EP2231853A2 - Verfahren und arbeitsbesteck zur probenkonservierung und zum zellaufschluss vor der extraktion von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren und arbeitsbesteck zur probenkonservierung und zum zellaufschluss vor der extraktion von nukleinsäuren

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Publication number
EP2231853A2
EP2231853A2 EP08865515A EP08865515A EP2231853A2 EP 2231853 A2 EP2231853 A2 EP 2231853A2 EP 08865515 A EP08865515 A EP 08865515A EP 08865515 A EP08865515 A EP 08865515A EP 2231853 A2 EP2231853 A2 EP 2231853A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
organic liquid
water
nucleic acids
cells
extraction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08865515A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rudolf Ehwald
Dietmar Lerche
Holger Woehlecke
Christina Lerche
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dr Lerche KG
Original Assignee
Dr Lerche KG
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Filing date
Publication date
Application filed by Dr Lerche KG filed Critical Dr Lerche KG
Publication of EP2231853A2 publication Critical patent/EP2231853A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast

Definitions

  • the invention relates to a method for sample preservation and cell disruption, which can be used to prepare the extraction of nucleic acids from living cells, cell aggregates and tissue samples, as well as a work set for performing the method.
  • the method comprises introducing living cells, cell aggregates or tissue samples whose nucleic acids are to be extracted into an excessively water-miscible and volatile organic liquid.
  • the saturation of the sample with the organic liquid has an advantageous effect on the extraction of the nucleic acids, which then takes place in an aqueous medium. By almost completely removing the water from the cells, the mechanical cell disruption is facilitated. In the organic liquid, the biomembranes are dissolved.
  • TRNAs and other RNA fractions with a low degree of polymerization which can permeate through the cell wall, can be selectively extracted without mechanical disruption.
  • the cells, cell aggregates or tissue samples Prior to the extraction of high molecular weight nucleic acids, the cells, cell aggregates or tissue samples are digested in the organic liquid by means of mechanical impulses. Since the nucleases are inactive in the dewatered organic liquid, the biological samples or the homogenates prepared from them can be stored in the organic liquid at room temperature for as long as desired. After incubation in the largely anhydrous organic liquid, the sample-specific nucleases are largely denatured.
  • An advantageous working utensil according to the invention contains an organic / aqueous mixed phase with denaturing properties and, for each sample, a dewatering shaped body adapted to the size of the preserving vessel and a mixture of a few large and numerous small digestion bodies adapted to the size of the preserving vessel for digestion in a nonaqueous medium.
  • An essential advantage of the invention is that can be dispensed with cooling and strong mechanical impulses in the disruption of the cells and in the extraction and that the extraction of DNA can be made time independent of the disruption of the cells.
  • nucleic acids In the extraction of nucleic acids from living biological material, it is necessary for numerous molecular biology applications, the enzymatic degradation of this To prevent macromolecules in the production of the cell-free extract.
  • bacteria, fungi and plant cells must be disrupted mechanically or enzymatically because the cell walls are impermeable to high molecular weight nucleic acids.
  • the most common method currently used is mechanical disruption of cells frozen in liquid nitrogen, cell aggregates or tissue samples (eg, tissue particles, tissue sections) and their subsequent transfer to an aqueous extraction or lysis buffer.
  • the energy input necessary for the mechanical digestion causes a risk of local thawing and the possible reaction of nucleases.
  • nucleases present in the lysosomes, vacuoles and cell walls upon inactivation of cells are rapidly inactivated. This is achieved imperfectly in biological samples with high endogenous RNAse activity by the usual combination of denaturing additives to the extractant, removal of calcium ions by chelators, low temperatures and short extraction time for biological samples with high endogenous nuclease activity and with reduced yield.
  • the patent US 6204375 describes a method and a means for preserving RNA in biological samples. It is based on the denaturing, dehydrating and the endogenous nucleic acids precipitating effect concentrated salt solutions and allows for longer storage of the preserved samples, the subsequent extraction of high molecular weight RNA in good quality.
  • the high salt concentration in the preservation solution may be detrimental to the following studies.
  • the problems associated with cell disruption are retained.
  • the task derives from preserving high molecular weight DNA and RNA of living cells, cell aggregates and tissue samples at normal temperature and to develop a method for the mechanical digestion of plant cells, fungi and bacteria, while largely avoiding enzymatic or mechanical depolymerization of the nucleic acids Normal temperature can be performed.
  • the invention is based on the finding that very resistant yeast and bacterial cells or plant tissue with low mechanical performance can be completely broken up in a short time against mechanical disruption, after they are dissolved in an organic water-miscible volatile liquid, for example acetone or ethanol, were largely drained.
  • an organic water-miscible volatile liquid for example acetone or ethanol
  • a substantially anhydrous organic liquid is to be understood that the water content of the organic liquid is smaller than the water content of the azeotropic mixture of the liquid with water.
  • the maximum water content is 4%, since 96% ethanol at 78.4 0 C azeotropically with a water content of 4% can be distilled.
  • a generator of mechanical pulses in a volume of liquid e.g. a shaker, a stirrer, a manually operated stirring rod, an ultrasonic source or the like required.
  • Essential to the invention is that the mechanical impulses act on a biological material that is in a largely water-free, water-miscible and volatile liquid.
  • An advantageous variant of the method according to the invention is to carry out the cell disruption in the preservation and digestion vessel used for dehydration in the organic liquid with the aid of suitable digestion particles.
  • Preference is given to using fine pulping particles of glass with a diameter of less than 0.5 mm with a volume fraction of 5 to 30% and some larger and heavier pulping particles of glass or steel having a diameter of 2 to 5 mm.
  • the larger digestion bodies increase the flow velocity gradients in the digestion vessel due to their inertia.
  • a high concentration of fine disruption particles increases the frequency of the cell-wall-breaking mechanical impulses, which act on the dehydrated cells, cell aggregates or tissue samples.
  • the digestion particles are used in an approximately anhydrous medium of the organic liquid in a similar manner as is usual for cell disruption in an aqueous medium.
  • the use according to the invention of digestion particles in an approximately water-free liquid medium has the advantage that a loss-free and complete disruption of the cells with low energy input is possible. As the cell walls lose their elasticity in the absence of water, cells or tissue particles are more likely to burst under the influence of shear when dehydrated.
  • the device is based on the fact that the mechanical impulses and shearing forces required to produce a homogenate of mechanically disrupted cells, cell aggregates or tissue samples act on the cells or tissue samples in the substantial absence of the swelling agent.
  • the high molecular weight nucleic acids are present in highly condensed form and are thereby protected from degradation by mechanical shear.
  • the mechanical disruption of cells and tissues in a well dehydrated organic liquid therefore does not result in degradation of the DNA by shear.
  • the water which has passed into the organic liquid can be removed in the simplest case by repeated renewal of the organic liquid, a water-containing organic medium being exchanged for anhydrous.
  • the biological material used as is typical for tissue samples of plants and fungi, has high endogenous activities of nucleases, phenol oxidases and other oxidizing or radical-releasing enzymes, by the gradual increase in the concentration of the organic liquid into the cells Nucleic acid degradation takes place.
  • the extractability of the nucleic acids can be impaired by formation of polyphenols and oxidative protein crosslinking.
  • the enzymatic processes associated therewith can be suppressed according to the invention by introducing the living tissue samples into a mixture of the organic liquid and a buffer of low pH (pH 2-4), whose proportion in the total volume is 5 to 30%. This mixture is replaced after a short exposure time (preferably 30 min to 2 h) against a largely anhydrous organic liquid.
  • a suitable reducing agent eg, sodium sulfite, sodium dithionite, mercaptoethanol, and the like may be added to the mixture.
  • the tissue samples first in an organic liquid with a water content of about 20% and has to replace this liquid after a short time against the largely anhydrous organic liquid has another advantage.
  • the vessel used for the sample preservation with the organic volatile liquid may also be added to a suitable for their dewatering solid.
  • a suitable for their dewatering solid particularly porous zeolite (molecular sieve) with a pore size of 0.3 nm, which is known under the name Molsieb used for drying alcohol and other organic liquids.
  • porous zeolite molecular sieve
  • anhydrous crystals of sodium sulfate, magnesium sulfate or the like are also be added in sufficient quantity.
  • the product of the bulk of the dehydrating agent and its water-binding capacity relative to the mass should exceed the water content of the sample. If the dehydrating agent is used in sufficient quantity, can be dispensed with the multiple replacement of the organic liquid.
  • An important advantage of the method and apparatus of the invention is that organic, water-miscible volatile liquids such as acetone, dioxane, methanol, ethanol and iso-propanol destroy the lipid membranes and rapidly invade cells and small tissue sections, causing them dehydrated and the nucleases and the oxidation-active enzymes are deactivated.
  • organic, water-miscible volatile liquids such as acetone, dioxane, methanol, ethanol and iso-propanol destroy the lipid membranes and rapidly invade cells and small tissue sections, causing them dehydrated and the nucleases and the oxidation-active enzymes are deactivated.
  • the said enzymes are also irreversibly denatured.
  • the saturated with the organic liquid tissue samples or cells or their homogenates, which were prepared by mechanical disruption of cells or tissue particles in the anhydrous organic liquid can be stored for any length of time without replacement of the organic liquid medium against the aqueous extraction buffer without the risk of enzymatic changes at room temperature become. Since the cell's own nucleases and possibly also nucleases that have been contaminated by the sample are denatured by extensive dehydration in the anhydrous, water-miscible organic liquids, the sample is usually free of active nucleases after cell disruption. Therefore, the subsequent extraction of the nucleic acids in an aqueous extractant without nuclease inhibitors can be carried out at room temperature.
  • the organic liquid can be easily separated from particulate cell residues containing the nucleic acids in undissolved form by centrifugation. Because of the large difference in density and the low solvation of the hydrophilic swelling substances in the particulate cell residues, the dewatered cell debris in the organic liquid sediments completely and in a short time at low speed. The volatility of the organic liquid then allows the complete removal of the organic liquid by evaporation. This process can be rationalized. For example, if 2 ml polypropylene sample tubes (Eppendorf tubes) are used as preservation and sample digestion vessels, after decanting or aspirating the majority of the supernatant organic liquid, the residual liquid is obtained by briefly incubating the vessel in vacuo at room temperature or heating in a commercial Heating block completely removed.
  • Eppendorf tubes polypropylene sample tubes
  • insoluble fine disruption particles and cell wall fragments are removed from the aqueous extraction fluid by microfluidization, centrifugation or simple sedimentation in order to obtain a clear aqueous crude extract.
  • a separate step for the separation of particulate residues from the aqueous extract can be dispensed with if a chromatographic separation bed is used for the subsequent isolation of the nucleic acids. In this case, it is advantageous to cover the chromatographic separation bed in the used disposable column with a microfilter and to allow the extract with the insoluble constituents to flow into the separation bed via this microfilter.
  • an inventive working utensils can be used. It comprises a suitable organic liquid and for each sample a solid nearly anhydrous dehydrating agent which is suitable in the organic Liquid to bind dissolved water. It is particularly advantageous if the dehydrating agent is present as a solid body and is adapted in its shape and mass to the vessel so that it can be conveniently removed again after the dehydration of the organic liquid. In order to prevent the dry dehydrating agent from absorbing water vapor from the air, the dewatering body adapted to the vessel is packed in a water vapor-tight manner. After dehydration of the sample, the dehydrating agent is removed again from the preservative vessel. Subsequently, the digestion particles are added to the organic liquid with the sample. Now, the preservation vessel can be used for cell disruption by shaking the sample with the disruption particles.
  • the working utensil according to the invention for each sample contains an adapted to the vessel amount of digestion particles, preferably in the form of a mixture of heavy particles that generate strong flow in the organic liquid during shaking and smaller particles containing the Accelerate disruption of small cells and tissue by ensuring a high pulse density.
  • digestion particles preferably in the form of a mixture of heavy particles that generate strong flow in the organic liquid during shaking and smaller particles containing the Accelerate disruption of small cells and tissue by ensuring a high pulse density.
  • the vessels were occasionally or constantly shaken. After 24 h or 8 weeks, cell disruption was performed.
  • the cell suspension was separated by decantation from the dehydrating agent and transferred to a sealable sample digestion vessel containing 200 mg of fine glass beads with a diameter of 1 to 10 microns (Spheriglas Potters Europe, Suffolk, UK) and 10 glass beads with a diameter of about 2 mm contained.
  • the digestion vessels (Eppendorf tubes) were shaken in a horizontal position on a simple commercial small shaker for mixing liquids (vortex mixer). The light microscopic evaluation revealed that the cells were almost completely digested after 30 minutes. In contrast, the yeast cells in control samples that were not dried with sodium sulfate were only partially disrupted.
  • the residue was shaken with 0.4 ml of an aqueous extraction buffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8, 1.4% sodium dodecyl sulfate) on the mixer for 10 minutes and then incubated at 37 ° C.
  • an aqueous extraction buffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8, 1.4% sodium dodecyl sulfate) on the mixer for 10 minutes and then incubated at 37 ° C.
  • 50 ⁇ l of these dispersions were applied after different times to a column for the isolation of nucleic acids according to DE 199 02 724 and DE 102004030878.
  • the columns contained over the sporopollenin microcapsule separation bed (1 ml) filter layer (3 mm) of fine particles (5-10 ⁇ m). Elution was with Na-EDTA (10mM, pH 8).
  • RNA molecules of different molecular mass were also detectable.
  • the duration of the preservation period 24 h or 8 weeks had no influence on the sharpness and position of the bands of the electropherogram. It is noteworthy that even with long extraction times (up to 24 h) and the high temperature during the Extraction (37 ° C) the high molecular weight RNA and DNA remained stable. Electrophoretically, no degradation of the nucleic acids in the extraction buffer was found. It follows that the preservation and digestion process of the invention irreversibly denatures the endogenous nucleases.
  • the extraction can be carried out in suitable buffers without risk of undesired enzymatic degradation at room temperature and also at elevated temperature over a longer period of time. Therefore, high yields of DNA and high molecular weight RNA can be achieved.
  • Ethanol was used as the organic liquid.
  • a yeast suspension was prepared by mixing with water in a ratio of 1/1. Samples of 50 ⁇ l of this suspension were added to 2 ml Eppendorf tubes with 1 ml of 96% ethanol. A portion of the samples (variant A) were shaken at room temperature overnight and then collected by centrifugation. In another part of the samples (variant B), the yeasts were collected by centrifugation after a shaking time of 4 h, the pellet was admixed with 1 ml of absolute ethanol and further shaken overnight. In another part of the samples (variant C), the water-containing ethanol was also exchanged for absolute ethanol.
  • a water-absorbent molding was introduced in variant C for the complete removal of the water from the ethanol-saturated cells and removed again after a drainage time of 18 hours.
  • the water-absorbent molded articles used were prepared by adhering twenty 3 mm diameter zeolite beads 0.3 nm pore size to a 1.8 cm long and 4 mm wide cellulose strip, in a freeze dryer at a shelf temperature of 80 0 C in vacuum (0.07 mbar) completely dehydrated and packaged vapor-tight in an Eppendorf tube.
  • a digestion body mixture consisting of 10 glass beads with a diameter of 3 mm and 100 mg of glass beads with a diameter of 0.2 to 0.5 mm was added to the suspensions after a dehydration time of 18 h.
  • the tubes were placed on a vortexing shaker with a frequency of 50 s -1 and a shaking radius of 2.5 mm 30 shaken for a long time.
  • no glass beads were added and the tubes were also not shaken.
  • the extraction of the nucleic acids in the aqueous extraction buffer was carried out in the same manner in all variants at room temperature.
  • 0.1 ml of the ethanolic suspensions of cells or cell residues were removed and centrifuged in a 0.5 ml Eppendorfrschreibchen. The ethanol was decanted. The pellets were taken up in 0.1 ml of aqueous extraction buffer (1.4% SDS, 50 mM EDTA-Na, pH 7.4) and shaken on an overhead shaker for about 18 hours. The extracts were freed of particles by centrifugation. 10 ⁇ l of the centrifuged extracts were analyzed electrophoretically by gel electrophoresis in an agarose gel (1.3%).
  • Variants B and C revealed a sharp band of high molecular weight DNA and two sharp bands of rRNA (28 S and 18 S rRNA).
  • Low molecular weight RNA (mainly tRNA) about 80 nucleotides in size was also seen.
  • variant C complete dehydration of the ethanol by zeolite
  • the bands of high molecular weight RNA and DNA were more prominent than in variant B.
  • the extracts of the mechanically undigested ethanol treated yeast cells contained no detectable amounts of high molecular weight nucleic acids. However, they contained low molecular weight RNA (especially tRNA) in a comparable amount as the extracts of variants B and C.
  • variants A, B and C were centrifuged and taken up with aqueous extraction buffer containing methylene blue (concentration 0.2%) In the microscope, the disrupted cell wall envelopes can easily be distinguished from the strongly blue-colored denatured cells with an intact cell wall in this staining. While in variant A all cell walls were uninjured, in variant C all cells were open. In variant B, about 60% of the cells were disrupted.
  • RNA molecules of the size of the t-RNA could be removed from the intact cells with the help of the Accordingly, after the preservation of the nucleic acids according to the invention with a water-miscible organic liquid, the cell wall can be utilized as an ultrafilter for the selective aqueous extraction of low molecular weight RNA fractions Water-miscible organic liquid, allows the selective extraction of a low molecular weight RNA size fraction. This is very advantageous for the investigation of small RNA molecules, such as siRNA, miRNA and tnRNA.
  • tissue samples were completely homogenized. Apart from cell debris, only open cells were visible in the microscope. Smaller pieces of connected cells were confined to xylem vessels and small areas of the epidermis, all of whose cells were open. Comparative samples in which fresh tissue were shaken with equal intensity in water, were not or only very incompletely homogenized.
  • the good quality of the extracted high-molecular nucleic acids is shown by the finding that the rRNA band for the 28 S subunit was stronger than that of the small subunit. It was also detectable in the plant tissues that the inventive method ensures a high stability of the high molecular weight nucleic acids in the subsequent extraction with an aqueous extractant. The same result was obtained even when the ethanolic homogenates were stored for 4 weeks at room temperature.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenkonservierung und zum Zellaufschluss, das zur Vorbereitung der Extraktion von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben einsetzbar ist, sowie ein Arbeitsbesteck zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren umfasst das Einbringen lebender Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben, deren Nukleinsäuren extrahiert werden sollen, in eine im Überschuss vorliegende mit Wasser mischbare und flüchtige organische Flüssigkeit. Die Sättigung der Probe mit der organischen Flüssigkeit wirkt vorteilhaft auf die anschließend im wässrigen Milieu stattfindende Extraktion der Nukleinsäuren. Durch nahezu vollständige Entfernung des Wassers aus den Zellen wird der mechanische Zellaufschluss erleichtert. In der organischen Flüssigkeit werden die Biomembranen aufgelöst. tRNA und andere RNA-Fraktionen mit geringem Polymerisationsgrad, die durch die Zellwand permeieren können, lassen sich ohne mechanischen Aufschluss selektiv extrahieren. Vor der Extraktion hochmolekularer Nukleinsäuren werden die Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben in der organischen Flüssigkeit mit Hilfe mechanischer Impulse aufgeschlossen. Da in der entwässerten organischen Flüssigkeit die Nukleasen inaktiv sind, können die biologischen Proben oder die aus ihnen hergestellten Homogenate in der organischen Flüssigkeit beliebig lange bei Raumtemperatur gelagert werden. Nach der Inkubation in der weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit sind die probeeigenen Nukleasen weitgehend denaturiert. Ein vorteilhaftes erfindungsgemäßes Arbeitsbesteck enthält eine organisch/wässrige Mischphase mit denaturierenden Eigenschaften und für jede Probe einen an die Größe des Konservierungsgefäßes angepassten Entwässerungs-Formkörper sowie eine an die Größe des Konservierungsgefäßes angepasste Mischung von wenigen großen und zahlreichen kleinen Aufschlusskörpern für den Aufschluss im nichtwässrigen Milieu. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, dass auf Kühlung und starke mechanische Impulse beim Aufbrechen der Zellen und bei der Extraktion verzichtet werden kann und dass die Extraktion der DNA zeitlich vom Aufschluss der Zellen unabhängig gestaltet werden kann.

Description

VERFAHREN UND ARBEITSBESTECK ZUR PROBENKONSERVIERUNG UND ZUM ZELLAUFSCHLUSS VOR DER EXTRAKTION VON NUKLEINSÄUREN
[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenkonservierung und zum Zellaufschluss, das zur Vorbereitung der Extraktion von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben einsetzbar ist, sowie ein Arbeitsbesteck zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren umfasst das Einbringen lebender Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben, deren Nukleinsäuren extrahiert werden sollen, in eine im Überschuss vorliegende mit Wasser mischbare und flüchtige organische Flüssigkeit. Die Sättigung der Probe mit der organischen Flüssigkeit wirkt vorteilhaft auf die anschließend im wässrigen Milieu stattfindende Extraktion der Nukleinsäuren. Durch nahezu vollständige Entfernung des Wassers aus den Zellen wird der mechanische Zellaufschluss erleichtert. In der organischen Flüssigkeit werden die Biomembranen aufgelöst. tRNA und andere RNA-Fraktionen mit geringem Polymerisationsgrad, die durch die Zellwand permeieren können, lassen sich ohne mechanischen Aufschluss selektiv extrahieren. Vor der Extraktion hochmolekularer Nukleinsäuren werden die Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben in der organischen Flüssigkeit mit Hilfe mechanischer Impulse aufgeschlossen. Da in der entwässerten organischen Flüssigkeit die Nukleasen inaktiv sind, können die biologischen Proben oder die aus ihnen hergestellten Homogenate in der organischen Flüssigkeit beliebig lange bei Raumtemperatur gelagert werden. Nach der Inkubation in der weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit sind die probeeigenen Nukleasen weitgehend denaturiert. Ein vorteilhaftes erfindungsgemäßes Arbeitsbesteck enthält eine organisch/wässrige Mischphase mit denaturierenden Eigenschaften und für jede Probe einen an die Größe des Konservierungsgefäßes angepassten Entwässerungs-Formkörper sowie eine an die Größe des Konservierungsgefäßes angepasste Mischung von wenigen großen und zahlreichen kleinen Aufschlusskörpern für den Aufschluss im nichtwässrigen Milieu. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, dass auf Kühlung und starke mechanische Impulse beim Aufbrechen der Zellen und bei der Extraktion verzichtet werden kann und dass die Extraktion der DNA zeitlich vom Aufschluss der Zellen unabhängig gestaltet werden kann.
Beschreibung der Erfindung
[0002] Bei der Gewinnung von Nukleinsäuren aus lebendem biologischem Material ist es für zahlreiche molekularbiologische Anwendungen notwendig, den enzymatischen Abbau dieser Makromoleküle bei der Herstellung des zellfreien Extraktes zu unterbinden. Insbesondere Bakterien, Pilze und Pflanzenzellen müssen mechanisch oder enzymatisch aufgeschlossen werden, weil die Zellwände für Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht undurchlässig sind. Das gegenwärtig gebräuchlichste Verfahren besteht im mechanischen Aufbrechen der in flüssigem Stickstoff gefrorenen Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben (z.B. Gewebepartikel, Gewebeschnitte) und deren anschließende Überführung in einen wässrigen Extraktions- oder Lysepuffer. Der für den mechanischen Aufschluss notwendige Energieeintrag bedingt eine Gefahr des lokalen Auftauens und der hierdurch möglichen Reaktion von Nukleasen. Außerdem wirken starke Scherkräfte im wässrigen Milieu depolymerisierend auf die Nukleinsäuren. Beim Konservieren der biologischen Proben oder Rohextrakte durch Einfrieren kommt es leicht zur Fragmentation der Nukleinsäuren, beispielsweise durch das Wachstum von Eiskristallen. Der für die Gefrierkonservierung und den Aufschluss der Zellen in flüssigem Stickstoff erforderliche technische Aufwand erschwert die Probenahme im Freiland für anschließende molekularbiologische Untersuchungen und verursacht Kosten beim Transport der Proben. Besonders empfindlich gegen enzymatischen Abbau ist hochmolekulare RNA, vor allem rRNA und mRNA. Für die Analyse der Transkription in lebenden Zellen werden daher besonders aufwändige Extraktionsprotokolle eingesetzt. Vor allem ist es wichtig, dass die beim Absterben der Zellen in den Lysosomen, Vakuolen und Zellwänden vorhandenen Nukleasen schnell inaktiviert werden. Dies wird bei biologischen Proben mit hoher endogener RNAse-Aktivität durch die übliche Kombination von denaturierenden Zusatzstoffen zum Extraktionsmittel, Entzug der Calciumionen durch Chelatoren, niedrige Temperaturen und kurze Extraktionszeit bei biologischen Proben mit hoher endogener Nukleaseaktivität nur unvollkommen und unter Herabsetzung der Ausbeute erreicht. In der Patentschrift US 6204375 ist ein Verfahren und ein Mittel zur Konservierung von RNA in biologischen Proben beschrieben. Es beruht auf der denaturierenden, entwässernden und die endogenen Nukleinsäuren fällenden Wirkung konzentrierten Salzlösungen und ermöglicht nach längerer Lagerung der konservierten Proben die spätere Extraktion der hochmolekularen RNA in guter Qualität. Die hohe Salzkonzentration in der Konservierungslösung kann für die folgenden Untersuchungen jedoch nachteilig sein. Außerdem bleiben bei der Vorbereitung der Nukleinsäure-Extraktion nach US 6204375 die mit dem Zellaufschluss verbundenen Probleme erhalten. Es besteht nach wie vor Bedarf an Verfahren zur Konservierung und zum Zellaufschluss, welche die anschließende Extraktion hochmolekularer Nukleinsäure ohne Qualitätsverlust ermöglichen. [0003] Hieraus leitet sich die Aufgabe ab, hochmolekulare DNA und RNA lebender Zellen, Zellverbände und Gewebeproben bei Normaltemperatur zu konservieren und ein Verfahren zum mechanischen Aufschluss von Pflanzenzellen, Pilzen und Bakterien zu entwickeln, das unter weitgehender Vermeidung enzymatischer oder mechanischer Depolymerisation der Nukleinsäuren bei Normaltemperatur durchgeführt werden kann.
[0004] Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und durch ein Arbeitsbesteck nach Anspruch 7 gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsvarianten der Erfindung.
[0005] Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass sich gegen mechanischen Aufschluss sehr resistente Hefe- und Bakterienzellen oder Pflanzengewebe mit geringer mechanischer Leistung in kurzer Zeit vollständig aufbrechen lassen, nachdem sie in einer organischen mit Wasser mischbaren flüchtigen Flüssigkeit, z.B. Aceton oder Ethanol, weitgehend entwässert wurden. Unter einer weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit ist zu verstehen, dass der Wassergehalt der organischen Flüssigkeit kleiner ist als der Wassergehalt der azeotropen Mischung der Flüssigkeit mit Wasser. Im Fall des Ethanols liegt der maximale Wassergehalt bei 4 %, da 96 %iger Ethanol bei 78,4 0C azeotrop mit einem Wasseranteil von 4 % destilliert werden kann.
[0006] Beispielsweise genügte das Schütteln einer nahezu wasserfreien Hefesuspension in Aceton mit feinen Glasperlen und einigen große Glasperlen (3 mm) auf einem konventionellen zum Mischen kleiner Flüssigkeitsvolumina ausgelegten Kleinschüttler (Vortex-Mischer), um die Wände aller Zellen zu zerstören. Es kam zu keiner erkennbaren Zellzerstörung bei gleicher Schütteldauer, und -intensität, wenn sich die Glasperlen und Hefezellen im gleichen Volumen eines üblichen wässrigen Milieus befanden. Die Effizienz des Zellaufschlusses war stark von der Entwässerung des organischen Mediums und der Zellen abhängig. Bereits ein geringer Wassergehalt der organischen Flüssigkeit, wie er beispielsweise durch das Eingeben von 50 μl einer wässrigen Hefesuspension in 1,2 ml reines Aceton oder Ethanol entsteht, beeinträchtigte die Effizienz der Zellfragmentierung stark. Es ist daher für die Erfindung wesentlich, die Suspension der Zellen, Zellverbände bzw. Gewebeproben in der organischen Flüssigkeit weitgehend von Restwasser zu befreien und die Solvatation der hydrophilen Polymeren der Zelle und vor allem der Zellwand mit Wasser zu verhindern, bevor die Probe in der entwässerten organischen Flüssigkeit mechanisch aufgeschlossen wird. Es zeigte sich generell, dass erst im weitgehend entwässerten Zustand Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben so brüchig werden, dass relativ schwache mechanische Impulse zu einem effizienten mechanischen Aufschluss führen. Anstelle von Aceton konnten mit vergleichbarem Erfolg andere mit Wasser mischbare und flüchtige organische Flüssigkeiten, beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Dioxan und dergleichen eingesetzt werden.
[0007] Für das erfindungsgemäße Verfahren des Zellaufschlusses wird, wie bei anderen mechanischen Zellaufschlussverfahren, ein Generator für mechanische Impulse in einem Flüssigkeitsvolumen, z.B. ein Schüttelgerät, ein Rührgerät, ein manuell zu betätigender Rührstab, eine Ultraschall-Quelle oder dergleichen benötigt. Erfindungswesentlich ist, dass die mechanischen Impulse auf ein biologisches Material einwirken, das sich in einer weitgehend wasserfreien, mit Wasser mischbaren und flüchtigen Flüssigkeit befindet.
[0008] Eine vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, den Zellaufschluss in dem zur Entwässerung in der organischen Flüssigkeit verwendeten Konservierungs- und Aufschlussgefäß mit Hilfe von geeigneten Aufschlusspartikeln durchzuführen. Hierzu wird eine Suspension der Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben in der weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit in einem Flüssigkeitsvolumen, das vorzugsweise 40 bis 60 % des Gefäßvolumens beträgt, mit Aufschlusspartikeln, beispielsweise Glasperlen, geschüttelt. Vorzugsweise werden feine Aufschlusspartikeln aus Glas mit einem Durchmesser unter 0,5 mm mit einem Volumenanteil von 5 bis 30 % und einige größere und schwerere Aufschlusspartikeln aus Glas oder Stahl mit einem Durchmesser von 2 bis 5 mm eingesetzt. Die größeren Aufschlusskörper verstärken auf Grund ihrer Trägheit die Strömungsgeschwindigkeitsgradienten im Aufschlussgefäß. Eine hohe Konzentration feiner Aufschlusspartikeln erhöht die Frequenz der zellwandbrechenden mechanischen Impulse, welche auf die entwässerten Zellen, Zellverbände bzw. Gewebeproben einwirken. Die Aufschlusspartikeln werden im annähernd wasserfreien Milieu der organischen Flüssigkeit in ähnlicher Weise eingesetzt, wie es für den Zellaufschluss im wässrigen Milieu gebräuchlich ist. Der erfindungsgemäße Einsatz von Aufschlusspartikeln im annähernd wasserfreien flüssigen Milieu hat jedoch den Vorteil, dass ein verlustfreies und vollständiges Aufbrechen der Zellen mit geringem Energieeintrag möglich ist. Da die Zellwände in Abwesenheit von Wasser ihre Elastizität verlieren, platzen Zellen oder Gewebeteilchen unter dem Einfluss von Scherkräften leichter, wenn sie entwässert vorliegen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung beruht darauf, dass die zur Herstellung eines Homogenats aus mechanisch aufgeschlossenen Zellen, Zellverbänden oder Gewebeproben erforderlichen mechanischen Impulse und Scherkräfte in weitgehender Abwesenheit des Quellmittels Wasser auf die Zellen oder Gewebeproben einwirken. Dabei liegen die hochmolekularen Nukleinsäuren in stark kondensierter Form vor und sind hierdurch vor dem Abbau durch mechanische Scherung geschützt. Der mechanische Aufschluss der Zellen und Gewebe in einer gut entwässerten organischen Flüssigkeit führt daher nicht zum Abbau der DNA durch Scherung.
[0009] Um die Zellen, Zellverbände bzw. Gewebeproben weitgehend zu entwässern, kann das in die organische Flüssigkeit übergetretene Wasser im einfachsten Fall durch mehrfache Erneuerung der organischen Flüssigkeit entfernt werden, wobei ein wasserhaltiges organisches Medium gegen wasserfreies ausgetauscht wird. Wenn das verwendete biologische Material, wie es für Gewebeproben von Pflanzen und Pilzen typisch ist, hohe endogene Aktivitäten von Nukleasen, Phenoloxidasen und anderen oxidierenden oder radikalfreisetzenden Enzymen besitzt, kann im Verlauf der Denaturationszeit, die durch allmähliches Ansteigen der Konzentration der organischen Flüssigkeit in die Zellen gekennzeichnet ist, Nukleinsäureabbau stattfinden. Außerdem kann die Extrahierbarkeit der Nukleinsäuren durch Bildung von Polyphenolen und oxidative Proteinvernetzung beeinträchtigt werden. Die hiermit verbundenen enzymatischen Vorgänge können erfindungsgemäß dadurch unterdrückt werden, dass die lebenden Gewebeproben in eine Mischung aus der organischen Flüssigkeit und einem Puffer niedrigen pH- Wertes (pH 2-4), dessen Anteil am Gesamtvolumen 5 bis 30 % beträgt, eingebracht werden. Diese Mischung wird nach kurzer Einwirkungszeit (vorzugsweise 30 min bis 2 h) gegen eine weitgehend wasserfreie organische Flüssigkeit ausgetauscht. Um die inhibitorische Wirkung des niedrigen pH- Wertes auf unerwünschte Oxidationsprozesse zu verstärken, kann dem Gemisch ein geeignetes Reduktionsmittel, z.B. Natriumsulfit, Natriumdithionit, Mercaptoethanol und dergleichen beigefügt werden. Die Gewebeproben zunächst in eine organische Flüssigkeit mit einem Wassergehalt von etwa 20 % einzubringen und diese Flüssigkeit nach kurzer Zeit gegen die weitgehend wasserfreie organische Flüssigkeit auszutauschen hat, hat einen weiteren Vorteil. Ein geringer Wassergehalt der organischen Flüssigkeit führt bei der Extraktion von Pflanzengeweben bekanntlich zu einer schnelleren und vollständigeren Extraktion amphiphiler Stoffe wie der Phospholipide und Phenolverbindungen und zu einer vollständigeren Extraktion lipophiler Stoffe wie des Karotins und des Chlorophylls. [0010] Erfindungsgemäß kann dem für die Probenkonservierung genutzten Gefäß mit der organischen flüchtigen Flüssigkeit auch ein zu ihrer Entwässerung geeigneter Feststoff hinzugefügt werden. Hierfür eignet sich besonders poröses Zeolith (Molsieb) mit einer Porenweite von 0,3 nm, das unter der Bezeichnung Molsieb bekanntlich zum Trocknen von Alkohol und anderen organischen Flüssigkeiten eingesetzt wird. Ebenfalls geeignet sind wasserfreie Kristalle von Natriumsulfat, Magnesiumsulfat oder dergleichen. Das Entwässerungsmittel muss in ausreichender Menge hinzugefügt werden. Um das in der Probe vorhandene Wasser nahezu vollständig zu binden, soll das Produkt aus der Masse des Entwässerungsmittels und seiner auf die Masse bezogenen Wasserbindungskapazität den Wassergehalt der Probe übersteigen. Wird das Entwässerungsmittel in ausreichender Menge eingesetzt, kann auf den mehrfachen Austausch der organischen Flüssigkeit verzichtet werden.
[0011] Ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass organische, mit Wasser mischbare flüchtige Flüssigkeiten wie Aceton, Dioxan, Methanol, Ethanol und iso-Propanol die Lipidmembranen zerstören und schnell in Zellen und kleine Gewebeschnitte eindringen, wodurch diese entwässert und die Nukleasen und die oxidationswirksamen Enzyme deaktiviert werden. Bei der Inkubation der Zellen, Zellverbände und Gewebeproben in wasserfreien wasserlösenden organischen Flüssigkeiten werden die genannten Enzyme außerdem irreversibel denaturiert. Durch Aufbewahrung in einer nahezu wasserfreien organischen Flüssigphase ist es möglich, Nukleinsäuren für nahezu unbegrenzte Zeit unverändert zu erhalten. Die mit der organischen Flüssigkeit gesättigten Gewebeproben oder Zellen bzw. deren Homogenate, die durch mechanischen Aufschluss der Zellen oder Gewebeteilchen in der wasserfreien organischen Flüssigkeit hergestellt wurden, können bis zum Austausch des organischen Flüssigmediums gegen den wässrigen Extraktionspuffer ohne Gefahr enzymatischer Veränderungen bei Raumtemperatur beliebig lange gelagert werden. Da die zelleigenen Nukleasen und gegebenenfalls auch Nukleasen, die durch Kontamination in die Probe gelangt sind, durch weitgehende Entwässerung in der wasserfreien, mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeiten denaturiert werden, ist nach dem Zellaufschluss die Probe in der Regel frei von aktiven Nukleasen. Daher kann auch die nachfolgende Extraktion der Nukleinsäuren in einem wässrigen Extraktionsmittel ohne Nuklease-Inhibitoren bei Raumtemperatur vorgenommen werden. [0012] Die organische Flüssigkeit kann von partikulären Zellresten, welche die Nukleinsäuren in ungelöster Form enthalten, leicht durch Zentrifugieren getrennt werden. Wegen des großen Dichteunterschieds und der geringen Solvatation der hydrophilen Quellstoffe in den partikulären Zellresten sedimentieren die entwässerten Zellbruchstücke in der organischen Flüssigkeit vollständig und in kurzer Zeit bei geringer Drehzahl. Die Flüchtigkeit der organischen Flüssigkeit ermöglicht anschließend die vollständige Entfernung der organischen Flüssigkeit durch Verdunsten. Dieser Prozess kann rationell gestaltet werden. Werden beispielsweise 2-ml-Probenröhrchen aus Polypropylen (Eppendorf-Röhrchen) als Konservierungs- und Probenaufschlussgefäße eingesetzt, wird nach dem Dekantieren oder Absaugen der Hauptmenge der überstehenden organischen Flüssigkeit der Flüssigkeitsrest durch eine kurze Inkubation des Gefäßes im Vakuum bei Raumtemperatur oder Erwärmen in einem handelsüblichen Heizblock vollständig entfernt. Da beim Verdunsten einer gut entwässerten organischen Flüssigkeit sich kein Restwasser konzentrieren kann, kommt es nicht zum Verquellen und Verkleben der hydrophilen Zellfragmente am Ende des Trocknungsvorganges. Das beim Trocknen entstandene Pulver aus Zellbruchstücken kann problemlos in einem wässrigen Extraktionspuffer aufgenommen werden. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die Löslichkeit der Nukleinsäuren im Anschluss an die Trocknung der Zellreste aus einer flüchtigen, mit Wasser mischbaren, wasserfreien organischen Flüssigkeit nicht herabgesetzt war.
[0013] Nach der Auflösung der im partikulären Rückstand vorhandenen Nukleinsäuren in einem hierfür geeigneten wässrigen Exktraktionspuffer sind unlösliche feine Aufschlusspartikeln und Zellwandfragmente durch Mikrofϊltration, Zentrifugieren oder einfaches Sedimentieren aus der wässrigen Exktraktionsflüssigkeit zu entfernen, um einen klaren wässrigen Rohextrakt zu gewinnen. Auf einen gesonderten Schritt zur Abtrennung partikulärer Reste aus dem wässrigen Extrakt kann verzichtet werden, wenn zur anschließenden Isolation der Nukleinsäuren ein chromatographisches Trennbett eingesetzt wird. In diesem Fall ist vorteilhaft, in der verwendeten Einwegsäule das chromatographische Trennbett mit einem Mikrofilter abzudecken und den Extrakt mit den unlöslichen Bestandteilen über dieses Mikrofilter in das Trennbett einströmen zu lassen.
[0014] Für das erfmdungsgemäße Verfahren kann ein erfindungsgemäßes Arbeitsbesteck eingesetzt werden. Es umfasst eine geeignete organische Flüssigkeit und für jede Probe ein festes nahezu wasserfreies Entwässerungsmittel, das geeignet ist, in der organischen Flüssigkeit gelöstes Wasser zu binden. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Entwässerungsmittel als fester Körper vorliegt und in seiner Form und Masse an das Gefäß so angepasst ist, dass es nach der Entwässerung der organischen Flüssigkeit wieder bequem entnommen werden kann. Um zu verhindern, dass das trockene Entwässerungsmittel Wasserdampf aus der Luft aufnimmt, wird der an das Gefäß angepasste Entwässerungskörper wasserdampfdicht verpackt. Nach erfolgter Entwässerung der Probe wird das Entwässerungsmittel wieder aus dem Konservierungsgefäß entnommen. Anschließend werden die Aufschlusspartikeln zu der organischen Flüssigkeit mit der Probe hinzugegeben. Nun kann das Konservierungsgefäß für den Zellaufschluss eingesetzt werden, indem die Probe mit den Aufschlusspartikeln geschüttelt wird.
[0015] In einer vorteilhaften Variante der Erfindung enthält das erfindungsgemäße Arbeitsbesteck für jede Probe eine an das Gefäß angepasste Menge von Aufschlusspartikeln, vorzugsweise in Form einer Mischung von schweren Partikeln, die beim Schütteln starke Strömung in der organischen Flüssigkeit erzeugen und kleineren Partikeln, die den Aufschluss von kleinen Zellen und Gewebeteilen durch Gewährleistung einer großen Impulsdichte beschleunigen. Die Erfindung wird im Folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
[0016] Als organische Flüssigkeit wurde Aceton eingesetzt. Das Aceton wurde in einer Flasche über wasserfreiem Natriumsulfat aufbewahrt. Proben von 50 μl einer konzentrierten Hefesuspension (Saccharomyces cerevisiae), die durch Mischen des durch Zentrifugation erhaltenen Hefepellets mit Wasser im Volumenverhältnis 1/1 entstand, wurden in verschließbare 2-ml- Konservierungsgefäße (Eppendorf-Röhrchen) dosiert, in denen sich 1,2 ml des wasserfreien Acetons und 200 mg wasserfreien Natriumsulfats befanden. Zur Kontrolle wurde in Konservierungsgefäße, die 1,2 ml wasserfreies Aceton ohne Natriumsulfatkristalle oder Wasser enthielten, ebenfalls 50 μl der Hefesuspension dosiert. Die Gefäße wurden dicht verschlossen und bei Raumtemperatur inkubiert. In den ersten Stunden wurden die Gefäße gelegentlich oder ständig geschüttelt. [0017] Nach 24 h oder 8 Wochen wurde der Zellaufschluss vorgenommen. Hierzu wurde die Zellsuspension durch Dekantieren vom Entwässerungsmittel abgetrennt und in ein verschließbares Probenaufschlussgefäß überführt, das 200 mg feiner Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 bis 10 μm (Spheriglas der Firma Potters Europe, Suffolk, UK) sowie 10 Glasperlen mit einem Durchmesser von etwa 2 mm enthielt. Die Aufschlussgefäße (Eppendorf-Röhrchen) wurden in horizontaler Lage auf einem einfachen handelsüblichen Kleinschüttler zum Mischen von Flüssigkeiten (Vortex-Mischer) geschüttelt. Die lichtmikroskopische Bewertung ergab, dass die Zellen nach 30 min nahezu vollständig aufgeschlossen waren. Im Unterschied hierzu waren die Hefezellen in Vergleichsproben, die nicht mit Natriumsulfat getrocknet wurden, nur unvollständig aufgeschlossen. Befand sich anstelle von Aceton Wasser in den Aufschlussgefäßen, waren die Zellen überhaupt nicht aufgebrochen. Die Eppendorfröhrchen wurden zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Die Aufschlussgefäße, welche die vollständig entwässerten Hefezellen enthielten, wurden geöffnet, mit einer perforierten Folie abgeschlossen, und das restliche Aceton wurde im Vakuum einer Wasserstrahlpumpe verdampft.
[0018] Der Rückstand wurde mit 0,4 ml eines wässrigen Extraktionspuffers (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8, 1,4 % Natriumdodecylsulfat) auf dem Mischgerät 10 min lang geschüttelt und anschließend bei 37°C inkubiert. Zur Abtrennung der hochmolekularen Nukleinsäuren aus den erhaltenen Dispersionen wurden nach unterschiedlichen Zeiten 50 μl dieser Dispersionen auf eine Säule zur Isolation von Nukleinsäuren nach DE 199 02 724 und DE 102004030878 aufgetragen. Die Säulen enthielten über dem aus Sporopollenin-Mikrokapseln bestehenden Trennbett (1 ml) Filterschicht (3mm) aus feinen Partikeln (5-10 μm). Die Elution erfolgte mit Na-EDTA (10 mM, pH 8). Mit dem Elutionsmittel waren die Säulen bereits vor dem Auftragen der Proben äquilibriert. Bei einem Elutionsvolumen von bis 0,37 ml wurden hochmolekulare DNA und RNA eluiert und in der Sammelfaser am Ausgang der Säule konzentriert. Die elektrophoretische Analyse der Eluate ergab, dass in allen Eluaten eine hochmolekulare DNA-Fraktion vorlag. Sie bildete bei der Elektrophorese im Agarose-Gel (0,8 %) eine scharfe Bande mit einem Polymerisationsgrad weit über 10000 bp. Die hohe Qualität der extrahierten RNA ist daran zu erkennen, , dass die deutlich stärkere Bande für die rRNA der 28 S Untereinheit gut von derjenigen der rRNA der 18S-Untereinheit getrennt war. Hochmolekulare RNA-Mo leküle unterschiedlicher Molmasse (mRNA) war ebenfalls nachweisbar. Die Dauer der Konservierungsperiode (24 h oder 8 Wochen) hatte keinen Einfluss auf die Schärfe und Lage der Banden des Elektropherogramms. Bemerkenswert ist, dass selbst bei langen Extraktionszeiten (bis 24 h) und der hohen Temperatur während der Extraktion (37°C) die hochmolekulare RNA und DNA stabil blieb. Elektrophoretisch konnte kein Abbau der Nukleinsäuren im Extraktionspuffer festgestellt wurde. Hieraus folgt, dass das erfindungsgemäße Konservierungs- und Aufschlussverfahren die endogenen Nukleasen irreversibel denaturiert. Da die endogenen Nucleasen auch in dem wässrigen Extraktionspuffer ihre Aktivität nicht mehr entfalten können, kann die Extraktion in geeigneten Puffern ohne Risiko unerwünschten enzymatischen Abbaus bei Raumtemperatur und auch bei höherer Temperatur über längere Zeit durchgeführt werden. Daher sind hohe Ausbeuten an DNA und hochmolekularer RNA erreichbar.
Beispiel 2
[0019] Als organische Flüssigkeit wurde Ethanol eingesetzt. Aus dem Pellet einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae wurde durch Mischung mit Wasser im Verhältnis 1/1 eine Hefesuspension hergestellt. Proben von 50 μl dieser Suspension wurden in 2 ml- Eppendorfröhrchen mit 1 ml 96%igen Ethanols versetzt. Ein Teil der Proben (Variante A) wurde bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt und anschließend durch Zentrifugation gesammelt. Bei einem weiteren Teil der Proben (Variante B) wurden die Hefen bereits nach einer Schüttelzeit von 4 h durch Zentrifugation gesammelt, das Pellet mit 1 ml absoluten Ethanols versetzt und über Nacht weiter geschüttelt. Bei einem weiteren Teil der Proben (Variante C) wurde das wasserhaltige Ethanol ebenfalls gegen absolutes Ethanol ausgetauscht. In die so erhaltene Suspension wurde bei Variante C zur restlosen Entfernung des Wassers aus den ethanolgesättigten Zellen ein Wasser absorbierender Formkörper eingebracht und nach einer Entwässerungszeit von 18 h wieder entnommen. [0020] Die verwendeten Wasser absorbierenden Formkörper wurden durch Aufkleben von zwanzig Zeolith-Perlen mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Porenweite von 0,3 nm an einen 1,8 cm langen und 4 mm breiten Zellulosestreifen hergestellt, in einer Gefriertrocknungsanlage bei einer Stellflächentemperatur von 800C im Vakuum (0,07 mbar) vollständig entwässert und in einem Eppendorf-Röhrchen dampfdicht verpackt. [0021] Bei den Varianten B und C wurde nach einer Entwässerungszeit von 18 h eine Aufschlusskörpermischung bestehend aus 10 Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm und 100 mg Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,5 mm zu den Suspensionen gegeben. Für den Zellaufschluss wurden die Röhrchen auf einem nach dem Vortex-Prinzip arbeitenden Schüttler mit einer Frequenz von 50 s"1 und einem Schüttelradius von 2,5 mm 30 min lang geschüttelt. Bei Variante A wurde keine Glasperlen hinzugefügt und die Röhrchen wurden auch nicht geschüttelt.
[0022] Im Anschluss an den Zellaufschluss erfolgte die Extraktion der Nukleinsäuren im wässrigen Extraktionspuffer bei allen Varianten bei Raumtemperatur in gleicher Weise. Hierzu wurden 0,1 ml der ethanolischen Suspensionen von Zellen bzw. Zellresten entnommen und in einem 0,5 ml-Eppendorfröhrchen zentrifugiert. Das Ethanol wurde dekantiert. Die Pellets wurden in 0,1 ml eines wässrigen Extraktionspuffers (1,4 % SDS, 50 mM EDTA-Na, pH 7,4) aufgenommen und auf einem Überkopfschüttler etwa 18 h geschüttelt. Die Extrakte wurden durch Zentrifugation von Partikeln befreit. 10 μl der zentrifugierten Extrakte wurde elektrophoretisch durch Gel-Elektrophorese in einem Agarose-Gel (1,3 %) analysiert. Bei den Varianten B und C waren eine scharfe Bande hochmolekularer DNA und zwei scharfe Banden von rRNA (28 S und 18 S rRNA) zu erkennen. Niedermolekulare RNA (hauptsächlich tRNA) mit einer Größe von etwa 80 Nukleotiden war ebenfalls zu erkennen. Bei Variante C (vollständige Entwässerung des Ethanols durch Zeolith) waren die Banden der hochmolekularen RNA und der DNA prominenter als bei Variante B. Die Extrakte der mechanisch nicht aufgeschlossenen ethanolbehandelten Hefezellen (Variante A) enthielten keine nachweisbaren Mengen an hochmolekularen Nukleinsäuren. Sie enthielten aber niedermolekulare RNA (vor allem tRNA) in vergleichbarer Menge wie die Extrakte der Varianten B und C. [0023] Die Homogenate der Varianten A, B und C wurden zentrifugiert und mit Methylenblau (Konzentration 0,2 %) enthaltendem wässrigen Extraktionspuffer aufgenommen.. Im Mikroskop lassen sich bei dieser Färbung die aufgebrochenen Zellwandhüllen leicht von den stark blau gefärbten denaturierten Zellen mit intakter Zellwand unterscheiden. Während bei Variante A alle Zellwände unverletzt waren, waren bei Variante C alle Zellen geöffnet. Bei Variante B waren etwa 60 % der Zellen aufgeschlossen.
[0024] Das Ergebnis zeigt, dass die hochmolekularen Nukleinsäuren (DNA, rRNA und hochmolekulare mRNA nicht durch die intakte Zellwand permeierten. RNA-Mo leküle von der Größe der t-RNA konnten nach der Behandlung mit Ethanol jedoch aus den intakten Zellen mit Hilfe des wässrigen Puffers effektiv extrahiert werden konnten. Nach der erfindungsgemäßen Konservierung der Nukleinsäuren mit einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit kann demnach die Zellwand als Ultrafilter zur selektiven wässrigen Extraktion niedermolekularer RNA-Fraktionen ausgenutzt werden. Das erfindungsgemäße Konservierungsverfahren, das in der Sättigung der Zellen mit einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit besteht, ermöglicht die selektive Extraktion einer niedermolekularen RNA-Größenfraktion. Dies ist sehr vorteilhaft für die Untersuchung kleiner RNA-Mo leküle, z.B. der siRNA, der miRNA und der tnRNA.
Beispiel 3
[0025] In den zur Probenkonservierung und zum Zellaufschluss eingesetzten 2 ml-Eppendorf- Röhrchen befand sich eine Menge von 1,5 ml einer Mischung aus Ethanol (80 Volumenprozent) und einem Citronensäure/Citratpuffer (100 mM, pH 3), der 0,5 % Natriumdithionit enthält (20 Volumenprozent). In diese Flüssigkeit wurden kleine Blattstücken verschiedener Pflanzen {Arabidopsis thaliana, Daucus carota, Apium graveolens, Ceratophyllum demersum, Dactylorhiza incarnata ) sowie Blüten von Arabidopsis thanliana, Daucus carota, Apium graveolens und Segmente von Wurzeln und Schoten von Arabidopsis thaliana eingebracht. Von den genannten Pflanzenmaterialien wurde jeweils eine Menge von etwa 200 mg eingesetzt. Die Dosierung erfolgte anhand des Anstiegs des Flüssigkeitsspiegels in dem zur Probenkonservierung eingesetzten Eppendorf- Röhrchen.
[0026] Nach 1 h wurde die Flüssigkeit abgesaugt. Die mit ihr gesättigten Pflanzengewebe wurden so weit wie möglich entfeuchtet, in dem sie mit etwas Zellstoff und einer Pinzette zusammengepresst wurden. Anschließend wurden 1,5 ml reinen Ethanols zu dem Pfianzenmaterial in das Konservierungsgefäß gegeben. Am nächsten Tag wurde das Ethanol entfernt und zu den Gewebeproben wurde 1 ml reinen Ethanols und der bereits unter 2. beschriebene aus dem Entwässerungsmittel gebildete Formkörper eingebracht. Die Röhrchen mit dem Entwässerungsmittel und den Gewebeproben wurden bis zum nächsten Tag auf einem Überkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Entwässerungsformkörper entnommen. In die Röhrchen mit den inzwischen vollständig entfärbten und entwässerten Gewebeproben wurden 200 mg feiner Glasperlen (Durchmesser 200 bis 500 μm) und 10 große Glasperlen (Durchmesser etwa 3 mm) eingefüllt. Die Röhrchen wurden 20 min lang auf einem Schüttelgerät für den Zellaufschluss (Schwingmühle MM2, Retsch GmbH, Deutschland) bei 50 % der maximalen Intensität in horizontaler Lage geschüttelt.
[0027] Danach waren die genannten Gewebeproben vollständig homogenisiert. Im Mikroskop waren neben Zelltrümmern nur noch geöffnete Zellen zu erkennen. Kleinere Stücken zusammenhängender Zellen beschränkten sich auf Xylemgefäße und kleine Flächen der Epidermis, deren Zellen sämtlich geöffnet waren. Vergleichproben, in denen frisches Gewebe mit gleicher Intensität in Wasser geschüttelt wurden, waren dagegen nicht oder nur sehr unvollständig homogenisiert.
[0028] Von den Homogenaten wurden nach unterschiedlichen Zeiten Proben von 0,1 ml entnommen und zentrifugiert. Die Pellets wurden in 0,1 ml eines zur Extraktion von RNA und DNA geeigneten Puffers (1,4 % SDS, 50 mM EDTA-Na, pH 7,5) aufgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur zur Extraktion der Nukleinsäuren inkubiert. 10 μl der Extrakte wurden nach Abtrennung der Partikeln durch Zentrifugation elektrophoretisch analysiert, wie unter 2. dargestellt. Die Trennung ergab für alle Proben eine scharfe DNA-Bande, zwei scharfe rRNA-Banden (entsprechend der 28 S - und der 18 S - Untereinheit) sowie eine breitere Bande im Größenbereich der tRNA. Außerdem war mRNA deutlich erkennbar. Die gute Qualität der extrahierten hochmolekularen Nukleinsäuren zeigt sich in dem Befund, dass die rRNA-Bande für die 28 S -Untereinheit kräftiger als die der kleinen Untereinheit war. Auch bei den Pflanzengeweben war nachweisbar, dass das erfmdungsgemäße Verfahren eine hohe Stabilität der hochmolekularen Nukleinsäuren bei der nachfolgenden Extraktion mit einem wässrigen Extraktionsmittel gewährleistet. Das gleiche Ergebnis wurde auch dann erzielt, wenn die ethanolischen Homogenate 4 Wochen bei Raumtemperatur gelagert wurden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Probenkonservierung und zum Zellaufschluss vor der Extraktion von Nukleinsäuren, bei dem eine Probe aus lebenden Zellen, Zellverbänden oder vielzelligem Gewebe vor der in einem wässrigen Medium stattfindenden Extraktion der Nukleinsäuren in eine mit Wasser mischbare, flüchtige organische Flüssigkeit wie Ethanol, Isopropanol, Aceton oder dergleichen, deren Masse gegenüber der Masse der biologischen Probe im Überschuss vorliegt, überführt und mit dieser äquilibriert wird
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die biologische Probe anschließend an ihre Äquilibrierung mit der weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit oder nach längerer Lagerung in ihr mit Hilfe mechanischer Impulse aufgebrochen und homogenisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die biologische Probe durch Schütteln mit harten Aufschlusspartikeln aufgeschlossen wird, wobei vorzugsweise eine Mischung aus wenigen großen und schweren und zahlreichen kleinen und leichten Mahlkörpern eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die organische Flüssigkeit, welche die biologische Probe umgibt, vor dem mechanischen Aufschluss mit einer für die Bindung des im Konservierungsgefäß vorhandenen Wasser ausreichenden Menge eines wasserbindenden Feststoffes, z.B. eines porösen zum Trocknen organischer Flüssigkeiten geeigneten entwässerten Zeoliths mit einer Porenweite von 0,3 nm oder entwässerter Natrium- oder Magnesiumsulfatkristalle oder dergleichen, in Kontakt gebracht wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die lebende biologische Probe in einer Mischung aus einer organischen mit Wasser mischbaren flüchtigen Flüssigkeit und einem wässrigen Puffer denaturiert wird, wobei der wässrige Puffer vorzugsweise einen pH- Wert zwischen 2 und 4 aufweist in einem Volumenanteil zwischen 5 und 30 % vorliegt, und bei dem die biologische Probe anschließend in eine nahezu wasserfreie, mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit überführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Mischung aus der organischen Flüssigkeit und dem Puffer ein Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol, Dithionit- oder Sulfitionen oder dergleichen enthält.
7. Arbeitsbesteck für die Probenkonservierung und den Zellaufschluss vor der Extraktion von Nukleinsäuren, das für jede Probe eine an das verschließbare Konservierungs- und Aufschlussgefäß, vorzugsweise ein handelsübliches Eppendorf-Röhrchen, angepasste Menge eines bekannten Entwässerungsmittels für organische, mit Wasser mischbare Flüssigkeiten, beispielsweise von kristallinem entwässerten Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat oder von Formkörpern aus Zeolith mit einer Porenweite von 0,3 nm umfasst.
8. Arbeitsbesteck nach Anspruch 7, mit einem einzelnen aus einem Entwässerungsmittel gebildeten Formkörper, der von einer wasserdampfdichten Hülle umgeben ist und in seiner Form und Größe an das Aufschlussgefäß angepasst ist.
9. Arbeitsbesteck nach Anspruch 7, mit einer an das Konservierungs- und Aufschlussröhrchen angepassten Vorrichtung zum mechanischen Aufschluss von Gewebeproben, vorzugsweise in Form von Glasperlen mit einem Durchmesser unter 0,5 mm und einigen Partikeln aus Glas oder Metall mit einem Durchmesser über 2 mm.
10. Arbeitsbesteck nach Anspruch 7 bis 10, mit einer Flüssigkeit, die zu 5 bis 30 Volumenprozent aus einem Puffer mit einem pH- Wert unter 4 und zu 95 bis 70 % aus einer mit Wasser mischbaren, flüchtigen organischen Flüssigkeit besteht und die vorzugsweise ein Reduktionsmittel wie Sulfit, Dithionit, Mercaptoethanol oder dergleichen enthält.
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