EP3857285A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe

Info

Publication number
EP3857285A1
EP3857285A1 EP19786270.9A EP19786270A EP3857285A1 EP 3857285 A1 EP3857285 A1 EP 3857285A1 EP 19786270 A EP19786270 A EP 19786270A EP 3857285 A1 EP3857285 A1 EP 3857285A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
wavelength
points
lighting
raster
unit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19786270.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lars Friedrich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3857285A1 publication Critical patent/EP3857285A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0064—Optical details of the image generation multi-spectral or wavelength-selective arrangements, e.g. wavelength fan-out, chromatic profiling
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a method for scanning a sample in microscopy, in which at least three illumination points are generated to form a point pattern.
  • the invention further relates to a device for scanning a sample in microscopy, with an illumination unit that generates at least three illumination points to form a dot pattern.
  • Known microscopy methods for scanning a sample use point patterns from several illumination points. By using several lighting points, several points assigned to the lighting points can be scanned on or in the sample. The scanning process is parallelized, so to speak, and the speed at which the sample is scanned is increased.
  • Known methods for scanning a sample also use illumination points with different wavelengths in order to excite different dyes in the sample, with which, for example, different sub-areas of the sample have been marked, for fluorescence. In this way, the position and the movement of the different sub-areas of the sample can be observed relative to one another.
  • the illuminating light points are imaged in a sample and fluorescent light emitted by the sample is recorded with a camera.
  • a microscope is known from US 2009109527 A1, in which an acousto-optical deflector (AOD) is used to generate illumination points which are arranged along a straight line and which are imaged in a sample.
  • the fluorescent light emitted by the sample is detected with an arrangement of point detectors, with a point detector being assigned to each illumination point.
  • AOD acousto-optical deflector
  • a device for multispot scanning microscopy is known from EP 3217205 A1, with a multicolored light source for generating an illumination light beam, a separating device for separating the illuminating light beam into a plurality of illuminating light partial beams and an illuminating beam path for guiding and focusing the illuminating light partial beams into a luminous spot on or in a sample. At least two of the illuminating beam paths comprise controllable beam manipulation means for adjusting the spectral composition of the illuminating light partial beam assigned to the illuminating beam path.
  • the device further comprises a scanning unit for guiding the light spots over the sample, a detection unit for detecting detection light and a control unit for controlling the scanning unit and the detection unit.
  • At least three illumination points are generated to form a point pattern.
  • the dot pattern formed by the illumination points is used to scan at least one predetermined area of the sample along a first direction to generate raster lines, which are each assigned to the illumination points of the dot pattern, and along a second direction to generate the raster lines - Because subsequently generated raster lines moved.
  • the dot pattern has min at least two lighting points with a first wavelength and a single lighting point with a second wavelength different from the first wavelength.
  • a raster line is a region of the sample that extends essentially in the first direction and is scanned by the at least two illumination points with the first wavelength and / or the illumination point with the second wavelength.
  • the specified area of the sample thus comprises a plurality of raster lines which follow one another along the second direction. It is often referred to as a "region of interest" (ROI).
  • ROI region of interest
  • the method according to the invention scans the sample with the at least two illumination points of the first wavelength. At the same time, the sample is scanned with the one illumination point with the second wavelength.
  • illumination points of different wavelengths allows in particular the excitation of two different fluorescent dyes with which different partial areas of the sample have been marked. In this way, for example, the position and the movement of the different partial areas can be observed relative to one another.
  • the scanning process is parallelized, which increases the speed at which the sample is scanned with illumination points of the first wavelength. The increased speed makes it possible, in particular, to observe dynamic processes in the sample, for example biological processes.
  • the method according to the invention thus combines the advantages of methods for scanning a sample with a dot pattern from a plurality of illumination points - a so-called multispot illumination - with the advantages of methods for scanning a sample that have a single illumination point - a so-called single spot or Single spot lighting - use.
  • the first direction is preferably perpendicular to the second direction. This case is easy to implement and can be used for common sample geometries. Alternatively, any other angle other than 90 ° can also be included by the first direction and the second direction.
  • the predetermined area is scanned continuously or step by step. Due to the continuous or step-by-step scanning, raster lines are scanned along the first direction, which serve as the basis for the generation of image lines in a later detection method.
  • the predetermined area is completely scanned by the lighting points with the first wavelength in a single raster pass, and if, when moving the point pattern along the second direction, the predetermined area is scanned by the lighting point is completely scanned with the second wavelength in at least two raster passes.
  • the dot pattern is shifted between two successive raster passes by at least one raster line along the second direction.
  • the predetermined area is preferably completely scanned by the illumination point with the second wavelength in a number of raster passes which corresponds to the number of illumination points with the first wavelength and the dot pattern after each raster pass by at least one raster. line offset.
  • the dot pattern is preferably moved along the second direction in such a way that it is moved in a raster step by at least two raster lines along the second direction. If the dot pattern is moved in the raster direction by at least two raster lines in the second direction, a maximum of every second raster line of the specified area is scanned by the illumination point with the second wavelength.
  • the term “scanning through” means the complete scanning of the specified area with the aid of the illumination points with the first wavelength.
  • a single raster run along the second direction can include movements of the dot pattern both with and against the second direction, as long as the predetermined range is completely scanned with the first wavelength by this procedure (ie covered by raster steps).
  • the dot pattern is first moved in the second direction, whereby individual partial areas of the predetermined area are skipped (ie not scanned), and then the dot pattern is moved against the second direction in order to scan these partial areas skipped in the outward movement.
  • a raster scan is a movement of the dot pattern with the second direction, partial areas are skipped, then a return against the second direction to the starting position (or another suitable position) and scanning of the first area that was skipped.
  • a raster step is understood to mean moving the dot pattern along the second direction to produce a raster line, the raster line generated in this way following a different raster line (except in the case of the first raster step of a raster run).
  • each raster line of the specified area can be scanned by the lighting points with the first wavelength, while only every second raster line of the specified area is scanned by the lighting point with the second wavelength.
  • the raster lines of the predetermined area that are not rasterized by the illumination point with the second wavelength are rasterized in the first raster run.
  • the dot pattern is preferably shifted by exactly one raster line in or against the second direction after a raster pass. If the raster lines serve as the basis for the generation of image lines in a later detection method, two images assigned to the first wavelength are generated for each image assigned to the second wavelength. As a result, a high refresh rate of images assigned to the first wavelength is achieved.
  • the refresh rate of Images associated with the second wavelength are smaller by a factor that corresponds to the number of illumination points with the first wavelength.
  • the illumination points of the dot pattern are arranged on a line along the second direction. This makes the process particularly simple since the generation and use of two-dimensional dot patterns is relatively complex in comparison to the generation of one-dimensional dot patterns.
  • the illumination points are arranged equidistantly with the first wavelength.
  • the equidistant arrangement of the lighting points with the first wavelength represents a particularly simple form of the dot pattern.
  • the lighting points with the first wavelength can also be arranged in groups, the lighting points assigned to a group being equi-distant with the first wavelength are arranged at a first distance from one another, while the groups have a second distance from one another which differs from the first distance (see FIG. 3 for an example).
  • a distance, defined in raster lines, between the illumination points with the first wavelength and / or a number of raster lines by which the dot pattern is moved in a raster step along the second direction also depends on the number of illumination points depends on the first wavelength.
  • the distance between two lighting points defined in raster lines is understood to be the number of raster lines that one of the two lighting points has to be moved along the second direction in order to reach the position of the other lighting point to get. Two raster lines in direct succession are therefore at a distance of one raster line.
  • the distance defined in raster lines between the lighting points with the first wavelength is equal to the number of lighting points with the first wavelength plus one.
  • all raster lines of the specified area with the lighting points with the first wavelength can be scanned in one raster scan if the dot pattern in each of the raster steps by a number of raster lines corresponding to the number the lighting points are moved along the second direction.
  • a number of raster passes is necessary which corresponds to the number of illumination points with the first wavelength.
  • the illumination points with the first wavelength and the illumination point with the second wavelength are non-overlapping illumination points.
  • the illumination points can overlap with the first wavelength and the illumination point with the second wavelength.
  • the invention further relates to a device for scanning a sample in microscopy, with an illumination unit that generates at least three illumination points to form a point pattern.
  • the device comprises a control unit for controlling the illumination unit, the control unit controlling the illumination unit in such a way that the illumination unit generates the dot pattern formed by the illumination points for scanning at least a predetermined area of the sample along a first direction of raster lines, each of which is assigned to the illumination points of the dot pattern, and moved along a second direction to generate raster lines which are subsequently generated in each case from the raster lines.
  • the dot pattern generated with the aid of the lighting unit has at least two lighting points with a first wavelength and a single lighting point with a second wavelength different from the first wavelength.
  • the illumination unit preferably has a scanning unit for moving the dot pattern along the first and / or second direction.
  • the device according to the invention scans the sample with the at least two illumination points of the first wavelength and with the one illumination point with the second wavelength in parallel.
  • the illumination points with different wavelengths make it possible, in particular, to excite two different fluorescent dyes with which, for example, two different partial areas of the sample are marked, for fluorescence.
  • the rasterization process is parallelized, which increases the speed at which the sample is scanned with illumination points of the first wavelength. The increased speed makes it possible, in particular, to observe dynamic processes in the sample, for example biological processes.
  • the device according to the invention thus combines the advantages of devices for scanning a sample with a dot pattern from a plurality of illumination points with the advantages of devices for scanning a sample that use lighting points with different wavelengths.
  • the illumination points with the first wavelength and the illumination point with the second wavelength are preferably non-overlapping illumination points.
  • the lighting points with the first wavelength and the lighting point with the second wavelength can overlap.
  • the unit for generating the point pattern comprises at least one first wavelength-selective beam splitter.
  • the first wavelength-selective beam splitter can, for example, be transparent to light with the first wavelength and reflect light with the second wavelength.
  • the first light source unit generates a light bundle with the first wavelength and the lighting unit has a beam multiplication unit, the beam multiplication unit generating the illumination points with the first wavelength from the light bundle with the first wavelength.
  • the beam multiplication unit preferably comprises at least one acousto-optical deflector (AOD) or at least one beam splitter.
  • AOD acousto-optical deflector
  • the use of an AOD enables flexible adjustment of the distances between the lighting points. With the help of beam splitters, complex dot patterns can also be generated.
  • the invention further relates to a microscope with a device for scanning a sample according to the aforementioned type.
  • the microscope according to the invention in particular enables microscopic observation of dynamic processes in the sample, for example biological processes. It is particularly advantageous if the microscope has a first detection unit that detects the detection light originating from the sample with a third wavelength assigned to the first wavelength, for example a spatially resolved surface detector, and a second detection unit that also includes the detection light originating from the sample a fourth wavelength assigned to the second wavelength, for example a non-spatially resolved point detector. This allows at least two different partial areas of the sample, which are marked with two different fluorescent dyes, to be observed microscopically at the same time.
  • FIG. 1 shows a method for scanning a sample with two illumination points with a first wavelength and an illumination point with a second wavelength according to a first embodiment
  • FIG. 2 shows a method for scanning a sample with three illumination points with the first wavelength and one illumination point with the second wavelength according to a second exemplary embodiment
  • FIG. 3 shows a method for scanning a sample with four illumination points with the first wavelength and one illumination point with the second wavelength according to a third exemplary embodiment
  • Figure 4 shows the method for scanning the sample according to a fourth embodiment
  • Figure 5 shows the method for scanning the sample according to a fifth embodiment
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a microscope with a device for scanning a sample according to an exemplary embodiment.
  • FIGS. 1 to 5 show a method for scanning a sample using various exemplary embodiments.
  • at least two illumination points with a first wavelength LI which are generally provided with the reference symbol 12 and are numbered with LIPO, L1P1, etc., and an illumination point 13 with a second wavelength L2 are generated to form a dot pattern.
  • the dot pattern which is generally given the reference numeral 10 below, is moved to scan at least one predetermined area 40 of the sample 102.
  • the movement of the dot pattern 10 takes place along a first direction for the generation of raster lines assigned to the illumination points 12, 13 of the dot pattern 10, which are generally provided with the reference number 14 below, and along a second direction for the generation of the raster lines 14 raster lines 14 each subsequently generated.
  • the at least one predetermined area 40 is continuously scanned along the first direction and scanned step by step along the second direction.
  • the step-by-step scanning of the predetermined region 40 along the second direction takes place in grid steps which are generally provided with the reference symbol 16.
  • Figures 1 to 3 the respective positions of the illumination points 12, 13 along the second direction, ie from top to bottom in FIGS. 1 to 3, are shown in chronologically successive raster steps 16 which are numbered starting with 0.
  • the sample is scanned in a plurality of chronologically successive raster runs, which are generally provided with the reference symbol 18 and which are numbered starting with 0.
  • a first raster area 42 is scanned by the illumination points 12 with the first wavelength LI, which is shown in FIGS. 1 to 3 to the right of the respective raster pass 18.
  • a second raster area 43 is scanned in each raster pass 18 by the illumination point 13 with the second wavelength L2, which is also shown on the right of the respective raster pass 18 in FIGS. 1 to 3.
  • FIG. 1 shows the method for scanning a sample with two illumination points 12 with the first wavelength LI and one illumination point 13 with the second wavelength L2 according to a first exemplary embodiment.
  • the two lighting points 12 with the first wavelength LI are arranged at a distance of three raster lines 14 along the second direction.
  • the illumination point 13 with the second wavelength L2 is arranged at a distance from a raster line 14 in the second direction to the first illumination point 12 (numbered with LIPO) with the first wavelength LI such that the three illumination points 12, 13 of the dot pattern 10 are in a line are arranged along the second direction.
  • the step-by-step scanning of the predetermined area 40 along the second direction is carried out by the dot pattern 10 in each step 16 by two Raster lines 14 is moved along the second direction.
  • the positions of the dot pattern 10 with raster steps 16 assigned to one another, ie with raster steps 16 with the same numbering, is in the second raster run 18 (numbered 1) compared to the first raster run 18 (numbered 0) by one raster line 14 in the direction of the second Offset direction.
  • the first raster region 42 which completely encompasses the predetermined region 40, is scanned by the illumination points 12 with the first wavelength LI. Every second raster line 14 of the predetermined area 40 is scanned by the illumination point 13 with the second wavelength L2 in each raster pass 18.
  • the illumination point 13 scans a third raster region 44 with the second wavelength L2, which completely encompasses the predetermined region 40 and which is shown on the far right in FIG.
  • the predetermined region 40 is consequently completely scanned in two successive raster passes 18 through the illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • Results obtained by detection can advantageously be used individually in each of the raster runs 18.
  • Images associated with the first and second wavelengths LI, L2 can be generated from these results.
  • the image associated with the first wavelength LI can be displayed after each raster pass 18.
  • the image associated with the second wavelength L2 can be displayed after every second raster pass 18.
  • the image assigned to the first wavelength LI can consequently be displayed with a frame rate twice as high as the image assigned to the second wavelength L2.
  • Figure 2 shows the method for scanning the sample according to a second embodiment.
  • FIG. 2 is divided into three sub-figures 2A to 2C, which follow one another on the dash-dotted lines.
  • the second exemplary embodiment shown in FIG. 2 differs from the first exemplary embodiment shown in FIG.
  • the sample 102 is scanned with three illumination points 12 with the first wavelength LI and one illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • the total of four lighting points 12, 13 of the point pattern 10 are arranged on a line along the second direction.
  • the three lighting points 12 with the first wavelength LI are arranged at a distance of four raster lines 14 along the second direction.
  • the step-by-step scanning of the predetermined region 40 along the second direction takes place in the second exemplary embodiment shown, in that the dot pattern 10 is moved by three raster lines 14 along the second direction in each raster step 16.
  • the positions of the dot pattern 10 with mutually assigned raster steps 16, i.e. in the case of raster steps 16 with the same numbering, one raster line 14 is offset in the direction of the second direction in the case of directly successive raster passes 18.
  • every third raster line 14 of the predetermined area 40 is scanned by the illumination point 13 with the second wavelength L2 in each raster run 18.
  • the third raster range 44 is scanned by the illumination point 13 with the second wavelength L2, which completely encompasses the predetermined range 40 and which is shown on the far right in FIG. 2C.
  • the predetermined area 40 is consequently completely scanned in three successive raster passes 18 through the illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • the image associated with the second wavelength L2 can be displayed after every third raster pass 18.
  • the representation of the image assigned to the first wavelength LI can consequently take place with a frame rate that is three times as high as the representation of the image associated with the second wavelength L2.
  • FIG. 3 shows the method for scanning the sample in accordance with a third exemplary embodiment.
  • FIG. 3 is divided into four sub-figures 3A to 3D, which follow one another on the dash-dotted lines.
  • the third exemplary embodiment shown in FIG. 3 differs from the first exemplary embodiment shown in FIG. 1 essentially in that the sample 102 is scanned with four illumination points 12 with the first wavelength LI and one illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • the five lighting points 12, 13 of the dot pattern 10 are arranged on a line along the second direction.
  • the four lighting points 12 with the first wavelength LI are divided into two groups 20, each with two lighting points 12 with the first wavelength LI.
  • the two illumination points 12 with the first wavelength LI of each of the two groups 20 are arranged at a distance of two raster lines 14 along the second direction.
  • the two groups 20 are spaced three apart Raster lines 14 to each other.
  • the illumination point 13 with the second wavelength L2 is arranged at a distance from a raster line 14 in the second direction to the first illumination point 12 (numbered with LIPO) with the first wavelength LI.
  • Every fourth raster line 14 of the predetermined area 40 is scanned by the illumination point 13 with the second wavelength L2 in each raster pass 18.
  • a third raster region 44 is scanned by the illumination point 13 with the second wavelength L2, which completely encompasses the predetermined region 40 and which is shown on the far right in FIG. 3D.
  • the predetermined area 40 is consequently completely scanned in four successive raster passes 18 by the illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • the image associated with the second wavelength L2 can be displayed after every fourth raster pass 18.
  • the image associated with the first wavelength LI can consequently be displayed at a frame rate that is four times as high as the image associated with the second wavelength L2.
  • FIG. 4 shows the method for scanning the sample in accordance with a fourth exemplary embodiment.
  • FIG. 4 is divided into four sub-figures 4A to 4D, which follow one another on the dash-dotted lines.
  • the fourth exemplary embodiment shown in FIG. 4 differs from the first exemplary embodiment shown in FIG. 3 essentially in that the four illumination points 12 are arranged equidistantly with a spacing of five raster lines 14 along the second direction.
  • the predefined region 40 is consequently completely scanned in four successive raster passes 18 by the illumination point 13 with the second wavelength L2.
  • FIG. 5 shows the method for scanning the sample in accordance with a fifth exemplary embodiment.
  • the fifth exemplary embodiment shown in FIG. 5 essentially differs from the first exemplary embodiment shown in FIG. 1 in that the first illumination point denoted by LIPO with the first wavelength LI and the second illumination point denoted by L1P1 with the first wavelength LI do not lie on a line along the second direction. Furthermore, the first illumination point with the first wavelength LI and the illumination point designated L2 with the second wavelength L2 partially overlap.
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a microscope 100 with a device 110 for scanning a sample 102 in accordance with an exemplary embodiment.
  • the microscope 100 furthermore comprises objective optics 104, a first detection unit 106, a second detection unit 108 and an observation beam path 112.
  • the microscope 100 according to FIG. 6 is particularly suitable for implementing the method according to one of the exemplary embodiments Figures 1 to 5 perform.
  • the device 110 for scanning the sample 102 comprises an illumination unit 114 for generating a dot pattern 10, a control unit 116 for Control of the lighting unit 114 and other optical elements, such as, for example, lenses, diaphragms, filters or prisms, which are generally designated by the reference mark 118.
  • the lighting unit 114 has a first light source unit 120 for generating lighting points 12 with a first wavelength LI and a second light source unit 122 for generating an lighting point 13 with a second wavelength L2.
  • the lighting unit 114 also has a first wavelength-selective beam splitter 124 for generating the point pattern 10.
  • the first light source unit 120 has a first light source 126 which generates a light bundle 127 with the first wavelength LI, and a beam multiplication unit 128, for example a beam splitter or an acousto-optical deflector (AOD), which generates the illumination points 12 with the first wavelength LI from the light bundle 127 with the first wavelength LI.
  • AOD acousto-optical deflector
  • the illumination unit 114 also has a scanning unit 130 (for example comprising one or more scanning mirrors) for moving the dot pattern 10 along a first and a second direction.
  • the scanning unit 130 is arranged outside the observation beam path 112.
  • the scanning unit 130 can be arranged within the observation beam path 112, as a result of which the scanning or scanning movement is canceled again when detection light 138, 139 emanating from the sample 102 returns. This is commonly referred to as a "descanned" arrangement.
  • the control unit 116 controls the scanning unit 130 of the lighting unit 114 in such a way that the scanning unit 130 scans the dot pattern 10 for scanning at least a predetermined area 40 of the sample 102 along the first Direction for generating raster lines 14, each of which is assigned to the illumination points 12, 13 of the dot pattern 10, and moved along the second direction for generating raster lines 14 which are subsequently generated in each case.
  • the observation beam path 112 is located between the sample 102 and the first detection unit 106.
  • the objective optics 104 In the observation beam path 112 are the objective optics 104, a second wavelength-selective beam splitter 132, a third wavelength-selective beam splitter 134 and further optical elements such as lenses, diaphragms, filters or prisms, which are generally designated by reference numeral 136.
  • the second wavelength-selective beam splitter 132 reflects light with the first wavelength LI and with the second wavelength L2 and is transmissive to light with a third wavelength LI 'assigned to the first wavelength LI.
  • the second wavelength-selective beam splitter 132 couples the dot pattern 10 generated by the illumination unit 114 into the observation beam path 112, which thus also serves as an illumination beam path, and reflects it in the direction of the objective optics 104.
  • the objective optics 104 images the dot pattern 10 on or in the sample 102.
  • the dot pattern 10 there excites dyes to emit detection light 138 with the third wavelength LI 'and detection light 139 with the fourth wavelength L2'.
  • the detection light 138 emanating from the sample 102 with the third wavelength LI 'and the detection light 139 emanating from the sample 102 with the fourth wavelength L2' is guided into the observation beam path 112 by the objective optics 104.
  • the third wavelength-selective beam splitter 134 reflects light with the fourth wavelength L2 'and is transparent to light with the first wavelength LI, light with the second wavelength L2 and light with the third wavelength LI'.
  • the third wavelength-selective beam splitter 134 couples the detection light 139 from the sample 102 with the fourth wavelength L2 'out of the observation beam path 112 and directs it into the second detection unit 108.
  • the first detection unit 106 comprises a first emission filter 140, which is only permeable to light with the third wavelength LI ', and a first sensor element 142, for example a CCD chip.
  • the first sensor element 142 detects the detection light emanating from the sample 102 138 recorded with the third wavelength LI '.
  • the detection light 138 with the third wavelength LI 'detected by the first sensor element 142 can in particular serve as the basis for the generation of an image associated with the first wavelength LI.
  • the first sensor element 142 can also comprise a plurality of point detectors, with each lighting point 12 having the first wavelength LI having its own point detector.
  • the second detection unit 108 comprises a second emission filter 144, which is only permeable to light with the fourth wavelength L2 ', a second sensor element 146, which is designed, for example, as a 1-channel detector, and further optical elements, such as for example lenses, diaphragms, filters or prisms, which are generally designated by the reference symbol 148.
  • the second sensor element 146 detects the detection light 139 emanating from the sample 102 with the fourth wavelength L2 '.
  • the detection light 139 with the fourth wavelength L2 'detected by the second sensor element 146 can serve in particular as the basis for generating an image associated with the second wavelength L2.
  • both the detection light 138 with the third wavelength LI 'and the detection light 139 with the fourth wavelength L2' are detected by the first sensor element 142.
  • the microscope 100 according to the alternative configuration therefore does not require a second detection unit 108 and no wavelength-selective beam splitter 134.
  • the second wavelength-selective beam splitter 132 is also transparent to light with a fourth wavelength L2 'assigned to the second wavelength L2.
  • the microscope 100 according to the alternative embodiment has an image separation system (“image splitting device”) for splitting light incident into the first detection unit 106 according to the third wavelength L1 'and the fourth wavelength L2'.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Bei einem Verfahren werden mindestens drei Beleuchtungspunkte (12, 13) zur Bildung eines Punktmusters (10) erzeugt. Das Punktmuster (10) wird zum Abrastern zumindest eines vorgegebenen Bereichs (40) einer Probe (102) entlang einer ersten Richtung und entlang einer zweiten Richtung bewegt. Das Punktmuster (10) hat mindestens zwei Beleuchtungspunkte (12) mit einer ersten Wellenlänge L1 und einen Beleuchtungspunkt (13) mit einer zweiten Wellenlänge L2. Eine Vorrichtung (110) zum Abrastern einer Probe (102) hat eine Beleuchtungseinheit (114), die mindestens drei Beleuchtungspunkte (12, 13) zur Bildung eines Punktmusters (10) erzeugt, eine Steuereinheit (116), welche die Beleuchtungseinheit (114) derart steuert, dass diese das Punktmuster (10) zum Abrastern zumindest eines vorgegebenen Bereichs (40) der Probe (102) entlang einer ersten Richtung und entlang einer zweiten Richtung bewegt. Das Punktmuster (10) hat mindestens zwei Beleuchtungspunkte (12) mit einer ersten Wellenlänge L1 und einen Beleuchtungspunkt (13) mit einer zweiten Wellenlänge L2.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abrastern einer Probe in der Mikrosko- pie, bei dem mindestens drei Beleuchtungspunkte zur Bildung eines Punktmus- ters erzeugt werden. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zum Abras- tern einer Probe in der Mikroskopie, mit einer Beleuchtungseinheit, die mindes- tens drei Beleuchtungspunkte zur Bildung eines Punktmusters erzeugt.
Bekannte Mikroskopieverfahren zum Abrastern einer Probe nutzen Punktmus- ter aus mehreren Beleuchtungspunkten. Durch das Verwenden mehrerer Be- leuchtungspunkte können mehrere den Beleuchtungspunkten zugeordnete Punkte auf oder in der Probe abgerastert werden. Der Abrastervorgang wird gleichsam parallelisiert und somit die Geschwindigkeit erhöht, mit der die Probe abgerastert wird.
Bekannte Verfahren zum Abrastern einer Probe nutzen ferner Beleuchtungs- punkte mit unterschiedlichen Wellenlängen, um verschiedene, in der Probe be- findliche Farbstoffe, mit denen beispielsweise unterschiedliche Teilbereich der Probe markiert wurden, zur Fluoreszenz anzuregen. Flierdurch können die Lage und die Bewegung der unterschiedlichen Teilbereiche der Probe relativ zuei- nander beobachtet werden.
Aus Bingen, P.; Reuss, M.; Engelhardt, J. & Hell, S. W. Parallelized STED flu orescence nanoscopy Opt Express, 2011, 19, 23716-23726 ist ein Verfahren be- kannt, bei dem mithilfe von Wollaston-Prismen mehrere Beleuchtungslicht- punkte erzeugt werden, die jeweils aus Licht mit unterschiedlichen Wellenlän- gen gebildet sind. Aus Bewersdorf, J.; Pick, R. & Hell, S. W. Multifocal multiphoton microscopy Opt Lett, 1998, 23, 655-657 ist ein Mikroskop bekannt, bei dem mithilfe einer An- ordnung von Mikrolinsen mehrere Beleuchtungslichtpunkte erzeugt werden.
Die Beleuchtungslichtpunkte werden in eine Probe abgebildet und von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht wird mit einer Kamera erfasst.
Aus der US 2009109527 Al ist ein Mikroskop bekannt, bei dem ein akustoopti- scher Deflektor (AOD) benutzt wird, um Beleuchtungspunkte zur erzeugen, die entlang einer geraden Linie angeordnet sind und die in eine Probe abgebildet werden. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird mit einer Anord- nung von Punktdetektoren detektiert, wobei jedem Beleuchtungspunkt ein Punktdetektor zugeordnet ist.
Aus Poland, S. P.; Krstajic, N.; Monypenny, J.; Coelho, S.; Tyndall, D.; Walker, R. J.; Devauges, V.; Richardson, J.; Dutton, N.; Barber, P.; Li, D. D.-U.; Suhling, K.; Ng, T.; Henderson, R. K. & Ameer-Beg, S. M. A high speed multifocal multipho- ton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging Biomed Opt Express, 2015 ist ein Mikroskop bekannt, bei dem mithilfe eines Spatial Light Modulators (SLM) mehrere Beleuchtungspunkte erzeugt werden, die in ei- nem zweidimensionalen Gitter angeordnet sind und die in eine Probe abgebil det werden. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird mit einer An- ordnung von Punktdetektoren detektiert, wobei jedem Beleuchtungspunkt ein Punktdetektor zugeordnet ist.
Aus EP 3217205 Al ist eine Vorrichtung zu Multispot-Scanning-Mikroskopie be- kannt, mit einer mehrfarbigen Lichtquelle zur Erzeugung eines Beleuchtungs- lichtstrahls, einer Trenneinrichtung zum Auftrennen des Beleuchtungslicht- strahls in mehrere Beleuchtungslichtteilstrahlen und einem Beleuchtungsstrah- lengang zum Leiten und Fokussieren der Beleuchtungslichtteilstrahlen in jeweils einen Leuchtfleck auf oder in einer Probe. Mindestens zwei der Beleuchtungs- Strahlengänge umfassen steuerbare Strahlmanipulationsmittel zum Einstellen der spektralen Zusammensetzung des jeweils dem Beleuchtungsstrahlengang zugeordneten Beleuchtungslichtteilstrahls. Die Vorrichtung umfasst ferner eine Scaneinheit zum Führen der Leuchtflecke über die Probe, eine Detektionsein- heit zum Nachweis von Detektionslicht und eine Steuereinheit zum Steuern der Scaneinheit und der Detektionseinheit.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, die es ermöglichen, eine Probe besonders effizient mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge abzurastern.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Vorrichtung nach Anspruch 11 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden mindestens drei Beleuchtungs- punkte zur Bildung eines Punktmusters erzeugt. Das durch die Beleuchtungs- punkte gebildete Punktmuster wird zum Abrastern zumindest eines vorgegebe- nen Bereichs der Probe entlang einer ersten Richtung zur Erzeugung von Ras- terzeilen, die jeweils den Beleuchtungspunkten des Punktmusters zugeordnet sind, und entlang einer zweiten Richtung zur Erzeugung von den Rasterzeilen je- weils nachfolgend erzeugten Rasterzeilen bewegt. Das Punktmuster hat min- destens zwei Beleuchtungspunkte mit einer ersten Wellenlänge und einen ein- zigen Beleuchtungspunkt mit einer von der ersten Wellenlänge verschiedenen zweiten Wellenlänge.
In der vorliegenden Anmeldung wird als Rasterzeile ein sich im Wesentlichen in die erste Richtung erstreckender Bereich der Probe bezeichnet, der durch die wenigstens zwei Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge und/oder den Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge abgerastert wird. Der vorgege- bene Bereich der Probe umfasst somit mehrere entlang der zweiten Richtung aufeinander folgende Rasterzeilen. Er wird häufig auch als„region of interest" (ROI) bezeichnet.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Probe mit den wenigstens zwei Beleuchtungspunkten der ersten Wellenlänge abgerastert. Gleichzeitig wird die Probe mit dem einem Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge abgerastert. Die Verwendung von Beleuchtungspunkten verschiedener Wellen- länge erlaubt insbesondere die Anregung zweier verschiedener Fluoreszenz- farbstoffe, mit denen verschiedene Teilbereiche der Probe markiert worden sind. Hierdurch können beispielsweise die Lage und die Bewegung der verschie- denen Teilbereiche relativ zueinander beobachtet werden. Durch die Verwen- dung von zwei Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge wird der Ras- tervorgang parallelisiert, was die Geschwindigkeit erhöht, mit der die Probe mit Beleuchtungspunkten der ersten Wellenlänge abgerastert wird. Durch die er- höhte Geschwindigkeit ist es insbesondere möglich, dynamische Vorgänge in der Probe, beispielsweise biologische Prozesse, zu beobachten. Das erfindungsgemäße Verfahren verbindet somit die Vorteile von Verfahren zum Abrastern einer Probe mit einem Punktmuster aus mehreren Beleuch- tungspunkten - eine sogenannte Multispot-Beleuchtung - mit den Vorteilen von Verfahren zum Abrastern einer Probe, die einen einzigen Beleuchtungs- punkt - eine sogenannte Einzelspot- oder Singlespot-Beleuchtung - nutzen.
Zum Bewegen des Punktmusters ist ferner nur eine einzige Abrastereinheit er- forderlich, da nur ein einziges Punkmuster bewegt werden muss. Das erfin- dungsgemäße Verfahren ist somit auch besonders einfach zu realisieren.
Vorzugsweise verläuft die erste Richtung senkrecht zur zweiten Richtung. Die- ser Fall ist einfach umzusetzen und kann für übliche Probengeometrien verwen- det werden. Alternativ kann durch die erste Richtung und die zweite Richtung auch jeder andere von 90° verschiedene Winkel eingeschlossen werden.
Es ist vorteilhaft, wenn beim Bewegen des Punktmusters entlang der ersten und/oder zweiten Richtung der vorgegebene Bereich kontinuierlich oder schrittweise abgerastert wird. Durch die kontinuierliche oder schrittweise Ab- rasterung werden entlang der ersten Richtung Rasterzeilen abgerastert, die in einem späteren Detektionsverfahren als Grundlage der Erzeugung von Bildzei len dienen.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn beim Bewegen des Punktmusters entlang der zweiten Richtung der vorgegebene Bereich durch die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge in einem einzigen Rasterdurchlauf vollständig abgeras- tert wird und wenn beim Bewegen des Punktmusters entlang der zweiten Rich tung der vorgegebene Bereich durch den Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge in wenigstens zwei Rasterdurchläufen vollständig abgerastert wird. Hierzu wird das Punktmuster zwischen zwei aufeinanderfolgenden Rasterdurch- läufen um wenigstens eine Rasterzeile entlang der zweiten Richtung versetzt.
Vorzugsweise wird beim Bewegen des Punktmusters entlang der zweiten Rich tung der vorgegebene Bereich durch den Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge in einer Anzahl von Rasterdurchläufen vollständig abgerastert, die der Anzahl von Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge entspricht und das Punktmuster nach jedem Rasterdurchlauf um wenigstens eine Raster- zeile versetzt. Hierdurch können insbesondere Beobachtungen dynamischer Prozesse in der Probe mit Hilfe der ersten Wellenlänge vorgenommen werden, während mit Hilfe der zweiten Wellenlänge gleichsam ein Hintergrund beo- bachtet werden kann, vor dem die dynamischen Prozesse stattfinden.
Vorzugsweise wird das Punktmuster entlang der zweiten Richtung derart be- wegt, dass es in einem Rasterschritt um mindestens zwei Rasterzeilen entlang der zweiten Richtung bewegt wird. Wird das Punktmuster in einem Raster- schritt um mindestens zwei Rasterzeilen entlang der zweiten Richtung bewegt, wird maximal jede zweite Rasterzeile des vorgegebenen Bereichs durch den Be- leuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge abgerastert.
In der vorliegenden Anmeldung wird somit unter Rasterdurchlauf das vollstän- dige Abrastern des vorgegebenen Bereichs mit Hilfe der Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge verstanden. Hierbei kann ein einzelner Rasterdurch- lauf entlang der zweiten Richtung Bewegungen des Punktmusters sowohl mit als auch entgegen der zweiten Richtung beinhalten, solange der vorgegebene Bereich durch dieses Vorgehen vollständig mit der ersten Wellenlänge abgeras- tert (also durch Rasterschritte abgedeckt) wird. Beispielsweise ist es denkbar, dass das Punktmuster zuerst mit der zweiten Richtung bewegt wird, wobei ein- zelne Teilbereiche des vorgegebenen Bereiches übersprungen (also nicht abge- rastert) werden, und anschließend das Punktmuster entgegen der zweiten Rich tung bewegt wird, um diese in der Hinbewegung übersprungenen Teilbereiche abzurastern. Ein weiteres Beispiel für einen Rasterdurchlauf ist eine Bewegung des Punktmusters mit der zweiten Richtung, wobei Teilbereiche übersprungen werden, dann ein Rückspringen entgegen der zweiten Richtung auf die Aus- gangsposition (oder eine andere geeignete Position) und Abrastern des zuerst übersprungenen Teilbereiches. Unter einem Rasterschritt wird das Bewegen des Punktmusters entlang der zweiten Richtung zur Erzeugung einer Rasterzeile verstanden, wobei die so erzeugte Rasterzeile (ausgenommen im Fall des ers- ten Rasterschritts eines Rasterdurchlaufs) einer anderen Rasterzeile nachfolgt.
Beispielsweise kann in einem ersten Rasterdurchlauf jede Rasterzeile des vorge- gebenen Bereichs durch die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge abgerastert werden, während nur jede zweite Rasterzeile des vorgegebenen Bereichs durch den Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge abgeras- tert wird. In einem dem ersten Rasterdurchlauf nachfolgenden zweiten Raster- durchlauf werden die im ersten Rasterdurchlauf nicht durch den Beleuchtungs- punkt mit der zweiten Wellenlänge abgerasterten Rasterzeilen des vorgegebe- nen Bereichs abgerastert. Vorzugsweise wird hierzu das Punktmuster nach ei- nem Rasterdurchlauf um genau eine Rasterzeile in oder entgegen der zweiten Richtung verschoben. Dienen die Rasterzeilen in einem späteren Detektionsver- fahren als Grundlage für die Erzeugung von Bildzeilen, werden für je ein der zweiten Wellenlänge zugeordnetes Bild zwei der ersten Wellenlänge zugeord- nete Bilder erzeugt. Es wird folglich eine hohe Bildwiederholrate von Bildern, die der ersten Wellenlänge zugeordnet sind, erreicht. Die Bildwiederholrate von Bildern, die der zweiten Wellenlänge zugeordnet sind, ist um einen Faktor ge- ringer, welcher der Anzahl von Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellen- länge entspricht.
Es ist vorteilhaft, wenn die Beleuchtungspunkte des Punktmusters auf einer Li- nie entlang der zweiten Richtung angeordnet sind. Hierdurch wird das Verfah- ren besonders einfach, da die Erzeugung und Verwendung zweidimensionaler Punktmuster im Vergleich zur Erzeugung eindimensionaler Punktmuster relativ komplex ist.
Es ist ferner vorteilhaft, wenn die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellen- länge äquidistant angeordnet sind. Die äquidistante Anordnung der Beleuch- tungspunkte mit der ersten Wellenlänge stellt eine besonders einfache Form des Punktmusters dar. Alternativ können die Beleuchtungspunkte mit der ers- ten Wellenlänge auch in Gruppen angeordnet sein, wobei die jeweils einer Gruppe zugeordneten Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge äqui distant mit einem ersten Abstand zueinander angeordnet sind, während die Gruppen einen von dem ersten Abstand verschiedenen zweiten Abstand zuei- nander haben (siehe Fig. 3 für ein Beispiel).
Es ist besonders vorteilhaft, wenn ein in Rasterzeilen definierter Abstand zwi- schen den Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge und/oder eine An- zahl von Rasterzeilen, um die das Punktmuster in einem Rasterschritt entlang der zweiten Richtung bewegt wird, von der Anzahl von Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge abhängig ist. Als in Rasterzeilen definierter Abstand zwischen zwei Beleuchtungspunkten wird dabei die Anzahl von Rasterzeilen verstanden, die einer der zwei Beleuchtungspunkte entlang der zweiten Rich tung bewegt werden muss, um zur Position des anderen Beleuchtungspunktes zu gelangen. Zwei direkt aufeinander folgende Rasterzeilen haben folglich einen Abstand von einer Rasterzeile.
Beispielsweise ist der in Rasterzeilen definierte Abstand zwischen den Beleuch- tungspunkten mit der ersten Wellenlänge gleich der Anzahl von Beleuchtungs- punkten mit der ersten Wellenlänge plus eins. Bei Nutzung eines Punktmusters, dass diese Eigenschaft besitzt, können alle Rasterzeilen des vorgegebenen Be- reichs mit den Beleuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge in einem Ras- terdurchlauf abgerastert werden, wenn das Punktmuster in jedem der Raster- schritte um eine Zahl von Rasterzeilen entsprechend der Anzahl der Beleuch- tungspunkte entlang der zweiten Richtung bewegt wird. Zum Abrastern des vorgegebenen Bereichs mit dem Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellen- länge ist somit eine Anzahl von Rasterdurchläufen nötig, die der Anzahl von Be- leuchtungspunkten mit der ersten Wellenlänge entspricht.
Es ist ferner vorteilhaft, wenn die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellen- länge und der Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge nicht überlap- pende Beleuchtungspunkte sind. Alternativ können sich die Beleuchtungs- punkte mit der ersten Wellenlänge und der Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge überlappen.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zum Abrastern einer Probe in der Mikroskopie, mit einer Beleuchtungseinheit, die mindestens drei Beleuchtungs- punkte zur Bildung eines Punktmusters erzeugt. Die Vorrichtung umfasst eine Steuereinheit zum Steuern der Beleuchtungseinheit, wobei die Steuereinheit die Beleuchtungseinheit derart steuert, dass die Beleuchtungseinheit das durch die Beleuchtungspunkte gebildete Punktmuster zum Abrastern zumindest eines vorgegebenen Bereichs der Probe entlang einer ersten Richtung zur Erzeugung von Rasterzeilen, die jeweils den Beleuchtungspunkten des Punktmusters zuge- ordnet sind, und entlang einer zweiten Richtung zur Erzeugung von den Raster- zeilen jeweils nachfolgend erzeugten Rasterzeilen bewegt. Das mithilfe der Be- leuchtungseinheit erzeugte Punktmuster hat mindestens zwei Beleuchtungs- punkte mit einer ersten Wellenlänge und einen einzigen Beleuchtungspunkt mit einer von der ersten Wellenlänge verschiedenen zweiten Wellenlänge. Vorzugs- weise hat die Beleuchtungseinheit eine Abrastereinheit zum Bewegen des Punktmusters entlang der ersten und/oder zweiten Richtung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung rastert die Probe mit den wenigstens zwei Beleuchtungspunkten der ersten Wellenlänge und mit dem einen Beleuch- tungspunkt mit der zweiten Wellenlänge parallel ab. Die Beleuchtungspunkte mit verschiedener Wellenlänge erlauben es insbesondere, zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen beispielsweise zwei verschiedene Teilbereiche der Probe markiert sind, zur Fluoreszenz anzuregen. Durch das Vorsehen von zwei Beleuchtungspunkten der ersten Wellenlänge wird der Rastervorgang pa- rallelisiert, was die Geschwindigkeit erhöht, mit der die Probe mit Beleuch- tungspunkten der ersten Wellenlänge abgerastert wird. Durch die erhöhte Ge- schwindigkeit ist es insbesondere möglich dynamische Vorgänge in der Probe, beispielsweise biologische Prozesse, zu beobachten.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung verbindet somit die Vorteile von Vorrichtun- gen zum Abrastern einer Probe mit einem Punktmuster aus mehreren Beleuch- tungspunkten mit den Vorteilen von Vorrichtungen zum Abrastern einer Probe, die Beleuchtungspunkte mit unterschiedlichen Wellenlängen nutzen. Vorzugsweise sind die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellenlänge und der Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge nicht überlappende Beleuch- tungspunkte. Alternativ können die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wellen- länge und der Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge sich überlap- pen.
Es ist vorteilhaft, wenn die Einheit zur Erzeugung des Punktmusters wenigstens einen ersten wellenlängenselektiven Strahlteiler umfasst. Dies stellt eine beson- ders einfache Möglichkeit dar, auch komplexe Punktmuster zu erzeugen. Der erste wellenlängenselektive Strahlteiler kann beispielsweise für Licht mit der ersten Wellenlänge durchlässig sein und Licht mit der zweiten Wellenlänge re- flektieren.
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn die erste Lichtquelleneinheit ein Lichtbündel mit der ersten Wellenlänge erzeugt und die Beleuchtungseinheit eine Strahlver- vielfachungseinheit hat, wobei die Strahlvervielfachungseinheit aus dem Licht- bündel mit der ersten Wellenlänge die Beleuchtungspunkte mit der ersten Wel- lenlänge erzeugt. Vorzugsweise umfasst die Strahlvervielfachungseinheit we- nigstens einen akustooptischen Deflektor (AOD) oder wenigstens einen Strahl teiler. Die Verwendung eines AOD ermöglicht eine flexible Einstellung der Ab- stände zwischen den Beleuchtungspunkten. Mithilfe von Strahlteilern lassen sich auch komplexe Punktmuster erzeugen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop mit einer Vorrichtung zum Abras- tern einer Probe nach vorgenannter Art. Durch das erfindungsgemäße Mikro- skop ist insbesondere eine mikroskopische Beobachtung dynamischer Vorgänge in der Probe, beispielsweise biologischer Prozesse, möglich. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Mikroskop eine erste Detektionseinheit, die von der Probe ausgehendes Detektionslicht mit einer der ersten Wellen- länge zugeordneten dritten Wellenlänge erfasst, beispielsweise einen ortsauf- gelösten Flächendetektor, und eine zweite Detektionseinheit hat, die von der Probe ausgehendes Detektionslicht mit einer der zweiten Wellenlänge zugeord- neten vierten Wellenlänge erfasst, beispielsweise einen nicht ortsaufgelösten Punktdetektor. Dies erlaubt es, wenigstens zwei verschiedene Teilbereiche der Probe, die mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, gleich- zeitig mikroskopisch zu beobachten.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusam- menhang mit den beigefügten Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 ein Verfahren zum Abrastern einer Probe mit zwei Beleuchtungs- punkten mit einer ersten Wellenlänge und einem Beleuchtungspunkt mit einer zweiten Wellenlänge gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel;
Figur 2 ein Verfahren zum Abrastern einer Probe mit drei Beleuchtungs- punkten mit der ersten Wellenlänge und einem Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel;
Figur 3 ein Verfahren zum Abrastern einer Probe mit vier Beleuchtungs- punkten mit der ersten Wellenlänge und einem Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel; Figur 4 das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem vierten Ausführungsbeispiel;
Figur 5 das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem fünften Ausführungsbeispiel; und
Figur 6 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einer Vor- richtung zum Abrastern einer Probe gemäß einem Ausführungsbeispiel.
Die Figuren 1 bis 5 zeigen ein Verfahren zum Abrastern einer Probe anhand von verschiedenen Ausführungsbeispielen. Bei dem Verfahren werden mindestens zwei Beleuchtungspunkte mit einer ersten Wellenlänge LI, die allgemein mit dem Bezugszeichen 12 versehen und mit LIPO, L1P1, usw. durchnummeriert sind, und ein Beleuchtungspunkt 13 mit einer zweiten Wellenlänge L2 zur Bil dung eines Punktmusters erzeugt. Das Punktmuster, das im Folgenden allge mein mit dem Bezugszeichen 10 versehen ist, wird zum Abrastern zumindest ei- nes vorgegebenen Bereichs 40 der Probe 102 bewegt. Die Bewegung des Punkt- musters 10 erfolgt dabei entlang einer ersten Richtung zur Erzeugung von den Beleuchtungspunkten 12, 13 des Punktmusters 10 zugeordneten Rasterzeilen, die im Folgenden allgemein mit dem Bezugszeichen 14 versehen sind, und ent- lang einer zweiten Richtung zur Erzeugung von den Rasterzeilen 14 jeweils nachfolgend erzeugten Rasterzeilen 14.
Beim Bewegen des Punktmusters 10 wird der wenigstens eine vorgegebene Be- reich 40 entlang der ersten Richtung kontinuierlich abgerastert und entlang der zweiten Richtung schrittweise abgerastert. Das schrittweise Abrastern des vor- gegebenen Bereichs 40 entlang der zweiten Richtung erfolgt in Rasterschritten, die allgemein mit dem Bezugszeichen 16 versehen sind. In den Figuren 1 bis 3 sind die jeweiligen Positionen der Beleuchtungspunkte 12, 13 entlang der zwei- ten Richtung, d.h. in den Figuren 1 bis 3 von oben nach unten, in zeitlich aufei- nanderfolgenden Rasterschritten 16 gezeigt, die mit 0 beginnend durchnumme- riert sind.
Die Probe wird in mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen abgerastert, die allgemein mit dem Bezugszeichen 18 versehen und die mit 0 beginnend durchnummeriert sind. In jedem Rasterdurchlauf 18 wird durch die Beleuchtungspunkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI jeweils ein erster Raster- bereich 42 abgerastert, der in den Figuren 1 bis 3 rechts des jeweiligen Raster- durchlaufs 18 dargestellt ist. Durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 wird in jedem Rasterdurchlauf 18 jeweils ein zweiter Rasterbe- reich 43 abgerastert, der in den Figuren 1 bis 3 ebenfalls rechts des jeweiligen Rasterdurchlaufs 18 dargestellt ist.
Figur 1 zeigt das Verfahren zum Abrastern einer Probe mit zwei Beleuchtungs- punkten 12 mit der ersten Wellenlänge LI und einem Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel. Die zwei Beleuchtungspunkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI sind mit einem Ab- stand von drei Rasterzeilen 14 entlang der zweiten Richtung angeordnet. Der Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 ist mit einem Abstand von einer Rasterzeile 14 in zweiter Richtung auf den ersten Beleuchtungspunkt 12 (mit LIPO nummeriert) mit der ersten Wellenlänge LI derart angeordnet, dass die drei Beleuchtungspunkte 12, 13 des Punktmusters 10 auf einer Linie entlang der zweiten Richtung angeordnet sind.
Das schrittweise Abrastern des vorgegebenen Bereichs 40 entlang der zweiten Richtung erfolgt, indem das Punktmuster 10 in jedem Rasterschritt 16 um zwei Rasterzeilen 14 entlang der zweiten Richtung bewegt wird. Die Positionen des Punktmusters 10 bei einander zugeordneten Rasterschritten 16, d.h. bei Raster- schritten 16 mit gleicher Nummerierung, ist beim zweiten Rasterdurchlauf 18 (mit 1 nummeriert) gegenüber dem ersten Rasterdurchlauf 18 (mit 0 numme riert) um eine Rasterzeile 14 in Richtung der zweiten Richtung versetzt.
In jedem der zwei Rasterdurchläufe 18 wird durch die Beleuchtungspunkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI der erste Rasterbereich 42 abgerastert, der den vorgegebenen Bereich 40 vollständig umfasst. Durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 wird in jedem Rasterdurchlauf 18 jede zweite Rasterzeile 14 des vorgegebenen Bereichs 40 abgerastert. In zwei aufeinander- folgenden Rasterdurchläufen 18 rastert der Beleuchtungspunkt 13 mit der zwei- ten Wellenlänge L2 einen dritten Rasterbereich 44 ab, der den vorgegebenen Bereich 40 vollständig umfasst und der in Figur 1 ganz rechts dargestellt ist. Der vorgegebene Bereich 40 wird folglich in zwei aufeinanderfolgenden Raster- durchläufen 18 durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 vollständig abgerastert.
Vorteilhafterweise können in jedem der Rasterdurchläufe 18 durch Detektion gewonnene Ergebnisse einzeln verwertet werden. Aus diesen Ergebnissen kön- nen der ersten und der zweiten Wellenlänge LI, L2 zugeordnete Bilder erzeugt werden. Eine Darstellung des der ersten Wellenlänge LI zugeordneten Bildes kann nach jedem Rasterdurchlauf 18 erfolgen. Eine Darstellung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes kann nach jedem zweiten Rasterdurchlauf 18 erfolgen. Die Darstellung des der ersten Wellenlänge LI zugeordneten Bildes kann folglich mit einer doppelt so hohen Bildwiederholrate erfolgen, wie die Darstellung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes. Figur 2 zeigt das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel. Zur besseren Übersicht ist die Figur 2 in drei Teilfiguren 2A bis 2C aufgeteilt, die sich an den strichpunktierten Linien einander anschließen. Das in Figur 2 gezeigte zweite Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten ersten Ausführungsbeispiel im Wesentlichen dadurch, dass die Probe 102 mit drei Beleuchtungspunkten 12 mit der ersten Wellenlänge LI und einem Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 abgerastert wird. Die insgesamt vier Beleuchtungspunkte 12, 13 des Punktmusters 10 sind auf einer Linie entlang der zweiten Richtung angeordnet. Die drei Beleuchtungs- punkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI sind mit einem Abstand von vier Ras- terzeilen 14 entlang der zweiten Richtung angeordnet. Der Beleuchtungspunkt
13 mit der zweiten Wellenlänge L2 ist mit einem Abstand von einer Rasterzeile
14 in zweiter Richtung auf den ersten Beleuchtungspunkt 12 (mit LIPO numme riert) mit der ersten Wellenlänge LI folgend angeordnet.
Das schrittweise Abrastern des vorgegebenen Bereichs 40 entlang der zweiten Richtung erfolgt in dem gezeigten zweiten Ausführungsbeispiel, indem das Punktmuster 10 in jedem Rasterschritt 16 um drei Rasterzeilen 14 entlang der zweiten Richtung bewegt wird. Die Positionen des Punktmusters 10 bei einan- der zugeordneten Rasterschritten 16, d.h. bei Rasterschritten 16 mit gleicher Nummerierung, sind bei direkt aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen 18 um jeweils eine Rasterzeile 14 in Richtung der zweiten Richtung versetzt.
In dem in Figur 2 gezeigten zweiten Ausführungsbeispiel wird durch den Be- leuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 in jedem Rasterdurchlauf 18 jede dritte Rasterzeile 14 des vorgegebenen Bereichs 40 abgerastert. Somit wird in drei aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen 18 der dritte Rasterbe- reich 44 durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 abge- rastert, der den vorgegebenen Bereich 40 vollständig umfasst und der in Figur 2C ganz rechts dargestellt ist. Der vorgegebene Bereich 40 wird folglich in dem in Figur 2 gezeigten zweiten Ausführungsbeispiel in drei aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen 18 durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellen- länge L2 vollständig abgerastert.
Die Darstellung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes kann folg lich im gezeigten zweiten Ausführungsbeispiel nach jedem dritten Rasterdurch- lauf 18 erfolgen. Die Darstellung des der ersten Wellenlänge LI zugeordneten Bildes kann folglich mit einer dreimal so hohen Bildwiederholrate erfolgen, wie die Darstellung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes.
Figur 3 zeigt das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem dritten Aus- führungsbeispiel. Zur besseren Übersicht ist die Figur 3 in vier Teilfiguren 3A bis 3D aufgeteilt, die sich an den strichpunktierten Linien einander anschließen.
Das in Figur 3 gezeigte dritte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten ersten Ausführungsbeispiel im Wesentlichen dadurch, dass die Probe 102 mit vier Beleuchtungspunkten 12 mit der ersten Wellenlänge LI und einem Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 abgerastert wird. Die insgesamt fünf Beleuchtungspunkte 12, 13 des Punktmusters 10 sind auf einer Linie entlang der zweiten Richtung angeordnet. Die vier Beleuchtungs- punkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI sind in zwei Gruppen 20 mit jeweils zwei Beleuchtungspunkten 12 mit der ersten Wellenlänge LI aufgeteilt. Die zwei Beleuchtungspunkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI jeder der zwei Gruppen 20 sind mit einem Abstand von zwei Rasterzeilen 14 entlang der zwei- ten Richtung angeordnet. Die zwei Gruppen 20 haben einen Abstand von drei Rasterzeilen 14 zueinander. Der Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellen- länge L2 ist mit einem Abstand von einer Rasterzeile 14 in zweiter Richtung auf den ersten Beleuchtungspunkt 12 (mit LIPO nummeriert) mit der ersten Wel- lenlänge LI angeordnet.
Durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 wird in jedem Rasterdurchlauf 18 jede vierte Rasterzeile 14 des vorgegebenen Bereichs 40 ab- gerastert. Somit wird in vier aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen 18 ein dritter Rasterbereich 44 durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wel- lenlänge L2 abgerastert, der den vorgegebenen Bereich 40 vollständig umfasst und der in Figur 3D ganz rechts dargestellt ist. Der vorgegebene Bereich 40 wird folglich in dem in Figur 3 gezeigten dritten Ausführungsbeispiel in vier aufeinan- derfolgenden Rasterdurchläufen 18 durch den Beleuchtungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 vollständig abgerastert.
Im gezeigten dritten Ausführungsbeispiel kann die Darstellung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes nach jedem vierten Rasterdurchlauf 18 er- folgen. Die Darstellung des der ersten Wellenlänge LI zugeordneten Bildes kann folglich mit einer viermal so hohen Bildwiederholrate erfolgen, wie die Darstel- lung des der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes.
Figur 4 zeigt das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem vierten Aus- führungsbeispiel. Zur besseren Übersicht ist die Figur 4 in vier Teilfiguren 4A bis 4D aufgeteilt, die sich an den strichpunktierten Linien einander anschließen.
Das in Figur 4 gezeigte vierte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem in Figur 3 gezeigten ersten Ausführungsbeispiel im Wesentlichen dadurch, dass die vier Beleuchtungspunkte 12 äquidistant mit einem Abstand von jeweils fünf Rasterzeilen 14 entlang der zweiten Richtung angeordnet sind. Der vorgegebene Bereich 40 wird folglich in dem in Figur 4 gezeigten vierten Ausführungsbeispiel genau wie in dem in Figur 3 gezeigten dritten Ausführungs- beispiel in vier aufeinanderfolgenden Rasterdurchläufen 18 durch den Beleuch- tungspunkt 13 mit der zweiten Wellenlänge L2 vollständig abgerastert.
Figur 5 zeigt das Verfahren zum Abrastern der Probe gemäß einem fünften Aus- führungsbeispiel. Das in Figur 5 gezeigte fünfte Ausführungsbeispiel unterschei- det sich von dem in Figur 1 gezeigten ersten Ausführungsbeispiel im Wesentli- chen dadurch, dass der mit LIPO bezeichnete erste Beleuchtungspunkt mit der ersten Wellenlänge LI und der mit L1P1 bezeichnete zweite Beleuchtungspunkt mit der ersten Wellenlänge LI nicht auf einer Linie entlang der zweiten Rich tung liegen. Ferner überlagern sich der erste Beleuchtungspunkt mit der ersten Wellenlänge LI und der mit L2 bezeichnete Beleuchtungspunkt mit der zweiten Wellenlänge L2 teilweise.
Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung eines Mikroskops 100 mit einer Vor- richtung 110 zum Abrastern einer Probe 102 gemäß einem Ausführungsbei- spiel. Das Mikroskop 100 umfasst ferner eine Objektivoptik 104, eine erste De- tektionseinheit 106, eine zweite Detektionseinheit 108 und einen Beobach- tungsstrahlengang 112. Das Mikroskop 100 nach Figur 6 eignet sich insbeson- dere, um das erfindungsgemäße Verfahren gemäß einem der Ausführungsbei- spiele nach den Figuren 1 bis 5 durchzuführen.
Die Vorrichtung 110 zum Abrastern der Probe 102 umfasst eine Beleuchtungs- einheit 114 zum Erzeugen eines Punktmusters 10, eine Steuereinheit 116 zum Steuern der Beleuchtungseinheit 114 und weitere optische Elemente, wie bei spielsweise Linsen, Blenden, Filter oder Prismen, die allgemein mit dem Bezugs- eichen 118 bezeichnet werden.
Die Beleuchtungseinheit 114 hat eine erste Lichtquelleneinheit 120 zur Erzeu- gung von Beleuchtungspunkten 12 mit einer ersten Wellenlänge LI und eine zweite Lichtquelleneinheit 122 zur Erzeugung eines Beleuchtungspunktes 13 mit einer zweiten Wellenlänge L2. Die Beleuchtungseinheit 114 hat weiterhin einen ersten wellenlängenselektiven Strahlteiler 124 zur Erzeugung des Punkt- musters 10. Die erste Lichtquelleneinheit 120 hat eine erste Lichtquelle 126, die ein Lichtbündel 127 mit der ersten Wellenlänge LI erzeugt, und eine Strahlver- vielfachungseinheit 128, beispielsweise einen Strahlteiler oder einen akustoop- tischen Deflektor (AOD), die aus dem Lichtbündel 127 mit der ersten Wellen- länge LI die Beleuchtungspunkte 12 mit der ersten Wellenlänge LI erzeugt. Die Beleuchtungseinheit 114 hat ferner eine Abrastereinheit 130 (beispielsweise umfassend einen oder mehrere Scanspiegel) zum Bewegen des Punktmusters 10 entlang einer ersten und einer zweiten Richtung. Im gezeigten Ausführungs- beispiel ist die Abrastereinheit 130 außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs 112 angeordnet. Alternativ kann die Abrastereinheit 130 innerhalb des Be- obachtungsstrahlengangs 112 angeordnet sein, wodurch die Abraster- bzw. Scanbewegung beim Zurücklaufen von Detektionslicht 138, 139, das von der Probe 102 ausgeht, wieder aufgehoben wird. Dies wird gemeinhin auch als „descanned"-Anordnung bezeichnet.
Die Steuereinheit 116 steuert die Abrastereinheit 130 der Beleuchtungseinheit 114 derart, dass die Abrastereinheit 130 das Punktmuster 10 zum Abrastern zu- mindest eines vorgegebenen Bereichs 40 der Probe 102 entlang der ersten Richtung zur Erzeugung von Rasterzeilen 14, die jeweils den Beleuchtungspunk- ten 12, 13 des Punktmusters 10 zugeordnet sind, und entlang der zweiten Rich tung zur Erzeugung von den Rasterzeilen 14 jeweils nachfolgend erzeugten Ras- terzeilen 14 bewegt.
Der Beobachtungsstrahlengang 112 befindet sich zwischen der Probe 102 und der ersten Detektionseinheit 106. In dem Beobachtungsstrahlengang 112 sind die Objektivoptik 104, ein zweiter wellenlängenselektiver Strahlteiler 132, ein dritter wellenlängenselektiver Strahlteiler 134 und weitere optische Elemente, wie beispielsweise Linsen, Blenden, Filter oder Prismen, die allgemein mit dem Bezugszeichen 136 bezeichnet werden, angeordnet.
Der zweite wellenlängenselektive Strahlteiler 132 reflektiert Licht mit der ers- ten Wellenlänge LI und mit der zweiten Wellenlänge L2 und ist für Licht mit ei- ner der ersten Wellenlänge LI zugeordneten dritten Wellenlänge LI' durchläs- sig. Durch den zweiten wellenlängenselektiven Strahlteiler 132 wird das durch die Beleuchtungseinheit 114 erzeugte Punktmuster 10 in den Beobachtungs- Strahlengang 112, der so auch als Beleuchtungsstrahlengang dient, eingekop- pelt und in Richtung der Objektivoptik 104 reflektiert.
Die Objektivoptik 104 bildet das Punktmuster 10 auf oder in die Probe 102 ab. Das Punktmuster 10 regt dort Farbstoffe zur Emission von Detektionslicht 138 mit der dritten Wellenlänge LI' und Detektionslicht 139 mit der vierten Wellen- länge L2' an. Das von der Probe 102 ausgehende Detektionslicht 138 mit der dritten Wellenlänge LI' und das von der Probe 102 ausgehende Detektionslicht 139 mit der vierten Wellenlänge L2' wird von der Objektivoptik 104 in den Be- obachtungsstrahlengang 112 geleitet. Der dritte wellenlängenselektive Strahlteiler 134 reflektiert Licht mit der vierten Wellenlänge L2' und ist für Licht mit der ersten Wellenlänge LI, Licht mit der zweiten Wellenlänge L2 und Licht mit der dritten Wellenlänge LI' durchlässig. Durch den dritten wellenlängenselektiven Strahlteiler 134 wird das von der Probe 102 ausgehende Detektionslicht 139 mit der vierten Wellenlänge L2' aus dem Beobachtungsstrahlengang 112 ausgekoppelt und in die zweite Detekti- onseinheit 108 gelenkt.
Die erste Detektionseinheit 106 umfasst ein erstes Emissionsfilter 140, das nur für Licht mit der dritten Wellenlänge LI' durchlässig ist, und ein beispielsweise als CCD-Chip ausgebildetes erste Sensorelement 142. Durch das erste Sensorel- ement 142 wird das von der Probe 102 ausgehende Detektionslicht 138 mit der dritten Wellenlänge LI' erfasst. Das durch das erste Sensorelement 142 erfasste Detektionslicht 138 mit der dritten Wellenlänge LI' kann insbesondere als Grundlage für die Erzeugung eines der ersten Wellenlänge LI zugeordneten Bil des dienen. Alternativ kann das erste Sensorelement 142 auch mehrere Punkt- detektoren umfassen, wobei jedem Beleuchtungspunkt 12 mit der ersten Wel- lenlänge LI ein eigener Punktdetektor zugeordnet ist.
Die zweite Detektionseinheit 108 umfasst ein zweites Emissionsfilter 144, das nur für Licht mit der vierten Wellenlänge L2' durchlässig ist, ein zweites Senso- relement 146, das beispielhaft als ein 1-Kanal-Detektor ausgebildet ist, und wei- tere optische Elemente, wie beispielsweise Linsen, Blenden, Filter oder Pris men, die allgemein mit dem Bezugszeichen 148 bezeichnet werden. Durch das zweite Sensorelement 146 wird das von der Probe 102 ausgehende Detektions- licht 139 mit der vierten Wellenlänge L2' erfasst. Das durch das zweite Senso- relement 146 erfasste Detektionslicht 139 mit der vierten Wellenlänge L2' kann insbesondere als Grundlage für die Erzeugung eines der zweiten Wellenlänge L2 zugeordneten Bildes dienen.
In einer alternativen Ausgestaltung des Mikroskops 100 werden sowohl das De- tektionslicht 138 mit der dritten Wellenlänge LI' als auch das Detektionslicht 139 mit der vierten Wellenlänge L2' durch das erste Sensorelement 142 erfasst. Das Mikroskop 100 gemäß der alternativen Ausgestaltung benötigt daher keine zweite Detektionseinheit 108 und keinen wellenlängenselektiven Strahlteiler 134. In dieser alternativen Ausgestaltung ist der zweite wellenlängenselektive Strahlteiler 132 auch für Licht mit einer der zweiten Wellenlänge L2 zugeordne- ten vierten Wellenlänge L2'durchlässig. Anstelle des ersten Emissionsfilters 140 hat das Mikroskop 100 gemäß der alternativen Ausgestaltung ein Bildtren- nungssystem („image Splitting device") zum Aufspalten von in die erste Detekti- onseinheit 106 einfallenden Lichts nach der dritten Wellenlänge Ll'und der vierten Wellenlänge L2'.
Bezugszeichenliste
10 Punktmuster
12, 13 Beleuchtungspunkt
14 Rasterzeile
16 Rasterschritt
18 Rasterdurchlauf
20 Gruppe
100 Mikroskop
102 Probe
104 Objektivoptik
106, 108 Detektionseinheit
110 Vorrichtung
112 Beobachtungsstrahlengang
114 Beleuchtungseinheit
116 Steuereinheit
118, 136, 148 Optisches Element
120, 122 Lichtquelleneinheit
124, 132, 134 Wellenlängenselektiver Strahlteiler 126 Lichtquelle
127 Lichtbündel
128 Strahlvervielfachungseinheit
130 Abrastereinheit
138, 139 Detektionslicht
140, 144 Emissionsfilter
142, 146 Sensorelement

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Abrastern einer Probe (102) in der Mikroskopie, bei dem mindestens drei Beleuchtungspunkte (12, 13) zur Bildung eines Punkt- musters (10) erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die Beleuchtungspunkte (12, 13) gebil dete Punktmuster (10) zum Abrastern zumindest eines vorgegebenen Bereichs (40) der Probe (102) entlang einer ersten Richtung zur Erzeugung von Rasterzei- len (14), die jeweils den Beleuchtungspunkten (12, 13) des Punktmusters (10) zugeordnet sind, und entlang einer zweiten Richtung zur Erzeugung von den Rasterzeilen (14) jeweils nachfolgend erzeugten Rasterzeilen (14) bewegt wird, wobei das Punktmuster (10) mindestens zwei Beleuchtungspunkte (12) mit ei- ner ersten Wellenlänge (LI) und einen einzigen Beleuchtungspunkt (13) mit ei- ner von der ersten Wellenlänge (LI) verschiedenen zweiten Wellenlänge (L2) hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass beim Bewe- gen des Punktmusters (10) entlang der ersten und/oder zweiten Richtung der vorgegebene Bereich (40) kontinuierlich oder schrittweise abgerastert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass beim Bewegen des Punktmusters (10) entlang der zweiten Richtung der vorgegebene Bereich (40) durch die Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) in einem einzigen Rasterdurchlauf (18) vollständig abgerastert wird, und dass beim Bewegen des Punktmusters (10) entlang der zweiten Richtung der vorge- gebene Bereich (40) durch die Beleuchtungspunkte (13) mit der zweiten Wel- lenlänge (L2) in wenigstens zwei Rasterdurchläufen (18) vollständig abgerastert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass beim Bewe- gen des Punktmusters (10) entlang der zweiten Richtung der vorgegebene Be- reich (40) durch die Beleuchtungspunkte (13) mit der zweiten Wellenlänge (L2) in einer Anzahl von Rasterdurchläufen (18) vollständig abgerastert wird, die der Anzahl von Beleuchtungspunkten (13) mit der zweiten Wellenlänge (L2) ent- spricht und dass das Punktmuster (10) nach jedem Rasterdurchlauf (18) um we- nigstens eine Rasterzeile (14) versetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Punktmuster (10) entlang der zweiten Richtung derart bewegt wird, dass es in einem Rasterschritt (16) um mindestens zwei Rasterzeilen (14) ent- lang der zweiten Richtung bewegt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspunkte (12, 13) des Punktmusters (10) auf einer Linie ent- lang der zweiten Richtung angeordnet sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) äquidistant angeordnet sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 , dadurch gekennzeichnet, dass ein in Rasterzeilen (14) definierter Abstand zwischen den Beleuchtungs- punkten (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) und/oder eine Anzahl von Raster- zeilen (14), um die das Punktmuster (10) in einem Rasterschritt (16) entlang der zweiten Richtung bewegt wird, von der Anzahl von Beleuchtungspunkten (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) abhängig ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der in Raster- zeilen (14) definierte Abstand zwischen den Beleuchtungspunkten (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) gleich der Anzahl von Beleuchtungspunkten (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) plus eins ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) und der Be- leuchtungspunkt (13) mit der zweiten Wellenlänge (L2) nicht überlappende Be- leuchtungspunkte sind.
11. Vorrichtung (110) zum Abrastern einer Probe (102) in der Mikroskopie, mit einer Beleuchtungseinheit (114), die mindestens drei Beleuchtungspunkte (12, 13) zur Bildung eines Punktmusters (10) erzeugt, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (114) eine Steuereinheit (116) zum Steuern der Beleuchtungseinheit (114) umfasst, wobei die Steuereinheit (116) die Beleuchtungseinheit (114) derart steuert, dass die Beleuchtungsein- heit (114) das durch die Beleuchtungspunkte (12, 13) gebildete Punktmuster (10) zum Abrastern zumindest eines vorgegebenen Bereichs (40) der Probe (102) entlang einer ersten Richtung zur Erzeugung von Rasterzeilen (14), die je- weils den Beleuchtungspunkten (12, 13) des Punktmusters (10) zugeordnet sind, und entlang einer zweiten Richtung zur Erzeugung von den Rasterzeilen (13) jeweils nachfolgend erzeugten Rasterzeilen bewegt, wobei das mithilfe der Beleuchtungseinheit (114) erzeugte Punktmuster (10) mindestens zwei Beleuchtungspunkte (12) mit einer ersten Wellenlänge (LI) und einen Beleuchtungspunkt (13) mit einer von der ersten Wellenlänge (LI) verschiedenen zweiten Wellenlänge (L2) hat.
12. Vorrichtung (110) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (114) eine erste Lichtquelleneinheit (120) zur Erzeugung der Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) und eine zweite Lichtquelleneinheit zur Erzeugung des Beleuchtungspunktes mit der zweiten Wellenlänge hat, und dass die Beleuchtungseinheit (114) eine Einheit zur Erzeu- gung des Punktmusters (10) hat, wobei die Einheit zur Erzeugung des Punkt- musters (10) eine Strahlvereinigung zur Erzeugung der Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) und des Beleuchtungspunktes (13) mit der zweiten Wellenlänge (L2) nutzt.
13. Vorrichtung (110) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheit zur Erzeugung des Punktmusters (10) wenigstens einen ersten Wellen- längenselektiven Strahlteiler (124) umfasst.
14. Vorrichtung (110) nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtquelleneinheit (120) ein Lichtbündel (127) mit der ersten Wellenlänge (LI) erzeugt, und dass die Beleuchtungseinheit (114) eine Strahl vervielfachungseinheit (128) hat, wobei die Strahlvervielfachungseinheit (128) aus dem Lichtbündel (127) mit der ersten Wellenlänge (LI) die Beleuchtungs- punkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) erzeugt.
15. Vorrichtung (110) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlvervielfachungseinheit (128) wenigstens einen akustooptischen Deflektor (AOD) oder wenigstens einen Strahlteiler umfasst.
16. Vorrichtung (110) nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (114) eine Abrastereinheit (130) zum Be- wegen des Punktmusters (10) entlang der ersten und/oder zweiten Richtung hat.
17. Vorrichtung (110) nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Beleuchtungspunkte (12) mit der ersten Wellenlänge (LI) und der Beleuchtungspunkt (13) mit der zweiten Wellenlänge (L2) nicht überlap- pende Beleuchtungspunkte sind.
18. Mikroskop mit einer Vorrichtung (110) nach einem der Ansprüche 11 bis 17.
19. Mikroskop nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch eine erste Detekti- onseinheit (106), die von der Probe (102) ausgehendem Detektionslicht (138) mit einer der ersten Wellenlänge (LI) zugeordneten dritten Wellenlänge (LI') erfasst, und durch eine zweite Detektionseinheit (108), die von der Probe (102) ausgehendem Detektionslicht (139) mit einer der zweiten Wellenlänge (L2) zu- geordneten vierten Wellenlänge (L2') erfasst.
EP19786270.9A 2018-09-24 2019-09-19 Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe Pending EP3857285A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018123381.7A DE102018123381A1 (de) 2018-09-24 2018-09-24 Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe
PCT/EP2019/075104 WO2020064481A1 (de) 2018-09-24 2019-09-19 Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3857285A1 true EP3857285A1 (de) 2021-08-04

Family

ID=68208264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP19786270.9A Pending EP3857285A1 (de) 2018-09-24 2019-09-19 Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe

Country Status (5)

Country Link
US (1) US12066614B2 (de)
EP (1) EP3857285A1 (de)
JP (1) JP7268144B2 (de)
DE (1) DE102018123381A1 (de)
WO (1) WO2020064481A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017125688A1 (de) * 2017-11-03 2019-05-09 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9015793D0 (en) * 1990-07-18 1990-09-05 Medical Res Council Confocal scanning optical microscope
DE19858456A1 (de) * 1998-12-18 2000-07-06 Leica Microsystems Verfahren zum Auffinden, zur Aufnahme und gegebenenfalls zur Auswertung von Objektstrukturen
US7684048B2 (en) * 2005-11-15 2010-03-23 Applied Materials Israel, Ltd. Scanning microscopy
JP4891057B2 (ja) 2006-12-27 2012-03-07 オリンパス株式会社 共焦点レーザー走査型顕微鏡
JP5259154B2 (ja) 2007-10-24 2013-08-07 オリンパス株式会社 走査型レーザ顕微鏡
BRPI0819301A2 (pt) * 2007-11-23 2015-05-12 Koninkl Philips Electronics Nv Gerador de pontos, e , microscópio de varredura de multipontos
US20120257037A1 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Valerica Raicu High speed microscope with two-stage scanning for detection of rarities in samples
DE102012019121A1 (de) * 2011-09-29 2013-04-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur Variation des Scanfeldes eines Laser-Scanning-Mikroskops
ITMO20130078A1 (it) 2013-03-25 2014-09-26 Angelo Egidio D Metodo di generazione di immagine di un campione fluorescente
DE102013021482A1 (de) 2013-12-17 2015-06-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur Scanning-Mikroskopie und Scanning-Mikroskop
DE102014119027B4 (de) * 2014-12-18 2024-08-08 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie
DE102016102286A1 (de) 2016-02-10 2017-08-10 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Multispot-Scanning-Mikroskopie
WO2017205857A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Verily Life Sciences Llc Systems and methods for 4-d hyperspectrial imaging
DE102016119730A1 (de) 2016-10-17 2018-04-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optikgruppe für Detektionslicht für ein Mikroskop, Verfahren zur Mikroskopie und Mikroskop

Also Published As

Publication number Publication date
US12066614B2 (en) 2024-08-20
JP7268144B2 (ja) 2023-05-02
JP2022500704A (ja) 2022-01-04
WO2020064481A1 (de) 2020-04-02
DE102018123381A1 (de) 2020-03-26
US20220043245A1 (en) 2022-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2444833B1 (de) SPIM-Mikroskop mit sequenziellem Lightsheet
EP2516993B1 (de) Hochauflösendes mikroskop und verfahren zur zwei- oder dreidimensionalen positionsbestimmung von objekten
EP3526634B1 (de) Optikgruppe für detektionslicht für ein mikroskop, verfahren zur mikroskopie und mikroskop
EP3177957B1 (de) Hochauflösende scanning-mikroskopie mit der unterscheidung mindestens zweier wellenlängenbereiche
EP2860566B1 (de) Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
WO2016180403A1 (de) Auswertung von signalen der fluoreszenzrastermikroskopie unter verwendung eines konfokalen laserscanning-mikroskops
DE102020209889A1 (de) Mikroskop und Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme mit variabler Beleuchtung
DE102013022538B3 (de) Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes und Mikroskopievorrichtung
EP2102695A1 (de) Verfahren und anordnung zur parallelisierten mikroskopischen bildgebung
EP2069761A1 (de) Verfahren und vorrichtung zum hochaufgelösten optischen abtasten einer probe
DE102023101782B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Erzeugen eines zusammengesetzten Bildes einer Probe
WO2009043545A1 (de) Verfahren und anordnung zur optischen erfassung einer beleuchteten probe
DE102021134427A1 (de) Mikroskop und verfahren zur mikroskopie
DE102006009831B4 (de) Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
EP3832370A1 (de) Mikroskopie-verfahren und mikroskop zur abbildung von proben mittels manipulierter anregungsstrahlung
DE102022203632A1 (de) Bilderfassungsverfahren in der Lichtfeldmikroskopie und Lichtfeldmikroskop
EP3857285A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe
DE102006009832B4 (de) Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben
EP3704529B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum abrastern einer probe
DE102019110869A1 (de) Mikroskop
DE102018132212B4 (de) Verfahren und Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe
DE102023210480A1 (de) Telezentrische abbildung mehrere lichtstrahlen in einen zielbereich

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20210312

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
P01 Opt-out of the competence of the unified patent court (upc) registered

Effective date: 20230414

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20230707