EP3145948B1 - Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes - Google Patents

Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes Download PDF

Info

Publication number
EP3145948B1
EP3145948B1 EP15732775.0A EP15732775A EP3145948B1 EP 3145948 B1 EP3145948 B1 EP 3145948B1 EP 15732775 A EP15732775 A EP 15732775A EP 3145948 B1 EP3145948 B1 EP 3145948B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amb
plant cell
pectate lyase
plant
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
EP15732775.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP3145948A1 (fr
Inventor
Véronique GOMORD
Anne-Catherine FITCHETTE
Virginie CATALA
Loïc FAYE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Angany Inc
Original Assignee
Angany Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Angany Inc filed Critical Angany Inc
Publication of EP3145948A1 publication Critical patent/EP3145948A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP3145948B1 publication Critical patent/EP3145948B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/55—Vectors comprising a special origin of replication system from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a plant cell comprising a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase chosen from Amb a 1, the alpha subunit of Amb a 1, the sub -beta unit of Amb a 1, and the homologs of Amb a 1, operably linked to a strong promoter, said DNA molecule not being integrated into the genome of the plant cell.
  • the invention also relates to a process for the production of pectate lyase using the plant cell.
  • Ragweed in particular Ambrosia artemisiifolia, is an annual plant, which belongs to the family of tubuliflorous compounds (or Asteraceae). This wild plant, native to North America, flowers from the end of summer until autumn. Its pollen has a very high allergenic power. Thus, ragweed is the leading cause of pollen allergy in the United States, with approximately 30 million people out of 40 million suffering from pollinosis. Unintentionally introduced into France in the 19th century, ragweed is a highly invasive plant which quickly progressed from the Rhône- Switzerland region to the north of France. Thus, in 2011, ragweeds were found in the Ile de France.
  • the pollen of this plant causes in sensitive people an allergic reaction characterized by its severity. Overall, rhinitis allergic to ragweed is much more severe than that caused by other pollens. Symptoms such as pruritus, anosmia (loss or reduced sensitivity to odors), rhinorrhea, sneezing and nasal obstruction are more prominent. In addition, in 50% of cases, this allergy develops into asthma, often more severe than that caused by other pollens. These symptoms are all the more pronounced the higher the pollen level in the air.
  • symptomatic treatments either locally (drops, eye drops, sprays), or generally (tablets, capsules), relieve symptoms during the period when pollens are present in the air. But the symptoms return quickly as soon as the treatment is stopped.
  • allergen immunotherapy or desensitization
  • This therapeutic route makes it possible to treat the cause of the allergy unlike so-called "symptomatic” drugs.
  • the extracts used today for the desensitization of patients allergic to ragweed are of insufficient quality for this treatment to be effective.
  • ragweed allergens have been characterized, in particular Amb a 1 which is responsible for more than 80% of cases of ragweed allergy.
  • Amb a 1 is a complex plant protein with typically plant post-translational maturation, and only a plant expression system will be able to produce this allergen in a form which can be used and is effective in allergen immunotherapy.
  • the inventors have now discovered that the production of the allergen Amb a 1, although toxic in vivo, in recombinant form is possible, by transient expression in plants.
  • This production which takes place in a plant cell, allows the allergen Amb a 1 to be obtained in mature and active form, with good yield, in a very simple and reproducible manner.
  • the allergen Amb a 1 obtained is not contaminated by proteases and / or other contaminants of plant origin. The inventors were thus able to obtain production, at commercially acceptable levels, of the allergen Amb a 1.
  • the subject of the invention is therefore a plant cell comprising a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase chosen from Amb a 1, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1, and the homologs of Amb a 1, operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter.
  • said plant cell is a Nicotiana benthamiana cell .
  • the plant cell according to the invention comprises a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a pectate lyase preproprotein operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter, said molecule of DNA not being integrated into the genome of the plant cell.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter
  • pectate lyase chosen from Amb a 1, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1, and the homologs of Amb a 1 is called “pectate lyase according to the invention” in this application.
  • the invention also relates to a plant comprising at least one plant cell according to the invention.
  • Another object of the invention is to provide a process for the production of a pectate lyase, comprising the expression of said pectate lyase in a plant cell according to the invention, or in a plant comprising such a cell.
  • a pectate lyase capable of being obtained by the method according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention can be used as a medicament. It can also be used in allergic immunotherapy, alone or in combination with at least one other allergen of Asteraceae. It can also be used in the diagnosis of allergies, and be integrated into an allergy diagnostic kit.
  • the plant cell according to the invention comprises a DNA molecule operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter.
  • operably linked is meant that the DNA molecule is fused with the strong promoter, so that the strong promoter induces transcription of the DNA molecule.
  • transient expression allows the expression of said DNA molecule in transient form, ie without integration of DNA, in particular cDNA, into the genome of the plant cell.
  • the use of the transient expression in a plant cell or a plant according to the invention makes it possible to increase the production yields of the pectate lyase according to the invention in active form up to high levels, compatible with commercial exploitation, but incompatible with the survival of a plant which would express these toxic pectate lyases in a stable manner.
  • the harvesting of the plant biomass takes place during the peak of expression of the recombinant protein, ie typically 4 to 6 days after the transfection.
  • the plant cell according to the invention comprises an expression vector comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase according to the invention operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter .
  • Amb a 1 is a pectate lyase from Ambrosia artemisiifolia. Recognized by more than 80% of patients sensitized to ragweed, this allergen is responsible for more than 90% of the allergenic activity of ragweed pollen. It is a 38 kDa protein described as non-glycosylated belonging to the family of pectate lyases. Twelve isoforms of Amb to 1 are listed, from Amb to 1.0101 to Amb to 1.0502 (according to the site www.allergome.org).
  • the nucleic acid and amino acid sequences of the twelve isoforms are detailed in Table 1 below: ⁇ i> Table 1: the twelve isoforms of Amb a 1, their nucleic and protein sequences ⁇ /i> isoallergens Accession number (GenBank) Nucleic sequence Accession number (UniProt) Amino acid sequence Amb a 1.0101 M80558 P27759 Amb to 1.0201 M62981 P27760 Amb to 1.0202 FR669658 E1XUL3 Amb a 1.0301 M62961 P27761 Amb a 1.0302 P27761 (variant L48Y) Amb a 1.0303 M80560 P27761 (variant H392R) Amb a 1.0304 FR669659 E1XUL4 Amb a 1.0305 FR669660 E1XUL5 Amb a 1.0401 M80562 P28744 Amb a 1.0402 FR669664 E1XUL9 Amb
  • Amb a 1 according to the invention is meant the twelve isoforms mentioned above in Table 1 above.
  • the protein sequences described in this table 1 correspond to the preproproteins of the various isoforms.
  • Amb a 1 undergoes proteolysis in the pollen grain and / or during the extraction or purification process resulting in two chains, alpha (26 kDa) and beta (12 kDa), associated in a non-covalent manner (King et al , 1974, 1981).
  • the alpha and beta substrings of Amb a 1 have a different reactivity on IgE and T lymphocytes.
  • Amb a 1 beta contains a significant number of epitopes fixing IgE, while Amb a 1 alpha behaves as a hypoallergenic and stimulates T cell activity
  • Amb a 1 has the protein sequence SEQ ID NO: 7 (preproprotein).
  • the beta subunit has the protein sequence SEQ ID NO: 8.
  • the alpha subunit has the protein sequence SEQ ID NO: 9.
  • Amb a 1 homologs proteins from the Asteraceae family which have at least 57% identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb a 1.
  • the homolog of Amb a 1 is a plant protein of the genus Ambrosia or Artemisia, more preferably Artemisia vulgaris, Ambrosia psilostachya or Ambrosia trifida, which has at least 57% identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb a 1.
  • the homolog of Amb a 1 is chosen from Amb p 1 (from Ambrosia psilostachya, with accession code 9064 on www.allergome.org) and Art v 6 (from Artemisia vulgaris, with accession number A0PJ16 in Uniprot).
  • percentage of identity between two amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • best alignment or “optimal alignment” is meant the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest.
  • Sequence comparisons between two amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity. .
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, in addition to manually, by means of the local homology algorithm. Smith and Waterman (1981, J.
  • the pectate lyase according to the invention is chosen from Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401 , Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1 and the proteins of the Asteraceae family which have at least 57% of identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb a 1.
  • the pectate lyase according to the invention is chosen from Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1 and the proteins of Artemisia vulgaris, Ambrosia psilostachya or Ambrosia trifida, which have at least 57% identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb a 1.
  • the DNA molecule comprises at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of pectate lyase according to the invention.
  • the pectate lyase preproprotein according to the invention comprises a signal peptide, a propeptide and mature pectate lyase.
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein according to the invention therefore comprises a sequence encoding the signal peptide, a sequence encoding the propeptide and a sequence encoding the mature pectate lyase.
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein according to the invention comprises a sequence encoding the signal peptide, a sequence encoding the propeptide of the subunit beta, a sequence encoding the beta subunit, a sequence encoding the propeptide of the alpha subunit and a sequence encoding the alpha subunit.
  • the signal peptide is in particular any signal peptide recognized by the plant cell, whether or not originating from a pectate lyase. It targets in particular the pectate lyase according to the invention in the intercellular medium.
  • the signal peptide is that of tobacco chitinase, or the natural signal peptide of pectate lyase.
  • the propeptide is, for its part, the natural propeptide of a pectate lyase, or else the propeptide of a C1A peptidase.
  • the propeptide is a propeptide of C1A peptidases, in particular of mites or of plant origin.
  • the peptidase propeptide C1A is the natural propeptide or the mutated or not propeptide of Der p1.
  • the peptidase propeptide C1A is chosen from the natural peptidase propeptide C1A and the sequence SEQ ID NO: 6 (ie amino acids 19 to 98 of the Uniprot sequence p08176).
  • the pectate lyase according to the invention is produced in fusion with its own propeptide or in fusion with the propeptide of peptidase C1A of mites or in fusion with a propeptide of peptidase C1A vegetable, in order increase protein production yields.
  • the sequence of the pectate lyase preproprotein is chosen from the protein sequences listed in Table 1 above and the sequences having at least 57%, preferably at least 60%, preferably at least 64% identity with one of these.
  • the heterologous nucleotide sequence coding for the preproprotein is chosen from SEQ ID NO: 1 to 5.
  • its sequence is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein can be obtained from a known gene already cloned encoding a pectate lyase according to the invention, or else by screening a cDNA library with anti- pectate lyase.
  • the methods used are well known to those skilled in the art, and include in particular the identification of the gene by hybridization with probes, PCR, sequencing and molecular cloning. It is also possible to synthesize the gene to reflect the use of preferred codons in plants; in this case, we speak of codon optimization, often useful for strong expression of selected proteases ( Murray et al, Nucleic Acid Res. 17: 477 498 (1980 )).
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein further comprises a sequence, called an intracellular addressing sequence.
  • This sequence makes it possible to target a pectate lyase storage compartment according to the invention, in order to control its maturation. This maturation is necessary to obtain pectate lyases in the form most suitable for the diagnosis of allergy and immunotherapy.
  • this peptide addressing sequence targets the pectate lyase according to the invention in soluble or membrane form towards the endoplasmic reticulum or the various compartments constituting the endomembrane secretory system of the plant cell.
  • the promoters used to control the expression of pectate lysis are strong promoters, and can be promoters of plant genes, such as, for example, the ubiquitin promoter, the promoter of the small ribulose subunit. -1, 5-bis-phosphate carboxylase, Agrobacterium tumefaciens promoters, nopaline synthase and octopine synthase promoters, or viral promoters such as cauliflower mosaic virus 19S and 35S (CaMV).
  • the strong promoter is 35S.
  • the pectate lyase according to the invention is typically expressed in an amount equal to at least 0.1% of the total soluble proteins of the plant, but often in a much higher amount, which can reach 5 to 10%.
  • the plant comprising the plant cells according to the invention can be a whole plant, but can also be a part of a plant, such as leaves.
  • the plant or plant cells according to the invention can be used as such, as a medicament.
  • the plant or plant cells according to the invention can be used as such, for applications as biofuel, in animal nutrition, or also in the production of paper or textile (cotton fibers in particular).
  • the recombinant pectate lyase is purified after extraction from the plant or plant cells which express it.
  • the enzyme may be expressed in fusion with tags (His6, GST, MBP, FLAG, etc.) which will be preferably located in the N- or C-terminal position of the mature protein.
  • the pectate lyase capable of being obtained by the process according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention, can be used as a medicament. It can also be used in allergic immunotherapy, alone or in combination with at least one other allergen of Asteraceae. This other Asteracea allergen can be chosen from Amb a 11, Amb a 5 and their mixtures. It can also be used in the diagnosis of allergies, especially pollen allergies.
  • the present description therefore also discloses an allergy diagnostic kit, comprising the pectate lyase capable of being obtained by the method according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention, and means for measuring the antibodies directed against this protein.
  • an allergy diagnostic kit comprising pectate lyase capable of being obtained by the method according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention, means for measuring antibodies directed against this protein, and means for measuring antibodies directed against another allergen of Asteraceae, for example the allergen Amb a 11 or Amb a 5.
  • the cDNAs are synthesized in native form, by optimizing the use of codons for their recognition by the plant system or by harmonizing the use of codons (reintroduction of rare codons to rhythm the synthesis of the protein).
  • the preferred optimization is the optimization for an expression in Nicotiana benthamiana, as indicated in Figure 1 .
  • Restriction sites Xba I / kpn I and Sal I / Sac I are respectively integrated at the 5 ′ and 3 ′ ends of the cDNA during the synthesis. These sites are then used in order to clone the cDNAs in the binary expression vector pAG01 ( Figure 1 ).
  • the cDNAs are cloned upstream of a 35S (35S) promoter and downstream of a nopaline synthase (Tnos) termination sequence; the vector pAG01 also contains an expression cassette making it possible to express the silencing inhibitor p19 simultaneously with the recombinant protein in order to increase the production yields.
  • the vectors are then used to transform the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens.
  • Agobacterium tumefaciens LBA4404 is used for the transfer of a cDNA encoding pectate lyase without the gene of interest being integrated into the genome of the plant cell: we are talking here about transfection and not transgenesis.
  • the plants are grown in hydroponic conditions in the presence of a nutrient medium (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, 10mL / 15mL / 5mL for 10 L of reverse osmosis water) and under LED lighting.
  • GHE nutrient medium
  • the agrobacterium is transferred into the leaf tissue by agro-infiltration according to two processes.
  • the agrobacteria are injected manually using a syringe applied against the epidermis of the underside of the leaf.
  • Leaf discs taken from the leaves 4 to 6 days after agro-infiltration are used for the analysis of the different prototypes of pectate lyases. This screening step makes it possible to define the expression vector which will be used to obtain a pectate lyase of optimal quality.
  • the expressed proteins are active. Indeed, the expression of Amb a 1 causes significant necrosis from the 4 th day of expression compared to control plants. These necroses are due to a strong pectate lyase activity (Liu et al, 2010).
  • the pectates lyases are extracted from fresh or frozen biomass and then purified on an IMAC column (HisTrap Excell).
  • This purification allows the production of the precursor form (preproprotein) and the alpha subunit.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

  • La présente invention se rapporte à une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, ladite molécule d'ADN n'étant pas intégrée dans le génome de la cellule végétale. L'invention se rapporte également un procédé de production de la pectate lyase utilisant la cellule végétale.
  • L'ambroisie, en particulier Ambrosia artemisiifolia, est une plante annuelle, qui appartient à la famille des Composées tubuliflores (ou Astéracées). Cette plante sauvage, originaire d'Amérique du nord, fleurit de la fin de l'été jusqu'à l'automne. Son pollen a un pouvoir allergénique très élevé. Ainsi, l'ambroisie est la première cause d'allergie pollinique aux Etats-Unis, avec environ 30 millions de personnes sur 40 millions souffrant de pollinoses. Introduite involontairement en France au XIXème siècle, l'ambroisie est une plante fortement invasive qui a rapidement progressé à partir de la région Rhône-Alpes vers le nord de la France. Ainsi, en 2011, des pieds d'ambroisie ont été retrouvés dans l'Ile de France.
  • Le pollen de cette plante provoque chez les personnes sensibles une réaction allergique caractérisée par sa sévérité. Globalement, la rhinite allergique à l'ambroisie est beaucoup plus sévère que celle causée par d'autres pollens. Les symptômes tels que prurit, anosmie (perte ou diminution de la sensibilité aux odeurs), rhinorrhée, éternuements et obstruction nasale sont plus importants. De plus, dans 50% des cas, cette allergie évolue en un asthme, souvent plus sévère que celui provoqué par d'autres pollens. Ces symptômes sont d'autant plus prononcés que le taux de pollen dans l'air est élevé.
  • Dans la région Rhône-Alpes, l'allergie à l'ambroisie touche aujourd'hui 6 à 12% de la population entre fin août et début septembre. Ainsi, pour cette seule région, le nombre total de consommateurs de médicaments antiallergiques à l'ambroisie a fortement augmenté (+60%) entre 2008 et 2011, passant de 161 200 à 258 700 personnes, et les dépenses de santé engendrées par cette allergie représentent entre 5,6 et 8,6 millions d'euros. L'allergie à l'ambroisie représente donc aujourd'hui un véritable problème de santé publique. Le plus simple pour se protéger des risques d'allergie serait d'éviter les expositions au pollen d'ambroisie, mais une éviction totale semble d'ores et déjà impossible malgré des arrêtés préfectoraux rendant obligatoire la destruction de l'ambroisie. Ces mesures n'ont pas permis d'enrayer la propagation de cette plante invasive dans un grand nombre de régions.
  • Les traitements dits « symptomatiques » soit par voie locale (gouttes, collyres, sprays), soit par voie générale (comprimés, gélules), permettent de soulager les symptômes pendant la période où les pollens sont présents dans l'air. Mais les symptômes reviennent rapidement dès l'arrêt du traitement. A l'inverse des traitements "symptomatiques", l'immunothérapie allergénique (ou désensibilisation) est le seul traitement susceptible de modifier l'évolution de la maladie allergique. Cette voie thérapeutique permet de traiter la cause de l'allergie contrairement aux médicaments dits « symptomatiques ». Toutefois, comme pour les autres allergies, les extraits utilisés aujourd'hui pour la désensibilisation des patients allergiques à l'ambroisie sont d'une qualité insuffisante pour que ce traitement soit efficace. Plusieurs allergènes d'ambroisie ont été caractérisés, en particulier Amb a 1 qui est responsable de plus de 80% des cas d'allergie à l'ambroisie. Différentes tentatives de production d'un Amb a 1 recombinant destiné à une désensibilisation spécifique ont échoué. En effet, Amb a 1 est une protéine végétale complexe présentant des maturations post-traductionelles typiquement végétales, et seul un système d'expression végétale sera capable de produire cet allergène sous une forme utilisable et efficace en immunothérapie allergénique.
  • Il existe donc un besoin pour produire cet allergène Amb a 1 sous forme recombinante, avec une bonne qualité, et de façon reproductible et efficace (avec un bon rendement). Par « bonne qualité », on entend que l'allergène est très fortement similaire, dans sa séquence et sa structure, à l'allergène présent naturellement dans l'ambroisie. Il existe également un besoin pour produire cet allergène à des niveaux commercialement et économiquement acceptables.
  • De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant découvert que la production de l'allergène Amb a 1, bien que toxique in vivo, sous forme recombinante est possible, par expression transitoire chez les plantes. Cette production, qui se fait dans une cellule végétale, permet l'obtention de l'allergène Amb a 1 sous forme mature et active, avec un bon rendement, de façon très simple et reproductible. En outre, l'allergène Amb a 1 obtenu n'est pas contaminé par des protéases et/ou d'autres contaminants d'origine végétale. Les inventeurs ont ainsi pu obtenir une production, à des niveaux commercialement acceptables, de l'allergène Amb a 1.
  • L'invention a donc pour objet une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. La molécule d'ADN liée au promoteur fort permet d'exprimer de façon transitoire la pectate lyase mature et active dans la cellule. De préférence, ladite cellule végétale est une cellule de Nicotiana benthamiana. De préférence, la cellule végétale selon l'invention comprend une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine de la pectate lyase liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S, ladite molécule d'ADN n'étant pas intégrée dans le génome de la cellule végétale.
  • La pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1 est appelée « pectate lyase selon l'invention » dans la présente demande.
  • L'invention a également pour objet une plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'invention.
    Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de production d'une pectate lyase, comprenant l'expression de ladite pectate lyase dans une cellule végétale selon l'invention, ou dans une plante comprenant une telle cellule.
    Une pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée en immunothérapie allergique, seule ou en combinaison avec au moins un autre allergène d'Asteracée. Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, et être intégrée dans un kit de diagnostic d'allergies.
  • La cellule végétale selon l'invention comprend une molécule d'ADN liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. Par « lié de manière fonctionnelle », on entend que la molécule d'ADN est fusionnée avec le promoteur fort, de telle sorte que le promoteur fort induise la transcription de la molécule d'ADN.
  • Cela permet l'expression de ladite molécule d'ADN sous forme transitoire, i.e. sans intégration de l'ADN, notamment l'ADNc, dans le génome de la cellule végétale. En effet, l'utilisation de l'expression transitoire dans une cellule végétale ou une plante selon l'invention permet d'augmenter les rendements de production de la pectate lyase selon l'invention sous forme active jusqu'à des niveaux élevés, compatibles avec une exploitation commerciale, mais incompatibles avec la survie d'une plante qui exprimerait ces pectates lyases toxiques de façon stable. Dans le cas d'une expression transitoire, la récolte de la biomasse végétale a lieu lors du pic d'expression de la protéine recombinante, i.e. typiquement 4 à 6 jours après la transfection.
    De préférence, la cellule végétale selon l'invention comprend un vecteur d'expression comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S.
  • Amb a 1 est une pectate lyase provenant d'Ambrosia artemisiifolia. Reconnu par plus de 80 % des patients sensibilisés à l'ambroisie, cet allergène est responsable de plus de 90 % de l'activité allergénique du pollen d'ambroisie. C'est une protéine de 38 kDa décrite comme non glycosylée appartenant à la famille des pectates lyases. Douze isoformes de Amb a 1 sont recensées, de Amb a 1.0101 à Amb a 1.0502 (d'après le site www.allergome.org).
    Les séquences nucléique et d'acides aminés des douze isoformes sont détaillées dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : les douze isoformes d'Amb a 1, leurs séquences nucléiques et protéiques
    Isoallergènes N° d'accession (GenBank) Séquence nucléique N° d'accession (UniProt) Séquence d'acides aminés
    Amb a 1.0101 M80558 P27759
    Amb a 1.0201 M62981 P27760
    Amb a 1.0202 FR669658 E1XUL3
    Amb a 1.0301 M62961 P27761
    Amb a 1.0302 P27761 (variant L48Y)
    Amb a 1.0303 M80560 P27761 (variant H392R)
    Amb a 1.0304 FR669659 E1XUL4
    Amb a 1.0305 FR669660 E1XUL5
    Amb a 1.0401 M80562 P28744
    Amb a 1.0402 FR669664 E1XUL9
    Amb a 1.0501 M80561 P27762
    Amb a 1.0502 FR669666 E1XUM1
  • Par « Amb a 1 » selon l'invention, on entend les douze isoformes précitées dans le tableau 1 ci-dessus. Les séquences protéiques décrites dans ce tableau 1 correspondent aux préproprotéines des différentes isoformes.
  • Amb a 1 subit une protéolyse dans le grain de pollen et/ou au cours du processus d'extraction ou de purification résultant en deux chaînes, alpha (26 kDa) et bêta (12 kDa), associées de façon non covalente (King et al, 1974, 1981). Il a été démontré que des modifications chimiques d'Amb a 1, y compris la réduction et l'alkylation des ponts disulfures ainsi que le processus de dénaturation/renaturation par l'urée ou la succinylation des résidus lysine, réduit sa réactivité vis-à-vis des IgE (King, 1976; Smith et al, 1988). Les sous-chaînes alpha et bêta d'Amb a 1 ont une réactivité différente sur les IgE et les lymphocytes T. En effet, Amb a 1 bêta contient un nombre important d'épitopes fixant les IgE, tandis que Amb a 1 alpha se comporte comme un hypoallergène et stimule l'activité des cellules T.
  • De préférence, Amb a 1 a pour séquence protéique SEQ ID NO :7 (préproprotéine). De préférence, la sous-unité bêta a pour séquence protéique SEQ ID NO :8. De préférence, la sous-unité alpha a pour séquence protéique SEQ ID NO :9.
  • Par « homologues d'Amb a 1 », on entend des protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1. De préférence, l'homologue d'Amb a 1 est une protéine de plante du genre Ambrosia ou Artemisia, plus préférentiellement d'Artemisia vulgaris, d'Ambrosia psilostachya ou d'Ambrosia trifida, qui présente au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1. De préférence, l'homologue d'Amb a 1 est choisi parmi Amb p 1 (provenant d'Ambrosia psilostachya, de code d'accession 9064 sur www.allergome.org) et Art v 6 (provenant d'Artemisia vulgaris, de numéro d'accession A0PJ16 dans Uniprot).
  • Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé.
  • Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • Ainsi, de préférence, la pectate lyase selon l'invention est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
    Plus préférentiellement, la pectate lyase selon l'invention est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines d'Artemisia vulgaris, d'Ambrosia psilostachya ou d'Ambrosia trifida, qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
  • La molécule d'ADN comprend au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine de la pectate lyase selon l'invention.
    La préproprotéine de la pectate lyase selon l'invention comprend un peptide signal, un propeptide et la pectate lyase mature. La séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend donc une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide et une séquence codant la pectate lyase mature. De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide de la sous-unité bêta, une séquence codant la sous-unité bêta, une séquence codant le propeptide de la sous-unité alpha et une séquence codant la sous-unité alpha.
    Le peptide signal est notamment tout peptide signal reconnu par la cellule végétale, provenant ou non d'une pectate lyase. Il cible notamment la pectate lyase selon l'invention dans le milieu intercellulaire. De préférence, le peptide signal est celui de la chitinase de tabac, ou le peptide signal naturel de la pectate lyase.
    Le propeptide est, quant à lui, le propeptide naturel d'une pectate lyase, ou bien le propeptide d'une peptidase C1A. Dans un mode de réalisation préféré, le propeptide est un propeptide de peptidases C1A, notamment d'acariens ou d'origine végétale. De préférence, le propeptide de peptidase C1A est le propeptide naturel ou le propeptide muté ou non de Der p1. De préférence, le propeptide de peptidase C1A est choisi parmi le propeptide naturel de peptidase C1A et la séquence SEQ ID NO :6 (i.e. les acides aminés 19 à 98 de la séquence Uniprot p08176). Dans un mode de réalisation préférée de la présente invention, la pectate lyase selon l'invention est produite en fusion avec son propre propeptide ou en fusion avec le propeptide de peptidase C1A d'acariens ou en fusion avec un propeptide de peptidase C1A végétale, afin d'augmenter les rendements de production de la protéine.
  • De préférence, la séquence de la préproprotéine de pectate lyase est choisie parmi les séquences protéiques listées dans le tableau 1 ci-avant et les séquences présentant au moins 57%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 64% d'identité avec l'une de ces dernières.
  • De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine est choisie parmi SEQ ID NO :1 à 5. De préférence, elle a pour séquence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 ou SEQ ID NO :5.
  • Selon l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine peut être obtenue à partir d'un gène connu déjà cloné codant pour une pectate lyase selon l'invention, ou bien par criblage d'une banque d'ADNc avec des anticorps anti-pectate lyase. Les méthodes utilisées sont bien connues de l'homme de l'art, et incluent notamment l'identification du gène par hybridation avec des sondes, PCR, séquençage et clonage moléculaire. Il est également possible de synthétiser le gène pour refléter l'utilisation des codons préférés chez les plantes ; dans ce cas, on parle d'optimisation de codons, souvent utile pour une forte expression des protéases sélectionnées (Murray et al, Nucleic Acid Res. 17:477 498 (1980)).
  • Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine comprend en outre une séquence, appelée séquence d'adressage intracellulaire. Cette séquence permet de cibler un compartiment de stockage de la pectate lyase selon l'invention, afin de contrôler sa maturation. Cette maturation est nécessaire pour l'obtention des pectates lyases sous la forme la plus adaptée pour le diagnostic d'allergie et l'immunothérapie. De préférence, cette séquence peptidique d'adressage cible la pectate lyase selon l'invention sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale.
  • Une fois que le gène d'intérêt a été isolé et modifié pour contenir tout ou partie des modifications décrites ci-dessus et obtenir la séquence nucléotidique hétérologue, cette dernière est placée dans un vecteur d'expression par des méthodes classiques. La sélection d'un vecteur d'expression approprié dépendra de la méthode d'introduction du vecteur d'expression dans des cellules hôtes. Un vecteur d'expression typique contient des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique à fournir pour la croissance et la sélection du vecteur d'expression dans l'hôte bactérien, un site de clonage pour l'insertion d'une séquence d'ADN exogène codant pour la pectate lyase; des éléments d'ADN eucaryotes comme une séquence d'initiation de la transcription du gène exogène, comme un promoteur, et des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation et une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing. Il contient également des séquences telles que des t-DNA qui sont nécessaires pour l'intégration d'un morceau d'ADN dans la plante ou dans la cellule végétale.
    De préférence, le vecteur d'expression comprend :
    • des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
    • au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S ;
    • une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence p19 ; et
    • des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos (séquence de terminaison de la nopaline synthase).
    De préférence, le vecteur d'expression est pAG01.
  • Les promoteurs utilisés pour contrôler l'expression de la pectate lyse sont des promoteurs forts, et peuvent être des promoteurs de gènes de plantes, tels que par exemple, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1, 5-bis-phosphate carboxylase, des promoteurs d'Agrobacterium tumefaciens, les promoteurs de la nopaline-synthase et de l'octopine synthase, ou encore des promoteurs viraux comme les 19S et 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV). De préférence, le promoteur fort est le 35S.
  • L'expression élevée et la qualité des pectates lyases recombinantes produites dans l'invention permettent de concevoir leur production commerciale. En effet, la pectate lyase selon l'invention est typiquement exprimée en une quantité égale à au moins 0,1 % des protéines solubles totales de la plante, mais souvent en une quantité beaucoup plus élevée, pouvant atteindre 5 à 10%.
  • La plante comprenant les cellules végétales selon l'invention peut être une plante entière, mais peut également être une partie de plante, telle que des feuilles.
  • La plante ou les cellules végétales selon l'invention peuvent être utilisées en tant que telles, comme médicament.
    La plante ou les cellules végétales selon l'invention peuvent être utilisées en tant que telles, pour des applications comme biocarburant, dans la nutrition animale, ou encore dans la production de papier ou de textile (fibres de coton notamment).
    Dans d'autres applications, la pectate lyase recombinante est purifiée après extraction à partir de la plante ou des cellules végétales qui l'expriment. Afin de faciliter sa purification, l'enzyme pourra être exprimée en fusion avec des tags (His6, GST, MBP, FLAG etc..) qui seront localisés de préférence en position N- ou C-terminale de la protéine mature.
  • La pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention, peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée en immunothérapie allergique, seule ou en combinaison avec au moins un autre allergène d'Asteracée. Cet autre allergène d'Asteracée peut être choisi parmi Amb a 11, Amb a 5 et leurs mélanges.
    Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, notamment d'allergies aux pollens. La présente description divulgue donc également un kit de diagnostic d'allergies, comprenant la pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention, et des moyens de mesure des anticorps dirigés contre cette protéine. Est également décrit un kit de diagnostic d'allergies, comprenant la pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention, des moyens de mesure des anticorps dirigés contre cette protéine, et des moyens de mesure des anticorps dirigés contre un autre allergène d'Asteracée, par exemple l'allergène Amb a 11 ou Amb a 5.
  • Les méthodes générales de culture de plantes, ainsi que les procédés pour introduire des vecteurs d'expression dans un tissu végétal, sont à la disposition de l'homme de l'art. Ils sont variés et dépendent de la plante sélectionnée. De préférence, les plantes seront cultivées selon les techniques propres à la plateforme Allergopur. Ce procédé de production de protéines recombinantes est décrit dans la demande FR1255510 , et comprend une première étape de culture de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, de préférence culture sur flotteur libre, et sous éclairage LEDs. Après cette première étape, notamment cinq semaines de culture en hydroponie sur des flotteurs libres, l'agroinfiltration des plantes est réalisée sous vide, par des agrobactéries comprenant un fragment d'ADN codant pour la pectate lyase selon l'invention. Cette étape d'agroinfiltration peut être mise en œuvre par tout moyen permettant de faire le vide. De préférence, dans le procédé utilisé selon l'invention, elle est réalisée sous vide par effet Venturi. Parmi les agrobactéries utilisables selon l'invention, on peut citer de préférence, les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 ou C58. Selon une première alternative, une fois l'étape d'agroinfiltration réalisée, les plantes sont typiquement égouttées tête en bas pendant 15 minutes, puis remises en culture, typiquement 3 à 6 jours, idéalement en assurant une brumisation fréquente de ces dernières pendant les 6 premières heures de culture qui suivent l'agroinfiltation. Enfin, la protéine est extraite et purifiée. De préférence, la protéine est extraite et purifiée comme décrit dans la demande FR1255510 . Selon une seconde alternative, une fois l'étape d'agroinfiltration réalisée, les plantes sont directement remises en culture, typiquement 3 à 6 jours, puis la protéine est extraite et purifiée.
    L'extraction de la protéine peut être effectuée par broyage des feuilles, ou encore selon un procédé faisant appel à une infiltration enzymatique.
    Dans un tel procédé faisant appel à une infiltration enzymatique, l'extraction de la protéine est effectuée par les étapes suivantes :
    • infiltration sous vide (notamment comme il a été décrit ci-dessus pour l'agroinfiltration) de la partie aérienne des plantes, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique. De préférence, la pectinase est la P162L commercialisée par Biocatalyst, formulée à 4% dans un milieu comprenant 50mM de citrate de sodium pH5.2, 0.5M NaCl et 0.04% métabisulfite. De préférence, la macérozyme est formulée à 0.5% dans un milieu comprenant 50mM de citrate de sodium pH5.2, 0.5M NaCl et 0.04% métabisulfite,prélèvement des feuilles des plantes infiltrées, et incubation dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, de préférence de 3h ou 4h30, à une température comprise entre 24°C et 30°C, de préférence 26°C, puis
    • mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante (i.e. environ 20-23°C) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
    • le digestat est ensuite filtré, de préférence sur une toile de 250µm, puis éventuellement centrifugé (par exemple à 250xg pendant 10 minutes),
    • le surnageant est récupéré afin d'effectuer une filtration en profondeur de préférence sur filtre K100 (commercialisé par Pall). De préférence, le filtrat est concentré 20 fois sur une cassette 5kDa et son pH est ajusté à 7 avec du Na3PO4.
    Les allergènes Amb a 1 et Amb a 11 peuvent être purifiés par chromatographie à partir des extraits comme il a été décrit dans la demande FR 1255510 .
  • Ainsi, de préférence, l'invention a également pour objet un procédé de production d'une pectate lyase dans une cellule végétale ou une plante, comprenant les étapes suivantes :
    1. a) transformation d'agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et
    2. b) transfection de la cellule végétale ou de la plante avec les agrobactéries obtenues à l'étape a).
  • De préférence, les agrobactéries utilisables dans l'étape a) sont choisies parmi les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 et C58. De préférence, le vecteur d'expression utilisé dans l'étape a) comprend :
    • des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
    • au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S ;
    • une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence p19 ; et
    • des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos.
    La transformation de l'étape a) se fait typiquement par des méthodes connues de l'art antérieur, par exemple par chocs thermiques avec passages successifs à 4°C, -80°C et 37°C.
  • La transfection de l'étape b) comprend de préférence les étapes suivantes :
    • b1) culture de la cellule végétale ou de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant cinq semaines en hydroponie sur des flotteurs libres,
    • b2) agroinfiltration de la cellule végétale ou plante obtenue en b1) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a). Cette étape d'agroinfiltration est, de préférence, réalisée sous vide par effet Venturi.
    • b3) remise en culture de la cellule végétale ou de la plante obtenue en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours.
  • Enfin, de préférence, la pectate lyase ainsi produite est extraite et purifiée.
    De préférence, le procédé de production d'une pectate lyase selon l'invention dans une cellule végétale ou une plante, comprend en outre une étape c) d'extraction de la pectate lyase produite, ladite étape c) comprenant les étapes suivantes :
    • infiltration sous vide de la cellule végétale ou des feuilles (i.e. partie aérienne) de la plante, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique. De préférence, la pectinase ou la macérozyme sont telles que décrites ci-avant,
    • prélèvement de la cellule végétale infiltrée ou des feuilles de la plante infiltrées et incubation, dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, à une température comprise entre 24°C et 30°C, puis
    • mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
    • filtration puis éventuellement centrifugation du digestat obtenu, et
    • récupération du surnageant.
  • Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles.
  • Les légendes des figures sont les suivantes :
    • Figure 1 : Représentation schématique des différentes cassettes permettant de produire une pectate lyase Amb a 1 mature et active (A, B, C, F et G) ou la sous-unité alpha (E et I) ou la sous-unité bêta (D et H), en utilisant soit le peptide signal et le propeptide naturel de la protéine (A-F), soit le peptide signal de la chitinase de tabac et un propeptide de la famille des peptidases C1A (G-I) afin d'augmenter les rendements.
      La pectate lyase est également produite sous forme mutée sur la lysine 180 (K180) afin de limiter la protéolyse permettant la production des sous-unités alpha et bêta (F).
      1. A (SEQ ID NO :1): ADNc codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 ,
      2. B (SEQ ID NO : 2): ADNc optimisé pour une utilisation chez N.benthamiana, codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 ,
      3. C (SEQ ID NO : 3): ADNc harmonisé codant pour la forme la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7). Cet ADNc contient des codons optimisés pour une utilisation chez N.benthamiana, mais comprend également des codons rares, afin de préserver le rythme de synthèse de la protéine pour une meilleure conservation de la structure 3D. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 ,
      4. D (SEQ ID NO : 4) : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité bêta (de séquence SEQ ID NO :8). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
      5. E (SEQ ID NO : 5) : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité alpha (de séquence SEQ ID NO :9). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
      6. F : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la forme mutée (K180) de la protéine. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
      7. G : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la forme mature de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der p1 (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
      8. H : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité bêta de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der p1 (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
      9. I : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité alpha de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der p1 (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265 .
    • Figure 2 : La plateforme AllergoPur utilisée pour l'expression et la production des différentes formes de pectate lyase selon l'invention.
    • Figure 3 : Expression de la protéine Amb a 1. Les protéines extraites de plantes transfectées par l'ADNc natif (F1-F3), par l'ADNc optimisé (F4-F6) ou par l'ADNc harmonisé (F7-F9) codant la protéine Amb a 1 ont été séparées par SDS-PAGE et analysées immmuno-détection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag. L'analyse par immuno-détection met en évidence la production spécifique de la protéine Amb a 1 et de la sous-unité alpha. La sous-unité bêta clivée n'est pas immunodétectée sur ce blot.
    • Figure 4 : Purification de l'allergène Amb a 1. Les protéines extraites de plantes ont été transfectées sous vide avec l'ADNc harmonisé codant la protéine Amb a 1 par chromatographie IMAC. Puis les fractions retenues sur la colonne ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE. Compte tenu de la position C-terminale du Flag, deux polypeptides correspondant à la forme précurseur (préproprotéine) (Amb a 1p) et à la sous-unité alpha sont purifiés à partir de l'extrait transfecté par l'ADNc complet (piste 3). Ces deux polypeptides (Amb a 1 alpha et Amb a 1p) sont ensuite séparés (pistes 4 et 5 respectivement) par chromatographie de tamisage moléculaire. Les deux polypeptides produits présentent une mobilité électrophorétique légèrement plus faible que les protéines natives. Cette différence s'explique par la présence du flag en position C-terminale.
    • Figure 5 : Expression de l'allergène Amb a 11. Les protéines extraites de 3 plantes (P1 - P3) transfectées par l'ADNc codant l'allergène Amb a 11 ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE. Les extraits protéiques sont analysés dès leur extraction (0H) ou après une incubation de 12h (12H) à température ambiante. L'incubation à température ambiante met en évidence l'accumulation de deux polypeptides correspondant à Amb a 11, ainsi que la dégradation quasi-totale des protéines de N.benthamiana. L'allergène Amb a 11 est donc produit sous forme active selon le même procédé que celui décrit présentement pour Amb a 1.
    EXEMPLE : Design moléculaire et synthèse de gène
  • Les ADNc sont synthétisés sous forme native, en optimisant l'usage des codons pour leur reconnaissance par le système végétal ou en harmonisant l'usage de codons (réintroduction de codons rares pour rythmer la synthèse de la protéine). Dans le cadre de cette invention, l'optimisation préférée est l'optimisation pour une expression chez Nicotiana benthamiana, comme indiqué en Figure 1.
    • Préparation des plasmides
  • Des sites de restriction Xba I/kpn I et Sal I/Sac I sont respectivement intégrés aux extrémités 5' et 3' de l'ADNc lors de la synthèse. Ces sites sont ensuite utilisés afin de cloner les ADNc dans le vecteur binaire d'expression pAG01 (Figure 1). Les ADNc sont clonés en amont d'un promoteur 35S (35S) et en aval d'une séquence de terminaison de la nopaline synthase (Tnos) ; le vecteur pAG01 contient en outre une cassette d'expression permettant d'exprimer l'inhibiteur de silencing p19 simultanément de la protéine recombinante afin d'augmenter les rendements de production. Les vecteurs sont ensuite utilisés pour transformer la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens.
    • Expression transitoire de pectates lyases selon l'invention dans des feuilles de Nicotiana benthamiana - Utilisation de la plateforme AllergoPur
  • Pour la production par expression transitoire Agobacterium tumefaciens LBA4404 est utilisé pour le transfert d'un ADNc codant la pectate lyase sans que le gène d'intérêt soit intégré dans le génome de la cellule végétale : on parle ici de transfection et non de transgenèse. Les plantes sont cultivées en condition hydroponique en présence d'un milieu nutritif (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, 10mL/ 15mL/ 5mL pour 10 L d'eau osmosée) et sous éclairage LED.
  • L'agrobactérie est transférée dans le tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés. Pour la production de petits lots de pectates lyases destinés au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées manuellement grâce à une seringue appliquée contre l'épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques foliaires prélevés dans les feuilles 4 à 6 jours après l'agro-infiltration sont utilisés pour l'analyse des différents prototypes de pectates lyases. Cette étape de criblage permet de définir le vecteur d'expression qui sera utilisé pour l'obtention d'une pectate lyase de qualité optimale. Le même procédé est utilisé pour la production commerciale à grande échelle mais, dans ce cas, l'agro-infiltration s'effectue sous vide, dans des enceintes contenant plusieurs litres d'une culture d'agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises en culture pendant 4 à 6 jours avant la purification des pectates lyases à partir des extraits foliaires (Figure 2).
    • Expression de la pectate lyase Amb a 1 et de ses sous-unités
  • L'expression des protéines ainsi que les rendements sont respectivement analysés par Western blotting et ELISA. Les résultats sont illustrés pour les 3 formes d'ADNc codant la protéine naturelle (Figure 3).
  • Les protéines exprimées sont actives. En effet, l'expression d'Amb a 1 provoque des nécroses importantes dès le 4ème jour d'expression comparé à des plantes contrôles. Ces nécroses sont dues à une forte activité pectate lyase (Liu et al, 2010).
    • Purification et caractérisation
  • Comme l'illustre la figure 4, les pectates lyases sont extraites à partir de la biomasse fraîche ou congelée puis purifiées sur colonne IMAC (HisTrap Excell).
  • Cette purification permet la production de la forme précurseur (préproprotéine) et de la sous-unité alpha.
  • Enfin, comme le montre la figure 5, il est possible de combiner les allergènes Amb a 1 et Amb a 11 obtenus par le procédé selon l'invention, pour obtenir une composition utilisable en immunothérapie allergique. Ces allergènes peuvent être produits et purifiés après une extraction mécanique comme décrit dans la demande FR1255510 , ou selon l'alternative d'extraction par infiltration enzymatique comme décrit dans la présente demande.
    • SEQUENCE LISTING
    • <110> ANGANY GENETICS
    • <120> Production commerciale de l'allergène Amb A1 par expression transitoire chez les plantes
    • <130> BFF140239
    • <160> 9
    • <170> Patent In version 3.5
    • <210> 1
      <211> 1254
      <212> DNA
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> ADNc codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7)
    • <400> 1
      Figure imgb0001
      Figure imgb0002
    • <210> 2
      <211> 1254
      <212> DNA
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> ADNc optimisé pour une utilisation chez N.benthamiana, codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7)
    • <400> 2
      Figure imgb0003
    • <210> 3
      <211> 1254
      <212> DNA
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> ADNc harmonisé codant pour la forme la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7)
    • <400> 3
      Figure imgb0004
    • <210> 4
      <211> 606
      <212> DNA
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité bêta
    • <400> 4
      Figure imgb0005
      Figure imgb0006
    • <210> 5
      <211> 786
      <212> DNA
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité alpha
    • <400> 5
      Figure imgb0007
    • <210> 6
      <211> 80
      <212> PRT
      <213> Artificial Sequence
    • <220>
      <223> propeptide Der p1
    • <400> 6
      Figure imgb0008
    • <210> 7
      <211> 417
      <212> PRT
      <213> Ambrosia artemisiifolia
    • <400> 7
      Figure imgb0009
      Figure imgb0010
      Figure imgb0011
    • <210> 8
      <211> 201
      <212> PRT
      <213> Ambrosia artemisiifolia
    • <400> 8
      Figure imgb0012
      Figure imgb0013
    • <210> 9
      <211> 261
      <212> PRT
      <213> Ambrosia artemisiifolia
    • <400> 9
      Figure imgb0014
      Figure imgb0015

Claims (12)

  1. Cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, dans laquelle ladite molécule d'ADN n'est pas intégrée dans le génome de la cellule végétale.
  2. Cellule végétale selon la revendication 1, dans laquelle la pectate lyase est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
  3. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle la pectate lyase est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines d'Artemisia vulgaris, d'Ambrosia psilostachya ou d'Ambrosia trifida, qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
  4. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide et une séquence codant la pectate lyase mature.
  5. Cellule végétale selon la revendication 4, dans laquelle :
    - le peptide signal est choisi parmi le peptide signal naturel de la pectate lyase et le peptide signal de la chitinase de tabac ; et
    - le propeptide est choisi parmi les propeptides naturels de pectates lyases et les propeptides de peptidases C1A.
  6. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend en outre une séquence peptidique d'adressage intracellulaire qui cible la pectate lyase sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale.
  7. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 6, qui comprend un vecteur d'expression comprenant :
    - des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
    - la séquence nucléotidique hétérologue telle que définie dans l'une des revendications précédentes ;
    - une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence p19 ; et
    - des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos.
  8. Plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 7.
  9. Procédé de production d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les homologues d'Amb a 1, comprenant l'expression de ladite pectate lyase dans une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 7, ou dans une plante selon la revendication 8.
  10. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 9, comprenant les étapes suivantes :
    a) transformation d'agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et
    b) transfection de la cellule végétale ou de la plante avec les agrobactéries obtenues à l'étape a).
  11. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 10, dans lequel les agrobactéries utilisées dans l'étape a) sont choisies parmi les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 et C58, et dans lequel la transfection de l'étape b) comprend de préférence les étapes suivantes :
    b1) culture de la cellule végétale ou de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant cinq semaines en hydroponie sur des flotteurs libres,
    b2) agroinfiltration de la cellule végétale ou plante obtenue en b1) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a) ; et
    b3) remise en culture de la cellule végétale ou de la plante obtenue en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours.
  12. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 10 ou 11, comprenant en outre une étape c) d'extraction de la pectate lyase produite, ladite étape c) comprenant les étapes suivantes :
    - infiltration sous vide de la cellule végétale ou des feuilles (i.e. partie aérienne) de la plante, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique,
    - prélèvement de la cellule végétale infiltrée ou des feuilles infiltrées de la plante et incubation, dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, à une température comprise entre 24°C et 30°C, puis
    - mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
    - filtration puis éventuellement centrifugation du digestat obtenu, et
    récupération du surnageant.
EP15732775.0A 2014-05-23 2015-05-20 Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes Active EP3145948B1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1454653A FR3021328B1 (fr) 2014-05-23 2014-05-23 Production commerciale de l'allergene amb a1 par expression transitoire chez les plantes
PCT/FR2015/051319 WO2015177464A1 (fr) 2014-05-23 2015-05-20 Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EP3145948A1 EP3145948A1 (fr) 2017-03-29
EP3145948B1 true EP3145948B1 (fr) 2020-01-01

Family

ID=51830398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP15732775.0A Active EP3145948B1 (fr) 2014-05-23 2015-05-20 Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20170159037A1 (fr)
EP (1) EP3145948B1 (fr)
CA (1) CA2949875C (fr)
DK (1) DK3145948T3 (fr)
ES (1) ES2781861T3 (fr)
FR (1) FR3021328B1 (fr)
WO (1) WO2015177464A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11338942B2 (en) * 2016-06-14 2022-05-24 Richard Stuart Blomquist Spacecraft and control method

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1255510A (fr) 1960-01-28 1961-03-10 S E B A M Charnière invisible pour porte de meuble
BR9915919A (pt) * 1998-10-07 2001-08-21 Syngenta Participations Ag Proteìnas terapeuticamente ativas em plantas
FR2809413B1 (fr) * 2000-05-29 2004-10-22 Tabacs & Allumettes Ind Production d'allergenes recombinants dans des cellules vegetales
US20110195452A1 (en) 2006-11-08 2011-08-11 Centre National De La Recherche Scientific-Cnrs set of sequences for targeting expression and control of the post-translational modification of a recombinant polypeptide
EP2692732A1 (fr) * 2012-08-03 2014-02-05 Stallergenes S.A. Nouvel allergène du pollen d'ambroisie et ses utilisations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170159037A1 (en) 2017-06-08
DK3145948T3 (da) 2020-04-06
FR3021328A1 (fr) 2015-11-27
WO2015177464A1 (fr) 2015-11-26
CA2949875C (fr) 2023-09-12
FR3021328B1 (fr) 2018-01-05
EP3145948A1 (fr) 2017-03-29
CA2949875A1 (fr) 2015-11-26
ES2781861T3 (es) 2020-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5517309B2 (ja) コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用
KR101216762B1 (ko) 식물에서 인슐린의 생산 방법
Dash et al. Isolation, purification and characterization of silk protein sericin from cocoon peduncles of tropical tasar silkworm, Antheraea mylitta
EP0951537B1 (fr) Collagenes recombinants produits par les plantes, leurs procedes d&#39;obtention et leurs utilisations
EP1523558B1 (fr) Production de peptides et de proteines par accumulation dans des corps proteiques derives du reticulum endoplasmique d&#39;une plante
EP1534834A2 (fr) Proteines oligomeriques de type chaperons, resistant aux proteases et/ou stables face aux denaturants, polynucleotides codant ces proteines, utilisations de ces proteines et procedes permettant d&#39;accroitre une activite specifique de ces proteines
WO1998005785A1 (fr) Phytases de plantes et applications biotechnologiques
CA2778695C (fr) Methodes et compositions permettant d&#39;augmenter la production d&#39;un polypeptide
CA2949875C (fr) Production commerciale de l&#39;allergene amb a1 par expression transitoire chez les plantes
EP2627667B1 (fr) Obtention de plantes ayant une tolérance améliorée à un déficit hydrique
JP5497353B2 (ja) 外来タンパク質の分泌方法
Philips et al. Functional characterization of the grapevine γ-glutamyl transferase/transpeptidase (EC 2.3. 2.2) gene family reveals a single functional gene whose encoded protein product is not located in either the vacuole or apoplast
FR2841906A1 (fr) Molecule d&#39;acide nucleique codant une preproproteine d&#39;allergene d&#39;un acarien du genre dermatophagoides ou euroglyphus et son utilisation pour la production dudit allergene dans les plantes
Zielonka et al. Characterization of five subgroups of the sieve element occlusion gene family in Glycine max reveals genes encoding non-forisome P-proteins, forisomes and forisome tails
KR102435211B1 (ko) 알부민을 고효율로 생산하는 식물 세포주 및 이의 용도
CA2366217A1 (fr) Promoteur inductible comtii, gene chimere le comprenant et plantes transformees
US20090253125A9 (en) Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
JP2015188442A (ja) セサミン生産用植物培養細胞およびそれを用いるセサミン製造方法
EP2986728B1 (fr) Production commerciale de peptidases c1a par expression transitoire chez les plantes
CA3171517A1 (fr) Enzyme pour la conversion d&#39;acide chlorogenique en acide isochlorogenique
FR2906818A1 (fr) Procede de production de proteines recombinantes a l&#39;aide de plantes carnivores
EP1138771A1 (fr) Endo-Mannanase de café
EP1433854A1 (fr) Plante génétiquement modifiée présentant une floraison accélérée
WO2001051637A1 (fr) Promoteur de plante fruit specifique

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20161219

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: FAYE, LOIC

Inventor name: FITCHETTE, ANNE-CATHERINE

Inventor name: GOMORD, VERONIQUE

Inventor name: CATALA, VIRGINIE

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20180123

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: ANGANY INC.

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: GRANT OF PATENT IS INTENDED

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20190731

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE PATENT HAS BEEN GRANTED

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: FG4D

Free format text: NOT ENGLISH

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: EP

Ref country code: AT

Ref legal event code: REF

Ref document number: 1219679

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20200115

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R096

Ref document number: 602015044651

Country of ref document: DE

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FG4D

Free format text: LANGUAGE OF EP DOCUMENT: FRENCH

REG Reference to a national code

Ref country code: DK

Ref legal event code: T3

Effective date: 20200331

REG Reference to a national code

Ref country code: NL

Ref legal event code: FP

REG Reference to a national code

Ref country code: LT

Ref legal event code: MG4D

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CZ

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: LT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: PT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200527

Ref country code: FI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: NO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200401

Ref country code: RS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200402

Ref country code: BG

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200401

Ref country code: HR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: SE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: IS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200501

Ref country code: LV

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

REG Reference to a national code

Ref country code: ES

Ref legal event code: FG2A

Ref document number: 2781861

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: T3

Effective date: 20200908

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R097

Ref document number: 602015044651

Country of ref document: DE

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: RO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: SM

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: EE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: SK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

REG Reference to a national code

Ref country code: AT

Ref legal event code: MK05

Ref document number: 1219679

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20200101

26N No opposition filed

Effective date: 20201002

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: MC

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: PL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20200520

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20200520

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: TR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: MT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: CY

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

Ref country code: AL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20200101

P01 Opt-out of the competence of the unified patent court (upc) registered

Effective date: 20230519

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Payment date: 20260429

Year of fee payment: 12

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: U11

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: U-0-0-U10-U11 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Effective date: 20260601

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Payment date: 20260608

Year of fee payment: 12

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 20260521

Year of fee payment: 12

Ref country code: DK

Payment date: 20260504

Year of fee payment: 12

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Payment date: 20260508

Year of fee payment: 12

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Payment date: 20260513

Year of fee payment: 12

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CH

Payment date: 20260601

Year of fee payment: 12

Ref country code: BE

Payment date: 20260528

Year of fee payment: 12

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Payment date: 20260421

Year of fee payment: 12