EP2670836A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol

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Publication number
EP2670836A1
EP2670836A1 EP12701151.8A EP12701151A EP2670836A1 EP 2670836 A1 EP2670836 A1 EP 2670836A1 EP 12701151 A EP12701151 A EP 12701151A EP 2670836 A1 EP2670836 A1 EP 2670836A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
production
acetolactate synthase
butanediol
klebsiella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12701151.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
Publication of EP2670836A1 publication Critical patent/EP2670836A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative production of 2,3-butanediol (2,3-BDL) by means of an improved microorganism strain having a 2 to 68-fold increased acetolactate synthase activity compared to the non-improved starting strain.
  • chemical raw materials (so-called chemical synthesis building blocks) from renewable raw materials are ethanol ⁇ C2 building block), glycerol, 1, 3-propanediol, 1, 2-propanediol (C3 building blocks) or succinic acid, 1-butanol, 2 ⁇ Butanol, 1,4-butanediol or 2, 3-butanediol (C4 building blocks).
  • chemical building blocks are the biogenic starting compounds from which further basic chemicals can be chemically produced.
  • a C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol.
  • the state of the art for fermentative 2,3-butanediol production is summarized in Celinska and Grajek (Biotechnol. Advances ⁇ 2009) 27: 715-725).
  • 2, 3-butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four carbon atoms (C4 building blocks) such as acetoin, diacetyl, 1,3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK).
  • 2,3-butanediol dehydrogenase Reaction of acetoin reductase (2, 3-butanediol dehydrogenase): NADH-dependent reduction of acetoin to 2,3-butanediol.
  • 2,3-butanediol Various natural producers of 2,3-butanediol are known, e.g. B, from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc. But also yeasts are known as producers (eg bakers yeast).
  • Known 2, 3 -BDL production strains from the biological safety level Sl are strains of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, strains of the genus Bacillus (or Paenibacillus) such as Bacillus polymyxa or Bacillus licheni ormis.
  • Bacillus or Paenibacillus
  • the species Klebsiella terrigena and Klebsiella planticola are also synonymous as Raoultella terrigena and Raoultella due to a taxonomic renaming designated planticola. These are strains of the same species.
  • 2,3-butanediol yields of not more than 57 g / l (637 mM, production time 60 h) have hitherto been reported for these strains classified in safety level Sl (Nakashimada et al., J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661- 664). These yields are far too low for economical production.
  • the minimum fermentation yield for economical production is considered to be> 80 g / l 2, 3-butanediol (fermentation duration maximum 72 h), preferably> 100 g / l 2, 3-butanediol.
  • biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories p. 9ff. (Table 1), Centers for Disease Control and Prevention (US) (Editor), Public Health Service (US) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
  • the object of the invention was to provide production strains for the production of 2, 3-butanediol, which allow significantly higher 2,3-Butandiolausbeuten than the output stem.
  • the object was achieved by a production strain which can be produced from an initial strain, characterized in that the production strain has an acetolactate synthase activity 2 to 68 times above the starting strain.
  • a parent strain In the present invention, a distinction is made between a parent strain and a production strain.
  • the starting trunk At the starting trunk it may be a non-optimized, but capable of 2,3-butanediol production wild-type strain or an already further optimized wild-type strain.
  • an already optimized wild-type strain eg, through genetic engineering
  • the acetolactate synthase activity is not affected by the optimization.
  • a production strain is to be understood as meaning a starting strain which has been optimized with respect to the production of 2,3-butanediol and which is distinguished by a
  • Starting strain is characterized by increased activity of the enzyme acetolactate synthase (ALS).
  • the production strain is made from the parent strain. If an already optimized starting strain is to be further improved by an increase in acetolactate synthase activity, it is of course also possible first to increase the acetolactate synthase activity in an unmodified strain and then to introduce further improvements.
  • the increase in acetolactate synthase activity in the production strain can be caused by any mutation in the genome of the parent strain (for example a promoter activity-increasing mutation), an enzyme activity-increasing mutation in the acetolactate synthase gene or by overexpression of a homologous or heterologous acetolactate synthase gene in the parent strain.
  • the overexpression of a homologous or a heterologous Acetolactatsynthasegens in the parent strain is preferred.
  • the acetolactate synthase activity is preferably increased by a factor of 3 to 64, more preferably by a factor of 3 to 30 and particularly preferably by a factor of 4 to 20, in comparison to the starting starch.
  • This increased acetolactate synthase activity is particularly preferred due to an increased expression compared to the parent strain.
  • a homologous or heterologous gene coding for an acetolactate synthase enzyme is particularly preferred due to an increased expression compared to the parent strain.
  • the parent strain can be any 2,3-butanediol producing strain. It is preferably a strain of the genus Klebsiella, Raoultella, Bacillus or Lactobacillus.
  • a strain of the species Klebsiella ⁇ Raoultella ⁇ terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa or Bacillus licheniformis with a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola is again preferred.
  • overexpression of the acetolactate synthase by a factor of 3.2 up to a factor of 68.4 is suitable for this purpose 2, 3 ⁇ Butandiolausbeute ⁇ determined as volume yield of 2,3-butanediol in g / 1) in shake flasks by more than 25%, preferably more than 30% and in particular by more than 40% (see Example 4) and in the fermentation to more than 15%, preferably more than 20%, and especially preferably more than 30% (see 5 and 6, Example) to increase.
  • Acetolactate synthase is an enzyme from the enzyme class EC 2.2.1.6. It may be any gene-encoded enzyme which, according to formula (I), causes the synthesis of acetolactate from two molecules of pyruvate.
  • the gene of the acetolactate synthase is derived from a bacterium of the genus Klebsiella (Raoultella) or Bacillus.
  • the gene of acetolactate synthase is derived from a strain of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus ⁇ Paenibacillus ⁇ polymyxa or Bacillus licheniformis and in particular from a strain of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola or Bacillus licheni ormi. These strains are all commercially available, e.g.
  • the strain according to the invention thus makes it possible to increase the fermentative production of acetolactate.
  • the invention thus enables not only the production of 2, 3-butanediol but also the production of other metabolites, which can be derived as acetonate, such as 2, 3-butanediol.
  • a production strain according to the invention is also characterized in that it is produced from an exit as defined in the application and produces an acetolactate synthase in recombinant form, with the result that its 2,3-BDL production ( Volume production expressed in g / 1 2,3-BDL) compared to the non-genetically optimized starting strain by at least 25%, preferably 50%, more preferably 75% and particularly preferably increased by 100%, wherein the 2,3-butanediol yield of the parent strain at least 90 g / 1.
  • the production strain according to the invention is preferably prepared by introducing a gene construct into one of the mentioned parent strains.
  • the gene construct in its simplest form is defined as consisting of the acetolactate synthase structural gene operatively linked to a promoter upstream.
  • the gene construct may also comprise a terminator downstream of the acetolactate synthase structural gene.
  • Preferred is a strong promoter, which leads to a strong transcription.
  • Preferred among the strong promoters is the so-called "tac promoter" familiar to the person skilled in the art from the molecular biology of E. coli.
  • the gene construct can be present in a manner known per se in the form of an autonomously replicating plasmid, it being possible for the copy number of the plasmid to vary.
  • a variety of plasmids are known to those skilled in the art, depending on their genetic
  • Structure in a given production strain can autonomously replicate.
  • the gene construct can also be integrated in the genome of the production strain, with each gene locus along the genome being suitable as an integration site.
  • the gene construct either in plasmid form or with the aim of genomic integration, is introduced into the production strain in a manner known per se by genetic transformation.
  • Various methods of genetic transformation are known to the person skilled in the art (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechol. (2010) 85: 1301-1313), including, for example, the
  • Selection markers for the selection of transformants with the desired gene construct are selected from antibiotic resistance markers or from the auxotrophy complementing selection markers.
  • antibiotic resistance markers Preference is given to antibiotic resistance markers, more preferably those which confer resistance to antibiotics selected from ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol or zeocin.
  • a production strain according to the invention contains the gene construct, either in plasmid form or integrated into the genome, and produces an acetolactate synthase enzyme in recombinant form.
  • the recombinant acetolactate synthase enzyme is capable of producing two molecules of pyruvate acetolactate by cleavage of C0 2 . It has now surprisingly been found that by suitable recombinant overexpression of the acetolactate synthase enzyme in the production strain, the 2,3-butanediol yield can be significantly increased compared to the starting strain.
  • the parent strain may be a non-optimized wild type strain.
  • the parent strain may have been previously optimized, or further optimized as in the production of acetolactate synthase-producing production strain.
  • the optimization of a production strain according to the invention which comprises acetolactate synthase according to the invention can be achieved on the one hand by mutagenesis and selection of Mutants with improved production properties take place.
  • the optimization can also be carried out by genetic engineering by additional expression of one or more genes which are suitable for improving the production properties. Examples of such genes are the already mentioned 2,3-butanediol biosynthesis genes acetolactate decarboxylase and acetoin reductase.
  • genes can be expressed in a manner known per se as separate gene constructs or in combination as an expression unit (as a so-called operon) in the production strain.
  • an expression unit as a so-called operon
  • Klebsiella terrigena all three biosynthesis genes of 2, 3-butanediol ⁇ so-called. BUD operon, Blomqvist et al. , J. Bacteriol. (1993) 175: 1392-1404), or in strains of the genus Bacillus the genes of acetoacetate synthase and acetolactate decarboxylase are organized in an operon (enna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863-3875).
  • the production strain can be optimized by inactivating one or more genes whose gene products adversely affect 2,3-butanediol production.
  • genes whose gene products are responsible for by-product formation include z. B. the lactate dehydrogenase (lactic acid formation), the acetaldehyde dehydrogenase (ethanol formation) or else the phosphotransacetylase, or the acetate kinase (acetate formation).
  • the invention comprises a process for the production of 2,3-butanediol with the aid of a production strain according to the invention.
  • the method is characterized in that cells of a production strain according to the invention are cultivated in a growth medium.
  • biomass of the production strain and on the other hand the product 2,3-BDL are formed.
  • the formation of biomass and 2,3-BDL can be time correlated or temporally decoupled from each other.
  • the cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art.
  • the cultivation in shake flasks (Labormass tab) or by fermentation (production scale ⁇ . Preference is given to a process on a production scale by fermentation, with a fermentation volume greater than 10 l being particularly preferred as the production scale and a fermentation volume greater than 300 l being particularly preferred.
  • Cultivation media are familiar to the person skilled in the art of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source), and additives such as vitamins, salts, and trace elements, which optimize cell growth and 2,3-BDL product formation.
  • C sources are those that can be used by the production base for 2,3-BDL product formation. These include all forms of monosaccharides, including C6- ucker such. Glucose, mannose or fructose, and C5 sugar such as glucose. Xylose, arabinose, ibose or galactose.
  • the production process according to the invention also comprises all C sources in the form of disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiose.
  • the production process according to the invention furthermore also comprises all C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units, such as, for example, As maltodextrin, starch, cellulose, hemicellulose, pectin or by hydrolysis ⁇ enzymatically or chemically) released monomers or oligomers.
  • the hydrolysis of the higher C sources may precede the production process according to the invention or take place in situ during the production process according to the invention.
  • C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or derived acetate salts), ethanol, glycerol, citric acid (and salts thereof) or
  • C sources which are affected by the production process according to the invention comprise both the isolated pure substances and, for reasons of greater economic efficiency, not further purified mixtures of the individual C sources, such as can be obtained as hydrolyzates by chemical or enzymatic digestion of the vegetable raw materials , These include z. B.
  • Hydrolysates of starch ⁇ monosaccharide glucose), sugar beet (monosaccharides glucose, fructose and arabinose), sugar cane (disaccharide sucrose), pectin (monosaccharide galacturonic acid) or lignocellulose (monosaccharide glucose from cellulose, monosaccharides xylose, arabinose, mannose , Galactose from hemicellulose and the non-carbohydrate lignin). Furthermore, can serve as C sources and waste products from the digestion of vegetable raw materials, such. As molasses (sugar beet) or bagasse (sugar cane).
  • Preferred C sources for cultivating the production strains are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose and plant hydrolysates which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • C source is glucose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
  • N sources are those that can be used by the production base for biomass production. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or else its salts such. As ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, suitable N-source are the known nitrate salts such. B. KN0 3 , NaN0 3 , ammonium nitrate, Ca (N0 3 ) 2 , Mg ⁇ N0 3 ) 2 and other N sources such as urea.
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • the cultivation can take place in the so-called batch mode, whereby the growth medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources.
  • Cultivation can also take place in the so-called fed-batch mode, with additional nutrient sources being fed in after an initial phase of growth in batch mode (feed) in order to compensate for their consumption.
  • the feed can consist of the C source, the N source, one or more important for the production of vitamins, or trace elements or a combination of the aforementioned.
  • the feed components can be used together as a mixture or else separately
  • Feed lines are added.
  • other media components as well as specific 2,3-BDL production enhancing additives may be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Preference is the ' breeding after the fed-batch mode.
  • Preferred C sources in the feed are glucose, sucrose, molasses, or vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • Preferred N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 0H and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KN0 3 , NaN0 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids Corn Steep Liquor as well as N -Amine and Yeast Nitrogen Base.
  • N sources in the feed are ammonia or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (in liquid or in dried form).
  • the cultivation takes place under pH and temperature conditions which favor the growth and the 2,3-BDL production of the production strain.
  • the useful pH range is from pH 5 to pH 8.
  • Preferred is a pH range of pH 5.5 to pH 7.5.
  • Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7.
  • the preferred temperature range for the growth of the production strain is 20 ° C to 40 ° C. Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation) .
  • oxygen supply is preferred, oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen Cultivation by entry of compressed air.
  • the cultivation time for 2,3-BDL production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
  • Cultivation batches obtained by the method described above contain the 2,3-BDL product, preferably in the culture supernatant.
  • the 2,3-BDL product contained in the cultivation mixtures can either be used further directly without further work-up or else be isolated from the cultivation batch.
  • known Verhrens intimide are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction, distillation or crystallization, or precipitation.
  • These process steps can be combined in any desired form in order to isolate the 2,3-BDL product in the desired purity.
  • the degree of purity to be achieved depends on the further use of the 2,3-BDL product.
  • Various analytical methods for the identification, quantification and determination of the purity of the 2,3-BDL product are available, including NMR, gas chromatography, HPLC, mass spectrometry or a combination of these analytical methods.
  • FIG. 1 shows the 4.9 kb acetolactate synthase expression vector pBudBkt produced in Example 1.
  • FIG. 2 shows the 4.9 kb acetolactate synthase expression vector pALSbl prepared in Example 1.
  • FIG. 3 shows the 2.9 kb expression vector p Kj produced in Example 1.
  • Fig. 5 shows the 6kb size epitaxial vector pALSbl-tet prepared in Example 1.
  • Fig. 6 shows the 6 kb plasmid pBudBkt-tet (rev) used in Example 1.
  • FIG. 7 shows the 5.3 kb epic expansion vector pAC-BudBkt produced in Example 1.
  • Fig. 8 shows the plasmid pACYC18 used in Example 1.
  • the acetolactate synthase genes from K. terrigena and B. licheniformis were used.
  • the DNA sequence of the acetolactate synthase gene from K. terrigena is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number L04507, bp 969-2648. It was isolated in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic K. terrigena DNA (strain DSM 2687, commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • the DNA sequence of the B. licheniformis acetolactate synthase gene is disclosed in the "GenBank" gene database under accession number NC_006270, which discloses the entire genomic sequence of B. licheniformis, in which the acetolactate synthase gene is in complementary form of bp 3675290 - It was found in a PCR reaction ⁇ Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic B lichenotypic DNA ⁇ strain DSM 13, commercially available from DSMZ GmbH) with the primers BLals-lf and BLals-2r as DNA Fragment of 1.7 kb size isolated.
  • the genomic DNA used for the PCR reactions was previously in a conventional manner with a DNA isolation kit (Qiagen) from cells of the culture of. terrigena DSM 2687 and B. licheniformis DSM 13 in LB medium ⁇ 10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl).
  • pKKj is a derivative of the expression vector pKK223-3.
  • the DNA sequence of pKK223-3 is disclosed in the "GenBank" gene database accessed by M77749.1, and approximately 1.7 kb were removed from the 4.6 kb plasmid (bp 262-1947 of M77749.1 of DNA sequence) resulting in the 2.9 kb expression vector pKKj ( Figure 3).
  • the expression vectors pBudBkt and pALSbl were modified by incorporation of an expression cassette for the tetracycline resistance gene.
  • the tetracycline resistance gene was first extracted from the plasmid pACYC184 (The DNA sequence of pACYC184 is accessible in the "Genbank” gene database under the accession number
  • Primer tetlf SEQ ID NO: 5
  • tet2r SEQ ID NO: 6
  • the plasmid pBudBkt-tet (rev) was first cut with Hind III and the 2 kb expression cassette for the acetolactate synthase gene was isolated.
  • pBudBkt-tet (rev) had been isolated upon cloning of the vector pBudBkt-tet and contained the tetracycline expression cassette in opposite orientation to the acetolactate synthase expression cassette ( Figure 6).
  • the DNA TM fragment was cloned into the Hind III cut vector pACYC-LH.
  • pACYC-LH is a 3.2 kb derivative of pACYC184 ( Figure 8) from which the chloramphenicol resistance marker was removed.
  • the 4.2 kb vector pACYC184 was cut with Sca I and Bst 11071 and then religated.
  • Plasmid DNA of the expression vectors pBudBkt-tet, pALSbl-tet and pAC-BudBkt was transformed into E. coli strain JM105 according to methods known per se.
  • the control was E. coli JM105 transformed with the vector pACYC-LH.
  • One clone each was selected and cultured in a shake flask culture.
  • a preculture was prepared in LBtet medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 g / ml tetracycline) (cultivation at 37 ° C. and 120 ° C.) rpm overnight).
  • acetolactate synthase 50 ml of the E. coli cells were centrifuged (10 min 15000 rpm, Sorvall RC5C centrifuge equipped with an SS34 rotor), the cell pellet in 2 ml KPi buffer (0.1 M potassium phosphate, 0, 1 M NaCl, pH 7.0), in a conventional manner with a so-called.
  • KPi buffer 0.1 M potassium phosphate, 0, 1 M NaCl, pH 7.0
  • acetolactate synthase activity was carried out in a manner known per se (Bauerle et al., Biochim Biophys Acta (1964) 92: 142-149).
  • 1 U acetolactate synthase activity is defined as the amount of enzyme which produces 1 ⁇ acetolactate / min under test conditions.
  • enzyme extract was adjusted to a volume of 2.5 ml together with assay buffer (100 mM KPi, 10 mM MgCl 2, pH 7.5) containing 2.5 ml of 80 mM Na-pyruvate, 160 ⁇ g / ml of thiamine pyruvate. dissolved in H20, mixed and incubated at 37 ° C.
  • assay buffer 100 mM KPi, 10 mM MgCl 2, pH 7.5
  • the amount of acetolactate formed was determined from a standard curve previously prepared with acetoin.
  • the protein concentration of the cell extracts was determined in a manner known per se using the so-called "BioRad protein assay" from BioRad. 3rd example: Expression of acetolactate synthase in Klebsiella terrigena
  • the starting strain was Klebsiella terrigena DSM 2687.
  • the transformation with the plasmids pBudBkt-tet, pAC-BudBkt and pALSbl-tet was carried out in a manner known per se analogously to the methods for the transformation of E. coli known to the person skilled in the art.
  • the control strain used was the untransformed wild-type strain Klebsiella terrigena DSM 2687.
  • Transformants were isolated and tested for acetolactate synthase activity by shake flask culture. For this purpose, in each case 50 ml of FM2tet medium (without tetracycline in the K. terrigena wild-type control strain) were inoculated with a transformant and incubated for 24 h at 30 ° C. and 140 rpm (Infors shaker).
  • FM2tet medium contained glucose 60 g / l; 10g / 1; Yeast Extract (Oxoid) 2.5 g / 1; Ammonium sulfate 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 0 75 mg / 1 ? Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1; KH 2 P0 4 1.5 g / 1; Trace element mix 10 ml / 1 and tetracycline 15 mg / 1.
  • the pH of the FM2tet medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / 1; CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / 1; ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 0 0.3 g / 1 and Na 2 Mo0 4 ⁇ 2 H 2 0 0.15 g / 1.
  • Example 2 The cells were analyzed as described in Example 2 for E. coli. Klebsiella cells were digested with the " French® Press" and the cell extracts analyzed for acetolactate synthase activity The specific acetolactate synthase activity in crude extracts of the various strains (determined as described in Example 2) is shown in Table 1. Table 1: Comparison of acetolactate synthase activity in recombinant K. terrigena strains
  • Example 4 2, 3 -BDL production by shake flask cultivation of recombinant K. terrigena strains
  • the determination of the 2,3-butanediol content in culture supernatants was carried out in a manner known per se by 1 H-NMR.
  • an aliquot of the culture was centrifuged (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) and 0.1 ml of the culture supernatant with 0.6 ml of TSP (3- (trimethylsilyl) ropionsäure- 2, 2, 3-d 4 sodium salt) standard solution defined content (internal standard, typically 5 g / 1) in D 2 0 mixed.
  • TSP trimethylsilyl
  • Feed medium (74% glucose, w / v) corresponding to the glucose consumption metered in via a peristaltic pump
  • an alk Vegetable-based oxylated fatty acid ester commercially available under the name Struktol J673 from Schill & Seilacher (diluted 20-25% v / v in water).
  • Klebsiella terrigena wild type strain control strain from Example 3
  • the acetolactate synthase overproducing strains Klebsiella terrigena pBudBkt-tet, Klebsiella terrigena pAC-BudBkt and Klebsiella terrigena-pALSbl-tet see Example 4
  • Fermentation medium was FM2tet medium (see 3rd example, medium without tetracycline for the K. terrigena wild-type control strain). 1.35 L of the medium was inoculated with 150 ml of preculture. The
  • Preculture of the strains to be fermented was produced by 24 h shake flask cultivation in Baten fermentation medium.
  • the Fermentation conditions were: temperature 30 ° C, stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.0.
  • the fermenter was sampled at regular intervals to analyze the following parameters:
  • the cell density OD600 as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (BioRad photometer SmartSpec TM 3000).
  • the glucose content was determined as described in Example 4.
  • the 2, 3 -BDL content was determined by NMR as described in Example 4.
  • the product was pumped by means of a pump (peristaltic pump 101 U / R of the Fa.
  • Watson Marlow added a 74% (w / v) glucose solution.
  • the feeding rate was determined by the current glucose consumption rate.
  • Table 3 shows the time-dependent 2, 3 -BDL formation in the K. terrigena control strain and in the acetolactate synthase overproducing, recombinant Klebsiella terrigena strains. As already observed in the shake flask experiments (4.
  • Example 6 2,3-BDL fermentation in 330 l scale
  • the strain Klebsiella terrigena-pALSbl-tet was fermented (see 4th and 5th examples).
  • An inoculum of Klebsiella terrigena pALSbl- tet in LBtet medium was prepared by 2 x 100 ml LBtet medium, each in a 1 1 Erlenmeyer flask, each with 0.25 ml of a Glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet medium, mixed with glycerol in a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C) was seeded for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on a Infors orbital shaker (cell density OD SO o / ml of 0.5-2.5) .100 ml of preculture used to inoculate 8 1 fermenter medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium.
  • Prefermenters The fermentation was performed three fermenters the company Sartorius BBI Systems GmbH in two Biostat ® C-DCU. Fermentation medium was FM2tet (see Example 3) The fermentation was carried out in the so-called batch mode.
  • Main fermentor The fermentation was ® in a Biostat D 500 fermenter (working volume 330 1, 500 1 tank volume) of the company Sartorius BBI Systems GmbH performed. Fermentation medium was FM2tet (see 3rd example). The fermentation took place in the so-called fed-batch mode.
  • the glucose consumption was reduced by off-line glucose Measurement with a glucose analyzer from the company YSI determined (see 4th example). As soon as the glucose concentration of the fermentation seed was about 20 g / l (8-10 h after inoculation), the metered addition of a 60% w / w glucose feed solution was started. The flow rate of the feed was chosen so that during the production phase a glucose concentration of 10 - 20 g / 1 could be maintained. After completion of the fermentation, the volume in the fermenter 330 was 1. The analysis of the fermentation parameters was carried out as described in the 5th example. The production process is shown in Table 4.

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Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2 , 3-Butandiol
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2 , 3-Butandiol (2,3-BDL) mittels eines verbesserten Mikroorganismenstammes, der eine 2 bis 68 -fach erhöhte Aceto- lactatsynthase Aktivität gegenüber dem nicht verbesserten Ausgangsstamm aufweist.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstel- lungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe. Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthese- bausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol {C2- Baustein) , Glycerin, 1, 3 -Propandiol , 1 , 2-Propandiol (C3- Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2~Butanol, 1,4- Butandiol oder auch 2 , 3-Butandiol (C4 -Bausteine) . Diese chemi- sehen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwach enden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Dabei ist entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen das gewünschte Produkt in hoher Konzentration und unter geringer Nebenprodukt- bildung aus dem biogenen Rohstoff herstellen. Die Optimierung der als Produktionsstämme bezeichneten Mikroorganismen in Bezug auf Produktivität und Wirtschaftlichkeit wird beispielsweise erreicht durch Metabolie Engineering.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4 -Baustein ist 2,3- Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances {2009) 27: 715-725). 2 , 3 -Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4 -Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3- Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK) . Ausserdem sind Produkte mit zwei C-Atomen {C2-Bausteine) wie Essigsäure (DE 102010001399) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2 , 3-Butandiol sind auch C8 -Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrxttene biosynthetische Weg zu 2 , 3 -Butandiol ist bekannt (siehe Review von Celins- ka und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatisehen Schritte zum 2 , 3-Butandiol :
Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2 , 3-Butandioldehydrogenase) : NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2 , 3 -Butandiol . Verschiedene natürliche Produzenten von 2 , 3 -Butandiol sind bekannt, z. B, aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus, Lactobacillus, Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z.B. Bäckerhefe). Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also grosstechnisch nicht ohne aufwändige und teuere technische Sicherheitsmassnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2, 3-Butandiolproduzenten siehe Re- view von Celinska und Grajek, Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725) . Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten. Für eine kosteneffiziente grosstechnische 2,3-BDL Produktion sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe Sl bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen 2,3-BDL Ausbeuten beschrieben. Bekannte 2 , 3 -BDL-Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Arten Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Bacillus polymyxa o- der Bacillus licheni ormis . In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol . Microbiol. (2001), 51: 925-932) werden infolge einer taxonomischen Umbennung die Arten Klebsiella ter- rigena und Klebsiella planticola synonym auch als Raoultella terrigena und Raoultella planticola bezeichnet. Es handelt sich dabei um Stämme der gleichen Art .
Für diese in der Sicherheitsstufe Sl eingestuften Stämme wurden bisher 2, 3 -Butandiolausbeuten von nicht mehr als 57 g/1 (637 mM, Produktionsdauer 60 h) berichtet (Nakashimada et al . , J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661-664). Diese Ausbeuten sind für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem zu gering. Als minimale Fermentationsausbeute für eine wirtschaft- liehe Produktion werden >80 g/1 2 , 3 -Butandiol (Fermentations- dauer maximal 72 h) , bevorzugt >100 g/1 2 , 3-Butandiol angesehen. Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN- 10: 0160850428.
Die Überexpression von Acetolactatsynthase in dem Milchsäure- gärenden Bakterium Lactococcus lactis ist in Platteeuw et al . , Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61: 3967 - 3971 beschrieben. Dort wurde die Verwertung der C-Quelle Lactose und das daraus resultierende Produktspektrum untersucht. Ziel der Untersuchungen war eine Optimierung der Produktion des Aromastoffes Di- acetyl. In Stämmen, die Acetolactatsynthase 100 -fach überexpri- mierten, konnte kein 2 , 3 -Butandiol nachgewiesen werden. In einem Acetolactatsynthase 100- fach überexprimierenden und Lactat- dehydrogenase-defizienten Stamm konnten Ausbeuten von maximal 22,3 mM (entspricht 2 g/1) 2 , 3 -Butandiol erzielt werden. Diese Ausbeuten liegen weit unterhalb der in Sl Wildtypstämmen erzielbaren Ausbeuten. Darüberhinaus wurden diese Ergebnisse nur unter Verwendung des aus tierischen Quellen gewonnenen ilchzu- ckers Lactose als C-Quelle erzielt, der für eine großtechnishce Anwendung zu teuer ist.
Aufgabe der Erfindung war es, Produktionsstämme zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol bereitzustellen, die deutlich höhere 2,3- Butandiolausbeuten ermöglichen als der Ausgang stamm.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm eine 2 bis 68 fach über dem Ausgangs- stamm liegende Acetolactatsynthase Aktivität aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten, aber zur 2,3- Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm oder einen bereits weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Bei einem bereits weiter optimierten Wildtypstamm (z.B. durch einen gentechnischen Eingriff erfolgt) , ist jedoch nicht die Acetolactatsynthaseak- tivität von der Optimierung betroffen.
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein bezüglich der 2, 3-Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine im Vergleich zum
Ausgangsstamm erhöhte Aktivität des Enzyms Acetolactatsynthase (ALS) gekennzeichnet ist. Der Produktionsstamm wird aus dem Ausgangsstamm hergestellt. Wenn ein bereits optimierter Ausgangsstamm durch eine Erhöhung der Acetolactatsynthase Aktivi- t t nochmals verbessert werden soll, so ist es natürlich ebenso möglich zunächst in einem unverbesserten Stamm die Acetolactatsynthase Aktivität zu erhöhen und anschließend weitere Verbesserungen einzubringen. Die Erhöhung der Acetolactatsynthaseaktivität im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des AusgangsStammes (z.B. eine die Promotoraktivität steigernde Mutation) , eine die Enzymaktivität steigernde Mutation im Acetolactatsynthasegen oder durch Überexpression eines homologen oder aber auch heterologen Acetolactatsynthase- gens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die Überexpression eines homologen oder eines heterologen Acetolactatsynthasegens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist im Produktionsstamm die Acetolactatsynthase Aktivität um den Faktor 3 bis 64 besonders bevorzugt um den Faktor 3 bis 30 und besonders bevorzugt um den Faktor 4 bis 20 im Vergleich zum Ausgangsstaram erhöht.
Besonders bevorzugt wird diese erhöhte Acetolactatsynthase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expres- sion eines homologen oder heterologen, für ein Acetolactatsyn- thaseenzym kodierenden Gens erreicht.
Bei dem Ausgangsstamm kann es sich um einen beliebigen 2,3- Butandiol produzierenden Stamm handeln. Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella, Raoultella, Bacillus oder Lactobacillus .
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Art Klebsiella {Raoultella} terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola nochmals bevorzugt ist.
Insbesondere bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe Sl und von diesen, darüberhinaus bevorzugt, Stämme der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola.
Hachdem in dem aus Platteeuw et al . , Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61: 3967 - 3971, bekannten Acetolactatsynthase- überexprimierenden Lactococcus Stamm kein 2 , 3-Butandiol nachge- wiesen werden konnte, ging der Fachmann davon aus, dass die Überexpression der Acetolactatsynthase keine Verbesserung der 2 , 3 -Butandiol Produktion in einem Produktion stamm bewirken kann. Im Rahmen von Versuchen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde überraschend gefunden, dass durch eine begrenzt erhöhte ALS Aktivität (3,2 bis 68,4 fach) in einem Produktionsstamm die Ausbeute an 2 , 3 -Butandiol signifikant gesteigert werden kann. Vorzugsweise wird die erhöhte ALS Aktivität durch re- kombinante Überexpression einer Acetolactatsynthase (EC
2.2.1.6) erreicht. ie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist eine Überexpression der Acetolactatsynthase um den Faktor 3,2 bis zu einem Faktor 68,4 (siehe 3. Beispiel) dazu geeignet, die 2 , 3~Butandiolausbeute {bestimmt als Volumenausbeute 2,3- Butandiol in g/1) in Schüttelkolben um mehr als 25 %, bevorzugt mehr als 30 % und insbesondere um mehr als 40 % (siehe 4. Beispiel) und in der Fermentation um mehr als 15 %, bevorzugt mehr als 20 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 30 % (siehe 5. und 6, Beispiel} zu steigern.
Wie im 3. und 4. Beispiel weiter gezeigt, ermöglicht die rekom- binante Überexpression der Acetolactatsynthase um einen Faktor 68 eine Erhöhung der 2 , 3 -Butandiolausbeute im Schüttelkolben.
Bei der Acetolactatsynthase (ALS) handelt es sich um ein Enzym aus der Enzymklasse EC 2.2.1.6. Es kann sich um jedes genkodierte Enzym handeln, das nach Formel (I) die Synthese von Ace- tolactat aus zwei Molekülen Pyruvat bewirkt.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetolactatsynthase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultel- la) oder Bacillus .
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetolactatsynthase aus einem Stamm der Art Klebsiella terrige- na, Klebsiella planticola, Bacillus {Paenibacillus} polymyxa oder Bacillus licheniformis und insbesondere aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola oder Bacillus licheni ormi . Diese Stämme sind alle käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Braunschweig) , darunter ist ebenso bei der DSMZ GmbH käuflich erhältlich der in den Beispielen verwendete Stamm Klebsiella (Raoultella) terrigena DSM 2687.
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht somit die Steigerung der fermentativen Produktion von Acetolactat . Die Erfindung ermöglicht somit nicht nur die Produktion von 2 , 3-Butandiol sondern auch die Produktion anderer StoffWechselprodukte , die sich wie 2, 3-Butandiol von Acetolactat ableiten lassen. Zu diesen Stoffwechselprodukten gehören Acetoin, Diacetyl, Ethanol und Essigsäure , Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm ist in einer bevorzugten Ausführung form auch dadurch charakterisiert, dass er aus einem Ausgang tamm, wie in der Anmeldung definiert, hergestellt wur- de und eine Acetolactatsynthase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 25 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2 , 3 -Butandiol Ausbeute des AusgangsStammes mindestens 90 g/1 beträgt.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstruktes in einen der ge~ nannten Ausgangestämme .
Das Genkonstrukt in seiner einfachsten Form ist definiert als bestehend aus dem Acetolactatsynthase Strukturgen, dem operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Acetolactatsynthase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription ührt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der sog. dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläufige „Tac- Promotor".
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom repli ierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen
Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können.
Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstam- mes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist. Das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder mit dem Ziel der genomischen Integration, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol . Biotech- nol . (2010) 85: 1301 - 1313}, darunter beispielsweise die
Elektroporation .
Zur Selektion transformierter Produktions tamme enthält das Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen sog. Selekti- onsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus An- tibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarker .
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker , besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Zeocin verleihen .
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder in das Genom integriert und produziert ein Acetolactatsynthase Enzym in rekombinanter Form. Das rekombinante Acetolactatsynthase Enzym ist in der Lage, unter Abspaltung von C02 aus zwei Molekülen Pyruvat Acetolactat zu produzieren. Nun wurde überraschend gefunden, dass durch geeignete rekombinante Überexpression des Acetolactatsynthase Enzyms im Produktionsstamm die 2 , 3 -Butandiol Ausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Der Ausgangsstamm kann jedoch bereits vorher optimiert worden sein, bzw. als er indungsgemässer Ace- tolactatsynthase produzierender Produktionsstamm weiter optimiert werden. Die von der Erfindung umfasste Optimierung eines erfindungsgemässen Acetolactatsynthase produzierenden Produktionsstammes kann einerseits durch Mutagenese und Selektion von Mutanten mit verbesserten Produktionseigenschaften erfolgen. Die Optimierung kann jedoch auch gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind die bereits genannten 2 , 3-Butandiol Biosynthesegene Acetolactatdecarboxylase und Acetoinreduktase . Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Gen- konstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Klebsiella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2 , 3-Butandiols {sog. BUD-Operon, Blomqvist et al . , J. Bacteriol. (1993) 175: 1392 - 1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetoiactatsyntha- se und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind ( enna et al . , J. Bacteriol (1993) 175: 3863 - 3875).
Weiterhin kann der Produktionsstamm dadurch optimiert werden, dass ein oder mehrere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die 2 , 3-Butandiol Produktion auswirken.
Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactat- dehydrogenase (Milchsäurebildung) , die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) oder aber auch die Phosphotransacetylase , bzw. die Acetatkinase (Acetatbildung) .
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von 2 , 3 -Butandiol mit Hilfe eines erfindungsgemässen Produktionsstammes . Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eines er- findungsgemässen ProduktionsStammes in einem Anzuchtsmedium kultiviert werden. Dabei wird einerseits Biomasse des Produkti- onsstammes und andererseits das Produkt 2,3-BDL gebildet. Die Bildung von Biomasse und 2,3-BDL kann dabei zeitlich korrelie- ren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormass tab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmassstab} . Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmassstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmassstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolu™ men grösser 300 1 insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiel- len Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die 2,3-BDL Produktbildung optimiert werden. C-Quellen sind solche, die vom Produktions - stamm zur 2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6- ucker wie z. B. Glucose, Mannose oder Fructose sowie C5- ucker wie z.B. Xylose, Arabinose, ibose oder Galactose.
Das erfindungsgemässe Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccha- rose, Lactose, Maltose oder Cellobiose.
Das erfindungsgemässe Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Malto- dextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse {enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C- Quellen dem erfindungsgemässen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemässen Pro- duktionsverfahrens erfolgen.
Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder
Pyruvat (und dessen Salze) . Es sind aber auch gasförmige C~ Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar. Die vom erfindungsgemässen Produktionsverfahren betroffenen C- Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch chemischen oder enzy atischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z. B.
Hydrolysate der Stärke {Monosaccharid Glucose) , der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose) , des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose) , des Pektins (Monosaccharid Ga- lacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glucose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den Kohlehydraten gehörende Lignin) . Weiterhin können als C-Quellen auch Abfallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr) .
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstamme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zu- ckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Glucose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats. N-Quellen sind solche, die vom Produktions tamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehören Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsul at, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KN03, NaN03, Ammoniumnitrat, Ca(N03)2, Mg{N03)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base. Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes in- okuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed) , um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen
Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die 2,3-BDL Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die' Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose, Melasse, oder pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH40H und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KN03, NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch N -Amine und Yeast Nitrogen Base .
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Am- moniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) . Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung} . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoff ersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das 2,3-BDL Produkt, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene 2,3-BDL Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des 2,3-BDL Produkts stehen an sich bekannte Ver ahrensschritte zur Verfügung, darunter Zent- rifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion, Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das 2,3-BDL Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung des 2,3-BDL Produkts. Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des 2,3-BDL Produktes sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Ana- lysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 4,9 kb grossen Acetolactatsynthase Expessionsvektor pBudBkt .
Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 4,9 kb grossen Acetolactatsynthase Expessionsvektor pALSbl .
Fig. 3 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 2,9 kb grossen Expessionsvektor p Kj .
Fig. 4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 6 kb grossen Ex- pessionsvektor pBudBkt-tet,
Fig. 5 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 6 kb grossen Expessionsvektor pALSbl-tet.
Fig. 6 zeigt zeigt das in Beispiel 1 verwendete 6 kb grosse Plasmid pBudBkt-tet (rev) .
Fig. 7 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,3 kb grossen Expessionsvektor pAC-BudBkt.
Fig. 8 zeigt das in Beispiel 1 genutzte Plasmid pACYC18 .
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu- tert:
1. Beispiel: Herstellung von Acetolactatsynthase Expressions- Vektoren
Verwendet wurden die Acetolactatsynthase Gene aus K. terrigena und B. licheniformis . Die DNS-Sequenz des Acetolactatsynthase- gens aus K. terrigena ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer L04507, bp 969 - 2648. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase , Qiagen) aus genomischer K. terrigena DNS (Stamm DSM 2687, käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH) mit den Primern BUD5f und BUD6r als DNS-Fragment von 1,7 kb Grösse isoliert. Die DNS-Sequenz des Acetolactatsynthase Gens aus B. lichenifor- mis ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer NC_006270, unter der die gesamte Genomsequenz von B. licheniformis offenbart ist. Das Acetolactatsynthase Gen ist dort in komplementärer Form von bp 3675290 - 3677008 zu finden. Es wurde in einer PCR-Reaktion {Taq DNS- Polymerase , Qiagen) aus genomischer B, licheni ormis DNS {Stamm DSM 13, käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH) mit den Primern BLals-lf und BLals- 2r als DNS-Fragment von 1,7 kb Grösse isoliert.
Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS- Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von . terrigena DSM 2687 und B. licheniformis DSM 13 in LB-Medium {10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefe- extrakt, 5 g/1 NaCl) gewonnen worden.
Primer BUD5 f (SEQ ID NO: 1) und BUD6r (SEQ ID NO: 2) hatten folgende DNS-Sequenzen: SEQ ID NO: 1:
5'~GAA TTC ATG GAC AAA CCG CGT CAC GAA CGT C-31
SEQ ID NO : 2 :
5'-AAG CTT TCA CAG TAT TTG GCT GAG ATG GAG C~3'
Primer BLals-lf (SEQ ID NO: 3) und BLals-2r {SEQ ID NO: 4) hatten folgende DNS -Sequen en: SEQ ID NO: 3 :
5 ' -GAA TTC ATG AAT AAT GTA GCC GCT AAA AAT G»3 x
SEQ ID NO: 4 :
5' -CTG CAG TCA AGA TTG CTT AGA GGC TTC- 31
Die PCR-Produkte wurden mit Eco RI (in Primer BÜDBf und BLals- lf enthalten) und Hind III {in Primer BUD6r enthalten) , bzw. Pst I (in Primer BLals-2r enthalten) nachverdaut und in den Ex- pressionsvektor p Kj kloniert. Dabei entstanden die jeweils 4,9 kb grossen Acetolactatsynthase Expessionsvektoren pBudBkt (Fig. 1) und pALSbl (Fig. 2) . Expressionsvektor pKKj :
pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS- Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugriff ummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 - 1947 der in M77749.1 of- fenbarten DNS-Sequenz ) , wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj (Fig. 3) entstand.
Die Expressionsvektoren pBudBkt und pALSbl wurden durch Einbau einer Expressionskassette für das Tetracyclin Resistenzgen mo- difiziert. Dazu wurde das Tetracyclin Resistenzgen zuerst aus dem Plasmid pACYC184 (Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zugänglich in der „Genbank" Gendatenbank unter der Zugangnummer
X06403.1, siehe auch Fig. 8) durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qi- agen) mit den Primern tetlf und tet2r und anschliessenden Ver- dau mit Bgl II (Schnittstellen enthalten in den Primern tetlf und tet2r) als 1,45 kb Fragment isoliert und dann in die jeweils mit Bam HI geschnittenen Vektoren pBudBkt und pALSbl kloniert. Dadruch entstanden die jeweils 6 kb grossen Expressionsvektoren pBudBkt-tet (Fig. 4) und pALSbl-tet (Fig. 5) . Wie in Fig. 4 und Fig. 5 dargestellt, wurde jeweils ein Klon ausgewählt, bei dem die Tetracyclin- und die Acetolactatsynthase Expressionskassetten jeweils in der gleichen Richtung orientiert waren . Primer tetlf (SEQ ID NO: 5) und tet2r (SEQ ID NO: 6) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 5:
5'-TCA TGA GAT CTC AGT GCA ATT TAT CTC TTC-31
SEQ ID NO: 6:
5'-TCA TGA GAT CTG CCA AGG GTT GGT TTG CGC ATT C-3' Expressionsvektor pAC-BudBkt:
Zur Herstellung eines Expressionsvektors mit im Vergleic zu pBudBkt-tet geringeren Kopienzahl wurde zuerst das Plasmid pBudBkt-tet (rev) mit Hind III geschnitten und die 2 kb grosse Expressionskassette für das Acetolactatsynthase Gen isoliert. pBudBkt- tet (rev) war bei der Klonierung des Vektors pBudBkt-tet isoliert worden und enthielt die Tetracyclin Expressionskassette in entgegengesetzter Orientierung zur Acetolactatsynthase Expressionskassette (Fig. 6) . Anschliessend wurde das DNS™ Fragment in den mit Hind III geschnittenen Vektor pACYC-LH klo- niert . Es entstand der 5,3 kb Expressionsvektor pAC-BudBkt (Fig. 7). pACYC-LH ist ein 3,2 kb Derivat von pACYC184 (Fig. 8) , aus dem der Chloramphenicol Resistenzmarker entfernt worden war. Dazu wurde der 4,2 kb Vektor pACYC184 mit Sca I und Bst 11071 geschnitten und anschliessend religiert.
2. Beispiel: Expressionsanalyse in E. coli
Plasmid-DNS der Expressionsvektoren pBudBkt-tet, pALSbl-tet und pAC-BudBkt wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm JM105 transformiert. Als Kontrolle diente E. coli JM105, transformiert mit dem Vektor pACYC-LH. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Von den E. coli-Stämmen wurde in LBtet-Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 g/ml Tetracyclin) eine Vorkul- tur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht) . Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBtet Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 30°C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte OD600 von 2,0 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid, 0,4 mM Endkonzentration) zugegeben und über Nacht bei 30°C und 180 rpm geschüttelt.
Zur Analyse der Acetolactatsynthase Expression wurden 50 ml der E. coli Zellen zentrifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall Zentri- fuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) , das Zellpellet in 2 ml KPi-Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl , pH 7,0) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog.
„French®Press" Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlos- sen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Acetolactatsynthase Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische Acetolactatsynthase Aktivität in Zellextrakten, abhängig vom jeweiligen Kon- strukt, zwischen 5 und 27 U/mg Protein.
Spektralphotometrische Bestimmung der Acetolactatsynthase Akti- vität:
Die Bestimmung der Acetolactatsynthase Aktivität wurde in an sich bekannter Weise (Bauerle et al . , Biochim. Biophys . Acta (1964) 92: 142 - 149) durchgeführt. Dabei ist 1 U Acetolactat- synthase Aktivität definiert als die Enzymmenge, die 1 μτηοΐ Acetolactat/min unter Testbedingungen produziert.
Eine geeignete Menge Enzymextrakt wurde zusammen mit Testpuffer (100 mM KPi, 10 mM MgCl2, pH 7,5) auf ein Volumen von 2 , 5 ml eingestellt, mit 2,5 ml 80 mM Na-Pyruvat, 160 pg/ml Thiamin Py- rophosphat, in H20 gelöst, gemischt und bei 37 °C inkubiert.
Nach 0', 10', 30' und 60' Inkubationsdauer wurden jeweils 1 ml des Ansatzes in 0,1 ml 50 % H2S04 pipettiert und 30 min bei 37°C inkubiert, um die Reaktion zu stoppen und gebildetes Aceto- lactat zu Acetoin zu decarboxyliere . Anschliessend wurden 0,9 ml 2,5 M NaOH zugegeben und 1,2 ml des Ansatzes mit 0,2 ml 0,5 % Creatin, 0,2 ml 5 % alpha-Naphtol in 2,5 M NaOH gemischt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schliesslich wurde die Extinktion bei 524 nm bestimmt. Dabei erfolgte der Nullabgleich des Photometers durch einen Testansatz nur mit Puffer, ohne Enzym.
Die Menge des gebildeten Acetolactats wurde aus einer zuvor mit Acetoin erstellten Standardkurve ermittelt.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt. 3. Beispiel: Expression von Acetolactatsynthase in Klebsiella terrigena
Ausgangsstamm war Klebsiella terrigena DSM 2687. Die Transfor- mation mit den Plasmiden pBudBkt-tet, pAC-BudBkt und pALSbl-tet erfolgte in an sich bekannter Weise analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Als Kon- trollstamra wurde der nicht transformierte Wildtyp Stamm Klebsiella terrigena DSM 2687 verwendet.
Transformanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf Acetolactatsynthase Aktivität getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2tet-Medium (ohne Tetracyclin beim K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm} mit einer Transformante beimpft und 24 h bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
FM2tet Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulfat 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1? Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; KH2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/1; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 x 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; ZnS04 x 7 H20 0,3 g/1 und Na2Mo04 x 2 H20 0,15 g/1.
Die Zellen wurden, wie im 2. Beispiel für E. coli beschrieben, analysiert. Klebsiella Zellen wurden mit der „French®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf Acetolactatsynthase Aktivität untersucht. Die spezifische Acetolactatsynthase Aktivität in Rohextrakten der verschiedenen Stämme (bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben) ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Vergleich der Acetolactatsynthase Aktivität in re- kombinanten K. terrigena Stämmen
4. Beispiel: 2 , 3 -BDL-Produktion durch Schüttelkolbenanzucht re- kombinanter K. terrigena Stämme
Die Kultivierung der mit dem Plasmiden pBudBkt-tet , pAC-BudBkt und pALSbl-tet transformierten K. terrigena Stämme erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Die Kultivierungsdauer betrug jedoch 96 h. Dabei wurde die Glucosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt {Glucoseanalysator 7100MBS der Fa. YSI) und Glucose bei Bedarf aus einer 40 % (w/v) Stocklösung nachgefüt- tert . In Abständen von 48 h wurden Proben auf ihren 2,3-BDL Gehalt untersucht. Das Ergebnis der 2,3-BDL Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: BDL-Produktion in Klebsiella terrigena Transformanten
Wie in Tabelle 2 ersichtlich, resultierte die Überexpression der Acetolactatsynthase Gene aus K. terrigena, bzw. B.
licheniformis in Klebsiella terrigena in einer unerwartet hohen Steigerung der 2, 3 -BDL Produktion in der Schüttelkolbenanzucht um ca. 40 %. Dabei war die Produktionssteigerung unabhängig da- von, ob die Acetolactatsynthase Aktivität der rekombinanten Stämme nur um den Faktor 3 oder aber um den Faktor 68 gesteigert worden war (vergleiche dazu 3. Beispiel). Offensichtlich reicht eine vergleichsweise nur geringe Überexpression aus, um im Schüttelkolben eine signifikante Erhöhung der 2,3-BDL Pro- duktion zu erzielen.
Die Bestimmung des 2 , 3 -Butandiolgehalts in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR . Dazu wurde ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3- (Trimethylsilyl) ropionsäure- 2 , 2 , 3 , 3-d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D20 gemischt. Die 1H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert :
TSP: 0,140 - - 0,145 ppm (9H)
2 , -Butandiol : 1,155 - - 1,110 m (6H)
Ethanol : 1,205 - - 1,157 ppm (3H)
Essigsäure : 2,000 - - 1,965 ppm (3H)
Acetoin: 2,238 - - 2,200 ppm (3H) 5. Beispiel:
2,3-BDL Produktion mit Acetolactatsynthase überexprimierenden . terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des p02 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausge- rüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fer- mentationspararaeter Rührerdrehzahl (rpm) , Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentati- onsmedium pro Minute) , p02 (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt) , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (74 % Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Glucoseverbrauch über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt}, verwendet.
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren der Klebsiella terrigena Wildtyp Stamm (Kontrollstamm aus dem 3. Beispiel) und die Acetolactatsynthase überproduzierenden Stämme Klebsiella terrigena-pBudBkt-tet , Klebsiella terrigena-pAC-BudBkt und Klebsiella terrigena-pALSbl-tet (siehe 4. Beispiel). Batch-
Fermentationsmedium war FM2tet Medium (siehe 3. Beispiel, Medium ohne Tetracyclin für den K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm) . 1,35 1 des Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die
Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüt- telkolbenanzucht in Baten-Fermentationsmedium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,0.
In regelmässigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnom- men zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Mass der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) .
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrif giert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt wurde bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben. Der 2 , 3 -BDL-Gehalt wurde durch NMR bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben. Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa.
Watson Marlow) eine 74 % (w/v) Glucoselösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt.
Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige 2 , 3 -BDL-Bildung im K. terri- gena Kontrollstamm und in den Acetolactatsynthase überproduzierenden, rekombinanten Klebsiella terrigena Stämmen. Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4.
Beispiel) , führt die Überexpression der Acetolactatsynthase mit den Expressionsplasmiden pAC-BudBkt und pALSbl-tet zu einer signifikanten Steigerung der 2 , 3 -Butandiolproduktion um 25 - 30 %, bezogen auf die Maximalausbeute bei 72 h Fermentationsdauer. überraschenderweise wurde durch die starke Überexpression der Acetolactatsynthase mit dem Plasmid pBudBkt-tet dagegen eine Hemmung der 2,3-BDL Produktion beobachtet. Dies bedeutet, dass die 2,3-BDL Ausbeute in der Fermentation durch Erhöhung der Acetolactatsynthase Aktivität gesteigert werden kann. Eine zu hohe Aktivität der Acetolactatsynthase führt jedoch unerwarteterweise zu einer Erniedrigung der 2,3-BDL Ausbeute. Die Pro- duktionsverläufe sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Produktion von 2,3-BDL in K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
6. Beispiel: 2,3-BDL Fermentation im 330 1 Maßstab Fermentiert wurde der Stamm Klebsiella terrigena-pALSbl-tet (siehe 4. und 5. Beispiel) .
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter : Ein Inokulum von Klebsiella terrigena-pALSbl- tet in LBtet Medium (siehe 2. Beispiel} wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, jeweils in einem 1 1 Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte ODSOo/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel}. Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 x 8 1 FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermenta- tionstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff- partialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm} . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 {20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte ODeoo/ml von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwen- det .
Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentations- temperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH40H, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (siehe 4. Beispiel, bezogen auf das Anfangsvolumen) . Der Sauerstoff artialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff artial™ druckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit {Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Glucoseverbrauch durch off-line Glucose- Messung mit einem Glucose-Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 4. Beispiel) . Sobald die Glukosekonzentration der Fermenta- tionsansätse ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feedlösung gestar- tet . Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glukosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1. Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 5. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 4 dargestellt .
Tabelle 4
Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Massstab

Claims

Patentansprüche :
1. Produktionsstamm zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol herstellbar aus einem Ausgangestamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm eine 2 bis 68 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetolactatsynthase Aktivität aufweist .
2. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er eine um den Faktor 3 bis 64, bevorzugt um den Faktor 3 bis 30, besonders bevorzugt um den Faktor 4 bis 20 erhöhte Acetolactatsynthase Aktivität aufweist.
3. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetolactatsynthase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines für das Acetolactatsynthaseenzym kodierenden Gens erreicht wird.
4. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella (Raoultella) , Bacillus (Paenibacillus) oder Lactobacillus handelt, wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis bevorzugt ist und ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola besonders bevorzugt ist und es sich insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Sicherheitsstufe Sl handelt .
5. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gen der Acetolactatsynthase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus stammmt .
6. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem nicht gentech- nisch optimierten Ausgangsstamm hergestellt wurde und eine Acetolactatsynthase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 25 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2,3- Butandiol Ausbeute des AusgangsStammes mindestens 90 g/1 beträgt .
Verfahren zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol , dadurch ge kennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen grösser als 300 1 erfolgt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE102013204728A1 (de) 2013-03-18 2014-09-18 Wacker Chemie Ag Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern
DE102013205986A1 (de) 2013-04-04 2014-10-23 Wacker Chemie Ag Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern
DE102013216658A1 (de) 2013-08-22 2015-02-26 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme
CN103497917B (zh) * 2013-10-11 2016-02-24 山东大学 一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌
DE102013223176A1 (de) 2013-11-14 2015-05-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme
DE102013224909A1 (de) 2013-12-04 2015-06-11 Wacker Chemie Ag Verfahren zur Isolierung von 2,3-Butandiol aus Fermentationsansätzen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8206970B2 (en) * 2006-05-02 2012-06-26 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of 2-butanol and 2-butanone employing aminobutanol phosphate phospholyase
BRPI0909989A2 (pt) * 2008-06-05 2021-06-22 Butamax Advanced Biofuels Llc célula de levedura recombinante e método para a produção de um produto
US8455224B2 (en) * 2008-09-29 2013-06-04 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria
DE102010001399A1 (de) 2010-01-29 2011-08-04 Wacker Chemie AG, 81737 Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren mit 1-3 Kohlenstoff-atomen aus nachwachsenden Rohstoffen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2012104243A1 *

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