erfindung betrifft verkapselte Mikropartikel, mit einem Kern, der Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form enthält, und einer Hülle, die den Kern umschließt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein dazugehöriges Herstellungsverfahren für die Mikropartikel. Die Verkapselung dient insbesondere der Verbesserung der UV-Stabilität und Erhöhung der Aufnahmerate von Baculoviren durch einen Wirtsorganismus, die zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden.
Technologischer Hintergrund und Stand der Technik
In zunehmendem Maße wird beispielsweise im ökologischen und integrierten Landbau der Einsatz von Viren zur Schädlingsbekämpfung angestrebt. Der kommerzielle Einsatz viraler Partikel bedingt die Notwendigkeit Formulierungen zu finden, die eine praktikable Handhabung der Viren erlauben, das heißt, die jeweils einzusetzenden Präparate müssen hinreichende Stabilität im Einsatzfeld, eine ausreichende Dosierung an viralen Partikeln besitzen sowie gegebenenfalls bestehenden Sicherheitsbestimmungen genügen.
So stellt beispielsweise der Einsatz von Baculoviren im ökologischen und integrierten Landbau eine bisher sehr bewährte biologische Bekämpfungsstrategie dar. Diese beruht auf einer absoluten Selektivität der Viren, ihrer Nützlingsschonung bei gleichzeitig sehr guter Wirksamkeit gegen den Zielorganismus und einer Ungiftigkeit gegenüber Anwender und Umwelt. Damit vereinigen auf Baculoviren basierende biologische Insektizide positive ökologische und ökonomische Aspekte. Aktuell sind aus der Familie der Baculoviren mehrere hundert Arten bekannt, einige davon sind mittlerweile als Insektizide zugelassen, so z.B. Baculoviren gegen den Baumwollkapselwurm, Schwammspinner, Apfelwickler und Apfelschalenwickler. In Deutschland besitzen derzeit nur Baculoviren aus der Gattung Granulovirus eine Zulassung. Dabei handelt es sich um das Apfelschalenwickler- Granulovirus und das Apfelwickler-Granulovirus.
Der ursprünglich nur in Europa vorkommende Apfelwickler (Cydia pomonella L.) ist inzwischen weltweit verbreitet und stellt einen der bedeutendsten Schädlinge in der Landwirtschaft dar. Für seine Bekämpfung werden im konventionellen Obstbau bevorzugt synthetische Insektizide eingesetzt, wohingegen im ökologischen Obstbau Pheromone und Apfelwickler-Granuloviren Anwendung finden. Auch im integrierten Obstbau vertraut man vermehrt auf die Wirkung der Granuloviren. Dies soll unter anderem einer zu schnellen Resistenzbildung gegen synthetische Insektizide entgegen wirken.
Granuloviren haben generell die Eigenschaft, dass sie ausschließlich die Larvenstadien ihres Wirtes (Insekten) befallen. Zur Entfaltung ihrer Pathogenität müssen sie aktiv vom Wirt aufgenommen werden um anschließend im Verdauungstrakt endocytotisch in die Darmepithelzellen zu gelangen, wo sie in ihre virulente Form übergehen. Dadurch werden die infizierten Larven innerhalb von 5 bis 9 Tage abgetötet und verursachen keinen Schaden mehr am Apfel. In der Praxis hat es sich jedoch gezeigt, dass die Aufnahmerate des Virus zu gering ist, mit der Konsequenz, dass die Apfelwicklerlarve nicht kurz nach dem Fressen oder/und dem Einbohren in den Apfel abstirbt. Erschwerend kommt noch hinzu, dass die Halbwertszeit des Apfelwickler-Granulovirus grundsätzlich nur bei zwei vollen Sonnentagen liegt und damit die einzelnen Spritzungen spätestens nach acht Tagen wiederholt werden müssen, damit ein ausreichender Schutz der Äpfel gewährleistet ist. In sonnigen Jahren kann dies bis zu 13 Wiederholungen und mehr für den Landwirt bedeuten. Um diesen Nachteilen entgegenzuwirken wird bisher zur Steigerung der Aufnahmerate des Virus die Zugabe von Zucker (5 kg/ha) und zur Verbesserung seiner UV-Stabilität die Zugabe von zum Beispiel 0,25% Magermilchpulver zur Spritzbrühe empfohlen. Die genannten Zusätze werden in die hoch verdünnte Spritzbrühe (Wasser und Virus) in erheblichen Mengen hinzugefügt, damit sichergestellt ist, dass sich die gewünschten Verbesserungen in Aufnahmerate und UV-Stabilität einstellen. Trotz vielversprechender Lösungsansätze zur Verbesserung des Einsatzes von Viren, insbesondere Baculoviren, als biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel im Landbau steht bisher noch kein Präparat zur Verfügung, das allen Anforderungen der Praxis genügt.
Arthurs et al. beschreiben als Erste die Herstellung und Verwendung sprühgetrockneter, ligninverkapselter Formulierungen des Granulovirus CpGV zur Bekämpfung von Cydia pomonella, wobei die Formulierung TiC>2 als UV-Stabilisator und Zucker als Fraßlockstoff eingesetzt ist (Evaluation of spray-dried lignin-based formulations and adjuvante as solar protectants for the granulovirus of the codling moth, Cydia pomonella (L) - Arthurs, S. P.; Lacey, L. A.; Behle, R. W.; Yakima Agricultural Research Laboratory, USA; Journal of Invertebrate Pathology (2006), 93(2), 88 - 95).
Erfindungsgemäße Lösung
Die Erfindung geht aus von verkapselten Mikropartikeln mit einem Kern, der Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form enthält, und einer Hülle, die den Kern umschließt. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel zeichnen sich dadurch aus, dass die Hülle zu mindestens 50 Gew.% aus einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass gesättigte oder ungesättigte Triacylglyceride mit einer Kettenlänge der Fettsäuren mit einer Länge von 10 bis 24 Kohlenstoff-Atomen die Verkapselung von Viren in freier oder an Träger gebundener Form erlauben, ohne dass deren virale Aktivität gehemmt ist. Die Materialwahl für die Hülle hat unter anderem den Vorteil, dass sie eine schnelle Resorption der Viren nach Aufnahme durch den Wirt ermöglichen, denn gerade diese Fette passieren besonders einfach die Epithelzellen im Verdauungstrakt der Schädlinge. Weiterhin ist die Triacylglycerid-Hülle besonders dazu geeignet, als Matrix für weitere Additive zu dienen, insbesondere wenn diese einen hydrophoben Charakter besitzen. Unter Kern im Sinne der Erfindung werden alle von der Hülle umfassten Bestandteile des Mikropartikels verstanden. Der Kern muss nicht kompakt als ein vereinzeltes Teilchen vorliegen, sondern kann mehrere, voneinander getrennte Fragmente beinhalten. Es ist also denkbar, mehrere Trägerfragmente für die Viren mit einer gemeinsamen Hülle zu verkapseln.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung besteht die Hülle zu mindestens 70 Gew.% aus Triacylglyceriden.
Triacylglyceride sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin mit drei Fettsäuremolekülen. Natürliche Fette bestehen zum überwiegenden Teil aus Triacylglyceriden mit drei langkettigen Fettsäuren, die meist aus unverzweigten Ketten mit 4 bis 26, typischerweise 12 bis 22 Kohlenstoff-Atomen bestehen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen sich in besonderer Weise Fettsäuren mit 10 bis 24 Kohlenstoff-Atomen.
Das Triacylglycerid weist vorzugsweise einen Schmelzpunkt im Bereich von 10 bis 1000C, insbesondere im Bereich von 25 bis 800C, besonders bevorzugt im Bereich von 25 bis 65°C auf.
Bevorzugt ist weiterhin, dass das Triacylglycerid Tripalmitin oder ein tripalmitin-haltiges Gemisch von Triacylglyceriden, insbesondere Palmfett, ist. Palmfett zeichnet sich zum einen durch seine geringen Gestehungskosten aus und enthält zum anderen Carotin, welches, wie weiter unten noch näher erläutert wird, als UV-Stabilisator zum Schutz des biologischen Agens dienen kann. Weiterhin sind Tripalmitin oder tripalmitin-haltige Gemische wie Palmfett Hauptinhaltsstoffe von Apfelkernen und Blattwachsen und wirken somit an sich als Fraßlockstoff für den Apfelwickler, sind also im Zusammenhang mit der Verwendung des Apfelwickler-Granulovirus besonders bevorzugt. Die Mikropartikel weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 500 μm, insbesondere von 1 bis 50 μm auf. Mikropartikel dieser Größenordnung lassen sich insbesondere mit den im Landbau bereits vorhandenen konventionellen Sprühvorrichtungen austragen. Die Anzahl der Viren pro Mikropartikel sollte vorzugsweise bei 1 bis 10, besonders bevorzugt bei 1 bis 2 Viren pro Partikel liegen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die sich insbesondere mit den zuvor genannten bevorzugten Ausführungsformen kombinieren lässt, enthält die Hülle einen Emulgator als Additiv. Vorzugsweise ist der Emulgator ein Mono- und Diacylglycerid, Lecithin, Pektin, ein Zuckerester oder besteht aus Gemischen derselben. Ein Anteil des Emulgators am Gesamtgewicht des Mikropartikels liegt vorzugsweise zwischen 0,1 bis 15 Gew.%. Der Emulgator dient vornehmlich dazu, die Herstellung einer wässrigen, die Mikropartikel enthaltenden Suspension zu erleichtern.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform, die abermals auch in Kombination mit allen zuvor genannten Ausführungsformen realisierbar ist, sieht vor, dass die Hülle einen UV-Stabilisator als Additiv enthält. Der UV-Stabilisator dient der Verbesserung der Stabilität der Viren gegenüber natürlicher UV-Strahlung. Vorzugsweise wird als UV-Stabilisator TiC>2, Carotinoide, Flavonoide, Magermilchpulver, mycosporin-artige Aminosäuren (englisch: mycosporin-like amino acid MAA), Scytonemin oder Gemische derselben eingesetzt. Der Einsatz von UV-Stabilisatoren ist insbesondere bei dem Apfelwickler-Granulovirus besonders vorteilhaft.
Weiterhin kann die Hülle einen Fraßlockstoff als Additiv enthalten. Auch diese Ausführungsform lässt sich mit allen zuvor genannten bevorzugten Ausführungsformen kombinieren. Der Fraßlockstoff ist vorzugsweise ein Pheromon, insbesondere 2(E), 4(Z)- Ethyldecadienoat, Glutamat oder Zucker, insbesondere Saccharose, Glukose oder Fruktose. Viele Pheromone sind stark flüchtig, so dass ihre biologische Wirkung schon kurze Zeit nach Austragung nicht mehr besteht. Viele dieser Pheromone sind jedoch lipophil, so dass die Inkorporation in eine lipophile Matrix das Freisetzungsverhalten im gewünschten Maße verzögert. Dies gilt insbesondere für den genannten Lockstoff des Apfelwickler-Granulovirus. Die genannte Verbindung dient als Pheromon für adulte Weibchen sowie als Fraßlockstoff für die Apfelwickler-Larven.
Besonders bevorzugt sind Baculoviren, insbesondere aus der Gattung Granulovirus. Ganz besonders vorteilhaft enthalten die Mikropartikel Apfelschalenwickler-Granuloviren oder Apfelwickler-Granuloviren. Ein besonders bevorzugter Mikropartikel für die beiden letztgenannten Viren enthält als Triacylglycerid Tripalmitin und/oder ein tripalmitin-haltiges Gemisch, insbesondere Palmfett. Weiterhin enthält dieser Mikropartikel 2(E), 4(Z)- Ethyldecadienoat als Fraßlockstoff sowie einen UV-Stabilisator. Die Viren können in Ringform oder aber auch gebunden an einen Träger Einsatz finden. Weitere, der Stabilisierung der Viren dienende Zusätze sind möglich.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines verkapselten Mikropartikels. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:
Bereitstellen eines Kapselmaterials, das zu mindestens 50 Gew.% aus einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht, in einem Druckbehälter einer Hochdruckanlage zur Partikelerzeugung (PGSS-Anlage);
Zugabe von Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form zum Kapselmaterial; optional, Zugabe weiterer Additive zum Kapselmaterial;
Aufschmelzen des Kapselmaterials zur Herstellung einer die Viren enthaltenden Suspension;
Beaufschlagen der Schmelze mit einem verdichteten Gas bei einem Druck im Bereich von 20 bis 500 bar und einer Temperatur im Bereich von 283 bis 373 K für eine vorgebbare Verweilzeit; und
Versprühen der Schmelze durch eine Düse oder Kapillare.
Bei dem sogenannten PGSS-Verfahren (Particles from Gas Saturated Solutions) handelt es sich um eine Hochdruckmethode zur Partikelerzeugung. Grundsätzlich können beliebig viele verflüssigbare Feststoffe vermischt und zu rieselfähigem Pulver verarbeitet werden. Dabei werden in der Regel überkritische Fluide als Hilfsstoffe genutzt. Schmelzen werden homogenisiert und pulverisiert, indem die verflüssigten Einzelkomponenten mit verdichtetem Kohlendioxid vermischt und anschließend, zum Beispiel über eine Düse, entspannt werden. Die Schmelze wird hierdurch in kleinste Tröpfchen zerrissen. Es bildet sich feinstes Pulver, welches aufgrund seiner gezielt einstellbaren Größe (Nano- bis Mikrometer), Morphologie und Zusammensetzung neue Anwendungen eröffnet. Das PGSS-Verfahren kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich (batchweise) betrieben werden.
Das verdichtete Gas ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Alkane mit einem Siedepunkt kleiner 500C bei 1 bar, Alkene mit einem Siedepunkt kleiner 500C bei 1 bar, Fluorkohlenwasserstoffe mit einem Siedepunkt kleiner 50°C bei 1 bar und Mischungen der genannten Gase. Besonders bevorzugt sind Kohlendioxid, Ethan, Propan oder Butan. Insbesondere ist das verdichtete Gas Kohlendioxid oder Propan. Propan und Kohlendioxid weisen einen für die erfindungsgemäßen Zwecke besonders günstigen Joule-Thompson-Effekt auf und dampfen aus der Hülle gut aus, so dass allenfalls nur geringe Kontaminationen verbleiben.
Anstelle des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch eine Sprühtrocknung erfolgen, ein Ausfällen aus geeigneten Lösemitteln öder es kann auf alternative Hochdrucksprühverfahren zurückgegriffen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren hat jedoch den Vorteil, dass kein Lösemittel verwendet wird, das anschließend abgetrennt werden muss oder die Partikel verunreinigt. Gegenüber der Sprühtrocknung ergeben sich niedrigere Arbeitstemperaturen, da zum Beispiel der Einsatz von Kohlendioxid die Schmelztemperatur der Mischung und deren Viskosität senkt. Andere Hochdruckprozesse arbeiten im Regelfall mit höherem Kohlendioxid- und Energiebedarf, so dass sie in diesem Fall weniger ökonomisch sind.
Der Schritt der Beaufschlagung der Schmelze mit Gas erfolgt vorzugsweise bei einem Druck im Bereich von 100 bis 200 bar. Weiterhin liegt die Temperatur in diesem Verfahrensschritt vorzugsweise im Bereich von 25 bis 800C.
Die Düsen oder Kapillaren der PGSS-Anlage haben vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 50 μm bis 1500 μm.
Nachfolgend wird der allgemeine Verfahrensgang an einem Beispiel näher beschrieben:
Das Kapselmaterial und die Zusatzstoffe (Fraßlockstoffe, UV-Stabilisatoren, Emulgatoren etc.) werden aufgeschmolzen und die Viren in der Schmelze dispergiert. In einem Druckbehälter wird die Schmelze mit Kohlendioxid beaufschlagt, wobei der Druck zwischen 20 und 500 bar (bevorzugt 100 - 200 bar) gewählt wird und die Temperatur zwischen 100C und 1000C (bevorzugt 25°C bis 65°C) eingestellt wird, mindestens jedoch so hoch, dass das Kapselmaterial schmilzt. Temperatur und Verweilzeit werden so gewählt wird, dass die Viren nicht deaktiviert werden.
Das Kapselmaterial wird mit dem darin gelösten Kohlendioxid durch eine Düse oder Kapillare (Durchmesser zwischen 50 μm und 1500 μm, bevorzugt 200 - 500 μm) versprüht. Die dabei entstehenden Partikel werden aufgefangen.
Ausführungsbeispiel
150 g Kapselmaterial (80 Gew.% Tripalmitin, 20 Gew.% Palmitin) werden bei 600C aufgeschmolzen und mit 4 ml einer glycerinhaltigen Apfelwickler-Granulovirus-Suspension (erhältlich unter dem Handelsnamen Madex; Virenkonzentration ca. 3 x 1013 Viren pro Liter) versetzt. Die Mischung wird in einem Druckbehälter mit Rührwerk eingebracht. Die Temperatur der Schmelze wird auf 60°C gehalten und es wird über einen Kompressor Kohlendioxid zugegeben, so dass sich ein Druck von 100 bar einstellt und für 30 min gerührt. Durch eine an den Behälter angeschlossene Düse (60°-Hohlkegeldüse, 400 μm) wird die Mischung gegen Atmosphäre versprüht. Die mittlere Größe der erhaltenen Kapseln liegt bei 15 μm. Die berechnete Beladung liegt bei 1 ,25 Viren pro Kapsel.
Ergebnisse aus Tierversuchen zur Temperaturtoleranz der Baculoviren:
Viren, die für 1 h auf 65°C erhitzt wurden, besitzen einen Wirkungsgrad von 95% verglichen mit thermisch unbehandelten Viren. Auf 700C erhitzte Viren haben noch einen Wirkungsgrad von ca. 88%, auf 800C erhitzte Viren töten nur noch 30% der Larven ab.
Wirkung der verkapselten Viren:
Die nach obigem Verfahren hergestellten Mikropartikel zeigten in Tierversuchen einen Wirkungsgrad von über 88%, bezogen auf unverkapselte Viren.
In ersten Freilandversuchen zeigten die verkapselten Viren einen deutlich gegenüber unbehandelten Viren verbesserten Wirkungsgrad, was sowohl auf eine verbesserte UV- Stabilisierung als auch erhöhte Aufnahmerate schließen lässt.

Claims

Patentansprüche
1. Verkapselte Mikropartikel mit einem Kern, der Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form enthält, und einer Hülle, die den Kern umschließt, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle zu mindestens 50 Gew.% aus einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht.
2. Mikropartikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Mikropartikel einen mittleren Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 500 μm aufweisen.
3. Mikropartikel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Durchmesser der Mikropartikel bei 1 bis 50 μm liegt.
4. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Triacylglycerid einen Schmelzpunkt im Bereich von 10 bis 1000C besitzt.
5. Mikropartikel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schmelzpunkt des Triacylglycerids bei 25 bis 800C liegt.
6. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Triacylglycerid Tripalmitin oder ein tripalmitin-haltiges Gemisch von Triacylglyceriden ist.
7. Mikropartikel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das tripalmitin-haltige Gemisch der Triacylglyceride Palmfett ist.
8. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle einen Emulgator als Additiv enthält.
9. Mikropartikel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Emulgator ein Mono- und Diacylglycerid, Lecithin, Pektin, Zuckerester oder ein Gemisch derselben ist.
10. Mikropartikel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anteil des
Emulgators am Gesamtgewicht des Mikropartikels zwischen 0,1 bis 15 Gew.% beträgt.
1 1. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle einen UV-Stabilisator als Additiv enthält.
12. Mikropartikel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der UV-Stabilisator TiÜ2, ein Carotinoid, Flavonoid, Magermilchpulver, eine mycosporin-artige Aminosäure, Scytonemin oder ein Gemisch derselben ist.
13. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle einen Fraßlockstoff als Additiv enthält.
14. Mikropartikel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Fraßlockstoff ein Pheromon, Glutamat oder Zucker ist.
15. Mikropartikel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das als Fraßlockstoff dienende Pheromon 2(E),4(Z)-Ethyldecadienoat ist.
16. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Baculoviren, insbesondere aus der Gattung Granulovirus sind.
17. Mikropartikel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Apfelschalenwickler-Granuloviren oder Apfelwickler-Granuloviren sind.
18. Verfahren zur Herstellung eines verkapselten Mikropartikels, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines Kapselmaterials, das zu mindestens 50 Gew.% aus einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht, in einem Druckbehälter einer Hochdruckanlage zur Partikelerzeugung (PGSS-Anlage);
Zugabe von Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form zum Kapselmaterial; optional, Zugabe weiterer Additive zum Kapselmaterial;
Aufschmelzen des Kapselmaterials zur Herstellung einer die Viren enthaltenden Suspension;
Beaufschlagen der Schmelze mit einem verdichteten Gas (Kohlendioxid, Distickstoffoxid sowie alle Alkane, Alkene und Fluorkohlenwasserstoffe mit einem Siedepunkt kleiner 500C bei 1 bar) oder Mischungen der genannten Gase bei einem Druck im Bereich von 20 bis 500 bar und einer Temperatur im Bereich von 283 bis 373 K für eine vorgebbare Verweilzeit; und
Versprühen der Schmelze durch eine Düse oder Kapillare.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Schritt der Beaufschlagung der Schmelze mit Gas bei einem Druck im Bereich von 100 bis 200 bar erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem der Schritt der Beaufschlagung der Schmelze mit Gas bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 65°C erfolgt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem die Düsen oder Kapillaren einen Durchmesser im Bereich von 50 μm bis 1500 μm aufweisen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , bei dem das Gas ausgewählt ist aus der Gruppe Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Alkane mit einem Siedepunkt kleiner 500C bei 1 bar, Alkene mit einem Siedepunkt kleiner 500C bei 1 bar, Fluorkohlenwasserstoffe mit einem Siedepunkt kleiner 50°C bei 1 bar und Mischungen der genannten Gase.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Gas Kohlendioxid, Ethan, Propan oder Butan ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Gas Kohlendioxid oder Propan ist.
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