EP3732485A1 - Vorhersage des metabolischen zustands einer zellkultur - Google Patents

Vorhersage des metabolischen zustands einer zellkultur

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Publication number
EP3732485A1
EP3732485A1 EP19700004.5A EP19700004A EP3732485A1 EP 3732485 A1 EP3732485 A1 EP 3732485A1 EP 19700004 A EP19700004 A EP 19700004A EP 3732485 A1 EP3732485 A1 EP 3732485A1
Authority
EP
European Patent Office
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extracellular
metabolites
cell
metabolite
intracellular
Prior art date
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Pending
Application number
EP19700004.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Paul
Arthur MOHR
Sayuri HORTSCH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of EP3732485A1 publication Critical patent/EP3732485A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/38—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of metabolites or enzymes in the cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
    • G06N20/00—Machine learning
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
    • G06N3/00—Computing arrangements based on biological models
    • G06N3/02—Neural networks
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
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    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • G16B5/30—Dynamic-time models

Definitions

  • the invention relates to the prediction of the metabolic state of cells, in particular cells kept in cell culture. State of the art
  • This tendency also and particularly relates to the operation of cell culture reactors used to produce pharmaceutically interesting molecules, especially macromolecules such as proteins.
  • the method further comprises, at each of a plurality of times during the culture of the cell culture, performing the following operations:
  • intracellular flows at the time of the future using the predicted extracellular fluxes of the extracellular metabolites and the stoichiometric equations of the metabolic model.
  • embodiments of the method according to the invention make it possible to control the quality of the prediction or the intermediate results obtained during this prediction during the cultivation of the cell culture.
  • the method described above involves the prediction of extracellular fluxes. These are easily determinable from the change in concentration of extracellular metabolites during fermentation by repeated sampling and analysis of culture medium samples. Thus, during the fermentation a
  • the method can be advantageous for the following reasons:
  • the metabolism of the cells depends essentially on the conditions in the bioreactor. If factors such as pH value, pO 2 value, pressure and temperature are kept constant, it is above all the metabolite concentrations in the reaction medium that are decisive for the behavior of the cells, which is why they were selected as inputs for the MLP.
  • the prediction of future metabolite fluxes has increased compared to Prediction of future metabolite concentrations to the next
  • Invention thus predicts the metabolic state of a cell culture in real time, since the information basis on which the prediction is based exists in the already defined metabolic model, the already trained trained MLP as well as measurement data, whereby the measurement data can easily be collected in real time.
  • the measurement data can be obtained, which is used to carry out the
  • the method for predicting the metabolic state of a cell culture at a future time in real time is continuously performed during the operation of a bioreactor containing the cell culture.
  • the method further comprises generating the MLP by machine learning.
  • Machine learning algorithms are achieved a high accuracy of the prediction on the other hand an adaptation to the metabolic conditions in other cell types very easily and without much manual effort or
  • the training data set is generated so that at each of a plurality of training times during the
  • Extracellular metabolites are trained as output parameter value.
  • the first relevance score is calculated as the partial mutual information score (PMI score) between a metabolite of the first amount and the single metabolite whose extracellular flow is to be predicted.
  • the second relevance score is calculated as the PMI score - between a metabolite of the first quantity and the single metabolite whose extracellular flux is to be predicted, taking into account all the metabolites already contained in the second quantity.
  • Metabolite concentration profile of a particular extracellular metabolite with the metabolite concentration profile of the metabolite whose extracellular flow serves as the output parameter value of the MLP ie: its extracellular flux is to be predicted.
  • the predictive relevance can be determined by various methods, e.g. Principal component analysis or PMI ("partial mutual information") as will be described below for embodiments of the invention.
  • Input parameters (extracellular metabolites whose concentration is measured and entered into the MLP) are completely independent of the MLP.
  • the selection process is performed in the form of a "wrapper" as described in Chapter 4.7.3 of the Appendix, eg as a functionality provided by the neural network.
  • Metabolites whose extracellular flux is to be predicted in each case are Metabolites whose extracellular flux is to be predicted in each case.
  • the calculated intracellular flows are checked for plausibility and consistency and / or with regard to further quality criteria and if necessary by supplementing, removing or changing
  • the calculation of the intracellular flow of one or more intracellular metabolites at each of the future times involves a calculation of multiple or preferably all intracellular flows of the metabolic model.
  • all intracellular flows of the model are calculated. The more intracellular flows are taken into account, e.g. in a plausibility assessment, the reliability of the prediction increases.
  • the invention in another aspect, relates to a method for monitoring and / or controlling a bioreactor that includes the cell culture of cells of a particular cell type.
  • the method includes a calculation
  • the method may serve to control the bioreactor and include sending a control command to the bioreactor.
  • the control command is sent to automatically initiate steps that change the state of the bioreactor or the media it contains, so that the
  • the method for monitoring and / or controlling a bioreactor includes identifying that reaction within the metabolic model of the cells which acts as a limiting factor for cell growth or production of a desired biomolecule according to the embodiments described herein and examples of the method of predicting the bioreactor metabolic state and multiple intracellular flows of cells. The method further comprises automatically adding selectively to those
  • a strong uptake and metabolism of amino acids does not necessarily mean that the cells also use the amino acids to synthesize the desired target protein.
  • the ingested amino acids are metabolized for completely different purposes.
  • this can be achieved by a metabolic flux analysis based on a specific metabolic model of the cell using the predictions of MLP.
  • Method includes:
  • Bioreactors with the different cell clones are determined whether the intracellular fluxes indicate that the gene encoding the target protein was incorporated into the genome of the cell and the target protein in the cell in
  • Embodiments described procedures was observed, so that the predicted flows were not consistent with the measurable flows but rather had a systematic error. It was observed that this error correlated with the LDFI concentration in the medium, which is an indicator of the presence of lysed cells in the medium. This enzyme is not released by an intact cell into the medium. The detection of LDFI in the reaction medium thus indicates destroyed cells.
  • the LDFI-corrected cell density value is used as the output variable. Accordingly, according to embodiments of the invention, cell densities measured by measured LDFI are used in training the MLP for extracellular flux calculation
  • This method includes:
  • the measurements comprising concentrations of several extracellular metabolites of the metabolic model in the culture medium of the cell culture and a measured cell density of the cells in the cell culture;
  • Control computer for one or more bioreactors act or on
  • intracellular metabolite is meant herein a metabolite of which is known or believed to be within cells of the particular cell type, e.g. because it is taken from the medium of cell culture or is produced by the cells.
  • a flow is therefore also referred to as "reaction rate” or "transport rate”. If several processes run concurrently in the given volume, it is possible that, due to the opposition of some processes, there is no net change in a substance concentration. , eg by substance conversion, uptake or delivery.
  • the volume to which a flow statement relates is the volume of a cell in the case of intracellular as well as extracellular metabolites.
  • Intracellular flows are formulated in the metabolic model for stoichiometric equations which specify a reversible or irreversible response of the above categories (intracellular transport between cell compartments, metabolism).
  • Embodiments of Invention are based on the assumption that the sum of the input and output flows on an intracellular metabolite (the concentration of which is unknown) is identical and therefore its concentration does not change. This is not correct, depending on the mode of operation of the reactor, but at least
  • the use of metabolic models with a large number of stoichiometric equations in MFA can also be used to monitor cell cultures and, in the event of a deviation of one or more metabolite flows from a setpoint range, specific changes in the amount and / or or composition of
  • the model is an MFA model that is suitable for performing a metabolic flux analysis and is based on the so-called steady-state assumption, according to which the amount of substance intracellular
  • Process duration is limited by the consumption of the substrates.
  • Reaction volume during the fermentation is not. With a suitable choice of the volume flows, a steady state equilibrium is established in the reactor in which the cell density and the nutrient concentrations remain constant.
  • a "split-batch bioreactor” is a batch or fed-batch type bioreactor operated to charge the reactor one or more times a substantial portion of its medium, e.g. over 10% or over 30% for the purpose of harvesting the cells contained therein.
  • the PMI is a measure of the dependence between a random input variable X and a random output variable Y, taking into account already selected inputs.
  • Various approaches for calculating the PMI of two variables are known, eg Sharma A (2000): “Seasonal to interannual rainfall probabilistic forecasts for improved water supply management: Part 1 - A Strategy for System predictor Identification ", Journal of Hydrology Vol. 239, Issues 1 - 4, 232-239.
  • a PMI criterion refers to a feature or characteristic that has been defined with respect to the PMI to make a decision.
  • a PMI criterion may be a limit whose overshoot or undershoot affects the course of a process.
  • FIG. 2 shows, by way of example, the process of obtaining information in several
  • FIG. 3 shows a block diagram of a system for predicting the
  • FIG. 7 shows a number of metabolite flows which successfully use the
  • Figure 13 shows input parameter values and output parameter values of an NN
  • FIG. 14 shows a histogram of the obtained RMSE for intracellular flows in FIG.
  • Metabolite flux and two for identical cell clones in two different bioreactors measured extracellular Metabolitflüssen;
  • FIG. 17 shows eleven plots with two curves each, all obtained for a fed batch bioreactor by means of two different calculation methods;
  • FIG. 18 shows eleven plots with two curves each of calculated extracellular flows of a cell clone ZK1;
  • FIG. 19 shows eleven plots with two curves each of calculated extracellular flows of a cell clone ZK2;
  • the reactions can then be in a stoichiometric matrix AE hold on, in which the
  • the system (2.4) is underdetermined, if applicable.
  • equation (2.6) is only for specific ones
  • the second method differs from the first one in that its solution satisfies the steady-state assumption (the measured flows are then called "balanced"). For this, the values of the measurable flows in the solution only approximately coincide with the actually measured values. This can certainly be considered useful if the steady-state assumption is given a higher reliability than the measured values for the flows, which are always faulty. In the solution of (2.8), all those measured flows that can be balanced are adjusted. The unbalanced, however, remain unchanged. A generalization of the just described method for the adaptation of balanceable flows results from a more statistically motivated one
  • v m be again the vector of the measured, error-prone flows and let v m be the vector of the corresponding true values.
  • the measurement error vector S denotes the difference between the true and the measured values:
  • Table 1 Comparison vectors and associated error quantities for three different error sources.
  • the metabolic model created according to embodiments of the invention comprises a network which should comprise the central intracellular material flows and nevertheless should have as little complexity as possible.
  • the model exemplified here is based essentially on the
  • the biomass balance was taken from the above publication by Nolan (2011), as well as the conversion of the living and total cell density into the unit mol / l.
  • the formulation of the stoichiometry for product formation follows from the amino acid composition of the target protein. Also regarding the
  • the network model contained in the metabolic model should encompass the central intracellular material fluxes and still minimize it
  • NAD (P) H and ATP were not included in the formulation of stoichiometry.
  • some metabolic branches have not been considered in detail but have been integrated into biomass formation (e.g.
  • the stoichiometric matrix A was formulated.
  • the columns which correspond to the known (in this case extracellular) material fluxes have been combined to form the sub-matrix A m , the remainder to the sub-matrix A u .
  • a metabolic model 402 of CHO cells was provided as shown in FIG.
  • the metabolic model involves a variety of intracellular 410 and 408 extracellular fluxes, using the metabolic model specifies at least a stoichiometric relationship between an intracellular 406 and an extracellular 404 metabolite.
  • the following steps 106-112 are performed for a plurality of times during the culture of a cell culture in a bioreactor.
  • a profile of actually measured extracellular material flows and for the next time (after expiration of an interval of defined length, for example 24 h) predicted extracellular flows can be created.
  • the deviation of these two profiles from each other indicates the quality of the prediction.
  • Step 106 Receiving Measured Values
  • a sample is taken at several times during the culture of a cell culture in a bioreactor 208 of this cell culture and automatically or manually transferred to one or more analyzers 250, as shown in Figure 2.
  • the analyzer may be a system of one or more analyzers, for example, a Thomassch or an optical counting station for determining the cell density.
  • a high performance liquid chromatograph or other suitable method known in the art may be used.
  • the sampling can be done for example in an interval of 24 hours.
  • the measurement data thus obtained are transmitted to a data processing system 252.
  • the data processing system 252 may be a computer that monitors and / or controls one or more bioreactors as a control unit.
  • At least some of the measured values are also determined by way of corresponding sensors of the bioreactor 208 themselves and transmitted to a data processing system 252.
  • Step 108 Enter the Measured Values in a Trained MLP
  • the data processing system 252 includes an MLP, for example, a neural network (NN) or a cooperative system of multiple neural networks, which has been trained to provide one or more extracellular responses based on input parameter values measured at a particular time (in particular, extracellular metabolite and cell density) Rivers of the metabolic model 254 predicts or estimates.
  • the data processing system 252 may include program logic that automatically transfers the measurement data obtained at a time to an MLP trained on test data sets obtained from cell cultures of the same type of cell that also includes the cells of the cell culture metabolic state at the future time (for example, next day) should be predicted.
  • Step 110 Predict future intake rates and delivery rates through the MLP
  • feeds are made during operation of the bioreactor, they should preferably be in and taken into account
  • Step 112 Perform an MFA
  • this predictive step can also be described as a prediction of a hybrid model relationship.
  • the coupling of the results of the predictions of the MLP with the information of the metabolic model in the course of the substance flow analysis can for example be implemented as follows:
  • Equation 4.5 in the appendix, which will be explained below, only to be understood as a rough approximation to the actual covariance matrix.
  • the covariance matrix is chosen to be a diagonal matrix for the purpose of predicting future intracellular flows since the different metabolite flows are estimated over separate networks and therefore the errors can be considered largely independent of each other.
  • embodiments of the invention for descriptive metabolic flux analysis of the current metabolic state of a cell use a covariance matrix in which the diagonal entries do not
  • Covariance matrix was formulated as a diagonal matrix and has the structure:
  • Equation 2.10 of the appendix refers to the descriptive MFA in which, according to the
  • an error analysis of the model based e.g. on a Gaussian error propagation as described in Section 4.7.8 of the Appendix.
  • these bioreactors include one or more fed-batch reactors and one or more other bioreactors from other types of reactors.
  • Inoculum concentration were chosen identically for each bioreactor, but different modes of operation were used:
  • Glucose concentrations in the medium which were adjusted by different strategies in the feeding.
  • the Fed-batch approaches will often be numbered. According to this numbering, in the first two approaches a short full glucose limitation occurred in the second half of the process before the bolus additions were made. The third and fourth approaches experienced the same limitation, but the subsequent boluses adjusted higher glucose concentrations. In the fifth and sixth approach there was always a positive minimum concentration of glucose.
  • a neural network was created which was to estimate the mean flows of the extracellular metabolites between the current and the next sampling time from the current state in the bioreactor (so-called one-step prognosis). It was for some embodiments for each
  • the extracellular metabolites named in the metabolic model are ranked according to their relevance for the prediction of the respective flow.
  • extracellular metabolites with redundant information content were not considered here.
  • Network 3 The third network training data set included the data from three of the fed-batch fermentations and the test data set the data from the remaining three fed-batch fermentations. f) One-step prediction of extracellular metabolite concentrations
  • the goal is to create a trained MLP that is as accurate as possible
  • the extracellular flow v of a component at time t is the amount of substance taken up by a cell per time.
  • the concentration of the substance in the feed is constant over time or is assumed to be approximately constant.
  • both the concentrations of extracellular metabolites in the previous sampling and the computationally based on the extracellular flows calculated since the last sampling are known and can be transferred together as reference value sets to the MLP to be trained, the As a result, based on the concentrations of the extracellular metabolites measured for the last sampling, the calculated extracellular body learns to predict that the smallest possible deviation from the calculated extracellular fluxes exists.
  • the trained MLP or trained neural network can now be stored and for one-step predictions of extracellular metabolite concentrations at any chosen future time , for example, next
  • the idea of training the neural network is based on the fact that the concentrations of extracellular metabolites are easily measurable and from which, at least in retrospect, extracellular flows can be empirically determined. By using the measured at a certain time
  • Extracellular metabolite concentrations as input parameter values and extracellular flows as calculated over the time interval between this current time point and a future time point based on the extracellular metabolite concentration difference as output parameter values can be used to train a neural network or in other machine-learning algorithms. That he can at least predict the extracellular fluxes for one future time.
  • the determination of the cell density allows a transfer of the total concentration difference in the medium to the individual cells of the cell culture contained in the medium.
  • Fermentation approaches a similar, approximately linear relationship between the LDFI concentration and the cell density difference to exist.
  • a measured total cell density is recorded continulatively in a fermenter and displayed in a plot.
  • the cell density is calculated.
  • the prediction may be calculated, for example, by a trained MLP trained according to embodiments of the invention, the measured cell concentration being another
  • a first temporal profile of the measured cell density of a cell culture of a particular cell type is determined empirically and also a second temporal profile of one based on the metabolic model and the extracellular
  • the discrepancy between measured and predicted cell density is referred to below as the "density discrepancy profile" and can optionally also be plotted in the plot.
  • the corrected cell density is therefore the sum of the measured cell density and that based on the measured LDH concentration by means of the linear function
  • "Snapshot" image 254 of the metabolic state of a cell can be output and / or stored via a graphical user interface.
  • the data processing system 252 is additionally configured to extracellular flow based on a plot of the measured extracellular metabolite concentrations for the future time interval (ie the time interval from the current time to the next time for which a prediction of the metabolic state is to be made) to be calculated and passed to the MLP as the output parameter value during the training.
  • the system 200 may be a data processing system
  • Example valves, pumps, metering units for boluses, stirrers, etc. which are coupled to the system and may receive and execute control commands from the system if necessary.
  • the system 200 includes one or more processors 202 and a first interface 210 for receiving measurement data from the one or more
  • the interface 210 may serve as a direct interface to the
  • Bioreactors or as an interface to analyzers in which samples are analyzed by the bioreactors, or a graphical user interface that allows a user to manually or otherwise input the obtained measurement data.
  • the system 201 includes or is coupled to volatile or nonvolatile storage media 212.
  • the storage medium may be, for example, memory, hard disk, or storage of a cloud service or a network storage or combinations of the aforementioned types of storage.
  • the storage medium includes a metabolic model 214 of the cells held and propagated in the bioreactors, for example a model as depicted in FIG.
  • the storage medium comprises a trained MLP 218, for example a trained neural network, which is designed to predict one or more extracellular flows at a future time, based on the measured concentrations of several extracellular metabolites received at a particular time.
  • a trained MLP 218 for example a trained neural network, which is designed to predict one or more extracellular flows at a future time, based on the measured concentrations of several extracellular metabolites received at a particular time.
  • the storage medium includes program logic 220 configured to pass the received measurements to the MLP 218 to perform a prediction of extracellular flows.
  • the program logic is designed to perform in real time a metabolic flow analysis (MFA) based on the metabolic model 214 and the predicted extracellular fluxes for future intracellular fluxes
  • MFA metabolic flow analysis
  • the program logic 220 may be in any one of
  • Programming language implemented, eg C ++, Java, Matlab or in form several program modules in different or the same programming language that are interoperable with each other.
  • Reference value ranges include. These reference ranges indicate acceptable or desirable intracellular flows of various intracellular metabolites.
  • the program logic 220 can determine whether the cells in one or more of the bioreactors are heading for an undesirable metabolic state, and optionally
  • a warning can be sent to a user via a user interface 224, for example a display device, for example an LCD display.
  • Display device the user can be informed about the predicted extracellular and intracellular flows and also about any predicted deviations of these rivers from desirable reference areas.
  • FIG. 5 shows the calculation of intracellular flows at several
  • the upper plot 502 shows a profile of the concentration of an extracellular metabolite which was determined at six measurement points (one measurement per day).
  • the middle plot 504 shows that a trained MLP predicts one or more extracellular flows from these measurements for a future time, respectively.
  • a comparison of the positions of the points in the upper and middle plots shows that the points in time of the collection of the measured data and the times at which the extracellular rivers were predicted in each case were about half a day
  • FIG. 6 shows various flows depicted in the metabolic model of FIG. The flows were based on the measured change in metabolite concentrations over a time interval and the measured
  • FIG. 7 illustrates the successful use of the method for generating biological findings.
  • the plot of the glucose flow top left shows that in the profile of the glucose flow at about 0.65 the glucose flow almost stops. Effects of this lack of glucose can be observed with alanine, series and glycine: alanine becomes larger rates in the case of the limitations
  • Glucose flow compared to the glucose concentration in the medium shows, even in product formation. Obviously, there is a very close relationship between these rivers. At the end of the fermentation, the amount of product was highest in those bioreactors without glucose limitation. The availability of glucose seems to be essential for effective product formation, a deficiency should be strictly avoided.
  • FIG. 8 illustrates another successful use of the method for
  • Laktatshift refers to the often observed in the cultivation of cell cultures effect that the lactate flow changes the sign of the positive to the negative.
  • Mulukutla et al. postulate that the lactate shift is the result of regulatory mechanisms that are due to the increasing Lactatinhibition be set in motion.
  • This biological hypothesis was checked by determining the lactate flow in several bioreactors over a number of measurements by means of the method according to the invention and for this the extracellular lactate concentrations were also measured. The corresponding results are shown in FIG. 9 for four bioreactors.
  • FIG. 9 shows plots with lactate fluxes and glutamine concentrations of four bioreactors of different types, which compares the courses of
  • Glutamine concentration and lactate flux allowed in a given cell culture The glutamine concentrations are characterized by solid lines and the lactate flows by dotted lines.
  • the lactate fluxes and concentrations of the individual rivers and metabolites were previously normalized by the
  • the arrows each indicate a reversal of the sign of the lactate flow.
  • Equation (2.10) of the appendix was used to calculate the extracellular, balanced flows that were intracellular via equation (2.5) of the
  • Figure 11 shows snapshots of intracellular and extracellular flows at various time points during the culture of a cell culture of CFIO cells.
  • phase I in the division shown in Fig. 11A
  • glucose is still present in excess, is rapidly transported into the cells and enters the Krebs cycle, and glutamine is also taken up Conversion to glutamate and further along with pyruvate via river v_8 in metabolites of the citrate cycle and in alanine Lactate and ammonia are released in larger quantities into the medium.
  • Lactate concentration in the medium is very low, so even the intake
  • phase IV glucose is added in a bolus manner. Therefore, there is again an increased intake, the flow through the Citrate cycle is particularly strong. All other reactions are extremely reduced.
  • Figure 13 shows some of the extracellular metabolites whose concentrations are used as input to predict extracellular flows.
  • Biomass which is preferably specified in the form of a cell density, and "TZD" the value corrected by the LDH concentration.
  • the table contains the results of the cross-validation, in which the number of input variables, which was determined by hidden variables H and the iteration number.
  • the input metabolites 1504 their concentrations as
  • Input parameter values entering the neural network are highlighted in yellow.
  • the data from several (for example 3) fed-batch fermentations as well as those from a batch batch served as a training data set.
  • the data obtained from other fermenters of the same cell type formed the test data set.
  • cross validations can be performed with other training / test record splits.
  • the selected metabolite may not be the one that, mechanistically, actually has an impact on the material flow, but is only strongly correlated with it. In fact, it could be observed that for a sample white change in the data selection used to calculate the PMI values, some arrangements were different. In some cases, for example, the position of glutamate and glutamine were exchanged, which are closely linked via the metabolism. However, today's selection based on biological intuition, as has been done in some publications, has sometimes yielded much worse predictions.
  • the core density estimator used is based on city block function, for the calculation of
  • Standardization had e.g. all input variables and the output variable the mean 0 and the standard deviation 0.5. This has distorting effects on the relevance of the sizes due to different
  • Test method using a trained MLP performed on the currently obtained measurements.
  • the PMI for the parameter X e.g. a particular extracellular metabolite
  • the parameter Y e.g. another extracellular metabolite
  • g is the density function of the marginal or common distributions.
  • the residuals contain only the information of X and Y that are not yet contained in U. The larger the value for G, the stronger the dependency.
  • kernel density estimators which also use information from the N samples. These estimators provide - in simplified terms - a continuous density function, the in its course similar to the histogram of the samples. It arises from a weighted superposition of N core functions.
  • the estimate is the density of a q-dimensional
  • the common density distribution of two random vectors X and Y can be determined using a product kernel estimator
  • the conditional expected value must generally be used for two random vectors X and U are estimated.
  • the Nadaraya-Watson estimator can be used for this. This is based on the previously applied principles and can be derived as follows:
  • the selection is made on the principle of a wrapper: For each output variable, 70 networks with the 1 to 7 (according to PMI) most relevant inputs and with 1 to 10 hidden neurons were trained in initially 1000 iterations. For this purpose, a training data set was formed from a part of the entire training data set, which consists of the 8 monitored training fermentations. The remaining data served as test data. At each training, the value of the test error was calculated over the number of iterations recorded and its minimum value, and the associated iteration number were determined. Subsequently, the comparison of the 70 networks based on the total minimum test error. This resulted in the determination of the combination of the input variables for the estimation of the respective metabolite flow, as well as the corresponding iteration number and the number of hidden neurons.
  • extracellular metabolites whose concentration is to be used as input parameter values for training or feeding the trained MLP ("input metabolites"), according to purely statistical criteria, individually for each output metabolite, ie individually for each extracellular flow; should be predicted.
  • Sorting step certain "relevance" or predictive power is not yet dependent on the metabolites in the second set.
  • the Predictive power of the "x" most relevant input metabolites determined by a test data set, x is varied, and then the number x is selected with the best predictive power.
  • the input metabolite within the metabolite remaining in the first set is repeatedly identified, the has the greatest predictive power with respect to the flow of a given output metabolite, taking into account the content of the second set. If the concentration profile of the metabolite with the highest predictive relevance within the remaining members of the first set correlates strongly with a metabolite already contained in the second set, this metabolite is usually not converted to the second set, as its predictive power is high However, its concentration profile does not provide any significant contribution over that of a metabolite already in the second set.
  • Concentration profiles of metabolites of the second amount leads, transferred from the first to the second amount.
  • Transfection was used to generate the clones, the clones due to different insertion and / or different copy number of the integrated DNA sequences metabolic differences.
  • Ten Fed batches were used to train the MLP (here: a neural network model), two Fed batches to test the model. These two Fed batches were used for the RMSE calculations.
  • the intracellular fluxes RMSE are calculated from a difference between the intracellular fluxes predicted by a combination of MLP and MFA and intracellular fluxes, which can be calculated from measured extracellular fluxes. RMSE is never negative, a value of 0 (almost never achieved in practice) would indicate a perfect fit of the predicted to the measured data. In general, a lower RMSE is better than a higher one. RMSE is the square root of the average squared error.
  • the same type of medium and nutrient solutions were used for the 12 fed-batch reactors to make the bispecific antibody.
  • the medium and the nutrient solutions differed from the medium and the nutrient solutions for the bioreactors or cell cultures whose metabolic means.
  • Footprint is shown in Figure 5.9 of the appendix.
  • the MLP here a neural network (NN) has been recalibrated to the new record, i. the NN, which has already been trained once on data obtained from the bioreactors shown in Figure 5.9 of the Appendix, was "retrained” or retrained for data from the 12 fed-batch reactors for production of the bispecific antibody.
  • the models were made in Python with the help of
  • Hyperparameters that best fit the data were stored and used as a "re-trained" NN for future predictions of extracellular and intracellular flows of cell cultures in the 12 bioreactors.
  • FIG. 15 shows a histogram of the obtained RMSE for extracellular flows obtained for the 12 fed-batch fermentation runs mentioned in FIG. All RMSE values are normalized to the error obtained for the glucose metabolite. RMSE values for extracellular flows are calculated from a difference between measured external flows and extracellular fluxes predicted by a combination of MLP, especially a neural network, and MFA.
  • Figure 16 shows a comparison of the predicted extracellular metabolite fluxes (black line) with two for two identical cell clones in different
  • FIG. 17 shows several plots with two curves each, all for a fed batch
  • Descriptive MFA were obtained by using measured concentrations of extracellular metabolites as input to metabolic flow analysis (MFA) to calculate various extracellular flows, each corresponding to one of the 11 plots.
  • the solid line curves ( ⁇ "NN-MFA ⁇ ") were obtained by using extracellular metabolite concentrations measured at a given time t0 as input to an MLP (eg, NN) to predict extracellular flows at a future time t1 future predicted extracellular fluxes were used as input for metabolic flux analysis (MFA).
  • MLP eg, NN
  • a comparison of the two curves of each of the 11 plots thus shows that the values predicted using MLP + MFA for a future date are very high
  • FIG. 18 shows several plots with two curves each, all for a fed batch
  • Bioreactor with a first cell clone ZK1 were obtained for the preparation of a bispecific antibody.
  • the dotted line curves (“NN + Descriptive Extracellular MFA") were obtained by using extracellular metabolite fluxes measured at a given time tO as input to an MLP (eg, NN) to detect extracellular flows on one predict future time t1, and these future predicted extracellular fluxes were used as input to metabolic flux analysis (MFA).
  • MLP metabolic flux analysis
  • Extracellular flows of extracellular metabolites were used as input to metabolic flow analysis (MFA) to calculate various extracellular flows, each corresponding to one of the plots shown in FIG.
  • MFA metabolic flow analysis
  • the extracellular fluxes were normalized for each plot and for each day in terms of the concentration of glucose.
  • current extracellular flows which were calculated on the basis of the metabolite concentrations measured currently and at a past point in time, were used as MLP input.
  • a metabolite concentration in the broader sense was used as input. It was observed that alternatively, when the measured metabolite concentrations were used as input, the predictive results of the MLP were ultimately substantially identical.
  • the measured values differed a little from the predicted fluxes.
  • the scaling is due to the glucose normalization corresponds to a very high "dissolution” and the deviations were rather small considering the total amount of the metabolite.
  • a certain tendency of the overfitting data was observed, which is usually remediable by increasing the data set.
  • FIG. 19 shows several plots with two curves each, all for a different fed batch bioreactor BR2 with a second cell clone ZK2 for locating the
  • the clones may have been generated, for example, by a method that does not fully control the position of integration of a new DNA sequence segment into the genome of the cells and / or the number the integrated sequence sections offers.
  • the starting lines used are genetically identical, in the course of integration of new genes or DNA sequences (e.g., in the case of random integration in the course of transfection), the
  • FIGS. 18 and 19 each show, for a particular cell clone ZK1, ZK2, that the combination of a neural network NN and a metabolic one
  • FIG. 20 shows several plots with two curves each, all of which have been obtained for the bioreactor BR1 with the cell clone ZK1 and which each represent calculated intracellular flows.
  • FIG. 20 thus corresponds to FIG. 18 with the difference that the calculated intracellular instead of the calculated extracellular flows are shown.
  • FIG. 21 shows several plots with two curves each, all of which have been obtained for the bioreactor BR2 with the cell clone ZK2 and which each represent calculated intracellular flows.
  • FIG. 21 thus corresponds to FIG. 19 with the difference that the calculated intracellular instead of the calculated extracellular flows are shown.
  • the totality of the plots in FIGS. 19 and 21 thus constitutes one

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps. Es umfasst eine Bereitstellung (102) eines metabolischen Modells (402) einer Zelle des bestimmten Zelltyps sowie die Durchführung folgender Schritte an jedem von einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung der Zellkultur: Empfang (106) gemessener Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten sowie einer gemessenen Zelldichte im Kulturmedium; Eingabe (108) der empfangenen Messwerte als Eingabeparameterwerte in eine trainierte Machinelearning-Programmlogik - MLP (218); Vorhersage (110) von extrazellulären Flüssen (408) der extrazellulären Metaboliten an einem Zukunftszeitpunkt durch die MLP; Durchführung (112) einer metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der intrazellulären Flüsse an dem Zukunftszeitpunkt auf Basis der vorhergesagten extrazellulären Flüsse und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells.

Description

Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur
Beschreibung
Technischer Bereich
Die Erfindung betrifft die Vorhersage des metabolischen Zustands von Zellen, insbesondere von in Zellkultur gehaltenen Zellen. Stand der Technik
In den vergangenen Jahren ist in der pharmazeutischen Industrie das Bestreben deutlich gewachsen, die Vorgänge in der Entwicklung, Produktion und
Qualitätssicherung effizienter zu gestalten, indem ein stärkerer Fokus auf Mittel zur Prozessanalyse, -kontrolle und -Steuerung gelegt wurde. Diese Tendenz betrifft auch und in besonderen Maßen den Betrieb von Zellkulturreaktoren, die zur Erzeugung pharmazeutisch interessanter Moleküle, insbesondere Makromoleküle wie Proteine, zum Einsatz kommen.
Die Modellierung des Zellstoffwechsels und von Fermentationsprozessen im
Rahmen der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung gestaltet sich jedoch als große technische Herausforderung: Der Stoffwechsel (Metabolismus) von Zellen, insbesondere eukaryotischer Zellen, zeichnet sich durch sehr komplexe nichtlineare chemische Reaktionskaskaden aus, die analytisch schwer zu simulieren oder modellieren sind.
So ist zum Beispiel die Analyse metabolischer Stoffflüsse mittels metabolischer Flussanalyse (MFA) bekannt. Die MFA wird insbesondere für Prozesse eingesetzt, in denen die intrazelluläre Flussverteilung zeitinvariant ist. Dies ist näherungsweise gegeben für die exponentiell Wachstumsphase im Satzverfahren („Batch
Bioreaktor“) oder für Kultivierung im Chemostaten. In den heutzutage vorwiegend verwendeten Fed-Batch Prozessen sind die Zellen allerdings
Umgebungsbedingungen ausgesetzt, die sich ständig ändern. Daher variieren auch die intrazellulären Flüsse im Laufe der Prozesse. Es reicht also nicht, eine einzige metabolische Stofffluss-Analyse durchzuführen, um den Zustand der Zellen über den gesamten Prozess hinweg abzubilden. Außerdem ist es im Hinblick auf die Prozesskontrolle ungünstig, wenn lediglich deskriptiv festgestellt wird, dass die Zellen eines Bioreaktors bereits in einen metabolischen ungünstigen Zustand übergegangen sind. Besser wäre es, dieses vorherzusagen und gegebenenfalls frühzeitig gegenzusteuern. Die Verwendung von MFA zur analysemetabolischer Stoffflüsse ist zum Beispiel in Ahn WS, Antoniewics MR (2012):„Towards dynamic metabolic flux analysis in CHO cell cultures“, Biotechnology Journal 7, 61 -74, beschrieben. Der Versuch, den Zustand der Zellen einer Zellkultur an einem künftigen Zeitpunkt vorauszusagen, gestaltet sich jedoch aus mehreren Gründen ebenfalls als sehr schwierig. Für die Vorhersage von Zeitverläufen werden in der Regel kinetische Modelle herangezogen. Diese bestehen aus einem System von
Differenzialgleichungen, die die zeitlichen Änderungen von Stoffkonzentrationen oder von Stoffmengen beschreiben. Die Gleichungen basieren meist auf
mechanistischen Kenntnissen, die zum Beispiel mittels einer Michaelis-Menten- Kinetik modelliert werden können. Allerdings sind diese kinetischen Kenntnisse schwierig zu erlangen. Für die Beschreibung eines ganzen intrazellulären
Stoffwechsel netzwerkes mittels kinetischer Ausdrücke reichen zumeist die vorhandenen mechanistischen Informationen nicht aus und die Anzahl der zu schätzenden Parameter wäre enorm.
Kinetische Hybridmodelle, die metabolische Flussanalysen mit kinetischen
Kenntnissen verbinden, waren jedoch in der Praxis zumeist nicht in der Lage, verlässliche Vorhersagen des zukünftigen Verhaltens einer Zellkultur zu generieren. Die Erstellung dieser Modelle hat sich als ausgesprochen arbeitsintensiv
herausgestellt. Zudem sind die so erstellten Modelle wenig flexibel und lassen sich nicht ohne erheblichen manuellen Aufwand an den Metabolismus anderer Zelltypen anpassen. Die Verwendung von hybriden Modellen ist zum Beispiel beschrieben in Covert MW, Xiao N, Chen TJ, Karr JR (2008),„Integrating metabolic, transcriptional regulatory and Signal transduction models in Escherichia coli”, Bioinformatics Vol.
24 no. 18, 2044, sowie in Nolan RP, Lee K (2011 )„Dynamic model of CHO cell metabolism“, Metabolic Engineering 13, 108.
Zusammenfassung
Vor diesem Hintergrund besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur
Vorhersage des metabolischen Zustands von Zellen und an entsprechend
verbesserten Systemen insofern, dass die vorangehend erwähnten Nachteile damit zumindest teilweise vermieden werden.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen spezifiziert. Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben. Die hier beschriebenen Ausführungsformen und Beispiele der Erfindung sind frei miteinander kombinierbar, sofern sie sich nicht gegenseitig ausschließen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorhersage des
metabolischen Zustands einer Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps. Das Verfahren umfasst eine Bereitstellung eines metabolischen Modells einer Zelle des bestimmten Zelltyps, wobei das metabolische Modell eine Vielzahl von
intrazellulären und extrazellulären Metaboliten sowie eine Vielzahl von
intrazellulären und extrazellulären Flüssen beinhaltet, und wobei das metabolische Modell stöchiometrische Gleichungen umfasst, die mindestens eine
stöchiometrische Beziehung zwischen einem der intrazellulären und einem der extrazellulären Metaboliten spezifizieren.
Das Verfahren umfasst ferner an jedem von einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung der Zellkultur die Durchführung folgender Operationen:
- Empfang mehrerer an diesem Zeitpunkt gemessener Messwerte, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der Zellkultur umfassen;
- Eingabe der empfangenen Messwerte als Eingabeparameterwerte in eine trainierte Machinelearning-Programmlogik (MLP);
- Vorhersage von extrazellulären Flüssen der extrazellulären Metaboliten an einem Zukunftszeitpunkt durch die MLP unter Verwendung der empfangenen Messwerte, wobei der Zukunftszeitpunkt ein dem Zeitpunkt des Empfangs der Messwerte nachfolgender Zeitpunkt ist, wobei die extrazellulären Flüsse Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in eine Zelle und/oder Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten von einer Zelle in das Medium sind;
- Durchführung einer metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der
intrazellulären Flüsse an dem Zukunftszeitpunkt unter Verwendung der vorhergesagten extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells.
Dies kann vorteilhaft sein, da auf diese Weise das Wissen, welches zum Beispiel in Form von Stöchiometrischen Reaktionsgleichungen bereits für viele wichtige Stoffwechselprozesse von Zellen in der Literatur vorhanden ist, und welches in Form von metabolischen Modellen darstellbar ist, auf sehr vorteilhafte Weise verknüpft werden kann mit der Verwendung einer MLP, die ein hohes Maß an Flexibilität erlaubt. So haben einige experimentelle Voruntersuchungen gezeigt, dass die Verwendung MLP-basierter Ansätze, zum Beispiel die Verwendung von neuronalen Netzen zur Vorhersage künftiger metabolischer Zustände von Zellen rein basierend auf zum Beispiel der Konzentration von deren
Ausscheidungsprodukten unzuverlässig ist. Die Komplexität und Dynamik des zellulären Metabolismus scheint es auch für ausgefeilte, moderne MLP-Verfahren unmöglich zu machen, eine verlässliche Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur in der Zukunft rein basierend auf aktuellen Zellkonzentrationen zu treffen, insbesondere bei Fed-Batch Bioreaktoren mit eukaryotischen Zellen. Dies mag zum einen daran liegen, dass der zellinterne Zustand durch das Messen extrazellulärer Metabolitkonzentrationen nur sehr indirekt und unzureichend charakterisiert wird, zum anderen besteht die Gefahr des„Over-Fittings“ an die Trainingsdaten im Zuge der Erzeugung der MLP in der Trainingsphase. Es hat sich aber gezeigt, dass MLP-basierte Verfahren, wie sie hier für Ausführungsformen beschrieben sind, zumindest für einen in nicht allzu ferner Zukunft liegenden
Zeitpunkt sehr verlässliche Vorhersagen machen können was die Konzentration und die Flüsse extrazellulärer Metaboliten angeht. Dadurch, dass dieses Wissen kombiniert wird mit dem Wissen über stöchiometrische und transportbedingte Abhängigkeiten zwischen intrazellulären und extrazellulären Metaboliten
untereinander und zwischen einander ist es Ausführungsformen der Erfindung möglich, den metabolischen Zustand der Zellen bis hin zur Stärke einzelner intrazellulärer Stoffflüsse akkurat vorherzusagen.
Zwar war auch bisher eine grobe Charakterisierung des metabolischen Zustands von Zellen auf Basis der von diesen ausgeschiedenen Stoffe (wie z.B. Laktat) möglich, die internen Prozesse der Zelle blieben aber letztlich eine„black box“. Eine feingranulare Vorhersage des Zellstoffwechsels bis hinunter auf die Ebene einzelner zellinterner Stoffflüsse war mit den aktuell bekannten Hybridmodellen nicht möglich.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt der Erfindung wird auch ein in hohem Maße flexibles Verfahren zur Vorhersage des Zellstoffwechsels bereitgestellt. Es hat sich gezeigt, dass bereits durch die Kultivierung einiger weniger Zellkulturen mit den Zellen eines bestimmten Zelltyps ein genügend großer Trainingsdatensatz gewonnen werden kann, um eine MLP zu trainieren, welche in der Lage ist, für Zellkulturen dieses Zelltyps verlässliche Vorhersagen bezüglich des metabolischen Zustands an einem künftigen Zeitpunkt zu treffen. Die Gewinnung der
Trainingsdaten und das anschließende Trainieren der MLP kann dabei weitgehend automatisch erfolgen. Das metabolische Modell, welches für die metabolische Flussanalyse verwendet wird, und dessen Erstellung gegebenenfalls umfangreiches Literaturstudium und manuelle Anpassungsschritte erfordert, kann dagegen oftmals für Zellen unterschiedlichen Zelltyps wieder verwendet werden. Somit ist es, anders als bei Verwendung von im Stand der Technik bekannten Hybridmodellen, bei Verwendung von Ausführungsformen des erfinderischen Verfahrens oftmals möglich, ohne aufwändige Erstellung neuer Modelle allein durch die Kultivierung einiger Zellkulturen zur Generierung eines Trainingsdatensatzes und
anschließendem trainieren eines MLP auf diesem Trainingsdatensatz möglich, ein Vorhersageverfahren bereitzustellen, welches spezifische metabolische
Charakteristika eines bestimmten Zelltyps berücksichtigt.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt wird die MFA nun zur Vorhersage
intrazellulärer Flüsse erfolgreich eingesetzt. Bisher wurde MFA im Wesentlichen nur für Prozesse eingesetzt, in denen die intrazelluläre Flussverteilung zeitinvariant ist. Dies ist näherungsweise gegeben für die exponentielle Phase in Satzverfahren oder für Kultivierungen im Chemostaten. In den heutzutage vorwiegend verwendeten Fed-Batch-Prozessen und perfusionsähnlichen Prozessen mit Zellrückhaltung sind die Zellen allerdings Umgebungsbedingungen ausgesetzt, die sich ständig ändern. Daher variieren auch die intrazellulären Flüsse im Laufe des Prozesses. Ansätze, die versucht haben, den Zustand der Zellen über den gesamten Prozess hinweg abzubilden, sind gescheitert. Erfindungsgemäß wurde dagegen ein Ansatz gefunden, den metabolischen Zustand von Fed-Batch Reaktoren zumindest für die kommenden Stunden und Tage akkurat vorherzusagen, indem ein dynamisches metabolisches Modell definiert wird, das die intrazellulären Flüsse in Abhängigkeit von der (ggf. diskretisierten) Prozesszeit beschreibt.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt ermöglichen es Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, eine Kontrolle der Qualität der Vorhersage bzw. der während dieser Vorhersage erhaltenen Zwischenergebnisse während der Kultivierung der Zellkultur durchzuführen. Das oben beschriebene Verfahren beinhaltet die Vorhersage von extrazellulären Flüssen. Diese sind anhand der Konzentrationsänderung der extrazellulären Metaboliten auf einfache Weise während der Fermentation durch wiederholte Entnahme und Analyse von Proben des Kulturmediums bestimmbar. Somit kann während der Fermentation eine
Überprüfung der Vorhersage der MLP erfolgen, indem die vorhergesagten und die gemessenen extrazellulären Flüsse wiederholt miteinander verglichen werden.
Falls hier erhebliche Differenzen auftreten, kann die Berechnung sofort gestoppt und nach den Ursachen für die Abweichung geforscht werden. Andere im Stand der Technik bekannte Vorhersageverfahren von metabolischen Flüssen dagegen verwenden 13C-Messdaten im stationären Zustand um intrazelluläre und
extrazelluläre Stoffflüsse vorherzusagen. Diese Verfahren benötigen also 13C- markierte Analysen und Experimente unter stationären Bedingungen, um direkt intra- und extrazelluläre Flüsse vorherzusagen. 13C Analysen sind aufwändig und während des laufenden Betriebes eines Fermenters kann in der Regel auch nicht von stationären Bedingungen ausgegangen werden. Außerdem sind die
vorhergesagten intrazellulären Flüsse nicht empirisch überprüfbar, sodass bei derartigen Verfahren kein Zwischenschritt stattfindet, der mit real gemessenen Daten abgeglichen werden kann.
Gemäß Ausführungsformen der Erfindung empfängt die MLP Eingangsdaten in Form von extrazellulären Konzentrationen extrazellulärer Metabolite zu einem aktuellen Zeitpunkt, um die entsprechenden extrazellulären Flüsse an einem künftigen Zeitpunkt (nächste Probenahmezeit) unter dynamischen
Fermentationsbedingungen vorherzusagen. Die interzelluläre MFA wird auf Basis des stöchiometrischen Stoffwechselmodells (für die künftige und optional auch die aktuelle Probenahmezeit) berechnet. Dies ermöglicht es, während der Fermentation die Vorhersage anhand gemessener extrazellulärer Metabolitkonzentrationen zu überprüfen.
Ausführungsformen der Erfindung stellen somit ein Verfahren zur Vorhersage des metabolischen Zustands von Zellkulturen bereit, welches sowohl akkurat ist (da es detailliert Auskunft über intrazelluläre metabolische Vorgänge gibt und experimentell gezeigt werden konnte, dass die Vorhersagen bezüglich extrazellulärer Flüsse sehr gut mit den real gemessenen extrazellulären Flüssen übereinstimmen) und welches sehr flexibel ist, da es sich ohne großen Aufwand an Zellen eines anderen Zelltyps anpassen lässt.
Nach Ausführungsformen beruhen zumindest einige der extrazellulären und intrazellulären Flüsse des metabolischen Modells nicht auf einer Zerlegung eines bekannten metabolischen Netzwerks in elementare Flussmoden. In der Literatur wurden bereits einfache intrazelluläre Netzwerk-Flüsse mithilfe von MLPs geschätzt. Es wurden dabei zunächst die elementaren Flussmoden des Netzwerks erzeugt. Elementare Flussmoden stellen eine Menge von zulässigen Flussverteilungen dar, aus denen durch unterschiedliche Gewichtungen alle weiteren möglichen
Flussverteilungen kombiniert werden können. Die MLP gibt dabei die
entsprechenden Gewichtungen aus. Die Anzahl dieser elementaren Flussmoden ist jedoch für die meisten biochemischen Netzwerke so groß, dass eine effektive und robuste Schätzung der Gewichtungen nicht möglich ist.
Erfindungsgemäß werden aber nur die extrazellulären Flüsse über neuronale Netze oder andere MLPs geschätzt, die Kopplung an die metabolische Stoffflussanalyse stellte sodann die Verbindung zur intrazellulären Flussverteilung her.
Gemäß Ausführungsformen der Erfindung ist die Machinelearning-Programmlogik also dazu ausgebildet, selektiv nur extrazelluläre Flüsse vorherzusagen, nicht jedoch intrazelluläre Flüsse.
Dies kann vorteilhaft sein, da die Vorhersage somit auf Werte beschränkt wird, die sich leicht messtechnisch auch während des Betriebs eines Bioreaktors erfassen lassen, sodass die extrazellulären Flüsse Zwischenwerte zur Vorhersage von intrazellulären Flüssen darstellen, wobei diese Zwischenwerte leicht mit real gemessenen Daten abgeglichen werden können um Fehler in der MLP schnell identifizieren zu können.
In einem weiteren Aspekt kann das Verfahren aus folgenden Gründen vorteilhaft sein: Der Metabolismus der Zellen hängt wesentlich von den Gegebenheiten im Bioreaktor ab. Werden Faktoren wie pH-Wert, p02-Wert, Druck und Temperatur konstant gehalten, sind vor allem die Metabolitkonzentrationen im Reaktionsmedium entscheidend für das Verhalten der Zellen, weshalb diese als Eingaben für den MLP gewählt wurden. Die Prädiktion künftiger Metabolitflüsse hat gegenüber der Vorhersage der künftigen Metabolitkonzentrationen zum nächsten
Probenahmezeitpunkt zwei wesentliche Vorteile:
Zum einen ist die so trainierte MLP flexibler im Bezug auf die Wahl der
Zeitintervalle. Werden nämlich Netze mit Metabolitkonzentrationen als Ausgaben trainiert, so bezieht sich die Vorhersage, die mit einer solchen trainierten MLP getroffen werden kann, immer auf das gleiche Zeitintervall wie im
Trainingsdatensatz. Schon bei der Generierung der Trainingsdaten wäre daher zu beachten, dass die Intervalle möglichst einheitlich gewählt werden, da sonst
Widersprüchlichkeiten entstehen können. Werden dagegen Flüsse vorhergesagt, hat das eine gewisse Unabhängigkeit des Zeitintervalls für die aktuelle Vorhersage von den während des Trainings der MLP verwendeten Zeitintervallen zur Folge. Das Verfahren ist also robuster und flexibler im Hinblick auf die Wahl der Zeitintervalle für die Vorhersage.
Zum anderen hängt die Metabolitkonzentration von kontinuierlichen und/oder pulsartigen Nährstoffzudosierungen ab, die teilweise variabel gehandhabt werden können. Diese Variabilität ist jedoch in der Prädiktion nicht gegeben, wenn die trainierte MLP die Zudosierungen, die im Trainingsdatensatz durchgeführt wurden, nicht separat behandelt, sondern blind mitlernt. Durch die Verwendung der extrazellulären Metabolitflüsse können die zukünftigen Konzentrationen über die Gleichung 4.4 des Appendix extrapoliert werden. Bezüglich des Zeitintervalls ist eine gewisse Flexibilität gegeben, sofern die Flüsse im Verhältnis zu den
Probenahmeintervallen nicht zu starken Schwankungen unterliegen. Nach
bevorzugten Ausführungsformen ist das Zeitintervall zwischen den Zeitpunkten, die für die Vorhersage der extrazellulären Flüsse verwendet werden, kleiner oder gleich oder maximal 20% größer als die bei der Erstellung des Trainingsdatensatzes verwendeten Zeitintervalle.
Nach Ausführungsformen werden die berechneten extrazellulären Flüsse so berechnet, dass diese um Stoffzudosierungen (z.B. Glukosezugaben) bereinigt sind. Im Rahmen der Vorhersage des einen oder der mehreren extrazellulären Flüsse kann also die Information, dass im nächsten Zeitintervall eine Zufütterung eines bestimmten extrazellulären Metaboliten erfolgt, verwendet werden, um die
Vorhersage der Konzentrationen dieses extrazellulären Metaboliten entsprechend anzupassen. Es ist auch möglich, die Zufütterungen anhand der Vorhersage geeignet einzustellen, sofern die MLP vorhersagt, dass mit einem Mangel an diesem extrazellulären Metaboliten zu rechnen ist. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Zudosierungen generell den mittleren Fluss beeinflussen können, da dadurch veränderte Konzentrationen im Reaktor vorliegen. Weicht das Dosierprofil stark von dem der Trainingsdaten ab, könnten sich daher Ungenauigkeiten ergeben
Ausführungsformen der Erfindung zufolge wird das zeitliche und mengenmäßige Profil der Zufütterungen von Metaboliten an eine Zellkultur, deren metabolischer Zustand vorhergesagt werden soll, identisch oder ähnlich zu dem Zufütterungsprofil gewählt, das zur Erzeugung der Trainingsdaten mit ein oder mehreren Trainings- Bioreaktoren verwendet wurde, wobei der MLP auf diesen Trainingsdaten trainiert wurde.
Nach Ausführungsformen der Erfindung erfolgen die Messungen zur Erhebung der Messdaten sowie die Vorhersage der extrazellulären Flüsse in Echtzeit, das heißt, während des Betriebes des Bioreaktors, in dem die Zellkultur enthalten ist. Die Zeitdauer zwischen der Erhebung der Messdaten und der Vorhersage des metabolischen Zustands der Zellen ist typischerweise klein und im Bereich einiger weniger Sekunden oder Minuten, typischerweise weniger als 15 Minuten, wohingegen die Zeitintervalle für einzelne Vorhersagen typischerweise im Bereich von 1 -48 Stunden und insb. 6-24 Stunden liegen.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt ermöglichen Ausführungsformen der
Erfindung somit die Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur in Echtzeit, da die Informationsbasis, auf welcher die Vorhersage beruht, in dem bereits definierten metabolischen Modell, der bereits vorliegenden trainierten MLP sowie Messdaten besteht, wobei die Messdaten leicht in Echtzeit erhoben werden können. So können zum Beispiel durch regelmäßige Entnahme einer Probe aus dem Kulturmedium und Bestimmung der Zellzahl und Metabolitkonzentration in dieser Probe die Messdaten gewonnen werden, die zur Durchführung der
Vorhersage erforderlich sind.
Nach Ausführungsformen der Erfindung wird das Verfahren zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur an einem künftigen Zeitpunkt in Echtzeit kontinuierlich während des Betriebs eines Bioreaktors, der die Zellkultur enthält, durchgeführt. Nach Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner eine Erzeugung der MLP durch maschinelles Lernen.
Die Erzeugung der MLP umfasst eine Erzeugung eines Trainingsdatensatzes, wobei die Erzeugung des Trainingsdatensatzes eine Durchführung der folgenden Operationen an jedem von einer Vielzahl von Trainings-Zeitpunkten während der Kultivierung von zumindest einer Trainings-Zellkultur von Zellen des bestimmten Zelltyps umfasst:
- Empfang mehrerer an diesem Trainings-Zeitpunkt gemessener Messwerte, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der zumindest einen Trainings-Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der zumindest einen Trainings-Zellkultur umfassen;
- Empfang der Zeitangabe des aktuellen Trainings-Zeitpunkts; und
- Berechnung von extrazellulären Flüssen der extrazellulären Metaboliten als Funktion der zu diesem Zeitpunkt und der zum jeweils vorhergehenden Zeitpunkt empfangenen Messwerte, wobei die extrazellulären Flüsse Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in die Zelle und/oder Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten in das Medium sind;
- Trainieren der MLP, wobei das Trainieren umfasst:
o Eingabe der Messwerte, die an jedem der Trainings-Zeitpunkte
empfangen wurden, als Eingabeparameterwerte in die MLP, und Eingabe der extrazellulären Flüsse, die an dem jeweils auf diesen Trainings-Zeitpunkt folgenden Zeitpunkt für diesen folgenden Zeitpunkt berechnet wurden, als zu diesen Eingabeparameterwerten gehörige Ausgabeparameterwerte in die MLP; und
o Durchführung eines Lernprozesses durch die MLP derart, dass die MLP lernt, basierend auf den Eingabeparameterwerten die jeweils zugehörigen Ausgabeparameterwerte vorherzusagen;
Speicherung der trainierten MLP in einem volatilen oder nicht-volatilen Speichermedium.
Die Verwendung und Erzeugung einer MLP gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann vorteilhaft sein, da zum einen bei der Wahl passender
Maschinenlernalgorithmen eine hohe Genauigkeit der Vorhersage erzielt werden kann, zum anderen eine Anpassung an die metabolischen Verhältnisse in anderen Zelltypen sehr einfach und ohne größeren manuellen Aufwand bzw.
Literaturstudium erfolgen kann. Der Betrieb einiger Trainings-Zellkulturen bei kontinuierlicher Sammlung und Aufzeichnung der oben genannten Messdaten und der aus diesen errechneten extrazellulären Flüsse reicht aus, um einen
Trainingsdatensatz bereitzustellen, auf dessen Basis eine MLP speziell für den Zelltyp der in den Trainings-Zellkulturen verwendeten Zellen trainiert und erzeugt werden kann.
Nach Ausführungsformen der Erfindung wird der Trainingsdatensatz so erzeugt, dass an jedem von einer Vielzahl von Trainings-Zeitpunkten während der
Kultivierung von mehreren Trainings-Zellkulturen von Zellen des bestimmten Zelltyps die Messwerte und Zeitangaben empfangen und die extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten berechnet werden. Hierbei werden die Zellkulturen vorzugsweise in Bioreaktoren unterschiedlichen Typs kultiviert. Vorzugsweise umfassen diese Bioreaktor-Typen zumindest zwei unterschiedliche Bioreaktortypen aus der folgenden Menge: ein Fed-Batch Bioreaktor, ein Batch Bioreaktor, ein Perfusionsreaktor (inklusive Varianten mit Zellrückhaltung), ein Chemostat und ein Split-Batch Bioreaktor.
Die Verwendung von Bioreaktoren unterschiedlichen Typs bei der Erzeugung des Trainingsdatensatzes kann vorteilhaft sein, da dadurch eine breitere Datenbasis erzeugt wird und ein„Overfitting“ der MLP im Zuge des Trainings vermieden oder reduziert werden kann. Außerdem ermöglicht es den Einsatz der gleichen MLP zur erfolgreichen Vorhersage des künftigen metabolischen Zustands einer Zellkultur in vielen verschiedenen Bioreaktortypen. Vorzugsweise wird der Trainingsdatensatz basierend auf Trainings-Zellkulturen erhoben, die in unterschiedlichen
Bioreaktortypen kultiviert werden, wobei die Bioreaktortypen zumindest einen Fed- Batch Bioreaktor und/oder zumindest einen Perfusionsreaktor beinhalten. Dies kann vorteilhaft sein, da diese Reaktortypen in der Praxis zunehmen häufig verwendet werden und die Darstellung des metabolischen Zustands von Zellkulturen in diesen Reaktortypen aufgrund deren großer Dynamik bisher eine besondere Schwierigkeit darstellte. Vorzugsweise wird die Zellkultur, deren künftiger metabolischer Zustand
vorhergesagt werden soll, in einem Bioreaktortyp kultiviert, welcher auch zur Erzeugung der Trainingsdatensätze verwendet wurde.
Nach Ausführungsformen wird der Trainingsdatensatz so erzeugt, dass an jedem von einer Vielzahl von Trainings-Zeitpunkten während der Kultivierung von mehreren Trainings-Zellkulturen von Zellen des bestimmten Zelltyps die Messwerte und Zeitangaben empfangen und die extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten berechnet werden, wobei die Zellkulturen in Bioreaktoren des gleichen Typs oder von unterschiedlichen Typen kultiviert werden, wobei sämtliche
Bioreaktoren nicht dem Batch Bioreaktortyp angehören. Beispielsweise könnten sämtliche Bioreaktortypen dem Fed-Batch Reaktortyp angehören.
Aufgrund der kontinuierlichen oder pulsweisen Zugabe von zusätzlicher Nährlösung während des Betriebs hat sich die Vorhersage zukünftiger metabolischer Zustände von Zellen in Fed-Batch Bioreaktoren als besondere technische Herausforderung erwiesen. Ausführungsformen der Erfindung sind gerade im Kontext der
Verwendung von Fed-Batch Bioreaktoren vorteilhaft, da sich herausgestellt hat, dass die Vorhersagen gemäß Ausführungsformen der Erfindung trotz der metabolischen Komplexität von Zellkulturen, die in diesem Reaktortyp kultiviert werden, akkurat sind.
Nach manchen Ausführungsformen handelt es sich bei der MLP um eine Support- Vektor-Maschine oder ein System mehrerer Support-Vektor-Maschinen.
Nach anderen Ausführungsformen handelt es sich bei der MLP um ein neuronales Netzwerk oder ein System aus mehreren neuronalen Netzwerken (NNs).
Einige erste Tests lassen darauf schließen, dass neben Support-Vektor-Maschinen und neuronalen Netzwerken auch andere MLP-Verfahren verwendet werden können. Allerdings wurden bei der Verwendung von neuronalen Netzen besonders gute Vorhersageergebnisse erzielt und es sind bereits eine breite Palette an Softwarelösungen für verschiedene Netzwerkarchitekturen erhältlich, die eine einfache Handhabung des neuronalen Netzes während der Trainingsphase wie auch während der Anwendungsphase ermöglichen. Nach Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei der MLP um ein System aus mehreren Unter-MLPs (insb. einzelnen NNs), wobei die einzelnen in dem
System enthaltenen Unter-MLPs jeweils für die Vorhersage des extrazellulären Flusses eines einzelnen extrazellulären Metaboliten trainiert wurden und selektiv für die Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen extrazellulären
Metaboliten an dem Zukunftszeitpunkt verwendet werden.
Dies kann vorteilhaft sein, da es sich herausgestellt hat, dass die prädiktive Kraft gemessener Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten im Hinblick auf einzelne extrazellulären Flüsse anderer extrazellulärer Metaboliten unterschiedlich ist. Die Qualität der Vorhersage kann erhöht werden, indem einzelne Unter-MLPs, zum Beispiel einzelne neuronale Netze, jeweils basierend auf einem spezifischen Satz an Eingabeparameterwerten im Hinblick auf den extrazellulären Fluss des
extrazellulären Metaboliten als Ausgabeparameterwert trainiert werden. Die
Ergebnisse der einzelnen Unter-MLPs können von einem übergeordneten MLP oder einer sonstigen Programmlogik so verknüpft werden, dass als Gesamtergebnis ein extrazellulärer Fluss von ein oder mehreren extrazellulären Metaboliten
zurückgegeben wird. Ein„Unter-MLP“ ist ein MLP, welches mit einem oder mehreren weiteren„Unter-MLP“s funktional so verbunden ist, dass der Output dieser und der weiteren„Unter-MLPs“ von einer übergeordneten Programmlogik, insbesondere einer weiteren, übergeordneten MLP, zu einem Gesamtergebnis kombiniert, z.B. aggregiert wird.
Nach Ausführungsformen der Erfindung verwendet die MLP zur Vorhersage des extrazellulären Flusses eines einzelnen der extrazellulären Metaboliten gemessene Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten als Eingabeparameterwerte. Hierbei unterscheiden sich die mehreren extrazellulären Metaboliten, die als
Eingabeparameterwerte für zumindest zwei der extrazellulären Metaboliten, deren extrazellulärer Fluss bestimmt werden soll, verwendet werden.
Dies kann vorteilhaft sein, da hierdurch eine höhere Akkuratheit der Vorhersage erreicht werden kann. Nach Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Verfahren ferner eine
Messung der Konzentrationen aller Eingabekandidaten-Metaboliten über mehrere Zeitpunkte. Insbesondere kann die Messung der Erstellung von
Metabolikonzentrationsprofilen über die Zeit dienen. Die Menge der
Eingabekandidaten-Metaboliten umfasst dabei alle extrazellulären Metaboliten, die in einem Referenz-Bioreaktor mit einer Zellkultur des bestimmten Typs
messtechnisch verfügbaren sind oder alle extrazellulären Metaboliten des metabolischen Modells. Bei dem Referenz-Reaktor kann es sich zum Beispiel um einen oder um mehrere Trainings-Bioreaktoren handeln, also um Reaktoren, die zur Erhebung der Trainingsdaten zur Erzeugung der MLP verwendet wurden. Alternativ dazu kann es sich bei dem Referenz-Reaktor auch um einem anderen Reaktor mit einer Zellkultur gleichen Typs wie der aktuell überwachte Bioreaktor handeln. Die Ermittlung derjenigen extrazellulären Metabolite, die als Eingabeparameterwerte für die MLP im Hinblick auf die Vorhersage der extrazellulären Flüsse einzelner extrazellulärer Metabolite des Modells dienen sollen, erfolgt also vorzugsweise während oder vor dem Training der MLP.
Für jeden einzelnen der extrazellulären Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll, erfolgt eine Durchführung eines Auswahlverfahrens zur Identifikation der mehreren extrazellulären Metaboliten, die als
Eingabeparameterwerte zur Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen Metaboliten verwendet werden sollen. Das Auswahlverfahren umfasst im Hinblick auf diesen einzelnen Metaboliten jeweils: a) Definieren einer ersten Menge extrazellulärer Metaboliten, wobei die erste Menge alle Eingabekandidaten-Metaboliten umfasst; b) Berechnung eines ersten Relevanz-Scores jedes der extrazellulären
Metaboliten in der ersten Menge als Funktion der gemessenen Konzentrationen dieses Metaboliten, wobei der erste Relevanz-Score die Vorhersagekraft der Konzentration des jeweiligen extrazellulären Metaboliten im Hinblick auf den extrazellulären Fluss dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten angibt; c) Überführung nur desjenigen der extrazellulären Metaboliten, der den höchsten ersten Relevanz-Score hat, von der ersten Menge in eine noch leere zweite Menge an extrazellulären Metaboliten unter Entfernung dieses Metaboliten aus der ersten Menge; d) Berechnung eines weiteren Relevanz-Scores jedes der extrazellulären
Metaboliten in der ersten Menge als Funktion der gemessenen Konzentrationen dieses Metaboliten und der gemessenen Konzentrationen aller in der zweiten Menge enthaltenen extrazellulären Metaboliten, wobei der weitere Relevanz- Score die Vorhersagekraft der Konzentration des jeweiligen Eingabekandidaten- Metaboliten im Hinblick auf den extrazellulären Fluss dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten unter Berücksichtigung der bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten angibt; e) Überführung nur desjenigen der extrazellulären Metaboliten der ersten Menge, der den höchsten weiteren Relevanz-Score hat, in die zweite Menge unter Entfernung dieses Metaboliten aus der ersten Menge, wobei die Überführung nur dann erfolgt, wenn durch die Aufnahme dieses Metaboliten die zweite Menge nicht einen maximalen Grenzwert für informative Redundanz der in ihr enthaltenen Metaboliten bezüglich der Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten übersteigt; f) Wiederholung der Schritte d) und e) so lange, bis keine Metaboliten mehr von der ersten in die zweite Menge überführt werden können ohne dass die zweite Menge den maximalen Grenzwert für informative Redundanz überschreitet; und g) Selektive Verwendung nur der Metaboliten, die in die zweite Menge überführt wurden, als Eingabeparameterwerte zur Vorhersage des extrazellulären
Flusses dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten.
Nach Ausführungsformen wird der erste Relevanz-Score berechnet als partial mutual Information score - PMI-Score - zwischen einem Metaboliten der ersten Menge und dem einzelnen Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll. Der zweite Relevanz-Score berechnet wird als PMI-Score - zwischen einem Metaboliten der ersten Menge und dem einzelnen Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll unter Berücksichtigung aller bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten. Dies kann vorteilhaft sein, da hierdurch Eingangsparameterwerte ermittelt und verwendet werden können, die für den jeweiligen extrazellulären Metaboliten bzw. dessen Fluss besonders hohe Vorhersagekraft haben. Overfitting im Zuge des Trainings und damit schlechte Vorhersagequalität kann vermieden werden.
Durch die Identifikation derjenigen Metaboliten, die für einen bestimmten
extrazellulären Fluss eines extrazellulären Metaboliten die höchste Aussagekraft („Relevanz“ bzw.„prädiktive Relevanz“) haben, wird sichergestellt, dass die ausgewählten Eingabeparameterwerte ein Erzeugen einer MLP mit guter
Vorhersagekraft ermöglichen. Die prädiktive Relevanz wird vorzugsweise ermittelt durch die Bestimmung des Maßes der Korrelation eines gemessenen
Metabolitkonzentrationsprofils eines bestimmten extrazellulären Metaboliten mit dem Metabolitkonzentrationsprofil des Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss als Ausgabeparameterwert der MLP dient (sprich: dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll). Die prädiktive Relevanz kann mittels verschiedener Verfahren ermittelt werden, z.B. Hauptkomponentenanalyse oder PMI („partial mutual Information“) wie im Folgenden noch für Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wird. Der Umstand, dass ein Metabolit nur dann in die zweite Menge aufgenommen wird, wenn in dieser nicht bereits ein Metabolit enthalten ist, dessen Konzentrationsprofil stark mit dem Konzentrationsprofil dieses Metaboliten korreliert (was einen hohen Grad informativer Redundanz dieses Metaboliten mit diesem bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten impliziert), schützt davor, dass die zweite Menge auch Gruppen von zwei oder mehr Metaboliten enthält, deren Konzentrationsprofile stark korrelieren und damit redundante Informationen in die zweite Menge einbringen würden. Ein hoher Anteil von informativ-redundanten Metaboliten in der zweiten Menge würde zu Overfitting-Effekten führen.
Beispielsweise kann für die Aufnahme weiterer Metaboliten von der ersten in die zweite Menge das Erreichen eines Maximalwerts für die informative Redundanz oder ein anderes Abbruchkriterium definiert werden, sodass in der Regel nur ein Teil der Metaboliten von der ersten in die zweite Menge übertragen wird.
Somit kann nach Ausführungsformen der Erfindung die Auswahl der
Eingabeparameter (extrazelluläre Metaboliten, deren Konzentration gemessen und in die MLP eingegeben werden) vollkommen unabhängig von der MLP erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, dass das Auswahlverfahren in Form eines„Wrappers“ vollzogen wird wie in Kapitel 4.7.3 des Appendix beschrieben, also z.B. als eine Funktionalität, die durch das neuronale Netz bereitgestellt wird.
Nach Ausführungsformen wird der erste Relevanz-Score jedes der Metaboliten in der ersten Menge im Hinblick auf diesen einzelnen extrazellulären Metaboliten berechnet als PMI-Score zwischen diesem Metaboliten und den einzelnen
Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss jeweils vorhergesagt werden soll.
Ein PMI-Score (im Gegensatz zur einfacheren Mutual Information (Ml)) kann auch bei den weiteren, iterativ ausgeführten Schritten zur Berechnung des weiteren Relevanz-Scores jedes in der ersten Menge verbliebenen Metaboliten erfolgen. Der weitere PMI score gibt die prädiktive Relevanz dieses Metaboliten im H inblick auf den extrazellulären Metaboliten an, wobei in diese Relevanz die informative
Redundanz des zu prüfenden Metaboliten aus der ersten Menge bezüglich aller bereits in die zweite Menge übernommenen Metaboliten eingeht. Bevor ein
Metabolit also letztlich in die zweite Menge aufgenommen wird, wird demnach geprüft, ob er angesichts der bereits in der zweiten Menge befindlichen Metaboliten überhaupt noch einen„prädiktiven Mehrwert“ über die bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten hinaus erbringt. Falls das gemessene Konzentrationsprofil dieses Metaboliten stark korreliert mit einem bereits in der zweiten Menge befindlichen Metaboliten, ist dies zu verneinen. In diesem Fall findet keine
Aufnahme in die zweite Menge statt.
Anhand eines Test-Datensatzes kann die Güte der Auswahl der Eingabeparameter abgeschätzt und die Architektur der MLP (z.B. Anzahl der Schichten eines neuronalen Netzwerks) optimiert werden.
Die Bestimmung der prädiktiven Relevanz eines Metaboliten im Hinblick auf einen Ausgabeparameter-Metaboliten mittels der PMI erlaubt also ein Messen bzw. eine Abschätzung der möglichen Eingabevariable und der Abhängigkeit zwischen jeder der möglichen Eingangsvariablen im Hinblick auf die Ausgangsvariable. Je stärker die Abhängigkeit ist, desto besser kann die Ausgangsgröße anhand der
Eingangsvariablen vorausgesagt werden, desto höher auch der Relevanz-Score des Eingabewert-Metaboliten. Dies ermöglicht die Berechnung der Relevanz-Scores und Score-basierten Sortierung der Metaboliten der ersten Menge. Bei der PMI-basierten Entscheidung, ob ein Metabolit in die zweite Menge aufgenommen wird, wird mittels der PMI die Abhängigkeit dieses Metaboliten zu jedem Metaboliten, der sich schon in der zweiten Menge befindet, ermittelt. Es werden nur Metaboliten in die zweite Menge aufgenommen, die im Vergleich zu den schon in der zweiten Menge befindlichen Metaboliten genügend relevante neue Informationen beinhalten, damit keine Redundanzen entstehen.
Bei der Auswahl des nächst-relevanten Metaboliten in die zweite Menge werden somit auch die bereits in die zweite Menge ausgewählten Metaboliten
berücksichtigt.
Die Berechnung der Abhängigkeit zwischen den extrazellulären Metaboliten in Form der PMI („partial mutual Information“) kann z.B. erfolgen, um im Zuge der
Entscheidung, ob ein Metabolit der ersten Menge in die zweite Menge
aufgenommen werden soll, die errechnete PMI mit einem PMI Kriterium, z.B. einem PMI Grenzwert für einen noch akzeptablen Grad der Abhängigkeit, zu vergleichen; in der Regel besteht der Vergleich mit einem PMI Kriterium jedoch nicht aus einem einfachen Vergleich mit einem Grenzwert, sondern besteht in einem statistischen Test oder einem alternativen Auswahlverfahren wie z.B. einem„Wrapper“, wie dieser beispielsweise im Appendix gemäß der Gleichungen 2.22-2.27 sowie im Kapitel 4.7.3 des Appendix erläutert ist. Nach der im Appendix beschriebenen Ausführungsform wird zunächst immer der„relevanteste“, also der mit dem höchsten PMI-Wert, in die erste Menge übernommen. So wird eine Ordnung aller Metaboliten erzeugt. Zuletzt befinden sich aber ALLE Metaboliten in der ersten Menge. In einem nachfolgenden Schritt (Wrapper) wird dann entschieden, wie viele der relevantesten Metaboliten in die„zweite Liste“ derjenigen zur Prädiktion verwendet werden.
Nach Ausführungsformen verwendet die MLP zur Vorhersage des extrazellulären Flusses jedes einzelnen der extrazellulären Metaboliten gemessene
Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten als Eingabeparameterwerte, wobei die mehreren extrazellulären Metaboliten mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei Aminosäuren umfassen. Die Metaboliten, deren Konzentrationen als Eingabeparameterwerte verwendet werden, enthalten oftmals, aber nicht notwendigerweise, den Metaboliten, dessen Fluss als Ausgabeparameterwert verwendet wird. Die Verwendung von Aminosäurekonzentrationen im Medium als
Eingabeparameterwerte für die MLP bzw. für das Training der MLP kann vorteilhaft sein, da bereits etablierte Verfahren zur Bestimmung deren Konzentration existieren und das ausreichende Vorhandensein von Aminosäuren oft notwendig für eine effiziente Synthese vieler Zielproteine in einem Bioreaktor ist.
Es ist möglich dass bereits während des Trainings selektiv nur die Konzentrationen dieser Teilmenge an Metaboliten zum Training der MLP verwendet werden.
Ordnet man die Eingabeparameterwerte der ersten Menge nach ihrer Relevanz (z.B. laut PMI), so sind am Ende alle verfügbaren Eingaben in dieser„Menge“ enthalten, aber in der Reihenfolge, die die Relevanz angibt. Es wird sodann ein zusätzliches Kriterium verwendet, um aus dieser Liste die Anzahl der
Eingabeparameter (Konzentrationen) zu bestimmen, die dann künftig als Eingabe genutzt werden sollen. Nach Ausführungsformen der Erfindung erfolgte die Auswahl während des Trainings selbst (es wurden unterschiedliche Anzahlen an
Eingabeparametern verglichen bezüglich ihrer prädiktiven Kraft, die anhand eines Testdatensatzes bewertet wurde).
Vorzugsweise werden selektiv nur die Konzentrationen dieser Teilmenge an
Metaboliten, die in der Zellkultur gemessen wurden, deren metabolischer Status vorhergesagt werden soll, als Eingabeparameterwerte für die bereits trainierte MLP verwendet. Die selektive Verwendung von prädiktiv relevanten und unabhängigen Eingangsvariablen (anstatt sämtlicher messtechnisch verfügbarer Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten) kann vorteilhaft sein, da das Problem des„Overfittens“ reduziert wird, die Datenerhebung vereinfacht wird (ggf. müssen nicht die
Konzentrationen sämtlicher extrazellulärer Metaboliten des Modells gemessen werden) und die Vorhersage weniger Rechnerressourcen verbraucht , da weniger Eingabeparameterwerte ausgewertet werden müssen.
Nach Ausführungsformen verkörpert das metabolische Modell für die intrazellulären Metaboliten des Modells eine steady state Annahme, wonach die Stoffmenge der intrazellulären Metaboliten konstant bleibt, sodass die Summe der eingehenden Flüsse für jeden intrazellulären Metaboliten der Summe der ausgehenden Flüsse dieses Metaboliten entspricht. Nach Ausführungsformen sind die Vielzahl von Zeitpunkten (die für die Vorhersage der extrazellulären Flüsse der aktuell kultivierten Zellkultur verwendet werden) durch Zeitintervalle von 10 Minuten bis 48 Stunden, vorzugsweise von 1 -24 Stunden, getrennt. Nach bevorzugten Ausführungsformen ist das Zeitintervall zwischen den Zeitpunkten, die für die Vorhersage der extrazellulären Flüsse verwendet werden, kleiner oder gleich oder maximal 20% größer als die bei der Erstellung des
Trainingsdatensatzes verwendeten Zeitintervalle.
Nach Ausführungsformen sind die Vielzahl von Zeitpunkten durch Zeitintervalle getrennt, die über die Dauer der Durchführung der Zellkultur gleich lang sind oder deren Länge zum Ende der Dauer der Kultivierung der Zellkultur kleiner wird. Nach bevorzugten Ausführungsformen ist das Profil der Änderung der Zeitintervalle zwischen den Zeitpunkten, die für die Vorhersage der extrazellulären Flüsse verwendet werden, identisch oder sehr ähnlich zu den Profilen der Änderungen der Zeitintervalle die bei der Erstellung des Trainingsdatensatzes verwendeten
Zeitintervalle.
Der bestimmte Zelltyp kann ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Zelltyp sein.
Insbesondere kann es sich bei dem bestimmten Zelltyp um einen eukaryotischen Zelltyp handeln.
Es hat sich herausgestellt, dass trotz der hohen Komplexität eukaryotischer
Stoffwechselvorgänge Ausführungsformen der Erfindung in der Lage sind, den metabolischen Zustand der Zelle akkurat vorherzusagen, insbesondere für künftige Zeiträume die im Bereich von Stunden bis 1-2 Tagen in der Zukunft liegen.
Beispielsweise kann es sich bei dem bestimmten Zelltyp um einen Zelltyp eines Säugetiers handeln, z.B. HELA Zellen u.a. Nach einer Ausführungsform handelt es sich bei dem bestimmten Zelltyp um
Chinese-Hamster-Ovary (CHO) Zellen.
Nach Ausführungsformen ist der bestimmte Zelltyp ein genetisch modifizierter Zelltyp, der zum Zweck der Gewinnung eines Biomoleküls in einem Bioreaktor gehalten und/oder vermehrt wird. Beispielsweise kann es sich um eine genetisch modifizierte Zelllinie handeln, die ein bestimmtes Protein, z.B. ein Enzym oder einen bestimmten Antikörper, exprimiert und/oder in besonders hohen Mengen exprimiert.
Nach Ausführungsformen werden die berechneten intrazellulären Flüsse auf Plausibilität und Konsistenz und/oder im Hinblick auf weitere Qualitätskriterien überprüft und ggf. durch Ergänzung, Entfernung oder Änderung von
stöchiometrischen Gleichungen modifiziert. Die gemessenen und/oder
vorhergesagten extrazellulären Metabolitflüsse werden nun an das modifizierte metabolische Modell übergeben um daraufhin die intrazellulären Flüsse erneut zu berechnen und auf Plausibilität und/oder Konsistenz zu prüfen. Somit kann die Qualität des metabolischen Modells verbessert und ggf. auch an bestimmte
Zelltypen bzw. bestimmte Zellklone angepasst werden. Anhand dieser
Plausibilitätskriterien können gemäß Ausführungsformen der Erfindung auf Basis mehrerer experimenteller Versuche auch plausible Referenzwerte für die
intrazellulären Flüsse gewonnen werden.
Nach Ausführungsformen beinhaltet die Berechnung des intrazellulären Flusses von einem oder mehreren intrazellulären Metaboliten an jedem der Zukunftszeitpunkte eine Berechnung mehrerer oder vorzugsweise aller intrazellulären Flüsse des metabolischen Modells. Vorzugsweise werden sämtliche intrazellulären Flüsse des Modells berechnet. Je mehr intrazelluläre Flüsse berücksichtigt werden, z.B. bei einer Plausibilitätsabschätzung, desto höher die Verlässlichkeit der Vorhersage.
Nach Ausführungsformen umfasst das Verfahren eine Identifikation aller
intrazellulären Flüsse, die von einem jeweiligen Referenzwert oder
Referenzwertbereich um mehr als den Grenzwert abweichen. Die Referenzwerte oder Referenzwertbereiche können z.B. empirisch gewonnen werden und/oder aus der Literatur abgeleitet werden. Das Verfahren umfasst ferner eine automatische Identifikation desjenigen intrazellulären Flusses, der als limitierender Faktor für das Zellwachstum oder die Produktion eines gewünschten Biomoleküls wirkt.
Für viele Metaboliten ist deren ungefährer intrazellulärer Fluss im Kontext eines bestimmten metabolischen Zustands bekannt, z.B. mittels kinetischer Modelle, mit Hilfe von 13C markierten Substraten und Quantifizierung via NMR von
Isotopomeren der Metabolite oder anhand der Aminosäurezusammensetzung der Zellproteine etc. Starke Abweichungen von diesen Referenzbereichen deuten also darauf hin, dass sich der Metabolismus der Zellen der Zellkultur in einem
ungünstigen oder zumindest unerwarteten Zustand befindet. Der Umstand, dass Ausführungsformen der Erfindung intrazelluläre Flüsse mit Referenzwerten abgleichen und nicht etwa die Konzentration extrazellulärer Metaboliten mit Referenzwerten, um dann über diese auf den metabolischen Zustand einer Zelle zu schließen, ist vorteilhaft, da so eine feingranularere und bessere Feststellung von (zumeist unerwünschten) Abweichungen des physiologischen Zustands einer Zelle von physiologisch üblichen bzw. günstigen Referenzwerten möglich ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Überwachung und/oder Steuerung eines Bioreaktors, der die Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps beinhaltet. Das Verfahren umfasst eine Berechnung
intrazellulärer Flüsse an einem Zukunftszeitpunkt gemäß den hier beschriebenen Ausführungsformen und Beispielen des Verfahrens zur Vorhersage des
metabolischen Zustands von Zellen. Das Verfahren umfasst ferner einen Vergleich der vorhergesagten intrazellulären Flüsse mit Referenzwerten oder
Referenzwertbereichen für akzeptable intrazelluläre Flüsse der jeweiligen ein oder mehreren intrazellulären Metaboliten.
Das Verfahren kann zur Überwachung des Bioreaktors dienen und eine Ausgabe einer Warnung beinhalten, wobei die Warnung ausgegeben wird, wenn eine Abweichung des berechneten intrazellulären Flusses von seinem jeweiligen Referenzwert oder Referenzwertbereich einen Grenzwert überschreitet. Die Warnung kann z.B. über eine graphische Benutzeroberfläche an einen Menschen und/oder über eine andere Schnittstelle an Maschinen oder Softwareprogramme, die die Abweichungen protokolliert, gesendet werden.
Zusätzlich oder alternativ dazu kann das Verfahren zur Kontrolle des Bioreaktors dienen und ein Senden eines Kontrollbefehls an den Bioreaktor beinhalten. Der Kontrollbefehl wird gesendet, um automatisch Schritte einzuleiten, die den Zustand des Bioreaktors oder des darin enthaltenen Mediums so ändern, dass die
Abweichung reduziert wird. Beispielsweise kann der Kontrollbefehl an ein Ventil, eine Pumpe oder eine sonstige Stelleinheit des Reaktors gehen und dort die Zugabe von Nährlösungen, Spurenelementen, Sauerstoff, C02, pFI-regulierende Säuren oder Basen oder eine entsprechende Drosselung der Zugabe bewirken. Insbesondere können die automatischen Schritte eine Änderung der Menge oder der Zusammensetzung einer Nährlösung beinhalten. Der Kontrollbefehl kann also z.B. an einen Mischer einer Nährlösung oder eine Drosselungseinheit an einer Zufuhrleitung der Nährlösung gehen, um z.B. in Abhängigkeit der vorhergesagten Flüsse die Menge bestimmter Zucker, Salze und/oder Aminosäuren in der
Nährlösung zu ändern oder die Zufuhrrate der Nährlösung in den Bioreaktor zu verringern oder zu erhöhen.
Beispielsweise kann gemäß Ausführungsformen des Verfahrens festgestellt oder vorhergesagt werden, dass ein bestimmter intrazellulärer Stoffwechselweg deutlich schwächer ausgeprägt ist (erkennbar an geringem intrazellulärem Fluss) als dies erwartet bzw. gewünscht ist. Von diesem Stoffwechselweg kann bekannt sein, dass er häufig durch die Menge an einem bestimmten Vitamin oder Spurenelement im Medium limitiert ist, z.B. Eisen. Falls also erkannt wird, dass dieser bestimmte intrazelluläre Fluss niedriger ist als erwartet, kann durch die gezielte Zugabe von Eisen in den Bioreaktor viel gezielter gegensteuert werden, als dies möglich ist, wenn nur darauf geachtet wird, dass physikalische bzw. extrazelluläre Parameter wie Temperatur, pH, Glukose-Konzentration etc. konstant gehalten werden.
Nach Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren zur Überwachung und/oder Kontrolle eines Bioreaktors ein Identifizieren derjenigen Reaktion innerhalb des metabolischen Modells der Zellen, die als limitierender Faktor für das Zellwachstum oder die Produktion eines gewünschten Biomoleküls wirkt gemäß den hier beschriebenen Ausführungsformen und Beispielen des Verfahrens zur Vorhersage des metabolischen Zustands und mehrerer intrazellulärer Flüsse von Zellen. Das Verfahren umfasst ferner eine automatische Zugabe von selektiv denjenigen
Substanzen (insbesondere Enzyme, Co-Enzyme, Spurenelemente oder Nährstoffe), welche (ausschließlich oder insbesondere) den als limitierender Faktor wirkenden intrazellulären Fluss so verändern, dass das Zellwachstum oder die Produktion des Biomoleküls oder die Qualität des Biomoleküls gefördert wird. Zusätzlich oder alternativ dazu umfasst das Verfahren eine Ausgabe einer Aufforderung zu einer solchen Zugabe über eine Nutzerschnittstelle.
Dies kann vorteilhaft sein, da eine detailliertere Überwachung bzw. die Ergreifung von sehr spezifischen Kontrollmaßnahmen zur Kontrolle eines Bioreaktors ermöglicht wird als mit im Stand der Technik bekannten Verfahren möglich ist welche darauf beruhen, zu versuchen, nur die Betriebsparameter des Bioreaktors einschließlich einiger im Medium gemessener Parameter konstant zu halten. Eine starke Aufnahme und Verstoffwechslung von Aminosäuren bedeutet zum Beispiel nicht zwangsläufig, dass die Zelle die Aminosäuren auch zur Synthese des gewünschten Zielproteins verwenden. Je nach Zustand der intrazellulären Flüsse der Zelle kann es auch sein, dass die aufgenommenen Aminosäuren für völlig andere Zwecke verstoffwechselt werden. Dies kann jedoch erfindungsgemäß durch eine metabolische Flussanalyse basierend auf einem bestimmten metabolischen Modell der Zelle unter Verwendung der Vorhersagen der MLP erreicht werden.
Nach Ausführungsformen des Verfahrens werden die vorhergesagten
extrazellulären und intrazellulären Flüsse ferner verwendet, um die Qualität des Modells zu prüfen. Weicht beispielsweise ein Modell, das für einen bestimmten CHO-Zellklon formuliert wurde, stark von einem anderen Klon oder von einer anderen Zelllinie (anderes Gewebe oder andere Tierart) ab, so können die vorhergesagten Flüsse (intrazellulär mittels MFA, extrazellulär mittels der MLP) mit gemessenen Konzentrationsänderungsraten oder Plausibilitätskriterien (keine unrealistisch oder unphysiologisch hohen Flüsse, etc.) verglichen werden. Bei hohen Abweichungen der vorhergesagten von den gemessenen oder plausiblen Flüssen wird das Modell angepasst bzw. als Indiz auf das Vorliegen eines Fehlers im metabolischen Modell angesehen auf dessen Basis das Modell korrigiert wird.
Nach Ausführungsformen werden durch den Vergleich der vorhergesagten Flüsse mit den gemessenen oder plausiblen Flüssen Messfehler bei der Bestimmung von Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten oder der Biomasse identifiziert, z.B. mittels statistischer Tests.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines metabolisch vorteilhaften Klons von Zellen eines bestimmten Zelltyps. Das
Verfahren umfasst:
- Kultivieren unterschiedlicher Zellkulturen in mehreren Bioreaktoren, wobei die unterschiedlichen Zellkulturen unterschiedliche Klone von Zellen des
bestimmten Zelltyps beinhalten;
- Berechnung des intrazellulären Flusses von einem oder mehreren
intrazellulären Metaboliten an mehreren Zeitpunkten getrennt für jeden der Zellklone gemäß den hier beschriebenen Ausführungsformen und Beispielen des Verfahrens zur Vorhersage des metabolischen Zustands von Zellen;
- Identifikation desjenigen der Zellklone, dessen berechneter intrazellulärer Fluss des einen oder der mehreren intrazellulären Metaboliten metabolisch am vorteilhaftesten ist.
Dies kann vorteilhaft sein, da im Kontext pharmazeutischer Syntheseverfahren häufig die Identifikation und selektive Weitervermehrung metabolisch vorteilhafter Zellklone notwendig ist. Viele bekannte Verfahren zur genetischen Modifikation von Zellen gewähren keine vollständige Kontrolle darüber, ob und an welcher Stelle im Genom einer Zelle ein bestimmtes Gen, das ein zu synthetisierendes Zielprotein kodiert, eingebaut wird. Je nach Lage im Genom kann die Expressionsrate unterschiedlich sein. Beispielsweise ist die Transfektion von Zellen mit Viren ein Verfahren, bei welchem viele verschiedene Zellklone entstehen, von welchen manche das gewünschte Gen gar nicht enthalten und andere das gewünschte Gen zwar eingebaut haben, aber an unterschiedlichen Stellen im Genom.
Erfindungsgemäß kann nun in Echtzeit beim parallelen Betrieb mehrerer
Bioreaktoren mit den unterschiedlichen Zellklonen festgestellt werden, ob die intrazellulären Flüsse darauf hindeuten, dass das Gen, das das Zielprotein kodiert, ins Genom der Zelle eingebaut wurde und das Zielprotein in der Zelle in
nennenswertem Umfang synthetisiert wird. Beispielsweise kann ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des Zielproteins mit den intrazellulären Flüssen zur Synthese bzw. zum Abbau einzelner Aminosäuren einen Hinweis darauf geben, ob das Zielprotein eingebaut wurde. Zusätzlich oder alternativ dazu können die intrazellulären Flüsse Aufschluss darüber geben, ob sich ein bestimmter Zellklon hinreichend schnell vermehrt und vital ist, ob er eine geringe Bildungsrate toxischer oder aus anderen Gründen unerwünschter Stoffwechsel Produkte aufweist, etc.
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können jedoch nicht nur zur Vorhersage des künftigen metabolischen Zustands von Zellen verwendet werden, sondern auch für eine Beschreibung des aktuellen metabolischen Zustands einer Zelle.
Nach Ausführungsformen umfasst das Verfahren:
- Berechnung des aktuellen extrazellulären Flusses von einem oder mehreren der extrazellulären Metaboliten anhand der an dem aktuellen Zeitpunkt und an dem vorhergegangenen Zeitpunkt gemessenen Konzentrationen der extrazellulären Metaboliten;
- Durchführung einer weiteren metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der aktuellen intrazellulären Flüsse an dem aktuellen Zeitpunkt unter
Verwendung der berechneten aktuellen extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells; und
- Verwendung berechneten aktuellen intrazellulären Flüsse als Beschreibung eines aktuellen metabolischen Zustands der Zellen der Zellkultur.
Dies kann vorteilhaft sein, da eine sehr akkurate Beschreibung des aktuellen metabolischen Zustands der Zellen einer Zellkultur bis hin auf die Ebene einzelner intrazellulärer Flüsse bereitgestellt ist.
Nach Ausführungsformen umfassen die Messwerte auch eine Laktatdehydrogenase (LDH) Konzentration und an jedem der Zeitpunkte während der Kultivierung der Zellkultur wird eine im Medium der Zellkultur gemessene LDH- Konzentration empfangen. Die Vorhersage der extrazellulären Flüsse der extrazellulären
Metaboliten an jedem der Zukunftszeitpunkte erfolgt durch die MLP unter
Verwendung einer korrigierten anstatt der gemessenen Zelldichte.
Vorzugsweise umfasst die Berechnung der korrigierten Zelldichte für jeden der Zeitpunkte eine Berechnung der Dichte lysierter Zellen im Medium der Zellkultur als Funktion der gemessenen LDH Konzentration. Bei dieser Funktion kann es sich insbesondere um eine empirisch ermittelte, heuristische und lineare Funktion handeln, die die Abhängigkeit der LDH Konzentration im Medium von der Anzahl lysierter Zellen dieses bestimmten Zelltyps darstellt. Sodann wird die korrigierte Zelldichte errechnet als Summe der gemessenen Zelldichte im Medium und der berechneten Dichte der lysierten Zellen.
Dies kann vorteilhaft sein, da Zellen, die komplett oder teilweise lysiert sind, mit optischen Verfahren zur Zelldichtebestimmung oft nicht oder nur schlecht nachweisbar sind, die lysierten Zellen aber bis kurz vor ihrer Lyse womöglich einen Einfluss auf die Konzentration der extrazellulären Metaboliten hatten. Die gängigen Methoden zur Zelldichtebestimmung erfassen nur Zellen, deren Struktur noch intakt ist. Dies hat eine Verfälschung der totalen Zelldichtebestimmung zur Folge, sofern der Zerfall von Zellen eintritt, was bei einer Fermentation tendenziell zu späteren Zeitpunkten der Fall ist. Es wurde beobachtet, dass in manchen Fällen ein systematischer Fehler bei der Vorhersage der Flüsse mit dem hier nach
Ausführungsformen beschriebenen Verfahren zu beobachten war, sodass die vorhergesagten Flüsse nicht mit den messbaren Flüssen in Übereinstimmung waren sondern vielmehr einen systematischen Fehler aufwiesen. Es wurde beobachtet, dass dieser Fehler mit der LDFI Konzentration im Medium korrelierte, welcher ein Anzeiger für das Vorhandensein von lysierten Zellen im Medium ist. Dieses Enzym wird von einer intakten Zelle nicht in das Medium freigesetzt. Der Nachweis von LDFI im Reaktionsmedium deutet damit auf zerstörte Zellen hin.
Mit Ausnahme der Batch-Fermentation wurde bei vielen Fermentationsansätzen ein ähnlicher, näherungsweise linearer Zusammenhang zwischen der LDFI- Konzentration und der Anzahl lysierter Zellen nachgewiesen. Nach
Ausführungsformen wird also die LDFI Konzentration im Medium als weiterer Messwert verwendet um eine korrigierte Zelldichte zu berechnen.
Nach Ausführungsformen der Erfindung werden die korrigierten Zelldichten als Eingabeparameterwerte beim Training bzw. bei der Anwendung des trainierten MLP verwendet.
Nach Ausführungsformen wird bei der MLP-basierten Vorhersage der
extrazellulären Flüsse zusätzlich zu den Konzentrationen der extrazellulären Metaboliten die LDFI-Konzentration als Eingangsvariable zur Vorhersage von zumindest einigen der extrazellulären Flüsse des Modells verwendet. Nach
Ausführungsformen wird ergänzend oder alternativ dazu der mittels LDFI korrigierte Wert der Zelldichte als Ausgangsvariable verwendet. Entsprechend werden gemäß Ausführungsformen der Erfindung beim Training der MLP für die Berechnung der extrazellulären Flüsse Zelldichten verwendet, die mittels gemessener LDFI
Konzentration korrigiert wurden und/oder es wird eine LDFI Konzentration als weiterer Eingabeparameterwert bzw. als Konzentration eines extrazellulären Metaboliten verwendet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein System zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps. Das System umfasst ein oder mehrere Prozessoren, eine erste Schnittstelle zum Empfang von Messwerten von einem Bioreaktor, der die Zellkultur beinhaltet, und ein volatiles oder nicht-volatiles Speichermedium.
Das Speichermedium beinhaltet ein metabolisches Modell einer Zelle des bestimmten Zelltyps, wobei das metabolische Modell eine Vielzahl von
intrazellulären und extrazellulären Metaboliten sowie eine Vielzahl von
intrazellulären und extrazellulären (408) Flüssen beinhaltet, wobei das metabolische Modell stöchiometrische Gleichungen umfasst, die mindestens eine
stöchiometrische Beziehung zwischen einem der intrazellulären und einem der extrazellulären Metaboliten spezifizieren. Außerdem beinhaltet das Speichermedium eine trainierte Machinelearning-Programmlogik ( MLP) sowie eine Programmlogik , die dazu ausgebildet ist, an jedem von einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung der Zellkultur ein Verfahren zur Vorhersage des metabolischen
Zustands der Zellen durchzuführen. Dieses Verfahren umfasst:
- Empfang mehrerer an diesem Zeitpunkt gemessener Messwerte über die erste Schnittstelle, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der Zellkultur umfassen;
- Eingabe der empfangenen Messwerte als Eingabeparameterwerte in die MLP;
- Vorhersage von extrazellulären Flüssen der extrazellulären Metaboliten an einem Zukunftszeitpunkt durch die MLP unter Verwendung der empfangenen Messwerte, wobei der Zukunftszeitpunkt ein dem Zeitpunkt des Empfangs der Messwerte nachfolgender Zeitpunkt ist, wobei die extrazellulären Flüsse Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in eine Zelle und/oder Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten von einer Zelle in das Medium sind;
- Durchführung einer metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der
intrazellulären Flüsse an dem Zukunftszeitpunkt unter Verwendung der vorhergesagten extrazellulären Flüsse und der stöchiometrischen
Gleichungen des metabolischen Modells.
Das metabolische Modell kann z.B. in Form einer Menge an stöchiometrischer Reaktionsgleichungen, die in MatLab definiert sind, in dem Speichermedium gespeichert sein. Bei dem Speichermedium kann es sich um einen Arbeitsspeicher eines Rechners oder um ein elektromagnetisches oder optisches Speichermedium handeln, z.B. eine Festplatte. Bei dem Speichermedium kann es sich auch um ein verteiltes System mehrerer Hardware-Speichereinheiten handeln, zum Beispiel um einen Cloud-Speicherbereich der von einem Clouddienst oder der IT- Infrastruktur eines Labors angeboten wird. Das System kann zum Beispiel als Standardcomputer realisiert sein, oder als Notebook oder portables Mobilfunkgerät eines Nutzers. Das System kann in ein Laborinformationssystem (LIS) eingebunden oder mit diesem operativ verbunden sein. Bei dem System kann es sich aber auch um einen
Kontrollcomputer für ein oder mehrere Bioreaktoren handeln oder um ein
Kontrollmodul, das an einen einzelnen Bioreaktor reversibel oder irreversibel gekoppelt ist, zum Beispiel integraler Bestandteil des Bioreaktors ist.
Bei der ersten Schnittstelle kann es sich zum Beispiel um eine Netzwerkschnittstelle handeln, die eine drahtlose oder drahtbasierte Verbindung zu ein oder mehreren Sensoren des Bioreaktors herstellt. Ergänzend oder alternativ dazu kann es sich bei der ersten Schnittstelle aber auch um eine Schnittstelle zur manuellen Eingabe der entsprechenden Messwerte handeln. Beispielsweise ist es möglich, dass die
Messwerte dadurch erhoben werden, dass in einem manuellen, semi- automatischen oder voll-automatischen Verfahren dem Bioreaktor an den
bestimmten Zeitpunkten eine Probe entnommen wird, die zu ein oder mehreren weiteren Analysegeräten transportiert wird, wo sodann die Zelldichte und/oder die Konzentration der extrazellulären Metaboliten erfolgt. Die so gewonnenen
Messwerte können nun wiederum automatisch von diesen Analysegeräten über die erste Schnittstelle an das System übertragen werden oder ein Nutzer gibt die Messwerte von Hand über eine als grafische Benutzeroberfläche ausgebildete erste Schnittstelle in das System ein.
Nach Ausführungsformen ist das System eine Kontrolleinheit zur Überwachung und/oder Kontrolle eines Bioreaktors oder mehrerer Bioreaktoren oder ist an eine solche Kontrolleinheit operativ gekoppelt. Vorzugsweise umfasst das System ferner eine Nutzer-Schnittstelle zur Ausgabe des berechneten intrazellulären Flusses an einen Nutzer. Beispielsweise können die vorhergesagten Flüsse tabellarisch dargestellt werden oder es kann eine dynamische Visualisierung der Flüsse mittels eines Bewegtbildes erfolgen, z.B. eines Bewegtbildes auf Basis einer graphischen Repräsentation des metabolischen Modells, welches der Vorhersage der intrazellulären Flüsse zu Grunde liegt.
Nach Ausführungssystemen umfasst das System ferner eine zweite Schnittstelle zum Senden von Steuerbefehlen an den Bioreaktor. Diese Programmlogik ist ausgebildet zum:
- Vergleich des vorhergesagten intrazellulären Flusses mit Referenzwerten oder Referenzwertbereichen für einen akzeptable intrazellulären Fluss des jeweiligen oder der jeweiligen intrazellulären Metaboliten;
- Ausgabe einer Warnung über die Nutzer-Schnittstelle, wenn eine Abweichung des berechneten intrazellulären Flusses mindestens eines der intrazellulären Metaboliten von seinem jeweiligen Referenzwert oder Referenzwertbereich einen Grenzwert überschreitet; und/oder
- Senden eines Kontrollbefehls an den Bioreaktor über die zweite Schnittstelle, wobei der Kontrollbefehl dazu ausgebildet ist, den Zustand des Bioreaktors oder des darin enthaltenen Mediums so ändern, dass die Abweichung reduziert wird.
Bei der Nutzerschnittstelle kann es sich zum Beispiel über eine grafische
Benutzeroberfläche (GUI ) und/oder eine akustische Nutzerschnittstelle handeln. Beispielsweise kann ein Warnton über die akustische Nutzer-Schnittstelle ausgegeben werden oder es kann eine Warnung in Form eines Textes,
vorzugsweise mit einem qualifizierten Flinweis auf den intrazellulären Fluss , für welchen die Abweichung festgestellt wurde, über die GUI auf einem Bildschirm angezeigt werden. Bei dem Bildschirm kann es sich um einen Bildschirm handeln, der an den Bioreaktor gekoppelt ist, oder um den Bildschirm eines Computers, der mit einem oder mehreren Bioreaktoren über ein Netzwerk verbunden ist, zum Beispiel ein Desktop-Rechner, ein Server oder ein mobiles Kommunikationsgerät, zum Beispiel ein Smartphone des Nutzers.
Die zweite Schnittstelle kann zum Beispiel in physikalischer Hinsicht als drahtlose oder drahtbasierte Verbindung zwischen dem System und dem Bioreaktor bzw. Stelleinheiten des Bioreaktors ausgebildet sein. Bei den Stelleinheiten kann es sich beispielsweise um Pumpen, Ventile für verschiedene Nährstoffe, Puffer, pH- regulierende Flüssigkeiten, Spurenelemente, Gase und/oder um Rührer oder Temperaturregler handeln. Ein„Trainings-Zeitpunkt“ ist ein Zeitpunkt während der Erstellung des Trainingsdatensatzes. Demgegenüber bezieht sich der„Zeitpunkt“ gemäß
Anspruchs 1 auf einen späteren Zeitpunkt, wenn die auf dem Trainingsdatensatz trainierte MLP zur Vorhersage des metabolischen Zustands eines aktuell überwachten und/oder kontrollierten Bioreaktors eingesetzt wird.
Unter einem„Metabolit“ im engeren Sinne wird ein Zwischenprodukt (Intermediat) in einem biochemischen Stoffwechselweg verstanden. Ein Metabolit im Sinne der vorliegenden Erfindung soll jedoch weiter gefasst sein als jegliche Substanz, die in Form eines Edukts, Produkts oder Intermediats an einer biochemischen Reaktion einer Zelle beteiligt ist. Insbesondere kann es sich bei einem Metaboliten um eine Aminosäure, um einen Zucker, um Fette, Peptide, Antikörper, Proteine, Bestandteile des Zitratzyklus, Bestandteile der Glykolyse, Bestandteile von Proteinaufbau- oder Abbaupathways und ähnlicher Stoffe handeln.
Unter einem„extrazellulären Metabolit“ wird hier ein Metabolit verstanden, von welchem bekannt ist oder von welchem gemäß eines metabolischen Modells des untersuchten Zelltyps angenommen wird, dass er im Medium einer Zellkultur vorkommt, z.B. weil er von Zellen des bestimmten Zelltyps in das Medium der Zellkultur ausgeschieden wird (z.B. Laktat) oder weil er als Komponente des Mediums oder einer Nährlösung der Zellkultur zugegeben wird (z.B. Glukose).
Unter einem„intrazellulären Metabolit“ wird hier ein Metabolit verstanden, von welchem bekannt ist oder von welchem gemäß eines metabolischen Modells des untersuchten Zelltyps angenommen wird, dass er innerhalb von Zellen des bestimmten Zelltyps vorkommt, z.B. weil er aus dem Medium der Zellkultur aufgenommen wird oder von den Zellen hergestellt wird.
Ein„Fluss“ ist eine Menge eines Stoffes, die sich pro Zeit in einem bestimmten Volumen aufgrund eines bestimmten Transport-oder Reaktionsprozesses ändert.
Ein Fluss wird daher auch als„Reaktionsrate“ oder„Transportrate“ bezeichnet. Falls in dem bestimmten Volumen mehrere Prozesse gleichzeitig ablaufen, ist es möglich, dass sich aufgrund der Gegenläufigkeit einiger Prozesse netto an einer Stoffkonzentration nichts ändert. , z.B. durch Stoffumsetzung, Aufnahme oder Abgabe. Gemäß Ausführungsformen ist das Volumen, auf welches sich eine Flussangabe bezieht, bei intrazellulären wie auch extrazellulären Metaboliten das Volumen einer Zelle.
Dadurch, dass die durch den bestimmten Prozess bewirkte Stoffmengenänderung auf die Zelle bzw. das Zellvolumen bezogen wird, gibt ein Fluss implizit auch eine durch den bestimmten Prozess bewirkte Konzentrationsänderung dieses Stoffes pro Zeit in diesem Volumen, der durch diesen bestimmten Reaktions- oder
Transportprozess bewirkt wird, an. Da sich bei gegebenem Volumen aus dem Fluss eines Stoffes implizit auch die Konzentrationsänderung dieses Stoffes in dem Volumen bedingt durch den bestimmten Prozess ergibt und umgekehrt, soll das Konzept eines Flusses hier gleichermaßen eine pro Zeit in einem Volumen erfolgte Änderungen einer Stoffmenge als auch eine pro Zeit erfolgte Konzentrationsmenge umfassen.
Vorzugsweise geht das nach Ausführungsformen der Erfindung verwendete metabolische Modell davon aus, dass die Menge bzw. Konzentration der
intrazellulären Metaboliten näherungsweise konstant bleibt. Dies bedeutet jedoch nicht, dass die intrazellulären Flüsse konstant bleiben. Vielmehr kann eine Zelle, in deren Zytosol die Konzentration eines intrazellulären Metaboliten rasch ansteigt, dies z.B. dadurch ausgleichen, dass die Reaktionsrate von einer oder von mehreren chemische Reaktionen, die diesen Metaboliten verstoffwechseln, erhöht wird.
Unter einem„extrazellulären Fluss“ wird hier die Rate verstanden, mit der ein extrazellulärer Metabolit über einen bestimmten Transportprozess von der Zelle aufgenommen bzw. abgegeben wird. Genauer gesagt handelt es sich um die Stoffmenge des Metaboliten, der durch diesen bestimmten Transportprozess pro Zelle und pro Zeit in die Zelle aufgenommen wird, oder von der Zelle in das diese umgebende Medium abgegeben wird. Gemäß Ausführungsformen der Erfindung wird der extrazelluläre Fluss v einer Komponente zur Zeit t ermittelt anhand der gemessenen Änderung der Konzentration des entsprechenden Metaboliten im Reaktormedium, die mit der Lebendzelldichte normiert wird.
Nach Ausführungsformen wird z.B. die Konzentrationsänderung des extrazellulären Metaboliten im Kulturmedium über ein Zeitintervall hinweg gemessen. Daraus kann (mithilfe des Medienvolumens im Reaktor) die absolute Metaboliten- mengenänderung im Medium berechnet werden. Die Lebendzellzahl im Medium kann gemessen werden. Durch Normierung der absoluten Änderung der Menge des extrazellulären Metaboliten auf die Zellzahl kann der extrazelluläre Fluss als spezifische (Biomasse-bezogene) Größe angegeben werden. Da das
durchschnittliche Volumen einer einzelnen Zelle des kultivierten Zelltyps in der Regel aus der Literatur bekannt ist oder gemessen werden kann, wird nach
Ausführungsformen der Erfindung eine Umrechnung der gemessenen
Konzentrationsänderung auf das durchschnittliche Zellvolumen durchgeführt.
Beispielsweise kann das metabolische Modell des Zellmetabolismus, das zur metabolischen Fluxanalyse (auch„Flussanalyse“ oder„Stoffflussanalyse“) verwendet wird, extrazelluläre stöchiometrische Reaktionsgleichungen beinhalten welchen jeweils ein extrazellulärer Fluss zugeordnet ist. Extrazelluläre Flüsse beschreiben also insbesondere Aufnahmeraten extrazellulärer Metaboliten in die Zellen einer Zellkultur, sodass diese dann als intrazelluläre Metaboliten fungieren, und Abgaberaten extrazellulärer Metaboliten der Zellen der Zellkultur an das diese umgebende Medium, sodass diese dort dann als extrazelluläre Metaboliten
Vorkommen.
Über diese extrazellulären Flüsse, die Transportflüsse in die bzw. aus der Zelle repräsentieren, sind die rein intrazellulären Flüsse mit den Konzentrationen und Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metaboliten in dem metabolischen Modell verbunden und erlauben es, anhand der in dem Modell spezifizierten
Stöchiometrien, Plausibilitätskriterien und den empirisch ermittelten bzw.
vorhergesagten Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metaboliten im Medium deskriptive Aussagen über aktuelle intrazelluläre Flüsse der Zelle und/oder Vorhersagen über künftige intrazelluläre Flüsse der Zelle anhand der extrazellulären Flüsse zu treffen.
Die intrazellulären und extrazellulären Flüsse sind somit in dem metabolischen Modell über ein oder mehrere intrazelluläre Metaboliten aneinander gekoppelt, da manche Substanzen sowohl als intrazelluläre Metaboliten Vorkommen, deren Bildungsrate aus bzw. Verstoffwechslungsrate in einen oder mehrere intrazelluläre Metaboliten beschrieben werden, und deren Importrate in die Zelle bzw. Abgaberate aus der Zelle durch extrazelluläre Flüsse des Modells beschrieben werden. Eine Konzentrationsänderung eines extrazellulären Metaboliten und damit ein extrazellulärer Fluss kann in manchen Bioreaktortypen zudem bewirkt werden durch eine externe Zugabe bzw. Zufütterung dieses Metaboliten in das Zellkulturmedium. Ein extrazellulärer Fluss kann näherungsweise z.B. dadurch berechnet werden, dass zunächst die absolute Differenz der an zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten gemessenen Metabolitkonzentration bestimmt wird und diese dann auf die gemessene Zelldichte umgerechnet wird. Je höher die Zelldichte, desto geringer der Fluss pro Zelle, da sich der absolut gemessene Stoffkonzentrationsänderung auf eine größere Anzahl Zellen verteilt. Der Aufnahmefluss eines extrazellulären
Metaboliten zu dem Zukunftszeitpunkt kann also errechnet werden als die in dem Zeitintervall zwischen den beiden Zeitpunkten gemessene Metabolitkonzentrations- differenz geteilt durch die Dauer des Zeitintervalls, wobei das Ergebnis sodann geteilt wird durch die gemessene Zelldichte.
Unter einem„intrazellulären Fluss“ wird hier die Rate (eine auf ein Zeitintervall bezogene Größe) verstanden, mit der eine Reaktion innerhalb einer Zelle abläuft, wobei die Reaktion bestehen kann aus: einem Transport zwischen intrazellulären Kompartimenten (z.B. Transport aus dem Zytosol in die Mitochondrien und umgekehrt) oder einer Konversion eines oder mehrerer intrazellulärer Metaboliten (Edukte) in ein oder mehrere andere Metaboliten (Produkte) in der Zelle. Bei einem intrazellulären Fluss sind alle Edukte und Produkte intrazelluläre Metaboliten.
Intrazelluläre Flüsse werden in dem metabolischen Modell für stöchiometrische Gleichungen formuliert, die eine reversible oder irreversible Reaktion der oben genannten Kategorien (intrazellulärer Transport zwischen Zellkompartimenten, Stoffumwandlung) spezifizieren.
"Nichtmessbare Flüsse“ sind Flüsse, welche nicht ohne Weiteres aus den
Fermentationsdaten ermittelt werden können. In der Regel sind intrazelluläre Flüsse aufgrund der schwierigen Beobachtbarkeit intrazellulärer Metaboliten nichtmessbar.
Nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung basiert die MFA zur
Bestimmung der intrazellulären Flüsse auf Basis bereitgestellter extrazellulärer Flüsse auf der Annahme, dass sich die Konzentration eines intrazellulären
Metaboliten nicht ändern. Konzentrationen intrazellulärer Metaboliten sind
messtechnisch nur sehr schwer oder gar nicht erfassbar. Ausführungsformen der Erfindung beruhen bei der MFA auf der Annahme, dass die Summe der Eingangs- und Ausgangsflüsse an einem intrazellulären Metaboliten (dessen Konzentration unbekannt ist) identisch ist und sich deshalb seine Konzentration nicht ändert. Dies stimmt je nach Betriebsweise des Reaktors nicht exakt, aber zumindest
näherungsweise im Hinblick auf die hier beschriebenen Zeitintervalle hinreichend gut, da der Zellmetabolismus recht schnell wieder zu seinem chemischen
Gleichgewicht zurückkehrt.
Gemäß Ausführungsformen umfasst das metabolische Modell, welches bei der MFA verwendet wird, mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 stöchiometrische Gleichungen. Das Modell ist vorzugsweise dazu ausgebildet, metabolische
Vorgänge in der Zelle vollständig oder zumindest näherungsweise vollständig zu beschreiben.
Die Verwendung eines metabolischen Modells, welches den Zellmetabolismus möglichst umfassend beschreibt kann vorteilhaft sein, da für die Auswahl bestimmter Zellklone ein möglichst vollständiges Bild der einzelnen metabolischen Aktivitäten und Besonderheiten eines jeden untersuchten Zellklons wichtig ist. Eine reine Plausibilitätsprüfung der von der MLP vorhergesagten extrazellulären Flüsse mittels einzelner stöchiometrischer Gleichungen würde in der Regel nicht genügend Daten liefern, um darauf aufbauend bestimmte Zellklone aufgrund vorteilhafter metabolischer Eigenschaften gezielt auswählen zu können.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt kann die Verwendung vom metabolischen Modellen mit einer großen Zahl an stöchiometrischen Gleichungen bei der MFA auch dazu verwendet werden, Zellkulturen zu überwachen und im Falle einer Abweichung eines oder mehrerer Metabolit-Flüsse von einem Sollwertbereich spezifische Änderungen an der Menge und/oder Zusammensetzung der
zugeführten Nährstofflösung oder sonstiger Steuerparameter (Temperatur, pH, Partialdruck Sauerstoff, Partialdruck C02, Geschwindigkeit Rührer etc)
automatisiert und/oder manuell vorzunehmen.
Unter einem„metabolischen Modell“ wird hier ein deskriptives Modell des momentanen Stoffwechselzustands von Zellen eines bestimmten Zelltyps verstanden. Das metabolische Modell ist dabei vorzugsweise gegenüber den realen in der Zelle ablaufenden Reaktionen komplexitätsreduziert und beschränkt sich auf diejenigen Teile des Zellmetabolismus, die für die jeweilige Anwendung von besonderem Interesse sind. Vorzugsweise beinhaltet das Modell mehrere
extrazelluläre und intrazelluläre Metaboliten, Reaktions- und Transportgleichungen mit stöchiometrischen Faktoren sowie extrazelluläre und intrazelluläre Flüsse. Der Metabolische Zustand einer Zelle kann zumindest in Teilen durch die Angabe der Flöhe der einzelnen intrazellulären Flüsse zu einem bestimmten Zeitpunkt charakterisiert werden. Vorzugsweise ergibt sich die zeitliche Änderung der
Metabolitmengen in der Zelle aus der Bilanzierung eingehender und ausgehender Stoffströme, wie diese in den extrazellulären und intrazellulären
Reaktionsgleichungen des Modells spezifiziert sind. Das Modell ist ein MFA Modell, das zur Durchführung einer metabolischen Fluxanalyse geeignet ist und auf der sog. Steady-State-Annahme basiert, wonach die Stoffmenge intrazellulärer
Metaboliten konstant bleibt, was bedeutet, dass die Summe der eingehenden Flüsse für jeden intrazellulären Metaboliten der Summe der ausgehenden
entspricht.
Bei den Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten, die gemessen und als
Eingabeparameterwerte einer trainierten MLP verwendet werden, handelt es sich nach Ausführungsformen der Erfindung um Metabolitkonzentrationen im engeren Sinne. Unter einer Metabolitkonzentration im engeren Sinne wird hier eine
Gehaltsangabe, die auf ein Volumen bezogen ist, verstanden. Die Konzentration gibt also an, wie viel von einem Metaboliten in einem Vergleichsvolumen (z.B.
Zellkulturmedium) vorhanden ist. Die Metabolitkonzentration kann z.B. als
Massenkonzentration in der Einheit g/l oder als Stoffmengen konzentration in der Maßeinheit mol/l angegeben sein.
Gemäß anderer Ausführungsformen handelt es sich bei den Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten, die gemessen und als Eingabeparameterwerte einer trainierten MLP verwendet werden, um Metabolitkonzentrationen im weiteren Sinne. Unter einer Metabolitkonzentration im weiteren Sinne werden hier Messwerte und davon abgeleitete Werte verstanden, von welchen bekannt ist, dass sie mit einer Metabolitkonzentration im engeren Sinne des jeweiligen Metaboliten in linearer Weise oder zumindest in näherungsweise (mind. 90% im fraglichen
Konzentrationsbereich) in linearer Weise korrelieren. Beispielsweise kann ein extrazellulärer Fluss eines extrazellulären Metaboliten als Metabolitkonzentration im weiteren Sinne verstanden werden. Der gemessene extrazelluläre Fluss bezeichnet die Änderung der Konzentration des Metaboliten im Medium im Zeitraum zwischen einem Zeitpunkt in der Vergangenheit, z.B. der letzten Messung der
Metabolitkonzentration, und einem aktuellen Zeitpunkt, an welchem aktuell die Messwerte erhoben und als Eingabe der MLP verwendet werden. Der im
Wesentliche lineare Zusammenhang zwischen gemessenem Fluss und
extrazellulärer Konzentration ergibt sich daraus, dass eine Erhöhung des
extrazellulären Flusses eines Metaboliten um einen bestimmten Betrag eine entsprechende Änderung der Konzentration des Metaboliten im extrazellulären Medium bewirkt. Außerdem können die gemessenen Metabolitkonzentrationen gemäß Ausführungsformen der Erfindung noch auf verschiedene Weise durch Verrechnung mit Korrektur- und Normierungsfaktoren modifiziert werden, sodass diese modifizierten Werte letztlich ebenfalls Metabolitkonzentrationen im weiteren Sinne darstellen, also mit den ursprünglich gemessenen Werten in linearer Weise korrelieren, aber nicht identisch zu diesen sind. Da die tatsächlich gemessene Metabolitkonzentration und die Metabolitkonzentration im weiteren Sinne linear miteinander korrelieren bzw. die Metabolitkonzentration aus der gemessenen Metabolitkonzentration im engeren Sinne abgeleitet sein kann, können beide Arten von Metabolitkonzentrationsangaben letztlich gleichermaßen als Eingabe für eine MLP verwendet werden.
Unter einem„deskriptiven Modell“ wird ein Modell verstanden, das den aktuellen statischen und dynamischen metabolischen Zustand einer Zelle beschreibt.
Unter einem„prädiktiven Modell“ wird ein Modell verstanden, welches die
Vorhersagen über einen künftigen statischen und dynamischen metabolischen Zustand einer Zelle ermöglicht. Nach Ausführungsformen handelt es sich bei dem metabolischen Modell, das für die Fluxanalyse verwendet wird, um ein deskriptives metabolisches Modell.
Ein„metabolisches Hybridmodell“ ist eine Kombination aus einem
mechanistischen Modell, das reaktionskinetisches Wissen repräsentiert, und einem empirischem Modell, das Messwerte eines Bioreaktors mit metabolischen
Zuständen einer Zelle in Beziehung setzt. Eine„metabolische Stoffflussanalyse“ (metabolic flux analysis, MFA) ist eine rechnerische Methode, mit Hilfe derer die intrazellulären Flüsse anhand der extrazellulären Flüsse abgeschätzt werden können. Der extrazelluläre Stofffluss bezeichnet hierbei die Stoffmenge, die pro Zeit von einer Zelle aufgenommen bzw. abgegeben wird. Der intrazelluläre Stofffluss beschreibt die Reaktionsrate, mit der ein intrazellulärer Metabolit umgesetzt oder gebildet wird. MFA umfasst
verschiedene Ansätze, die die Geschwindigkeit metabolischer Reaktionen innerhalb einer biologischen Einheit bestimmen sollen. Der Metabolismus ist ein dynamischer Prozess und kann als eine Art„zellulärer Phänotyp“ angesehen werden, der mittels MFA beschrieben wird.
Ein„Batch Bioreaktor“ ist ein Bioreaktor, der im Batch-Verfahren („Satzverfahren“) betrieben wird oder zum Betrieb im Batch-Verfahren ausgebildet ist. Das Batch- Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass sämtliche Substrate (vor allem Zucker und Aminosäuren) vor der in Inokulation im Bioreaktor vorgelegt werden. Gase und PH-Korrekturmittel werden hingegen auch während des Prozesses in das System eingebracht. Näherungsweise kann das Satzverfahren jedoch als geschlossenes System mit konstantem Reaktionsvolumen betrachtet werden. Aufgrund des allmählichen Verbrauchs der Substrate durch die Zellen folgt nach einer
anfänglichen unlimitierten Wachstumsphase (sogenannte exponentielle Phase) eine Phase der Stagnation (stationäre Phase), bei der sich Wachstum und Absterben der Zellen im Gleichgewicht befinden. Anschließend folgt die Absterbephase mit Abnahme der Zelldichte als Folge von starkem Mangel an Nährstoffen. Unter den üblichen Betriebsweisen eines Bioreaktors ist das Batch-Verfahren insgesamt am wenigsten aufwendig und birgt das geringste Kontaminationsrisiko. Allerdings wird im Satzverfahren in der Regel keine optimale Produktausbeute erreicht, die
Prozessdauer ist durch den Verbrauch der Substrate limitiert.
Ein„Fed-Batch Bioreaktor“ ist ein Bioreaktor, der im Fed-Batch-Verfahren
(„Zulaufverfahren“) betrieben wird oder zum Betrieb im Fed-Batch-Verfahren ausgebildet ist. Im Fed-Batch-Verfahren wird während des Prozesses zusätzlich Nährlösung zudosiert (oft erst nach einer anfänglichen Batch-Phase). Die zu
Fütterung kann hierbei kontinuierlich oder in Form von einem oder mehreren hochkonzentrierten Boli (d.h., pulsartig) erfolgen. Dadurch ist im Vergleich zum Satzverfahren eine Verlängerung der Prozesszeit möglich, da verbrauchte Substrate nachdosiert werden können. Zudem kann eine bessere Prozesskontrolle erfolgen. Beispielsweise lassen sich durch fortwährend niedriger gehaltene Edukt- Konzentrationen Inhibitionsphänomene und die Bildung toxischer Nebenprodukte eindämmen. Insgesamt können durch das Fed-Batch-Verfahren wesentlich höhere zelldichten und Produkt ausbeuten als im Batch-Verfahren erzielt werden.
Ein„Chemostat“ („kontinuierlicher Reaktor“) ist ein Bioreaktor, dem ein konstanter Strom an Nährlösung zugeführt wird und dem in gleichem Maße zell- und
produkthaltiges Reaktionsmedium entzogen wird. Somit verändert sich das
Reaktionsvolumen während der Fermentation nicht. Bei geeigneter Wahl der Volumenströme stellt sich im Reaktor ein Fließgleichgewicht ein, bei dem die Zelldichte sowie die Nährstoffkonzentrationen konstant bleiben.
Ein„Perfusionsbioreaktor“ oder„Perfusionsreaktor“ ist ein Bioreaktor, bei dem ein kontinuierlicher Strom an Nährlösung zugegeben wird und dem ein kontinuierlicher Strom an (meist zellfreiem) Reaktionsmedium entzogen wird. Durch gezieltes „bleeding“ kann auch kontinuierlich ein Strom von zellhaltigem Reaktionsmedium abgeführt werden. Die Wahl der Volumenströme wird an einen oder mehrere Prozessführungsparameter gekoppelt und so eingestellt, dass das
Reaktionsvolumen im Reaktor konstant bleibt. Zelldichte und
Nährstoffkonzentrationen können je nach Prozessführung konstant (bezogen auf die Zelldichte) oder auch variabel sein (ähnlich dem Fed-Batch Betrieb).
Ein„Split-Batch Bioreaktor“ ist ein Bioreaktor des Batch oder Fed-Batch-Typs, der so betrieben wird, dass dem Reaktor ein oder mehrmals ein erheblicher Teil seines Mediums, z.B. über 10% oder über 30% zum Zweck der Ernte der darin enthaltenen Zellen, entnommen wurde.
Die„PMI“ (partial mutual Information“,„partielle Transinformation“) ist ein
Datenwert, welcher nichtlineare direkte Abhängigkeiten zweier Parameter quantifiziert. Im Kontext von manchen Machine-Learning Ansätzen, z.B. neuronaler Netze, ist die PMI ein Maß für die Abhängigkeit zwischen einer Zufalls- Eingangsvariablen X und einer Zufalls-Ausgangsvariablen Y unter Berücksichtigung bereits ausgewählter Eingänge. Verschiedene Ansätze zur Berechnung des PMI zweier Variablen sind bekannt, z.B. Sharma A (2000):„Seasonal to interannual rainfall probabilistic forecasts for improved water supply management: Part 1 - A strategy for System predictor Identification”, Journal of Hydrology Vol. 239, Issues 1 - 4, 232-239.
Ein“PMI-Kriterium” bezeichnet also ein Merkmal oder eine Eigenschaft, das oder die im Hinblick auf die PMI festgelegt wurde, um eine Entscheidung zu treffen. Beispielsweise kann ein PMI-Kriterium ein Grenzwert sein, dessen Über- oder Unterschreitung Einfluss auf den Verlauf eines Verfahrens hat.
Einige Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in größerer Ausführlichkeit im Appendix erläutert, der dieser Anmeldung beiliegt und dessen Offenbarungsgehalt Bestandteil dieser Anmeldung ist. Um Konsistenz zwischen der Beschreibung und dem Appendix zu gewährleisten wurden die Bedeutung der Variablen, wie diese im Variablenverzeichnist des Appendix spezifiziert ist, beibehalten. Im Hinblick auf die Bedeutung der Variablen wird insofern auf das Variablenverzeichnis des Appendix verwiesen. Beispiele und Ausführungsformen sowie weitere Erläuterungen, die im Appendix beschrieben sind, sind frei mit den im Anmeldungstext beschriebenen Ausführungsformen, Beispielen und Merkmalen kombinierbar sofern sie sich nicht gegenseitig ausschließen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Im folgenden werden Ausführungsformen der Erfindung in exemplarischer Weise stärker im Detail beschrieben, wobei Bezug genommen wird auf die Figuren, die jeweils Ausführungsformen der Erfindung bzw. einzelne Aspekte dieser
Ausführungsformen darstellen.
Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Vorhersage des
metabolischen Zustands einer Zelle;
Figur 2 zeigt beispielhaft den Prozess der Informationsgewinnung in mehreren
Stadien unter Heranziehung verschiedener Geräte und Datenquellen;
Figur 3 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems zur Vorhersage des
metabolischen Zustands einer Zelle, welches zur Überwachung und oder Kontrolle von ein oder mehreren Bioreaktoren verwendet werden kann; Figur 4 zeigt ein metabolisches Modell einer Zelle mit mehreren intrazellulären und extrazellulären Flüssen intrazellulärer wie extrazellulärer Metaboliten;
Figur 5 zeigt die Berechnung intrazellulärer Flüsse an mehreren
aufeinanderfolgenden Zeitpunkten während des Betriebs eines
Bioreaktors;
Figur 6 zeigt Flüsse verschiedener Metaboliten gemäß des in Figur 4
dargestellten metabolischen Modells;
Figur 7 zeigt mehrere Metabolitflüsse die den erfolgreichen Einsatz des
Verfahrens zur Generierung biologischer Erkenntnisse illustrieren;
Figur 8 zeigt mehrere Metabolitflüsse die den erfolgreichen Einsatz des
Verfahrens zur Generierung biologischer Erkenntnisse illustrieren;
Figur 9 zeigt Plots mit Laktat-Flüssen und Glutamin-Konzentrationen;
Figur 10 zeigt Zeitverläufe intrazellulärer Flüsse; Figur 11 zeigt mehrere intrazelluläre und extrazelluläre Flüsse an verschiedenen
Zeitpunkten während der Kultivierung einer Zellkultur;
Figur 12 zeigt den stark korrelierenden Verlauf intrazellulärer Flüsse, die zum einen mittels deskriptiver MFA für den aktuellen Zeitpunkt errechnet wurden und zum anderen mittels einer Kombination aus MLP und MFA für einen in der Zukunft liegenden Zeitpunkt vorhergesagt wurden;
Figur 13 zeigt Eingabeparameterwerte und Ausgabeparameterwerte eines NN;
Figur 14 zeigt ein Histogramm der erhaltenen RMSE für intrazelluläre Flüsse in
12 Fed-Batch Fermentationsläufen;
Figur 15 zeigt ein Histogramm der erhaltenen RMSE für extrazelluläre Flüsse in
12 Fed-Batch Fermentationsläufen;
Figur 16 zeigt 12 Plots mit jeweils einem vorhergesagten extrazellulären
Metabolitfluss und zwei für identische Zellklone in zwei unterschiedlichen Bioreaktoren (fed-batch und split batch) gemessenen extrazellulären Metabolitflüssen;
Figur 17 zeigt 11 Plots mit je zwei Kurven, die alle für einen fed batch bioreaktor mittels zweier unterschiedlicher Rechenverfahren erhalten wurden; Figur 18 zeigt 11 Plots mit je zwei Kurven berechneter extrazellulärer Flüsse eines Zellklons ZK1 ;
Figur 19 zeigt 11 Plots mit je zwei Kurven berechneter extrazellulärer Flüsse eines Zellklons ZK2;
Figur 20 zeigt 11 Plots mit je zwei Kurven berechneter intrazellulärer Flüsse
eines Zellklons ZK1 ; und
Figur 21 zeigt 11 Plots mit je zwei Kurven berechneter intrazellulärer Flüsse eines Zellklons ZK1.
Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Vorhersage des
metabolischen Zustands von einer Zellkulturen von CFIO Zellen gemäß einer Ausführungsform, wobei das Verfahren gleichermaßen auch für andere Zelltypen geeignet ist.
Schritt 102: Modellerzeuauna
Die Vorgänge in einem Bioreaktor lassen sich mathematisch beschreiben. Zunächst soll die Abbildung der zeitlichen Änderungen relevanter Stoffkonzentrationen oder - mengen im Reaktionsmedium betrachtet werden (z.B. Verläufe von
Substratmengen, Produktmengen, Zelldichten). Die Formulierung beruht hierbei auf Massenbilanzen und setzt sich zusammen aus einem Term, der die Reaktion des Stoffes beschreibt und einem Konvektionsterm, der eventuell vorhandene
Stoffströme in den und aus dem Reaktor umfasst. Es gilt allgemein (vgl. [51], Abschnitt 4.2 im Appendix):
beziehungsweise in Formeln: wobei 771 die Stoffmenge im Reaktionsmedium bezeichnet, 1 die Prozesszeit, V U bzw. va den Volumenstrom des Zu- bzw. Ablaufs, bzw. die Konzentrationen des entsprechenden Stoffs im Zu- bzw. Ablauf und Q die Stoffmenge, die pro Zeit und Volumen umgesetzt wird. Im Falle, dass Stoffmengen extrazellulärer
Metaboliten betrachtet werden, umfasst der Reaktionsterm in erster Linie die Aufnahme bzw. Abgabe des Stoffes durch die Zellen. Soll die Zelldichte im
Fermenter beschrieben werden, beinhaltet er die Bildung und das Absterben der Zellen.
Nach Ausführungsformen beruht das metabolische Modell auf der Annahme gemäß der obigen Gleichung, dass der zeitliche Verlauf der Stoffmenge differenzierbar ist. Dies ist gerechtfertigt, sofern alle ein- und ausgehenden Ströme kontinuierlich sind. Im Falle von Bolus-Zufütterungen oder Probenahmen während der Fermentation erhält man Verläufe, die stückweise stetig sind. Die obige Gleichung gilt dann für die Bereiche zwischen den Unstetigkeitsstellen.
Auf dieser Differentialgleichung können zahlreiche mathematische Modelle zur Prozessbeschreibung, -kontrolle und -Optimierung spezifiziert werden. Diese spielen eine immer größer werdende Rolle aufgrund des wachsenden Bestrebens, Bioprozesse besser zu verstehen und sie unter Einsparung teurer und
zeitaufwändiger Laborexperimente in silico zu verbessern. Modelle, die nur auf solchen Stoffbilanzen beruhen und keine intrazellulären Vorgänge beschreiben, bezeichnet man als Black-Box-Modelle. Sie können Abhängigkeiten zwischen den betrachteten Verläufen nicht mechanistisch erklären. Hierzu wäre es nötig, den Stoffwechsel als Bindeglied zwischen den verschiedenen extrazellulären Stoffen zu modellieren.
Letztlich soll das metabolische Modell eine Durchführung einer metabolischen Stoffflussanalyse ermöglichen, sodass mit Hilfe des Modells von den extrazellulären Flüssen auf die intrazellulären Flüsse geschlossen werden kann. Während zur Zelldichtebestimmung und zur Messung extrazellulärer Stoffkonzentrationen in der Regel einfach durchführbare Methoden etabliert sind, ist die Beobachtung
intrazellulärer Reaktionsraten wesentlich aufwändiger. Um entsprechende
Experimente zu umgehen, wurde die metabolische Stoffflussanalyse (metabolic flux analysis, MFA) entwickelt - eine rechnerische Methode, mit Hilfe derer die intrazellulären Flüsse anhand der extrazellulären abgeschätzt werden können. Der extrazelluläre Stofffluss bezeichnet hierbei die Stoffmenge, die pro Zeit von einer Zelle aufgenommen bzw. abgegeben wird. Der intrazelluläre Stofffluss ist die Stoffmenge, die bei einer intrazellulären Reaktion pro Zeit und Zelle umgesetzt wird.
Um die metabolische Stoffflussanalyse durchführen zu können, wird also zunächst ein (vorzugsweise bzw. in der Regel vereinfachtes) biochemisches,
stöchiometrisches Stoffwechselnetzwerk des betrachteten Organismus zu erstellt, welches die wichtigsten intra- und extrazellulären Reaktionen umfasst. Als extrazelluläre Reaktionen werden - analog zu den Flüssen - diejenigen bezeichnet, bei denen Metaboliten von der Zelle aufgenommen oder abgegeben werden.
Es sei angenommen, das Netzwerk bestünde aus Reaktionen, wovon km messbar und damit bekannt seien (dabei handelt es sich i.d.R. um die extrazellulären
Reaktionen), und aus l intrazellulären Metaboliten. Die Reaktionen lassen sich dann in einer stöchiometrischen Matrix A E festhalten, in welcher die
stöchiometrischen Koeffizienten (negativ für Edukte, positiv für Produkte der einzelnen Reaktionen) eingetragen werden, wobei die Zeilen den verschiedenen Metaboliten und die Spalten den Reaktionen entsprechen. Die extrazellulären Metaboliten werden hierbei weggelassen. Ein konkretes Beispiel findet sich in Abschnitt 2 im Appendix.
Der Stofffluss der /-ten Reaktion sei mit bezeichnet. Weiterhin sei die
Stoffmenge des ί-ten intrazellulären Metaboliten in einer einzelnen Zelle. Fasst man die Flüsse und Metabolitmengen zu Vektoren v bzw. m zusammen, gilt:
Die Gleichung besagt, dass sich die zeitliche Änderung der Metabolitmengen in der Zelle aus der Bilanzierung eingehender und ausgehender Stoffströme ergibt.
Die MFA basiert nun auf der sog. Steady-State-Annahme, dass die Stoffmenge intrazellulärer Metaboliten konstant bleibt, was bedeutet, dass die Summe der eingehenden Flüsse für jeden intrazellulären Metaboliten der Summe der
ausgehenden entspricht. Damit vereinfacht sich Gleichung (2.2) zu
Unterteilt man den Vektor v in den Teilvektor der bekannten (messbaren)
und den Teilvektor der unbekannten Flüsse und die Matrix A
entsprechend in die Teilmatrizen und so dass gilt wird Gleichung (2.3) zu
Die Bestimmung der unbekannten Flüsse mittels MFA kann somit durch die Lösung eines linearen Gleichungssystems erfolgen.
Als nächster Schritt wird das Gleichungssystem klassifiziert. Die naheliegende Formulierung für die Lösung des Gleichungssystems
ist meist nicht anwendbar, da die Matrix Au in der Regel nicht invertierbar ist. In solchen Fällen kann der Lösungsraum unendlich groß sein oder
Widersprüchlichkeiten können auftreten, so dass keine Lösung existiert. Es wurden folgende Begriffe von van der Heijden et al. (1994) eingeführt, welche das
Gleichungssystem bzw. die Stoffflüsse nach Kriterien der Lösbarkeit und Konsistenz klassifizieren [17, 39, 40], und welche gemäß Ausführungsformen der Erfindung ebenfalls für die Erstellung des Modells herangezogen wruden:
Bestimmtheit: Das System (2.4) ist unterbestimmt, falls gilt. In
diesem Fall können nicht alle unbekannten Flüsse eindeutig berechnet werden, da das metabolische Netzwerk zu wenig Restriktionen beinhaltet. Ist so hat das System höchstens eine Lösung und wird als
bestimmt bezeichnet.
Redundanz: Ist so ist das System redundant. Dies bedeutet, dass
linear abhängige Zeilen in A vorliegen. Aufgrund von Messfehlern bei der
Bestimmung von oder Ungenauigkeiten im metabolischen Netzwerkmodell führt
dies in der Regel zu einem inkonsistenten System, für welches keine Lösung existiert (es gilt dann wobei letzterer Term die erweiterte Koeffizientenmatrix darstellt). Falls ist das System nicht
redundant und damit stets konsistent.
Kalkulierbarkeit: Ein Fluss aus vu heißt kalkulierbar, falls er anhand von
Gleichung (2.4) eindeutig berechnet werden kann, ansonsten nicht kalkulierbar. Hierbei wird von einem konsistenten System ausgegangen. Falls das System unterbestimmt ist, gibt es mindestens einen Fluss, der nicht kalkulierbar ist.
Balancierbarkeit: Ein Fluss aus heißt balancierbar, falls sein Wert einen Einfluss auf die Konsistenz des Systems hat, ansonsten nicht balancierbar.
Balancierbare Flüsse treten nur in redundanten Systemen auf.
Wie bereits erwähnt, sind MFA-Systeme oft unterbestimmt und/oder redundant (wobei ein System zugleich unterbestimmt und redundant sein kann). Es lässt sich dann eine Lösung mittels der Moore-Penrose-Pseudoinversen A*, welche für alle Au definiert ist, formulieren:
Im Falle der Unterbestimmtheit liefert dieser Ausdruck eine der unendlich vielen Lösungen für das Gleichungssystem, bei Inkonsistenz ergibt sich eine Least- Squares-Lösung.
Im Folgenden sollen Verfahren vorgestellt werden, mit denen überprüft werden kann, welche der unbekannten Flüsse im Falle der Unterbestimmtheit dennoch kalkulierbar sind, und welche der gemessenen Flüsse bei Redundanz balancierbar sind. Identifikation kalkulierbarer Flüsse
Es wird die von Klamt et al. publizierte Verfahrensweise zur Identifikation kalkulierbarer Flüsse vorgestellt [17]. Sei eine Matrix, deren Spalten eine Basis des Kerns von bilden. Es gilt dann:
Jeder Vektor lässt sich als Linearkombination der Basisvektoren darstellen. Es gibt also ein a so dass gilt
Gleichung (2.4) lässt sich erweitern zu:
wobei a beliebig ist. Die linksseitige Anwendung der
Pseudoinversen ergibt dann:
Durch Variation des Vektors a erhält man den Raum der Lösungen des
Gleichungssystems (2.4). t besitzt genau dann einen Rang größer 0, falls das System unterbestimmt ist. Daraus lässt sich schließen, dass die kalkulierbaren Flüsse in vu genau diejenigen sind, auf welche eine Variation von a keinen Einfluss hat. Dies ist genau dann der Fall, wenn die entsprechende Zeile in der Matrix T eine Nullzeile ist.
Vorzugsweise erfolgt gemäß Ausführungsformen der Erfindung im nächsten Schritt eine Identifikation balancierbarer Flüsse.
Bei einem nicht redundanten System liefert Einsetzen von (2.5) in (2.4) die
Formulierung
mit der Redundanzmatrix (siehe Literaturstellen [17, 39] im
Appendix).
Ist das System allerdings redundant, so ist Gleichung (2.6) nur für bestimmte
erfüllt, was äquivalent ist zur Lösbarkeit von Gleichung (2.4). Die spaltenweise Notation
verdeutlicht, dass ein gemessener Fluss genau dann keinen Einfluss auf die
Lösbarkeit von Gleichung (2.4) hat, wenn der entsprechende Spaltenvektor von R der Nullvektor ist. bezeichnet in obiger Formulierung den /-ten Spaltenvektor von
und den /-ten gemessenen Fluss.
Nachfolgend werden Möglichkeiten vorgestellt, um unterbestimmte und redundante Systeme bzw. entsprechende metabolische Modelle gemäß Ausführungsformen der Erfindung zu behandeln.
Behandlung unterbestimmter Systeme Falls das System unterbestimmt ist, also unendlich viele Lösungen hat, gibt es mehrere Möglichkeiten, das Probien zu modifizieren, um zu einer eindeutigen Lösung zu gelangen. Eine Option wäre, falls möglich, durch Erweiterung des metabolischen Netzwerkmodells die dadurch erzeugten Restriktionen zu
verschärfen und damit ein bestimmtes System zu erzeugen. Desweiteren kann man versuchen, durch zusätzliche experimentelle Quantifizierungen die Anzahl bekannter Flüsse zu erhöhen. Die Bestimmung intrazellulärer Flüsse kann beispielsweise durch Markierungsexperimente bewerkstelligt werden (siehe Literaturstelle [43] im Appendix).
Möchte man diesen experimentellen Aufwand umgehen, bietet sich die verbreitete Methode der Flux Balance Analysis (FBA) an. Hierbei wird eine zu optimierende
Zielfunktion definiert, welche nach biologischer Plausibilität gewählt wird und die von den Stoffflüssen abhängt. Beispielsweise lässt sich annehmen, dass die
Wirtsorganismen ihre Stoffflüsse auf die Maximierung ihrer Wachstumsrate ausrichten, da dies einen bedeutenden evolutionären Vorteil darstellt. Bezeichnet man die Zielfunktion mit F, so ergibt sich für die FBA die allgemeine Formulierung:
Durch die Formulierung als Optimierungsproblem mit Gleichungsnebenbedingungen ergibt sich in der Regel eine eindeutige Flussverteilung als Lösung. Liegen
Informationen über Irreversibilitäten von Reaktionen vor, lässt sich der zulässige Bereich (Zulässiger Bereich: Menge der Punkte, für die alle Nebenbedingungen des Optimierungsproblems erfüllt sind) durch die zusätzlichen
Ungleichungsbedingungen weiter einschränken, wobei den Vektor aller irreversiblen Flüsse bezeichnet.
Das Hauptproblem bei der FBA besteht in der korrekten Wahl der Zielfunktion, von welcher die Lösung stark abhängt. Es ist durchaus denkbar, dass Zellen während einer Fermentation ihr biologisches Ziel ändern (Siehe Literaturstelle [33] im
Appendix).
Behandlung eines redundanten Systems
Im Falle eines redundanten Gleichungssystems gibt es aufgrund von
Widersprüchen in den balancierbaren Flüssen meist keine Flussverteilung, die die Gleichung (2.4) löst. Selbst in einem völlig korrekt definierten Netzwerkmodell treten in der Regel Inkonsistenzen auf, die durch Messfehler bei der Bestimmung von hervorgerufen werden. Die tatsächlich gemessenen Flusswerte sollen im Folgenden mit bezeichnet werden, um sie klar von den wahren messbaren Werten zu unterscheiden. In der Literatur findet ma verschiedene Verfahren, mit denen eine approximative Lösung ^ eines redundanten MFA-Problems berechnet wird:
Eine Möglichkeit wäre, zu setzen und den Vektor so zu wählen, dass
der mittlere quadratische Abstand zwischen den Vektoren und ~
minimiert wird. Die Formulierung als Optimierungsproblem lautet dann:
Die zugehörige Lösung erfüllt die Steady-State-Annahme nur näherungsweise. Ist das System bestimmt, so gilt
Als zweite Möglichkeit bietet sich die Bestimmung einer Least-Squares-Lösung für den Vektor v an, welche den relativen quadratischen Abstand zu den gemessenen Flüssen minimiert (siehe Literaturstelle [39] im Appendix) und dabei die Steady- Sfate-Bedingung erfüllt. Die Formulierung hierzu lautet:
Auch hier können Irreversibilitäten als zusätzliche Nebenbedingungen mit einbezogen werden.
Das zweite Verfahren unterscheidet sich vom ersten vor allem darin, dass seine Lösung die Steady-State- Annahme erfüllt (man nennt die gemessenen Flüsse dann balanciert). Dafür stimmen die Werte der messbaren Flüsse in der Lösung nur näherungsweise mit den tatsächlich gemessenen Werten überein. Dies kann durchaus als sinnvoll erachtet werden, wenn man der Steady-State- Annahme eine höhere Zuverlässigkeit beimisst als den Messwerten für die Flüsse, welche stets fehlerbehaftet sind. Bei der Lösung von (2.8) werden all diejenigen gemessenen Flüsse angepasst, die balancierbar sind. Die nicht balancierbaren hingegen bleiben unverändert. Eine Verallgemeinerung der eben beschriebenen Methode zur Anpassung balancierbarer Flüsse ergibt sich durch eine stärker statistisch motivierte
Herangehensweise, die in den im Appendix zitierten Literaturstellen [39, 40] erläutert wird. Sie beruht auf einem Weighted-Least-Squares-Ansatz :
Sei vm wieder der Vektor der gemessenen, fehlerbehafteten Flüsse und sei vm der Vektor der entsprechenden wahren Werte. Der Messfehlervektor S bezeichne die Differenz zwischen den wahren und den gemessenen Werten:
Es wird angenommen, dass d normalverteilt ist mit Erwartungsvektor o und
Kovarianzmatrix
Da unbekannt ist, muss eine plausible, erfahrungsbasierte Schätzung der Kovarianzmatrix für die weiteren Berechnungen herangezogen werden. Ziel ist nun eine Schätzung von welche die Steady-State- Annahme erfüllt und zugleich nahe bei iegt, wobei die Informationen über Kovarianzen berücksichtigt
werden sollen. Dies wird durch die Verwendung der Mahalanobis-Distanz erreicht. Das Optimierungsproblem hierzu lautet:
Die Lösung vm des Optimierungsproblems hat die Gestalt
(vgl. Literaturstelle [23] gemäß Appendix). I ist die Einheitsmatrix. R bezeichnet
hierbei die reduzierte Form von R, die durch Elimination linear abhängiger Zeilen erzeugt wird und daher vollen Rang besitzt (diese ist nicht eindeutig). Sie kann durch Multiplikation mit einer nicht-quadratischen Matrix r generiert werden, welche die entsprechenden Zeilentransformationen durchführt:
Diese balancierten Werte können nun in Gleichung (2.5) eingesetzt werden, um die unbekannten Flüsse zu berechnen.
Unter der Annahme, die Messungen der Flüsse seien unabhängig (d.h. die
Kovarianzmatrix sei diagonal) und die Standardabweichung von sei
proportional zum Betrag des Messwerts mit einheitlicher Proportional konstante b > o, ist das Optimierungsproblem (2.9) äquivalent zu (2.8). Es gilt nämlich:
Die Formulierung (2.9) bietet gegenüber (2.8) den Vorteil, dass die Kovarianzmatrix flexibel an die Qualität der Messdaten angepasst werden kann. Bei der
Balancierung von Flüssen, deren Messwerte als unzuverlässig eingestuft werden, werden damit stärkere Änderungen der Werte zugelassen als bei vermutlich genauer gemessenen Flüssen. Bevor die Anwendung der MFA in bioprozesstechnischen Fragestellungen illustriert wird, soll zunächst im folgenden Abschnitt die statistische Validierung von metabolischen Stoffwechselmodellen, wie sie gemäß Ausführungsformen der Erfindung durchgeführt wird, behandelt werden, da diese auf den soeben
erläuterten Betrachtungen aufbaut.
Validierung des biochemischen Stoffwechselmodells
In den bisherigen Ausführungen wurde die Qualität des postulierten biochemischen Netzwerkmodells noch nicht thematisiert. Es ist jedoch naheliegend, dass eine unzureichende Güte in seiner Formulierung zu starken Defiziten in den Ergebnissen der MFA führen kann. Um ein sinnvolles Modell als Kompromiss zwischen hoher Aussagekraft und möglichst starker Vereinfachung zu erstellen, sind
Validierungsmethoden vonnöten. In einer Publikation von van der Heijden et al. aus dem Jahre 1994 werden statistisch motivierte Tests vorgestellt und die Detektion möglicher systematischer Fehlerquellen erläutert (siehe Literaturstelle [40] des Appendix). Die Untersuchungen basieren auf der Analyse von balancierbaren Flüssen und ihrem Einfluss auf Inkonsistenzen im Modell. Sie sind also nur anwendbar, wenn ein redundantes System vorliegt.
Ein Test für die Bewertung von Inkonsistenzen
Im vorigen Abschnitt in Gleichung (2.11 ) wurde bereits die reduzierte Form Rf der Redundanzmatrix eingeführt. Der Residuenvektor sei definiert durch
Bei einem redundanten System gilt in der Regel . Die Kovarianzmatrix von kann berechnet werden durch
Sie ist also abhängig von der Kovarianzmatrix der gemessenen Flüsse, die die Unsicherheiten in den Messungen berücksichtigt. Für den Test wird die Teststatistik herangezogen, deren Beobachtungen gegeben sind durch: Es kann gezeigt werden, dass die Teststatistik einer unterliegt (vgl.
[40] im Appendix). Die Freiheitsgrade entsprechen dem Rang von
Insgesamt erhält man folgenden Hypothesentest: Teste
Die Inkonsistenz des betrachteten Stoffwechselmodells ist nicht signifikant gegen Die Inkonsistenz des betrachteten Stoffwechselmodells ist signifikant: bezeichnet das -Quantil der Verteilung mit
Freiheitsgraden. Detektion möglicher , systematischer Fehlerquellen
Weist der zuvor definierte Test auf Inkonsistenzen hin, so kann dies auf eine Unterschätzung des Messrauschens zurückzuführen sein, was sich in der Matrix C niederschlägt und dadurch den Ausgang des Tests beeinflusst. In Literaturstelle [40] des Appendix werden drei weitere, mögliche Fehlerquellen diskutiert:
Systematische Messfehler: Die Messung des /-ten Flusses ist mit einem systematischen Fehler behaftet.
Fehlen einer wichtigen Reaktion im Stoffwechselnetzwerk: Eine ( ) wichtige Reaktion fehlt im Netzwerkmodell; die stöchiometrische Matrix A müsste um eine weitere Spalte erweitert werden. Der zugehörige Fluss sei
bezeichnet.
Fehlerhafte Definition einer Reaktion im Stoffwechselnetzwerk: Die /-te
Reaktion ist falsch definiert; anstelle des Spaltenvektors in der stöchiometrischen
Matrix sollte der Vektor stehen.
Die Untersuchung des Fehlers stützt sich auf die Struktur des Residuenvektors e\ Für jeden der oben genannten Fehler kann ein charakteristischer Vergleichsvektor v definiert werden, dessen Richtung ungefähr mit der Richtung von e übereinstimmt, sofern die jeweilige Fehlerquelle tatsächlich vorliegt. Ein statistischer Test, der die Ähnlichkeit zwischen den Richtungen der Vektoren bewertet, wird ebenfalls vorgestellt. Die Länge von £ liefert einen Hinweis auf die Größe s des Fehlers. In nachfolgender Tabelle sind die entsprechenden Vergleichsvektoren aufgelistet r L bezeichnet hier den /-ten Spaltenvektor von Rf. Die Herleitung der
Vergleichsvektoren soll hier nur für die erste der aufgelisteten Fehlerquellen demonstriert werden. Für die weiteren Fälle sei auf [40] verwiesen.
Es gilt
Im Falle eines korrekt definierten Netzwerkmodells gilt E[s] = o. Weicht nun aber der wahre Wert für den /-ten Fluss um den systematischen Fehler p vom
gemessenen ab, d.h. ist
so gilt
Es ist also zu erwarten, dass e und rL die gleichen Richtungen besitzen.
Table 1 : Vergleichsvektoren und zugehörige Fehlergrößen für drei unterschiedliche Fehlerquellen.
Um die Ähnlichkeit zwischen £ und v zu bewerten, wird die Teststatistik herangezogen, die -verteilt ist mit einem Freiheitsgrad von
Der folgende Hypothesentest beurteilt die Ähnlichkeit von und
Teste Die Vektoren und sind ähnlich
gegen Die Vektoren sind nicht ähnlich:
Die statistische Herleitung findet sich im Anhang von Literaturstelle [40] des
Appendix.
Nach Ausführungsformen umfasst das nach Ausführungsformen der Erfindung erstellte metabolische Modell ein Netzwerk, welches die zentralen intrazellulären Stoffflüsse umfassen und dennoch eine möglichst geringe Komplexität aufweisen sollte. Das hier beispielhaft erläuterte Modell basiert im Wesentlichen auf den
Netzwerkstöchiometrien, die in den folgenden Publikationen vorgeschlagen wurden: Altamirano C, lllanes A, Becerra S, Cairo JJ, Godia F (2006):“Considerations on the lactate consumption by CHO cells in the presence of galactose”, Journal of
Biotechnology 125, 547 - 556; Lianeras F, Pico J (2007):“A procedure for the estimation over time of metabolic fluxes in scenarios where measurements are uncertain and/or insufficient”, BMC Bioinformatics 8:421 ; und Nolan RP, Lee K (2011 ):“Dynamic model of CHO cell metabolism”, Metabolic Engineering 13, 108- 124.
Kompartimentierungen der Zellen wurden allerdings nicht betrachtet. Aufgrund ihrer Vielzahl konnten nicht alle Reaktionen, an denen Redox- und Energieäquivalente beteiligt sind, in das Stoffwechselmodell aufgenommen werden. Daher wurden NAD(P)H und ATP nicht in die Formulierung der Stöchiometrie einbezogen. Zudem wurden manche Stoffwechselzweige nicht detailliert betrachtet, sondern in die Biomassebildung integriert (z.B. der Pentosephosphatweg). Meist handelt es sich bei den formulierten Reaktionen um eine Zusammenfassung mehrerer
hintereinandergeschalteter biochemischer Reaktionen ohne Verzweigungen, die nach der Steady-State-Annahme identische Stoffflüsse aufweisen sollten
(beispielsweise sind nur wenige Intermediate der Glykolyse oder des Citratzyklus explizit aufgeführt).
Die Biomassebilanz wurde aus der oben genannten Publikation von Nolan (2011 ) übernommen, ebenso wie die Umrechnung der Lebend- und Gesamtzelldichte in die Einheit mol/l. Die Formulierung der Stöchiometrie zur Produktbildung folgt aus der Aminosäure-Zusammensetzung des Zielproteins. Auch bezüglich der
Reversibilität der Reaktionen wurden die o.g. Publikationen herangezogen.
Das resultierende metabolische Modell ist in Figur 4 im Einzelnen dargestellt. Diese zeigt in Figur 4a ein biochemisches Netzwerkmodell über intra- und extrazelluläre Stoffflüsse von CHO-Zellen]{Biochemisches Netzwerkmodell über intra- und extrazelluläre Stoffflüsse von CHO-Zellen. Es modelliert die zentralen Flüsse des Stoffwechsels, welche den Transport und die Umwandlung von Glucose (Glc),
Laktat (Lac), Alanin (Ala), Glutamat (Glu), Glutamin (Gin), Ammoniak (NH3), Aspartat (Asp), Asparagin (Asn), Serin (Ser), Glycin (Gly), totaler Zelldichte (BIO), Produkt (Prod), Glucose-6-Phosphat (G6P), Pyruvat (Pyr), alpha-Ketoglutarat (AKG), Malat (Mal) und Oxalacetat (Oxa) umfassen. Die Reversibilität ist durch die Form der Pfeile gekennzeichnet.
In der in Figur 4b abgebildeten Tabelle sind die einzelnen stöchiometrischen Reaktionen des metabolischen Modells aufgelistet. Davon sind die Reaktionen 1 , 3, 9, 11 , 13, 14, 16, 18, 20, 21 , 22 und 23 extrazellulär. Das Modell umfasst 13 intrazelluläre Metaboliten, für die die Steady-State-Annahme gelten soll. Der Index „e“ bezeichnet hier extrazelluläre Stoffe. Die Reversibilität/Irreversibilität von
Reaktionen ist durch den Reaktionspfeil angegeben.
Das in dem metabolische Modell enthaltene Netzwerkmodell sollte die zentralen intrazellulären Stoffflüsse umfassen und dennoch eine möglichst geringe
Komplexität aufweisen. Die in dieser Arbeit gewählte Formulierung basiert im Wesentlichen auf den Netzwerkstöchiometrien, die in den oben genannten
Publikationen von Altamirano et al. (2006), Lianeras et al. (2007) und Nolan et al. (2011 ) vorgeschlagen wurden. Kompartimentierungen der Zellen wurden allerdings nicht betrachtet. Aufgrund ihrer Vielzahl konnten nicht alle Reaktionen, an denen Redox- und Energieäquivalente beteiligt sind, in das Stoffwechselmodell
aufgenommen werden. Daher wurden NAD(P)H und ATP nicht in die Formulierung der Stöchiometrie einbezogen. Zudem wurden manche Stoffwechselzweige nicht detailliert betrachtet, sondern in die Biomassebildung integriert (z.B. der
Pentosephosphatweg). Meist handelt es sich bei den formulierten Reaktionen um eine Zusammenfassung mehrerer hintereinandergeschalteter biochemischer Reaktionen ohne Verzweigungen, die nach der Steady-State-Annahme identische Stoffflüsse aufweisen sollten (beispielsweise sind nur wenige Intermediate der Glykolyse oder des Citratzyklus explizit aufgeführt).
Die Biomassebilanz wurde aus der oben genannten Publikation von Nolan (2011 ) übernommen, ebenso wie die Umrechnung der Lebend- und Gesamtzelldichte in die Einheit mol/l. Die Formulierung der Stöchiometrie zur Produktbildung folgt aus der Aminosäure-Zusammensetzung des Zielproteins.
Auch bezüglich der Reversibilität der Reaktionen wurden die o.g. Publikationen herangezogen.
Zu dem Stoffwechselnetzwerk, das in der oben spezifizierten Tabelle dargestellt ist, wurde die stöchiometrische Matrix A formuliert. Die Spalten, die den bekannten (in diesem Fall extrazellulären) Stoffflüssen entsprechen, wurden zur Teilmatrix Am zusammengefasst, die übrigen zur Teilmatrix Au.
Die Charakterisierung des Stoffwechsel netzwerks kann z.B. nach einem Schema erfolgen, das im Appendix als Abbildung 4.2 dargestellt und erläutert ist.
Das Stoffwechselnetzwerk kann wie in im Anhang beschrieben validiert und ggf. modifiziert werden.
Somit wurde ein metabolisches Modell 402 von CHO-Zellen wie in Figur 4 dargestellt bereitgestellt. Das metabolische Modell beinhaltet eine Vielzahl von intrazellulären 410 und extrazellulären 408 Flüssen, wobei das metabolische Modell mindestens eine stöchiometrische Beziehung zwischen einem intrazellulären 406 und einem extrazellulären 404 Metaboliten spezifiziert.
Die folgenden Schritte 106-112 werden für eine Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung einer Zellkultur in einem Bioreaktor durchgeführt. Dabei kann ein Profil aus tatsächlich gemessenen extrazellulären Stoffflüssen und für den nächsten Zeitpunkt (nach Ablauf eines Intervalls definierter Länge, z.B. 24 h) vorhergesagten extrazellulären Flüssen erstellt. Die Abweichung dieser beiden Profile voneinander zeigt die Qualität der Vorhersage an.
Schritt 106: Empfang von Messwerten
In einer Ausführungsform wird an mehreren Zeitpunkten während der Kultivierung einer Zellkultur in einem Bioreaktor 208 dieser Zellkultur eine Probe entnommen und automatisch oder von Hand zu ein oder mehreren Analysegeräten 250 verbracht, wie dies in Figur 2 dargestellt ist. Bei dem Analysegerät kann es sich um ein System aus einem oder mehreren Analysegeräten handeln, zum Beispiel einer Thomaskammer oder einer optischen Zählstation zur Bestimmung der Zelldichte. Zur Bestimmung der Konzentration einzelner Aminosäuren kann beispielsweise ein Hochleistungsflüssigchromatograph oder andere geeignete im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Die Probenentnahme kann beispielsweise in einem Intervall von 24 Stunden erfolgen. Die so erhaltenen Messdaten werden an ein Datenverarbeitungssystem 252 übermittelt. Bei dem Datenverarbeitungssystem 252 kann es sich zum Beispiel um einen Computer handeln, der als Kontrolleinheit ein oder mehrere Bioreaktoren überwacht und/oder steuert.
Nach manchen Ausführungsformen werden zumindest einige der Messwerte, zum Beispiel die Zelldichte, auch über entsprechende Sensoren des Bioreaktors 208 selbst ermittelt und an ein Datenverarbeitungssystem 252 übermittelt werden.
Neben den Konzentrationen ausgewählter extrazelluläre Metaboliten, von welchen bekannt ist oder erwartet wird, dass diese eine gewisse prädiktive Kraft im Hinblick auf die Konzentration und den Fluss dieses oder eines anderen extrazellulären Metaboliten zu einem zukünftigen Zeitpunkt haben, können auch weitere
Eingangsparameterwerte bestimmt werden, insbesondere die aktuelle Uhrzeit, die aktuelle Zelldichte, und gegebenenfalls weitere Parameter wie zum Beispiel die LDH Konzentration, die als Korrekturfaktor für die bei der Zelldichtebestimmung nicht berücksichtigten lysierten Zellen verwendet werden kann. Die so empirisch zu einem bestimmten Zeitpunkt gewonnenen Messdaten können nun zur Vorhersage extrazelluläre Flüsse an einem nachfolgenden Zeitpunkt, zum Beispiel am nächsten Tag, mittels einer MLP verwendet werden, wie dies im nachfolgenden Schritt beschrieben ist.
Schritt 108: Eingabe der Messwerte in eine trainiertes MLP
Das Datenverarbeitungssystem 252 beinhaltet eine MLP, zum Beispiel ein neuronales Netz (NN) oder ein zusammenwirkendes System mehrerer neuronaler Netze, welches so trainiert wurde, dass es anhand einer an einem bestimmten Zeitpunkt gemessenen Eingabeparameterwerte (insbesondere Konzentrationen extrazellulären Metaboliten und Zelldichte) ein oder mehrere extrazelluläre Flüsse des metabolischen Modells 254 vorhersagt bzw. schätzt. Beispielsweise kann das Datenverarbeitungssystem 252 eine Programlogik enthalten, welches die zu einem Zeitpunkt erhaltenen Messdaten automatisch als Eingabe an eine MLP übergibt, die auf Testdatensätzen trainiert wurde, die von Zellkulturen des gleichen Typs von Zellen erhalten wurden, dem auch die Zellen der Zellkultur angehören, deren metabolischer Zustand zum künftigen Zeitpunkt (zum Beispiel nächste Tag) vorhergesagt werden soll. Schritt 110: Vorhersage künftiger Aufnahmeraten und Abgaberaten durch die MLP
Über das neuronale Netz werden sodann in einer Ein-Schritt-Vorhersage
ausgehend von aktuell gemessenen Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten zum Zeitpunkt extrazelluläre Flüsse zu einem beliebig gewählten künftigen Zeitpunkt vorhergesagt bzw. geschätzt. Somit wird vom MLP in diesem Schritt in Antwort auf die Eingabe der gemessenen
Eingangsparameterwerte in die MLP von dieser ein oder mehrere extrazelluläre Flüsse für den künftigen Zeitpunkt berechnet und zurückgegeben.
Optional: Vorhersage von Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten durch die
MLP Die über das neuronale Netz geschätzten extrazellulären Flüsse werden nach Ausführungsformen der Erfindung zudem für Ein-Schritt-Vorhersagen von
Metabolitkonzentrationen zu einem beliebig gewählten künftigen Zeitpunkt ausgehend von den aktuellen Konzentrationen zum Zeitpunkt Verwendet.
Hierzu wird Gleichung (4.1 ) des Appendix nach c 2 aufgelöst. Da die
Lebendzelldichte des künftigen Zeitpunkts unbekannt ist, wird sie durch die aktuell gemessene und ggf. korrigierte Zelldichte ersetzt. Die umformulierte Gleichung lautet dann:
Falls Zufütterungen während des Betriebs des Bioreaktors durchgeführt werden sollten diese vorzugsweise in und berücksichtigt
werden.
Schritt 112: Durchführung einer MFA
Auf Basis der Aufnahmeraten und Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten (extrazelluläre Flüsse), wie diese von der MLP für den künftigen Zeitpunkt vorhergesagt wurden, wird gemäß Ausführungsformen der Erfindung sodann eine metabolische Flussanalyse durchgeführt, in welche auch die intrazellulären Flüsse und stöchiometrischen Gleichungen, wie sie in dem metabolischen Modell formuliert sind, Eingang finden. Da in dem metabolischen Modell extrazelluläre und
intrazelluläre Flüsse über ein oder mehrere intrazellulärer Metaboliten aneinander gekoppelt sind, ist es mathematisch möglich, anhand der vorhergesagten
extrazellulären Flüsse auch die intrazellulären Flüsse zu dem künftigen Zeitpunkt vorherzusagen. Entsprechende Programmroutinen zur Durchführung metabolischer Flussanalysen lassen sich in Matlab und anderen auf dem Markt existierenden Softwarelösungen implementieren.
Da in die Vorhersage der intrazellulären Flüsse sowohl die Vorhersage das auf dynamischen, empirischen Daten trainierten MLP als auch das in dem
metabolischen Modell spezifizierte Wissen über stöchiometrischen
Zusammenhänge und Reaktionsgleichungen eingeht, kann dieser Vorhersageschritt auch als Vorhersage eines Hybridmodells angesehen Beziehung beschrieben werden.
Die Kopplung der Ergebnisse der Vorhersagen der MLP mit den Informationen des metabolischen Modells im Zuge der Stoffflussanalyse kann zum Beispiel wie folgt implementiert werden:
Nach der Prädiktion der extrazellulären Flüsse im nachfolgenden Zeitintervall mithilfe des neuronalen Netzes wird eine metabolische Stoffflussanalyse
durchgeführt, die die Flussverteilung im nächsten Zeitintervall schätzen soll. Zunächst wird eine Schätzung einer Kovarianzmatrix der Flüsse des metabolischen Modells erstellt:
zeigt, dass sowohl die Qualität der Messungen, als auch die der Schätzungen der gemessenen Werte durch das neuronale Netz in die Kovarianzmatrix einfließen. Jedoch kann die Umformulierung die Abschätzung nicht erleichtern, da die
Differenzen und keine unabhängigen Zufallsvariablen
darstellen und somit der Erwartungswert im mittleren Term der rechten Seite unbekannt ist. Daher ist der in dieser Arbeit verwendete Ausdruck gemäß der Gleichung 4.5 im Appendix , der im folgenden erläutert werden soll, nur als grobe Näherung an die tatsächliche Kovarianzmatrix zu verstehen.
Nach Ausführungsformen wird die Kovarianzmatrix für den Zweck der Vorhersage künftiger intrazellulärer Flüsse als Diagonalmatrix gewählt, da die verschiedenen Metabolit-Flüsse über getrennte Netze geschätzt sind und die Fehler daher als weitgehend unabhängig voneinander betrachtet werden können. Die
Diagonaleinträge sollten definitionsgemäß die Varianten der Fehler der geschätzten Flüsse widerspiegeln, oder zumindest proportional dazu sein (der
Proportionalitätsfaktor spielt bei der Lösung des MFA-Problems wie in Gleichung 2.9 des Appendix dargestellt keine Rolle).
Im Gegensatz dazu wird nach Ausführungsformen der Erfindung zur deskriptiven metabolischen Stoffflussanalyse des aktuellen metabolischen Zustands einer Zelle eine Kovarianzmatrix „ verwendet, in welcher die Diagonaleinträge nicht
abhängig vom Betrag der Flüsse sind.
Se der j-te gemessene prädiktive Fluss im n-ten Zeitintervall. Die
Kovarianzmatrix wurde als Diagonalmatrix formuliert und besitzt die Struktur:
Die Diagonaleinträge wurden dabei als die Mediane der Mengen
gewählt. Es wird in dieser Ausführungsform angenommen, dass das„Zeitintervall im Trainingsdatensatz“ identisch oder ähnlich ist zum Zeitintervall, das für die aktuelle Vorhersage verwendet werden soll. Sodann wird eine Flussanalyse auf Basis dieser Kovarianzmatrix durchgeführt wie dies an sich im Stand der Technik bekannt ist. Die Kovarianzmatrix dient hierbei zur Balancierung der Flüsse nach Gleichung (2.10) des Appendix. Gleichung 2.10 des Appendix bezieht sich zwar auf die deskriptive MFA, bei der gemäß der im
Appendix beschriebenen Ausführungsform eine andere Kovarianzmatrix verwendet wurde. Die Balancierung bzw. Berechnung der Flüsse durch MFA erfolgt aber im Falle der prädiktiven MFA genauso.
Optional kann eine Fehleranalyse des Modells basierend z.B. auf einer Gaußschen Fehlerfortpflanzung durchgeführt werden wie dies in Abschnitt 4.7.8 des Appendix beschrieben ist.
Erzeugung und Trainieren eines Neuronalen Netzwerks
Gegenüber der Spezifikation reaktionskinetischer Modelle zur Vorhersage künftiger Stoffflüsse hat die Verwendung trainierter MLPs den Vorteil, dass deren Erzeugung in der Regel einfacher und schneller in einem halbautomatischen Verfahren möglich ist. Ein Beispiel, wie ein MLP in Form eines NN durch Training erzeugt werden kann, wird im Folgenden beschrieben. a) Kultivierung mehrerer Trainings-Zellkulturen
Um eine möglichst breite Datenbasis für das Training der MLP zu erhalten, werden vorzugsweise mehrere Trainingskulturen in mehreren Bioreaktoren kultiviert.
Vorzugsweise umfassen diese Bioreaktoren ein oder mehrere Fed-Batch-Reaktoren sowie ein oder mehrere weitere Bioreaktoren von anderen Reaktortypen.
Es wurden in einer Ausführungsform acht Fermentationen eines Klons
rekombinanter CFIO-Zellen im Ein-Liter-Maßstab durchgeführt. Die
Anfangsbedingungen (Volumen, Medienzusammensetzung,
Inokulumskonzentration) wurden für jeden Bioreaktor identisch gewählt, es kamen jedoch unterschiedliche Betriebsweisen zum Einsatz:
• Ein Bioreaktor wurde im Batch-Verfahren betrieben, bis die Viabilität der Zellen unter 50% sank.
• In einem zweiten Bioreaktor wurde ebenfalls zunächst das Batch-Verfahren angewandt. Gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurde eine Teilernte durchgeführt und der Reaktor mit frischem Medium aufgefüllt, so dass ähnliche Bedingungen wie zu Beginn der Fermentation erreicht wurden (bezüglich des Volumens und der Inokulumskonzentration). Anschließend wurde der Ansatz im Batch-Verfahren weiterbetrieben (sog. Split-Batch- Verfahren).
• Die Fermentation in den restlichen sechs Reaktoren erfolgte als Fed-Batch mit initialer Batch-Phase. Es fanden sowohl eine kontinuierliche Zufütterung, als auch gegen Ende der Fermentation eine pulsartige Nährstoffzugabe statt. Die Fed-Batch-Fermentationen differierten dabei in den
Glucosekonzentrationen im Medium, die durch unterschiedliche Strategien in der Zufütterung eingestellt wurden. In den folgenden Ausführungen werden die Fed-Batch-Ansätze des Öfteren mit einer Nummerierung versehen sein. Gemäß dieser Nummerierung fand in den ersten beiden Ansätzen eine kurzzeitige vollständige Glucoselimitierung in der zweiten Prozesshälfte statt, bevor die Boluszugaben erfolgten. Der dritte und vierte Ansatz erfuhr die gleiche Limitierung, durch die anschließenden Boli wurden jedoch höhere Glucosekonzentrationen eingestellt. Im fünften und sechsten Ansatz lag stets eine positive Mindestkonzentration an Glucose vor.
Temperatur, p02-Wert und pH-Wert wurden während der gesamten Fermentation konstant gehalten. Es erfolgten regelmäßige Probenahmen über den Prozess hinweg. Die Proben wurden hinsichtlich ihrer Lebend- und Gesamtzelldichte untersucht, wobei eine Färbemethode zum Einsatz kam, die zwischen lebenden und toten Zellen unterscheidet. Lysierte Zellen wurden hierbei nicht erfasst. Weiterhin wurde der Gehalt an verschiedenen Substanzen im Reaktionsmedium mithilfe eines COBAS INTEGRA-Analysegeräts bzw. durch
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht. Dazu zählten Glucose, Laktat und Ammonium, sowie die Aminosäuren Alanin, Glutamin, Glutamat, Asparagin, Aspartat, Serin, Glycin und das Enzym Laktatdehydrogenase. Die
Produktkonzentration wurde ebenfalls bestimmt.
Zu den Probenahmezeitpunkten wurde das Flüssigkeitsvolumen im Bioreaktor über eine Fermenterwaage erfasst. b) Bestimmung der Netzwerkarchitektur
Es wurde ein neuronales Netz erstellt, das aus dem momentanen Zustand im Bioreaktor die mittleren Flüsse der extrazellulären Metaboliten zwischen dem aktuellen und dem nächsten Probenahmezeitpunkt schätzen sollte (sog. Ein-Schritt- Prognose). Dabei wurde nach manchen Ausführungsformen für jeden
extrazellulären Stofffluss als Ausgangsgröße ein eigenes Netz trainiert. Als
Eingangsgrößen diente eine Auswahl der aktuell vorherrschenden extrazellulären Metabolitkonzentrationen.
Das neuronale Netz bestand in einem zweilagigen Perzeptron mit linearer
Aktivierungsfunktion in der Ausgabeschicht und sigmoidaler Aktivierungsfunktion in der versteckten Schicht (vgl. Abbildung 2.4 im Appendix). Für letztere wurden sowohl die Sigmoidfunktion als auch der Tangens hyperbolicus getestet. Es waren keine signifikanten Unterschiede erkennbar zu den Resultaten, die unter
Verwendung der Sigmoidfunktion erzielt wurden. Das Training erfolgte nach dem sequentiellen Gradientenabstiegsverfahren (wie dies exemplarisch in den
Gleichungen (2.16), (2.17) und (2.18) im Appendix illustriert ist). c) Auswahl der Eingangsvariablen
Nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden zur Auswahl der Eingabeparameterwerte mehrere oder alle in dem metabolischen Modell genannten extrazellulären Metaboliten nach ihrer Relevanz für die Vorhersage des jeweiligen Flusses geordnet. Vorzugsweise wurden hierbei extrazelluläre Metaboliten mit redundantem Informationsgehalt nicht berücksichtigt.
Eine detaillierte Beschreibung für die Auswahl der Eingangsparameterwerte gemäß Ausführungsformen der Erfindung findet sich in der Beschreibung zu Figur 13. d) Wahl der Trainingsparameter, Initialisierung der Gewichte und
Normalisierung der Daten
Nachdem die Anzahl an Iterationen und versteckten Neuronen festgelegt wurde, werden nun für die anfängliche Lern sch rittweite in jedem Netz die Werte in der Ausgabeschicht und in der versteckten Schicht gewählt. Nach jedem Zehntel der Gesamtiterationszahl wurden die Schrittweiten um 1/10 des r_ 1 J_
Ausgangswerts reduziert. Als Initialwerte für die Gewichte wurden auf *- 105 10 J gleichverteilte Zufallszahlen generiert. Die Ein- und Ausgangs-Trainingsdaten wurden getrennt nach Metaboliten standardisiert, so dass die angepassten Werte den empirischen Mittelwert 0 und die empirische Standardabweichung 0,5 besaßen. Die Testdaten wurden mit den Mittelwerten und Standardabweichungen des
Trainingsdatensatzes auf die gleiche Art transformiert.
e) Wahl der Trainings- und Testdatensätze
Die Schätzungen wurden von drei verschiedenen neuronalen Netzen getroffen, die sich in der Gruppierung der Daten in Trainings- und Testdatensätze unterscheiden:
1. Netz 1 : Der Trainingsdatensatz des ersten Netzes bestand aus den Daten von drei der Fed-Batch-Fermentationen und der Batch-Fermentation, der
Testdatensatz aus denen der der übrigen drei Fed-Batch-Fermentationen und der Split-Batch-Fermentation. 2. Netz 2: Das zweite Netz hatte Daten aus drei der Fed-Batch-Fermentationen im
Trainingsdatensatz und die Daten der übrigen drei Fed-Batch-Fermentationen, der Batch-Fermentation und der Split-Batch-Fermentation im Testdatensatz.
3. Netz 3: Der Trainingsdatensatz des dritten Netzes umfasste die Daten aus drei der Fed-Batch-Fermentationen und der Testdatensatz die Daten der übrigen drei Fed-Batch-Fermentationen. f) Ein-Schritt Vorhersage extrazellulärer Metabolitkonzentrationen
Ziel ist die Erstellung einer trainierten MLP, welche eine möglichst akkurate
Vorhersage des Stoffwechsels einer Zelle ermöglicht. Falls bei der Erzeugung des Trainingsdatensatzes niederfrequente Daten generiert werden, kann es geschehen, dass eine Mittelung/Filterung der Daten zu einem zu großen Informationsverlust führen würde. Daher sollten in diesem Fall mittlere extrazelluläre Flüsse zwischen zwei konsekutiven Messpunkten approximiert weren. Die Berechnung basiert auf Gleichung und soll im Folgenden erläutert werden:
Da das Batch- und das Fed-Batch-Verfahren betrachtet werden sollen und es somit keinen Flüssigkeitsausstrom gibt, gilt in jedem Falle Der extrazelluläre Fluss v einer Komponente zur Zeit t ist, wie bereits in Abschnitt 2.2.2 des Appendix erwähnt, die Stoffmenge, die pro Zeit von einer Zelle aufgenommen bzw.
abgegeben wird. Er ist daher gegeben durch
wobei die Anzahl an Lebendzellen im Reaktionsmedium zur Zeit t bezeichnet. Nach Gleichung 2.1 im Appendix gilt also im Bereich zwischen zwei
Unstetigkeitsstellen
Die Konzentration des Stoffs im Zulauf ist zeitlich konstant bzw. wird als näherungsweise konstant angenommen.
Unstetigkeiten können zu den Probenahmezeitpunkten, sowie bei den Bolus- Zugaben auftreten.
Es sei zunächst angenommen, dass die Nährstoffzugabe stets kontinuierlich erfolgt ist und dass daher die Größen m und ^“zwischen zwei Messpunkten
differenzierbar sind. Will man den mittleren Fluss / ;r' zwischen zwei konsekutiven Messzeitpunkten und t2 bestimmen, so kann man ihn -- zunächst scheinbar trivial -- abschätzen durch:
Dabei bezeichnen die indizierten Größen den Wert zum Zeitpunkt ti bzw.
ist die Stoffmenge, die über den Zulauf im betrachteten Zeitintervall dem
Reaktionsmedium zugeführt wird und VCD bezeichnet die Lebendzelldichte. Der
Operator ^ symbolisiert die Differenz der entsprechenden Größen zwischen t1 und
Die obige Abschätzung (4.1 ) soll im Folgenden mathematisch begründet werden. Man erhält sie durch Integration über das Zeitintervall wobei die einzelnen
Messgrößen zwischen den beiden Probenahmezeiten linear interpoliert werden, und durch zusätzliche Taylor-Entwicklung: Bei linearer Interpolation gilt für alle
Damit ist
Für das verbleibende Integral gilt:
Es wird eine Taylorentwicklung der Logarithmen um bis zur ersten
Ordnung wird durchgeführt und liefert:
Setzt man diesen Ausdruck für das obige Integral ein, erhält man die Abschätzung des Flusses gemäß Gleichung 4.1 oben bzw. des Appendix). Im Falle, dass zwischen zwei Probenahmezeitpunkten und ein Bolus zum
Zeitpunkt zugegeben wird, der den betrachteten Stoff enthält, so wird
angenommen, dass der mittlere Fluss zwischen und und zwischen und
gleich ist. Man kann dann leicht zeigen, dass auch in diesem Fall die Gleichung (4.1 ) angewendet werden kann, wobei die Stoffmenge, die über den Bolus zugeführt wird, im Ausdruck enthalten ist.
Somit sind zum Zeitpunkt einer aktuellen Probenahme aus einem Trainings- Bioreaktor sowohl die Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten bei der vorigen Probenahme als auch die rechnerisch auf Basis des seit der letzten Entnahme errechneten extrazellulären Flüsse bekannt und können als Referenzwertmengen zusammen an die zu trainierende MLP übergeben werden, die dadurch lernt, auf Basis der zur letzten Probenahme gemessenen Konzentrationen der extrazellulären Metaboliten die berechneten extrazellulären so vorherzusagen, dass eine möglichst geringe Abweichung von den berechneten extrazellulären Flüssen besteht.
Die trainierte MLP bzw. das trainierte neuronale Netz kann nun gespeichert werden und für ein-Schritt-Vorhersagen von Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten zu einem beliebig gewählten künftigen Zeitpunkt , zum Beispiel am nächsten
Tag, ausgehend von den aktuellen Konzentrationen zum Zeitpunkt
verwendet werden. Zusammengefasst basiert die Idee des Trainieren des neuronalen Netzes darauf, dass die Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten leicht messbar sind und aus diesen zumindest im Rückblick extrazelluläre Flüsse empirisch feststellbar sind. Durch Verwendung der an einem bestimmten Zeitpunkt gemessenen
Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten als Eingabeparameterwerte und der extrazellulären Flüsse, wie sie sich über das Zeitintervall zwischen diesen aktuellen Zeitpunkt und einem künftigen Zeitpunkt anhand der Konzentrationsdifferenz eines extrazellulären Metaboliten berechnen lassen, als Ausgabeparameterwerte, kann ein neuronales Netz oder in anderer Machinelearning-Algorithmus so trainiert werden, dass er zumindest die extrazellulären Flüsse für den einen künftigen Zeitpunkt Vorhersagen kann. Die Ermittlung der Zelldichte erlaubt dabei eine Umlegung der gesamten Konzentrationsdifferenz im Medium auf die einzelnen in dem Medium enthaltenen Zellen der Zellkultur.
Die Aufnahme/Abgaberate extrazellulärer Metabolit (Reaktionsterm) errechnet sich gemäß bevorzugter Ausführungsformen aus der Differenz der Gesamtheit der Konzentrationsänderung des Stoffes im Bioreaktor abzüglich des dem Bioreaktor zugeführte/entnommenen Stoffes (Konvektionsterm) . Es wurde festgestellt, dass der Reaktionsterm bei extrazellulären Metaboliten in erster Linie aus der Aufnahme bzw. Abgabe in bzw. durch Zellen bestimmt wird, sodass die gemessenen
Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metaboliten im Wesentlichen mit den Aufnahmeraten bzw. Abgaberaten dieser extrazellulären Metaboliten in die Zellen bzw. aus den Zellen gleichgesetzt werden können. In manchen Ausführungsformen die eine erhebliche Zufuhr oder Entnahme bestimmter extrazellulärer Metaboliten beim Betrieb des Bioreaktors vorsehen kann jedoch eine Korrekturrechnung erfolgen, wonach bei der Berechnung der Aufnahmeraten bzw. Abgaberaten dieser extrazellulären Metaboliten von den gemessenen Konzentrationsänderungen diejenigen Anteile der Konzentrationsänderungen abgezogen werden, die auf die externe Zufuhr bzw. Entnahme der extrazellulären Metaboliten in das Kulturmedium bzw. aus dem Kulturmedium zurückzuführen sind. Diese Korrektur muss jedoch auch im Fed-Batch verfahren nicht notwendigerweise vorgenommen werden. Auch im Fed-Batch Verfahren sind die ein- und ausgehenden Ströme kontinuierlich. Im Falle von Bolus-Zufütterungen oder Probenahmen während der Fermentation erhält man Verläufe, die stückweise über weite Strecken stetig und damit differenzierbar sind. Damit ist die Annahme eines differenzierbaren Verlaufs der
Konzentratiosnänderungen auch für Fed-Batch Reaktoren gerechtfertig.
Vorzugsweise wird jedoch eine Korrektur der gemessenen Zelldichte beim Training und/oder bei der Vorhersage der extrazellulären Flüsse mittels der trainierten MLP vorgenommen. Mit Ausnahme der Batch-Fermentation scheint bei den
Fermentationsansätzen ein ähnlicher, näherungsweise linearer Zusammenhang zwischen der LDFI-Konzentration und der Zelldichtedifferenz zu bestehen.
Nach Ausführungsormen der Erfindung wird in einem Fermenter eine gemessene totale Zelldichte kontinulierlich erfasst und in einem Plot dargestellt. Parallel dazu wird die Zelldichte berechnet. Die Vorhersage kann beispielsweise von einer trainierten MLP berechnet werden, die gemäß Ausführungsformen der Erfindung trainiert wurde, wobei die gemessene Zellkonzentration als weiterer
Ausgabeparameterwert verwendet wurde. Diese„vorhergesagte“ Zelldichte wird ebenfalls in dem Plot aufgetragen. Gemäß Ausführungsformen der Erfindung wird also ein erstes zeitliches Profil der gemessenen Zelldichte einer Zellkultur eines bestimmten Zelltyps empirisch ermittelt und außerdem ein zweites zeitliches Profil einer auf Basis des metabolischen Modells und der extrazellulären
Metabolitkonzentrationen vorhergesagten Zelldichte. Es wird also ein Plot erhalten, der ein zeitliches Profil der gemessenen und vorhergesagten Zelldichten und ihrer Abweichung voneinander beinhaltet.
Es zeigt sich, dass oftmals eine erhebliche Abweichung zwischen gemessener Zelldichte und der von der MLP vorhergesagten Zelldichten besteht, insbesondere gegen Ende einer Zellkultur hin. Die Diskrepanz zwischen gemessener und vorhergesagter Zelldichte wird im Folgenden als„Dichtediskrepanzprofil“ bezeichnet und kann optional ebenfalls in dem Plot graphisch dargestellt werden. Das
Dichtediskrepanzprofil repräsentiert das zeitliche Profil des Auftretens lysierter Zellen, welche nicht als Zellen messtechnisch erfassbar sind aber noch Einfluss auf die Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten haben. Es wird sodann eine empirische Funktion, z.B. mit Hilfe iner linearen Ausgleichsgeraden über das Dichtediskrepanzprofil charakterisiert durch zwei Parameter a0 und a±, erstellt, welche die Dichte lysierter Zellen gemäß des Dichtediskrepanzprofils in lineare Beziehung setzt mit der zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessenen LDH
Konzentration im Medium. Diese Funktion erlaubt eine approximative Umrechnung von der LDH-Konzentration in die Dichtedifferenz und damit in die lysierten Zellen. Die korrigierte Zelldichte ist also die Summe der gemessenen Zelldichte und der auf Basis der gemessenen LDH Konzentration mittels der linearen Funktion
errechneten Anzahl der lysierten Zellen. Mit anderen Worten werden also die gemessenen Zelldichten 4Gΐi rnithilfe dieser Umrechnung um die Dichtedifferenz ergänzt:
wobei M die LDH-Konzentration zum h-ten Zeitpunkt bezeichnet und so
gewählt wurde, dass ein Zeitpunkt ist, an dem eine
Fermentation gestartet wurde.
Mit diesen korrigierten Zelldichte-Werten werden nach bevorzugten Ausführungs- formenn die korrigierten Biomasseflüsse berechnet. Dies hat den Vorteil dass
der Anteil inkonsistenter Flussverteilungen als Ergebnis der MFA deutlich reduziert werden.
Figur 2 zeigt beispielhaft den Prozess der Informationsgewinnung in mehreren Stadien unter Fieranziehung verschiedener Geräte und Datenquellen.
Zellen, deren metabolischer Zustand an einem zukünftigen Zeitpunkt vorhergesagt werden soll, werden in einem Bioreaktor 208 gehalten, zum Beispiel in einem Fed- Batch-Fermenter. Der Fermenter kann einige Sensoren beinhalten oder an diese operativ gekoppelt sein, zum Beispiel Sensoren zur Bestimmung der Zelldichte. Stattdessen oder zusätzlich dazu können regelmäßig Proben der Zellkultur entnommen und zu ein oder mehreren analytischen Geräten 250 überführt werden. Dort findet die Messung der Konzentration der extrazellulären Metaboliten statt. Die gemessene Zelldichte, die gemessenen extrazellulären Metabolitkonzentrationen sowie gegebenenfalls Zeitpunkt und Menge der externen Zufuhr von Metaboliten (z.B. Glukose-Boli) werden an ein Datenverarbeitungssystem 252 weitergeleitet. Dieses System 252 umfasst ein metabolisches Modell der Zelle sowie eine MLP, die zur Vorhersage von extrazellulären Flüssen basierend auf aktuell gemessenen Konzentrationen extrazellulären Metaboliten für den aktuell verwendeten Zelltyp trainiert wurde. Die Messwerte, die zu einem bestimmten Zeitpunkt empfangen und gemessen wurden, werden als Eingabe an die trainierte MLP übermittelt, welche daraufhin extrazellulären Flüsse an einem zukünftigen Zeitpunkt vorhersagt. Im Zuge einer anschließenden MFA werden anhand der extrazellulären Flüsse und der stöchiometrischen Gleichungen des Modells auch die intrazellulären Flüsse für den zukünftigen Zeitpunkt vorhergesagt. Das komplette Modell einschließlich der vorhergesagten extrazellulären und intrazellulären Flüsse kann als
„Schnappschuss“-Bild 254 des metabolischen Zustands einer Zelle über eine grafische Benutzeroberfläche ausgegeben und/oder gespeichert werden.
Falls der Bioreaktor 208 eine Trainings-Zellkultur beinhaltet, also eine Zellkultur, von welcher Daten über einen längeren Zeitraum regelmäßig erhoben werden um einen Trainingsdatensatz zu generieren, so ist das Datenverarbeitungssystem 252 zusätzlich dazu ausgebildet, anhand eines Plots der gemessenen Konzentrationen extrazellulären Metaboliten einen extrazellulären Fluss für das künftige Zeitintervall (also das Zeitintervall vom aktuellen Zeitpunkt bis zum nächsten Zeitpunkt, für welchen eine Vorhersage des metabolischen Zustands getroffen werden soll), zu berechnen und als Ausgabeparameterwert während des Trainings der MLP an diese zu übergeben.
Figur 3 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zelle, welches zur Überwachung und oder Kontrolle von ein oder mehreren Bioreaktoren verwendet werden kann.
Bei dem System 200 kann es sich um ein Datenverarbeitungssystem
verschiedensten Typs handeln. Beispielsweise kann es sich um eine Desktop- Computer, einen Server-Computer, ein Notebook oder ein portables Mobilfunkgerät eines Nutzers handeln. Bei dem System 200 kann es sich um ein Kontroll-Modul handeln, das Bestandteil eines Bioreaktors oder einer Bioreaktoranlage mit mehreren Bioreaktoren ist oder dass an einen solchen Bioreaktor oder eine solche Bioreaktoranlage gekoppelt ist. In der hier gezeigten Ausführungsform ist das System an drei Bioreaktoren 204, 206,208 gekoppelt und dazu konfiguriert, den metabolischen Zustand der Zellen in der jeweiligen Zellkultur in Echtzeit zu überwachen sowie für einen zukünftigen Zeitpunkt, zum Beispiel einen Zeitpunkt 12 Stunden oder 24 Stunden in der Zukunft, vorherzusagen. Jeder der Bioreaktoren kann über ein oder mehrere Messgeräte oder Sensoren zur Bestimmung der Zelldichte und/oder Metabolitkonzentration verfügen oder um einen Mechanismus, der eine Probename ermöglicht, sodass die Metabolitkonzentration durch andere Geräte durch Analyse der Probe vorgenommen werden können. Vorzugsweise verfügen die Bioreaktoren 204-208 über verschiedene Stelleinheiten wie zum
Beispiel Ventile, Pumpen, Dosiereinheiten für Boli, Rührer, etc. die an das System gekoppelt sind und gegebenenfalls Steuerbefehle von dem System empfangen und ausführen können.
Das System 200 beinhaltet ein oder mehrere Prozessoren 202 sowie eine erste Schnittstelle 210 zum Empfang von Messdaten von den ein oder mehreren
Bioreaktoren. Die Schnittstelle 210 kann als direkte Schnittstelle zu den
Bioreaktoren ausgebildet sein oder als eine Schnittstelle zu Analysegeräten, in welchen Proben von den Bioreaktoren analysiert werden, oder um eine grafische Benutzeroberfläche, die es einem Nutzer ermöglicht, die erhaltenen Messdaten manuell oder auf andere Weise einzugeben.
Außerdem umfasst das System 201 flüchtiges oder nichtflüchtiges Speichermedium 212 oder ist an dieses gekoppelt. Beim Speichermedium kann es sich zum Beispiel um Arbeitsspeicher, Festplatte, oder Speicher eines Clouddienstes oder um einen Netzwerkspeicher oder um Kombinationen der vorgenannten Speichertypen handeln. Das Speichermedium beinhaltet ein metabolisches Modell 214 der Zellen, die in den Bioreaktoren gehalten und vermehrt werden, zum Beispiel um ein Modell, wie es in Figur 4 abgebildet ist.
Das Speichermedium umfasst eine trainierte MLP 218, zum Beispiel ein trainiertes neuronales Netzwerk, welche dazu ausgebildet ist, ausgehend von den zu einem bestimmten Zeitpunkt empfangenen, gemessenen Konzentrationen mehrerer extrazellulären Metaboliten einen oder mehrere extrazellulären Flüsse an einem künftigen Zeitpunkt vorherzusagen.
Außerdem umfasst das Speichermedium eine Programlogik 220, die dazu ausgebildet ist, die empfangenen Messwerte an die MLP 218 zu übergeben um eine Vorhersage extrazellulären Flüsse durchzuführen. Außerdem ist die Programmlogik dazu ausgebildet, in Echtzeit eine metabolische Flussanalyse (MFA) basierend auf dem metabolischen Modell 214 und den vorhergesagten extrazellulären Flüssen durchzuführen, um für den künftigen Zeitpunkt intrazellulären Flüsse
vorherzusagen. Die Programmlogik 220 kann in einer beliebigen
Programmiersprache implementiert sein, z.B. C++, Java, Matlab oder in Form mehrerer Programmmodule in verschiedenen oder der selben Programmiersprache, die miteinander interoperabel sind.
Optional kann das Speichermedium mehrere Referenzwerte und
Referenzwertbereiche beinhalten. Diese Referenzwerte bzw. Referenzwertbereiche geben akzeptable oder wünschenswerte intrazellulärer Flüsse verschiedener intrazellulärer Metaboliten an. Durch Echtzeit-Abgleich der vorhergesagten intrazellulären Flüsse mit den Referenzwerten 216 kann die Programlogik 220 erkennen, ob die Zellen in einem oder mehreren der Bioreaktoren auf einen nicht wünschenswerten metabolischen Zustand zusteuern und gegebenenfalls
Gegenmaßnahmen durch Ausgabe von entsprechenden Steuerbefehlen, die dem vorhergesagten Trend entgegenwirken, an den jeweiligen Reaktor über eine zweite Schnittstelle 222 ergreifen. Alternativ oder ergänzend dazu kann in diesem Fall eine Warnung über eine Nutzerschnittstelle 224, zum Beispiel eine Anzeigevorrichtung, zum Beispiel ein LCD Display, an einen Nutzer erfolgen. Über die
Anzeigevorrichtung kann der Nutzer über die vorhergesagten extrazellulären und intrazellulären Flüsse informiert werden und auch über eventuell vorhergesagte Abweichungen dieser Flüsse von wünschenswerten Referenzbereichen.
Figur 5 zeigt die Berechnung intrazellulärer Flüsse an mehreren
aufeinanderfolgenden Zeitpunkten während des Betriebs eines Bioreaktors. Der obere Plot 502 zeigt ein Profil der Konzentration eines extrazellulären Metaboliten der an sechs Messpunkten (eine Messung pro Tag) ermittelt wurde. Der mittlere Plot 504 zeigt, dass eine trainierte MLP ausgehend von diesen Messwerten jeweils für einen künftigen Zeitpunkt ein oder mehrere extrazellulären Flüsse vorhersagt.
Ein Vergleich der Positionen der Punkte im oberen und mittleren Plot zeigt, dass die Zeitpunkte der Erhebung der Messdaten und die Zeitpunkte zu welchen die extrazellulären Flüsse jeweils vorhergesagt wurden ca. einen halben Tag
auseinanderliegen. D.h., wenn beispielsweise täglich um 12:00 Uhr mittags die Konzentrationen der extrazellulären Metaboliten gemessen werden, werden diese Daten verwendet, um die extrazellulären Flüsse um Mitternacht vorherzusagen. Der untere Plot 506 zeigt das durch Durchführung einer MFA an jeden dieser
zukünftigen Zeitpunkte die vorhergesagten extrazellulären Flüsse um vorhergesagte intrazellulärer Flüsse ergänzt wurden. Figur 6 zeigt verschiedene Flüsse, die in dem metabolischen Modell gemäß Figur 4 dargestellten sind. Die Flüsse wurden auf Basis der gemessenen Änderung der Metabolitkonzentrationen über ein Zeitintervall hinweg und der gemessenen
Zelldichte errechnet und zeigen, dass die Flüsse für verschiedene Metaboliten einen sehr unterschiedlichen und teils charakteristischen Verlauf haben.
Figur 7 illustriert den erfolgreichen Einsatz des Verfahrens zur Generierung biologischer Erkenntnisse. Der Plot des Glukose-Flusses links oben zeigt, dass im Profil des Glukoseflusses etwa bei Zeitpunkt 0,65 der Glukosefluss nahezu zum Erliegen kommt. Effekte dieses Glukosemangels lassen sich bei Alanin, Serien und Glycin beobachten: Alanin wird im Falle der Limitationen größeren Raten
aufgenommen, was wohl zur verstärkten Bereitstellung von Pyruvat dient. Zudem findet eine stärkere Konversion von Serin zu Glycin statt, die mit einer erhöhten Ammoniumbildung verbunden ist.
Ein Vergleich der Flussverläufe von Glukose und Produkt offenbart gewisse
Ähnlichkeiten: sowohl eine zwischenzeitliche Abnahme der Flüsse zu einem frühen Fermentationszeitpunkt, als auch ein späterer Einbruch, als kurzzeitig keine
Glukose mehr im Medium vorlag, ist in beiden Verläufen zu erkennen. Dieser Einbruch fehlt in den Produktflüssen der Fermenter ohne Glukose-Limitierung.
Ebenso sieht man den Effekt der Glucose-Boli, der die Sensitivität des
Glukoseflusses gegenüber der Glukosekonzentration im Medium zeigt, auch in der Produktbildung. Offensichtlich besteht ein sehr enger Zusammenhang zwischen diesen Flüssen. Am Ende der Fermentation war die Stoffmenge des Produkts in denjenigen Bioreaktoren ohne Glukose-Limitierung am höchsten. Die Verfügbarkeit von Glukose scheint demnach essenziell für eine effektive Produktbildung zu sein, ein Mangel sollte strikt vermieden werden.
Figur 8 illustriert einen weiteren erfolgreichen Einsatz des Verfahrens zur
Generierung biologischer Erkenntnisse.
Der sogenannte Laktatshift bezeichnet den beim der Kultivierung von Zellkulturen häufig beobachteten Effekt, dass der Laktatfluss das Vorzeichen vom Positiven ins Negative ändert. In der Literatur existieren zahlreiche Erklärungsversuche für den Laktatshift. Mulukutla et al. postulieren beispielsweise, dass der Laktatshift das Resultat von Regulationsmechanismen ist, die durch die zunehmende Laktatinhibition in Gang gesetzt werden. Diese biologische Hypothese wurde dadurch überprüft, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens der Laktat- Fluss in mehreren Bioreaktoren über mehrere Messungen hinweg ermittelt wurde und hierfür auch die extrazellulären Laktatkonzentrationen gemessen wurden. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Figur 9 für vier Bioreaktoren dargestellt. Es zeigte sich, dass an dem Zeitpunkt, an welchem eine Umkehr der netto- Flussrichtung des Laktat beobachtet wurde, die Laktatkonzentration in den verschiedenen Bioreaktoren unterschiedlich war. Der bis dahin in der Literatur postulierte Mechanismus scheint somit nicht verantwortlich für den Laktatshift zu sein. Vielmehr scheint es, als ob der Shift vom Glutaminstoffwechsel abhängt, wie dies in Abbildung 6.2 des Appendix gezeigt ist. Ein Vergleich der Verläufe von Glutaminkonzentrationen und Laktatflüssen in mehreren unterschiedlichen
Fermentertypen zeigt, dass der Laktatshift immer mit einem vollständigen
Verbrauch von Glutamin einhergeht.
Diese Beobachtung wurde auch schon einmal in der Literatur berichtet, wobei ein bestimmter CHO Klon beschrieben wurde, bei welchem der Shift erst dann eintrat, als Glukose aufgebraucht wurde (Zagari F, Jordan M, Stettier M, Broly H, Wurm FM (2013):„Lactate metabolism shift in CHO cell culture: the role of mitochondrial oxidative activity“, New Biotechnology, Vol.30, No. 2). Erfindungsgemäß ist es also möglich, durch die wiederholte Vorhersage intrazellulärer Flüsse und durch den Vergleich dieser Flüsse mit anderen intrazellulären Flüssen und/oder
Konzentrationen extrazellulärer Metaboliten Hypothesen bezüglich des
Zellstoffwechsels erfolgreich zu testen und gegebenenfalls zu verwerfen sowie metabolische Besonderheiten einzelner Zellklone zu identifizieren. Anhand der Analyseergebnisse liegt es nahe, dass der Großteil des gebildeten Laktats bei den gängigen CHO Klonen aus der Glutaminolyse stammt. Interessanterweise kommt nach dem Laktatshift die Glutaminolyse zunächst zum Erliegen: es findet keine Glutamin-Aufnahme mehr statt, vielmehr wird es in geringem Maße gebildet, wodurch seine Konzentration im Bioreaktor steigt. Die Zellen scheinen ihren Metabolismus nun ausschließlich auf das Substrat Glukose eingestellt zu haben. Auffällig ist, dass eine zweite Phase der Glutamin-Aufnahme beobachtet werden kann, sobald Glukose in sehr niedrige Konzentrationsbereiche gelangt. Zugleich ist auch eine kurze Phase erneuter Laktatproduktion zu erkennen. Figur 9 zeigt Plots mit Laktat-Flüssen und Glutamin-Konzentrationen von vier Bioreaktoren unterschiedlichen Typs, die einen Vergleich der Verläufe von
Glutamin-Konzentration und Laktat-Fluss in einer bestimmten Zellkultur erlaubt. Die Glutamin-Konzentrationen sind durch durchgezogene und die Laktat-Flüsse durch gepunktete Linien gekennzeichnet. Die Laktatflüsse und Konzentrationen der einzelnen Flüsse und Metaboliten wurden zuvor normalisiert um die
Vergleichbarkeit zu erhöhen. Die Pfeile geben jeweils eine Umkehr des Vorzeichens des Laktat-Flusses an.
Figur 10 zeigt Zeitverläufe intrazellulärer Flüsse an, wie diese mittels deskriptiver Modellierung durch MFA basierend auf dem metabolischen Modell jeweils für den aktuellen Zeitpunkt (also deskriptiv, nicht prädiktiv) errechnet wurden.
In Abschnitt 2.2.2 des Appendix sind verschiedene Methoden vorgestellt, um redundante metabolische Modelle zu behandeln. Für die Berechnung der Flüsse wurde das Optimierungsproblem Gleichung 2.9 im Appendix) gelöst und damit eine Weighted-Least-Squares-Lösung erhalten. Dadurch wurde zugelassen, dass die extrazellulären Flüsse, die durch die Lösung des Optimierungsproblems ermittelt werden, von den Flüssen abweichen, die aus den experimentellen Daten direkt berechnet wurden.
Gleichung (2.10) des Appendix diente zur Berechnung der extrazellulären, balancierten Flüsse, die intrazellulären wurden über die Gleichung (2.5) des
Appendix ermittelt, also
Zur Formulierung der Kovarianzmatrix werden vorzugsweise die Ergebnisse der Modellvalidierung mit einbezogen, die zeigten, welche Standardabweichungen zu einem weitgehend konsistenten Modell führten und welche Messwerte evtl, als unzuverlässig eingestuft werden sollten. Anschließend wurden die berechneten Flüsse visualisiert: Einerseits wurden ihre Zeitverläufe nach Metaboliten getrennt aufgetragen, andererseits wurde die gesamte Flussverteilung zu ausgewählten Zeitpunkten abgebildet.
Figur 11 zeigt Schnappschüsse intrazellulärer und extrazellulärer Flüsse an verschiedenen Zeitpunkten während der Kultivierung einer Zellkultur von CFIO Zellen.
Neben den Verläufen einzelner Stoffflüsse über die Zeit können auch
Schnappschüsse der gesamten intra- und extrazellulären Flussverteilung in den einzelnen Zeitintervallen betrachtet werden. In Abbildung 11 sind exemplarisch vier Stoffwechselzustände von Zellen aus der vierten Fed-Batch-Fermentation gezeigt. Sie stammen vom zweiten, elften, 14. und 21. Zeitintervall. Die vier Bilder zeigen Flussverteilungen während einer Fed-Batch-Fermentation. Als Referenz dient der Gluk39osefluss im zweiten Zeitintervall. Der Produktfluss wurde mit 10.000 multipliziert.
Im zweiten Zeitintervall, also in einer frühen Fermentationsphase (Phase I in der Einteilung, dargestellt in Fig. 11A, liegt Glucose noch im Überschuss vor, wird rasch in die Zellen transportiert und geht in den Citratzyklus ein. Auch Glutamin wird aufgenommen, es erfolgt die Konversion zu Glutamat und weiter zusammen mit Pyruvat über Fluss v_8 in Metaboliten des Citratzyklus und in Alanin. Laktat und Ammoniak werden in größeren Mengen in das Medium abgegeben.
Im elften Zeitintervall (Phase III), dargestellt in Figur 11 B, hat bereits der Laktatshift stattgefunden, d.h. Laktat wird aus dem Medium aufgenommen, zu Pyruvat verstoffwechselt und geht dann in den Citratzyklus ein. Der Glucose-Verbrauch ist reduziert, Glutamin wird nicht mehr aufgenommen. Es findet keine Ammonium- Abgabe mehr statt. Die Biomasseproduktion hat abgenommen, die Produktbildung dagegen ist angestiegen.
Im Vergleich zum Fermentationsbeginn läuft der Citratzyklus mit fast unveränderter Intensität ab, die anaplerotische Reaktion von Malat zu Pyruvat ist jedoch reduziert.
Im 14. Zeitintervall (ebenfalls Phase III), dargestellt in Figur 11C, ist die
Laktatkonzentration im Medium sehr niedrig, so dass auch die Aufnahme
eingeschränkt ist. Dafür wird Alanin aufgenommen und in Pyruvat umgesetzt. Ammonium wird wieder verstärkt in das Medium abgegeben. Die Produktbildung ist noch weiter angestiegen.
Gegen Ende der Fermentation (Phase IV), dargestellt in Figur 11 D, wird Glucose bolusartig zudosiert. Es findet daher wieder eine verstärkte Aufnahme statt, der Fluss durch den Citratzyklus ist besonders stark. Alle übrigen Reaktionen sind jedoch extrem reduziert.
Figur 12 zeigt den stark korrelierenden Verlauf intrazellulärer Flüsse, die zum einen mittels deskriptiver MFA für den aktuellen Zeitpunkt errechnet wurden und zum anderen mittels einer Kombination aus MLP und MFA für einen in der Zukunft liegenden Zeitpunkt vorhergesagt wurden. Eine„deskriptiver MFA für den aktuellen Zeitpunkt“ errechnet die extrazellulären Flüsse des metabolischen Modells aus den gemessenen Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metaboliten über das gerade vergangene Zeitintervall und verwendet diese extrazellulären Flüsse als Eingabe für die MFA um die intrazellulären Flüsse zu berechnen für den aktuellen Zeitpunkt. Die„prädiktive“ Ermittlung der intrazellulären Flüsse beruht dagegen darauf, mittels der trainierten MLP extrazellulärer Flüsse für den künftigen Zeitpunkt vorherzusagen und die so vorhergesagten extrazellulären Flüsse als Eingabe für die NSA zu verwenden, um die intrazellulären Flüsse an dem zukünftigen Zeitpunkt vorherzusagen.
Figur 13 zeigt einige der extrazellulären Metaboliten, deren Konzentrationen als Eingabewerte zur Vorhersage extrazellulärer Flüsse verwendet werden.
Für jeden extrazellulären Metabolitfluss (angegeben in der obersten Tabellenzeile), der vom trainierten MLP einmal vorhergesagt werden soll, und die beim Training als Ausgangsparameterwerte übergeben werden, sind in der darunterliegenden Spalte die Input-Metaboliten in absteigender Relevanz für die Schätzung des Flusses der „Ausgangs-Metaboliten“ aufgelistet. Bio“ bezeichnet hierbei die gemessene
Biomasse, die vorzugsweise in Form einer Zelldichte spezifiziert ist, und„TZD“ den um die LDH-Konzentration korrigierten Wert. Der PMI-Berechnung, die zur
Bestimmung dieser Relevanz durchgeführt wird, werden vorzugswiese die Werte aus allen durchgeführten Trainings-Fermentationen zugrunde gelegt. Zudem enthält die Tabelle die Ergebnisse der Kreuzvalidierung, bei der die Anzahl an Eingabevariablen, die an versteckten Variablen H und die Iterationszahl bestimmt wurde. Die Input-Metaboliten 1504, deren Konzentrationen als
Eingabeparameterwerte in das neuronale Netz eingehen, sind gelb unterlegt.
Als Trainingsdatensatz dienten dabei die Werte aus mehreren (z.B. 3) Fed-Batch- Fermentation, sowie die aus einem Batch-Ansatz. Die aus weiteren Fermentern mit dem gleichen Zelltyp gewonnenen Daten bildeten den Testdatensatz. Zusätzlich können Kreuzvalidierungen mit anderen Trainings-/Test-datensatz Aufteilungen durchgeführt werden.
Die in der Tabelle gezeigte Auflistung entspricht allerdings nicht zwingend einer vom biologischen Gesichtspunkt her intuitiven Ordnung: beispielsweise hat hier die Glukosekonzentration eine untergeordnete Rolle, obgleich es naheliegend wäre, dass das wichtigste Substrat der CFIO-Zellen einen großen Einfluss auf manche Stoffschlüsse hat. Allerdings besitzt die anhand der nachfolgend beschriebenen, PMI-basierten Anordnung nur eine eingeschränkte biologische Aussagekraft, was vor allem auf folgenden Sachverhalt zurückgeführt werden kann: die Verläufe der Metabolitkonzentrationen sind in gewissem Maße über den Stoffwechsel
miteinander korreliert. Daher ist es möglich, dass nach Auswahl eines Metaboliten viele andere an Relevanz für die Schätzung verlieren, da ein Großteil der in ihnen enthaltenen Informationen bereits durch den ersten Metaboliten beschrieben ist. Der ausgewählte Metabolit ist aber möglicherweise nicht derjenige, der mechanistisch gesehen tatsächlich einen Einfluss auf den Stoffstrom hat, sondern ist nur stark mit diesem korreliert. Tatsächlich konnte beobachtet werden, dass sich bei einer Probe weißen Änderung der Datenauswahl, mit der die PMI-Werte berechnet wurden, zum Teil andere Anordnungen ergaben. Hierbei waren in einigen Fällen beispielsweise die Position von Glutamat und Glutamin vertauscht, die über den Stoffwechsel eng miteinander verbunden sind. Doch eine auf biologische Intuition basierende, heutige Selektion, wie sie in manchen Publikationen vorgenommen wurde, wurden teilweise wesentlich schlechtere Vorhersagen erzielt. Dies kann daran liegen, dass die biologischen Zusammenhänge oft nicht immer bekannt sind und das redundante Informationen ausgewählt werden. Zudem kostet das Literaturstudium zur Auswahl geeigneter Eingabeparameterwerte basierend auf mutmaßlicher biologischer Relevanz viel Zeit. Zunächst wurden für jeden Metabolitfluss die potentiellen Eingaben mithilfe der partiellen Transinformation (Partial Mutual Information (PMI), siehe Gleichung 2.19 im Appendix) nach ihrer Relevanz geordnet. Die PMI wurde mittels der
Diskretisierung gemäß Gleichung 2.22 im Appendix) errechnet. Der verwendete Kerndichteschätzer basiert auf City-Block-Funktion, für die Berechnung der
Residuen wurde der Nadaraya-Watson-Schätzer (siehe Gleichung 2.27 im
Appendix) herangezogen. Hierzu wurde ein Trainingsdatensatz verwendet. Dieser kann beispielsweise wie im vorliegenden Fall die Messdaten von 8
Zellkulturprojekten in 8 verschiedenen Bioreaktoren umfassen. Die Ordnung der Eingaben zur Schätzung des j-ten extrazellulären Metabolitflusses wurde nach folgendem Algorithmus durchgeführt:
1. Fasse in der Menge alle potentiellen Eingangsgrößen zusammen, hier also alle aktuellen Konzentrationen extrazellulärer Metabolite. Die Menge enthalte alle bereits ausgewählten Eingangsvariablen (sie ist zu Beginn leer). sei die Ausgangsvariable, also der j-te extrazelluläre Metabolitfluss zwischen dem aktuellen und dem zukünftigen Probenahmezeitpunkt.
2. Berechne eine Näherung für die partielle Transinformation zwischen jeder
potentiellen Eingangsgröße in und ^ unter Berücksichtigung der Elemente in
anhand des gegebenen, standardisierten Datensatzes. Durch die
Standardisierung hatten z.B. alle Eingangsvariablen und die Ausgangsvariable den Mittelwert 0 und die Standardabweichung 0,5. Dadurch wurden verzerrende Effekte auf die Relevanz der Größen aufgrund unterschiedlicher
Größenordnungen eliminiert. Vorzugsweise wird diese Standardisierung vor dem Training des neuronalen Netzes bezüglich der Messwerte des
Trainingsdatensatzes als auch bei der Eingabe aktueller Messwerte im
Testverfahren unter Einsatz einer trainierten MLP bezüglich der aktuell erhaltenen Messwerte durchgeführt.
3. Notiere die Variable in die den größten PMI-Wert besitzt. Füge sie zu hinzu und entferne sie aus
4. Wiederhole die Schritte 2. und 3., bis L leer ist.
Nach Ausführungsformen der Erfindung wird die PMI für den Parameter X, z.B. ein bestimmter extrazellulärer Metabolit, im Hinblick auf den Parameter Y, z.B. ein weiterer extrazellulärer Metabolit, wie folgt berechnet:
und
Dabei ist g die Dichtefunktion der marginalen bzw. gemeinsamen Verteilungen. Die Residuen beinhalten lediglich die Informationen von X und Y,die noch nicht in U enthalten sind. Je größer der Wert für G ist, desto stärker ist die Abhängigkeit.
Eine approximative, diskrete Version von Ausdruck 2.19) lautet:
Paare von Stichproben der X und Y und die zugehörigen, -verteilten Residuenpaare sind. Die im
Regelfall unbekannten Dichtefunktionen können wiederum über Kerndichteschätzer approximiert werden, die ebenfalls Informationen aus den N Stichproben nutzen. Diese Schätzer liefern -- vereinfacht ausgedrückt - eine stetige Dichtefunktion, die in ihrem Verlauf dem Histogramm der Stichproben ähnelt. Sie entsteht durch eine gewichtete Superposition von N Kernfunktionen. Diese sind ihrerseits
Dichtefunktionen, die glockenförmig und symmetrisch um je einen der
Stichprobenwerte sind. Unter anderem wurden in Publikationen bisher der Gaußkern und die City-Block- Funktion zur Berechnung der PMI verwendet.
In allgemeiner Formulierung lautet die Schätzung der Dichte eines q-dimensionalen
Zufallsvektors X mit den Stichproben unter Verwendung der
Kernfunktion mit Bandbreite m:
Mit der City-Block-Funktion als Kernfunktion ergibt sich daraus:
Die gemeinsame Dichteverteilung zweier Zufallsvektoren X und Y lässt sich unter Verwendung eines Schätzers mit Produktkern
Die Wahl der Bandbreite hat einen maßgeblichen Einfluss auf die Qualität der Schätzung. Je größer die Bandbreite, desto glatter, aber auch undetaillierter ist die Dichteapproximation. In mehreren Studien und vorliegend hat sich die Wahl als erfolgreich erwiesen.
Für die Berechnung der Redundanzen nach den Gleichungen 2.20 und 2.21 muss allgemein der bedingte Erwartungswert für zwei Zufallsvektoren X und U abgeschätzt werden. Hierfür kann der Nadaraya-Watson-Schätzer herangezogen werden. Dieser basiert auf den vorher angewandten Prinzipien und lässt sich folgendermaßen herleiten:
Im approximativen Schritt wurden die Dichten über Kerndichteschätzer angenähert. Das letzte Gleichheitszeichen ergibt sich aus der Tatsache, dass
ist.
Nach Ausführungsformen der Erfindung wird die Auswahl nach dem Prinzip eines Wrappers vollzogen: Für jede Ausgangsvariable wurden 70 Netze mit den 1 bis 7 (laut PMI) relevantesten Eingängen und mit 1 bis 10 versteckten Neuronen trainiert in zunächst 1000 Iterationen. Hierzu wurde ein Trainingsdatensatz aus einem Teil des gesamten Trainingsdatensatzes, der aus den 8 überwachten Trainings- Fermentationen gebildet. Die übrigen Daten dienten als Testdaten. Es wurde bei jedem Training der Wert des Testfehlers £· über die Anzahl der Iterationen aufgezeichnet und sein Minimalwert, sowie die zugehörige Iterationszahl wurden bestimmt. Anschließend erfolgte der Vergleich der 70 Netze anhand des insgesamt minimalen Testfehlers. Daraus ergab sich die Festlegung der Kombination der Eingangsvariablen zur Schätzung des jeweiligen Metabolitflusses, sowie die entsprechende Iterationszahl und die Anzahl an versteckten Neuronen.
Die Liste der ausgewählten Eingangsparameterwerte, hier auch als„Eingaben“ oder „Eingangsgrößen“ bezeichnet, für verschiedene Ausgabeparameterwerte
(„Ausgaben“,„Ausgangsgrößen“) ist in Figur 13 entsprechend gekennzeichnet.
Nach bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Auswahl derjenigen
extrazellulären Metaboliten, deren Konzentration als Eingabeparameterwerte für das Trainieren bzw. Füttern der trainierten MLP verwendet werden sollen („Input- Metabolite“), nach rein statistischen Kriterien, und zwar individuell für jeden Output- Metaboliten, d.h., individuell für jeden extrazellulären Fluss, der vorhergesagt werden soll.
1. Ordnung der Input-Metaboliten nach ihrer„Relevanz“:
Zunächst werden alle messtechnisch zur Verfügung stehenden Input-Metaboliten oder zumindest alle Metaboliten, die im metabolischen Modell als extrazelluläre Metaboliten Vorkommen, in eine„erste Menge“ überführt und nach ihrer Relevanz geordnet: Es wird anhand des PMI-Kriteriums bestimmt, welcher Metabolit die größte Aussage-A/orhersagekraft für den Output (Rate des extrazellulären
Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll -„Output- Metaboliten“) hat. Dieser Metabolit wird in eine„zweite Menge“ übernommen, die dann die tatsächlichen Eingabeparameterwerte stellt. Die in diesem ersten
Sortierschritt bestimmte„Relevanz“ bzw. prädiktive Kraft hängt noch nicht von den in der zweiten Menge befindlichen Metaboliten ab.
2. Bestimmung der tatsächlichen Input-Metaboliten:
Vorzugsweise werden nicht alle Input-Metaboliten als Input beim Training der MLP bzw. bei der Anwendung der MLP verwendet (dies führt aufgrund von Overfitting zu sehr schlechter Vorhersagekraft). Es wird daher bestimmt, wie viele der
relevantesten Input-Metaboliten verwendet werden sollen. Hierzu wird die Vorhersagekraft der„x“ relevantesten Input-Metaboliten anhand eines Testdatensatzes bestimmt, x wird dabei variiert, und anschließend wird die Zahl x mit der besten Vorhersagekraft gewählt.
Nach dem ersten Sortierschritt und der Übertragung des relevantesten Metaboliten von der ersten in die„zweite Menge“ der tatsächlichen Input-Metaboliten (deren Konzentration die Eingabeparameter der MLP stellen) wird wiederholt derjenige Input-Metabolit innerhalb der in der ersten Menge verbliebenen Metaboliten identifiziert, der die größte Vorhersagekraft im Hinblick auf den Fluss eines bestimmten Ausgabemetaboliten besitzt, wobei der Inhalt der zweiten Menge berücksichtigt wird. Korreliert das Konzentrationsprofil des Metaboliten mit der höchsten prädiktiven Relevanz innerhalb der verbliebenen Mitglieder der ersten Menge stark mit einem Metaboliten, der schon in der zweiten Menge enthalten ist, wird dieser Metabolit in der Regel nicht in die zweite Menge überführt, da zwar dessen prädiktive Kraft hoch sein mag, sein Konzentrationsprofil jedoch keinen nennenswerten Beitrag über den eines schon in der zweiten Menge befindlichen Metaboliten liefert. Vielmehr würde seine Aufnahme nur den Anteil redundanter Information in der zweiten Menge erhöhen. Falls also der Metabolit in der ersten Menge aus diesen Gründen nicht in die zweite Menge aufgenommen kann, wird der Metabolit mit dem nächsthöchsten Relevanz-Score der ersten Menge, der nicht zu einer übermäßigen Erhöhung der Redundanz des Informationsgehalts der
Konzentrationsprofile der Metaboliten der zweiten Menge führt, von der ersten in die zweite Menge überführt.
Ein Metaboliten kann also sehr aussagekräftig für die Rate des Outputs eines bestimmten Ausgabe-Metaboliten sein, ohne dass dieser in die zweite Menge übernommen wird. Eine Übernahme kann insbesondere dann unterbleiben, wenn das Konzentrationsprofil dieses Metaboliten sehr stark korreliert mit dem eines Metaboliten, der schon in der zweiten Menge enthalten ist, sodass es genügt, nur einen der beiden bzw. dessen Konzentrationen als Eingabeparameterwert beim Training der MLP und später auch beim Einsatz der trainierten MLP zu verwenden. D.h. wählt man einen der beiden als "relevant" aus, verliert der andere seine
Bedeutung. Dies wird vom PMI-Kriterium erkannt). So fährt man fort, bis alle im Hinblick auf ihre Vorhersagekraft relevanten und hinreichend voneinander unabhängigen Input-Metaboliten in die zweite Menge aufgenommen wurden. Beispielsweise hat sich im Falle des Glu-Flusses (4. Spalte in der in Figur 13 dargestellten Tabelle) herausgestellt, dass mit der Information über die aktuelle Biomasse und der aktuellen Glycin-Konzentration bessere Vorhersagen getroffen werden können, als wenn man nur Biomasse als Input verwendet (zu wenig
Information), oder als wenn man zusätzlich Informationen über Glutamin, Aspartat etc. in das neuronale Netz einspeist (zu viel Information, Overfitting).
Figur 14 zeigt ein Histogramm der erhaltenen„Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung“ (Root Mean Square Error - RMSE) für intrazelluläre Flüsse, die für mehrere Fed-Batch-Fermentationsläufe erhalten wurden: Es wurden 12 Fed-Batch Reaktoren angesetzt, die jeweils einen CHO Zellklon beinhalteten, der sich von den Zellklonen der 11 anderen Reaktoren unterschied. Die 12 Zellklone wurden genetisch so verändert, dass alle 12 Klone das gleiche Produkt hersteilen, nämlich einen bispezifischen Antikörper. Obwohl die gleiche DNA-Sequenz bei der
Transfektion zur Erzeugung der Klone verwendet wurde, weisen die Klone aufgrund unterschiedlicher Insertionsloki und/oder unterschiedlicher Kopienzahl der integrierten DNA-Sequenzen metabolische Unterschiede auf. 10 Fed-Batches wurden für das Training des MLP (hier: ein neuronales Netzwerkmodell) verwendet, zwei Fed-Batches für den Test des Modells. Diese beiden Fed-Batches wurden für die RMSE-Berechnungen verwendet.
Die RMSE für die intrazellulären Flüsse werden berechnet aus einer Differenz der mittels einer Kombination aus MLP und MFA vorhergesagten intrazellulären Flüssen und intrazellulären Flüssen, welche sich aus gemessenen extrazellulären Flüssen berechnen lassen. RMSE ist niemals negativ, ein Wert von 0 (in der Praxis fast nie erreicht) würde eine perfekte Passung der vorhergesagten an die gemessenen Daten anzeigen. Im Allgemeinen ist eine niedrigere RMSE besser als eine höhere. RMSE ist die Quadratwurzel des Durchschnitts der quadrierten Fehler. Die
Auswirkung jedes Fehlers auf RMSE ist proportional zur Größe des quadrierten Fehlers; größere Fehler haben also einen unverhältnismäßig großen Einfluss auf RMSE.
Die gleiche Art von Medium und die gleichen Nährlösungen wurden für die 12 Fed- Batch-Reaktoren zur Herstellung des bispezifischen Antikörpers verwendet. Das Medium und die Nährlösungen unterschieden sich jedoch von dem Medium und den Nährlösungen für die Bioreaktoren bzw. Zellkulturen, deren metabolischer
Fußabdruck in Figur 5.9 des Appendix dargestellt ist.
Die MLP, hier ein neuronales Netz (NN) wurde auf den neuen Datensatz rekalibriert, d.h. das NN, welches bereits einmal auf Daten trainiert wurde, die von den in Figur 5.9 des Appendix dargestellten Bioreaktoren erhalten wurden, wurde„umtrainiert“ bzw. neu trainiert auf Daten aus den 12 fed-batch Reaktoren zur - Produktion des bispezifischen Antikörpers. Die Modelle wurden in Python mit Hilfe der
Maschinenbibliothek - Scikit learn - erstellt. Die Hyperparameter verschiedener NN- Modelle wurden mit Hilfe einer Rastersuchfunktion optimiert. Modelle und
Hyperparameter, die am besten zu den Daten passten, wurden gespeichert und in Form eines„neutrainierten“ NNs für künftige Vorhersagen extrazellulärer wie intrazellulärer Flüsse der Zellkulturen in den 12 Bioreaktoren verwendet.
Figur 15 zeigt ein Histogramm der erhaltenen RMSE für extrazelluläre Flüsse, die für die in Figur 14 erwähnten 12 Fed-Batch-Fermentationsläufen erhalten wurden. Alle RMSE-Werte werden auf den für den Metabolit Glukose erhaltenen Fehler normiert. Die RMSE-Werte für extrazelluläre Flüsse werden berechnet aus einer Differenz zwischen gemessenen externen Flüsse und extrazellulären Flüssen, die von einer Kombination aus MLP, insb. einem neuronalen Netzwerk, und MFA vorhergesagt wurden.
Es konnte beobachtet werden, dass die RMSEs sowohl der intrazellulären wie der extrazellulären Flüsse, die für die 12 fed-batch Reaktoren zur Produktion des bispezifischen Antikörpers erhalten wurden, im gleichen Bereich lagen wie die RMSEs die für andere Zellkulturen bzw. andere Zellklone erhalten wurden (siehe Masterarbeit -„Appendix“ - Seite 67, Abbildung 5.9, bei dem Proteinprodukt dieser Zellkultur handelt es sich um ein Antikörper-Fusionsprotein . Bei den 12 Zellkulturen handelt es sich um CHO Zellkulturen. Die RMSE der externen und internen Flüsse (gemessen an den vorhergesagten) lagen zwischen 10-35%.
Figur 16 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten extrazellulären Metabolitflüsse (schwarze Linie) mit zwei für zwei identische Zellklone in unterschiedlichen
Bioreaktoren (fed-batch und split batch Bioreaktor) gemessenen extrazellulären Metabolitflüsse (zwei graue Linien) für verschiedene Metabolite (Aminosäuren). Bei dem Zellklon in beiden Bioreaktoren handelt es sich rekombinante CHO-Zellen (monoklonal), welche ein bestimmtes Antikörper-Fusionsprotein synthetisieren. Die Kurvenverläufe zeigen, dass das Verfahren gemäß Ausführungsformen der
Erfindung dazu in der Lage ist, die Flüsse extrazellulärer Metaboliten sowohl für fed batch (fb) als auch split batch (b) sehr exakt vorherzusagen. Im Detail zeigt Figur 16 einen Vergleich der extrazellulären gemessenen Flüsse mit den vorhergesagten extrazellulären Flüssen und zwar in unterschiedlichen Kombinationen
Trainingsdaten-/Testdatensatz. Der Ausdruck„fb/fb+b“ heißt fed-batch Datensatz als Trainingsdaten und fed-batch +batch als Testdatensatz. Dargestellt ist dann jeweils ein Lauf aus dem Testdatensatz.
Figur 17 zeigt mehrere Plots mit je zwei Kurven, die alle für einen fed batch
Bioreaktor mit einem Zellklon zur Herstellung des Antikörper-Fusionsproteins erhalten wurden. Die aus gepunkteten Linien bestehenden Kurven
(„beschreibende MFA“) wurden dadurch erhalten, dass gemessene Konzentrationen extrazellulärer Metabolite als Input einer metabolischen Flussanalyse (MFA) verwendet wurden, um verschiedene extrazelluläre Flüsse, die jeweils in einem der 11 Plots entsprechen, zu berechnen. Die aus durchgezogenen Linien bestehenden Kurven („NN-MFA“) wurden dadurch erhalten, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt tO gemessene Konzentrationen extrazellulärer Metabolite als Input einer MLP (z.B. NN) verwendet wurden, um extrazelluläre Flüsse an einem künftigen Zeitpunkt t1 vorherzusagen, und diese künftigen vorhergesagten extrazellulären Flüsse als Input für die metabolische Flussanalyse (MFA) verwendet wurden. Ein Vergleich der beiden Kurven jedes der 11 Plots zeigt also, dass die mittels MLP + MFA für einen zu einem künftigen Zeitpunkt vorhergesagten Werte eine sehr hohe
Übereinstimmung haben mit Werten, die man mit einem statischen MFA Modell unter Verwendung gemessener Jetzt-Zeit Konzentrationen von extrazellulären Metaboliten erhält.
Figur 18 zeigt mehrere Plots mit je zwei Kurven, die alle für einen fed batch
Bioreaktor mit einem ersten Zellklon ZK1 zur Herstellung eines bispezifischen Antikörpers erhalten wurden. Die aus gepunkteten Linien bestehenden Kurven („NN + Beschreibende MFA extrazellulär“) wurden dadurch erhalten, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt tO gemessene Flüsse extrazellulärer Metabolite als Input einer MLP (z.B. NN) verwendet wurden, um extrazelluläre Flüsse an einem künftigen Zeitpunkt t1 vorherzusagen, und diese künftigen vorhergesagten extrazellulären Flüsse als Input für die metabolische Flussanalyse (MFA) verwendet wurden. Die aus durchgestrichenen Linien bestehenden Kurven („Beschreibende MFA extrazellulär“) wurden dadurch gewonnen, dass aktuell gemessene
extrazelluläre Flüsse extrazellulärer Metabolite als Input einer metabolischen Flussanalyse (MFA) verwendet wurden, um verschiedene extrazelluläre Flüsse, die jeweils in einem der in Figur 18 dargestellten Plots entsprechen, zu berechnen. Die extrazellulären Flüsse wurden für jeden Plot und für jeden Tag normalisiert bezüglich der Konzentration von Glukose. Hier wurden also anstatt gemessener extrazellulärer Metabolitkonzentrationen aktuelle extrazelluläre Flüsse, die auf Basis der aktuell und an einem in der Vergangenheit liegenden Zeitpunkt gemessenen Metabolitkonzentrationen berechnet wurden, als MLP Eingabe verwendet. Es wurde also eine Metabolitkonzentration im weiteren Sinne als Eingabe verwendet. Es wurde beobachtet, dass wenn alternativ die gemessenen Metabolitkonzentrationen als Eingabe verwendet werden, die Vorhersageergebnisse der MLP letztlich im Wesentlichen identisch waren. Es können also letztlich gemessene Konzentrationen im engeren Sinne wie auch Metabolitkonzentrationen im Weiteren Sinne
gleichermaßen als Eingabe der MLP dienen.
Ein Vergleich der beiden Kurven jedes der Plots der Figur 18 zeigt also, dass die mittels MLP + MFA für einen zu einem künftigen Zeitpunkt vorhergesagten Werte eine gute Übereinstimmung haben mit Werten, die man mit einem statischen MFA Modell unter Verwendung gemessener Jetzt-Zeit Konzentrationen von
extrazellulären Metaboliten erhält. Abweichungen im Einzelnen sind jedoch möglich.
Die Plots in Figur 18 vergleichen a) den Fortschritt der gemessenen
(extrazellulären) Flüsse mit ihren von der MLP vorhergesagten Gegenstücken. Alle Flüsse werden als normalisierte Werte ausgedrückt - normiert auf den gemessenen Glukosefluss. Deshalb ist der Glukosefluss immer bei 1 (nicht als Plot abgebildet); und b) den Fortschritt der von MFA berechneten internen Flüsse aus gemessenen externen Flüssen mit den von MFA berechneten internen Flüssen aus den von NN berechneten externen Flüssen. Auch hier werden alle Flussmittel gegen den
Glukosefluss normiert.
Für einzelne Metaboliten wichen die gemessenen von den vorhergesagten Flüssen vereinzelt ab. Zum einen ist hier aber zu beachten, dass die Skalierung aufgrund der Glukosenormierung einer sehr hohen„Auflösung“ entspricht und die Abweichungen unter Berücksichtigung der Gesamtmenge des Metabolits eher gering waren. Außerdem wurde eine gewisse Tendenz der Daten zum Overfitting beobachtet, was durch Vergrößerung des Datensatzes in der Regel behebbar ist.
Die für 11 unterschiedliche extrazelluläre Flüsse generierten Plots der Figur 18 stellen einen„metabolischen Fingerabdruck“ des Zellklons ZK1 dar. Im Folgenden soll gezeigt werden, dass dieser Fingerabdruck deutlich von dem anderer Zellklone, die das gleiche Produkt (bispezifischer Antikörper hersteilen, die aber die das Protein kodierende Sequenz in abweichender Kopienzahl oder an einer anderen Stelle im Genom beinhalten, abweichen kann.
Figur 19 zeigt mehrere Plots mit je zwei Kurven, die alle für einen anderen fed batch Bioreaktor BR2 mit einem zweiten Zellklon ZK2 zur Fierstellung des
bispezifischen Antikörpers erhalten wurden. Die Kurven wurden so ermittelt wie bereits für Figur 18 beschrieben, aber basierend auf Daten des zweiten Zellklons ZK2. Die in den Figuren 18 und 19 gezeigten Plots beziehen sich auf die Daten zweier Bioreaktoren BR1 , BR2, die mit dem gleichen Typ Medium und mit der gleichen Nährlösung betrieben wurden und die sich im Wesentlichen nur
dahingehend unterscheiden, dass in den beiden Bioreaktoren unterschiedliche Zellklone ZK1 und ZK2 gehalten werden, die zwar beide das gleiche Produkt (bispezifischer Antikörper) synthetisieren, jedoch in genetischer Hinsicht
Unterschiede aufweisen, die sich auch auf den Metabolismus der Klone auswirken können: Die Klone können beispielsweise mit einem Verfahren erzeugt worden sein, das keine vollständige Kontrolle über die Position der Integration eines neuen DNA- Sequenzabschnitts in das Genom der Zellen und/oder über die Zahl der integrierten Sequenzabschnitte bietet. Obwohl also die verwendeten Ausgangszeilen genetisch identisch sind, können im Zuge der Integration neuer Gene oder DNA-Sequenzen (z.B. im Falle einer random Integration im Zuge einer Transfektion) die
Gensequenzen für die leichte Kette (LC) und die schwere Kette (FIC) des
bispezifischen Antikörpers in unterschiedlichen Kopienzahlen und verschiedenen Genomloci inseriert werden. Dies wiederum kann metabolischen Unterschiede und auch Unterschiede in der Produktivität und Vitalität eines bestimmten Zellklons bewirken, welche gemäß Ausführungsformen der Erfindung durch die metabolische Vorhersage mittels einer Kombination aus MLP und MFA gut erkennbar und differenzierbar sind. Der zweite Bioreaktor BR2 war baugleich dem Bioreaktor BR1 , der für die Zellkultur des Klons ZK1 verwendet wurde.
Die Figuren 18 und 19 zeigen jeweils für einen bestimmten Zellklon ZK1 , ZK2, dass die Kombination eines neuronalen Netzwerks NN und einer Metabolischen
Flussanalyse MFA zu anderen und letztlich akkurateren Vorhersagen kommt als eine rein auf eine MFA und die aktuelle ist-Zeit bezogene Vorhersage extrazellulärer Flüsse. Zusätzlich hat diese Kombination den Vorteil, dass die Qualität der
Vorhersage durch die gemessenen Konzentrationen der extrazellulären Flüsse immer wieder verifizierbar sind. Eine direkte Vorhersage der intrazellulären Flüssen würde nur eine Überprüfung mit 13C-gelabelten Metaboliten ermöglichen, was insbesondere für den Flochdurchsatz oder gar für Produktionsfermentationen weder praktikabel noch wirtschaftlich ist. Außerdem stellt eine für einen bestimmten Zellklon ZK1 , ZK2 berechnete Menge an vorhergesagten extrazellulären Flüssen wie z.B. in Figur 18 für ZK1 und in Figur 19 für ZK2 dargestellt, einen
„metabolischen Fingerabdruck“ eines bestimmten Zellklons dar. Dieser kann analysiert werden, um einzelne Zellklone zu identifizieren, die im Hinblick auf einen bestimmten Parameter wie z.B. Wachstumsgeschwindigkeit, Geschwindigkeit des Ammoniakabbaus, der Geschwindigkeit der Herstellung von Serin etc. besonders vorteilhaft erscheinen. Die Metabolischen„Fingerabdrücke“ können auch verwendet werden, um zwei oder mehr verschiedene Zellklone im Hinblick auf ihre
metabolische Ähnlichkeit auszuwählen oder zu charakterisieren.
Figur 20 zeigt mehrere Plots mit je zwei Kurven, die alle für den Bioreaktor BR1 mit dem Zellklon ZK1 erhalten wurden und welche jeweils berechnete intrazelluläre Flüsse darstellen. Figur 20 entspricht also Figur 18 mit dem Unterschied, dass die berechneten intrazellulären statt der berechneten extrazellulären Flüsse dargestellt werden.
Figur 21 zeigt mehrere Plots mit je zwei Kurven, die alle für den Bioreaktor BR2 mit dem Zellklon ZK2 erhalten wurden und welche jeweils berechnete intrazelluläre Flüsse darstellen. Figur 21 entspricht also Figur 19 mit dem Unterschied, dass die berechneten intrazellulären statt der berechneten extrazellulären Flüsse dargestellt werden. Die Gesamtheit der Plots in Figur 19 bzw. 21 stellt also einen
metabolischen Fingerabdruck dar, welcher zur metabolischen Charakterisierung eines Zellklons verwendet werden kann. Durch das Sammeln von Daten einer Vielzahl dieser„Fingerabdrücke“ für eine Vielzahl unterschiedlicher Klone und Fermentationsbedingungen und eine Erfassung der Vitalität und/oder Produktivität der einzelnen Klone ist es möglich, z.B. mittels Korrelationsanalysen, vorteilhafte metabolische Fingerabdrücke zu erkennen und diese als vorteilhaft erkannten metabolischen Fingerabdrücke als Referenzwert zu verwenden, um bei künftigen Klonierungen vorteilhafte Klone zu erkennen und für ein Fermentationsprojekt auszuwählen.
Liste der Bezugszeichen

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps, umfassend:
- Bereitstellung (102) eines metabolischen Modells (402) einer Zelle des
bestimmten Zelltyps, wobei das metabolische Modell eine Vielzahl von intrazellulären und extrazellulären Metaboliten sowie eine Vielzahl von intrazellulären (410) und extrazellulären (408) Flüssen beinhaltet, wobei das metabolische Modell stöchiometrische Gleichungen umfasst die mindestens eine stöchiometrische Beziehung zwischen einem der intrazellulären (406) und einem der extrazellulären (404) Metaboliten spezifizieren;
- an jedem von einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung der Zellkultur:
o Empfang (106) mehrerer an diesem Zeitpunkt gemessener Messwerte, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der Zellkultur umfassen;
o Eingabe (108) der empfangenen Messwerte als
Eingabeparameterwerte in eine trainierte Machinelearning- Programmlogik - MLP - (218);
o Vorhersage (110) von extrazellulären Flüssen (408) der extrazellulären Metaboliten an einem Zukunftszeitpunkt durch die MLP unter
Verwendung der empfangenen Messwerte, wobei der
Zukunftszeitpunkt ein dem Zeitpunkt des Empfangs der Messwerte nachfolgender Zeitpunkt ist, wobei die extrazellulären Flüsse
Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in eine Zelle und/oder Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten von einer Zelle in das Medium sind;
o Durchführung (112) einer metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der intrazellulären Flüsse an dem Zukunftszeitpunkt unter Verwendung der vorhergesagten extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , ferner umfassend eine Erzeugung der MLP durch maschinelles Lernen, wobei die Erzeugung umfasst:
- Erzeugung eines Trainingsdatensatzes, wobei die Erzeugung umfasst:
o an jedem von einer Vielzahl von Trainings-Zeitpunkten während der Kultivierung von zumindest einer Trainings-Zellkultur von Zellen des bestimmten Zelltyps:
■ Empfang mehrerer an diesem Trainings-Zeitpunkt gemessener Messwerte, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der zumindest einen Trainings-Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der zumindest einen Trainings-Zellkultur umfassen;
■ Empfang der Zeitangabe des aktuellen Trainings-Zeitpunkts; und
■ Berechnung von extrazellulären Flüssen der extrazellulären Metaboliten als Funktion der zu diesem Zeitpunkt und der zum jeweils vorhergehenden Zeitpunkt empfangenen Messwerte, wobei die extrazellulären Flüsse Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in die Zelle und/oder Abgaberaten der extrazellulären Metaboliten in das Medium sind;
- Trainieren der MLP, wobei das Trainieren umfasst:
o Eingabe der Messwerte, die an jedem der Trainings-Zeitpunkte
empfangen wurden, als Eingabeparameterwerte in die MLP, und Eingabe der extrazellulären Flüsse, die an dem jeweils auf diesen Trainings-Zeitpunkt folgenden Zeitpunkt für diesen folgenden
Zeitpunkt berechnet wurden, als zu diesen Eingabeparameterwerten gehörige Ausgabeparameterwerte in die MLP; und
o Durchführung eines Lernprozesses durch die MLP derart, dass die MLP lernt, basierend auf den Eingabeparameterwerten die jeweils zugehörigen Ausgabeparameterwerte vorherzusagen; Speicherung der trainierten MLP in einem volatilen oder nicht-volatilen Speichermedium.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Trainingsdatensatz so erzeugt wird, dass an jedem von einer Vielzahl von Trainings-Zeitpunkten während der Kultivierung von mehreren Trainings-Zellkulturen von Zellen des bestimmten Zelltyps die Messwerte und Zeitangaben empfangen und die extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten berechnet werden, wobei die
Zellkulturen in Bioreaktoren unterschiedlichen Typs kultiviert werden, wobei die Typen der Bioreaktoren zumindest zwei unterschiedliche Bioreaktortypen aus den folgenden Bioreaktortypen umfasst: ein Fed-Batch Bioreaktor, ein Batch Bioreaktor, ein Perfusionsreaktor, ein Chemostat und ein Split-Batch
Bioreaktor.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der MLP um ein neuronales Netzwerk oder ein System aus mehreren neuronalen Netzwerken handelt.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den
gemessenen Konzentrationen der mehreren extrazellulären Metaboliten jeweils handelt um:
- eine auf ein Volumen bezogene Gehaltsangabe des Metaboliten,
insbesondere um eine Massenkonzentration oder Stoffmengen konzentration handelt, oder
- einen Wert, welcher in linearer Weise oder zumindest näherungsweise
linearer Weise mit der volumenbezogenen Gehaltsangabe korreliert, insbesondere eine korrigierte oder normalisierte gemessene
Metabolitkonzentration oder einen gemessenen Fluss des extrazellulären Metaboliten.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der MLP um ein System aus mehreren Unter-MLPs handelt, wobei die einzelnen in dem System enthaltenen Unter-MLPs jeweils für die Vorhersage des extrazellulären Flusses eines einzelnen extrazellulären Metaboliten trainiert wurden und selektiv für die Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten an dem Zukunftszeitpunkt verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die MLP zur
Vorhersage des extrazellulären Flusses eines einzelnen der extrazellulären Metaboliten gemessene Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten als Eingabeparameterwerte verwendet, wobei sich die mehreren
extrazellulären Metaboliten, die als Eingabeparameterwerte für zumindest zwei der extrazellulären Metaboliten, deren extrazellulärer Fluss bestimmt werden soll, unterscheiden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, ferner umfassend:
- Messung der Konzentrationen aller Eingabekandidaten-Metaboliten über mehrere Zeitpunkte, wobei die Eingabekandidaten-Metaboliten alle
extrazellulären Metaboliten umfasst, die in einem Referenz-Bioreaktor mit einer Zellkultur des bestimmten Typs messtechnisch verfügbaren sind oder alle extrazellulären Metaboliten des metabolischen Modells umfasst;
- für jeden einzelnen der extrazellulären Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll, Durchführung eines Auswahlverfahrens zur Identifikation der mehreren extrazellulären Metaboliten, die als
Eingabeparameterwerte zur Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen Metaboliten verwendet werden sollen, wobei das
Auswahlverfahren im Hinblick auf diesen einzelnen Metaboliten jeweils umfasst: a) Definieren einer ersten Menge extrazellulärer Metaboliten, wobei die erste Menge alle Eingabekandidaten-Metaboliten umfasst; b) Berechnung eines ersten Relevanz-Scores jedes der extrazellulären Metaboliten in der ersten Menge als Funktion der gemessenen Konzentrationen dieses Metaboliten, wobei der erste Relevanz-Score die Vorhersagekraft der Konzentration des jeweiligen extrazellulären Metaboliten im Hinblick auf den extrazellulären Fluss dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten angibt; c) Überführung nur desjenigen der extrazellulären Metaboliten, der den höchsten ersten Relevanz-Score hat, von der ersten Menge in eine noch leere zweite Menge an extrazellulären Metaboliten unter Entfernung dieses Metaboliten aus der ersten Menge; d) Berechnung eines weiteren Relevanz-Scores jedes der extrazellulären Metaboliten in der ersten Menge als Funktion der gemessenen
Konzentrationen dieses Metaboliten und der gemessenen
Konzentrationen aller in der zweiten Menge enthaltenen extrazellulären Metaboliten, wobei der weitere Relevanz-Score die Vorhersagekraft der Konzentration des jeweiligen Eingabekandidaten-Metaboliten im
Hinblick auf den extrazellulären Fluss dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten unter Berücksichtigung der bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten angibt; e) Überführung nur desjenigen der extrazellulären Metaboliten der ersten Menge, der den höchsten weiteren Relevanz-Score hat, in die zweite Menge unter Entfernung dieses Metaboliten aus der ersten Menge, wobei die Überführung nur dann erfolgt, wenn durch die Aufnahme dieses Metaboliten die zweite Menge nicht einen maximalen Grenzwert für informative Redundanz der in ihr enthaltenen Metaboliten bezüglich der Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten übersteigt; f) Wiederholung der Schritte d) und e) so lange, bis keine Metaboliten mehr von der ersten in die zweite Menge überführt werden können ohne dass die zweite Menge den maximalen Grenzwert für informative Redundanz überschreitet; und g) Selektive Verwendung nur der Metaboliten, die in die zweite Menge überführt wurden, als Eingabeparameterwerte zur Vorhersage des extrazellulären Flusses dieses einzelnen extrazellulären Metaboliten.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
- wobei der erste Relevanz-Score berechnet wird als partial mutual Information score - PMI-Score - zwischen einem Metaboliten der ersten Menge und dem einzelnen Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll;
- wobei der zweite Relevanz-Score berechnet wird als PMI-Score - zwischen einem Metaboliten der ersten Menge und dem einzelnen Metaboliten, dessen extrazellulärer Fluss vorhergesagt werden soll unter Berücksichtigung aller bereits in der zweiten Menge enthaltenen Metaboliten.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die MLP zur
Vorhersage des extrazellulären Flusses jedes einzelnen der extrazellulären Metaboliten gemessene Konzentrationen mehrerer extrazellulären Metaboliten als Eingabeparameterwerte verwendet, wobei die mehreren extrazellulären Metaboliten mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei Aminosäuren umfassen.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Vielzahl von
Zeitpunkten durch Zeitintervalle von 10 Minuten bis 48 Stunden, vorzugsweise von 1 -24 Stunden, getrennt sind.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zelltyp ein genetisch modifizierter Zelltyp ist, der zum Zweck der Gewinnung eines Biomoleküls in einem Bioreaktor gehalten und/oder vermehrt wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an jedem der Zukunftszeitpunkte eine Berechnung mehrerer oder aller intrazellulärer Flüsse des metabolischen Modells erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend:
- Identifikation von ein oder mehreren intrazellulären Metaboliten des
metabolischen Modells, deren berechnete intrazelluläre Flüsse (410) von einem jeweiligen Referenzwert oder Referenzwertbereich um mehr als den Grenzwert abweicht;
- automatische Identifikation desjenigen intrazellulären Flusses, der als
limitierender Faktor für das Zellwachstum oder die Produktion eines gewünschten Biomoleküls wirkt.
15. Verfahren zur Überwachung und/oder Steuerung eines Bioreaktors, der die Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps beinhaltet, umfassend:
- Berechnung der intrazellulären Flüsse der Zellen an einem Zukunftszeitpunkt gemäß des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 -14;
- Vergleich der vorhergesagten intrazellulären Flüsse mit Referenzwerten oder Referenzwertbereichen für akzeptable intrazelluläre Flüsse der jeweiligen ein oder mehreren intrazellulären Metaboliten;
- Ausgabe einer Warnung, wenn eine Abweichung des berechneten
intrazellulären Flusses mindestens eines der intrazellulären Metaboliten von seinem jeweiligen Referenzwert oder Referenzwertbereich einen Grenzwert überschreitet; und/oder
- Senden eines Kontrollbefehls an den Bioreaktor, um automatisch Schritte einzuleiten, die den Zustand des Bioreaktors oder des darin enthaltenen Mediums so ändern, dass die Abweichung reduziert wird, wobei die automatischen Schritte insbesondere eine Änderung der Menge und/oder eine Änderung der Zusammensetzung einer Nährlösung beinhalten.
16. Verfahren nach Anspruch 15, ferner mit:
- Identifizieren derjenigen Reaktion innerhalb des metabolischen Modells der Zellen, die als limitierender Faktor für das Zellwachstum oder die Produktion eines gewünschten Biomoleküls wirkt gemäß Anspruch 14; und
- automatische Zugabe von selektiv denjenigen Substanzen, welche den als limitierender Faktor wirkende intrazellulären Fluss so verändern, dass das Zellwachstum oder die Produktion des Biomoleküls oder die Qualität des Biomoleküls gefördert wird, oder Ausgabe einer Aufforderung zu einer solchen Zugabe über eine Nutzerschnittstelle.
17. Verfahren zur Identifikation eines metabolisch vorteilhaften Klons von Zellen eines bestimmten Zelltyps, umfassend:
- Kultivierung unterschiedlicher Zellkulturen in mehreren Bioreaktoren, wobei die unterschiedlichen Zellkulturen unterschiedliche Klone von Zellen des bestimmten Zelltyps beinhalten; - Berechnung des intrazellulären Flusses von einem oder mehreren
intrazellulären Metaboliten an mehreren Zeitpunkten getrennt für jeden der Zellklone gemäß einem der Ansprüche 1 -16;
- Identifikation desjenigen der Zellklone, dessen berechneter intrazellulärer Fluss des einen oder der mehreren intrazellulären Metaboliten metabolisch am vorteilhaftesten ist.
18. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, ferner umfassend:
- Berechnung des aktuellen extrazellulären Flusses von einem oder mehreren der extrazellulären Metaboliten anhand der an dem aktuellen Zeitpunkt und an dem vorhergegangenen Zeitpunkt gemessenen Konzentrationen der extrazellulären Metaboliten;
- Durchführung einer weiteren metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der aktuellen intrazellulären Flüsse (410) an dem aktuellen Zeitpunkt unter Verwendung der berechneten aktuellen extrazellulären Flüsse der extrazellulären Metaboliten und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells; und
- Verwendung der berechneten aktuellen intrazellulären Flüsse als
Beschreibung eines aktuellen metabolischen Zustands der Zellen der Zellkultur.
19. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche,
- wobei an jedem der Zeitpunkte während der Kultivierung der Zellkultur ferner eine im Medium der Zellkultur gemessene Laktatdehydrogenase -LDH- Konzentration empfangen wird;
- wobei die Vorhersage der extrazellulären Flüsse der extrazellulären
Metaboliten an jedem der Zukunftszeitpunkte durch die MLP unter
Verwendung einer korrigierten anstatt der gemessenen Zelldichte erfolgt, wobei die Berechnung der korrigierten Zelldichte für jeden der Zeitpunkte umfasst:
o Berechnung der Dichte lysierter Zellen im Medium der Zellkultur als Funktion der gemessenen LDH Konzentration, wobei die Funktion eine empirisch ermittelte, heuristische und lineare Funktion ist, die die Abhängigkeit der LDH Konzentration im Medium von der Anzahl lysierter Zellen dieses bestimmten Zelltyps darstellt; o Berechnung der korrigierten Zelldichte als Summe der gemessenen Zelldichte im Medium und der berechneten Dichte der lysierten Zellen.
20. System (200) zur Vorhersage des metabolischen Zustands einer Zellkultur von Zellen eines bestimmten Zelltyps, umfassend:
- ein oder mehrere Prozessoren (202);
- eine erste Schnittstelle (210) zum Empfang von Messwerten von einem
Bioreaktor (204, 206, 208), der die Zellkultur beinhaltet;
- ein volatiles oder nicht-volatiles Speichermedium (212) mit:
o einem metabolischen Modell (402) einer Zelle des bestimmten Zelltyps, wobei das metabolische Modell eine Vielzahl intrazellulärer Metaboliten und extrazellulärer Metaboliten sowie eine Vielzahl von intrazellulären (410) und extrazellulären (408) Flüssen beinhaltet, wobei das metabolische Modell stöchiometrische Gleichungen umfasst die mindestens eine stöchiometrische Beziehung zwischen einem der intrazellulären (406) und einem der extrazellulären (404) Metaboliten spezifizieren;
o einer trainierte Machinelearning-Programmlogik - MLP -(218);
o einer Programmlogik (220), die dazu ausgebildet ist, an jedem von einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Kultivierung der Zellkultur ein Verfahren durchzuführen, welches umfasst:
■ Empfang (106) mehrerer an diesem Zeitpunkt gemessener Messwerte über die erste Schnittstelle, wobei die Messwerte Konzentrationen mehrerer extrazellulärer Metaboliten des metabolischen Modells in dem Kulturmedium der Zellkultur sowie eine gemessene Zelldichte der Zellen in der Zellkultur umfassen;
■ Eingabe (108) der empfangenen Messwerte als
Eingabeparameterwerte in die MLP;
■ Vorhersage (110) von extrazellulären Flüssen (408) der
extrazellulären Metaboliten an einem Zukunftszeitpunkt durch die MLP unter Verwendung der empfangenen Messwerte, wobei der Zukunftszeitpunkt ein dem Zeitpunkt des Empfangs der Messwerte nachfolgender Zeitpunkt ist, wobei die extrazellulären Flüsse Aufnahmeraten der extrazellulären Metaboliten in eine Zelle und/oder Abgaberaten der
extrazellulären Metaboliten von einer Zelle in das Medium sind; Durchführung (112) einer metabolischen Flussanalyse zur Berechnung der intrazellulären Flüsse an dem
Zukunftszeitpunkt unter Verwendung der vorhergesagten extrazellulären Flüsse und der stöchiometrischen Gleichungen des metabolischen Modells.
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