EP3762481A1 - Modele d'injection sous cutanee ex vivo - Google Patents

Modele d'injection sous cutanee ex vivo

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Publication number
EP3762481A1
EP3762481A1 EP19711245.1A EP19711245A EP3762481A1 EP 3762481 A1 EP3762481 A1 EP 3762481A1 EP 19711245 A EP19711245 A EP 19711245A EP 3762481 A1 EP3762481 A1 EP 3762481A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
skin
composition
injection
insert
matrix
Prior art date
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Pending
Application number
EP19711245.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pascal Descargues
Emeline PAGÈS
Claire JARDET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoskin SAS
Original Assignee
Genoskin SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genoskin SAS filed Critical Genoskin SAS
Publication of EP3762481A1 publication Critical patent/EP3762481A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/128—Chemically defined matrices for immobilising, holding or storing living parts, e.g. alginate gels; Chemically altering living parts, e.g. by cross-linking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar

Definitions

  • the present invention relates to the field of subcutaneous injection and more specifically proposes the first ex vivo model for this type of injection.
  • Syringeability and injectability are two critical features of any formulation intended for parenteral injection. The first refers to the ability of a formulation to pass easily through a hypodermic needle and the second refers to the performance of this formulation during injection (GROVES, Parental Technical Manual, Interpharm Press Vol.9, p: 99-100, 1988).
  • the syringability is based on various factors such as ease of sealing, foaming or measurement of the dose to be injected. In terms of inj ectability, this relies on the required pressure or injection force, uniformity of flow, and the absence of clogging.
  • ICH Guideline Q6A parenteral formulations packaged in pre-filled syringes or in auto-injector cartridges must be submitted to the International Standard for Human Medicinal Products (ICH). testing procedures and acceptance criteria related to the functionality of the administration system. Similarly, in the FDA industry guidance on container closure systems for the packaging of drugs for human use and biologics, the evaluation of syringe performance is required. These prerequisites must be addressed by determining the force required to initiate and maintain the movement of the plunger in the chamber, and the ability of the syringe to deliver the amount of drug product.
  • the inventors have indeed demonstrated that despite the "soft" structure of the hypodermis, the use of a skin explant comprising at least 5 mm of hypodermis in a specific culture method does not involve, as one would have could have expected, a subsidence of the hypodermis with time. It is moreover common that the loss of the three-dimensional structure leads to functional modifications and the modification of the cellular structure with, in particular, phenomena of dedifferentiation or of inappropriate differentiation. On the contrary, the inventors have been able to demonstrate that such skin explant used in this culture process retains its native three-dimensional structure where the connective tissue just as much as the adipocyte tissue forming the hypoderm show no change with time, especially at the cellular level. It is thus possible, after 5 to 7 days, to perform a skin fold on the latter so as to perform a subcutaneous injection.
  • a first object of the invention relates to an in vitro method comprising the steps of: i) immersing a skin explant in a liquid matrix able to solidify so that the upper surface of the epidermis is not covered, which matrix is itself contained in a cell culture insert whose bottom consists of a porous membrane, and
  • the skin explant comprises a thickness of at least 5 mm of hypodermis and in that the method aims to obtain an ex vivo model for subcutaneous injection.
  • the method according to the invention further comprises the steps of: iii) placing the insert in a container or a culture well, and iv) culturing the skin explant in a suitable medium.
  • a second subject of the invention relates to an insert for cell culture obtainable by the method according to the invention, which can be put in place in a container or a culture well which has a bottom consisting of a porous membrane and which contains the skin explant trapped in a solidified matrix that is in contact with the inner edge of the insert and the porous membrane and where the epidermis of the skin exantant is in contact with the atmosphere, and the dermis, epidermal appendages and hypodermis of this skin explant are trapped in the solidified matrix.
  • this insert is the ex vivo subcutaneous injection model obtained by the method according to the invention.
  • a third subject of the invention concerns the use of such an insert as an ex vivo subcutaneous injection model.
  • a fourth object of the invention relates to a kit comprising such an insert and an automatic injection device, which is preferably coupled to a dynamometer, so as to be able to determine the injectability characteristics of a composition.
  • FIG. 1 is a representation of G insert for cell culture (1) with lugs (5) whose bottom consists of a porous membrane (2) and which contains the skin explant (3) trapped in a solidified matrix (4).
  • FIGS. 2A and 2B show sections of skin explants of two different donors used in the process according to the invention at 0, 3 and 7 days of culture.
  • Figure 3 illustrates the stability over time of adipocyte size within the skin explant of the ex vivo subcutaneous injection model.
  • Figure 4 shows sections of skin explants 6h, 12h and 24h after injection into the adipose tissue of a pro-inflammatory cocktail.
  • subcutaneous injection means an injection which is carried out in the hypoderm, which is also called the “hypodermic” injection.
  • This type of injection which is well known to those skilled in the art, generally requires a skin fold with the fingers and the subcutaneous injection is then performed in the skinfold.
  • skin explant is meant a skin fragment which comprises, in addition to the epidermis, the dermis and epidermal appendages, a thickness of at least 5 mm of hypodermis.
  • the epidermal appendages correspond to the hair follicles, the sebaceous glands and the sweat glands.
  • the hypodermis is the layer of tissue that is immediately below the dermis of the skin.
  • the hypodermis is a loose connective tissue that is richly vascularized and contains adipose tissue.
  • skin explant comprises between 5 and 15 mm of hypodermis and, preferably, between 5 and 10 mm of hypodermis.
  • the immersion of the skin explant is such that the hypodermis is immersed entirely in the liquid matrix capable of solidifying and the upper dermis layer is submerged in at least 90% (in the thickness direction), preferably at least 95% and ideally all.
  • the epidermis layer, at the surface of the skin explant emerges at least 90% (in the thickness direction), preferably at least 95% and, ideally again, in totality. .
  • the solidification phase it is carried out so that the exposure of the hypodermis, the dermis and the epidermis is the same as following the immersion phase of the skin explant in the liquid matrix capable of solidifying.
  • the skin explant is advantageously of cylindrical shape, other geometric shapes may be perfectly suitable for implementing the method according to the invention.
  • skin explants with square, rectangular, oval, or even triangular or other forms.
  • the dimensions of the skin explant will be chosen so that a skin fold can be made, which is typically made by means of a thin forceps. Now, practicing a skin fold to perform the subcutaneous injection is not necessary. In the case of an automated subcutaneous injection device for example, the practice of such a skin fold is not necessary and this injection can be performed by setting the subcutaneous injection device so that it performs an injection at a depth of penetration of the needle in the explant which is previously parameterized.
  • this one can come from a plasty coming from any part of the body, with in particular plasty of the abdomen, the chest, the buttocks, the back or, why not, the scalp or any other part of the body including skin.
  • the skin explant In order to benefit from a good survival of the skin explant in vitro, it is preferable that it has been taken less than 72 hours before it is used in the process according to the invention. Now, we prefer to use an explant from which was taken less than 48 hours ago. Typically, once the skin explant removed, it takes at least one hour before it can be implemented in the method according to the invention.
  • the method according to the invention is, in a way, an improvement, the distinct nature of the skin explant used also allows to do without the association skin explant with a ring (or perforated disk) consisting of a hydrophobic material and which will confer sufficient buoyancy to the explant within the liquid matrix.
  • the inventors have found that the presence of a thickness of at least 5 mm makes it possible to confer sufficient buoyancy to the skin explant on the liquid matrix so that it is possible to use no additional means. to improve the buoyancy of the skin explant.
  • the method according to the invention will not include any step, prior to step i), attachment to the skin explant, especially on the surface epidermic, of a hydrophobic material; which hydrophobic material is normally used to improve the buoyancy of the skin explant.
  • a hydrophobic material which hydrophobic material is normally used to improve the buoyancy of the skin explant.
  • the method according to the invention will then comprise, prior to immersion of the skin explant in the liquid matrix capable of solidifying, a step i) of attachment to the surface of the epidermis of the explant of skin of a ring, or perforated disc, constituted by a hydrophobic material, whose outer diameter is greater than that of the epidermal surface of the skin explant, and the inside diameter is that of this same epidermal surface of the skin; skin explant.
  • hydrophobic material that can be used to make this ring, materials which have no toxicity to the skin, such as, for example, paraffinic polymer of the PARAFILM® (S1GMA) type, or a silicone polymer, will be preferred.
  • this ring As regards the attachment of this ring to the surface of the epidermis of the skin explant, it is preferably carried out using an adhesive, which glue is preferably added to the lower surface of the skin. 'ring.
  • This glue can be chosen from any type of non-toxic material for the skin and having the effect of adhesion of the ring to the epidermal surface of the skin explant.
  • a hydrophobic adhesive such as, for example, a silicone-based glue.
  • Solidifying liquid matrix means any liquid solution whose specific composition (whether in terms of compound (s) and concentration) is such that, when appropriate conditions are in In particular conditions of temperature, the liquid solution takes a consistency of solid type or gel type.
  • the nature of this matrix capable of solidifying must allow the cells of the skin biopsy to be kept alive, that is to say have no cytotoxic effect and have a temperature of solidification / polymerization at room temperature ( ie 15 ° C to 25 ° C).
  • Its specific composition can have an animal, vegetable, synthetic or even mixed origin.
  • the nature and the concentration (s) of these components are chosen according to the desired physicochemical characteristics of the matrix when it is solidified, in particular in terms of flexibility and resistance.
  • the volume of the liquid matrix it will be 1/3 to 2/3 of the total volume of the insert, preferably 2/5 to 3/5 of the total volume; half the total volume of the insert being the preferred volume.
  • this liquid matrix capable of solidifying it will be chosen from liquid solutions, preferably nutritive, capable of taking the form of a solid or a gel under particular conditions compatible with the survival and the culture of the cells that make up the skin explant.
  • liquid matrix capable of solidifying By way of example of such a liquid matrix capable of solidifying, mention may be made of blood plasma, a solution derived from blood plasma (eg a dilution of blood plasma in physiological buffer, in particular a dilution of blood plasma with at least 10 %, 20%, 30%, or even at least 40% (total weight / weight of the matrix)), a solution of fibrinogen, a solution of collagen, a solution of gelatin, solutions of synthetic polymers, polymer solutions natural (eg agarose (agarose or low / low melting agar), starch, polysaccharides), and mixtures thereof.
  • this liquid matrix capable of solidification contains no growth factor, and more preferably no serum.
  • the liquid matrix capable of solidifying is composed of two solutions which are mixed together in the insert prior to step i) of immersion of the skin explant.
  • This matrix is then composed of a first solution chosen from a solution of blood plasma, a solution derived from blood plasma, a solution of fibrinogen, a solution of collagen, and mixtures thereof, and a second agar-agar solution. or agarose with a low melting point.
  • the first solution chosen from a solution of blood plasma, a solution derived from blood plasma, a solution of fibrinogen, a solution of collagen, or mixtures thereof, is advantageously a nutrient solution.
  • this first solution is especially capable of solidifying under the action of an increase or decrease of the temperature and / or by the addition of a specific compound or composition.
  • the compound allowing this first solution to solidify is the Ca 2+ ion.
  • the liquid matrix has a Ca 2+ concentration of between 1 mM and 5 mM, preferably between 1.5 mM and 4.5 mM; which concentration will cause its solidification.
  • the liquid matrix has a Ca 2+ concentration of between 1 mM and 2 mM, preferably between 1.2 mM and 1.4 mM.
  • the liquid matrix has a Ca 2+ concentration of between 2 mM and 3 mM, preferably between 2.5 mM and 2.9 mM
  • this solution comprises at least one anti-fibrinolytic agent, such as sodium citrate, tranexamic acid or aprotinin, and in a concentration sufficient to obtain the desired anti-fibrinolytic activity.
  • the liquid matrix has a final concentration (weight / total matrix weight) of between 2 and 5% of this at least one anti-fibrinolytic agent.
  • the first solution will preferably be a fibrinogen solution.
  • the second low-melting agar-agarose solution is preheated for a time and at a temperature sufficient to be liquid and to remain liquid at about 37 ° C for the time sufficient to be mixed with the first. solution in said insert and up to the moment of immersion of the skin explant.
  • this second solution is preheated to its melting temperature or at a slightly higher temperature, preferably at a temperature between 65 ° C and 70 ° C.
  • the choice of agar-agar or low-melting agarose is made so as to benefit, for a solution at 1.5% (total weight / weight composition) of a gelling temperature of between 24 ° C. C and 28 ° C, and a melting temperature above 65.5 ° C.
  • agar-agar or low-melting agarose is between 1% and 5% (preferably in a physiological solution), more preferably between 2% and 5% between 3% and 4.5%, between 3.5% and 4, 5% or between 3.8% and 4.2% or between 3.9% and 4, 1%, 4% being the concentration the more preferred (in weight relative to the total weight of the composition).
  • this second agar-agar or low-melting agarose solution may be stored in liquid form for at least 1 hour at 37 ° C.
  • the solidifying liquid matrix comprising said first and said second low melting agar or agarose solution has a final concentration of agar-agar or low-melting agarose between 0, 1% and 2%, preferably between 0.2% and 1.8% (weight / total weight of the matrix).
  • a concentration makes it possible not only to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible to retain the three-dimensional structure and to maintain said skin fragment or biopsy in survival, but also to obtain a solid matrix that is sufficiently flexible to be non-brittle and resistant. to one-off shocks.
  • the solidification of this liquid matrix is done after deposition of the fragment or skin biopsy leaving the device thus obtained at a temperature between 37 ° C and room temperature, preferably at 20 ° C.
  • the final concentration of agarose or agarose with a low melting point in the liquid matrix (comprising the first and said second solution) is between 0.5% and 2%, preferably between 0.5% and 1.25%, more preferably between 0.5% and 1.0%, with a concentration of 0.7% (total weight / weight of the matrix) being the most preferred concentration.
  • the final concentration of agarose or agarose with a low melting point in the liquid matrix (comprising the first and said second solution) is between 0.1% and 2%, preferably between 0, 2% and 1.75%, 0.25% being the most preferred concentration.
  • concentration makes it possible to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible at the same time to preserve the three-dimensional structure and to maintain the skin explant in survival, and simultaneously to obtain a sufficiently flexible matrix to be non-brittle and resistant to mechanical effects applied to the skin explant.
  • the solidification of this liquid matrix is after immersion of the skin explant by allowing the whole to cool.
  • the solidifying liquid matrix further comprises cells other than cells that make up the skin explant, which cells are selected from the group consisting of fibroblasts, endothelial cells and cells. nerve.
  • these cells are fibroblasts and, ideally, primary fibroblasts (as opposed to fibroblasts), such as dermal fibroblasts obtained from human foreskin.
  • primary fibroblasts especially dermal fibroblasts, can be prepared and obtained from standard methods well known to those skilled in the art (see, for example, HOWARD BV et al., A new method for the establishment of diploid fibroblast cell cultures.
  • these cells, and in particular the fibroblasts are contained in the matrix at a concentration of between 5 ⁇ 10 3 and 5 ⁇ 10 5 cells / ml, more preferably between 10 4 and 10 5 cells / ml, the interval ranging from 3 ⁇ 10 4 to 5.10 4 cells / ml being the most preferred concentration range.
  • the liquid matrix may furthermore comprise various compounds such as preservatives, pH agents, etc.
  • the liquid matrix will contain between 5 and 500 mg / ml of ascorbic acid, preferably between 25 and 75 mg. / mL, with a preferred concentration of ascorbic acid of 50 mg / mL.
  • the liquid matrix capable of being able to solidify is a solution derived from blood plasma and comprises: a) from 25 to 75% (volume / total volume A *) of fibrinogen, preferably 35% at 45% (v / v), b) from 5% to 12% (volume / total volume) of a salt solution of CaCl 2 at 1%, preferably 8%, c) from 5% to 2%, of preferably the anti-fibrinolytic agent being selected from tranexamic acid or aprotinin d) from 0.5% to 4% low melting point agarose, preferably from 1% to 2%, and e) a physiological solution such as a solution of 0.9% NaCl, qsp
  • the insert it can take multiple forms and in particular correspond to a suspended insert or an insert on stilts. Now, we will opt for a suspended insert.
  • the bottom of this insert consists of a porous membrane whose diameter is between 5 and 40 mm and more preferably between 9.5 and 30 mm. As for the porosity of this membrane, it must prevent the liquid matrix from crossing before its solidification.
  • this porous membrane will have a porosity of between 0.4 and 8 ⁇ m, preferably between 0.4 ⁇ m and 1.5 ⁇ m, with a range of 0.8 ⁇ m and 1.2 ⁇ m as the porosity range. prefer.
  • a porous membrane chosen from polyethylene terephthalate (PET), nitrocellulose and polycarbonate membranes.
  • inserts can take the form of inserts with polycarbonate membrane, PET or nitrocellulose, which are pre-packaged in 6, 8, 12 or 24-well multi-well culture plate plates, and whose membrane porosity may vary from 0.4 to 8 ⁇ m.
  • the inserts used have a PET membrane with a porosity of between 0.8 ⁇ m and 1 ⁇ m, and are suitable for the wells of the 8-well culture plates.
  • the solidification step of the liquid matrix is obtained in the presence of calcium ions, preferably also in the presence of thrombin.
  • the liquid matrix is a liquid matrix containing a solution of blood plasma, a solution derived from blood plasma, a solution of fibrinogen or a solution of collagen
  • the solidification of this matrix in step ii) is obtained for this solution following the addition of thrombin and / or following an increase in temperature and / or in the presence of factors secreted by the cells such as the primary fibroblasts integrated into the matrix.
  • this liquid matrix solidifies after a maximum of 8 hours, preferably less than one hour, with a preferred duration of the solidification step of less than 10 min after immersion of the skin explant in the liquid matrix suitable for to solidify in step i).
  • the method according to the invention further comprises the steps of: iii) placing the insert in a container or a culture well, and iv) culturing the skin explant in a suitable medium.
  • the container or the well into which this insert is deposited is a well of a 6, 8, 12, 24 or 48 well cell culture plate.
  • culture plates that can be used in the process according to the invention, mention may be made of those provided in particular by the companies NUNC, CORNING, BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL),
  • the bottom of the insert is located at a distance of between 1 and 2.5 mm from the bottom of the container / well containing it.
  • the method according to the invention may further comprise a step iii '), subsequent to step iii), which consists in affixing a lid or a film on the container or the well in which the insert has been placed. step iii), this in order to make this container or this well sealed.
  • the container or well obtained can be transported without difficulty, whether by land, sea or air. Indeed, the skin exantant is not only trapped and thus firmly held by the solid matrix in G porous membrane insert, but also fed, thus traveling without culture medium during transport while being maintained in survival.
  • culture or “culturing” is meant here in particular the maintenance of the physiological and, where appropriate, morphological state of the skin explant, and therefore of the cells that compose it. Thus, it is intended by this step to limit the phenomena of cell death and maintain the state of differentiation of the cells (in fact limit inappropriate dedifferentiation or differentiation phenomena).
  • medium or “culture medium” is meant a liquid composition comprising all the elements necessary for culturing the cells of the skin explant (eg William's medium E, KBM, DMEM, etc.).
  • This culture medium by its nature as well as by its volume in the container, helps promote the survival of skin explant and cells constituting it over time.
  • the culture medium in question makes it possible, in particular by limiting the stress on these, to maintain the cells of the skin explant in their initial state whether in structural or functional terms.
  • step iii ' does not comprise the step iii ') described above, it could comprise a step iv'), following step iii), which consists in affixing a lid or a film on the container or the well in which the insert was placed in step iii), this in order to make this container or the well tight.
  • step iv' following step iii
  • step iii which consists in affixing a lid or a film on the container or the well in which the insert was placed in step iii
  • the method according to the invention further comprises the step of: v) injecting, subcutaneously and in the skin explant, a composition.
  • the composition in question is a test composition which is in liquid form.
  • the volume of this composition is between 10 m ⁇ and 1 ml, preferably between 10 m ⁇ and 500 m ⁇ and, particularly preferably, between 10 m ⁇ and 200 m ⁇ .
  • the needle for injection of the composition typically has a length sufficient to reach the hypodermis.
  • needles having a length greater than or equal to 10 mm will preferably be used.
  • needles having a length of 12, 16, 20, 25, 30, 35, 40 or 45 mm may be used.
  • the needle has a length of between 16 and 45 mm, preferably a length of 20 to 40 mm.
  • the diameter of the needle to be used it can be identified simply by one skilled in the art with regard to his general knowledge.
  • such hypodermic needles are of the type 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G or even 31G.
  • step v) is performed by an experimenter.
  • the injection step v) can be directly preceded by a step v) of pinching the skin explant by the experimenter so allow the formation of a skin fold and facilitate, for the experimenter, step v) subcutaneous injection.
  • this step v) is performed by an automatic injection device.
  • the device allows an injection at a given depth, relative to the surface of the epidermis, so as to obtain a subcutaneous injection.
  • the method according to the invention further comprises the step of: vi) determining the injectability of the composition.
  • step v) of injection is performed by an experimenter, it is he who will determine the injectability of this composition. To do so, it is possible to associate with this injectability arbitrary values associated with specific characteristics of this injection. For example, the experimenter can use the scale below:
  • the experimenter by performing, on several occasions, an injection of the given composition, may assign him an average value of injectability.
  • the injection step v) is performed by an automatic injection device, the injectability is determined by it.
  • the automatic injection device is coupled to a dynamometer.
  • the automatic injection device is capable of determining the force required (mPa) for the subcutaneous injection of the composition.
  • the dynamometer makes it possible to determine: 1) the initial glide force (PBF), which is the force required to move the piston of the syringe;
  • PPF initial glide force
  • DGF dynamic glide force
  • the method according to the invention may comprise a step of: vi) determining the injection bolus of the composition, the local toxicity resulting from the injection of the composition and / or the effectiveness of the composition.
  • the method according to the invention makes it possible to truly determine the injection bolus by selecting a volume of a composition which comprises a given concentration of an active ingredient.
  • the method according to the invention provides access to the local toxicity resulting from the injection. It suffices for this to proceed to the morphological and / or molecular analysis at the injection site. Such an analysis can be carried out by the inclusion of the ex vivo skin model following the injection, the preparation of sections from the block obtained and finally the visual and / or immunohistochemical analysis of localized sections at the site. injection.
  • This insert may be the insert as obtained at the end of step iii ') of the process according to the invention. All the features of this insert are described above and in particular the fact that it can take multiple forms as a suspended insert or on piles with a preference for a suspended insert due to the presence of lugs (60).
  • This insert may in particular be a porous membrane whose diameter is between 5 and 40 mm, in particular between 9.5 and 30 mm, the porosity of which is between 0.4 and 8 ⁇ m, or even between 0.4 ⁇ m and 1 ⁇ m. 5 ⁇ m and which is selected from polyethylene terephthalate (PET), nitrocellulose and polycarbonate membranes.
  • this injectability is a function not only of the composition, but also of the syringe and especially of the needle used.
  • kits comprising an insert as defined above and an automatic injection device, which is preferably coupled to a dynamometer, so as to determine the injectability characteristics of a composition.
  • the automatic injection device is able to determine the takeoff force (PBF), the maximum force (Fmax), and the dynamic glide force ("dynamic glide force" or composition.
  • Skin explants are prepared from two complete samples of skin from two separate donors, which samples include the epidermis, dermis and hypodermis (1.5 to 2 cm). The explants (epidermis, dermis and hypodermis) are then cut with a metal punch to obtain cylinders 1 to 20 mm in diameter in which the hypodermic thickness is adjusted to the desired value ( 0.5 to 1 cm). Then, they are floated in buffered saline until the "inclusion" stage in the solidified matrix.
  • each skin explant is then included with a process similar to that used for the NATIVESKIN TM model. Briefly, the skin explant is gently deposited on an insert (8-well MILLICELL TM cup) with a porous membrane (made of PET, porosity 1 ⁇ m) and containing a solution derived from blood plasma treated with a anticoagulant agent. reversible properties in the presence of calcium ions (sodium citrate).
  • This solution contains 42% blood plasma, 50% 0.9% NaCl solution, 8% 1% CaCl 2 saline, antifibrinolytic agent (tranexamic acid or aprotinin), and 0.7% low melting agarose (LMP GIBCOBRL Agarose, LIFE TECHNOLOGIES) (oven melted at 65.5 ° C).
  • Coagulation consists essentially of the transformation, in the presence of calcium ions and thrombin, of the fibrinogen present in the plasma into a scaffold of fibrin molecules linked together by covalent bonds.
  • the anti-fibrinolytic agent has the function of inhibiting enzymes capable of degrading the plasma matrix, these enzymes being secreted by the skin explant, and thus of maintaining the integrity of the explant.
  • FIG. 1 illustrates represents such an insert for cell culture (1) with lugs (5) whose bottom consists of a porous membrane (2) and which contains the skin explant (3) after it has been trapped in the solidified matrix (4).
  • the assembly consisting of the skin explant is kept in culture for 7 days in a CO 2 incubator at 37 ° C. with the epidermis in contact with the air.
  • the DMEM culture medium supplemented with calcium and vitamin C contained in G insert disposed (suspended) on the well of the cell culture plate is changed daily.
  • the skin explants are dehydrated by a first alcohol bath and then by a second xylene bath. Finally, a first bath in paraffin allows to replace the water previously contained in the skin exfoliant paraffin.
  • the paraffin-impregnated samples are taken out of their bath and transferred to a container whose bottom is lined with absorbent paper, in order to be brought close to the inclusion station.
  • the samples, locked in histology cassettes, are immersed in liquid paraffin at 56 ° C to remelt the paraffin which impregnates them.
  • the histology cassette is opened, the sample is optionally cut in half.
  • Linen inclusion mold is filled with liquid paraffin and the sample (or 2 pieces of sample) is placed in the mold and oriented in the desired direction for cutting.
  • the mold is at the same time transferred to a refrigerated carrier to solidify the paraffin from the bottom of the mold and to maintain the sample.
  • the lid of the histology cassette on which the reference of the sample is placed is placed on top, so that the paraffin passes through (possibility of adding paraffin if necessary), then the whole is placed in the cold (refrigerator, freezer, cold room ...) several minutes (5 to 6)), to solidify paraffin en bloc, imprisoning in fact the sample in the right orientation with the cover of the histology cassette which will become the support of the block.
  • paraffin block Once the paraffin block is well solidified, it is removed from the mold. Excess paraffin is optionally scraped off with a spatula on the sides of the lid of the inclusion cassette.
  • FIGS. 2A and 2B illustrate the results of a performed staining (Hematoxylin and Eosin) on the skin explants of two different donors used in the process according to the invention after 0, 3 or 7 days of culture.
  • Figure 3 shows the distribution of adipocytes as a function of their surface in the different explants at 0 and 7 days of culture.
  • Skin explants are prepared as before. Various tests performed on cultured explants show that it is possible to perform, without difficulty, subcutaneous injections on these skin explants. In addition, and since the explant has a suitable diameter (of the order of ... mm), it is easy to practice a skin fold with a thin forceps, so as to perform this injection. In these conditions, the explant is perfectly maintained and behaves very exactly like the skin of an individual.
  • FIG. 1 shows H & E staining performed on paraffin sections of pm thick to evaluate the effect of the injected solution on the viability and structure of the tissue.
  • results show the appearance of vacuolated and pycnotic cells in the epidermis of the models, as well as a partial degradation of the collagen fibers of the dermis, suggesting a degeneration related to the effect of the pro-inflammatory solution.

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Abstract

L'invention est relative à un modèle ex vivo pour l'injection sous-cutanée et vise un procédé in vitro comprenant les étapes de i) immersion d'un explant de peau dans une matrice liquide apte à se solidifier de sorte que la face supérieure de l'épiderme ne soit pas recouverte, laquelle matrice est elle-même contenue dans un insert pour culture cellulaire dont le fond est constitué d'une membrane poreuse, et de (ii) solidification de cette matrice de sorte d'emprisonner la partie immergée de cet explant de peau, où la face supérieure de l'épiderme n'est pas recouverte, et de faire adhérer cette même matrice aux parois latérales et à la membrane poreuse de l'insert, où l'expiant de peau comprend une épaisseur d'au moins 5 mm d'hypoderme.

Description

Modèle d’injection sous cutanée ex vivo
La présente demande internationale revendique la priorité de la demande de brevet français FR18/70232 déposée en date du 5 mars 2018.
Domaine de l’invention La présente invention est relative au domaine de l’injection sous-cutanée et propose, plus spécifiquement, le premier modèle ex vivo pour ce type d’injection.
Art antérieur
La seringuabilité et l’injectabilité sont deux caractéristiques critiques de toute formulation destinée à une injection parentérale. La première se réfère à la capacité d’une formulation à passer facilement à travers une aiguille hypodermique et la seconde se réfère à la performance de cette formulation durant l’injection (GROVES, Parentéral Technology Manual. Interpharm Press. Vol.9, p:99— 100, 1988).
La seringuabilité repose sur divers facteurs tels que la facilité à colmater, à mousser ou encore la mesure de la dose à injecter. Pour ce qui est de 1’ inj ectabilité, celle-ci repose sur la pression ou la force d’injection requise, l’uniformité d’écoulement et l’absence de colmatage.
Ces deux paramètres peuvent être affectés aussi bien par la formulation en tant que telle que par la géométrie de l’aiguille, notamment par son diamètre interne, par sa longueur, par la forme de son ouverture ou par l’extrémité de la seringue. Ces deux paramètres sont en tout cas d’une importance critique dès lors que l’on s’adresse aux dispositifs d’auto-injection, tels que les stylos ou les auto-injecteurs, lesquels sont équipés d’aiguilles très fines avec des aiguilles de l’ordre de 29 à 31G. Si de telles aiguilles permettent de réduire la douleur à l’injection, elles requièrent néanmoins d’augmenter la force d’injection et nécessitent donc de déterminer rapidement, au cours
FEUI LLE DE REM PLACEM ENT ( RÈG LE 26) du développement, la seringuabilité et Pinjectabilité de la composition de sorte de les modifier si nécessaire.
Selon la note d'orientation Q6A de l'ICH (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE), les formulations parentérales conditionnées dans des seringues préremplies ou dans des cartouches d'auto-injecteurs doivent être soumises à des procédures d'essai et à des critères d'acceptation liés à la fonctionnalité du système d'administration. De même, dans les conseils pour l'industrie de la FDA sur les systèmes de fermeture des récipients pour l'emballage des médicaments à usage humain et des produits biologiques, l'évaluation de la performance de la seringue est requise. Ces prérequis doivent être adressés en déterminant la force nécessaire pour initier et maintenir le mouvement du piston dans la chambre, et la capacité de la seringue à délivrer la quantité de produit médicamenteux.
En dépit de ces exigences réglementaires, aucune procédure de test officielle n'est spécifiée dans les pharmacopées. Maintenant, si une mauvaise seringuabilité peut être solutionnée facilement en faisant varier la taille de l’aiguille, il n’en va pas de même pour Pinjectabilité. Aussi, et dans la mesure où Pinjectabilité a potentiellement un impact important sur l'observance du patient, il importe d’étudier très tôt ce paramètre.
Des méthodes de détermination de Pinjectabilité d’une composition ont donc été déterminées dans Part antérieur. RITSCHEL & SUZUKI (1979) ont ainsi proposé une méthode pour déterminer Pinjectabilité de compositions parentérales basée sur la détermination du temps nécessaire à l’injection en douceur, avec une pression donnée et pour un système à aiguille-seringue donné, d’une solution ou suspension donnée dans un échantillon de viande. La détermination de la force nécessaire pour injecter un liquide à travers une aiguille a également utilisé par le passé un dynamomètre ou un rhéomètre micro-capillaire relié à un dynamomètre. Finalement, il résulte des études menées avec ces dispositifs que Pinjectabilité d’une composition est liée d’un côté à la vitesse de son injection et à sa viscosité et, de l’autre côté, à la nature du milieu dans lequel elle est injecté. Il en résulte que la détermination et l’adaptation de Pinjectabilité in vivo (dans la peau) d’une composition donnée ne sont pas simples d’accès et nécessitent le plus souvent de passer par une dernière étape d’essai chez l’homme. Il existe donc un besoin existant pour déterminer facilement et rapidement G injectabilité in vivo d’une composition, notamment par voie sous cutanée, en limitant, autant que possible, le passage par une mise au point (re formulation) chez l’homme, mais aussi par ranimai sachant que son utilisation tend à se limiter de plus en plus. Résumé de l’invention
Les inventeurs ont en effet mis en évidence que malgré la structure « molle » de l’hypoderme, l’utilisation d’un expiant de peau comprenant au moins 5mm d’hypoderme dans un procédé de culture spécifique n’entraine pas, comme on aurait pu s’y attendre, un avachissement de l’hypoderme avec le temps. Il est en outre courant que la perte de la structure tridimensionnelle entraîne des modifications fonctionnelles et la modification de la structure cellulaire avec notamment des phénomènes de dédifférenciation ou alors de différenciation inappropriée. Au contraire, les inventeurs ont pu mettre en évidence qu’un tel expiant de peau mis en œuvre dans ce procédé de culture garde sa structure tridimensionnelle native où le tissu conjonctif tout autant que le tissu adipocytaire formant l’hypoderme ne montrent pas de changement avec le temps, notamment au niveau cellulaire. Il est ainsi possible, après 5 à 7 jours, d’effectuer un pli cutané sur ce dernier de sorte de réaliser une injection sous-cutanée.
Cette découverte permet de bénéficier d’un expiant de peau en culture reproduisant fidèlement ex vivo la structure tridimensionnelle de la peau avec ses différentes Côüchês de peau et, surtout, son hypoderme. Dès lors, l’existence d’un tel expiant rend possible, pour la première fois, le fait de tester ex vivo une injection sous- cutanée et ses différents paramètres. Cette découverte des inventeurs a donc permis la réalisation du premier modèle ex vivo d’injection sous-cutanée, lequel modèle reproduit fidèlement la structure tridimensionnelle de la peau, même après plusieurs jours de culture.
En conséquence, un premier objet de l’invention concerne un procédé in vitro comprenant les étapes de : i) immersion d’un explant de peau dans une matrice liquide apte à se solidifier de sorte que la face supérieure de l’épiderme ne soit pas recouverte, laquelle matrice est elle-même contenue dans un insert pour culture cellulaire dont le fond est constitué d’une membrane poreuse, et
ii) solidification de cette matrice de sorte d’emprisonner la partie immergée de cet expiant de peau, où la face supérieure de l’épiderme n’est pas recouverte, et de faire adhérer cette même matrice aux parois latérales et à la membrane poreuse de l’insert ;
Caractérisé en ce que l’expiant de peau comprend une épaisseur d’au moins 5 mm d’hypoderme et en ce que le procédé vise à l’obtention d’un modèle ex vivo pour l’injection sous-cutanée.
Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend en outre les étapes de : iii) mise en place de l’insert dans un container ou un puits de culture, et iv) mise en culture de l’expiant de peau dans un milieu approprié.
Un deuxième objet de l’invention concerne un insert pour culture cellulaire susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention, qui peut être mis en place dans un container ou un puits de culture qui présente un fond constitué d’une membrane poreuse et qui contient l’expiant de peau emprisonné dans une matrice solidifiée qui est en contact avec le bord interne de l’insert et la membrane poreuse et où l’épiderme de l’expiant de peau est en contact avec l’atmosphère, et le derme, les annexes épidermiques et l’hypoderme de cet expiant de peau sont emprisonnés dans la matrice solidifiée.
A noter que cet insert constitue le modèle d’injection sous-cutanée ex vivo obtenu par le procédé selon l’invention.
Un troisième objet de l’invention concerne l’utilisation d’un tel insert en tant que modèle ex vivo d’injection sous cutanée.
Avantageusement, pour la détermination de l’injectabilité d’une composition, du bolus d’injection de la composition, de la toxicité locale résultant de l’injection de la composition et/ou encore de l’efficacité de la composition Un quatrième objet de l’invention concerne un kit comprenant un tel insert et un dispositif d’injection automatique, lequel est de préférence couplé à un dynamomètre, de sorte de pouvoir déterminer les caractéristiques d’injectabilité d’une composition.
Description des dessins
La figure 1 est une représentation de G insert pour culture cellulaire (1) avec des ergots (5) dont le fond est constitué d’une membrane poreuse (2) et qui contient l’explant de peau (3) emprisonné dans une matrice solidifiée (4).
Les figures 2A et 2B montrent des coupes d’explants de peau de deux donneurs distincts mis en œuvre dans le procédé selon l’invention à 0, 3 et 7 jours de culture.
La figure 3 illustre la stabilité dans le temps de la taille des adipocytes au sein de l’explant de peau du modèle ex vivo d’injection sous-cutanée.
La figure 4 montre des coupes d’explants de peau 6h, 12h et 24h après l’injection dans le tissu adipeux d’un cocktail pro-inflammatoire.
Description détaillée de l’invention
En ce qui concerne le premier objet de l’invention, on entend par « injection sous- cutanée », une injection qui est réalisée dans l'hypoderme, ce qui lui vaut également l’appellation d’injection « hypodermique ». Ce type d’injection, qui est bien connue de l’homme du métier, nécessite généralement de pratiquer un pli cutané à l'aide des doigts et l’injection sous-cutanée est alors réalisée dans le pli cutané.
Par « expiant de peau », on désigne un fragment de peau qui comprend, outre l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques, une épaisseur d’au moins 5 mm d’hypoderme. Les annexes épidermiques correspondent aux follicules pileux, aux glandes sébacées et aux glandes sudoripares. L'hypoderme est la couche de tissu qui est située immédiatement sous le derme de la peau. L’hypoderme un tissu conjonctif lâche qui est richement vascularisé et qui contient en outre du tissu adipeux. Idéalement, explant de peau comprend entre 5 et 15 mm d’hypoderme et, préférentiellement, entre 5 et 10 mm d’hypoderme.
En lien avec l’étape i), l’immersion de l’expiant de peau est telle que l’hypoderme est immergé en totalité dans la matrice liquide apte à se solidifier et la couche supérieure de derme est quant à elle immergée à au moins 90% (dans le sens de l’épaisseur), de préférence à au moins 95% et, idéalement, en totalité. Parallèlement, la couche d’épiderme, en surface de l’explant de peau, émerge d’au moins 90% (dans le sens de l’épaisseur), de préférence d’au moins 95% et, idéalement là encore, en totalité.
Pour ce qui est de la phase de solidification, elle est réalisée de sorte que l’exposition de l’hypoderme, du derme et de l’épiderme soit la même que suite à la phase d’immersion de l’explant de peau dans la matrice liquide apte à se solidifier.
Si l’explant de peau est avantageusement de forme cylindrique, d’autres formes géométriques peuvent parfaitement convenir pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Ainsi, on peut tout aussi bien envisager des expiants de peau présentant des formes carrées, rectangulaires, ovales, voire triangulaires ou autres.
On choisira les dimensions de l’expiant de peau de sorte de pouvoir réaliser un pli cutané, lequel est typiquement réalisé au moyen d’une pince fine. Maintenant, le fait de pratiquer un pli cutané pour réaliser l’injection sous-cutané n’est nullement nécessaire. Dans le cas d’un dispositif d’injection sous-cutané automatisé par exemple, la pratique d’un tel pli cutané n’est nullement nécessaire et cette injection peut être effectuée en paramétrant le dispositif d’injection sous-cutané de sorte qu’il effectue une injection à une profondeur de pénétration de l’aiguille dans l’explant qui est préalablement paramétrée.
Dans le cas d’un expiant de peau de forme cylindrique, on optera ainsi plutôt pour un expiant de peau présentant un diamètre compris entre 10 mm et 50 mm, de préférence entre 15 mm et 40 mm, voir même entre 15 mm et 30mm avec des valeurs qui pourront être comprises typiquement entre 17 et 23 mm. Si cet explant de peau est prélevé chez un mammifère, on pourra opter pour l’humain ou le porc. Maintenant, eu égard à la destination privilégiée du procédé selon l’invention, on optera plutôt pour un explant de peau humaine.
En lien avec l’origine de l’explant de peau, celui-ci peut provenir d’une plastie provenant de n’importe quelle partie du corps, avec notamment des plasties de l’abdomen, de la poitrine, des fesses, du dos, voire, pourquoi pas, du cuir chevelu ou de tout autre partie du corps comprenant de la peau.
Dans le but de bénéficier d’une bonne survie de l’expiant de peau in vitro, il est préférable que celui-ci ait été prélevé moins de 72h avant sa mise en œuvre dans le procédé selon l’invention. Maintenant, on préférera utiliser un expiant de qui a été prélevé il y a moins de 48 heures. Typiquement, une fois l’explant de peau prélevé, il faut au moins une heure avant que celui-ci ne puisse être mis en œuvre dans le procédé selon l’invention.
Par rapport au procédé décrit dans la demande internationale WO 2013/164436 dont le procédé selon l’invention constitue, d’une certaine manière, un perfectionnement, la nature distincte de l’explant de peau utilisé permet également de se passer de l’association de l’explant de peau avec un anneau (ou disque perforé) constitué par un matériau hydrophobe et qui va conférer une flottabilité suffisante à l’explant au sein de la matrice liquide.
En effet, les inventeurs ont constaté que la présence d’une épaisseur d’au moins 5 mm permet de conférer une flottabilité suffisante à l’expiant de peau sur la matrice liquide de sorte qu’il est possible de n’utiliser aucun moyen complémentaire pour améliorer la flottabilité de l’explant de peau.
En conséquence, et selon un mode de réalisation que l’on pourra considérer comme préféré, le procédé selon l’invention ne comprendra aucune étape, préalable à l’étape i), de fixation à l’explant de peau, notamment sur la surface épidermique, d’un matériau hydrophobe ; lequel matériau hydrophobe étant normalement utilisé pour améliorer la flottabilité de l’explant de peau. Maintenant, il est également possible de faire le choix d’une telle étape préalable et ceci même si elle n’est pas nécessaire. En effet, la fixation de cet anneau permet de délimiter la zone d’application topique pour des composés à tester. Dans ce cas, le procédé selon l’invention comprendra alors, préalablement à l’immersion de l’explant de peau dans la matrice liquide apte à se solidifier, une étape i) de fixation à la surface de l’épiderme de l’explant de peau d’un anneau, ou disque perforé, constitué par un matériau hydrophobe, dont le diamètre extérieur est supérieur à celui de la surface épidermique de l’expiant de peau, et le diamètre intérieur est celui de cette même surface épidermique de l’expiant de peau.
A titre de matériau hydrophobe utilisable pour réaliser cet anneau, on préférera des matériaux ne présentant aucune toxicité pour la peau comme, par exemple, un polymère de paraffine, de type PARAFILM ® (S1GMA), ou un polymère de silicone.
Pour ce qui est de la fixation de cet anneau à la surface de l’épiderme de l’explant de peau, elle est réalisée de préférence à l’aide d’une colle, laquelle colle est de préférence ajoutée à la surface inférieure de l’anneau. Cette colle peut être choisie parmi tout type de matériau non toxique pour la peau et ayant pour effet l’adhésion de l’anneau à la surface épidermique de l’expiant de peau. Typiquement, on pourra choisir une colle hydrophobe comme, par exemple, une colle à base de silicone.
Par « matrice liquide apte à se solidifier », on désigne toute solution liquide dont la composition spécifique (que ce soit en termes de composé(s) et de concentration) est telle que, lors de la mise en œuvre de conditions appropriées, notamment des conditions particulières de température, la solution liquide prend une consistance de type solide ou de type gel. Maintenant, la nature de cette matrice apte à se solidifier doit permettre le maintien en vie des cellules de la biopsie de peau, c’est-à-dire n’avoir aucun effet cytotoxique et posséder une température de solidification/polymérisation à température ambiante (i.e. de 15°C à 25°C). Sa composition spécifique peut avoir une origine animale, végétale, synthétique, voire mixte. En outre, la nature et la ou les concentrations de ces composants sont choisis en fonction des caractéristiques physico- chimiques souhaitées de la matrice lorsqu’elle est solidifiée, notamment en termes de souplesse et de résistance. Pour ce qui est du volume de la matrice liquide, il sera de 1/3 à 2/3 du volume total de l’insert, de préférence de 2/5 à 3/5 du volume total ; la moitié du volume total de l’insert étant le volume préféré. Pour ce qui est du choix de cette matrice liquide apte à se solidifier, on la choisira parmi les solutions liquides, de préférence nutritives, capable de prendre la forme d’un solide ou d’un gel dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture des cellules qui composent l’explant de peau. A titre d’exemple de telle matrice liquide apte à se solidifier, on pourra citer le plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin (ex. une dilution de plasma sanguin dans du tampon physiologique, notamment une dilution de plasma sanguin à au moins 10%, 20%, 30%, voire à au moins 40% (poids/poids total de la matrice)), une solution de fibrinogène, une solution de collagène, une solution de gélatine, des solutions de polymères synthétiques, des solutions de polymères naturels (ex. agarose (agarose ou agar-agar à faible/bas points de fusion), amidon, polysaccharides), et leurs mélanges. Idéalement, cette matrice liquide apte à se solidifier ne contient aucun facteur de croissance, et mieux encore pas de sérum.
Selon un mode de réalisation préféré, la matrice liquide apte à se solidifier est composée de deux solutions qui sont mélangées ensemble dans l’insert en préalable à l’étape i) d’immersion de l’explant de peau. Cette matrice est alors composée d’une première solution choisie parmi une solution de plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène, une solution de collagène, et leurs mélanges, et d’une deuxième solution d’agar-agar ou d’agarose à bas point de fusion.
La première solution, choisie parmi une solution de plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène, une solution de collagène, ou leurs mélanges, est avantageusement une solution nutritive. Maintenant, cette première solution est surtout apte à se solidifier sous l’action d’une augmentation ou d’une diminution de la température et/ou par l’addition d’un composé ou d’une composition spécifique. De préférence, le composé permettant à cette première solution de se solidfier est l’ion Ca2+. Ainsi, la matrice liquide présente une concentration en Ca2+comprise entre 1 mM et 5 mM, de préférence entre 1,5 mM et 4,5 mM ; laquelle concentration va entraîner sa solidification.
Selon un premier mode de réalisation particulier, la matrice liquide présente une concentration en Ca2+comprise 1 mM et 2 mM, de préférence entre 1,2 mM et 1,4 mM. Selon un deuxième mode de réalisation particulier, la matrice liquide présente une concentration en Ca2+comprise 2 mM et 3 mM, de préférence entre 2,5 mM et 2,9 mM
2+
et plus préférentiellement 2,8 mM de Ca .
A noter que, dans le cas d’une solution de plasma sanguin ou d’une solution dérivée de plasma sanguin, celle-ci est préalablement traitée par un agent anticoagulant aux propriétés réversibles. Pour se faire, cette solution comprend au moins un agent anti-fibrinolytique, comme le citrate de sodium, l’acide tranexamique ou de l’aprotinine, et en concentration suffisante pour obtenir l’activité anti-fribrinolytique recherchée. De préférence la matrice liquide présente une concentration finale (poids/poids total matrice) comprise entre 2 et 5 % de cet au moins un agent anti-fibrinolytique.
Maintenant, la première solution sera de préférence une solution de fibrinogène.
La deuxième solution d’agar-agar ou d’agarose à bas point de fusion est préalablement chauffée pendant une durée et à une température suffisante pour être liquide et pour rester liquide à environ 37°C pendant le temps suffisant pour être mélangée à la première solution dans ledit insert et jusqu’au moment de l’immersion de l’explant de peau. Typiquement, cette deuxième solution est préalablement chauffée à sa température de fusion ou à une température légèrement supérieure, de préférence à une température comprise entre 65 °C et 70 °C. Le choix de l’agar-agar ou de l’agarose à bas point de fusion est fait de sorte à bénéficier, pour une solution à 1,5% (poids/poids total composition) d’une température de gélification comprise entre 24°C et 28°C, et d’une température de fusion supérieure à 65,5°C. A titre d’exemple, on pourra insi citer l’agarose nommé LMP Agarose Low melting point (GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES). Toujours en lien avec cette deuxième solution, sa concentration en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 1% et 5% (de préférence dans une solution physiologique), de manière plus préférée comprise entre 2% et 5%, entre 3% et 4,5%, entre 3,5% et 4, 5% ou encore entre 3,8% et 4,2% ou entre 3,9% et 4, 1%, 4% étant la concentration la plus préférée (en poids rapportée au poids total de la composition). A cette concentration et une fois chauffée à sa température de fusion ou à une température légèrement supérieure, cette deuxième solution en agar- agar ou en agarose à bas point de fusion peut être conservée sous une forme liquide pendant au moins 1 heure à 37 0 voire, idéalement, au moins 4 heures, 10 heures ou 16 heures. De préférence, la matrice liquide apte à se solidifier comprenant ladite première et ladite deuxième solution d’agar-agar ou d’agarose à bas point de fusion, présente une concentration finale en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion comprise entre 0, 1% et 2%, de préférence entre 0,2% et 1,8% (poids/poids totale de la matrice). Une telle concentration permet d’obtenir non seulement une matrice qui une fois solidifiée permet de conserver la structure tridimentionnelle et de maintenir en survie ledit fragment ou biopsie de peau, mais également d’obtenir une matrice solide mais suffisamment souple pour être non cassante et résistante à des chocs ponctuels. La solidification de cette matrice liquide se faisant après dépôt du fragment ou biopsie de peau en laissant le dispositif ainsi obtenu à température comprise entre 37 °C et la température ambiante, de préférence à 20 °C.
Selon un premier mode de réalisation particulier, la concentration finale en agar- agar ou en agarose à bas point de fusion dans la matrice liquide (comprenant la première et ladite deuxième solution) est comprise entre 0,5% et 2%, de préférence entre 0,5% et 1, 25%, de préférence encore entre 0,5% et 1,0%, avec une concentration de 0,7% (poids/poids total de la matrice) étant la concentration la plus préférée.
Selon un deuxième mode de réalisation particulier, la concentration finale en agar- agar ou en agarose à bas point de fusion dans la matrice liquide (comprenant la première et ladite deuxième solution) est comprise entre 0,1% et 2%, de préférence entre 0, 2% et 1,75%, 0,25% étant la concentration la plus préférée. Une telle concentration permet d’obtenir une matrice qui, une fois solidifiée, permet tout à la fois de conserver la structure tridimenssionnelle et de maintenir en survie l’explant de peau, et simultanément d’obtenir une matrice suffisamment souple pour être non cassante et résistante à des effets mécaniques appliqués sur l’explant de peau. La solidification de cette matrice liquide se fait après immersion de l’explant de peau en laissant refroidir l’ensemble.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la matrice liquide apte à se solidifier comprend en outre des cellules autres que les cellules qui composent l’expiants de peau, lesquelles cellules sont choisies dans le groupe consistant en les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules nerveuses. De préférence, ces cellules sont des fibroblastes et, idéalement, des fibroblastes primaires (par opposition aux lignées cellulaires de fibroblastes), tels que des fibroblastes dermiques obtenus à partir de prépuce humain. Ces fibroblastes primaires, notamment dermiques, peuvent être préparés et obtenus à partir de méthodes standards bien connues de l’homme de l’art (voir par exemple le document HOWARD BV et al., A new method for the establishment of diploid fîbroblast cell cultures from human foreskins, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., vol.153(2), p:280-3, 1976). De préférence, ces cellules, et notamment les fibroblastes, sont contenues dans la matrice à une concentration entre 5.103 et 5.105 cellules/ml, de préférence encore entre 104 et 105 cellules/ml, l’intervalle allant de 3.104 à 5.104 cellules/ml étant la gamme de concentration la plus préférée. La matrice liquide pourra en outre comprendre différents composés tels que conservateurs, agents de pH, etc... A titre d’exemple, la matrice liquide contiendra entre 5 et 500 mg/mL d’acide ascorbique, de préférence entre 25 et 75 mg/mL, avec une concentration préférée d’acide ascorbique de 50 mg/mL.
Selon un troisième mode de réalisation également préféré, la matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution dérivée de plasma sanguin et comprend : a) de 25 à 75 % (volume/volume totalA*) de fibrinogène, de préférence de 35 % à 45 % (v/v), b) de 5 % à 12 % (volume/volume total) d’une solution saline de CaCl2 à 1 %, de préférence 8 %, c) de 5 % à 2 %, de préférence l’agent anti-fibrinolytique étant choisi parmi l’acide tranexamique ou de l’aprotinine d) de 0,5% à 4% d’agarose à bas point de fusion, de préférence de 1 % à 2 %, et e) une solution physiologique comme une solution de NaCl à 0,9 %, qsp à
100%. Pour plus de détail en lien avec les matrices aptes à se solidifier et les méthodes pour y placer les expiants de peau, on pourra consulter la demande de brevet Européen n° EP 2 882 290 Al . Maintenant, ces matrices et ces méthodes sont incorporées à la présente demande de brevet par référence. Pour ce qui est de l’insert, il peut prendre des formes multiples et notamment correspondre à un insert suspendu ou à un insert sur pilotis. Maintenant, on optera de préférence pour un insert suspendu. Le fond de cet insert est constitué d’une membrane poreuse dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm et de manière plus préférée entre 9,5 et 30 mm. Pour ce qui est de la porosité de cette membrane, elle doit permettre d’empêcher à la matrice liquide de la traverser avant sa solidification. Typiquement, cette membrane poreuse présentera une porosité comprise entre 0,4 et 8 pm, de manière préférée entre 0,4 pm et 1,5 pm, avec l’intervalle allant de 0,8 mth et 1,2 pm comme intervalle de porosité préféré. En termes de matière, on pourra ainsi choisir une membrane poreuse choisie parmi les membranes en polyéthylène téréphtalate (PET), en nitrocellulose et en polycarbonate. Finalement, et à titre d’exemple de tels inserts, on pourra citer ceux fournis par les sociétés NUNC, CORNING, BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL), qui peuvent prendre la forme d’ inserts avec membrane en polycarbonate, en PET ou en nitrocellulose, lesquels sont pré emballés dans des plaques multi-puits pour plaque de culture 6, 8, 12 ou 24 puits, et dont la porosité de la membrane peut varier de 0,4 et 8pm. Typiquement, les inserts utilisés présentent une membrane en PET de porosité comprise entre 0,8 pm et 1 pm, et sont adaptés pour les puits des plaques de culture à 8 puits.
L’étape de solidification de la matrice liquide est obtenue en présence d’ions calcium, de préférence également en présence de thrombine. Lorsque la matrice liquide est une matrice liquide contenant une solution de plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène ou une solution de collagène, la solidification de cette matrice à l’étape ii) est obtenue pour cette solution suite à l’ajout de thrombine et/ou suite à une augmentation de la température et/ou en présence de facteurs secrétés par les cellules telles que les fibroblastes primaires intégrées à la matrice. Avantageusement, cette matrice liquide se solidifie après un maximum de 8 heures, de préférence moins d’une heure, avec une durée préférée de l’étape de solidification de moins de 10 min après immersion de l’explant de peau dans la matrice liquide apte à se solidifier à l’étape i).
Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend en outre les étapes de : iii) mise en place de l’insert dans un container ou un puits de culture, et iv) mise en culture de l’explant de peau dans un milieu approprié.
Typiquement, le container ou le puits dans lequel est déposé cet insert est un puits d’une plaque de culture cellulaire à 6, 8, 12, 24 ou 48 puits. Parmi les plaques de cultures utilisables dans le procédé selon l’invention, on pourra citer celles fournies en particulier par les sociétés NUNC, CORNING, BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL),
Selon un autre mode de réalisation préférée, le fond de l’insert est situé à une distance comprise entre 1 et 2,5 mm du fond du container/puits le contenant.
Le procédé selon l’invention pourra en outre comprendre une étape iii’), consécutive à l’étape iii), laquelle consiste en apposer un couvercle ou un film sur le container ou le puits dans lequel a été mis en place l’insert à l’étape iii), ceci en vue de rendre ce container ou ce puits étanche. De la sorte, le container ou le puits obtenu peut être transporté sans difficultés, que ce soit par voie terrestre, maritime ou aérienne. En effet, l’expiant de peau est non seulement emprisonné et donc maintenu fermement par la matrice solide dans G insert à membrane poreuse, mais également nourri, pouvant ainsi voyager sans milieu de culture lors de son transport tout en étant maintenu en survie.
Par « culture » ou « mise en culture », on entend désigner ici en particulier la maintenance de l’état physiologique et, le cas échéant, morphologique de l’expiant de peau, et donc desdites cellules qui le compose. Ainsi, on vise par cette étape à limiter les phénomènes de mort cellulaire et à maintenir l’état de différenciation des cellules (en fait limiter les phénomènes de dédifférenciation ou de différenciation inappropriés).
Par « milieu » ou « milieu de culture » on entend une composition liquide comprenant tous les éléments nécessaires à la culture des cellules de l’expiant de peau (ex. milieu William’ s E, KBM, DMEM, etc.). Ce milieu de culture, par sa nature tout autant que par son volume dans le container, permet de favoriser la survie de l’expiant de peau et des cellules le constituant dans le temps. Outre la survie des cellules de l’expiant de peau, le milieu de culture en question permet, notamment en limitant le stress sur celles-ci, de maintenir les cellules de l’explant de peau dans leur état initial que ce soit en terme structurel ou fonctionnnel.
Dans le cas où le procédé selon l’invention ne comprendrait pas l’étape iii’) décrite précédemment, il pourrait comprendre une étape iv’), consécutive à l’étape iii), laquelle consiste en apposer un couvercle ou un film sur le container ou le puit dans lequel a été mis en place l’insert à l’étape iii), ceci en vue de rendre ce container ou ce puit étanche. De la sorte, le container ou le puit obtenu peut être transporté sans difficultés, que ce soit par voie terrestre, maritime ou aérienne.
Selon un mode de réalisation préférée, le procédé selon l’invention comprend en outre l’étape de : v) injection, en sous-cutané et dans l’expiant de peau, d’une composition.
La composition en question est une composition à tester qui est sous forme liquide. Avantageusement, le volume de cette composition est compris entre 10 mΐ et 1 ml, de préférence entre 10 mΐ et 500 mΐ et, de manière particulièrement préférée, entre 10 mΐ et 200 mΐ.
L’aiguille pour l’injection de la composition présente typiquement une longueur suffisante pour atteindre l’hypoderme. Ainsi, on utilisera de préférence des aiguilles présentant une longueur supérieure ou égale à 10 mm. A titre d’exemple de telles aiguilles, on pourra utiliser des aiguilles présentant une longueur de 12, 16, 20, 25, 30, 35, 40 ou encore 45 mm. Avantageusement donc, l’aiguille présente une longueur comprise entre 16 et 45 mm, de préférence une longueur allant de 20 à 40 mm. Pour ce qui est du diamètre de l’aiguille à utiliser, il peut être identifié simplement par l’homme de l’art au regard de ses connaissances générales. Typiquement, de telles aiguilles hypodermiques sont du type 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G voire 31 G.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape v) est réalisée par un expérimentateur. Dans un tel cas, l’étape d’injection v) peut être directement précédée d’une étape v°) de pincement de l’expiant de peau par l’expérimentateur de sorte de permettre la formation d’un pli cutané et de faciliter, pour l’expérimentateur, l’étape v) d’injection sous-cutanée.
Dans un autre mode de réalisation particulier, cette étape v) est réalisée par un dispositif d’injection automatique. Typiquement, le dispositif permet une injection à une profondeur déterminée, par rapport à la surface de l’épiderme, de sorte d’obtenir une injection sous-cutanée.
Selon un autre mode de réalisation préférée, le procédé selon l’invention comprend en outre l’étape de : vi) détermination de l’injectabilité de la composition. Lorsque l’étape v) d’injection est réalisée par un expérimentateur, c’est lui qui va déterminer l’injectabilité de cette composition. Pour se faire, il est possible d’associer à cette injectabilité des valeurs arbitraires associées à des caractéristiques spécifiques de cette injection. A titre d’exemple, l’expérimentateur pourra utiliser l’échelle ci-dessous :
Score 1 : injection impossible ou très difficile ; écoulement : nul ou lent (à-coups) Score 2 : injection difficile ; écoulement : lent au départ (à-coups) puis continu
Score 3 : injection correcte ; écoulement : continu
Score 4 : injection facile ; écoulement : continu
L’expérimentateur, en effectuant, à plusieurs reprises, une injection de la composition donnée, pourra lui attribuer une valeur moyenne d’ injectabilité. Lorsque maintenant l’étape v) d’injection est réalisée par un dispositif d’injection automatique, l’injectabilité est déterminée par celui-ci. Pour se faire, le dispositif d’injection automatique est couplé à un dynamomètre. Ainsi, le dispositif d’injection automatique est capable de déterminer la force nécessaire (mPa) à l’injection sous- cutanée de la composition.
Plus spécifiquement, le dynamomètre permet de déterminer : 1) la force de décollage (“initial glide force” ou PBF), qui correspond à la force requise pour mettre en mouvement le piston de la seringue ;
2) la force maximale (Fmax) qui correspond à la valeur de force mesurée la plus importante pour mettre en mouvement le piston de la seringue avant que ce dernier ne finisse sa course à l’extrémité de la seringue ; et/ou
3) la force de glissement dynamique (« dynamic glide force” ou DGF) qui correspond à la force requise pour maintenir le piston de la seringue en mouvement de sorte qu’il expulse le contenu de celle-ci.
Ces trois valeurs sont caractéristiques de l’injectabilité d’une composition.
Maintenant, et selon un autre mode de réalisation préférée, le procédé selon l’invention pourra comprendre une étape de : vi) détermination du bolus d’injection de la composition, de la toxicité locale résultant de l’injection de la composition et/ou de l’efficacité de la composition.
En lien avec la connaissance de la dose thérapeutique à administrer, le procédé selon l’invention permet de déterminer véritablement le bolus d’injection en sélectionnant un volume d’une composition qui comprend une concentration donnée d’un principe actif.
De même, le procédé selon l’invention permet d’accéder à la toxicité locale résultant de l’injection. Il suffit pour cela de procéder à l’analyse morphologique et/ou moléculaire au niveau site d’injection. Une telle analyse peut être effectuée par l’inclusion du modèle de peau ex vivo à la suite de l’injection, la préparation de coupes à partir du bloc obtenu et enfin l’analyse visuelle et/ou immunohistochimique des coupes localisées au niveau du site d’injection.
Enfin, en ce qui concerne la détermination de l’efficacité de la composition, celle- ci n’est possible que si l’effet thérapeutique résultant de la composition peut être déterminée au niveau du modèle d’injection ex vivo. Pour ce qui est du deuxième objet de l’invention, il s’agit d’un insert pour culture cellulaire susceptible d’être obtenu à l’issu de l’étape ii) du procédé selon l’invention.
Maintenant, il peut s’agir de l’insert tel qu’obtenu à l’issu de l’étape iii’) du procédé selon l’invention. L’ensemble des spécificités de cet insert sont décrites précédemment et notamment le fait qu’il puisse prendre des formes multiples comme un insert suspendu ou sur pilotis avec une préférence pour un insert suspendu grâce à la présence d’ergots (60). Cet insert pourra notamment d’une membrane poreuse dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm, notamment entre 9,5 et 30 mm, dont la porosité est comprise entre 0,4 et 8 pm, voire entre 0,4 pm et 1,5 pm et qui est choisie parmi les membranes en polyéthylène téréphtalate (PET), en nitrocellulose et en polycarbonate.
En lien avec le troisième objet de l’invention, c’est plus spécifiquement la détermination de l’injectabilité d’une composition donnée qui est visée. Naturellement, cette injectabilité est fonction, non seulement de la composition, mais également de la seringue et surtout de l’aiguille utilisée.
Enfin, un kit comprenant un insert tel que défini précédemment et un dispositif d’injection automatique, lequel est de préférence couplé à un dynamomètre, de sorte de pouvoir déterminer les caractéristiques d’ injectabilité d’une composition. De préférence, le dispositif d’injection automatique est à même de déterminer la force de décollage (PBF), la force maximale (Fmax), et la force de glissement dynamique (« dynamic glide force” ou de la composition.
Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d’illustration de l’objet de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES
1) Stabilité de l’explant dans le temps
Des explants de peau sont préparés à partir de deux prélèvements complets de peau issus de deux donneurs distincts, lesquels prélèvements comprenant l’épiderme, le derme et l’hypoderme (1,5 à 2cm). Les expiants (épiderme, derme et hypoderme) sont ensuite découpés à l’aide d’un emporte-pièce métallique pour obtenir des cylindres de 1 1 à 20 mm de diamètre dans lesquels l’épaisseur d’hypoderme est ajustée à la valeur voulue (0,5 à lcm). Puis, ils sont maintenus en flottaison dans une solution saline tamponnée jusqu’à l’étape de « inclusion » dans la matrice solidifiée.
Chaque explant de peau est alors inclus avec un procédé similaire à celui utilisé pour le modèle NATIVESKIN™. Brièvement, l’expiant de peau est délicatement déposé sur un insert (cupule MILLICELL™ 8 puits) disposant au fond d’une membrane poreuse (en PET, porosité 1 pm) et contenant une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles en présence d’ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d’une solution de NaCl à 0,9 %, 8 % d’une solution saline de CaC12 à 1%, un agent anti- fibrinolytique (acide tranexamique ou aprotinine), et de l’agarose fondu à bas point de fusion à 0,7% (Agarose LMP GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES) (fondu à l’étuve à 65,5 °C).
En coagulant, le plasma fait office de support dermique sur lequel adhère l’explant de peau. La coagulation consiste essentiellement en la transformation, en présence d’ions calcium et de thrombine, du fibrinogène présent dans le plasma en un échafaudage de molécules de fibrine reliées entre elles par des liaisons covalentes. L’agent anti-fibrinolytique a pour fonction d’inhiber les enzymes susceptibles de dégrader la matrice de plasma, ces enzymes étant sécrétées par l’explant de peau, et ainsi de maintenir l’intégrité de l’explant.
La solution d’ agarose à 0,7% contenue dans la solution de plasma gélifie progressivement à 37°C permettant ainsi le maintien ferme de l’explant de peau dans l’ insert. La figure 1 illustre représente un tel insert pour culture cellulaire (1) avec des ergots (5) dont le fond est constitué d’une membrane poreuse (2) et qui contient l’explant de peau (3) après qu’il ait été emprisonné dans la matrice solidifiée (4).
L’ensemble constitué par l’explant de peau est maintenu en culture pendant 7 jours dans un incubateur à C02 à 37°C avec l’épiderme au contact de l’air. Le milieu de culture DMEM supplémenté avec du calcium et de la vitamine C contenu dans G insert disposé (suspendu) sur le puits de la plaque de culture cellulaire est changé quotidiennement.
Pour les deux donneurs, des expiants de peau sont prélevés à J0, J3 et J7 jours de culture avant d’être fixés et inclus dans un bloc de paraffine en vue d’effectuer une analyse histologique.
Dans le détail, les explants de peau sont déshydratés par un premier bain d’alcool puis par un second bain de xylène. Enfin, un premier bain dans la paraffine permet de remplacer l’eau préalablement contenue dans l’expiant de peau par la paraffine. Les échantillons imprégnés de paraffine sont sortis de leur bain et transférés dans un récipient dont le fond est tapissé de papier absorbant, afin d’être apportés à proximité de la station d’inclusion.
Les échantillons, enfermés dans des cassettes d’histologie, sont plongés dans la paraffine liquide à 56°C pour faire refondre la paraffine qui les imprègne.
Pour chaque échantillon, la cassette d’histologie est ouverte, l’échantillon est éventuellement coupé en deux. Lin moule d’inclusion est rempli de paraffine liquide et l’échantillon (ou les 2 morceaux d’échantillon) est placé dans le moule et orienté dans le sens désiré pour la coupe. Le moule est en même temps transféré sur un support réfrigéré afin de solidifier la paraffine du fond du moule et d’y maintenir l’échantillon. Le couvercle de la cassette d’histologie sur lequel figure la référence de l’échantillon est placé par-dessus, de telle façon que la paraffine le traverse (possibilité d’ajouter de la paraffine si besoin), puis le tout est placé au froid (réfrigérateur, freezer, chambre froide...) plusieurs minutes (5 à 6), afin de solidifier la paraffine en bloc, emprisonnant de fait l’échantillon dans la bonne orientation avec le couvercle de la cassette d’histologie qui deviendra le support du bloc.
Une fois le bloc de paraffine bien solidifié, il est démoulé. L’excès de paraffine est éventuellement gratté à l’aide d’une spatule sur les côtés du couvercle de la cassette d’inclusion.
Des coupes sériées d’épaisseur variant de 4 à 5 pm sont alors réalisées sur toute la longueur du bloc de paraffine contenant l’échantillon.
Les figures 2A et 2B illustrent les résultats d’une coloration réalisée (Hématoxyline et Eosine) sur les expiants de peau de deux donneurs distincts mis en œuvre dans le procédé selon l’invention après 0, 3 ou 7 jours de culture.
Les résultats montrent une stabilité remarquable des explants dans le temps tant en terme de structure (les différents couches de la peau, dont celle de l’hypoderme ne montrent aucun changement notable) que de viabilité (on n’observe aucune mort cellulaire significative). Pour affiner cette analyse, l’évolution des adipocytes a été suivie dans le temps par analyse d’images (PLUGIN ADIPOSOFT du freeware IMAGEJ).
La figure 3 montre la répartition des adipocytes en fonction de leur surface dans les différents expiants à 0 et 7 jours de culture.
Là encore, les résultats établissent la grande stabilité dans le temps des adipocytes au sein de l’explant de peau du modèle ex vivo d’injection sous-cutanée.
Finalement, ces résultats démontrent que l’explant de peau présente une structure stable de son hypoderme (de même que de son derme et de son épiderme) avec le temps, ce qui en fait un modèle ex vivo de peau complète.
2) Injection sous-cutanée
Des explants de peau sont préparés comme précédemment. Différents essais réalisés sur des explants mis en culture montrent qu’il est possible d’effectuer, sans difficulté, des injections sous-cutanées sur ces explants de peau. En outre, et dès lors que l’explant a un diamètre adapté (de l’ordre de ... mm), il est aisé de pratiquer un pli cutané avec une pince fine, de sorte d’effectuer cette injection. Dans ces conditions, l’explant se maintient parfaitement et se comporte très exactement comme la peau d’un individu.
En vue d’établir que l’explant de peau constitue bien un modèle ex vivo d’injection sous-cutanée, nous avons cherché à savoir si celui-ci réagissait de la même manière qu’m vivo. Pour ce faire, 100 pL d’une solution pro-inflammatoire composée de TNF-alpha
(500 ng/mL) et LPS (0.2 mg/mL) ont été injectés dans le tissu adipeux des modèles à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 27G de 12 mm de longueur. Les modèles ont ensuite été cultivés dans des conditions de culture cellulaire (incubateur à 37°C, 5% de C02 et atmosphère saturée en eau pendant 6h, l2h ou 24h. La figure 4 montre une coloration H&E réalisée sur des coupes en paraffine de 5 pm d’épaisseur afin d’évaluer l’effet de la solution injectée sur la viabilité et la structure du tissu.
Les résultats montrent l’apparition de cellules vacuolisées et pycnotiques dans l’épiderme des modèles, ainsi qu’une dégradation partielle des fibres de collagène du derme, suggérant une dégénérescence liée à l’effet de la solution pro-inflammatoire.
En conséquence, ces résultats confirment que la pertinence de ce modèle d’injection sous cutané, lequel se comporte bien comme la peau in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un procédé in vitro comprenant les étapes de :
i) immersion d’un expiant de peau dans une matrice liquide apte à se solidifier de sorte que la face supérieure de l’épiderme ne soit pas recouverte, laquelle matrice est elle-même contenue dans un insert pour culture cellulaire dont le fond est constitué d’une membrane poreuse, et
ii) solidification de cette matrice de sorte d’emprisonner la partie immergée de cet expiant de peau, où la face supérieure de l’épiderme n’est pas recouverte, et de faire adhérer cette même matrice aux parois latérales et à la membrane poreuse de G insert,
Caractérisé en ce que l’explant de peau comprend une épaisseur d’au moins 5 mm d’hypoderme et en ce que le procédé vise à l’obtention d’un modèle ex vivo pour l’injection sous-cutanée.
2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend en outre les étapes de :
iii) mise en place de l’ insert dans un container ou un puits de culture, et iv) mise en culture de l’explant de peau dans un milieu approprié.
3. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend en outre l’étape de :
v) injection, en sous-cutané et dans l’explant de peau, d’une composition.
4. Le procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend en outre l’étape de :
vi) détermination de l’injectabilité de la composition.
5. Le procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend en outre l’étape de :
vi) détermination du bolus d’injection de la composition, de la toxicité locale résultant de l’injection de la composition et/ou de l’efficacité de la composition.
6. Un insert pour culture cellulaire susceptible d’être obtenu par le procédé selon la revendication 1 , qui peut être mis en place dans un container ou un puit de culture, qui présente un fond constitué d’une membrane poreuse et qui contient l’explant de peau emprisonné dans une matrice solidifiée qui est en contact avec le bord interne de l’insert et la membrane poreuse, et où l’épiderme de l’expiant de peau est en contact avec l’atmosphère, et le derme, les annexes épidermiques et l’hypoderme de cet expiant de peau sont immergés dans la matrice solidifiée.
7. Une utilisation d’un insert tel que défini à la revendication précédente en tant que modèle ex vivo d’injection sous cutanée.
8. L’utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le modèle ex vivo d’injection sous cutanée vise à déterminer l’injectabilité d’une composition.
9 L’utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le modèle ex vivo d’injection sous cutanée vise à déterminer le bolus d’injection d’une composition, la toxicité locale résultant de l’injection d’une composition et/ou l’efficacité de la composition.
10. Un kit comprenant un insert tel que défini à la revendication 6 et un dispositif d’injection automatique.
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