EP3532086A1 - Nouvel oligonucleotide double brin bisquecifiques pour le traitement des cancers - Google Patents

Nouvel oligonucleotide double brin bisquecifiques pour le traitement des cancers

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EP3532086A1
EP3532086A1 EP17800566.6A EP17800566A EP3532086A1 EP 3532086 A1 EP3532086 A1 EP 3532086A1 EP 17800566 A EP17800566 A EP 17800566A EP 3532086 A1 EP3532086 A1 EP 3532086A1
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EP
European Patent Office
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sirna
composition
siarh2ax
h2ax
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17800566.6A
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Florence Cabon
Hilary BROOKS
Stéphanie DELMAS
Maud CHUSSEAU
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Selexel
Original Assignee
Selexel
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Publication date
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    • C12N2310/30—Chemical structure
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Definitions

  • the present invention relates to a bispecific double-stranded oligonucleotide, at the same time targeting the androgen receptor and histone H2AX.
  • the cells of our organism undergo every day a large number of lesions of the DNA, provoked either by their metabolism which produces for example reactive species of the oxygen, or by their environment, in particular by the ionizing radiation or UV, agents physical or chemical, including certain drugs (https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_damage_(naturally_occurring).)
  • Cells have developed several mechanisms of verification and repair during evolution to maintain the integrity of the genome
  • tumor suppressor proteins such as p53, orchestrate the blockage of cell division and the activation of repair mechanisms, and most lesions are normally repaired. Beyond a certain threshold of damage to the DNA however, the cell is no longer viable, enters apoptosis and dies.
  • cancer cells accumulate a large number of DNA lesions because their DNA repair mechanisms are frequently deficient and / or because they are more resistant to apoptosis than normal cells.
  • the threshold of damage to DNA leading to cell death is higher in a tumor cell than in a normal cell.
  • DNA lesions occur in a context where DNA is not linear but is compacted by nucleosomes consisting of histones. Some histones play a role of structure, others, like H2AX, are key in the functioning or the repair of the genome, H2AX is a histone expressed in all the cells of the body.
  • H2AX is a histone expressed in all the cells of the body.
  • the phosphorylation of H2AX then noted ⁇ 2 ⁇ , for example by proteins such as DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ATM (mutated in ataxia-telangiectasia) or ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related), is a major event. and early in DNA repair, which allows for the recruitment and assembly of many other proteins needed to repair the lesion.
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • ATM mutated in ataxia-telangiectasia
  • ATR ataxia telangiectasia and Rad3-
  • H2AX can also be acetylated on lysine 36 by CBP / P300 and on threonine 101, and these two posttranslational modifications allow cells to survive ionizing radiation independently of the phosphorylation of H2AX.
  • Inhibiting the expression of H2AX in a cell, particularly in a cancer cell, is a method that prevents the repair of DNA damage.
  • inhibition of H2AX expression alone is not sufficient to induce cell death (Yuan and Chen, 2010).
  • Radiation therapy or certain chemotherapies have been developed to treat cancers by increasing the number of DNA lesions to exceed the threshold compatible with cell viability, threshold above which the apoptosis of the cancer cell is triggered. . These treatments work by inducing DNA damage and / or preventing the repair of lesions present in cancer cells. Radiation therapy is now essential in oncology since it is programmed in two thirds of treatment regimens, either alone or associated with surgery and / or chemotherapy. These treatments induce DNA damage, and in particular double-strand breaks (DSB).
  • DSB double-strand breaks
  • Cytotoxic chemotherapy aims to block the divisions of cancer cells and / or to induce their apoptosis. Most of these treatments lead to the accumulation of DNA lesions in the cell, either directly because of their mode of action. creates new lesions, either by preventing DNA repair or by keeping the cell at a cell cycle stage, or the repair processes are not very active. However, the many genome-testing and repair mechanisms that attempt to repair DNA damage reduce the effectiveness of these chemotherapy or radiation treatments.
  • the inhibition of H2AX thus provides a means of enhancing cell death induced by radiotherapy or chemotherapy treatments inducing DNA damage or preventing their repair.
  • AR The androgen receptor
  • AR is a transcription factor whose activity is regulated by its ligands. AR is expressed in both men and women by many cell types in most tissues and organs and in the hematopoietic system. AR regulates the expression of very many genes involved, for example, in proliferation, migration, survival, invasion, production of growth factors.
  • a deregulation of the expression or the functioning of AR for example and in a non-limiting way by overexpression, mutation, alternative splicing, post-translational modification or protein partner change, is described in the initiation, the maintenance and progression of various carcinomas, sarcomas, myelomas and leukemias, for example and in a non-limiting manner, certain cancers of the prostate, breast, ovary, bladder, liver, colon, stomach, adrenal and salivary glands, thymus, thyroid, uterus, peritoneum, pancreas, testes, kidney, skin, brain, nasopharynx, head and neck, meninges, lungs, testes, bones (Munoz et al., 2015).
  • Castration which prevents the production of AR ligands and therefore the transcriptional activity of AR, is a therapeutic strategy whose efficacy has been clinically demonstrated in prostate cancer.
  • the effectiveness of these treatments is transient and patients relapse systematically. There is therefore a real need for these cancers to improve the effectiveness of treatments targeting the AR signaling pathway.
  • AR is expressed in most cells of the body, and the deregulation of its expression or function is described in many cancers other than those of the prostate, the inhibition of the RA signaling pathway has not been shown to be sufficient to treat previously developed cancers in humans other than prostate cancer.
  • the proliferation of other cancer cells for example from breast tumors, melanomas or glioblastoma, which express AR at levels ranging from very low to high is not affected by the inhibition of this signaling path, as illustrated in the examples below.
  • the present invention is based on the unexpected results of the inventors according to which certain particular double-stranded oligonucleotides are bi-specific, since they simultaneously and specifically inhibit the expression of histone H2AX and that of the androgen receptor, which effectively inhibits the proliferation and survival of cells.
  • This effect of simultaneous inhibition of AR and H2AX can be enhanced by combining with a chemotherapy or radiation treatment that increases the number of DNA lesions or prevents their repair.
  • Micro RNAs are small double-stranded RNAs of about twenty nucleotides encoded by the genome of all eukaryotic organisms. After transcription and maturation, they are loaded into a protein complex: RNA Induced Silencing Complex (RISC).
  • RISC RNA Induced Silencing Complex
  • Hybridization with one or more mRNAs of nucleotides 2 to 8 inclusive of miRNA is of particular importance to trigger the mechanism of RNA interference.
  • a miRNA can hybridize with several target mRNAs and regulate their stability or translation. No computer or other tool can accurately predict the mRNAs regulated by a given miRNA (Gorski et al., 2017).
  • Interfering RNAs or Small Interfering RNAs are synthetic double-stranded oligoribonucleotides that when introduced into cells mimic the action of miRNAs, hybridize with their target mRNA, and trigger the RNA interference mechanism. Like miRNAs, they can hybridize incompletely with other mRNAs, and computer tools do not accurately predict among those many possible incomplete hybridizations those that interfere with mRNA and disrupt function. These so-called off-target effects are generally undesirable because they can produce potentially toxic biological effects that, if not predicable, must therefore be evaluated experimentally. Using multiple siRNAs simultaneously multiplies the number of potential off-target effects and therefore the risk of toxicity. To choose the sequence of a siRNA for inhibiting the expression of a gene of interest, there are many computer tools. These tools are designed so that the chosen siRNA hybridizes with only one mRNA so as to avoid off-target effects.
  • siRNAs are not comparable to any other type of oligonucleotide such as ribozymes, morpholinos, triple helix oligonucleotides, antisense RNA or antisense DNA oligonucleotides (ODN).
  • oligonucleotide such as ribozymes, morpholinos, triple helix oligonucleotides, antisense RNA or antisense DNA oligonucleotides (ODN).
  • the present invention is based on the unexpected results of the inventors according to which certain particular siRNAs described in Table 1, which hybridize perfectly with the mRNA encoding the receptor of androgens, which inhibit their expression, are bt-specific because they also partially hybridize with the mRNA encoding H2AX as described in Figure 1 and also specifically inhibit expression.
  • the present invention aims at providing a means for simultaneously inhibiting the expression of the androgen receptor and H2AX by the use of a bispecific siRNA.
  • the use of a bispecific AR-H2AX siRNA inhibiting both AR and H2AX, has a specific advantage over a siRNA targeting only AR, or a siRNA targeting only H2AX.
  • siRNAs are preferable to the combination of two siRNAs, one targeting AR and the other targeting H2AX, to limit the potentially toxic off-target effects of such a combination, and to facilitate the development clinical and industrial applications of this use.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one bispecific siRNA, defined as wholly or partially hybridizing with both an androgen receptor-encoding mRNA and an H2AX-encoding mRNA, such that this hybridization induces the degradation of these mRNAs or inhibits their translation
  • said siRNA being chosen from siRNA siARH2AX-1, SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or siARH2AX-1b, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4 , as described in Table 1, for its use in the prevention and / or treatment of cancer, wherein said siRNA is used in combination with a therapy resulting in DNA damage or preventing their repair.
  • partial hybridization is meant the hybridization of a sufficient number of nucleotides of the bispecific siRNA of the invention with the sequence of the androgen receptor mRNA or with that of H2AX to cause either cleavage or inhibition of the translation of the mRNA with which it hybridizes, which leads to a decrease in the expression of the protein encoded by mRNA, a decrease that can be measured, for example, by a Western blot immunoassay or immunofluorescence immunoassay. indirect.
  • this hybridization may involve 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nucleotides, or more if the siRNA has more nucleotides, for example 20, 21,
  • the percentage of hybridization can be between 30 and 95%.
  • said prevention and / or said treatment is carried out in a human patient or in a mammal.
  • siRNA sequences of the present invention are shown in Table 1.
  • the expression "at least 75% identity with a sequence" in Table 1 means 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99% and 100%, including 79%, 81%, 84%, 86%, 90%, 95% and 99%.
  • siRNAs whose sequence is 100% identical to that of the siRNAs shown in Table 1 hybridize 100% with a region of the androgen receptor-encoding mRNA transcribed from exon 1. , all these siRNAs inhibit the expression of all forms of androgen receptor splicing expressed in cancer cells, including those partially or completely deletions of the ligand binding domain, such as, for example, the AR-V7 receptor variants expressed in certain cancers.
  • siRNA guide strand nucleation region siARH2AX-1 and siARH2AX-1b is also perfectly complementary to the mRNA encoding H2AX.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA may have chemical modifications on one and / or the other strand, on one or more nucleotides located at the 3 'or 5' terminal ends, and / or or on one or more nucleotides constituting the internal skeleton.
  • said chemical modifications are located on the ribose and / or the base and / or the phosphoric acid.
  • Said chemical modifications comprise, for example, at least one substitution of the 2 'OH group of the ribose with a 2'-O-group.
  • RNA (2'OMe) or 2'-O-methoxyethyl (2'MOE) or 2'-fluoro (2'F) or 2'-fluoro-p ⁇ arabinonucleotide (FANA), an alkylation of oxygen in 2 aminoethyl-, guanidinoethyl-, cyanoethyi- or allyl, phosphodiester group replacement by phosphorothioate, alkylation or thiloation of one or more nucleotides of the oligonucleotide, replacement of a ribonucleotide with a deoxyribonucleotide, or replacement thereof of a nucleotide by a Locked Nucleic Acid (LNA).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification.
  • said siRNA is devoid of chemical modification, and comprises two deoxynucleotides overflowing at the 3 'end, in particular two deoxythymidines.
  • said siRNA is devoid of chemical modification, and does not comprise two deoxynucleotides overflowing at the 3 'end, in particular two deoxythymidines.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is formulated in a composition that allows its penetration into tumor cells.
  • a targeting agent is an agent that facilitates the penetration of a siRNA into the cells of the body.
  • This agent may be chemically conjugated to either strand of siRNA, or noncovalently associated with siRNA.
  • These include, for example, lipids, polymers, peptides, dendrimers, simple or complex sugars, polyethyleneimine derivatives, nanoparticles, magnetic spheres, or inorganic or organic nanostructures.
  • said composition contains an addressing molecule.
  • an addressing molecule is a molecule addressing the siRNA towards a particular cell type, for example endothelial cells or cancer cells.
  • An addressing molecule is not intended to penetrate the siRNA inside the cell or to penetrate with the siRNA but to increase its concentration to the outer membrane of the cell of interest.
  • an addressing molecule may be an aptamer, an antibody, transferrin, an RGD peptide, the ligand of a receptor, this targeting molecule interacting or binding to a molecule expressed on the surface of the targeted cells, such as for example and without limitation a receptor, an integrin, a membrane antigen such as for example PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) or the CD36 receiver.
  • a targeting molecule such as for example and without limitation a receptor, an integrin, a membrane antigen such as for example PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) or the CD36 receiver.
  • this targeting molecule is a CD36 receptor ligand, for example oxidized LDLs, or hexareiine peptide or a long chain fatty acid (more than 16 carbons), or a mixture of these components two by two or three to three.
  • CD36 receptor ligand for example oxidized LDLs, or hexareiine peptide or a long chain fatty acid (more than 16 carbons), or a mixture of these components two by two or three to three.
  • the abovementioned composition contains oxidized LDLs in a weight: weight ratio of 1 siRNA for 0.01 to 10 oxidized LDLs and preferably 0.1 to 1, or hexarelin peptide, in a weight: weight ratio of 1 siRNA for 0.01 to 10 hexarelin, preferably 0.1 to 1.
  • the addressing molecule may be either associated with siRNA without a covalent bond, or covalently coupled with either siRNA strand, or incorporated into a targeting agent, for example a nanoparticle or a liposome containing siRNA, so as to address the targeting agent to the target cell or tissue.
  • said composition contains neither a targeting agent nor an addressing molecule.
  • said composition contains a vectorization agent but no addressing molecule.
  • said composition contains an addressing molecule but no targeting agent.
  • the targeting molecule is in particular a CD36 ligand, and more particularly oxidized LDL or helix 'areline.
  • said composition contains a targeting agent and an addressing molecule.
  • the targeting molecule is in particular a CD36 ligand, and more particularly oxidized LDL or hexarelin.
  • said composition containing said bispecific siAR-H2AX siRNA is formulated to be administered locally or ioco regionally, in particular by intratumoral administration, in single dose or by repeated injections, intermittently or else still continuously by the use of an external pump or implantable, or any other device, or biodegradable compound allowing a slow and continuous release of the composition in the vicinity or in the tumor to be treated (intra-tumor administration).
  • the continuous mode of administration aims to keep the concentration of the siRNA substantially constant throughout the entire period of administration of the siRNA in the tissue if it is a local or loco regional administration or in blood and peripheral tissues if it is a systemic administration.
  • the phrase "maintain substantially constant" means that the concentration of siRNA in the blood and peripheral tissues may vary slightly depending on the metabolism of the individual receiving said composition.
  • continuous is meant the uninterrupted administration of the composition for a period of 1 day to several months, for example 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days , 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 9 months, 1 year, 2 years.
  • the siRNA delivered in a continuous mode of delivery is delivered continuously for a period of time greater than or equal to 2 days.
  • the siRNA delivered according to a continuous administration mode is delivered without the administration being interrupted beyond the time necessary to recharge or exchange the device delivering the siRNA, for example 4 hours, for a duration of administration ranging from 2 days to 1 year, for example 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 9 months, 1 year.
  • the siRNA delivered according to a continuous mode of administration is delivered in successive cycles, interrupted by a period without treatment ranging from more than 24 hours to a few weeks, each cycle being defined by continuous administration. without interruption greater than the time required to recharge or exchange the device delivering the siRNA, for example 4 hours, and for a duration of administration ranging from 2 days to 1 month.
  • intermittent administration is understood to mean any mode of administration in which the period of administration of the product (for example, 10 seconds, 1 minute, 1 hour, 2 hours, 4 hours, etc.) is followed by a period during which the product is not administered (for example, 1 hour, 2 hours, 6 hours, 24 hours, 1 week ). It may, for example and without limitation, be a bolus administration, single or repeated over time or a slow infusion over a period of a few hours, leading over time to significant variation the concentration of the product in the tissue or organism.
  • siARNA bispecific siRNA which distributes them in several tissues and organs, is therefore advantageous for treating cancers that are metastasized or likely to become so.
  • systemic means that the siRNA is conveyed in the body to act at a distance from the place where it is administered, as opposed to a local or loco-regional administration, in particular as opposed to an administration. intratumoral.
  • the systemic distribution in the body is obtained by any method that results in a passage of siRNA in extracellular fluids such as blood, lymph or cerebrospinal fluid, that the compound containing the siRNA is ingested (orally).
  • systemic administration can be carried out by administering a single or repeated dose of said composition, intermittently or else by the use of an external or implantable pump, or any other device, or biodegradable compound allowing a slow and continuous release of said composition, such that the siARH2AX bispecific siRNA is systemically transported via the extracellular fluids in the body.
  • said method of systemic administration is selected from the subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intradermal, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, intrathecal, intracerebral, oral administration mode, and is especially subcutaneous.
  • said mode of administration is continuous, subcutaneously.
  • the siARH2AXs according to the invention are administered systemically or locally by being formulated in an acidic pH buffer solution.
  • a buffer solution according to the present invention provides the pH stability of the siRNA dilution solution. Examples of such buffers are given in Table 3.
  • the pH of the buffer solution is acid, ranging from pH 3 to pH 7, preferably from pH 5 to pH 6.5 and preferentially to pH 6.
  • the buffer solution is a citrate or histidine buffer at pH 6.
  • the SiARH2AX siRNAs according to the invention are administered systemically or locally in an acidic pH buffer solution supplemented with cations derived from inorganic or organic salts. These cations within the meaning of the invention are not constituents of the buffer solution, they are not intended to ensure a buffer effect, but they are added to this buffer solution.
  • these cations are, for example and without limitation, polyamines, in particular putrescine, and / or spermidine, and / or spermine, and / or salts whose cation is chosen from metal cations such as, for example, Zn2 +, Co2 + , Cu2 +, Mn2 +, Ca2 +, Mg2 +, Fe2 +, the counterion being of any nature, for example a chloride, nitrate, sulfate or carbonate ion.
  • the buffer solution contains MgCl 2, ZnCl 2, MnCl 2, or a two-by-two mixture of these salts, or a mixture of the three salts.
  • the concentration of each cation is from 0.02 mM to 200 mM, preferably from 0.05 to 100 mM and preferably from 1 to 50 mM.
  • the cations are added to a buffer solution which is a citrate buffer or a histidine buffer.
  • a buffer solution which is a citrate buffer or a histidine buffer.
  • the pH of this solution is 6.
  • said composition is formulated for a mode of administration of siRNA siRNA bispecific at a therapeutically effective dose, and in particular at doses of 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, in particular 0.01 mg / kg / day to 10 mg / kg / day.
  • "0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day” means all doses ranging from 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, eg 0.008; 0.01; 0.05; 0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 10.0; 10.5; 14.0; 14.5; 20; 20.5; 25; 25.5; 29.5 mg / kg / day.
  • said composition is used in combination with a treatment inducing DNA lesions or preventing their repair and said treatment being chosen from radiotherapy and / or chemotherapy.
  • Radiotherapy refers to a method of locoregional treatment of cancers, using radiation to destroy cancer cells by blocking their ability to multiply.
  • the technique and the modalities of radiotherapeutic treatment, in particular the doses of radiation delivered, are adapted according to the cancer and the patient.
  • Radiotherapy is the best known and the most used.
  • the radiation source outside the patient, produces high energy X-ray beams and electron beams.
  • - Brachytherapy also called brachytherapy
  • brachytherapy is a local radiotherapy by implantation of grains or radioactive needles. Such a therapy is especially used in the treatment of prostate cancers.
  • - Vector-based metabolic radiotherapy is a radiotherapy technique based on oral administration or injection of a radio-labeled radio-labeled agent.
  • the radioactive isotope will bind preferentially to the diseased target cells.
  • iodine 131 binds to the thyroid.
  • the metastatic bone pain can thus be treated, for example, by injection of samarium 153, strontium-labeled liquid strontium chloride 894, or radium-223 chloride.
  • Chemotherapy refers to a drug treatment (cytostatic and antineoplastic chemotherapeutic agents) against cancer.
  • said chemotherapy resulting in lesions of the DNA or preventing their repair is carried out using at least one chemotherapeutic agent chosen from: alkylating agents, anti-metabolites, cytotoxic antibiotics, inhibitors topoisomerase I inhibitors, topoisomerase II inhibitors, anti-tumor antibiotics, genotoxic agents, PARP inhibitors (poly (ADP-ribose) polymerase), microtubule-forming and dissociation inhibiting agents, such as vinca alkaloids, taxanes or epothilones,
  • a chemotherapeutic agent is chosen in particular from:
  • said therapy resulting in lesions of DNA or preventing their repair and the administration of said composition containing at least one bispecific SiAR-H2AX siRNA are simultaneous or successive.
  • the term "successive” is understood according to the invention of the expression “separated, spread over time”.
  • the invention also relates to a combination product containing:
  • siRNA chosen from: if ARH2AX-1, siARH2AX-1b and
  • At least one chemotherapeutic agent causing damage to the DNA or preventing its repair
  • the invention also relates to a combination product containing:
  • siRNA chosen from: siARH2AX-1, siARH2AX-1b and
  • At least one radiopharmaceutical agent which causes a lesion of the DNA at least one radiopharmaceutical agent which causes a lesion of the DNA
  • the invention also provides a combination product formulated for intermittent or continuous local administration containing:
  • siRNA chosen from: siARH2AX-1, siARH2AX-1b and
  • the cancer is a primary tumor, or a metastasis of a primary tumor.
  • the cancer is adrenocortical, esophageal, gastric, basal cell, thyroid, or uterine carcinoma, astrocytoma, glioblastoma, oligodendroglioma, meningioma, thymoma, lymphoma, melanoma, or non-melanoma skin cancer, leukemia, mesothelioma, cholangiocarcinoma, myeloma, gastrointestinal cancer, bladder, breast, cervix, head and neck, non-malignant lung small cells, ovary, pancreas, prostate, testis, thymus, kidney, salivary gland, endometrium, anus, colon, appendix, mouth , bronchi and / or upper airways, bile duct, nasal and paranasal cavity, brain, heart, stomach, liver, throat, tongue, lips, nasopharynx, esophagus, bones, par
  • said composition comprising at least one bispecific siRNA, said siRNA hybridizing wholly or partially with both an androgen receptor-encoding mRNA and an H2AX-encoding mRNA, such that hybridization induces the degradation of these mRNAs or inhibits their translation
  • said siRNA being chosen from siRNA siARH2AX-1, SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or siARH2AX-Ib, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4, such as described in Table 1, is used alone for its use in the prevention and / or treatment of cancer, in particular adrenocortical, esophageal, gastric carcinoma, basal cells, thyroid or uterine carcinoma, astrocytoma , glioblastoma, oligodendroglioma, meningioma, thymoma, lymphoma, melanoma or non-melanoma skin cancer, leukemia, mesothelioma, chol
  • said prevention and / or said treatment is carried out in a human patient or in a mammal.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA can have chemical modifications on one and / or the other strand, on one or more nucleotides located at the 3 'or 5' terminal ends, and / or on one or more nucleotides constituting the internal skeleton. Examples of chemical modifications can be found in the section entitled "Chemical modifications”.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification and comprises two deoxynucleotides overflowing at the 3 'end, in particular two deoxyfhymidines.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification and does not comprise two deoxynucleotides bridging at the 3 'end, in particular two deoxythymidines.
  • said composition contains neither a targeting agent nor an addressing molecule or contains a targeting agent but no targeting molecule or contains an addressing molecule but no targeting agent or contains a targeting agent.
  • vectorization and an addressing molecule can be found in the section entitled "Vectorization agents and addressing molecules"
  • the addressing molecule may be either associated with siRNA without a covalent bond, or covalently coupled with either siRNA strand, or incorporated into a targeting agent, for example a nanoparticle or a liposome containing siRNA, so as to address the targeting agent to the target cell or tissue.
  • composition containing siRNA bispecific siARH2AX is formulated for a systemic, local, or loco-regional administration, in single dose or repeated intermittently or continuously.
  • the siARH2AXs according to the invention are administered systemically or locally by being formulated in an acidic pH buffer solution.
  • acidic pH buffer solution examples of such buffers are given in Table 3.
  • the buffer solution is a citrate or histidine buffer.
  • the acidic pH buffer solution is supplemented or not with cations from inorganic or organic salts. Examples of cations can be found in the section entitled "Buffer and cations”.
  • the concentration of each cation is from 0.02 mM to 200 mM, preferably from 0.05 to 100 mM and preferably from 1 to 50 mM.
  • the cations are added to a buffer solution which is a citrate buffer or a histidine buffer.
  • said composition is formulated for a mode of administration of siRNA siRNA bispecific at a therapeutically effective dose, and in particular at doses of 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, in particular 0.01 mg / kg / day to 10 mg / kg / day.
  • "0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day” means all doses ranging from 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, eg 0.008; 0.01; 0.05; 0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 10.0; 10.5; 14.0; 14.5; 20; 20.5; 25; 25.5; 29.5 mg / kg / day.
  • the present invention also relates to compositions containing at least one siRNA selected from siRNA siARH2AX-1, SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or siARH2AX-1b, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4. as described in Table 1, said siRNA being in an acidic pH buffer solution. Examples of such buffers are given in Table 3.
  • said composition is formulated for a systemic, local or loco-regional administration mode, in single dose or repeated intermittently or continuously.
  • the buffer solution is a citrate or histidine buffer.
  • the acidic pH buffer solution is supplemented or not with cations from inorganic or organic salts. Examples of cations can be found in the section entitled "Buffer and cations”.
  • the concentration of each cation is from 0.02 mM to 200 mM, preferably from 0.05 to 100 mM and preferably from 1 to 50 mM.
  • the cations are added to a buffer solution which is a citrate buffer or a histidine buffer.
  • the present invention also relates to compositions containing at least one siRNA selected from siRNA siARH2AX-1, SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or siARH2AX- 1b, of SEQ ID No. 3 and SEQ ID NO 4, said siRNA being in a buffer solution at acidic pH, said buffer solution being in particular a citrate or histidine buffer, said buffer solution being supplemented with cations originating from inorganic or organic salts, in particular salt whose cation is chosen from polyamines, especially chosen from spermine, spermidine or putrescine, or in particular from a salt whose cation is chosen from metal cations, in particular chosen from zinc, cobalt, copper and manganese salts, calcium, magnesium or iron, especially manganese, zinc, magnesium, alone or in combination two to two or three to three.
  • siRNA siARH2AX-1 siRNA siARH2AX-1, SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or siARH2AX- 1b
  • said bispecific AR-H2AX siRNA can have chemical modifications on one and / or the other strand, on one or more nucleotides located at the 3 'or 5' terminal ends, and / or on one or more nucleotides constituting the internal skeleton. Examples of chemical modifications can be found in the section entitled "Chemical modifications”.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification and comprises two deoxynucleotides bridging at the 3 'end, in particular two deoxythymidines.
  • said bispecific AR-H2AX siRNA is devoid of chemical modification and does not comprise two deoxynucleotides bridging at the 3 'end, in particular two deoxythymidines.
  • said composition contains neither a targeting agent nor an addressing molecule or contains a targeting agent but no targeting molecule or contains an addressing molecule but no targeting agent or contains a targeting agent.
  • vectorization and an addressing molecule can be found in the section entitled "Vectorization agents and addressing molecules"
  • the addressing molecule may be either associated with siRNA without a covalent bond, or covalently coupled with either siRNA strand, or incorporated into a targeting agent, for example a nanoparticle or a liposome containing siRNA, so as to address the targeting agent to the target cell or tissue.
  • said composition is used in combination with a treatment inducing DNA lesions or preventing their repair and said treatment being chosen from radiotherapy and / or chemotherapy.
  • a treatment inducing DNA lesions or preventing their repair and said treatment being chosen from radiotherapy and / or chemotherapy.
  • radiotherapy or chemotherapeutic agents can be found in the section entitled "association with treatment inducing DNA damage or preventing its repair”.
  • said bispecific siARNA siRNA bispecific included in said composition is at a therapeutically effective dose, and in particular at doses of 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, in particular 0.01 mg / kg / day at 10 mg / kg / day.
  • "0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day” means all doses ranging from 0.005 mg / kg / day to 30 mg / kg / day, eg 0.008; 0.01; 0.05; 0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 10.0; 10.5; 14.0; 14.5; 20; 20.5; 25; 25.5; 29.5 mg / kg / day.
  • the first column indicates the name of the siRNA.
  • the second column indicates the composition of the siRNA, consisting of the combination of a strand-type oligonucleotide (1b) or an oligonucleotide whose sequence has at least 75% identity with this strand-type oligonucleotide ( respectively lb),
  • oligonucleotide 2 a strand-type oligonucleotide 2 (respectively 2b) or an oligonucleotide whose sequence has at least 75% identity with this strand-type oligonucleotide 2 (respectively 2b).
  • the third column indicates the numbering of the oligonucleotide as filed.
  • the fourth column indicates the sequence in the 5 'to 3' orientation.
  • the notation [dT] [dT] is used to indicate the presence of two overflowing deoxythymidines.
  • the target sequence i.e., the sequence of the mRNA to which the siRNA guide strand hybridizes
  • the target sequence i.e., the sequence of the mRNA to which the siRNA guide strand hybridizes
  • the target sequence of these siRNA is present in humans in all the mRNAs encoding the androgen receptor, whether this receptor is wild, that it has splicing variations leading to the partial deletion or total hormone binding domain (variant AR-V7 for example) or that it has one of the mutations described in prostate cancer.
  • the second column indicates the tissue origin of the cells
  • the level of mRNA encoding AR was measured by RT-qPCR in these lines and normalized by that of the mRNA encoding the cyclophilin A (delta CT method).
  • the results, given in the third column, are expressed in arbitrary units, the level measured in the 22RV1 cells being considered as 100,000.
  • Figure 1 Schematic representation of the method of quantification of a siRNA by RT qPCR. Example of reference range.
  • FIG. 2 Comparison of the complementarity of the siRNA sequences of the invention and siRNA siRNA with the mRNA encoding the androgen receptor in humans and that encoding H2AX.
  • the underlined bases are those which are perfectly complementary to those of the guide strand of the indicated siRNAs.
  • the siRNAs indicated are composed of oligonucleotides 100% identical to those described in Table 1.
  • the gray boxes indicate the nucleation region (seed region), that is, the nucleotides ranging from
  • Figure 3 Quantification by RT-qPCR of mRNAs encoding AR and H2AX 48h after transfection in C4-2 cells of control siRNA (Cont, black bars), siAR2 (gray bars) or siARH2AX-1
  • each mRNA is expressed relative to that measured in cells transfected with a siRNA control.
  • FIG. 4 Quantification by RT-qPCR of the mRNAs Encoding AR, PSA and H2AX 72h After Transfection in the LNCaP or C4-2 Cells of a Control siRNA (Cont, Black Bars), SiAR7 (Dark Gray Bars), or SiARH2AX -l (white bars). The level of expression of each mRNA is expressed relative to that measured in cells transfected with a siRNA control.
  • FIG. 5 Quantification by RT-qPCR of mRNAs Encoding AR and H2AX 72h After Transfection in LNCaP or MDA MB -453 Cells of a Control siRNA (Cont, Black Bars), SiH2AX (Dark Gray Bars), SiARh (Bars) light gray), or siARH2AX-1 (white bars). For each cell type, the level of expression of each mRNA is expressed relative to that measured in cells transfected with a siRNA control.
  • Figure 6 immunoblotting of the expression of AR and H2AX 72h by western blot after transfection of C4-2 cells by one of the following siRNAs: Control (Cont), siARH2AX-1, siRNA, siH2AX, or a mixture of both siRNA siH2AX and siARh.
  • Figure 7 Immuno detection by western blot of the expression of AR, H2AX and ⁇ 2 ⁇ 72h after transfection of PC3 cells by one of the following siRNAs: Control (Cont), siAR7 or siARH2AX-1.
  • FIG. 8 Immuno detection of ⁇ 2 ⁇ (first column) and 53BP1 (second column) in C4-2 cells treated for 6 h with bleomycin (10 ⁇ l) or the vehicle added 72 h after transfection of cells by a control siRNA (Cont. ), siARNA siAR7, or siARH2AX-1.
  • Figure 9 Measurement of cell viability by a WST1 test of MDA MB231 or C4-2 cells 90h after transfection of a siRNA control (black bars) of siAR2 (gray bars) or siARH2AX-1 (bars) white). The measured values are related to the average of the values measured in the control condition (control siRNA, vehicle).
  • Figure 10 Left panel: Viability of 22RV1, MDA MB-453, U87, WM266-4 and MDA MB231 cells measured by a 72 hr WST1 test after transfection of a siRNA control (Cont), siARh, siH2AX or siARH2AX .
  • Right panel LNCaP or C4-2 cell viability measured by a 72 hr WST1 test after transfection of a control siRNA (Cont), siAR7, or siARH2AX. For each line, the results are related to cell viability in the control condition.
  • Figure 11 Measurement of cell viability by a WST1 test of C4-2 cells transfected for 48 h by a control siRNA (black bars), siAR2 (gray bars) or siARH2AX-1 (white bars) and then incubated for 48 h in a medium containing 10 ⁇ of bleomycin or 10 ⁇ of etoposide or the vehicle. The measured values are related to the average of the values measured in the control condition (control siRNA, vehicle).
  • FIG. 12 Viability of the LNCaP or C4-2 cells, measured by a WST1 metabolic test, 48 h after treatment with bleomycin 10 ⁇ or by its vehicle added 24 h after transfection of the cells by a control siRNA (Cont) or by siARH2AX-1 .
  • the viability measurements of the different samples are related to the average of the values measured in the cells cultured under the control condition (siRNA control without bleomycin) considered as 100%.
  • FIG. 13 Viability of MDA MB231 and WM266-4 cells, measured by a WST1 metabolic test, 48h after treatment with etioposide 40 ⁇ or by its vehicle added 24 hours after transfection of the cells by a control siRNA (Cont, black bars) , siRNA siH2AX (dark gray bars), siARh siRNA (light gray bars) or siARH2AX-1 (white bars).
  • the viability measurements of the different samples are related to the average of the values measured in the cells cultured under the control condition (siRNA control without bleomycin) considered as 100%.
  • Figure 14 Inhibition of bone metastases from prostate cancer by continuous systemic administration of if ARH2AX-1.
  • Figure 16 Effect of a composition comprising siRNA siH2AX-1 and a CD36 receptor ligand administered as a single dose on siRNA distribution in vivo.
  • Figure 17 Effect of a composition comprising siRNA siH2AX-1 and a CD36 receptor ligand administered systemically subcutaneously continuously on the distribution of siRNA in vivo.
  • Osmotic pumps delivering continuously for 3 days 2mg / kg / day of siRNA siARH2AX-1 were implanted subcutaneously in mice bearing human prostatic tumors 22RV1.
  • the siRNA was formulated either in a saline solution (154 mM NaCl, gray bars) or in 10 mM citrate buffer at pH 6 containing 1 ⁇ M MgCl 2 and supplemented with oxidized LDL (siARH2AX-1: oxidized LDL 1: 0.1, weight / weight) (black bars).
  • SiARH2AX-1 was quantified by RT-qPCR at the end of the 3 days of treatment.
  • the mean of each group (3 mice per group) was related to the mean values in the serum of the NaCl group.
  • the axis of ordinates indicates the concentration of siARH2AX-1 relative to that measured in the serum of the mice having received the siRNA diluted in a solution of NaCl.
  • Figures 18 Volume versus time of C4-2 tumors developing by nude mice treated three times a week by the vehicle (DMSO) (black diamonds), etoposide at a dose of 5 mg / kg (gray diamonds clear), or 10 mg / kg (dark gray diamonds), or treated with continuous subcutaneous administration of siRNA siARH2AX-1 (white triangles), administered alone or in combination with etoposide at a dose of 5 (light gray triangles) or 10 (dark gray triangles) mg / kg three times a week.
  • DMSO black diamonds
  • etoposide at a dose of 5 mg / kg gray diamonds clear
  • 10 mg / kg dark gray diamonds
  • siRNA siARH2AX-1 white triangles
  • siRNA not hybridizing with any known mRNA was used.
  • This siRNA, Cont is composed of the following two oligonucleotides:
  • siRNA inhibiting AR Four siRNA inhibiting AR are used:
  • siRNA siARH2AX- is composed of two oligonucleotides SEQ NO 1 and SEQ NO 2 as indicated in Table 1.
  • SiARNA siRNA described in application PCT / FR2002 / 003843, is composed of the following two oligonucleotides: Two other siRNAs hybridizing with AR mRNA but not with H2AX mRNA were used. SiARh hybridizes with a sequence of the first exon of AR, siAR7 with a sequence of the 7 ° exon of AR. These siRNAs are composed of the following two oligonucleotides:
  • siRNA, siH2AX, hybridizing with H2AX mRNA but not with AR mRNA was also used.
  • This siRNA is composed of the following two oligonucleotides:
  • the cells are cultured in DMEM or RPMI supplemented with 10% fetal calf serum, or as recommended by the ATCC. When indicated, they are transfected with siRNA using lipofectamine (Life Technologies), following the provider's protocol. The number of living cells after the indicated treatments was quantified by measuring their metabolic activity by the WST1 test according to the supplier's indications (Roche).
  • RNAs extracted by a conventional phenol-chloroform method Trizol
  • the amount of RNA was normalized by measuring the mRNA encoding cyclophilin A which is not regulated by AR (delta delta CT method).
  • Immuno-detection of tubulin or actin is used to ensure that comparable amounts of protein are analyzed under the different conditions.
  • RT-qPCR quantitative PCR
  • a specific stem-loop primer with 8 protruding nucleotides is synthesized, the 8 nucleotides being complementary to the 8 nucleotides of the 3 'end of the siRNA (antisense) guide strand.
  • the product obtained is amplified by PCR using two primers, one hybridizing with the region corresponding to the loop of the reverse transcription primer.
  • the 12 nucleotides at 3 'of the second primer having a DNA sequence corresponding to the 12 nucleotides of the 5' end of the newly synthesized cDNA after reverse transcription of the siRNA guide strand. Detection of the amplification is carried out continuously by the degradation of a Taqman fluorescent probe or by incorporation of SybrGreen.
  • FIG. 1 shows schematically the RT-qPCR method and an exemplary range showing the relationship between the number of copies present in the reaction and the CT (cycle threshold or amplification threshold) obtained.
  • the biological samples in which the siRNAs are quantified are either serum or total RNAs extracted from known weight tissue fragments thought to contain siRNA. These RNAs are extracted by conventional methods such as by the phenol-chloroform method (trizol extraction). After extraction, they are diluted in water;
  • the CT values obtained for each sample are compared with those obtained for the range.
  • Tumors are obtained by subcutaneous injection of tumor cells into the flank of Nude mice. Only animals on which tumor uptake is found are included in the study and randomized to receive treatment or control treatment.
  • Etoposide When indicated, Etoposide, diluted in DMSO and then adjusted to the required concentration in a 154 mM NaCl solution, is injected intraperitoneally at the indicated dose, 3 times per week.
  • siRNAs are diluted in water containing 154mM NaCl or in the indicated buffer.
  • the continuous administration of siRNA is carried out by implantation of an Alzet osmotic pump subcutaneously on the back of the mice, on the opposite side to the tumor when the mice wear one.
  • the concentration of siRNA in the pump is adjusted to deliver the indicated amount in mg / kg / day taking into account the pump flow rate indicated by the manufacturer.
  • the animals are sacrificed, the serum, the tumors and different tissues are dissected, the extracted RNAs and the siRNAs present in these RNAs are quantified.
  • siRNA siARH2AX-1 and siARH2AX-1b of the invention are bispecific.
  • FIG. 2 The alignments shown in Figure 2 show that the 19 siARH2AX-1 bases and the 21 siAR2 bases are perfectly complementary to the AR mRNA. This figure also shows that 17 bases out of 19 of siARH2AX-1 and 17 bases out of 21 of siAR2 hybridize with those of the mRNA encoding H2AX. The presence of two deoxythymidines brimming with these siRNAs has no effect on the hybridization of these siRNAs.
  • siRNA nucleation region of siARH2AX-1 and siARH2AX-1b that is to say nucleotides 2 to 8 inclusive of the 5 'to 3' sequence of their guide strand, (gray box in FIG. 1) is perfectly complementary. (7 bases out of 7, ie 100%) of the mRNA of H2AX. This complementarity is however only partial, from 5 bases out of 7, that is only 71% for siAR2, the nucleotides in position 2 and 3 of siAR2 not being complementary to the mRNA of H2AX. This difference results in a functional difference between siARH2AX-1 and siAR2 as shown in Figure 3.
  • siRNA siARH2AX-1 and siAR2 inhibit AR expression in a similar manner.
  • SiAR2 siRNA whose nucleation region is only partially (71%) complementary to the H2AX mRNA is considerably less effective at inhibiting the expression of H2AX than the siRNA siARH2AX-1 whose nucleation region is perfectly complementary to the H2AX mRNA.
  • the LNCaP or C4-2 tumor cells were transfected with the following siRNAs: Cont, siAR7 or siARH2AX-1.
  • the analysis of the mRNAs encoding AR, coding for the Antigen-specific Prostate, or PSA, which is a gene regulated by the androgen receptor, and those encoding H2AX shows that in both lines, siAR7 and siARH2AX-1 inhibit the expression of AR and PSA, but that only siARH2AX-1 also inhibits the expression of H2AX to more than 90%.
  • siRNAs Cont, siH2AX, siArh, siARH2AX-1.
  • siARh inhibits AR but not H2AX
  • siH2AX inhibits H2AX but not AR.
  • the siRNA siARH2AX-1 alone inhibits the expression of the two mRNAs encoding AR and H2AX.
  • siRNAs Cont, siARH2AX-1, siArh, siH2AX, and a mixture ( 1: 1) of both siRNA siARh and siH2AX.
  • siARh inhibits AR but not H2AX
  • siH2AX inhibits H2AX but not AR
  • the mixture of both siRNA inhibits AR and H2AX.
  • the siRNA siARH2AX-1 alone inhibits the expression of both AR and H2AX proteins.
  • the PC3 tumor cells which express weakly AR, were transfected with the following siRNAs: Cont, siAR7 or siARH2AX-1. 72 hours after transfection, the expression of AR and H2AX proteins was measured. It is observed that the expression of H2AX is inhibited by siARH2AX-1 but by siAR7. Inhibition of H2AX is accompanied by inhibition of its phosphorylated form ⁇ 2 ⁇ .
  • siRNA siARH2AX-1 has the ability to inhibit both AR and H2AX at the same time.
  • siARH2AX-1 siRNA is much more effective than siRNA siARNA in inhibiting H2AX expression.
  • a difference of two bases in the nucleation region of these two siRNAs profoundly modifies their ability to inhibit H2AX.
  • siARH2AX-1 Inhibition of H2AX by siARH2AX-1 occurs in cells expressing AR strongly (LNCaP, C4-2), intermediate (MDA MB253) or weakly (PC3).
  • Example 3 Inhibition of H2AX prevents the recruitment of 53BP1 on bleomycin-induced DNA lesions and decreases cell viability.
  • C4-2 cells were transfected with a control siRNA or siARH2AX-1. 72 hours after transfection, the cells were then treated for 6 hours with 10 ⁇ l of bleomycin or the corresponding vehicle.
  • siAR7 transfected cells In siAR7 transfected cells, bleomycin induces an increase in ⁇ 2 ⁇ labeling and recruitment of 53BP1.
  • siARH2AX-1 In cells transfected with siARH2AX-1, the expression of H2AX is very small compared to the control condition whereas the expression of 53BP1 is comparable. After treatment with bleomycin, siARH2AX-1 transfected cells were not seen to increase H2AX or to recruit 53BP1 to focal points of repair of DNA lesions.
  • siRNA siARH2AX inhibits DNA repair.
  • siRNA siARH2AX-1 reduces cell viability regardless of the level of AR expression.
  • siRNA Control Cont
  • siH2AX siARh
  • siARH2AX-1 in the right panel, the cells were transfected with siRNA Control (Cont), siH2AX, siARh, or siARH2AX-1 and in the right panel. by a siRNA Control, siAR7 or siARH2AX-l.
  • the siRNA siARh and siAR7 inhibit the proliferation of cells that strongly express AR (22RV1, C4-2, LNCaP) but not other lines expressing intermediate or low levels of AR (MDA MB 453, MDA MB 231, WM 266 -4, U87).
  • siRNA siARH2AX-1 inhibits the proliferation of all cell lines, regardless of the level of AR expression, and regardless of the effect on their proliferation of AR inhibition by the siRNA siARh that does not inhibit H2AX whereas siRNA siH2AX that only inhibits H2AX expression without affecting AR has little effect on cell proliferation, regardless of lineage.
  • siRNA siARH2AX-1 alone inhibits cell proliferation, whether it depends or does not depend on AR expression and that AR is expressed very strongly at an intermediate level. or very weakly in these cells.
  • Example 5 The effects of siRNA siARH2AX-1 and DNA damage inducing agents are potentiated, regardless of the level of AR expression.
  • siRNA cont 48 hours after transfection of C4-2 cells by siRNA cont, siAR2 or siARH2AX-1, the cells were treated with a vehicle or with etoposide ( ⁇ ) or bleomycin ( ⁇ ), chemotherapy agents inducing DNA damage. 48 hours after addition of the chemotherapy agents, it is observed that the combination of siRNA siRNA with one or other of these agents does not produce a significantly greater inhibitory effect on viability than that measured by the chemotherapeutic agent alone. In contrast, the effects of siARH2AX-1 and either of the chemotherapeutic agents potentiate to inhibit cell viability.
  • MDA MB 231 or WM266-4 cells that express weakly AR were transfected with a control siRNA (Cont), siH2AX, siArh, or siARH2AX-1. 24 hours after transfection, the cells were treated with 40 ⁇ l of eioposide or by the vehicle, and the cell viability, relative to that of the cells under controlled conditions, was measured by a WST1 test 48 h later. It is observed that in both lines, etoposide inhibits cell proliferation. When this treatment is associated with inhibition of H2AX by siH2AX, or with inhibition of AR by siRNA siARh, there is no amplification of the effects of etoposide on proliferation. On the other hand, etoposide and siARH2AX-1 treatments potentiate when combined.
  • siRH2AX-1 siRNA is much more effective than siRNA siRNA in inhibiting H2AX expression and cell viability, including in cells expressing low AR.
  • siARH2AX-1 potentiates the inhibitory effects of viability produced by chemotherapies.
  • Example 6 Administration of siARH2AX-1 to tumor-bearing mice inhibits metastatic spread.
  • siARNA siARNA2-1 subcutaneously continues to mice with human prostatic tumors 22RV1 to inhibit the expression of the androgen receptor in the bones of mice ( Figure 14 left panel). This inhibition is accompanied by a decrease in the number of mice spontaneously developing bone metastases of these tumors and a decrease in the size of these tumors, evaluated by the level of expression of a human mRNA (HRPT) in the tumors. bone ( Figure 14 right panel).
  • HRPT human mRNA
  • siRNA siARH2AX-1 thus allows it to be delivered in the metastases of a cancer developing in bone, to inhibit the expression of the target siRNA gene in the bone and to to limit the implantation and / or the development of metastases.
  • osmotic pumps continuously delivering siARH2AX-1 at a dose of 2 mg / kg / day diluted either in saline solution (154 mM NaCl) or in solution in citrate buffer at pH 6 containing 10 mM of MgCl2 (Cit / mg), were implanted subcutaneously in tumor-bearing mice. After 3 days, siARH2AX-1 was quantified by RT-qPCR in serum, various organs, and tumors. It is found that compared to the saline formulation, the citrate buffer formulation at pH 6 supplemented with 10 mM MgC12 significantly increases the concentration of siARH2AX-1 in tissues and tumors.
  • the CD36 receptor is expressed to the outer membrane of endothelial cells of many tumor cells and other cell types such as macrophages. This CD36 receptor binds different classes of ligands, such as oxidized LDLs or hexarelin peptide.
  • siRNA siARH2AX-1 at the dose of 0.12 mg / kg, formulated in a solution of 154 mM NaCl (control group, denoted NaCl) or in a 10 mM citrate buffer pH 6
  • Addition of 0.02 mM hexarelin peptide (Cit / Hexarelin) or 30 nM oxidized LDL (Cit / LDL) was administered as a bolus subcutaneous injection to groups of adult mice.
  • siRNA siARH2AX-1 a dose of 2 mg / kg / day.
  • the siRNA was formulated either in 154 mM NaCl solution, or in 10 mM citrate buffer pH 6 containing oxidized LDL (siARH2AX-1: LDLox in ratio 1: 0.1, weight: weight).
  • the concentration of siARH2AX-1 was measured after 3 days of treatment in serum, different organs and tumors. It is found that the addition of oxidized LDL increases the concentration of siARH2AX-1 in serum, different organs and tumors.
  • Example 8 The combination of siARH2AX-1 and a DNA damage inducing agent potentiates the effect of each of these separately administered treatments on tumor development.
  • an osmotic pump was implanted into 22RV1 human prostate tumor-bearing mice for subcutaneous and continuous administration for 22 days from day 1 of siRNA siARH2AX-1 to dose of 2mg / kg / day formulated in 10mM citrate buffer pH 6 containing 10mM MgCl2, or the vehicle alone.
  • the mice received an intraperitoneal injection of etoposide at a dose of 5 or 10 mg / kg or the vehicle and this treatment was repeated twice a week until sacrifice of the mice. It is observed that etoposide at 5 mg / kg only slightly inhibits tumor development.
  • siRNA siARH2AX-1 is as effective as the high dose of etoposide without causing weight loss.
  • the combination of treatment with etoposide and siARH2AX-1 potentiates the effect of these two treatments taken separately.
  • siRNA siARH2AX-1 effectively inhibits tumor development, with no significant toxic effect in animals, and that the combination of this treatment with low, non-toxic doses of an agent inducing DNA amplifies inhibition of tumor growth.

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Abstract

La présente invention concerne un oligonucléotide double brin pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer, en association avec une thérapie entraînant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation. La présente invention concerne un oligonucléotide double brin pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer, à l'exception d'un cancer de la prostate dépendant du récepteur des androgènes.

Description

NOUVEL OLIGONUCLEOTIDE DOUBLE BRIN BISQUECIFIQUES POUR LE
TRAITEMENT DES CANCERS
La présente invention concerne un oligonucléotide double brin bispécifique, ciblant en même temps le récepteur des androgènes et l'histone H2AX.
Les cellules de notre organisme subissent chaque jour un grand nombre de lésions de l'ADN, provoquées soit par leur métabolisme qui produit par exemple des espèces réactives de l'oxygène, soit par leur environnement, notamment par les rayonnements ionisants ou U V, des agents physiques ou chimiques, y compris certains médicaments (https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_damage_(naturally_occurring). Les cellules ont développé au cours de l'évolution plusieurs mécanismes de vérification et de réparation pour maintenir l'intégrité du génome. Lorsque des lésions de l'ADN se produisent dans une cellule normale, des protéines suppresseur de tumeurs, comme la p53, orchestrent le blocage de la division cellulaire et l'activation des mécanismes de réparation. La plupart des lésions sont normalement réparées. Au-delà d'un certain seuil de dommages à l'ADN cependant, la cellule n'est plus viable, entre en apoptose et meurt.
Dans la même situation, les cellules cancéreuses accumulent un grand nombre de lésions de l'ADN car leurs mécanismes de réparation de l'ADN sont fréquemment déficients et/ou parce qu'elles sont plus résistantes à l'apoptose que les cellules normales. Le seuil de dommages à l'ADN conduisant à la mort cellulaire est plus élevé dans une cellule tumorale que dans une cellule normale.
Les lésions de l'ADN interviennent dans un contexte où l'ADN n'est pas linéaire mais compacté par les nucléosomes constitués d'histones. Certaines histones jouent un rôle de structure, d'autres, comme H2AX, sont clé dans le fonctionnement ou la réparation du génome, H2AX est une histone exprimée dans la totalité des cellules de l'organisme. La phosphorylation de H2AX, alors notée γΗ2ΑΧ, par exemple par des protéines telles que DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ATM (mutated in ataxia-telangiectasia) ou ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related), est un événement majeur et précoce dans la réparation de l'ADN, qui permet le recrutement et l'assemblage de nombreuses autres protéines nécessaires à la réparation de la lésion. La détection de γΗ2ΑΧ, en particulier par des anticorps spécifiques, est fréquemment utilisée comme indicateur sensible et quantitatif de la présence de lésions de l'ADN. H2AX peut également être acétylé sur la lysine 36 par CBP/P300 et sur lathréonine 101 et ces deux modifications posttraductionnelles permettent la survie des cellules aux radiations ionisantes, indépendamment de la phosphorylation de H2AX.
Inhiber l'expression de H2AX dans une cellule, en particulier dans une cellule cancéreuse, est une méthode qui empêche la réparation des lésions de l'ADN. Cependant, du fait de la multiplicité des mécanismes de réparation de l'ADN, l'inhibition de l'expression de H2AX seule n'est pas suffisante pour induire la mort cellulaire (Yuan and Chen, 2010).
La radiothérapie ou certaines chimiothérapies ont été développées pour traiter les cancers en augmentant le nombre de lésions de l'ADN j usqu'à dépasser le seuil compatible avec la viabilité des cellules, seuil au-delà duquel l'apoptose de la cellule cancéreuse se déclenche. Ces traitements agissent en induisant des dommages à l'ADN et/ou en empêchant la réparation des lésions présentes dans les cellules cancéreuses. La radiothérapie est aujourd'hui incontournable en cancérologie puisqu'elle est programmée dans deux tiers des schémas thérapeutiques, soit seule, soit associée à la chirurgie et/ou à la chimiothérapie. Ces traitements induisent des lésions de l'ADN, et en particulier des cassures double-brin (DSB, double strand break).
La chimiothérapie cytotoxique vise à bloquer les divisions des cellules cancéreuses et/ou à induire leur apoptose, La plupart de ces traitements conduisent à l'accumulation de lésions de l'ADN dans la cellule, soit directement du fait de leur mode d'action qui crée de nouvelles lésions, soit en empêchant la réparation de l'ADN, soit en maintenant la cellule à un stade du cycle cellulaire ou les processus de réparation sont peu actifs. Cependant, les nombreux mécanismes de vérification et de réparation du génome qui tentent de réparer les lésions de l'ADN diminuent l'efficacité de ces traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie.
Il existe ainsi un réel besoin d'améliorer l'efficacité des thérapies induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation.
En empêchant la réparation des lésions de l'ADN, l'inhibition de H2AX fournit ainsi un moyen d'amplifier la mortalité cellulaire induite par les traitements de radiothérapie ou de chimiothérapie induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation.
Le récepteur des androgènes (AR) est un facteur de transcription dont l'activité est régulée par ses ligands. AR est exprimé chez l'homme comme chez la femme par de très nombreux types cellulaires, dans la plupart des tissus et organes et dans le système hématopoïétique. AR régule l'expression de très nombreux gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la migration, la survie, l'invasion, la production de facteurs de croissance.
Du fait de ces propriétés, une dérégulation de l'expression ou du fonctionnement d'AR, par exemple et de façon non limitative par surexpression, mutation, épissage alternatif, modification post traductionnelle ou changement de partenaire protéique, est décrite dans l'initiation, le maintien et la progression de différents carcinomes, sarcomes, myélomes et leucémies comme par exemple et de façon non limitative, certains cancers de la prostate, du sein, des ovaires, de la vessie, du foie, du colon, de l'estomac, des glandes surrénales et salivaires, du thymus, de la thyroïde, de l'utérus, du péritoine, du pancréas, des testicules, du rein, de la peau, du cerveau, du nasopharynx, de la tête et du cou, des méninges, du poumon, des testicules, des os (Munoz et al., 2015).
La castration, qui empêche la production des ligands d'AR et donc l'activité transcriptionnelle d'AR, est une stratégie thérapeutique dont l'efficacité a été démontrée en clinique dans les cancers de la prostate. Cependant, l'efficacité de ces traitements est transitoire et les patients rechutent de façon systématique. 11 existe donc pour ces cancers un réel besoin d'améliorer l'efficacité des traitements ciblant la voie de signalisation d'AR.
Bien qu'AR soit exprimé dans la plupart des cellules de l'organisme, et que la dérégulation de son expression ou de sa fonction soit décrite dans nombreux cancers autres que ceux de la prostate, l'inhibition de la voie de signalisation d'AR n'a pas été montrée comme étant suffisante pour traiter chez les humains des cancers déjà développés autres que des cancers de la prostate. Ainsi, la prolifération d'autres cellules cancéreuses, par exemple provenant de tumeurs du sein, de mélanomes ou de glioblastome, qui expriment AR à des niveaux allant de très faible à élevé n'est-elle pas affectée par l'inhibition de cette voie de signalisation, comme illustré dans les exemples ci-après.
La présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels certains oligonucléotides double brins particuliers sont bi-spécifiques, car ils inhibent en même temps et spécifiquement l'expression de l'histone H2AX et celle du récepteur des androgènes, ce qui inhibe efficacement la prolifération et la survie des cellules.
Cet effet de l'inhibition simultanée d'AR et de H2AX peut être amplifié en ie combinant avec un traitement de chimiothérapie ou de radiothérapie qui augmente le nombre de lésions de l'ADN ou empêche leur réparation.
Les micro RNAs (miRNAs) sont des petits ARN double brins d'une vingtaine de nucléotides codés par le génome de tous les organismes eucaryotes. Après transcription et maturation, ils sont chargés dans un complexe protéique : RNA ïnduced Silencing Complex (RISC). L'un des deux brins s'hybride, de façon généralement imparfaite chez les mammifères, avec un ou plusieurs ARN messagers (ARNm), appelés ARNm cible, dont ils induisent soit la coupure, conduisant à la dégradation de l' ARNm, soit l'inhibition de la traduction en protéine. L'hybridation avec un ou plusieurs ARNm des nucléotides 2 à 8 inclus du miRNA (sens du brin guide également appelé brin antisens), région appelée région de nucléation ou "seed région", est d'une importance particulière pour déclencher le mécanisme d'ARN interférence. Un miRNA peut dans une même cellule s'hybrider avec plusieurs ARNm cibles et en réguler la stabilité ou la traduction. Aucun outil informatique ou autre ne permet de prédire à ce jour de façon exacte les ARNm régulés par un miRNA donné (Gorski et al., 2017).
Les ARN interférents ou Small Interfering RNA, ou encore siRNA, sont des oligoribonucléotides double brins synthétiques qui une fois introduits dans les cellules miment l'action des miRNAs, s'hybrident avec leur ARNm cible, et déclenchent le mécanisme d'ARN interférence. Tout comme les miRNAs, ils peuvent s'hybrider de façon incomplète avec d'autres ARNm et les outils informatiques ne permettent pas de prédire de façon exacte parmi les nombreuses hybridations incomplètes possibles celles qui interfèrent avec un ARNm et en perturbent la fonction. Ces effets dits hors cible (off-target) sont généralement indésirables car ils peuvent produire des effets biologiques potentiellement toxiques qui faute d'être prédictibles doivent donc être évalués expérimentalement. Utiliser plusieurs siRNA simultanément multiplie le nombre d'effets hors cible potentiels et donc le risque de toxicité. Pour choisir la séquence d'un siRNA destiné à inhiber l'expression d'un gène d'intérêt, il existe de nombreux outils informatiques. Ces outils sont conçus pour que le siRNA choisi ne s'hybride qu'avec un seul ARNm de façon à éviter les effets off-target.
Le mécanisme d'action et les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des siRNA ne sont comparables à aucun autre type d'oligonucléotide tel que les ribozymes, les morpholinos, les oligonucléotides formant triple hélice, les ARN antisens ou les oligonucléotides ADN antisens (ODN).
La présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels certains siRNA particuliers décrits dans le tableau 1, qui s'hybrident parfaitement avec l'ARNm codant le récepteur des androgènes et qui en inhibent l'expression, sont bt-spécifiques, car ils s'hybrident également partiellement avec l'ARNm codant H2AX comme décrit dans la figure 1 et en inhibent aussi spécifiquement l'expression.
La présente invention vise à fournir un moyen pour inhiber simultanément l'expression du récepteur des androgènes et de H2AX par l'utilisation d'un siRNA bispécifique.
En inhibant en même temps le récepteur des androgènes , clé dans de nombreux processus cancéreux, notamment dans la prolifération et la résistance à l'apoptose, et l'histone H2AX, clé dans la réparation des lésions de l'ADN, l'utilisation d'un siRNA AR-H2AX bispécifique, inhibant à la fois AR et H2AX, présente un avantage spécifique par rapport à un siRNA ne ciblant qu'AR, ou à un siRNA ne ciblant que H2AX.
L'utilisation d'un seul siRNA bispécifique est préférable à la combinaison de deux siRNA, l'un ciblant AR et l'autre ciblant H2AX, afin de limiter les effets hors cibles potentiellement toxiques d'une telle combinaison, et de faciliter le développement d'applications cliniques et industrielles de cette utilisation.
Dans un premier aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA bispécifique, défini comme s'hybridant en totalité ou partiellement à la fois avec un ARNm codant le récepteur des androgènes et avec un ARNm codant H2AX, de telle sorte que cette hybridation induise la dégradation de ces ARNm ou en inhibe la traduction, le dit siRNA étant choisi parmi les siRNA siARH2AX-1, de SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou siARH2AX-1b, de SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, tels que décrits dans le Tableau 1, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer, dans laquelle ledit siRNA est utilisé en association avec une thérapie entrainant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation.
On entend par hybridation partielle, l'hybridation d'un nombre suffisant de nucléotides du siRNA bispécifique de l'invention avec la séquence de l'ARNm du récepteur des androgènes ou avec celle de H2AX pour entraîner soit la coupure, soit l'inhibition de la traduction de l'ARNm avec lequel il s'hybride, ce qui conduit à une diminution de l'expression de la protéine codée par le mRNA, diminution que l'on peut mesurer par exemple par un test immunologique de type western bïot ou immunofluorescence indirecte. Par exemple, cette hybridation peut concerner 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nucléotides, ou davantage si le siRNA comporte plus de nucléotides, par exemple 20, 21, 22 ou 23. Par exemple, au sens de l'invention, le pourcentage d'hybridation peut être compris entre 30 et 95%.
Selon l'invention, ladite prévention et/ou ledit traitement est effectué chez un patient humain ou chez un mammifère.
Les séquences des siRNA de la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1. L'expression « au moins 75% d'identité avec une séquence » dans le Tableau 1 signifie 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, notamment 79%, 81%, 84%, 86%, 90%, 95% et 99%.
Tous les siRNA dont la séquence est à 100% identique à celle des siRNA indiqués dans le Tableau 1 s'hybrident à 100% avec une région de l'ARNm codant le récepteur des androgènes qui est transcrite à partir de l'exon 1. Ainsi, tous ces siRNAs inhibent l'expression de toutes les formes d'épissage du récepteur des androgènes exprimées dans les cellules cancéreuses, y compris celles partiellement ou complètement délétées du domaine de liaison des ligands, comme par exemple les variants AR-V7 du récepteur exprimés dans certains cancers.
Avantageusement la région de nucléation des brins guide des siRNA siARH2AX-l et siARH2AX- lb est également parfaitement complémentaire de l'ARNm codant H2AX.
Modifications chimiques
Selon l'invention et dans tous ses aspects, ledit siRNA AR-H2AX bispécifîque peut présenter des modifications chimiques sur l'un et/ou l'autre brin, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3' ou 5', et/ou sur un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne. Par exemple, lesdites modifications chimiques se situent sur le ribose et/ou la base et/ou l'acide phosphorique, Lesdites modifications chimiques comprennent par exemple au moins une substitution du groupement OH en 2' du ribose par un groupement 2'-0-methyl RNA (2'OMe) ou 2'-O-methoxyethyl (2'MOE) ou 2'-fluoro (2'F) ou 2'-fluoro-p~ arabinonucleotide (FANA), une alkylation de l'oxygène en 2' en aminoethyl-, guanidinoethyl- , cyanoethyi- ou allyl, un remplacement du groupement phosphodiester par un phosphorothioate, une alkylation ou une thiloation de un ou plusieurs nucléotides de l'oligonucléotide, le remplacement d'un ribonucléotide par un desoxyribonucléotide, ou le remplacement d'un nucléotide par un Locked Nucleic Acid (LNA).
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifîque est dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Selon l'invention et dans tous ses aspects, ledit siRNA AR-H2AX bispécifîque est formulé dans une composition qui permet sa pénétration dans les cellules tumorales.
Agents de vectorisation et molécules d'adressage
Dans un aspect particulier, ladite composition contient un agent de vectorisation. Selon l'invention, un agent de vectorisation est un agent qui facilite la pénétration d'un siRNA dans les cellules de l'organisme. Cet agent peut être chimiquement conjugué à l'un ou l'autre brin du siRNA, ou associé de façon non covalente au siRNA. Il s'agit par exemple de lipides, de polymères, de peptides, de dendrimères, de sucres simples ou complexes, de dérivés de la polyéthylènimine, de nanoparticules, de sphères magnétiques, ou de nanostructures inorganiques ou organiques.
Dans un aspect particulier, ladite composition contient une molécule d'adressage. Selon l'invention, une molécule d'adressage est une molécule adressant le siRNA vers un type cellulaire particulier, comme par exemple les cellules endothéliales ou les cellules cancéreuses. Une molécule d'adressage n'est pas destinée à faire pénétrer le siRNA à l'intérieur de la cellule ou à pénétrer avec le siRNA mais à augmenter sa concentration à la membrane externe de la cellule d'intérêt. Par exemple et de façon non exhaustive, une molécule d'adressage peut être un aptamère, un anticorps, la transferrine, un peptide RGD, le ligand d'un récepteur, cette molécule d'adressage interagissant ou se liant à une molécule exprimée à la surface des cellules ciblées, comme par exemple et de façon non limitative un récepteur, une intégrine, un antigène membranaire comme par exemple le PSMA (Prostate Spécific Membrane Antigen) ou le récepteur CD36.
Dans un aspect particulier de l'invention, cette molécule d'adressage est un ligand du récepteur CD36, par exemple des LDL oxydés, ou le peptide hexareiine ou un acide gras à longue chaîne (plus de 16 carbones), ou un mélange de ces composants deux à deux ou trois à trois.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient des LDL oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou le peptide hexaréline, dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 d'hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
La molécule d'adressage peut être soit associée au siRNA sans liaison covalente, soit couplée de façon covalente avec l'un ou l'autre des deux brins du siRNA, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple une nanoparticule ou un liposome contenant le siRNA, de façon à adresser l'agent de vectorisation vers la cellule ou le tissu cible.
Dans un aspect particulier, ladite composition ne contient ni agent de vectorisation ni molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ladite composition contient un agent de vectorisation mais pas de molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ladite composition contient une molécule d'adressage mais pas d'agent de vectorisation. La molécule d'adressage est en particulier un ligand de CD36, et plus particulièrement des LDL oxydés ou de helx' aréline.
Dans un aspect particulier, ladite composition contient un agent de vectorisation et une molécule d'adressage. La molécule d'adressage est en particulier un ligand de CD36, et plus particulièrement des LDL oxydés ou de l'hexaréline.
Administration locale, locorégionale ou systémique
Selon l'invention et dans tous ses aspects, ladite composition contenant ledit siRNA siAR-H2AX bispécifique est formulée pour être administrée localement ou de façon ioco régionale, notamment par administration intratumorale, en dose unique ou par des injections répétées, de façon intermittente ou bien encore de façon continue par l'utilisation d'une pompe externe ou implantable, ou de tout autre dispositif, ou composé biodégradable permettant une libération lente et continue de la composition à proximité ou dans la tumeur à traiter (administration intra tumorale).
Selon l'invention, le mode d'administration continu a pour objectif de maintenir sensiblement constante la concentration du siRNA pendant tout le temps d'administration du siRNA dans le tissu s'il s'agit d'une administration locale ou loco régionale ou dans le sang et les tissus périphériques s'il s'agit d'une administration systémique. L'expression « maintenir sensiblement constante » signifie que la concentration du siRNA dans le sang et les tissus périphériques peut légèrement varier selon le métabolisme de l'individu qui reçoit ladite composition. Par continue on entend l'administration sans interruption de la composition pendant une durée de 1 jour à plusieurs mois, par exemple 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, lOjours, 11 jours, 12jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 3 semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois, 1 an, 2 ans.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration continue est délivré sans interruption pendant une durée supérieure ou égale à 2 jours.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration continue est délivré sans que l'administration ne soit interrompue au-delà du temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, pendant une durée d'administration allant de 2 jours à 1 an, par exemple 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 3 semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois, 1 an.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration continue est délivré par cycles successifs, interrompus par une période sans traitement allant de plus de 24 heures à quelques semaines, chaque cycle étant défini par l'administration continue sans interruption supérieure au temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, et pendant une durée d'administration allant de 2 jours à 1 mois.
Selon l'invention, on entend par administration intermittente tout mode d'administration dans lequel la période d'administration du produit (par exemple, 10 secondes, 1 minute, 1 heure, 2 heures, 4 heures ...) est suivie d'une période pendant laquelle le produit n'est pas administré (par exemple, 1 heure, 2 heures, 6 heures, 24 heures, 1 semaine ...). Il peut, par exemple et de façon non limitative, s'agir d'une administration en bolus, unique ou répétée dans le temps ou encore d'une infusion lente sur une période de quelques heures, conduisant au cours du temps à une variation significative de la concentration du produit dans le tissu ou l'organisme.
La mortalité par cancer résulte fréquemment de la dissémination des cellules cancéreuses dans des sites secondaires, formant des métastases. L'administration par voie systémique de siRNA bispécifiques siARH2AX, qui les distribue dans plusieurs tissus et organes, est donc avantageuse pour traiter des cancers métastasés ou susceptibles de le devenir. Dans ce qui suit, on entend par systémique le fait que le siRNA est véhiculé dans l'organisme pour agir à distance de l'endroit où il est administré, par opposition à une administration locale ou loco-régionale, notamment par opposition à une administration intratumorale. La distribution de façon systémique dans l'organisme est obtenue par toute méthode qui entraîne un passage du siRNA dans les fluides extracellulaires comme par exemple le sang, la lymphe ou le liquide céphalo- rachidien, que le composé contenant le siRNA soit ingéré (voie orale), ou injecté (voie parentérale), ou qu'il pénètre à travers la peau ou les muqueuses. L'administration systémique peut s'effectuer par administration d'une dose unique ou répétée de ladite composition, de façon intermittente ou bien encore par l'utilisation d'une pompe externe ou implantable, ou de tout autre dispositif, ou composé biodégradable permettant une libération lente et continue de ladite composition, de telle sorte que le siRNA bispécifique siARH2AX soit véhiculé via les fluides extracellulaires de façon systémique dans l'organisme. Dans un aspect particulier, ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapéritonéai, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, intrathécal, intracérébral, oral, et est notamment sous-cutané.
Dans un aspect préféré, ledit mode d'administration est continu, par voie sous-cutanée.
Tampon et cations
Dans un aspect particulier, les siARH2AX selon l'invention sont administrés par voie systémique ou locale en étant formulés dans une solution tampon à pH acide.
Une solution tampon suivant la présente invention assure la stabilité du pH de la solution de dilution du siRNA. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le Tableau 3.
Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de la solution tampon est acide, allant de pH 3 à pH 7, préférentiellement de pH 5 à pH 6.5 et préférentiellement à pH 6.
Dans un aspect préféré de l'invention la solution tampon est un tampon citrate ou histidine à pH 6.
Dans un aspect particulier, les siRNA siARH2AX selon l'invention sont administrés par voie systémique ou locale dans une solution tampon à pH acide additionnée de cations provenant de sels minéraux ou organiques. Ces cations au sens de l'invention ne sont pas des constituants de la solution tampon, ils ne sont pas destinés à assurer un effet tampon, mais ils sont ajoutés à cette solution tampon. Ces cations sont par exemple et de façon non limitative des polyamines, notamment la putrescine, et/ou la spermidine, et/ou la spermine, et/ou des sels dont le cation est choisi parmi les cations métalliques tels que par exemple Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, le contre ion pouvant être d'une nature quelconque, par exemple un ion chlorure, nitrate, sulfate, ou carbonate. Dans un aspect préféré de l'invention, la solution tampon contient du MgC12, du ZnC12, du MnC12, ou un mélange deux à deux de ces sels, ou un mélange des trois sels.
Dans un aspect particulier, qu'ils soient utilisés seuls ou en combinaison, la concentration de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05 à 100 mM et préférentiellement de i à 50mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, les cations sont ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon histidine. Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de cette solution est de 6.
Doses
Dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration du siRNA siARH2AX bispécifique à une dose thérapeutiquement efficace, et en particulier à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour. De « 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour » s'entend de toutes les doses comprises de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5 ; 1.0 ; 1.5 ; 10.0 ; 10.5 ; 14.0 ; 14.5 ; 20 ; 20.5 ; 25 ; 25.5 ; 29.5 mg/kg/jour. Association avec un traitement induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation
Dans un aspect particulier de l'invention, ladite composition est utilisée en association avec un traitement induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation et ledit traitement étant choisi parmi la radiothérapie et/ou la chimiothérapie.
La radiothérapie fait référence à une méthode de traitement locorégional des cancers, utilisant des radiations pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se multiplier. La technique et les modalités de traitement radiothérapeutique, notamment les doses de radiation délivrées, sont adaptées en fonction du cancer et du patient. On distingue trois grandes techniques de radiothérapie que sont la radiothérapie externe, la curiethérapie et la radiothérapie métabolique vectorielle. Chacune d'elle possède ses indications selon le type de tumeur et sa localisation.
- La radiothérapie externe est la plus connue et la plus utilisée. La source de rayonnement, à l'extérieur du patient, produit des faisceaux de rayons X haute énergie et des faisceaux d'électrons.
- La curiethérapie, aussi appelée brachythérapie, est une radiothérapie locale par implantation de grains ou d'aiguilles radioactifs. Une telle thérapie est notamment utilisée dans le traitement des cancers de la prostate.
- La radiothérapie métabolique vectorielle, est une technique de radiothérapie reposant sur l'administration par voie orale ou par injection d'un agent radio-pharmaceutique marqué par un radioélément. L'isotope radioactif va se fixer préférentiellement sur les cellules cibles malades. Par exemple l'iode 131 se fixe sur la thyroïde. Les douleurs métastatiques osseuses peuvent ainsi être traitées par exemple par injection de samarium 153, de chlorure de strontium liquide marqué au strontium 894, ou de chlorure de radium 223.
La chimiothérapie fait référence à un traitement médicamenteux (agents chimiothérapeutiques cytostatiques et antinéoplasiques) contre le cancer.
Dans un aspect particulier, ladite chimiothérapie entraînant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation est effectuée à l'aide d'au moins un agent chimiothérapeutique choisi parmi : les agents alkylants, les agents anti-métabolites, les antibiotiques cytotoxiques, les inhibiteurs de topoisomérase I, les inhibiteurs de topoisomérase II, les antibiotiques anti-tumoraux, les agents génotoxiques, les inhibiteurs de la PARP (poly(ADP-ribose) poiymerase), les agents inhibant la formation et la dissociation des microtubules, comme les vinca-alcaloïdes, les taxanes ou les épothilones,
Dans un aspect particulier, un agent chimiothérapeutique est notamment choisi parmi :
Arabinosylcytosine, Bleomycine, Busulfan, Capecitabine, Carboplatine, Carmustine, Chlorambucil, Cisplatine, Cladribine, Cyclophosphamide, Dacarbazine, Daunorubicine, Doxorubicine, Epirubicine, Etoposide, Floxuridine, Fludarabine, Fluorouracil et notamment 5-Fluorouracil, Gemcitabine, Hydroxyurée, Idarubicine, Ifosfamide, Iniparib, Irinotecan, Lomustine, Mechlorethamine, Melphalan, Mercaptopurine et notamment 6-Mercaptopurine, Methotrexate, Mitomycine C, Mitoxantrone HC1, Mustine, Niraparib, Olaparib, Oxaliplatine, Procarbazine, Rubitecan, Rucaparib, Streptozocin, Talazopanib, Thioguanine et notamment 6-Thioguanine, Topotecan, Veliparib, Actinomycine D, Amsacrine, Anthracyclines, Camptotécine, Epipodophyllotoxine, Plicamycine, Temozolomide, Vincristine, Vinblastine, Vinorelbine, Paclitaxel, Docétaxel, Cabazitaxel, Taxanes, Epotliilones.
Dans un aspect particulier, ladite thérapie entraînant des lésions de i'ADN ou empêchant leur réparation et l'administration de ladite composition contenant au moins un siRNA siAR-H2AX bispécifique sont simultanées ou successives. Le terme « successives » s'entend selon l'invention de l'expression « séparées, étalées dans le temps ».
Dans un aspect particulier, l'invention concerne également un produit de combinaison contenant :
- un siRNA choisi parmi : si ARH2AX- 1 , siARH2AX- 1 b et
au moins un agent chimiothérapeutique entraînant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation
pour une utilisation simultanée ou successive dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer.
Dans un aspect, l'invention concerne également un produit de combinaison contenant :
- un siRNA choisi parmi : siARH2AX-l, siARH2AX-lb et
- au moins un agent radiopharmaceutique qui entraine une lésion de l'ADN,
pour une utilisation simultanée ou successive dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer.
Dans un aspect, l'invention concerne également un produit de combinaison formulé pour une administration locale intermittente ou continue contenant :
- un siRNA choisi parmi : siARH2AX-l, siARH2AX-lb et
- un traitement de curiethérapie qui entraine une lésion de l'ADN,
pour une utilisation simultanée ou successive dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer
Dans un aspect particulier, le cancer est une tumeur primaire, ou une métastase d'une tumeur primaire.
Dans un aspect particulier, le cancer est un carcinome adrénocortical, œsophagien, gastrique, des cellules basales, de la thyroïde ou de l'utérus, un astrocytome, un glioblastome, un oligodendrogliome, un méningiome, un thymome, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un myélome, un cancer gastro-intestinal, de la vessie, du sein, du col de l'utérus, de la tête et du cou, du poumon non à petites cellules, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du testicule, du thymus, du rein, des glandes salivaires, de l'endomètre, de l'anus, du colon, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du cœur, de l'estomac, du foie, de la gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'œsophage, des os, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, du rectum, des surrénales, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vulve, un adénocarcmome du colon, du rectum, une tumeur desmoïde, un fibrome du nasopharynx, un sarcome, un ostéosarcome, un leimyosarcome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, un phéochromocytome ou les métastases de ces cancers se développant dans d'autres organes.
Dans un autre aspect de l'invention, ladite composition comprenant au moins un siRNA bispécifique, ledit siRNA s'hybridant en totalité ou partiellement à la fois avec un ARNm codant le récepteur des androgènes et avec un ARNm codant H2AX, de telle sorte que cette hybridation induise la dégradation de ces ARNm ou en inhibe la traduction, le dit siRNA étant choisi parmi les siRNA siARH2AX-l , de SEQ ID NO 1 et SEQ 1D NO 2 ou siARH2AX-Ib, de SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, tels que décrits dans le Tableau 1, est utilisée seule pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer, en particulier un carcinome adrénocortical, œsophagien, gastrique, des cellules basales, de la thyroïde ou de l'utérus, un astrocytome, un glioblastome, un oligodendrogliome, un méningiome, un thymome, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un myélome, un cancer gastro-intestinal, de la vessie, du sein, du col de l'utérus, de la tête et du cou, du poumon non à petites cellules, de l'ovaire, du pancréas, du testicule, du thymus, du rein, des glandes salivaires, de l'endomètre, de l'anus, du colon, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du cœur, de l'estomac, du foie, de la gorge, de fa langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'œsophage, des os, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, du rectum, des surrénales, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vulve, un adénocarcinome du colon, du rectum, une tumeur desmoïde, un fibrome du nasopharynx, un sarcome, un ostéosarcome, un leimyosarcome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, un pheochromocytome ou les métastases de ces cancers se développant dans d'autres organes.
Selon l'invention, ladite prévention et/ou ledit traitement est effectué chez un patient humain ou chez un mammifère.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique peut présenter des modifications chimiques sur l'un et/ou l'autre brin, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3' ou 5', et/ou sur un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne. Des exemples de modifications chimiques se trouvent dans le paragraphe intitulé « modifications chimiques ».
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxyfhymidines.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un aspect particulier, ladite composition ne contient ni agent de vectorisation ni molécule d'adressage ou contient un agent de vectorisation mais pas de molécule d'adressage ou contient une molécule d'adressage mais pas d'agent de vectorisation ou contient un agent de vectorisation et une molécule d'adressage. Des exemples d'agents d'adressage se trouvent dans le paragraphe intitulé « Agents de vectorisation et molécules d'adressage »
La molécule d'adressage peut être soit associée au siRNA sans liaison covalente, soit couplée de façon covalente avec l'un ou l'autre des deux brins du siRNA, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple une nanoparticule ou un liposome contenant le siRNA, de façon à adresser l'agent de vectorisation vers la cellule ou le tissu cible.
Dans un aspect particulier, ladite composition contenant le siRNA siARH2AX bispécifique est formulée pour un mode d'administration systémique, locale, ou loco-régionale, en dose unique ou répétées de façon intermittente ou bien de façon continue.
Dans un aspect particulier, les siARH2AX selon l'invention sont administrés par voie systémique ou locale en étant formulés dans une solution tampon à pH acide. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le tableau 3.
Dans un aspect particulier, la solution tampon est un tampon citrate ou histidine.
Dans un aspect préféré, la solution tampon à pH acide est additionnée ou non de cations provenant de sels minéraux ou organiques. Des exemples de cations se trouvent dans le paragraphe intitulé « tampon et cations ».
La concentration de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05 à 100 mM et préférentiellement de 1 à 50mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, les cations sont ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon histidine.
Dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration du siRNA siARH2AX bispécifique à une dose thérapeutiquement efficace, et en particulier à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour. De « 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour » s'entend de toutes les doses comprises de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5 ; 1.0 ; 1.5 ; 10.0 ; 10.5 ; 14.0 ; 14.5 ; 20 ; 20.5 ; 25 ; 25.5 ; 29.5 mg/kg/jour.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne également des compositions contenant au moins un siRNA choisi parmi les siRNA siARH2AX-1, de SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou siARH2AX-lb, de SEQ ÏD NO 3 et SEQ ID NO 4, tels que décrits dans le Tableau 1, ledit siRNA étant dans une solution tampon à pH acide. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le tableau 3.
Dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique, locale, ou loco-régionale, en dose unique ou répétées de façon intermittente ou bien de façon continue.
Dans un aspect particulier, la solution tampon est un tampon citrate ou histidine.
Dans un aspect préféré, la solution tampon à pH acide est additionnée ou non de cations provenant de sels minéraux ou organiques. Des exemples de cations se trouvent dans le paragraphe intitulé « tampon et cations ».
La concentration de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05 à 100 mM et préférentiellement de 1 à 50mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, les cations sont ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon histidine.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne également des compositions contenant au moins un siRNA choisi parmi les siRNA siARH2AX-1, de SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou siARH2AX- lb, de SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, ledit siRNA étant dans une solution tampon à pH acide, ladite solution tampon étant notamment un tampon citrate ou histidine, ladite solution tampon étant additionnée de cations provenant de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique peut présenter des modifications chimiques sur l'un et/ou l'autre brin, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3' ou 5', et/ou sur un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne. Des exemples de modifications chimiques se trouvent dans le paragraphe intitulé « modifications chimiques ».
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines .
Dans un aspect particulier, ledit siRNA AR-H2AX bispécifique est dépourvu de modification chimique et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines .
Dans un aspect particulier, ladite composition ne contient ni agent de vectorisation ni molécule d'adressage ou contient un agent de vectorisation mais pas de molécule d'adressage ou contient une molécule d'adressage mais pas d'agent de vectorisation ou contient un agent de vectorisation et une molécule d'adressage. Des exemples d'agents d'adressage se trouvent dans le paragraphe intitulé « Agents de vectorisation et molécules d'adressage »
La molécule d'adressage peut être soit associée au siRNA sans liaison covalente, soit couplée de façon covalente avec l'un ou l'autre des deux brins du siRNA, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple une nanoparticule ou un liposome contenant le siRNA, de façon à adresser l'agent de vectorisation vers la cellule ou le tissu cible.
Dans un aspect particulier, ladite composition est utilisée en association avec un traitement induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation et ledit traitement étant choisi parmi la radiothérapie et/ou la chimiothérapie. Des exemples de radiothérapies ou d'agents chimiothérapeutiques se trouvent dans le paragraphe intitulé « association avec un traitement induisant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation ».
Dans un aspect particulier, ledit siRNA siARH2AX bispécifique compris dans ladite composition est à une dose thérapeutiquement efficace, et en particulier à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour. De « 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour » s'entend de toutes les doses comprises de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5 ; 1.0 ; 1.5 ; 10.0 ; 10.5 ; 14.0 ; 14.5 ; 20 ; 20.5 ; 25 ; 25.5 ; 29.5 mg/kg/jour.
Pour chacune des séquences (SEQ ID NO) numérotées de 1 à 4 du Tableau 1 :
- La première colonne indique la dénomination du siRNA.
La deuxième colonne indique la composition du siRNA, constitué par l'association d'un oligonucléotide de type brin 1 (respectivement lb) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité avec cet oligonucléotide de type brin 1 (respectivement lb),
et d'un oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité avec cet oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b).
La troisième colonne indique la numérotation de l'oligonucléotide telle que déposée La quatrième colonne indique la séquence dans l'orientation 5' vers 3'. La notation [dT][dT] est utilisée pour indiquer la présence de deux désoxythymidines débordantes.
Lorsque les siRNA indiqués dans le Tableau 1 sont constitués de deux oligonucléotides simple brin dont la séquence est à 100% identique à celle inscrite dans le Tableau, la séquence cible (c'est-à-dire la séquence de l'ARNm à laquelle le brin guide de ce siRNA s'hybride) de ces siRNA est présente chez l'homme dans tous les ARNm codant pour le récepteur des androgènes, que ce récepteur soit sauvage, qu'il présente des variations d'épissage conduisant à la délétion partielle ou totale du domaine de liaison des hormones (variant AR-V7 par exemple) ou qu'il présente une des mutations décrite dans les cancers de la prostate.
Pour chacune des lignées cellulaires utilisées dans les exemples, la seconde colonne indique l'origine tissulaire des cellules, le niveau d'ARNm codant pour AR a été mesuré par RT-qPCR dans ces lignées et normalisé par celui de l'ARNm codant pour la cyclophiline A (méthode delta CT). Les résultats, portés dans la troisième colonne, sont exprimés en unités arbitraires, le niveau mesuré dans les cellules 22RV1 étant considéré comme 100 000.
L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci -après visent à éciaircir l'objet de invle' ntion et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas ne visent à restreindre la portée de l'invention. Légende des figures :
Figure 1 : Représentation schématique de la méthode de quantification d'un siRNA par RT qPCR. Exemple de gamme de référence.
Figure 2 : Comparaison de la complémentarité des séquences des siRNAs de l'invention|ei de celle du siRNA siAR2 avec l'ARNm codant chez l'homme le récepteur des androgènes et avec celui codant H2AX.
Les positions indiquées correspondent respectivement à celles de l'ARNm du récepteur des androgènes humain (AR, Numéro d'accession : NM_00044.3, SEQ ID NO : 5) et de l'ARNm de H2AX chez l'homme (Numéro d'accession : NM_002105.2, SEQ ID NO : 6).
Les bases soulignées sont celles qui sont parfaitement complémentaires de celles du brin guide des siRNA indiqués. Les siRNA indiqués sont composés d'oligonucléotides 100% identiques à ceux décrits dans le tableau 1.
Les cadres gris indiquent la région de nucléation (seed région), c'est-à-dire les nucléotides allant de
2 à 8 inclus du brin guide du siRNA (sens 5' 3') et leur complémentarité avec l'ARNm codant H2AX.
Figure 3 : Quantification par RT-qPCR des ARNm codant AR et H2AX 48h après transfection dans les cellules C4-2 du siRNA contrôle (Cont, barres noires), du siAR2 (barres grises) ou du siARH2AX-l
(barres blanches). Le niveau d'expression de chaque ARNm est exprimé par rapport à celui mesuré dans les cellules transfectées par un siRNA contrôle.
Figure 4 : Quantification par RT-qPCR des ARNm codant AR, PSA et H2AX 72h après transfection dans les cellules LNCaP ou C4-2 d'un siRNA contrôle (cont, barres noires), de siAR7 (barres gris foncé), ou de siARH2AX-l (barres blanches). Le niveau d'expression de chaque ARNm est exprimé par rapport à celui mesurés dans les cellules transfectées par un siRNA contrôle.
Figure 5 : Quantification par RT-qPCR des ARNm codant AR et H2AX 72h après transfection dans les cellules LNCaP ou MDA MB -453 d'un siRNA contrôle (cont, barres noires), de siH2AX (barres gris foncé), de siARh (barres gris clair), ou de siARH2AX-l (barres blanches). Pour chaque type cellulaire, le niveau d'expression de chaque ARNm est exprimé par rapport à celui mesuré dans les cellules transfectées par un siRNA contrôle.
Figure 6 : ïmmuno détection par western blot de l'expression d'AR et de H2AX 72h après transfection de cellules C4-2 par un des siRNA suivants : Contrôle (Cont), siARH2AX-l , siARh, siH2AX, ou un mélange des deux siRNA siH2AX et siARh.
Figure 7 : Immuno détection par western blot de l'expression d'AR, de H2AX et de γΗ2ΑΧ 72h après transfection de cellules PC3 par un des siRNA suivants : Contrôle (Cont), siAR7 ou siARH2AX-l .
Figure 8 : Immuno détection de γΗ2ΑΧ (première colonne) et de 53BP1 (deuxième colonne) dans des cellules C4-2 traitées pendant 6h par de la bléomycine (10μΜ) ou le véhicule ajouté 72 h après transfection des cellules par un siRNA contrôle (Cont), le siRNA siAR7, ou siARH2AX-l.
Figure 9 : Mesure de la viabilité cellulaire par un test WST1 de cellules MDA MB231 ou C4-2 90h après transfection d'un siRNA contrôle (barres noires) de siAR2 (barres grises) ou de siARH2AX-l (barres blanches). Les valeurs mesurées sont rapportées à la moyenne des valeurs mesurées dans la condition contrôle (siRNA contrôle, véhicule).
Figure 10 : Panneau de gauche : Viabilité des cellules 22RV1, MDA MB-453, U87, WM266-4 et MDA MB231 mesurée par un test WST1 72h après transfection d'un siRNA contrôle (Cont), de siARh, de siH2AX ou de siARH2AX. Panneau de droite : Viabilité des cellules LNCaP ou C4-2 mesurée par un test WST1 72h après transfection d'un siRNA contrôle (Cont), de siAR7, ou de siARH2AX. Pour chaque lignée, les résultats sont rapportés à la viabilité des cellules dans la condition contrôle.
Figure 11 : Mesure de la viabilité cellulaire par un test WST1 de cellules C4-2 transfectées pendant 48h par un siRNA contrôle (barres noires), siAR2 (barres grises) ou siARH2AX-l (barres blanches) puis incubées pendant 48h dans un milieu contenant 10μΜ de bleomycine ou 10μΜ d'étoposide ou le véhicule. Les valeurs mesurées sont rapportées à la moyenne des valeurs mesurées dans la condition contrôle (siRNA contrôle, véhicule).
Figure 12 : Viabilité des cellules LNCaP ou C4-2, mesurée par un test métabolique WST1, 48h après traitement par de la bléomycine 10μΜ ou par son véhicule ajoutés 24 h après transfection des cellules par un siRNA contrôle (Cont) ou par siARH2AX-1. Les mesures de viabilité des différents échantillons sont rapportées à la moyenne des valeurs mesurées dans les cellules cultivées en condition contrôle (siRNA contrôle sans bléomycine) considérée comme 100%.
Figure 13 : Viabilité des cellules MDA MB231 et WM266-4, mesurée par un test métabolique WST1, 48h après traitement par de l'étoposide 40μΜ ou par son véhicule ajoutés 24 h après transfection des cellules par un siRNA contrôle (Cont, barres noires), par le siRNA siH2AX (barres gris foncé), le siRNA siARh (barres gris clair) ou par siARH2AX-l (barres blanches). Les mesures de viabilité des différents échantillons sont rapportées à la moyenne des valeurs mesurées dans les cellules cultivées en condition contrôle (siRNA contrôle sans bléomycine) considérée comme 100%.
Figure 14 : Inhibition des métastases osseuses de cancers de la prostate par administration systémique continue de si ARH2AX-1.
Panneau de gauche : Niveau d'expression de l'ARNm d'AR humain, dans le tibia de souris nude porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 chez des souris traitées par le véhicule (NaCl 154 mM, barre noire) ou par le siARH2AX-l dilué dans ce véhicule (barre grise) et administré par voie sous cutanée de façon continue pendant 3 semaines (moyenne ± SEM, n=7 valeurs rapportées à la valeur de la moyenne du groupe NaCl).
Panneau de droite : Charge métastatique dans l'os, mesurée par l'expression de l'ARNm de l'HPRT humain dans les deux groupes d'animaux. Chaque barre représente la charge métastatique osseuse dans une souris. "0" indique que l'ARNm de l'HPRT n'a pas été détecté chez cet animai.
Figure 15 : Quantification par RT-qPCR dans le sérum, différents organes et des tumeurs du siARH2AX-l administré par voie sous cutanée de façon continue pendant 3 jours, dilué soit dans une solution de NaCl 154 mM (barres grises) soit dans un tampon citrate à pH 6 contenant lOmM de MgC12 (barres noires) (moyenne ± SEM, n=4, valeurs rapportées à la valeur de la moyenne du groupe NaCl dans le sérum). Figure 16 : Effet d'une composition comprenant le siRNA siH2AX-l et un ligand du récepteur CD36 administré en dose unique sur la distribution du siRNA in vivo. Quantification par RT-qPCR dans le sérum (panneau A) ou différents organes (panneau B) du siARH2AX-l 10 minutes après administration par voie sous cutanée à la dose unique de 0.12mg/kg formulé soit dans une solution de NaCl 154 mM (NaCl), ou en tampon citrate 10mM pH 6 contenant de l'hexaréline, (siAR-l :hexaréline 1 :1, poids/poids), ou des LDL oxydés (siAR-1 :LDL oxydés 1 :0.1, poids/poids), La moyenne de chaque groupe (3 souris par groupe) a été rapportée à la moyenne des valeurs du groupe NaCl.
Figure 17 : Effet d'une composition comprenant le siRNA siH2AX-1 et un ligand du récepteur CD36 administrée de façon systémique par voie sous cutanée continue sur la distribution du siRNA in vivo.
Des pompes osmotiques délivrant de façon continue pendant 3 jours 2mg/kg/jour du siRNA siARH2AX-l ont été implantées en sous cutané chez souris porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1. Le siRNA a été formulé soit dans une solution saline (NaCl 154mM, barres grises), soit dans un tampon citrate lOmM à pH 6 contenant 1 OmM de MgC12 et additionné de LDL oxydés (siARH2AX-l :LDL oxydés 1 :0,1, poids/poids) (barres noires). Le siARH2AX- 1 a été quantifié par RT-qPCR à la fin des 3 jours de traitement. La moyenne de chaque groupe (3 souris par groupe) a été rapportée à la moyenne des valeurs dans le sérum du groupe NaCl. L'axe des ordonnées indique la concentration de siARH2AX-1 rapportée à celle mesurée dans le sérum des souris ayant reçu le siRNA dilué dans une solution de NaCl.
Figures 18 : Volume en fonction du temps de tumeurs C4-2 se développant par des souris nude traitées trois fois par semaine par le véhicule (DMSO) (losanges noirs), de l'étoposide à la dose de 5 mg/kg (losanges gris clair), ou de 10mg/kg (losanges gris foncés), ou bien traités en par administration continue par voie sous cutanée du siRNA siARH2AX-l (triangles blancs), administré seul ou en combinaison avec de l'étoposide à la dose de 5 (triangles gris clair) ou 10 (triangles gris foncé) mg/kg trois fois par semaine.
EXEMPLES
Exemple 1 : méthodes
1- siRNA utilisés
Un siRNA ne s'hybridant avec aucun ARNm connu (siRNA Contrôle) a été utilisé. Ce siRNA, Cont, est composé des deux oligonucléotides suivants:
Quatre siRNA inhibant AR sont utilisés :
- Le siRNA siARH2AX-lest composé des deux oligonucléotides SEQ NO 1 et SEQ NO 2 tels qu'indiqués dans le Tableau 1.
- Le siRNA siAR2, décrit dans la demande PCT/FR2002/003843 est composé des deux oligonucléotides suivants : Deux autres siRNA s'hybridant avec l'ARNm d'AR mais pas avec celui de H2AX ont été utilisés. SiARh s'hybride avec une séquence du premier exon d'AR, siAR7 avec une séquence du 7° exon d'AR. Ces siRNA sont composés des deux oligonucléotides suivants:
Un siRNA, siH2AX, s'hybridant avec l'ARNm de H2AX mais pas avec celui d'AR a également été utilisé. Ce siRNA est composé des deux oligonucléotides suivants:
2- Lignées cellulaires, conditions de culture et de transfection, mesure de l'expression génique Toutes les cellules utilisées dans les exemples suivants sont des cellules humaines et expriment H2AX.
Le Tableau 2 indique l'origine des lignées et le niveau d'expression relatif de l'ARNm d'AR, mesuré par RT-qPCR normalisé par rapport à l'expression de la cyclophiline-A et exprimé en unités arbitraires (22RV1 = 100 000).
Les cellules sont cultivées en DMEM ou en RPMI additionné de 10% de sérum de veau fœtal, ou selon les recommandations de l'ATCC. Lorsque qu'indiqué, elles sont transfectées par des siRNA en utilisant la lipofectamine (Life Technologies), suivant le protocole du fournisseur. Le nombre de cellules vivantes après les traitements indiqués a été quantifié en mesurant leur activité métabolique par le test WST1 suivant les indications du fournisseur (Roche).
L'effet de la transfection des siRNA et/ou des traitements par les différents agents chimiothérapeutiques sur l'expression génique a été mesuré :
- par quantification par RT-qPCR des ARNm extraits par une méthode conventionnelle au phénol - chloroforme (Trizol). La quantité d'ARN a été normalisée en mesurant l'ARNm codant la cyclophiline A qui n'est pas régulé par AR (méthode delta delta CT).
- par Western blot sur des extraits protéiques. Les anticorps utilisés sont les suivants :
AR: Santacruz, N-20 sc-816 ; H2AX : Merck Millipore ref 07-627 ; Tubuline : Sigma T6199 ; Actine : Merck Millipore MAB 1501 ; γΗ2ΑΧ : Merck Millipore 05-636
L'immuno détection de la tubuline ou de l'actine est utilisée pour s'assurer d'analyser des quantités comparables de protéines dans les différentes conditions.
- par immunofluorescence indirecte sur les cellules cultivées sur lamelle de verre et fixées. Les anticorps utilisés sont les suivants : γΗ2ΑΧ : Merck Millipore 05-636 ; 53BP1 : Novus, NB 100-304. 2- Quantification de siRNA par une méthode de RT-PCR quantitative modifiée
Pour quantifier un siRNA dans les échantillons biologiques, les inventeurs ont développé une méthode de réverse transcription suivie d'une PCR quantitative (RT-qPCR). Pour chaque siRNA, une amorce tige-boucle spécifique, présentant 8 nucléotides débordants est synthétisée, les 8 nucléotides étant complémentaires des 8 nucléotides de l'extrémité 3' du brin guide (antisens) du siRNA. Après une étape de reverse transcription, ie produit obtenu est amplifié par PCR à l'aide de deux amorces, l'une s'hybridant avec la région correspondant à la boucle de l'amorce de reverse transcription. Les 12 nucléotides en 3' de la seconde amorce ayant une séquence ADN correspondant aux 12 nucléotides de l'extrémité 5' du cDNA nouvellement synthétisé après reverse transcription du brin guide du siRNA. La détection de l'amplification est réalisée de façon continue par la dégradation d'une sonde fluorescente Taqman ou par incorporation de SybrGreen.
Une gamme de siRNA double brins, de 103 à 109 copies dans la réaction de RT, diluées dans de Peau est réalisée et traitée en même temps que les échantillons par RT-qPCR. La Figure 1 représente schématiquement la méthode de RT-qPCR et un exemple de gamme montrant la relation entre le nombre de copies présentes dans la réaction et le CT (cycle threshold ou seuil d'amplification) obtenu.
Les échantillons biologiques dans lesquels les siRNA sont quantifiés sont soit du sérum, soit des ARN totaux extraits à partir de fragments de tissus de poids connu supposés contenir le siRNA. Ces ARN sont extraits par des méthodes conventionnelles telles que par la méthode au phénol-chloroforme (extraction au trizol). Après extraction, ils sont dilués dans de l'eau ;
Les valeurs des CT obtenus pour chaque échantillon sont comparées à celles obtenues pour la gamme.
Ceci permet de calculer le nombre de copies de siRNA présent dans l'échantillon dosé. Les valeurs sont alors rapportées d'abord à la quantité d'ARN total réverse transcrit, puis au poids de tissu dont les ARN ont été extraits ou au volume de sérum, et les résultats finaux sont exprimés en moles/L (M) en considérant que la densité de tous les tissus est de lg/cm3.
3- Greffe de cellules tumorales chez les souris
Les tumeurs sont obtenues par injection sous cutanée de cellules tumorales dans le flanc de souris Nude. Seuls les animaux sur lesquels la prise tumorale est constatée sont inclus dans l'étude et randomisés pour recevoir le traitement ou le traitement contrôle.
Lorsque qu'indiqué, l'Etoposide, dilué dans du DMSO puis ajusté à la concentration requise dans une solution de NaCl 154mM, est injecté par voieintrapéritonéale à la dose indiquée, 3 fois par semaine.
Tous les siRNA sont dilués dans de l'eau contenant 154mM de NaCl ou dans le tampon indiqué.
Lorsqu'indiqué, l'administration continue de siRNA est réalisée par implantation d'une pompe osmotique Alzet en sous cutané sur le dos des souris, du côté opposé à la tumeur lorsque les souris en portent une. La concentration du siRNA dans la pompe est ajustée pour délivrer la quantité indiquée en mg/kg/jour en tenant compte du débit de la pompe indiqué par le fabricant.
Le volume des tumeurs sous cutanées est estimé en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse le plus grand (D), le plus petit (d) diamètre des tumeurs et leur hauteur (h). Le volume est calculé par la formule V= DxdxhxPi/6. En fin d'expérience, les animaux sont sacrifiés, le sérum, les tumeurs et différents tissus sont disséqués, les ARN extraits et les siRNA présents dans ces ARN sont quantifiés.
Tous les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés par les comités d'éthique et autorités réglementaires françaises. Ils sont mis en œuvre de façon à limiter le nombre d'animaux utilisés et à éviter toute souffrance inutile.
Exemple 2 : les siRNA siARH2AX-l et siARH2AX-lb de l'invention sont bispécifiques.
Les alignements indiqués dans la Figure 2 montrent que les 19 bases de siARH2AX- l et les 21 bases de siAR2 sont parfaitement complémentaires de I'ARNm de AR. Cette figure montre également que 17 bases sur 19 de siARH2AX- 1 et 17 bases sur 21 de siAR2 s'hybrident avec celles de I'ARNm codant H2AX. La présence de deux déoxythymidines débordantes à ces siRNA est sans effet sur l'hybridation de ces siRNA.
La région de nucléation des siRNA siARH2AX-1 et siARH2AX-lb c'est-à-dire les nucléotides 2 à 8 inclus de la séquence 5' vers 3' de leur brin guide, (encadré gris sur la Figure 1) est parfaitement complémentaire (7 bases sur 7, soit 100%) de I'ARNm de H2AX. Cette complémentarité n'est en revanche que partielle, de 5 bases sur 7 soit seulement 71% pour siAR2, les nucléotides en position 2 et 3 de siAR2 n'étant pas complémentaires de I'ARNm de H2AX. Cette différence entraine une différence fonctionnelle entre siARH2AX-l et siAR2 comme illustré dans la Figure 3. Dans cette expérience, les cellules tumorales C4-2 ont été transfectées par les siRNA suivants: Cont, siARH2AX-1 ou siAR2. 48h après transfection, on observe que les siRNA siARH2AX-l et siAR2 inhibent l'expression d'AR de façon similaire. En revanche, le siRNA siAR2 dont la région de nucléation n'est que partiellement (71%) complémentaire de I'ARNm de H2AX est considérablement moins efficace pour inhiber l'expression de H2AX que le siRNA siARH2AX- 1 dont la région de nucléation est parfaitement complémentaire de I'ARNm de H2AX.
Dans les Figures 4, 5, 6 et 7, différentes lignées cellulaires ont été transfectées par siARH2AX-l et par deux autres siRNA ciblant respectivement une séquence de l'exon 1 (siARh), ou de l'exon 7 (siAR7) de AR mais qui ne ciblent pas H2AX, ou bien encore par un siRNA ciblant H2AX mais pas AR.
Dans l'expérience représentée à la Figure 4, les cellules tumorales LNCaP ou C4-2 ont été transfectées par les siRNA suivants : Cont, siAR7 ou siARH2AX-l . 72h après transfection, l'analyse des ARNm codant AR, codant le Prostate Spécifie Antigen, ou PSA, qui est un gène régulé par le récepteur des androgènes, et ceux codant H2AX montre que dans les deux lignées, siAR7 et siARH2AX-l inhibent de façon comparable l'expression d'AR et du PSA mais que seul siARH2AX-l inhibe aussi l'expression de H2AX, à plus de 90%.
De façon similaire, dans l'expérience représentée à la Figure 5, les cellules tumorales LNCaP ou MDA MB-453 ont été transfectées par les siRNA suivants : Cont, siH2AX, siARh, siARH2AX-l. Dans les deux lignées, siARh inhibe AR mais pas H2AX, siH2AX inhibe H2AX mais pas AR. Le siRNA siARH2AX-l inhibe à lui seul l'expression des deux ARNm codant AR et H2AX.
Dans l'expérience représentée à la Figure 6, l'expression protéique d'AR et de H2AX a été mesurée 72h après transfection des cellules C4-2 par les siRNA suivants : Cont, siARH2AX-l, siARh, siH2AX, et un mélange (1 :1) des deux siRNA siARh et siH2AX. siARh inhibe AR mais pas H2AX, siH2AX inhibe H2AX mais pas AR, le mélange des deux siRNA inhibe AR et H2AX. Le siRNA siARH2AX-l inhibe à lui seul l'expression des deux protéines AR et H2AX.
Dans l'expérience représentée à la Figure 7, les cellules tumorales PC3, qui expriment faiblement AR, ont été transfectées par les siRNA suivants : Cont, siAR7 ou siARH2AX-l. 72h après transfection, l'expression des protéines AR et H2AX a été mesurée. On observe que l'expression de H2AX est inhibée par siARH2AX-l mais par siAR7. L'inhibition de H2AX s'accompagne d'une inhibition de sa forme phosphorylée γΗ2ΑΧ.
Pris ensemble, ces résultats montrent que seul le siRNA siARH2AX-l a la capacité d'inhiber en même temps AR et H2AX. Le siRNA siARH2AX-1 est beaucoup plus efficace que le siRNA siAR2 pour inhiber l'expression de H2AX. Une différence de deux bases dans la région de nucléation de ces deux siRNA modifie donc profondément leur capacité à inhiber H2AX.
L'inhibition de H2AX par siARH2AX-l se produit dans des cellules exprimant AR fortement (LNCaP, C4-2), de façon intermédiaire (MDA MB253) ou faiblement (PC3).
Exemple 3 : L'inhibition de H2AX empêche le recrutement de 53BP1 sur les lésions de l'ADN induites par la bléomycine et diminue la viabilité cellulaire.
Dans l'expérience représentée à la Figure 8, des cellules C4-2 ont été transfectées par un siRNA contrôle ou par siARH2AX-l. 72h après transfection, les cellules ont alors été traitées pendant 6h par 10μΜ de bléomycine ou par le véhicule correspondant.
On observe que dans la condition contrôle (siRNA Cont, absence de bléomycine), γΗ2ΑΧ est détectable mais faiblement exprimé, tandis que l'expression de 53BP1 est majoritairement diffuse. Le traitement par la bléomycine augmente fortement l'expression de γΗ2ΑΧ tandis que le marquage de 53BP1 devient punctiforme, traduisant son recrutement via γΗ2ΑΧ sur les lésions de i'ADN induites par la bléomycine.
Dans les cellules transfectées par siAR7, la bléomycine induit une augmentation de marquage de γΗ2ΑΧ et du recrutement de 53BP 1.
Dans les cellules transfectées par siARH2AX-l, l'expression de H2AX est très réduite par rapport à la condition contrôle alors que l'expression de 53BP1 est comparable. Après traitement par la bléomycine, on ne voit dans les cellules transfectées par siARH2AX-l ni augmentation de H2AX, ni recrutement de 53BP1 sur des points focaux de réparation des lésions de l'ADN.
On conclut de cette expérience que le siRNA siARH2AX inhibe la réparation de l'ADN.
Exemple 4 : Le siRNA siARH2AX-l réduit la viabilité cellulaire quel que soit le niveau d'expression d'AR.
Dans l'expérience décrite à la Figure 9, on observe que 90 heures après transfection de cellules MDA MB231 qui expriment faiblement AR, ou de cellules C4-2, la viabilité des cellules transfectées par le siRNA siARH2AX est significativement réduite dans les deux lignées alors qu'elle ne l'est que marginalement dans les cellules transfectées par le siRNA siAR2.
Dans l'expérience représentée à la Figure 10, dans le panneau de gauche, les cellules ont été transfectées par un siRNA Contrôle (Cont), siH2AX, siARh, ou siARH2AX-l et dans le panneau de droite par un siRNA Contrôle, siAR7 ou siARH2AX-l. Les siRNA siARh et siAR7 inhibent la prolifération des cellules qui expriment fortement AR (22RV1, C4-2, LNCaP) mais pas celles d'autres lignées exprimant des niveaux intermédiaires ou faibles d'AR (MDA MB 453, MDA MB 231, WM 266-4, U87).
En revanche, le siRNA siARH2AX-1 inhibe la prolifération de toutes les lignées cellulaires, et ceci quel que soit le niveau d'expression d'AR, et quel que soit l'effet sur leur prolifération de l'inhibition d'AR par le siRNA siARh qui n'inhibe pas H2AX alors qu'un siRNA siH2AX qui n'inhibe que l'expression de H2AX sans affecter AR n'a que peu d'effet sur la prolifération cellulaire, quelle que soit la lignée.
On conclut de ces expériences qu'à lui seul, le siRNA siARH2AX-1 inhibe la prolifération cellulaire, que celle-ci dépende ou ne dépende pas de l'expression d'AR et qu'AR soii exprimé très fortement, à un niveau intermédiaire ou très faiblement dans ces cellules.
Exemple 5 : Les effets du siRNA siARH2AX-1 et d'agents induisant des lésions de l'ADN se potentialisent, indépendamment du niveau d'expression d'AR.
Dans l'expérience décrite à la Figure 11, 48h après transfection des cellules C4-2 par les siRNA cont, siAR2 ou siARH2AX-l, les cellules ont été traitées par ou un véhicule ou par l'étoposide (ΙΟμΜ) ou la bléomycine (ΙΟμΜ), agents de chimiothérapie induisant des dommages à l'ADN. 48h après addition des agents de chimiothérapie, on observe que la combinaison du siRNA siAR2 avec l'un ou l'autre de ces agents ne produit pas d'effet inhibiteur de la viabilité significativement supérieur à celui mesuré par l'agent chimiothérapeutique seul. En revanche, les effets de siARH2AX-l et de l'un ou l'autre des agents chimïothérapeutiques se potentialisent pour inhiber la viabilité cellulaire.
Dans l'expérience décrite à la Figure 12, 48h après transfection des cellules C4-2 par les siRNA Cont ou siARH2AX-1, les cellules ont été traitées par un véhicule ou par la bléomycine (ΙΟμΜ). On observe que la combinaison de siARH2AX-1 avec un traitement par la Bléomycine dans les cellules LNCaP produit des effets environ deux fois plus inhibiteurs de la survie cellulaire que ce qui serait attendu de l'addition des effets des deux traitements séparés, montrant une potentialisation de ces deux traitements.
Dans l'expérience représentée à la Figure 13, des cellules MDA MB 231 ou WM266-4 qui expriment faiblement AR ont été transfectées par un siRNA contrôle (Cont), siH2AX, siARh, ou par siARH2AX-1. 24h après transfection, les cellules ont été traitées par 40 μΜ d'éioposide ou par le véhicule puis la viabilité cellulaire, rapportée à celui des cellules en condition contrôle, a été mesuré par un test WST1 48 h plus tard. On observe que dans les deux lignées, l'étoposide inhibe la prolifération cellulaire. Lorsque ce traitement est associé avec l'inhibition de H2AX par le siH2AX, ou avec l'inhibition d'AR par le siRNA siARh, il n'y a pas d'amplification des effets de l'étoposide sur la prolifération. En revanche, les traitements par l'étoposide et par siARH2AX-l se potentialisent lorsqu'ils sont combinés.
On conclut de ces expériences qu'il est avantageux d'associer un traitement induisant des dommages à l'ADN avec le siARH2AX-1 pour inhiber la prolifération de cellules tumorales, y compris dans des cellules exprimant de faibles niveaux d'AR. Le siRNA siARH2AX-l est beaucoup plus efficace que le siRNA siAR2 pour inhiber l'expression de H2AX et la viabilité cellulaire, y compris dans des cellules exprimant faiblement AR. De plus, siARH2AX-1, mais pas siAR2, potentialise les effets inhibiteurs de la viabilité produits par des chimiothérapies. Exemple 6 : L'administration de siARH2AX-l à des souris porteuses de tumeur permet d'inhiber la dissémination métastatique.
Dans l'expérience représentée à la Figure 14, des cellules 22RV1 ont été implantées chez des souris Nude. Une fois la prise tumorale constatée, des pompes Alzet administrant soit 0.2 mg/kg/jour du siRNA siARH2AX-1 formulé dans une solution saline (NaCl 154mM), soit le véhicule seul, ont été implantées pendant 3 semaines. En fin de traitement, les os (tibia) ont été récupérés pour y quantifier le siARH2AX-l , et les ARNm d'origine humaine codant pour le récepteur des androgènes et l'HPRT.
L'administration du siRNA siARH2AX-1 par voie sous cutanée continue à des souris porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 permet d'inhiber l'expression du récepteur des androgènes dans les os des souris (Figure 14 panneau de gauche). Cette inhibition s'accompagne d'une diminution du nombre de souris développant spontanément des métastases osseuses de ces tumeurs et d'une diminution de la taille de ces tumeurs, évaluée par le niveau d'expression d'un ARNm humain (HRPT) dans les os (Figure 14 panneau de droite).
L'administration systémique continue par voie sous cutanée du siRNA siARH2AX-l permet donc de le délivrer dans les métastases d'un cancer se développant dans l'os, d'inhiber l'expression du gène cible du siRNA dans l'os et de limiter l'implantation et/ou le développement des métastases.
Exemple 7 : Amélioration de la distribution d'un siRNA par sa formulation
Dans l'expérience représentée à la Figure 15, des pompes osmotiques délivrant en continu le siARH2AX- 1 à la dose de 2 mg/kg/jour dilué soit en solution saline (NaCl 154mM), soit en solution dans un tampon citrate à pH 6 contenant lOmM de MgC12 (Cit/mg), ont été implantées en sous cutané chez des souris porteuses de tumeurs. Après 3 jours, le siARH2AX-l a été quantifié par RT-qPCR dans le sérum, différents organes et les tumeurs. On constate que par rapport à la formulation en solution saline, la formulation en tampon citrate à pH 6 additionné de lOmM de MgC12 augmente significativement la concentration de siARH2AX-l dans les tissus et les tumeurs.
Le récepteur CD36 est exprimé à la membrane externe des cellules endothéliales de nombreuses cellules tumorales et d'autres types cellulaires comme les macrophages. Ce récepteur CD36 lie différentes classes de ligands, comme des LDL oxydés ou le peptide hexaréline.
Dans l'expérience représentée à la Figure 16, le siRNA siARH2AX-1, à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans une solution de 154 mM de NaCl (groupe contrôle, noté NaCl) ou dans un tampon citrate 10 mM pH 6 additionné de 0.02 mM du peptide hexareline (Cit/Hexarelin) ou de 30 nM de LDL oxydés (Cit/LDL) a été administré en une injection sous cutanée en bolus à des groupes de souris adultes. 20 minutes après injection la concentration moyenne du siRNA mesurée dans le sérum (panneau A) ou les tissus (panneau B) de ces différents groupes de souris (4 souris par groupe), rapportée à la valeur de la moyenne du groupe contrôle, montre que l'ajout d'hexaréline ou de LDL oxydés augmente la concentration de siRNA dans le sérum et les tissus.
Dans l'expérience représentée à la Figure 17, une pompe osmotique a été utilisée pour administrer à des souris porteuses de tumeur prostatiques humaines 22RV1 , par voie sous cutanée et de façon continue pendant 3 jours le siRNA siARH2AX-l à la dose de 2mg/kg/jour. Le siRNA a été formulé soit en solution de NaCl 154 mM, soit dans un tampon citrate lOmM pH 6 contenant des LDL oxydés (siARH2AX-l : LDLox en rapport 1 : 0.1, poids : poids). La concentration de siARH2AX-l a été mesurée après 3 jours de traitement dans le sérum, différents organes et les tumeurs. On constate que l'ajout de LDL oxydés augmente la concentration de siARH2AX-l dans le sérum, différents organes et les tumeurs.
Exemple 8 : La combinaison de siARH2AX-l et d'un agent induisant des dommages à l'ADN potentialise l'effet de chacun de ces traitements administrés séparément sur le développement tumoral.
Dans l'expérience représentée à la Figure 18, une pompe osmotique a été implantée à des souris porteuse de tumeur prostatiques humaines 22RV1 pour administrer par voie sous cutanée et de façon continue pendant 22 jours à partir du jour 1 le siRNA siARH2AX-1 à la dose de 2mg/kg/jour formulé dans un tampon citrate lOmM pH 6 contenant 10mM de MgC12, ou bien le véhicule seul. Deux jours après implantation des pompes, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'étoposide à la dose de 5 ou de 10 mg/kg ou le véhicule et ce traitement a été répété deux fois par semaine jusqu'au sacrifice des souris. On observe que i'étoposide à 5mg/kg n'inhibe que faiblement le développement tumoral. La dose de 15mg/kg produit une inhibition mais s'accompagne chez plusieurs animaux traités d'une perte de poids indiquant une toxicité de ce traitement. Le siRNA siARH2AX-l est aussi efficace que la forte dose d'étoposide sans entraîner de perte de poids. La combinaison d'un traitement par I'étoposide et par le siARH2AX-1 potentialise l'effet de ces deux traitements pris séparément.
On conclut de cette expérience que le siRNA siARH2AX-l inhibe efficacement le développement des tumeurs, sans effet toxique notable chez l'animal, et que la combinaison de ce traitement avec des doses faibles, non toxiques d'un agent induisant des dommages à l'ADN amplifie l'inhibition de la croissance des tumeurs.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant au moins un siRNA bispécifique s'hybridant en totalité ou partiellement à la fois avec un ARNm codant le récepteur des androgènes et avec un ARNm codant H2AX, de telle sorte que cette hybridation induise la dégradation de ces ARNm ou en inhibe la traduction, le dit siRNA étant choisi parmi les siRNA siARH2AX-1, de SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou siARH2AX-lb, de SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un cancer, dans laquelle ledit siRNA est utilisé en association avec une thérapie entraînant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation
2. Composition pour son utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ladite thérapie entraînant une cassure de l'ADN est choisie parmi ia radiothérapie et/ou la chimiothérapie.
3. Composition pour son utilisation selon la revendication 2, dans laquelle ladite chimiothérapie entraînant des lésions de l'ADN ou empêchant leur réparation est effectuée à l'aide d'au moins un agent choisi parmi : les agents alkylants, les agents anti-métabolites, les antibiotiques cytotoxiques, les inhibiteurs de topoisomérase I, les inhibiteurs de topoisomérase II, les antibiotiques anti -tumoraux, les agents génotoxiques, les inhibiteurs de la PARP, et est notamment choisi parmi Arabinosylcytosine, Bleomycine, Busulfan, Capecitabine, Carboplatine, Carmustine, Chlorambucil, Cisplatine, Cladribine, Cyclophosphamide, Dacarbazine, Daunorubicine, Doxorubicine, Epirubicine, Etoposide, Floxuridine, Fludarabine, Fluorouracil et notamment 5-FluorouraciI, Gemcitabine, Hydroxyurée, Idarubicine, Ifosfamide, ïniparib, Irinotecan, Lomustine, Mechlorethamine, Melphalan, Mercaptopurine et notamment 6-Mercaptopurine, Methotrexate, Mitomycine C, Mitoxantrone HCI, Mustine, Niraparib, Olaparib, Oxaliplatine, Procarbazine, Rubitecan, Rucaparib, Streptozocin, Talazopanib, Thioguanine et notamment 6-Thioguanine, Topotecan, Veliparib, Actinomycine D, Amsacrine, Anthracyclines, Camptotécine, Epipodophyllotoxine, Plicamycine, Temozolomide, Vincristine, Vinblastine, Vinorelbine, Paclitaxel, Docétaxel, Cabazitaxel, Taxanes, Epothilones
4. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cancer est un carcinome adrénocortical, œsophagien, gastrique, des cellules basales, de la thyroïde ou de l'utérus, un astrocytome, un glioblastome, un oligodendrogliome, un méningiome, un thymome, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un myélome, un cancer gastro-intestinal, de la vessie, du sein, du col de l'utérus, de la tête et du cou, du poumon non à petites cellules, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du testicule, du thymus, du rein, des glandes salivaires, de l'endomètre, de l'anus, du colon, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du cœur, de l'estomac, du foie, de la gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'œsophage, des os, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, du rectum, des surrénales, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vulve, un adénocarcinome du colon, du rectum, une tumeur desmoïde, un fibrome du nasopharynx, un sarcome, un ostéosarcome, un leimyosarcome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, un pheochromocytome ou les métastases de ces cancers se développant dans d'autres organes.
5, Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, formulée pour un mode d'administration locale, loco-régionale, et notamment intratumorale, ou systémique, en doses uniques ou répétées, de façon intermittente ou continue, et notamment dans laquelle ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapérïtonéal, intramusculaire, intradermique, transdermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, intrathécal, intracérébral, oral, et est notamment sous-cutané, et en particulier un mode d'administration continu et sous-cutané.
6. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit siRNA bispécifique est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine.
7. Composition pour son utilisation selon la revendication 6, dans laquelle ledit siRNA bispécifique est dans une solution tampon à pH acide, additionnée de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois
8. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, formulée pour un mode d'administration du siRNA à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour plus particulièrement 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour.
9. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition ne contient pas d'agent de vectorisation ni d'agent d'adressage.
10. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition ne contient pas d'agent de vectorisation et contient un agent d'adressage, en particulier un ligand de CD36, et en particulier des LDL oxydés ou de l'Hexaréline.
11. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition contient un agent de vectorisation et ne contient pas d'agent d'adressage
12. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition contient un agent de vectorisation et contient un agent d'adressage, en particulier un ligand de CD36, et en particulier des LDL oxydés ou de l'Hexaréline,
13. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit au moins un siRNA bispécifique est dépourvu de modifications chimiques ou présente des modifications chimiques.
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