EP3387122A1 - Lipasen mit erhöhter thermostabilität - Google Patents

Lipasen mit erhöhter thermostabilität

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Publication number
EP3387122A1
EP3387122A1 EP16800947.0A EP16800947A EP3387122A1 EP 3387122 A1 EP3387122 A1 EP 3387122A1 EP 16800947 A EP16800947 A EP 16800947A EP 3387122 A1 EP3387122 A1 EP 3387122A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lipase
amino acid
seq
positions
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP16800947.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Daniela HERBST
Timothy O'connell
Nina Mussmann
Ulrich Schwaneberg
Ronny MARTINEZ-MOYA
Christian Lehmann
Volkan Besirioglu
Ljubica Vojcic
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP3387122A1 publication Critical patent/EP3387122A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the invention is in the field of enzyme technology.
  • the invention relates to lipases from Rhizopus oryzae whose amino acid sequence, in particular with regard to the use in detergents and cleaning agents have been changed to give them a better thermal stability, and encoding them for nucleic acids and their preparation.
  • the invention further relates to the uses of these lipases and processes in which they are used as well as agents containing them, in particular washing and cleaning agents.
  • Lipases are among the most technically important enzymes of all. Their use in detergents and cleaning agents is industrially established and they are contained in virtually all modern, powerful detergents and cleaners. Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of ester bonds in lipid substrates, especially in fats and oils, and thus belong to the group of esterases. Lipases are typically enzymes that can cleave a variety of substrates, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove greasy soils by catalyzing their hydrolysis (lipolysis).
  • Lipases with broad substrate spectra are used in particular where inhomogeneous raw materials or substrate mixtures have to be reacted, for example in detergents and cleaners, since soiling may consist of differently structured fats and oils.
  • the lipases used in the washing or cleaning agents known from the prior art are usually of microbial origin and are generally derived from bacteria or fungi, for example the genera Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma or Trichosporon. Lipases are usually produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi.
  • European patent application EP 0443063 describes a lipase from Pseudomonas sp. Intended for washing and cleaning agents. ATCC 21808.
  • Japanese Patent Application JP 1225490 discloses a Rhizopus oryzae lipase.
  • only selected lipases are suitable for use in liquid surfactant-containing preparations. Many lipases do not show sufficient catalytic performance or stability in such formulations.
  • washing processes which are generally carried out at temperatures are leads which are higher than 20 ° C, exhibit many lipases thermal instability, which in turn leads to an insufficient catalytic activity during the washing process.
  • this problem is even more serious, for example due to the complex-forming properties of the phosphonates or due to unfavorable interactions between the phosphonate and the lipase.
  • lipase and surfactant-containing liquid formulations of the prior art have the disadvantage that they often do not have satisfactory lipolytic activity in the temperature ranges required by a washing process and therefore do not show optimum cleaning performance on lipase-sensitive soils.
  • a lipase from Rhizopus oryzae or a sufficiently similar lipase which has an amino acid substitution on at least one of the positions K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 or S364, each based on the numbering according to SEQ ID NO: 1, is improved in terms of the (thermal) stability compared to the wild-type form and is therefore particularly suitable for use in detergents or cleaners.
  • the invention therefore in a first aspect comprises a lipase comprising an amino acid sequence which has at least 70% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length and an amino acid substitution at at least one of the positions K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 or S364, each based on the numbering according to SEQ ID NO: 1, has.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of a lipase comprising the substitution of an amino acid at at least one position, the position 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 or 364 in SEQ ID NO: 1, in an initial lipase having at least 70% sequence identity to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length such that the lipase comprises at least one of the amino acid substitutions K142E, I149R, S195R, K204R , N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C or S364R.
  • a lipase in the sense of the present patent application therefore comprises both the lipase as such and a lipase produced by a method according to the invention. All statements on the lipase therefore relate both to the lipase as such and to the lipases produced by means of corresponding processes.
  • nucleic acids coding for these lipases relate to the nucleic acids coding for these lipases, to non-human host cells containing lipases or nucleic acids according to the invention and to lipases comprising the present invention, in particular detergents and cleaners, washing and cleaning processes, and uses of the lipases according to the invention in detergents or cleaners for the removal of greasy stains.
  • At least one as used herein means one or more, i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or more.
  • the present invention is based on the surprising discovery of the inventors that an amino acid substitution at least one of positions 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 or 364 of the Rhizopus oryzae lipase according to SEQ ID NO: 1, in a lipase comprising at least 70% identical amino acid sequence to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, such that at least one of the corresponding positions comprises amino acids 142E, 149R, 195R, 204R, 2181 , 287V, 292S, 294R, 302T, 308S, 309L, 335G, 364C or 364R, provides improved (thermal) stability of these altered lipase in detergents and cleaners.
  • This is particularly surprising inasmuch as none of the abovementioned amino acid substitutions has been previously associated with increased stability of the lipase.
  • the lipases according to the invention have increased stability in detergents or cleaners, in particular to elevated temperatures. Such performance-enhanced lipases provide improved wash results on lipolytically-sensitive soils over a wide temperature range.
  • the lipases according to the invention have enzymatic activity, that is, they are capable of hydrolysing fats and oils, in particular in a washing or cleaning agent.
  • a lipase of the invention is therefore an enzyme which catalyzes the hydrolysis of ester bonds in lipid substrates and thereby is able to cleave fats or oils.
  • a lipase of the invention is preferably a mature lipase, i. to the catalytically active molecule without signal and / or propeptide (s). Unless otherwise stated, the sequences given refer to each mature (processed) enzymes.
  • the lipase of the invention contains at least one amino acid substitution selected from the group consisting of K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C and S364R, respectively Numbering according to SEQ ID NO: 1, is selected.
  • the lipase of the invention contains one of the following amino acid substitution variants: (i) P308S; (ii) S195R and S364C; (iii) S195R and E335G; (iv) Q294R and S364R; (v) E287; (vi) N218I and I302T; (vii) P292S; (viii) E335G; or (ix) K142E, I149R, K204R and Q309L, wherein the numbering is based in each case on the numbering according to SEQ ID NO: 1.
  • the lipase comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its total length to at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77 %, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90, 91, 91 , 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5 %, 98%, 98.5% and 98.8%, and which are at least one of the positions 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 or 364 in FIG the count according to SEQ ID NO.
  • the feature means that a lipase has the indicated substitutions, that it contains at least one of the corresponding amino acids at the corresponding positions, ie that not all of the 14 positions are otherwise mutated or deleted, for example by fragmentation of the lipase.
  • the amino acid sequences of such lipases which are preferred according to the invention are given in SEQ ID Nos. 2-10.
  • sequence comparison is based on the BLAST algorithm established and commonly used in the prior art (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search Biol. 215: 403-410; and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
  • Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp.3389-3402) and is in principle effected by similar sequences of nucleotides or amino acids in the nucleic acid or nucleic acid sequences Amino acid sequences are assigned to each other. A tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment.
  • Another algorithm available in the prior art is the FASTA algorithm. Sequence comparisons (alignments), in particular multiple sequence comparisons, are created with computer programs.
  • the Clustal series see, for example, Chenna et al., 2003: Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs, Nucleic Acid Research 31, 3497-3500
  • T-Coffee see, for example, Notredame et al (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 302, 205-217
  • programs based on these programs or algorithms are also possible.
  • alignment comparisons with the computer program Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with the default parameters, whose AlignX module for sequence comparisons is based on ClustalW.
  • the sequence identity given herein is determined by the BLAST algorithm.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity of the compared sequences to each other. It is usually expressed as a percentage of identity, ie the proportion of identical nuclei. leotide or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions indicated.
  • the broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in the consideration of amino acid sequences, that is, amino acids with similar chemical activity, as these usually perform similar chemical activities within the protein. Therefore, the similarity of the sequences compared may also be stated as percent homology or percent similarity.
  • Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences.
  • Such areas often have identical functions. They can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless otherwise indicated, identity or homology information in the present application, however, refers to the total length of the particular nucleic acid or amino acid sequence indicated.
  • the lipase is characterized in that its purification performance is not significantly reduced compared to that of a lipase comprising an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1, i. has at least 80% of the reference washing power, preferably at least 100%, more preferably at least 1 10%.
  • the cleaning performance can be determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the lipase, wherein the lipases to be compared are used in the same concentration (based on active protein) and the cleaning performance a soiling on cotton is determined by measuring the degree of cleaning of the washed textiles.
  • the washing process for 70 minutes at a temperature of 40 ° C and the water have a water hardness between 15.5 and 16.5 ° (German hardness).
  • the concentration of the lipase in the detergent intended for this washing system is 0.001-0.1% by weight, preferably 0.01-0.06% by weight, based on active, purified protein.
  • a liquid reference detergent for such a washing system may be composed as follows (all figures in weight percent): 7% alkylbenzenesulfonic acid, 9% other anionic surfactants, 4% C12-C18 Na salts of fatty acids (soaps), 7% not -ionic surfactants, 0.7% phosphonates, 3.2% citric acid, 3.0% NaOH, 0.04% defoamer, 5.7% 1,2-propanediol, 0.1% carboxylic acid manifestungsstoffe, 2% ethanol, 0.2% dye transfer inhibitor, remainder demineralized water.
  • the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor.
  • the determination of the cleaning performance is carried out, for example, at 34.8 ° C using a liquid detergent as indicated above, wherein the washing process is preferably carried out for 30 minutes.
  • the whiteness i. the brightening of the stains, as a measure of the cleaning performance is determined by optical measurement methods, preferably photometrically.
  • a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d.
  • the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
  • the activity-like use of the respective lipase ensures that even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the cleaning performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
  • the lipase activity can also be determined in the usual manner, preferably as described in Bruno Stellmach, "Methods of Determining Enzymes for Pharmacy, Food Chemistry, Technology, Biochemistry, Biology, Medicine” (Steinkopff Verlag Darmstadt, 1988, p 172ff)
  • Lipase-containing samples are added to an olive oil emulsion in emulsifier-containing water and incubated at 30 ° C and pH 9.0, thereby fatty acids are released.These are titrated with an autotitrator over 20 minutes continuously with 0.01 N sodium hydroxide solution, so that the pH remains constant (“pH stat titration"). Based on the sodium hydroxide consumption, the determination of the lipase activity takes place by reference to a reference lipase sample.
  • An alternative test for determining the lipolytic activity of the lipases according to the invention is an optical measuring method, preferably a photometric method.
  • the appropriate test involves the lipase-dependent cleavage of the substrate para-nitrophenol butyrate (pNP-butyrate). This is cleaved by the lipase into para-nitrophenolate and butyrate.
  • the presence of para-nitrophenolate can be determined using a photometer, eg the Tecan Sunrise device and the XFLUOR software, at 405 nm and thus allows a conclusion on the enzymatic activity of the lipase.
  • the protein concentration can be determined by known methods, for example, the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). Determination of the active protein concentration in this regard may be achieved by titration of the active sites using a suitable irreversible inhibitor and determination of residual activity (see M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc., 88, 24 (1966), p -5913).
  • lipases according to the invention can undergo further amino acid changes, in particular amino acid substitutions,
  • lipases are, for example, by targeted genetic modification, i. by mutagenesis, further developed and optimized for specific applications or specific properties (for example, in terms of catalytic activity, stability, etc.).
  • nucleic acids according to the invention can be introduced into recombination approaches and thus used to generate completely novel lipases or other polypeptides.
  • the goal is to introduce into the known molecules targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions, for example, to improve the cleaning performance of enzymes of the invention.
  • targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions
  • the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with the substrate can be changed.
  • the net charge of the enzymes can be changed in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • the stability of the lipase can be further increased by one or more corresponding mutations, thereby improving its cleaning performance.
  • Advantageous properties of individual mutations, e.g. individual substitutions can complement each other.
  • a lipase which has already been optimized with regard to certain properties, for example with respect to its stability to elevated temperatures, can therefore be further developed within the scope of the invention.
  • amino acid substitutions For the description of substitutions which concern exactly one amino acid position (amino acid substitutions), the following convention is used herein: first, the naturally occurring amino acid is designated in the form of the international one-letter code, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are separated by slashes. For insertions, additional amino acids are named after the sequence position. In the case of deletions, the missing amino acid is replaced by a symbol, for example a star or a dash, or a ⁇ is specified in front of the corresponding position.
  • K142E describes the substitution of lysine at position 142 by glutamic acid
  • K142KE the insertion of glutamic acid after the amino acid lysine at position 142 and K142 * or AK142 the deletion of Lysine at position 142.
  • This nomenclature is known to those skilled in the art of enzyme technology.
  • Another object of the invention is therefore a lipase, which is characterized in that it is obtainable from a lipase as described above as the starting molecule by single or multiple conservative amino acid substitution, wherein the lipase in the count according to SEQ ID NO: 1 nor at least one the amino acid substitutions according to the invention at the positions corresponding to positions 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 and 364 in SEQ ID NO: 1, as described above.
  • the term "conservative amino acid substitution” means the substitution of one amino acid residue for another amino acid residue, which substitution does not result in a change in polarity or charge at the position of the exchanged amino acid, e.g.
  • the lipase is characterized in that it is obtainable from a lipase according to the invention as starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence which is over a length of at least 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 , 350, 360, 361, 362, 363, 364 or 365 contiguous amino acids with the parent molecule, wherein the (s) amino acid substitution (s) contained in the starting molecule at one or more of the positions, the positions 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 and 364 in SEQ ID NO: 1 are still present.
  • the enzymes retain their lipolytic activity, i. their lipolytic activity is at least equal to that of the parent enzyme, i. in a preferred embodiment, the lipolytic activity is at least 80, preferably at least 90% of the activity of the starting enzyme.
  • Other substitutions can also show beneficial effects. Both single and multiple contiguous amino acids can be substituted for other amino acids.
  • the lipase is characterized in that it is obtainable from a lipase according to the invention as the starting molecule by mono- or multiple conservative amino acids. noklare substitution, wherein the lipase at least one of the amino acid substitutions K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C or S364R at the positions corresponding to the positions 142, 149, 195, 204 , 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 and 364 as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the lipase is characterized in that it is obtainable from a lipase according to the invention as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence which is over a length of at least 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330 , 340, 350, 360 or 366 contiguous amino acids with the parent molecule, wherein the lipase is at least one of the amino acid substitutions K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C or S364R the positions corresponding to positions 142, 149, 195, 204
  • the further amino acid positions are hereby defined by an alignment of the amino acid sequence of a lipase according to the invention with the amino acid sequence of the lipase from Rhizopus oryzae, as indicated in SEQ ID NO: 1. Furthermore, the assignment of the positions depends on the mature (mature) protein. This assignment should also be used in particular if the amino acid sequence of a lipase according to the invention comprises a higher number of amino acid residues than the Rhizopus oryzae lipase according to SEQ ID NO. 1 . Starting from the mentioned positions in the amino acid sequence of the Rhizopus oryzae lipase, the change positions in a lipase according to the invention are those which are just assigned to these positions in an alignment.
  • Advantageous positions for sequence changes, in particular substitutions, of the Rhizopus oryzae lipase which are preferably transferred to homologous positions of the lipases according to the invention and which confer advantageous functional properties on the lipase are accordingly the positions which are aligned in positions 142, 149, 195 , 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 and 364 in SEQ ID NO: 1, ie in the counting according to SEQ ID NO: 1.
  • an amino acid exchange in a specific position of the Rhizopus oryzae lipase according to SEQ ID NO: 1 is accompanied by a change in an enzymatic parameter, for example an increase in the M value
  • a corresponding change in the enzymatic parameter for example likewise one Increasing the M value, observed in a lipase variant according to the invention, whose amino acid exchange has been achieved by the same amino acid introduced, is here to be seen confirmation of the correct assignment.
  • a method according to the invention further comprises one or more of the following method steps: a) introducing a single or multiple conservative amino acid substitution, wherein the lipase at least one of the amino acid substitutions K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S , Q309L, E335G, S364C or S364R at the positions corresponding to positions 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 and 364 of SEQ ID NO: 1; b) alteration of the amino acid sequence by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis such that the lipase comprises an amino acid sequence of at least 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 , 140, 150, 160, 170
  • the lipase or the lipase produced by a method according to the invention is still at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92, 5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% , or 98.8% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length.
  • the lipase or the lipase prepared by a method according to the invention is still at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%. , 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93 %, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, or 98% identical to one of the amino acid sequences given in SEQ ID Nos: 2-10 over their entire length.
  • the lipase or the lipase produced by a method according to the invention has an amino acid substitution on at least one of the positions K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 or S364, in each case based on the numbering according to FIG SEQ ID NO: 1, on.
  • the amino acid substitution is at least one selected from the group consisting of K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C and S364R, each based on the numbering according to SEQ ID NO.
  • the lipase comprises one of the following amino acid substitution variants: (i) P308S; (ii) S195R and S364C; (iii) S195R and E335G; (iv) Q294R and S364R; (v) E287; (vi) N218I and I302T; (vii) P292S; (viii) E335G; or (ix) K142E, I149R, K204R and Q309L.
  • Another object of the invention is a previously described lipase, which is additionally stabilized, in particular by one or more mutations, for example substitutions, or by coupling to a polymer.
  • all stabilization options described in the prior art and / or appropriate considerations come into consideration. Preference is given to those stabilizations which are achieved via mutations of the enzyme itself, since such stabilizations do not require any further working steps following the recovery of the enzyme. Examples of sequence changes suitable for this purpose are mentioned above. Other suitable sequence changes are known from the prior art.
  • Preferred embodiments are those in which the enzyme is stabilized in several ways, as several stabilizing mutations act additive or synergistic.
  • Another object of the invention is a lipase as described above, which is characterized in that it has at least one chemical modification.
  • a lipase with such a change is called a derivative, i. the lipase is derivatized.
  • derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified.
  • derivatizations can be For example, in vivo, by the host cell expressing the protein.
  • couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
  • derivatizations can also be carried out in vitro, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein.
  • another compound may also be another protein that is bound to a protein of the invention via bifunctional chemical compounds, for example.
  • derivatization is to be understood as meaning the covalent binding to a macromolecular carrier, or else a noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures.
  • Derivatizations may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage. Such modifications may further affect stability or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • couplings with macromolecular compounds for example, polyethylene glycol, can improve the protein in terms of stability and / or skin tolerance.
  • Derivatives of a protein according to the invention can also be understood in the broadest sense to mean preparations of these proteins.
  • a protein can be combined with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also have been deliberately added to other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its enzymatic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
  • the joint preparation of lipases with specific inhibitors is possible in this regard.
  • lipases or lipase variants and / or derivatives described above particular preference is given in the context of the present invention to those whose stability and / or activity corresponds to at least one of the lipases according to SEQ ID Nos: 2-10 and / or their purification performance of at least one of them the lipases according to SEQ ID Nos: 2-10, wherein the cleaning performance is determined in a washing system as described above.
  • a further subject of the invention is a nucleic acid which codes for a lipase according to the invention, as well as a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
  • DNA or RNA molecules may be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. Especially in the case of DNA molecules, the sequences of both complementary strands must be taken into account in all three possible reading frames. Furthermore, it should be noted that different codons, so base triplets, can code for the same amino acids, so that a particular amino acid sequence can be encoded by several different nucleic acids. Due to this degeneracy of the genetic code, all nucleic acid sequences are included in this subject of the invention which can encode any of the lipases described above.
  • nucleic acids according to the invention one or more codons may be replaced by synonymous codons.
  • This aspect relates in particular to the heterologous expression of the enzymes according to the invention.
  • each organism for example a host cell of a production strain, has a particular codon usage. Codon usage is understood to mean the translation of the genetic code into amino acids by the particular organism.
  • Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons lying on the nucleic acid in the organism face a comparatively small number of loaded tRNA molecules. Although coding for the same amino acid, this results in a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon encoding the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, it can be more efficiently translated in the organism.
  • a person skilled in the art can use well-known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences, the corresponding nucleic acids to complete genes manufacture.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such methods are for example from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press.
  • vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a nucleic acid according to the invention as a characteristic nucleic acid region. You can do this in one species or cell line over several generations. to establish them as a stable genetic element.
  • Vectors especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements.
  • a nucleic acid according to the invention is cloned into a vector.
  • the vectors include, for example, those whose origin are bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. They may be extrachromosomal as separate units or integrated into a chromosome or chromosomal DNA.
  • Expression vectors comprise nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a contained nucleic acid there.
  • expression is influenced by the promoter (s) that regulate transcription.
  • the expression may be effected by the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also by a promoter of the host cell provided on the expression vector or also by a modified or completely different promoter of another organism or another host cell.
  • at least one promoter for the expression of a nucleic acid according to the invention is made available and used for its expression.
  • expression vectors can be regulatable, for example by changing the culturing conditions or when a specific cell density of the host cells contained therein is reached or by addition of specific substances, in particular activators of gene expression.
  • An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is used as activator of the bacterial lactose operon (lac operon).
  • IPTG galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • lac operon lac operon
  • a further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention or which contains a lipase according to the invention, in particular one which secretes the lipase into the medium surrounding the host cell.
  • a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is transformed into a microorganism, which then represents a host cell according to the invention.
  • individual components, ie nucleic acid parts or fragments of a nucleic acid according to the invention can be introduced into a host cell such that the resulting host cell contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more constituents of a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention and the further constituents are then supplemented accordingly.
  • Methods of transforming cells are well established in the art and skilled in the art well known. In principle, all cells, that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example as regards the transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, for example unicellular fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling.
  • Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenially) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
  • the lipases can be modified by the cells producing them after their production, for example by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such post-translational modifications can functionally influence the lipase.
  • Further preferred embodiments are those host cells which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This enables an economical production of the proteins according to the invention.
  • An example of such a compound is IPTG as described above.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Bacteria are characterized by short generation times and low demands on cultivation conditions. As a result, inexpensive cultivation methods or production methods can be established. In addition, the expert has a wealth of experience in bacteria in fermentation technology. For a specific production, gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a wide variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.
  • Gram-negative bacteria such as Escherichia coli
  • Gram-negative bacteria can also be designed such that they eject the expressed proteins not only into the periplasmic space but into the medium surrounding the bacterium.
  • gram-positive bacteria such as, for example, Bacilli or Actinomycetes or other representatives of the Actinomycetales
  • gram-positive bacteria have no outer membrane, so that secreted proteins are readily released into the medium surrounding the bacteria, generally the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. You can take off the medium directly isolated or further processed.
  • Gram-positive bacteria are related or identical to most of the organisms of origin for technically important enzymes and usually form even comparable enzymes, so they have a similar codon use and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.
  • Host cells according to the invention may be altered in their requirements of the culture conditions, have different or additional selection markers or express other or additional proteins. In particular, it may also be those host cells which express several proteins or enzymes transgene.
  • the present invention is applicable in principle to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, particularly preferably those of the genus Bacillus, and results in the production of proteins according to the invention by the use of such microorganisms. Such microorganisms then represent host cells in the sense of the invention.
  • the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the genera Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausa, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomon
  • the host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • a further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples thereof are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to lower the allergenicity of an expressed protein. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic le fungal Express ion systems are particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants.
  • the host cells according to the invention are conventionally cultivated and fermented, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time.
  • Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium, in which over a relatively long period of time cells partly die out but also regrow and at the same time the protein formed can be removed from the medium.
  • Host cells according to the invention are preferably used to prepare lipases according to the invention.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing a lipase comprising
  • This subject invention preferably comprises fermentation processes. Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the lipases according to the invention. All fermentation processes which are based on a corresponding process for preparing a lipase according to the invention represent embodiments of this subject matter of the invention.
  • Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, come in particular into consideration.
  • the media components consumed by the ongoing cultivation are fed.
  • considerable increases can be achieved both in the cell density and in the cell mass or dry matter and / or in particular in the activity of the lipase of interest.
  • the fermentation can also be designed so that undesired metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or suitable counterions.
  • the produced lipase can be harvested from the fermentation medium.
  • Such a fermentation process is preferable to isolation of the lipase from the host cell, ie, product preparation from the cell mass (dry matter), but requires the provision of suitable host cells or one or more suitable secretion markers or mechanisms and / or transport systems for the host cells to provide Seize lipase in the fermentation medium.
  • the isolation of the lipase from the host Cell ie a purification of the same from the cell mass, carried out, for example by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification.
  • Another object of the invention is an agent which is characterized in that it contains a lipase according to the invention as described above.
  • the agent is as a washing or cleaning agent.
  • This subject matter of the invention includes all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and undiluted agents, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning.
  • detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which the term detergent is used.
  • washing and cleaning agents in the invention also include washing aids which are added to the actual detergent in the manual or machine textile laundry to achieve a further effect.
  • laundry detergents and cleaners in the context of the invention also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling, and also agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge. Among the latter, i.a. calculated the fabric softener.
  • the washing or cleaning agents according to the invention may contain, in addition to a lipase according to the invention, all known ingredients customary in such agents, preferably at least one further ingredient being present in the composition .
  • the agents according to the invention may contain, in particular, surfactants, builders, peroxygen compounds or bleach activators. In addition, they may contain water-miscible organic solvents, further enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and / or further auxiliaries such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators, as well as dyes and fragrances, and combinations thereof.
  • a combination of a lipase according to the invention with one or more further ingredients of the composition is advantageous, since in preferred embodiments according to the invention such an agent has an improved cleaning performance by virtue of resulting synergisms.
  • a lipase according to the invention with a surfactant and / or a builder (builder) and / or a peroxygen compound and / or a bleach activator, such a synergism can be achieved.
  • An agent according to the invention advantageously contains the lipase in an amount of from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, more preferably from 20 ⁇ g to 15 mg and very particularly preferably from 50 ⁇ g to 10 mg per g of the composition.
  • the lipase contained in the agent, and / or other ingredients of the agent may be coated with a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent.
  • Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the lipase is coated with a substance which is impermeable to the lipase at room temperature or in the absence of water.
  • the washing or cleaning agent itself may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process.
  • the agent is characterized in that it
  • (A) is in solid form, in particular as a free-flowing powder having a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l, or
  • (b) is in pasty or liquid form, and / or
  • (c) is in the form of a gel or pouch, and / or
  • (d) is present as a one-component system, or
  • compositions according to the invention include all solid, powdery, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of compositions according to the invention, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form.
  • the agent can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
  • the solid dosage forms of the composition also include extrudates, granules, tablets or pouches.
  • the agent may also be liquid, gelatinous or pasty, for example in Form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • the agent may be present as a one-component system. Such funds consist of one phase.
  • an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components.
  • Detergents or cleaning agents according to the invention may contain only one lipase. Alternatively, they may also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent. A further embodiment of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes.
  • enzymes which can be used as further enzymes are all enzymes which can display catalytic activity in the agent according to the invention, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, ⁇ -glucosidase, pectinase, carrageenase, Perhydrolase, oxidase, oxidoreductase or other - distinguishable from the lipases of the invention - lipases, and mixtures thereof.
  • each additional enzyme is in an amount of 1 x 10 -3 ⁇ 7 wt .-%, of 0.00001-1 wt .-%, of 0.00005 to 0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0, 1 wt .-% and particularly preferably from 0.0001 to 0.05 wt .-% in agents according to the invention, based on active protein.
  • the enzymes show synergistic cleaning performance against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance.
  • a further subject of the invention is a process for the cleaning of textiles or hard surfaces, which is characterized in that an agent according to the invention is used in at least one process step or in at least one process step a lipase according to the invention becomes catalytically active, in particular such that the lipase in an amount of 40 ⁇ g to 4g, preferably from 50 ⁇ g to 3g, more preferably from 100 ⁇ g to 2g and most preferably from 200 ⁇ g to 1g is used.
  • the method described above is characterized in that the lipase at a temperature of 0-100, preferably 0-60, more preferably 20-40 ° C and most preferably at 34.8 ° C is used.
  • a temperature of 0-100 preferably 0-60, more preferably 20-40 ° C and most preferably at 34.8 ° C is used.
  • These include both manual and mechanical processes, with mechanical processes being preferred.
  • Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned and washed off after the contact time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution or dilution of this product. The same applies to processes for cleaning all other materials than textiles, especially hard surfaces.
  • washing or cleaning processes can be enriched in at least one of the process steps by the use of a washing or cleaning agent or a lipase according to the invention and then represent embodiments of the present invention.
  • All facts, objects and embodiments, the lipases according to the invention and containing them Means are described are also applicable to this subject invention. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above inventive method.
  • a single and / or the sole step of such a method can consist in that the lipase as the only active-ingredient-active component is contacted with the soiling, preferably in a buffer solution or in water.
  • Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which a lipase according to the invention becomes active in at least one process step.
  • methods for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.
  • the invention also encompasses the use of the lipases described herein in detergents, for example as described above, for the (improved) removal of greasy soils, for example textiles or hard surfaces.
  • Example 1 Determining the Thermal Stability of LipRO in a Detergent Matrix
  • This matrix is still provided with 1% boric acid for the measurements with stabilizer.
  • thermostability a microtiter plate-based assay using para-nitrophenol butyrate (pNP butyrate) as the substrate was used. Upon enzymatic hydrolysis in the aqueous medium, para-nitrophenolate and butyrate were released and then para-nitrophenolate was detected by absorbance measurement at a wavelength of 405 nm.
  • the plates were incubated in parallel at 34.8 ° C and at RT. Reaction conditions were as follows: 40 ⁇ L of clear supernatant obtained after cell lysis and centrifugation was added to 10 ⁇ M matrix solution (1: 200 dilution in 50 mM TEA buffer, pH 7.4) and mixed.
  • a plate was incubated for 30 minutes at 34.8 ° C in a PCR cycler, followed by a 5 minute incubation on ice.
  • the RT plate was incubated at RT for 35 minutes.
  • 40 ⁇ of the reaction mixture was transferred to a new MTP.
  • the enzyme reaction was initiated by addition of 60 ⁇ freshly prepared pNP-butyrate solution (final concentration 1.5 mM) and the increase in absorbance was measured at 405 nm wavelength using the Tecan Sunrise and XFLUOR software. The absorbance was measured in the Accuracy mode for 60 cycles at 7 sec intervals and the plates were shaken within the reader for 2 minutes.
  • the dilution of the pNP-butyrate stock solution to the working concentration must be carried out before the measurement due to the high autohydrolysis.
  • the activity ratio was calculated by dividing (slope / min activity value) at 34.8 ° C by (slope / min activity value) at RT:
  • Variants 5 and 11 represent comparative examples in which the amino acid substitutions did not improve the stability.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Lipasen umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und die eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen K142, I149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 oder S364, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1, aufweisen sowie deren Herstellung und Verwendung. Derartige Lipasen zeigen eine sehr gute Stabilität, insbesondere Temperaturstabilität, bei gleichzeitig guter Reinigungsleistung.

Description

„Lipasen mit erhöhter Thermostabilität"
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Lipasen aus Rhi- zopus oryzae deren Aminosäuresequenz, insbesondere im Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verändert wurden um ihnen eine bessere Thermostabilität zu verleihen, und die für sie codierende Nukleinsäuren sowie deren Herstellung. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendungen dieser Lipasen und Verfahren in denen sie eingesetzt werden sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Lipasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Ihr Einsatz in Wasch- und Reinigungsmittel ist industriell etabliert und sie sind in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthalten. Lipasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Esterbindungen in Lipidsubstraten, insbesondere in Fetten und Ölen, katalysieren und damit zur Gruppe der Esterasen gehören. Lipasen sind typischerweise Enzyme, die eine Vielzahl an Substraten spalten können, beispielsweise aliphatische, alizyklische, bizyklische und aromatische Ester, Thioester und aktivierte Amine. Lipasen werden zur Entfernung von fetthaltigen Anschmutzungen eingesetzt, indem sie deren Hydrolyse (Lipolyse) katalysieren. Lipasen mit breiten Substratspektren werden insbesondere dort verwendet, wo inhomogene Rohstoffe oder Substratgemische umgesetzt werden müssen, also beispielsweise in Wasch- und Reinigungsmitteln, da Anschmutzungen aus unterschiedlich aufgebauten Fetten und Ölen bestehen können. Die in den aus dem Stand der Technik bekannten Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzten Lipasen sind üblicherweise mikrobiel- len Ursprungs und stammen in der Regel aus Bakterien oder Pilzen, beispielsweise der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma oder Trichosporon. Lipasen werden üblicherweise nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Pilze.
In der europäischen Patentanmeldung EP 0443063 ist beispielsweise eine für Wasch- und Reinigungsmittel vorgesehene Lipase aus Pseudomonas sp. ATCC 21808 offenbart. In der japanischen Patentanmeldung JP 1225490 wird eine Lipase aus Rhizopus oryzae offenbart. Generell sind nur ausgewählte Lipasen für den Einsatz in flüssigen Tensid-haltigen Zubereitungen überhaupt geeignet. Viele Lipasen zeigen in derartigen Zubereitungen keine ausreichende katalytische Leistung oder Stabilität. Insbesondere in Waschverfahren, die im Allgemeinen bei Temperaturen durchge- führt werden, die höher als 20°C liegen, zeigen viele Lipasen thermische Instabilität, die wiederum zu einer unzureichenden katalytischen Aktivität während des Waschvorgangs führt. In Phosphonat- haltigen flüssigen Tensidzubereitungen ist diese Problematik noch gravierender, beispielsweise auf Grund der komplexbildenden Eigenschaften der Phosphonate oder auf Grund von unvorteilhaften Wechselwirkungen zwischen dem Phosphonat und der Lipase.
Folglich haben lipase- und Tensid-haltige flüssige Formulierungen aus dem Stand der Technik den Nachteil, dass sie oftmals in den Temperaturbereichen, die ein Waschverfahren erfordert, keine zufriedenstellende lipolytische Aktivität aufweisen und daher keine optimale Reinigungsleistung an Lipase-sensitiven Anschmutzungen zeigen.
Überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, dass eine Lipase aus Rhizopus oryzae oder eine hierzu hinreichend ähnliche Lipase (bezogen auf die Sequenzidentität), die eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 oder S364, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 1 , aufweist, hinsichtlich der (thermischen) Stabilität gegenüber der Wildtypform verbessert ist und daher besonders für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln geeignet ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher in einem ersten Aspekt eine Lipase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 oder S364, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Lipase umfassend das Substituieren einer Aminosäure an mindestens einer Position, die der Position 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 oder 364 in SEQ ID NO: 1 entspricht, in einer Aus- gangslipase, die mindestens 70 % Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, derart, dass die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R aufweist.
Eine Lipase im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung umfasst daher sowohl die Lipase als solche als auch eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase. Alle Ausführungen zur Lipase beziehen sich daher sowohl auf die Lipase als solche wie auch auf die mittels entsprechender Verfahren hergestellten Lipasen.
Weitere Aspekte der Erfindung betreffen die für diese Lipasen codierenden Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Lipasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen sowie erfin- dungsgemäße Lipasen umfassende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren, und Verwendungen der erfindungsgemäßen Lipasen in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Entfernung von fetthaltigen Anschmutzungen.
„Mindestens eine", wie hierin verwendet, bedeutete eine oder mehrere, d.h. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 oder mehr.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 oder 364 der Lipase aus Rhizopus oryzae gemäß SEQ ID NO: 1 , in einer Lipase, die eine zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 70% identische Aminosäuresequenz umfasst, derart, dass an mindestens einer der entsprechenden Positionen die Aminosäuren 142E, 149R, 195R, 204R, 2181, 287V, 292S, 294R, 302T, 308S, 309L, 335G, 364C oder 364R vorhanden sind, eine verbesserte (thermische) Stabilität dieser veränderten Lipase in Wasch- und Reinigungsmitteln bewirkt. Das ist insbesondere insoweit überraschend, als dass keine der oben genannten Aminosäuresubstitutionen zuvor mit einer erhöhten Stabilität der Lipase in Verbindung gebracht wurde.
Die erfindungsgemäßen Lipasen verfügen über eine erhöhte Stabilität in Wasch- oder Reinigungsmitteln, insbesondere gegenüber erhöhten Temperaturen. Solche leistungsverbesserten Lipasen ermöglichen verbesserte Waschergebnisse an lipolytisch-sensitiven Anschmutzungen in einem weiten Temperaturbereich.
Die erfindungsgemäßen Lipasen weisen enzymatische Aktivität auf, das heißt, sie sind zur Hydrolyse von Fetten und Ölen befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Lipase ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Esterbindungen in Lip- id-Substraten katalysiert und dadurch in der Lage ist, Fette oder Öle zu spalten. Ferner handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Lipase vorzugsweise um eine reife (mature) Lipase, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife (prozessierte) Enzyme.
In verschiedenen Ausführungsformen enthält die erfindungsgemäße Lipase mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der Gruppe bestehend aus K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C und S364R, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 1 , ausgewählt ist. In weiter bevorzugten Ausführungsformen enthält die erfindungsgemäße Lipase eine der folgenden Aminosäuresubstitutionsvarianten: (i) P308S; (ii) S195R und S364C; (iii) S195R und E335G; (iv) Q294R und S364R; (v) E287; (vi) N218I und I302T; (vii) P292S; (viii) E335G; oder (ix) K142E, I149R, K204R und Q309L, wobei die Nummerierung jeweils bezogen ist auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 1. ln einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Lipase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% und 98,8% identisch ist, und die an mindestens einer der Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 oder 364 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 , eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen 142E, 149R, 195R, 204R, 2181, 287V, 292S, 294R, 302T, 308S, 309L, 335G, 364C oder 364R aufweist. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet das Merkmal, dass eine Lipase die angegebenen Substitutionen aufweist, dass sie mindestens eine der entsprechenden Aminosäuren an den entsprechenden Positionen enthält, d.h. nicht alle der 14 Positionen anderweitig mutiert oder, beispielsweise durch Fragmentierung der Lipase, deletiert sind. Die Aminosäuresequenzen derartiger Lipasen, die erfindungsgemäß bevorzugt sind, sind in SEQ ID Nos: 2-10 angegeben.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera- tion of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer- Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert. Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem BLAST-Algorithmus bestimmt.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nuk- leotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet die Angabe, dass eine Aminosäu- repositon einer numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO: 1 entspricht daher, dass die entsprechende Position der numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO:1 in einem wie oben definierten Alignment zugeordnet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung gegenüber derjenigen einer Lipase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, nicht signifikant verringert ist, d.h. mindestens 80 % der Referenzwaschleistung besitzt, vorzugsweise mindestens 100 %, noch bevorzugter mindestens 1 10%. Die Reinigungsleistung kann in einem Waschsystem bestimmt werden, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Lipase enthält, wobei die zu vergleichenden Lipasen konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer Anschmutzung auf Baumwolle bestimmt wird durch Messung des Reinigungsgrades der gewaschenen Textilien. Beispielsweise kann der Waschvorgang für 70 Minuten bei einer Temperatur von 40°C erfolgen und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweisen. Die Konzentration der Lipase in dem für dieses Waschsystem bestimmten Waschmittel beträgt 0,001 -0,1 Gew.- %, vorzugsweise 0,01 bis 0,06 Gew.-%, bezogen auf aktives, gereinigtes Protein.
Ein flüssiges Referenzwaschmittel für ein solches Waschsystem kann wie folgt zusammengesetzt sein (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 7% Alkylbenzolsulfonsäure, 9% weitere anionische Ten- side, 4% C12-C18 Na-Salze von Fettsäuren (Seifen), 7% nicht-ionische Tenside, 0,7% Phospho- nate, 3,2% Zitronensäure, 3,0% NaOH, 0,04% Entschäumer, 5,7% 1 ,2-Propandiol, 0, 1 % Konser- vierungsstoffe, 2% Ethanol, 0,2% Farbstoff-Transfer-Inhibitor, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.
Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Reinigungsleistung beispielsweise bei 34,8°C unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie vorstehend angegeben, wobei der Waschvorgang vorzugsweise für 30 Minuten erfolgt.
Der Weißegrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Lipase wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann.
Die Lipaseaktivität kann ansonsten auch in fachüblicher Weise bestimmt werden, und zwar vorzugsweise wie beschrieben in Bruno Stellmach,„Bestimmungsmethoden Enzyme für Pharmazie, Lebensmittelchemie, Technik, Biochemie, Biologie, Medizin" (Steinkopff Verlag Darmstadt, 1988, S. 172ff). Hierbei werden Lipase-haltige Proben zu einer Olivenölemulsion in emulgator-haltigem Wasser gegeben und bei 30°C und pH 9,0 inkubiert. Dabei werden Fettsäuren freigesetzt. Diese werden mit einem Autotitrator über 20 Minuten laufend mit 0,01 N Natronlauge titriert, so dass der pH-Wert konstant bleibt („pH-stat-Titration"). Anhand des Natronlauge-Verbrauchs erfolgt mittels Bezug auf eine Referenzlipaseprobe die Bestimmung der Lipaseaktivität.
Ein alternativer Test zur Feststellung der lipolytischen Aktivität der erfindungsgemäßen Lipasen ist ein optisches Messverfahren, bevorzugt ein photometrisches Verfahren. Der hierfür geeignete Test umfasst die Lipase-abhängige Spaltung des Substrats para-Nitrophenol-butyrate (pNP-butyrate). Dieses wird durch die Lipase in para-Nitrophenolat und Butyrat gespalten. Die Anwesenheit von para-Nitrophenolat kann unter Verwendung eines Photometers, z.B. des Tecan Sunrise Geräts und der XFLUOR Software, bei 405 nm ermittelt werden und ermöglicht somit einen Rückschluss auf die enzymatische Aktivität der Lipase. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration kann diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors und Bestimmung der Restaktivität (vgl. M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), S. 5890-5913) erfolgen.
Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten Aminosäureveränderungen können erfindungsgemäße Lipasen weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-Substitutionen,
-Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Lipasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Lipasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.
Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Lipase noch weiter erhöht und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Lipase, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber erhöhten Temperaturen, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird hierin folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein Δ angegeben. Beispielsweise beschreibt K142E die Substitution von Lysin an Position 142 durch Glutaminsäure, K142KE die Insertion von Glutaminsäure nach der Aminosäure Lysin an Position 142 und K142* oder AK142 die Deletion von Lysin an Position 142. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Lipase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Lipase wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, wobei die Lipase in der Zählung gemäß SEQ ID NO: 1 noch mindestens eine der erfindungsgemäßen Aminosäuresubstitutionen an den Positionen, die Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 in SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist, wie vorstehend beschrieben. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
Alternativ oder ergänzend ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Lipase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 361 , 362, 363, 364 oder 365 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die im Ausgangsmolekül enthaltene(n) Aminosäuresubstitution(en) an einer oder mehreren der Positionen, die Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 in SEQ ID NO:1 entsprechen, noch vorhanden ist/sind.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die lipolytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Ersetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre lipolytische Aktivität, d.h. ihre lipolytische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die lipolytische Aktivität mindestens 80, vorzugsweise mindestens 90 % der Aktivität des Ausgangsenzyms. Auch weitere Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Alternativ oder ergänzend ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Lipase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Ami- nosäuresubstitution, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist.
In weiteren Ausführungsformen ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Lipase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Inser- tions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360 oder 366 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, umfasst.
Die weiteren Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Lipase mit der Aminosäuresequenz der Lipase aus Rhizopus oryzae, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist, definiert. Weiterhin richtet sich die Zuordnung der Positionen nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Lipase eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Lipase aus Rhizopus oryzae gemäß SEQ ID NO. 1 . Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Lipase aus Rhizopus oryzae sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Lipase diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind.
Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Lipase aus Rhizopus oryzae, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Lipasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Lipase vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen, die in einem Alignment den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 in SEQ ID NO: 1 entsprechen, d.h. in der Zählung gemäß SEQ ID NO: 1. An den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Lipase aus Rhizopus oryzae folgende Aminosäurereste: K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 und S364.
Eine weitere Bestätigung der korrekten Zuordnung der zu verändernden Aminosäuren, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Lipasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die en- zymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Lipase aus Rhizopus oryzae gemäß SEQ ID NO: 1 mit einer Veränderung eines enzymatischen Parameters einher, beispielsweise mit der Erhöhung des «M-Wertes, und wird eine entsprechende Veränderung des enzymatischen Parameters, beispielsweise also ebenfalls eine Erhöhung des «M-Wertes, in einer erfindungsgemäßen Lipase-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin eine Bestätigung der korrekten Zuordnung zu sehen.
Alle genannten Sachverhalte sind auch auf die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Lipase anwendbar. Demnach umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren ferner einen oder mehrere der folgenden Verfahrensschritte: a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, umfasst; b) Veränderung der Aminosäuresequenz durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Sub- stitutionsmutagenese derart, dass die Lipase eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360 oder 366 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, umfasst.
Sämtliche Ausführungen gelten auch für die erfindungsgemäßen Verfahren.
In weiteren Ausgestaltungen der Erfindung ist die Lipase beziehungsweise die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase noch mindestens zu 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, oder 98,8% identisch zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge. Alternativ ist die Lipase beziehungsweise die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase noch mindestens zu 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, oder 98% identisch zu einer der in SEQ ID Nos:2-10 angegebenen Aminosäuresequenzen über deren Gesamtlänge. Die Lipase beziehungsweise die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase weist eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 oder S364, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , auf. In bevorzugteren Ausführungsformen ist die Aminosäuresubstitution mindestens eine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K142E, I149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C und S364R, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1. In weiter bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Lipase eine der folgenden Aminosäuresubstitutionsvarianten: (i) P308S; (ii) S195R und S364C; (iii) S195R und E335G; (iv) Q294R und S364R; (v) E287; (vi) N218I und I302T; (vii) P292S; (viii) E335G; oder (ix) K142E, I149R, K204R und Q309L.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Lipase, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Muationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:
- Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf oder an der Oberfläche des Proteins bewirken;
- Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Lipase wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Lipase mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Lipase ist derivatisiert.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen kön- nen beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Car- boxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter De- rivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymati- sche Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immu- nogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.
Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen kombiniert sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Lipasen mit spezifischen Inhibitoren ist diesbezüglich möglich.
Unter allen vorstehend beschriebenen Lipasen beziehungsweise Lipasevarianten und/oder Derivaten sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders bevorzugt, deren Stabilität und/oder Aktivität mindestens einer derjenigen der Lipasen gemäß SEQ ID Nos: 2-10 entspricht, und/oder deren Reinigungsleistung mindestens einer derjenigen der Lipasen gemäß SEQ ID Nos: 2-10 entspricht, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird wie vorstehend beschrieben. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Lipa- se codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungs- vektor oder ein Expressionsvektor.
Hierbei kann es sich um DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Lipasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Ma- niatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press, bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generatio- nen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren.
Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopro- pyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac- Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Lipase beinhaltet, insbesondere eine, die die Lipase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile oder -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Lipasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Lipase funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernier- te Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von E- scherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloli- quefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausa, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas mal- tophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu proka- ryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophi- le pilzliche Express ionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Lipasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Lipase umfassend
a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, und
b) Isolieren der Lipase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Lipasen. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Lipase beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Lipase erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Die hergestellte Lipase kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Lipase aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Lipase in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Lipase aus der Wirts- zelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Lipasen herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Lipase wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel als ein Wasch- oder Reinigungsmittel.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Lipase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Persauer- stoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten. Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Lipase mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) des Mittels ist vorteilhaft, da ein solches Mittel in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausgestaltungen eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Lipase mit einem Tensid und/oder einem Builder (Gerüststoff) und/oder einer Persauerstoffverbindung und/oder einem Bleichaktivator kann ein solcher Synergismus erreicht werden.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Lipase vorteilhafterweise in einer Menge von 2μg bis 20mg, vorzugsweise von 5μg bis 17,5mg, besonders bevorzugt von 20μg bis 15mg und ganz besonders bevorzugt von 50μg bis 10mg pro g des Mittels. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Lipase, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Lipase undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Wasch- oder Reinigungsmittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es
(a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder
(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder
(c) in gelförmiger oder dosierbeutelförmiger (Pouches) Form vorliegt, und/oder
(d) als Einkomponentensystem vorliegt, oder
(e) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Lipase enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicel- lulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder andere - von den erfindungsgemäßen Lipasen unterscheidbare - Lipasen, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10~7-3 Gew.-%, von 0,00001-1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0, 1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solcher Synergismus vor zwischen der erfindungsgemäß enthaltenen Lipase und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen der genannten Lipase und einer Amylase und/oder einer Protease und/oder einer Mannanase und/oder einer Cellulase und/oder einer Pektinase. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Lipase katalytisch aktiv wird, insbesondere derart, dass die Lipase in einer Menge von 40μg bis 4g, vorzugsweise von 50μg bis 3g, besonders bevorzugt von 100μg bis 2g und ganz besonders bevorzugt von 200μg bis 1g eingesetzt wird.
In verschieden Ausführungsformen zeichnet sich das oben beschriebene Verfahren dadurch aus, dass die Lipase bei einer Temperatur von 0-100 , bevorzugt 0-60 , weiter bevorzugt 20-40°C und am meisten bevorzugt bei 34,8°C eingesetzt wird. Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels oder einer erfindungsgemäßen Lipase bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Lipasen und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Da erfindungsgemäße Lipasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einzige Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass als einzige reinigungsaktive Komponente eine erfindungsgemäße Lipase mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Lipase aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Schließlich erfasst die Erfindung auch die Verwendung der hierin beschriebenen Lipasen in Wasch- oder Reinigungsmitteln, beispielsweise wie oben beschrieben, zur (verbesserten) Entfernung von fetthaltigen Anschmutzungen, beispielsweise von Textilien oder harten Oberflächen.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Lipase und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis„Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Übersicht über die Mutationen:
Beispiel 1 : Bestimmen der Thermostabilität von LipRO in einer Waschmittelmatrix:
Die MTP-Expression in E.coli von einer Lipase aus Rhizopus oryzae mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sowie den Varianten mit den AS-Sequenzen gemäß SEQ ID Nos. 2-10, wurde mit der Zugabe von IPTG nach 2-stündiger Kultivierung bei 37°C induziert. Danach wurden die Platten bei 30°C für 4 h kultiviert. Die Zellpellets wurden in 150 μΙ Lysozym-Lösung (1 mgxml in TEA-Puffer; 50 mM, pH 7,4) resuspendiert. Anschließend wurden die Platten bei 37°C inkubiert und bei 900 UpM für 1 Stunde zentrifugiert. Danach wurden die Mikrotiterplatten für 15 min zentri- fugiert (4000xg, 4°C) und der klare Überstand wurde für den Thermostabilitätstest verwendet. In eine PCR-Mikrotiterplatte wurde 40 μΙ klarer Überstand überführt und zusammen mit einer Henkel Matrix (1 :200 in TEA-Puffer) für 30 Minuten in einem PCR-Thermocycler zwischen 30 und 40°C inkubiert (1 . Schritt). Danach wurde die PCR-Mikrotiterplatte für 5 min auf Eis gekühlt und 40 μΙ Überstand wurde für den pNP-Butyrat-Assay verwendet (2. Schritt). Folgende Waschmittelmatrix wurde verwendet (LSPA+):
Diese Matrix wird für die Messungen mit Stabilisator noch mit 1 % Borsäure versehen.
Aktivitätsassay
Zur Identifizierung von Varianten mit verbesserter Thermostabilität wurde ein Mikrotiterplatten basierter Assay unter Verwendung von para-Nitrophenol-Butyrat (pNP Butyrat) als Substrat verwendet. Bei enzymatischer Hydrolyse im wässrigen Medium wurden para-Nitrophenolat und Butyrat freigesetzt und anschließend wurde para-Nitrophenolat durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm detektiert. Für das Screening auf Thermostabilität wurden die Platten parallel bei 34.8°C und bei RT inkubiert. Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 40 μΙ klarer Überstand, der nach Zelllyse und Zentrifugation erhalten wurde, wurde auf 10 μΙ Matrix-Lösung (1 :200- Verdünnung in 50 mM TEA Puffer, pH 7,4) gegeben und gemischt. Anschließend wurde eine Platte für 30 Minuten bei 34,8°C in einem PCR-Cycler inkubiert, gefolgt von einer 5 minütigen Inkubation auf Eis. Die RT-Platte wurde 35 Minuten bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden 40 μΙ der Reaktionsmischung in eine neue MTP überführt. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 60 μΙ frisch hergestellter pNP-Butyrat-Lösung (Endkonzentration 1 ,5 mM) eingeleitet und der Anstieg der Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm unter Verwendung des Tecan Sunrise und XFLUOR Software gemessen. Die Absorption wurde im Accuracy-Mode über 60 Zyklen in 7-sec- Intervallen gemessen und die Platten wurden innerhalb des Lesegeräts für 2 Minuten geschüttelt.
Herstellung von 100 mM pNP-Butyrat (Stammlösung):
17,6 μΙ pNP-Butyrat vermischt mit 983 μΙ Acetonitril Arbeits-pNP-Butyrat-Konzentrationen:
7800 μΙ von 50 mM TEA Puffer, pH 7,4 wurde mit 200 μΙ 100 mM pNP-Butyrat vermischt
Die Verdünnung der pNP-Butyrat Stammlösung zur Arbeitskonzentration muss aufgrund der hohen Autohydrolyse vor der Messung erfolgen.
Unten angegeben sind die Aktivitätsverhältnisse von LipRO-Varianten im pNP-Butyrat-MTP-Assay. Das Aktivitätsverhältnis wurde durch Dividieren (Steigung/min Aktivitätswert) bei 34,8°C durch (Steigung/min Aktivitätswert) bei RT berechnet:
Varianten 5 und 1 1 stellen Vergleichsbeispiele dar, in denen die Aminosäuresubstitutionen keine Verbesserung der Stabilität bewirkten.

Claims

Patentansprüche
1. Lipase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und die eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen K142, 1149, S195, K204, N218, E287, P292, Q294, I302, P308, Q309, E335 oder S364, jeweils bezogen auf die Num- merierung gemäß SEQ ID NO:1 , aufweist.
2. Lipase nach Anspruch 1 , wobei die mindestens eine Aminosäuresubstitution aus der Gruppe bestehend aus K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C und S364R, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , ausgewählt ist.
3. Lipase nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Lipase eine der folgenden Aminosäuresubstitutionsvarianten aufweist:
(i) P308S;
(ü) S195R und S364C;
(Iii) S195R und E335G;
(iv) Q294R und S364R;
(v) E287;
(vi) N218I und I302T;
(vii) P292S;
(viii) E335G; oder
(iv) K142E, I 149R, K204R und Q309L
4. Lipase, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) sie aus einer Lipase nach Anspruch 1 -3 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist; und/oder
(b) sie aus einer Lipase nach Anspruch 1 -3 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 361 , 362, 363, 364 oder 365 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, umfasst.
5. Verfahren zur Herstellung einer Lipase umfassend das Substituieren einer Aminosäure an mindestens einer der Positionen, die Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 in SEQ ID NO: 1 entsprechen, in einer Ausgangslipase, die mindestens 70 % Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, vorzugsweise derart, dass die Lipase an mindestens einer Position die Aminosäuresubstitution K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 5, ferner umfassend einen oder beide der folgenden Verfahrensschritte:
(a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, umfasst;
b) Veränderung der Aminosäuresequenz durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese derart, dass die Lipase eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 361 , 362, 363, 364 oder 365 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Lipase mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K142E, I 149R, S195R, K204R, N218I, E287V, P292S, Q294R, I302T, P308S, Q309L, E335G, S364C oder S364R an den Positionen, die den Positionen 142, 149, 195, 204, 218, 287, 292, 294, 302, 308, 309, 335 und 364 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, umfasst.
7. Nukleinsäure kodierend für eine Lipase nach einem der Ansprüche 1 -4 oder kodierend für eine nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6 erhältliche Lipase.
8. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
9. Nicht-menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder einen Vektor nach Anspruch 8 beinhaltet, oder die eine Lipase nach einem der Ansprüche 1-4 beinhaltet, oder die eine nach einem Verfahren der Ansprüche 5 oder 6 erhältliche Lipase beinhaltet.
10. Verfahren zur Herstellung einer Lipase umfassend
a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 9; und
b) Isolieren der Lipase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
1 1. Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Lipase nach einem der Ansprüche 1-4 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 5 oder 6 erhältliche Lipase enthält.
12. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach Anspruch 1 1 angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Lipase nach einem der Ansprüche 1-4 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 5 oder 6 erhältliche Lipase angewendet wird.
13. Verwendung einer Lipase nach einem der Ansprüche 1 -4 oder einer nach einem Verfahren der Ansprüche 5 oder 6 erhältlichen Lipase in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von fetthaltigen Anschmutzungen.
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