EP3938111A1 - Vorrichtung und verfahren zur thermischen behandlung von proben - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur thermischen behandlung von proben

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EP3938111A1
EP3938111A1 EP20705679.7A EP20705679A EP3938111A1 EP 3938111 A1 EP3938111 A1 EP 3938111A1 EP 20705679 A EP20705679 A EP 20705679A EP 3938111 A1 EP3938111 A1 EP 3938111A1
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EP
European Patent Office
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temperature
cover plate
sample block
sample
control unit
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20705679.7A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Winter
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Analytik Jena GmbH and Co KG
Original Assignee
Analytik Jena GmbH Analysenmessgeraete und Laboreinrichtungen
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Publication date
Application filed by Analytik Jena GmbH Analysenmessgeraete und Laboreinrichtungen filed Critical Analytik Jena GmbH Analysenmessgeraete und Laboreinrichtungen
Publication of EP3938111A1 publication Critical patent/EP3938111A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
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    • G—PHYSICS
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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
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    • B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements
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    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1894—Cooling means; Cryo cooling

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the thermal treatment of in
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such a cycle typically consists of a denaturation phase at a high temperature (e.g. 94 to 100 ° C), a primer hybridization phase at a low temperature (e.g. 55 to 65 ° C) and an elongation or amplification phase at a medium temperature (e.g. 60 to 72 ° C).
  • the samples run through this cycle about 30 times.
  • an analysis using optical measurement methods is carried out at the same time as the sample is replicated. These applications are also called “real-time
  • thermo cyclers are conventionally used to carry out the PCR. These devices have a thermoblock on which the sample vessels are placed and which is set up to control the temperature of the sample vessels.
  • the thermal cyclers have control electronics that are set up to control the temperature of the samples according to a desired temperature profile in the value range between 4 ° C and 100 ° C. It is of decisive advantage for the user if these temperature changes can be carried out with the steepest possible temperature gradients and thus with many cycles in the shortest possible time. Ideally, the 30 cycles mentioned above will only take a few minutes.
  • Thermoblocks of conventional thermal cyclers often have a sample block intended to hold sample vessels, Peltier elements that can be controlled by the control electronics for heating and cooling the sample vessels and a heat sink in contact with the Peltier elements, e.g. in the form of heat sinks.
  • the Peltier elements are sandwiched between the
  • the sample block forms a receiving area for the sample vessels.
  • the sample block can have depressions into which the individual sample vessels engage when they are arranged in the receiving area.
  • the sample vessels are often combined in a microtiter plate.
  • the sample vessels are formed by indentations (so-called wells). So-called 96-well and 384-well microtiter plates made from polypropylene on injection molding machines are common. Microtiter plates that have a hard frame overmolded from a second plastic or plastic mixture and are therefore more robust to handle are also common, but are much more expensive. These plates are also referred to in technical jargon by the English term "hard skirted plates".
  • the wells can, depending on the
  • the sample block of the thermal cycler is often designed in such a way that it can receive the individual wells of the microtiter plate in the mentioned wells in the receiving area in a form-fitting manner.
  • the individual sample vessels can be closed or sealed.
  • the individual sample vessels can each have their own closure or a stopper made of an insulating material that cannot be mixed with the sample, e.g. Wax.
  • Microtiter plates can be covered with a sealing mat or a sealing film (also referred to as sealing film), which tightly seals the wells.
  • a sealing mat or a sealing film also referred to as sealing film
  • a heatable cover plate is often used for the sample vessels in thermal cyclers, which is placed on the sample vessels or on a sealing film or sealing mat covering the sample vessels and, if necessary, pressed against them.
  • the cover plate is typically kept at a temperature which is approximately 5 K above the highest temperature occurring in the temperature profile of the sample block.
  • the disadvantage of this solution is that in certain phases of the cycle, for example in a cooling phase, there is a large temperature difference between the sample block and the cover plate, and consequently a large temperature gradient across the sample vessels.
  • the sample block can cool the sample to temperatures below 70 ° C, while the cover plate remains at a temperature which can be 5 K above the maximum temperature of the PCR temperature cycle, for example in the vicinity of 100 ° C.
  • the high temperature gradient leads to undesired heat input from the cover plate into the samples during the cooling phase. This means that the final temperature of the cooling phase is only reached with a delay and stands in the way of a further reduction in the cycle duration.
  • the influence of the heated cover plate on the temperature of the samples can be kept low by means of the largest possible contact area between the sample vessels and the sample block.
  • microtiter plates with conically shaped wells and corresponding sample blocks with conically shaped depressions in the receiving area for the microtiter plates are therefore often used. This configuration ensures a relatively large
  • Sample vessels DE 69914220 T2 suggests the use of sample vessels that are as thin as possible. These sample vessels can be designed as wells of a microtiter plate, which through
  • Thermoforming or vacuum molding can be produced from a thin thermoplastic film.
  • the microtiter plates can comprise a frame that supports the edges of the plates or individual wells. This frame can be injection molded and joined to the film forming the thin-walled sample vessels by means of a heat connection.
  • this assembly of deep-drawn parts and injection-molded parts is relatively complex and correspondingly expensive.
  • US Pat. No. 9,492,825 describes a special microtiter plate for PCR applications which consists of materials with different levels of thermal conductivity. In the area of its base area intended for contact with the sample block, it is formed from a relatively good heat-conducting material, while in an area intended for contact with the cover plate it is formed from a relatively good heat-conducting material.
  • the cycle speeds can be influenced considerably. Nevertheless, even when using these microplates, the cover plate, which is tempered to 5 K above the maximum temperature of the PCR temperature cycle, acts against the cooling cycles of the sample block. This effect has a very clear effect in the case of relatively flat, very thin-walled microplates, as described for example in DE 699 14 220 T2 or used in the above-mentioned speedCycler, and results in a reduction in the possible cycle frequency.
  • the invention is therefore based on the object of specifying an improved device and an improved method for the thermal treatment of samples contained in sample vessels.
  • the device and the method should ensure that even in low
  • Sample vessels e.g. in microtiter plates for small volumes samples contained in a desired temperature profile as exactly as possible and run through at high speed.
  • the device according to the invention for the thermal treatment of samples contained in sample vessels comprises:
  • a first temperature control device which is thermally coupled to the sample block and is set up to set a temperature of the sample block
  • a cover plate for sample vessels arranged in the receiving area of the sample block
  • a second temperature control device which is thermally coupled to the cover plate and is configured to set a temperature of the cover plate
  • control unit which is connected to the first and the second temperature control device and is set up to control the first and the second temperature control device
  • control unit is set up to control the temperature of the sample block and the temperature of the cover plate in a coordinated manner by means of the first and the second temperature control device.
  • the device can, for example, be a thermal cycler for carrying out the PCR in the
  • Sample containers contained samples.
  • the device according to the invention is set up to regulate the temperature of the cover plate in a manner matched to the temperature of the sample block. This makes it possible, on the one hand, to regulate the temperature of the cover plate in such a way that the undesired formation of condensation on a cover of the sample vessels is prevented, and on the other hand to reduce the influence of the heated cover plate on the sample temperature, so that the desired sample temperatures can be set quickly and precisely is possible.
  • control unit can be set up to control the temperature of the cover plate and the temperature of the sample block in such a way that the temperature of the cover plate is equal to or greater than the temperature of the sample block and that a difference between the temperature of the cover plate and the sample block does not exceed a, in particular a predetermined, maximum value.
  • control unit regulates the temperature of the sample block and the cover plate in such a way that the temperature of the cover plate is on the one hand equal to or greater than the
  • the temperature gradient is specifically controlled and ideally kept as low as possible, thus reducing the influence of the cover plate on the sample temperature.
  • the maximum value of the temperature difference can depend on the type of application, e.g. on the nature of the sample vessels and on the temperature profile to be set for the samples.
  • the maximum value of the temperature difference is advantageously much smaller than the difference between the highest and the lowest temperature setpoint to be set by the control unit for the sample block,
  • the maximum value of the temperature difference is less than a quarter or even less than a tenth of the difference between the highest and the lowest
  • Temperature difference between the temperature of the cover plate and the sample block is less than 10 K, in particular less than 5 K.
  • the control unit can be set up to control the temperature of the cover plate and the temperature of the sample block in such a way that it is coordinated with one another that it controls the temperature of the cover plate as a function of the temperature of the sample block.
  • the control unit can include, for example, a first controller which is set up to control the temperature of the sample block, in particular cyclically, by means of the first temperature control device, according to a predefined setpoint temperature profile.
  • Tempering device to regulate the temperature of the cover plate using a reference variable, the reference variable depending on one of the following variables: a setpoint temperature of the sample block, an actual temperature of the sample block or one of the first controller
  • the first and / or the second controller can be designed as electrical or electronic control circuits.
  • the first and / or the second controller can also be implemented as software that is executed by a microcontroller of the control unit.
  • the control unit can be designed as electrical or electronic control circuits.
  • the first and / or the second controller can also be implemented as software that is executed by a microcontroller of the control unit.
  • the microcontroller of the control unit.
  • the reference variable for the second controller is determined from the target temperature of the sample block, the actual temperature of the sample block or from the manipulated variable output by the first controller.
  • the second controller or another connected to the second controller can be used
  • Component of the control unit determine the reference variable for the second controller by adding a value representing the temperature difference between the sample block and the cover plate to the actual temperature of the sample block, the setpoint temperature of the sample block or the manipulated variable.
  • control unit can be designed to control the temperature of the cover plate and the temperature of the sample block in such a way that it is coordinated with one another so that it controls the temperature of the sample block as a function of the temperature of the cover plate.
  • control unit can for example include a first controller which is set up to control the temperature of the sample block by means of the first temperature control device.
  • the control unit can additionally comprise a second controller which is set up to control the temperature of the cover plate, in particular cyclically, by means of the second temperature control device according to a predetermined target temperature profile, the first controller being set up to control the temperature of the sample block using a To regulate reference variable, which depends on one of the following variables: a target temperature of the cover plate, an actual temperature of the
  • the temperature of the cover plate is determined by the temperature of the sample block
  • the temperature of the sample block is determined according to the temperature of the cover plate
  • the first and / or the second controller can also in this embodiment be implemented as electrical or electronic control circuits and / or as executable by a microcontroller of the control unit Software.
  • the reference variable can be determined in a manner analogous to that in the embodiment described above.
  • the device according to the invention is particularly advantageously used for the thermal treatment of samples in sample vessels which are combined in a microtiter plate for small sample volumes.
  • the cover plate can have a planar front surface which is designed to rest against sample vessels arranged in the receiving region of the sample block in such a way that the
  • Sample vessels are sandwiched between the sample block and the cover plate.
  • the cover plate can have a multiplicity of openings or windows through which an optical observation of the sample vessels is possible and which are arranged in a, for example, rectangular, central region of the cover plate.
  • the second temperature control device can comprise at least one heating element arranged on the cover plate and at least one cooling element, wherein the at least one cooling element surrounds the central area of the cover plate which has the openings or windows
  • Peripheral area is arranged.
  • Several cooling elements are advantageously arranged in the peripheral area.
  • the at least one heating element can be arranged on or in webs of the cover plate that run between the openings or windows.
  • the cover plate can consist of a material containing at least one refractory metal, produced by powder metallurgy, containing copper or silver. These materials have the advantage of high thermal conductivity combined with a comparatively low thermal capacity.
  • the thermal conductivity of the material from which the cover plate is formed is advantageously between 160 and 500 W / mK and the heat capacity between 150 and 300 J / kgK.
  • the first temperature control device can have at least one thermoelectric element in contact with the sample block, e.g. a Peltier element, and one with the at least one
  • thermoelectric element in contact heat sink The device advantageously comprises several Peltier elements.
  • the method according to the invention for the thermal treatment of samples in sample vessels with the aim of DNA replication comprises the following steps:
  • Controlling a temperature of the sample block by means of a control unit and a first temperature control device which is thermally coupled to the sample block and which is controlled by the control unit for setting the temperature of the sample block;
  • the step of closing the sample vessels can be carried out before or after the arrangement of the sample vessels in the receiving area of the sample block.
  • the sample vessels can be closed by means of individual, preferably optically transparent, closures each assigned to a sample vessel or, if the sample vessels are combined in a microtiter plate, by means of a preferably optically transparent sealing film or sealing mat.
  • Sample vessels are covered with the cover plate.
  • the temperature of the cover plate and the temperature of the sample block can be coordinated so that the temperature of the cover plate is equal to or greater than the temperature of the sample block and that a difference between the temperature of the
  • the maximum value can be specified by the control unit and, for example, be stored in a memory of the control unit.
  • the maximum value can, for example, be a fraction of the difference between the maximum value and the minimum value of the nominal temperature profile of the sample block or samples, e.g. a value of a few degrees Kelvin.
  • the temperature of the sample block can be regulated according to a predetermined target temperature curve, the temperature of the cover plate being regulated using a reference variable that depends on one of the following variables: a target temperature of the Sample block, an actual temperature of the sample block or a manipulated variable output by the control unit for setting the temperature of the sample block to the first temperature control device.
  • the specified target temperature profile of the sample block can be, for example, a cyclical temperature profile for carrying out the PCR in the samples.
  • the temperature of the cover plate can be regulated according to a predetermined target temperature profile, the temperature of the sample block being controlled using a reference variable that depends on one of the following variables: a target temperature of the cover plate, an actual temperature of the cover plate or a manipulated variable output by the control unit for setting the temperature of the cover plate to the second temperature control device.
  • An arrangement for performing the method described here in accordance with one of the specified configurations and variants comprises a device configured, for example, as a thermal cycler, in accordance with one of the configurations described above and a plurality of
  • Sample vessels containing samples to be thermally treated the sample vessels being combined in a microtiter plate, and the microtiter plate being arranged in a receiving area of the sample block and being covered by the cover plate. That way is the
  • Microtiter plate sandwiched between the sample block and the cover plate.
  • the device according to the invention and the method according to the invention are particularly advantageously used when using sample vessels combined in microtiter plates for small sample volumes in the low microliter range, for example those as described in DE 600 26 834 T2 and DE 699 14 220 T2.
  • sample vessels combined in microtiter plates for small sample volumes in the low microliter range for example those as described in DE 600 26 834 T2 and DE 699 14 220 T2.
  • the device and the method described enable fast and precise setting of the sample temperatures according to a specified, required for the PCR
  • the volume of an individual sample vessel of the microtiter plate or of the sample received in a single sample vessel is between 10 and 20 ⁇ l.
  • the sample vessels can be designed as wells or depressions in the microtiter plate.
  • the wall thickness of the sample vessels combined in the microtiter plate can be selected, at least in an area intended for receiving a liquid sample, so that it is not more than 100 ⁇ m, advantageously between 10 and 40 ⁇ m.
  • Show it: 1 shows a diagram of the temperature profile over time of a sample block, a
  • FIG. 2 shows a schematic sectional illustration of a device for the thermal treatment of samples
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a plan view of the device according to FIG. 2;
  • Sample vessel sealing cover e.g. a sealing film
  • a cover plate which is heated to avoid condensation on the cover.
  • Sample vessels for small sample volumes also have a correspondingly low overall height.
  • the temperature of the sample block (solid line) is determined according to a
  • the temperature profile for one cycle of the PCR is regulated: In a first period of time, the sample block is heated to 95 ° C (denaturation phase), then the sample block is cooled to 50 ° C (primer hybridization phase) and held at this temperature for a second period of time.
  • sample block is then reheated to a temperature of 72 ° C
  • the sample block is again heated to 95 ° C and a new cycle begins.
  • the temperature of the heatable cover plate (dashed line) is kept constant at 95 ° C.
  • the dotted line shows the course of the sample temperature. It can be seen that the influence of the heated cover plate on the temperature of the samples means that the temperature of the samples does not precisely follow the course of the temperature of the sample block. It is particularly disadvantageous that the samples do not reach the final temperature of 50 ° C. desired for the primer hybridization phase, but rather remain at an actual final temperature of around 60 ° C.
  • FIG. 2 an example of an improved device according to the invention for controlling the temperature of samples is shown schematically in a sectional illustration.
  • the device has a sample block 4 on, on the underside of which temperature control elements 5 are arranged, which are in thermal contact with the sample block 4 in order to heat or cool it.
  • the temperature control elements 5 can be designed, for example, as Peltier elements.
  • the temperature control elements 5 are in contact with a heat sink 6.
  • the heat sink 6 comprises a plurality of heat sinks for dissipating heat from the temperature control elements 5.
  • the temperature control elements 5 are thus sandwiched between the sample block 4 and the Heat sink 6 arranged.
  • the sample block 4 is made of a material with high
  • Thermal conductivity e.g. made of silver or aluminum. This enables the temperature of the sample block 4 to be set quickly by means of the temperature control elements 5.
  • the sample block 4 On its front side, which is opposite the rear side in contact with the temperature elements 5, the sample block 4 has a receiving area for sample vessels 9.
  • sample vessels 9 are combined in a microtiter plate 3.
  • the microtiter plate 3 used here is a microtiter plate for small volumes.
  • the receiving area of the sample block 4 accordingly has a surface resting against the rear side of the microtiter plate 3 with recesses for receiving the sample vessels 9.
  • the microtiter plate 3 is covered by a sealing film 10, which the individual, as wells in the
  • Microtiter plate designed, sample vessels 9 sealed tight.
  • the microtiter plate 3 with the sealing film 10 is covered by a cover plate 2.
  • the cover plate 2 is thermally coupled to a temperature control device which comprises one or more heating elements 1.
  • a temperature control device which comprises one or more heating elements 1.
  • a single, flat heating element 1 is present.
  • the heating element or elements 1 can be configured as resistance heating elements, for example.
  • Fig. 3 is a view of the device is shown schematically from above.
  • the heating element 1 has a plurality of openings 12 through which optical measurements, e.g. Fluorescence measurements on in the sample vessels 9 of the microtiter plate 3
  • the cover plate 2 can consist of a material that is transparent to measurement radiation. Alternatively and advantageously, it can consist of a material which is not transparent to the measuring radiation and which, in addition to good thermal conductivity, has a low thermal conductivity
  • Suitable materials are refractory metals and refractory metal alloys, for example materials containing at least one refractory metal and made of copper or silver produced by powder metallurgy.
  • Refractory metals are usually refractory metals of the 4th, 5th and 6th subgroups of the periodic table of the elements, e.g. titanium, zirconium, hafnium, vanadium, niobium, tantalum, chromium, molybdenum and tungsten, as well as one or more of these metals Understand alloys.
  • Refractory metals or alloys which have a thermal conductivity in the range between 160 and 400 W / mK and a heat capacity between 150 and 300 J / kgK are advantageous for use as the material of the cover plate 2.
  • a tungsten-copper sintered material with a thermal conductivity between 160 and 230 W / mK and a heat capacity between 200 and 250 J / kgK can be considered.
  • the cover plate 2 Openings aligned with the openings 12 of the heating element 1, through which the measuring radiation from the sample vessels of the microtiter plate 3 can be detected.
  • the sealing film 10 consists of a polymer that is transparent to measurement radiation.
  • the temperature control device for the cover plate 2 also includes a plurality of cooling elements 11.
  • the cooling elements 1 1 are in the present example on the periphery of the
  • Cover plate 2 arranged.
  • heat pipes or fluid cooling, e.g. Water or air cooling.
  • the device for thermal treatment of the samples contained in the microtiter plate 3 further comprises a control unit 13 which is electrically connected to the temperature control elements 5 for setting the temperature of the sample block 4 and to the heating element 1 and the cooling elements 11 for setting the temperature of the cover plate 2 .
  • the control unit 13 can comprise an electrical or electronic control circuit, in particular with a microcontroller with software for executing a data memory containing temperature control.
  • the control unit 13 is set up to control the temperature of the cover plate 2 and the temperature of the sample block 4 in a coordinated manner.
  • the control unit 13 includes two controllers, namely a first controller 7 for controlling the temperature of the sample block 4 and a second controller 8 for controlling the temperature of the cover plate.
  • the first controller 7 is set up to use a reference variable that represents the setpoint temperature profile of the PCR cycle and the current actual temperature of the sample block 4
  • the controlled variable can be made available, for example, by a temperature sensor (not shown in FIGS. 2 and 3) which detects the current actual temperature of the sample block 4.
  • the first controller 7 is also set up to measure the actual temperature of the sample block 4
  • the signal can be, for example, the reference variable of the first controller 7, the controlled variable of the first controller 7 or the manipulated variable output by the first controller 7 or a signal derived from one of these variables.
  • the second controller 8 is designed to use a command variable derived from the signal obtained from the controller 7 and representing the actual temperature of the sample block 4 and a control variable representing the current actual temperature of the cover plate 2 to determine a manipulated variable and to transmit it to the heating element 1 and / or output to the cooling elements 1 1 in order to set the temperature of the cover plate 2 to the value of the reference variable.
  • the controlled variable can be, for example, a temperature of the cover plate 2 detected by a temperature sensor (not shown in FIGS. 2 and 3).
  • the reference variable for the second controller 8 can be determined based on the signal made available by the first controller 7 in such a way that it corresponds to a setpoint temperature corresponds to the cover plate 2, which is equal to the actual temperature of the sample block 4 or is a few Kelvin, for example 2 to 10 K, higher than the actual temperature of the sample block 4.
  • the method is carried out by means of the device shown in FIGS. 2 and 3.
  • the sample vessels 9 containing the samples, which are combined in the microtiter plate 3 are arranged in the receiving area of the sample block 4.
  • the sample vessels 9 are closed, e.g. by means of a sealing film 10 which is placed or glued onto the microtiter plate 3.
  • the sample vessels 9 are then covered with the cover plate 2.
  • the microtiter plate 3 is then sandwiched between the sample block 4 and the cover plate 2.
  • the control unit 13 the temperature of the
  • Cover plate 2 and the temperature of the sample block 4 are regulated in a coordinated manner, so that the samples have a desired, e.g. one used for DNA amplification by means of PCR,
  • control unit 13 can regulate the temperature of the cover plate 2 and the sample block in such a way that the temperature of the cover plate 2 is equal to or greater than the temperature of the sample block 4 and that the difference between the temperature of the cover plate 2 and the temperature of the sample block does not exceed a maximum value.
  • this maximum value can be a few Kelvin, e.g. 2 to 10 K.
  • the temperature of the cover plate 2 is controlled as a function of the temperature of the sample block 4.
  • the temperature of the sample block 4 is controlled for the thermal treatment of the samples, namely in the present example according to one for the cycles the course of the PCR.
  • the first controller 7 under-regulates the temperature control elements 5 thermally coupled to the sample block 4
  • the first controller also outputs a signal representing the actual temperature of the sample block 4 to the second controller 8, which signal, for example, the reference variable of the first controller 7, the
  • the second controller 8 determines its reference variable from the signal, for example in the simplest case by adding an amount representing a desired temperature difference between the sample block 4 and the cover plate 2 to the value of the signal.
  • the reference variable determined in this way corresponds to a setpoint temperature of the cover plate 2, which is higher by the desired temperature difference than the current actual temperature of the sample block 4.
  • the second controller regulates the temperature of the cover plate 2 based on the determined reference variable and a control variable representing the current actual temperature of the cover plate 2, which can be determined for example by means of a temperature sensor. For this purpose, it can send a manipulated variable to the heating element 1 and / or to the Output cooling elements 1 1 in order to set the temperature of the cover plate 2 to the value of the reference variable.
  • the profiles of the temperatures of the sample block 4, the cover plate 2 and a sample contained in the microtiter plate 3 in the course of the described method are illustrated in FIG. 4 in a schematic representation.
  • the temperature of the sample block 4 (solid line) follows the predetermined temperature profile for one cycle of the PCR. It essentially corresponds to the temperature profile of the sample block with the denaturation phase, the primer hybridization phase and the amplification phase, as shown in FIG. 1.
  • the temperature of the cover plate 2 of the device shown in FIGS. 2 and 3 does not remain constant at a high value.
  • the temperature of the cover plate 2 (dashed line) is adapted at any time to the temperature profile of the sample block 4, so that a temperature difference between the cover plate 2 and the sample block 4 does not exceed a maximum value of 10 K. exceeds. From FIG. 4 it can be seen that, as a result of this temperature regulation of the cover plate 2, the temperature of the sample (dotted line) is essentially also significantly
  • the value given by the sample block 4 is reached during the cooling phase.
  • the invention includes a large number of variants and modifications of the exemplary embodiment described here.
  • a temperature sensor that detects the current actual temperature of the sample block outputs a signal representing the actual temperature of the sample block to the second controller of the control unit in order to derive the reference variable of the second controller.
  • a first controller connected to the temperature control elements for the sample block regulates the temperature of the sample block as a function of the temperature of the cover plate, which is regulated by a second controller regulates.
  • the second controller is given a command variable reflecting the course of the PCR cycles, while the first controller receives a signal representing the actual temperature of the cover plate from the second controller, on the basis of which the command variable of the first controller for temperature control of the sample block is determined .

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur thermischen Behandlung von in Probengefäßen (9) enthaltenen Proben, umfassend: einen Probenblock (4) mit einem Aufnahmebereich für die Probengefäße (9); eine erste Temperiervorrichtung, die mit dem Probenblock (4) thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur des Probenblocks (4) einzustellen; eine Abdeckplatte (2) für in dem Aufnahmebereich des Probenblocks (4) angeordnete Probengefäße (9); eine zweite Temperiervorrichtung, die mit der Abdeckplatte (2) thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur der Abdeckplatte (2) einzustellen; und eine Regeleinheit (13), die mit der ersten und der zweiten Temperiervorrichtung verbunden ist, und dazu eingerichtet ist, die erste und die zweite Temperiervorrichtung zu steuern, wobei die Regeleinheit (13) dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks (4) und die Temperatur der Abdeckplatte (2) mittels der ersten und der zweiten Temperiervorrichtung aufeinander abgestimmt zu regeln. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur thermischen Behandlung von in Probengefäßen enthaltenen Proben.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur thermischen Behandlung von Proben
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur thermischen Behandlung von in
Probengefäßen enthaltenen Proben, insbesondere für die DNA-Vervielfältigung.
In der Laboranalytik gibt es eine Reihe von Anwendungen, bei denen eine Vielzahl kleiner
Probenvolumina gleichzeitig behandelt und untersucht werden. Ein Beispiel für eine derartige
Anwendung, die in der DNA-Analytik eine große Rolle spielt, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit der sich geringste DNA-Mengen vervielfältigen lassen. Die PCR erfordert eine thermische
Behandlung der Proben, bei der diese wiederholt einen thermischen Zyklus durchlaufen. Ein solcher Zyklus besteht typischerweise aus einer Denaturierungsphase bei einer hohen Temperatur (z.B. 94 bis 100 °C), einer Primerhybridisierungsphase bei einer tiefen Temperatur (z.B. 55 bis 65 °C) und einer Elongations- oder Amplifikationsphase bei einer mittleren Temperatur (z.B. 60 bis 72 °C).
Typischerweise durchlaufen die Proben diesen Zyklus ca. 30-mal.
In manchen Anwendungen wird gleichzeitig zum Vervielfältigen der Probe eine Analyse mittels optischer Messverfahren durchgeführt. Diese Anwendungen werden auch als„Real-time
PCR“ bezeichnet.
Zur thermischen Behandlung von Proben gibt es eine Vielzahl an für die jeweilige Anwendung angepasster Laborgeräte. Aus dem deutschen Gebrauchsmuster G 9205824 U1 ist beispielsweise ein einfacher Metallblock-Thermostat bekannt, der die gleichzeitige thermische Behandlung mehrerer Proben erlaubt. Im Unterschied zu einem solchen einfachen Metallblock-Thermostaten ist es zur Realisierung kurzer Prozesszeiten bei der erwähnten Zahl von Behandlungszyklen, z.B. bei der PCR, erforderlich, dass Wärme möglichst schnell in die Proben übertragen oder aus ihnen entnommen werden kann. Zur Durchführung der PCR werden herkömmlich sogenannte Thermocycler eingesetzt. Diese Geräte weisen einen Thermoblock auf, auf den die Probengefäße aufgesetzt werden, und der dazu eingerichtet ist, die Probengefäße zu temperieren. Zur Steuerung der thermischen Behandlung der Proben weisen die Thermocycler eine Regelelektronik auf, die dazu eingerichtet ist, die Temperatur der Proben gemäß einem gewünschten Temperaturverlauf im Wertebereich zwischen 4 °C und 100 °C zu regeln. Für den Anwender ist es von entscheidendem Vorteil, wenn diese Temperaturwechsel mit möglichst steilen Temperaturverläufen und somit mit vielen Zyklen in möglichst kurzer Zeit ausgeführt werden können. Idealerweise werden für die oben erwähnten 30 Zyklen nur wenige Minuten benötigt.
Thermoblöcke herkömmlicher Thermocycler weisen häufig einen zur Aufnahme von Probengefäßen bestimmten Probenblock, von der Steuerelektronik steuerbare Peltier-Elemente zur Heizung und Kühlung der Probengefäße und eine mit den Peltier-Elementen in Kontakt stehende Wärmesenke, z.B. in Form von Kühlkörpern, auf. Die Peltier-Elemente sind dabei sandwichartig zwischen dem
Probenblock und der Wärmesenke angeordnet, so dass die Wärmesenke entstehende Abwärme ableitet, und dadurch einen schnelleren Temperaturwechsel ermöglicht. Der Probenblock bildet einen Aufnahmebereich für die Probengefäße. In diesem Aufnahmebereich kann der Probenblock Vertiefungen aufweisen, in die die einzelnen Probengefäße eingreifen, wenn sie im Aufnahmebereich angeordnet sind. Häufig sind die Probengefäße in einer Mikrotiterplatte zusammengefasst. In vielen Mikrotiterplatten sind die Probengefäße durch Eintiefungen (sogenannte Wells) gebildet. Üblich sind hierfür aus Polypropylen auf Spritzgussmaschinen hergestellte sogenannte 96-er und 384-er Mikrotiterplatten. Ebenfalls üblich, aber wesentlich teurer sind Mikrotiterplatten, die über einen aus einem zweiten Kunststoff oder Kunststoffgemisch umspritzten harten Rahmen verfügen und deshalb robuster in der Handhabung sind. Diese Platten werden in der Fachsprache auch mit dem englischen Begriff„hard skirted plates“ bezeichnet. Die Wells können, abhängig vom
Verwendungszweck der Mikrotiterplatte, unterschiedlich ausgeformt sein. Häufig ist der Probenblock des Thermocyclers so ausgestaltet, dass er die einzelnen Wells der Mikrotiterplatte in den erwähnten Vertiefungen im Aufnahmebereich formschlüssig aufnehmen kann.
Zur Vermeidung von Probenverlusten durch Verdunstung können die einzelnen Probengefäße verschlossen bzw. abgedichtet werden. Die einzelnen Probengefäße können hierzu jeweils einen eigenen Verschluss oder einen Pfropfen aus einem isolierenden, nicht mit der Probe mischbaren Material, z.B. Wachs, aufweisen. Mikrotiterplatten können mittels einer Dichtmatte oder einer Dichtfolie (auch als Sealing-Folie bezeichnet) abgedeckt werden, die die Wells dicht verschließt. Jedoch verdunstet innerhalb eines jeden Probengefäßes stets eine geringe Menge Wasser aus der
Probenflüssigkeit und schlägt sich in kühleren Bereichen des Probengefäßes durch Kondensation nieder. Dies hat mehrere Nachteile: Zum einen kann es dadurch zu einem unerwünschten
Aufkonzentrieren der Probe kommen. Zum anderen kann es sein, dass durch Kondensation gebildete Tropfen an der Sealing-Folie hängen bleiben und eine optische in situ-Messung bei Real-time-PCR- Anwendungen beeinträchtigen.
Um diese Kondensation und die damit einhergehenden Nachteile zu vermeiden, wird in Thermocyclern häufig eine heizbare Abdeckplatte für die Probengefäße verwendet, die auf die Probengefäße bzw. auf eine die Probengefäße abdeckende Dichtfolie oder Dichtmatte aufgelegt und ggfs an diese angepresst wird. Typischerweise wird die Abdeckplatte auf einer Temperatur gehalten, die etwa 5 K über der höchsten im Temperaturverlauf des Probenblocks vorkommenden Temperatur liegt. Ein solcher Thermocycler mit heizbarer Abdeckplatte ist beispielsweise in US 9,776,187 B2 beschrieben.
Nachteilig an dieser Lösung ist, dass in bestimmten Phasen des Zyklus, beispielsweise in einer Abkühlphase, ein großer Temperaturunterschied zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte, und mithin ein großer Temperaturgradient über die Probengefäße, auftritt. In der Abkühlphase kann der Probenblock die Probe auf Temperaturen unter 70 °C abkühlen, während die Abdeckplatte weiterhin auf einer Temperatur verbleibt, die 5 K oberhalb der Maximaltemperatur des PCR-Temperaturzyklus, also beispielsweise in der Nähe von 100 °C, liegen kann. Der hohe Temperaturgradient führt zu einem während der Abkühlphase unerwünschten Wärmeeintrag aus der Abdeckplatte in die Proben. Dies führt dazu, dass die Endtemperatur der Abkühlphase erst verzögert erreicht wird und steht einer weiteren Verringerung der Zyklusdauer im Wege.
Der Einfluss der beheizten Abdeckplatte auf die Temperatur der Proben kann mittels einer möglichst großen Kontaktfläche zwischen den Probengefäßen und dem Probenblock geringgehalten werden. Für PCR-Anwendungen werden daher häufig Mikrotiterplatten mit konisch geformten Wells und entsprechende Probenblöcke mit konisch ausgestalteten Vertiefungen im Aufnahmebereich für die Mikrotiterplatten verwendet. Diese Ausgestaltung gewährleistet eine verhältnismäßig große
Kontaktfläche zwischen den Wells und dem Probenblock, was eine gute Wärmekopplung ermöglicht, so dass der Einfluss der beheizten Abdeckplatte gering bleibt und die Temperatur der Proben mit nur geringer Verzögerung dem Temperaturverlauf des Probenblocks folgt.
Als weitere Maßnahme zur Verbesserung der Wärmekopplung zwischen Probenblock und
Probengefäßen schlägt die DE 69914220 T2 die Verwendung möglichst dünnwandiger Probengefäße vor. Diese Probengefäße können als Wells einer Mikrotiterplatte ausgestaltet sein, die durch
Thermoformen oder Vakuumformen aus einem dünnen thermoplastischen Film erzeugt werden kann. Für die automatisierte Handhabung durch einen Roboter können die Mikrotiterplatten einen Rahmen umfassen, der die Ränder der Platten oder einzelne Vertiefungen unterstützt. Dieser Rahmen kann spritzgegossen und an die die dünnwandigen Probengefäße bildende Folie durch eine Hitzeverbindung gefügt sein. Diese Montage von Tiefziehteilen und Spritzgussteilen ist jedoch verhältnismäßig aufwändig und entsprechend kostspielig.
DE 60026834 T2 beschreibt die Anwendung dieser speziellen Mikroplatten in einem sehr schnellen Thermocycler. Ein derartiger Thermocycler wurde auch von der Anmelderin unter der Bezeichnung speedCYCLER auf den Markt gebracht. Die oben genannten typischen 30 Zyklen können so deutlich schneller als in einer halben Stunde absolviert werden.
Ein analoger Ansatz ist in US 10,076,757 B2 beschrieben. Hier werden mehrere Temperaturblöcke verwendet, zwischen denen die extrem dünnwandige Mikrotiterplatte ihre Position wechselt. Dies erlaubt noch schnellere Temperaturwechsel. Der Positionswechsel der Mikrotiterplatten ist jeweils mit dem mechanischen Einpressen in Vertiefungen der Temperaturblöcke verbunden. Eine solche Anordnung ist jedoch mechanisch aufwändig und kann verschleißanfällig sein.
In US 9,492,825 ist eine spezielle Mikrotiterplatte für PCR-Anwendungen beschrieben, die aus unterschiedlich gut wärmeleitfähigen Materialien besteht. Sie ist im Bereich ihrer zum Kontakt mit dem Probenblock bestimmten Grundfläche aus einem relativ gut wärmeleitenden Material gebildet, während sie in einem zum Kontakt mit der Abdeckplatte bestimmten Bereich aus einem relativ
wärmeisolierenden Material gebildet ist. Im Bereich des gut wärmeleitenden Materials sind zusätzlich Vertiefungen ausgebildet, die in Aufnahmen des Probenblocks hineinragen und entsprechend eine Vergrößerung der Kontaktfläche einen besseren Wärmeübergang in die Probe bewirken und damit die schnelle Durchführung von Reaktionszyklen der PCR ermöglicht. Diese Lösung erfordert jedoch eine aufwändig geformte Oberfläche des Probenblocks sowie eine aus zwei unterschiedlichen Materialien bestehende PCR-Platte. Dies macht die Herstellung des Probenblocks und der Mikrotiterplatte ebenfalls aufwändig und kostspielig.
Mit den genannten geometrischen und materialtechnischen Ausgestaltungen der Mikroplatten kann erheblich Einfluss auf die Zyklus-Geschwindigkeiten genommen werden. Trotzdem wirkt auch bei Verwendung dieser Mikroplatten die auf 5 K oberhalb der Maximaltemperatur des PCR- Temperaturzyklus temperierte Abdeckplatte gegen die Kühlzyklen des Probenblocks. Dieser Effekt wirkt sich bei relativ flachen, sehr dünnwandigen Mikroplatten, wie sie beispielsweise in DE 699 14 220 T2 beschrieben sind bzw. im oben genannten speedCycler zur Anwendung kommen, sehr deutlich aus und resultiert in einer Verringerung der möglichen Zyklusfrequenz.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Vorrichtung und ein verbessertes Verfahren zur thermischen Behandlung von in Probengefäßen enthaltenen Proben anzugeben.
Insbesondere sollen die Vorrichtung bzw. das Verfahren sicherstellen, dass auch in niedrigen
Probengefäßen, z.B. in Mikrotiterplatten für kleine Volumina enthaltenen Proben einen gewünschten Temperaturverlauf möglichst exakt und mit hoher Geschwindigkeit durchlaufen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und das Verfahren gemäß Anspruch 14. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur thermischen Behandlung von in Probengefäßen enthaltenen Proben, umfasst:
einen Probenblock mit einem Aufnahmebereich für die Probengefäße;
eine erste Temperiervorrichtung, die mit dem Probenblock thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur des Probenblocks einzustellen;
eine Abdeckplatte für in dem Aufnahmebereich des Probenblocks angeordnete Probengefäße;
eine zweite Temperiervorrichtung, die mit der Abdeckplatte thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur der Abdeckplatte einzustellen; und
eine Regeleinheit, die mit der ersten und der zweiten Temperiervorrichtung verbunden ist, und dazu eingerichtet ist, die erste und die zweite Temperiervorrichtung zu steuern,
dadurch gekennzeichnet, dass die Regeleinheit dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks und die Temperatur der Abdeckplatte mittels der ersten und der zweiten Temperiervorrichtung aufeinander abgestimmt zu regeln.
Die Vorrichtung kann beispielsweise ein Thermocycler zur Durchführung der PCR an in den
Probengefäßen enthaltenen Proben sein. Im Unterschied zu herkömmlichen Thermocyclern mit beheizbarer Abdeckplatte für die Probengefäße, bei denen die beheizbare Abdeckplatte unabhängig von der Temperatur des Probenblocks auf einer konstanten Temperatur gehalten wird, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dazu eingerichtet, die Temperatur der Abdeckplatte auf die Temperatur des Probenblocks abgestimmt zu regeln. Dies ermöglicht es, die Temperatur der Abdeckplatte zum einen so zu regeln, dass die unerwünschte Kondensatbildung an einer Abdeckung der Probengefäße verhindert wird, und zum anderen den Einfluss der beheizten Abdeckplatte auf die Probentemperatur zu verringern, so dass eine schnelle und präzise Einstellung von gewünschten Probentemperaturen möglich ist.
In einer ersten Ausgestaltung kann die Regeleinheit dazu eingerichtet sein, die Temperatur der Abdeckplatte und die Temperatur des Probenblocks derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass die Temperatur der Abdeckplatte gleich oder größer als die Temperatur des Probenblocks ist, und dass eine Differenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte und des Probenblocks einen, insbesondere vorgegebenen, Höchstwert nicht überschreitet.
Indem die Regeleinheit die Temperatur des Probenblocks und der Abdeckplatte so aufeinander abgestimmt regelt, dass die Temperatur der Abdeckplatte einerseits gleich oder größer als die
Temperatur des Probenblocks ist, andererseits aber die Differenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte und der des Probenblocks einen Höchstwert nicht überschreitet, wird einerseits die Kondensatbildung an einer die Probengefäße verschließenden Abdeckung vermieden. Andererseits wird ein sich über die Probe zwischen der Abdeckplatte und dem Probenblock ausbildender
Temperaturgradient gezielt gesteuert und idealerweise möglichst gering gehalten, und so der Einfluss der Abdeckplatte auf die Probentemperatur reduziert.
Der Höchstwert der Temperaturdifferenz kann von der Art der Anwendung, z.B. von der Beschaffenheit der Probengefäße und von dem einzustellenden Temperaturverlauf der Proben, abhängen. Vorteilhaft ist der Höchstwert der Temperaturdifferenz wesentlich kleiner, als die Differenz des höchsten und des niedrigsten von der Regeleinheit einzustellenden Temperatur-Sollwerts des Probenblocks,
beispielsweise kleiner als die die Hälfte der Differenz des höchsten und niedrigsten Temperatur- Sollwerts des Probenblocks. Noch vorteilhafter ist der Höchstwert der Temperaturdifferenz kleiner als ein Viertel oder sogar kleiner als ein Zehntel der Differenz des höchsten und des niedrigsten
Temperatur-Sollwerts des Probenblocks. In absoluten Werten kann der Höchstwert der
Temperaturdifferenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte und des Probenblocks weniger als 10 K, insbesondere weniger als 5 K, betragen.
Die Regeleinheit kann dazu eingerichtet sein, die Temperatur der Abdeckplatte und die Temperatur des Probenblocks derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass sie die Temperatur der Abdeckplatte in Abhängigkeit von der Temperatur des Probenblocks regelt. Die Regeleinheit kann beispielsweise einen ersten Regler umfassen, der dazu eingerichtet ist, mittels der ersten Temperiervorrichtung die Temperatur des Probenblocks, insbesondere zyklisch, gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf zu regeln.
Sie kann weiter einen zweiten Regler umfassen, der dazu eingerichtet ist, mittels der zweiten
Temperiervorrichtung die Temperatur der Abdeckplatte unter Verwendung einer Führungsgröße zu regeln, wobei die Führungsgröße von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur des Probenblocks, einer Ist-Temperatur des Probenblocks oder einer von dem ersten Regler
ausgegebenen Stellgröße.
Der erste und/oder der zweite Regler können als elektrische oder elektronische Regelschaltungen ausgebildet sein. Der erste und/oder der zweite Regler können auch als Software realisiert sein, die von einem Mikrocontroller der Regeleinheit ausgeführt wird. In dieser Ausgestaltung wird die
Führungsgröße für den zweiten Regler aus der Soll-Temperatur des Probenblocks, der Ist-Temperatur des Probenblocks oder von der von dem ersten Regler ausgegebenen Stellgröße ermittelt. Im einfachsten Fall kann der zweite Regler oder eine mit dem zweiten Regler verbundene weitere
Komponente der Regeleinheit die Führungsgröße für den zweiten Regler durch Addieren eines die Temperaturdifferenz zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte repräsentierenden Werts zu der Ist-Temperatur des Probenblocks, zur Soll-Temperatur des Probenblocks oder zur Stellgröße ermitteln.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die Regeleinheit dazu ausgestaltet sein, die Temperatur der Abdeckplatte und die Temperatur des Probenblocks derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass sie die Temperatur des Probenblocks in Abhängigkeit von der Temperatur der Abdeckplatte regelt.
Die Regeleinheit kann in dieser Ausgestaltung beispielsweise einen ersten Regler umfassen, der dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks mittels der ersten Temperiervorrichtung zu regeln. Die Regeleinheit kann zusätzlich einen zweiten Regler umfassen, der dazu eingerichtet ist, mittels der zweiten Temperiervorrichtung die Temperatur der Abdeckplatte, insbesondere zyklisch, gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf zu regeln, wobei der erste Regler dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks unter Verwendung einer Führungsgröße zu regeln, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur der Abdeckplatte, einer Ist-Temperatur der
Abdeckplatte oder einer von dem zweiten Regler ausgegebenen Stellgröße.
Anders als bei der zuvor beschriebenen Ausgestaltung, bei der sich die Temperatur der Abdeckplatte nach der Temperatur des Probenblocks bestimmt, ist es bei der hier beschriebenen alternativen Ausgestaltung die Temperatur des Probenblocks, die sich nach der Temperatur der Abdeckplatte bestimmt.
Der erste und/oder der zweite Regler können auch in dieser Ausgestaltung als elektrische oder elektronische Regelschaltungen und/oder als von einem Microcontroller der Regeleinheit ausführbare Software realisiert sein. Die Ermittlung der Führungsgröße kann in analoger Weise wie bei der zuvor beschriebenen Ausgestaltung erfolgen.
Besonders vorteilhaft kommt die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Einsatz für die thermische Behandlung von Proben in Probengefäßen, die in einer Mikrotiterplatte für geringe Probenvolumina zusammengefasst sind.
Die Abdeckplatte kann eine planare Vorderfläche aufweisen, die dazu eingerichtet ist, gegen im Aufnahmebereich des Probenblocks angeordnete Probengefäße derart anzuliegen, dass die
Probengefäße sandwichartig zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte angeordnet sind.
Die Abdeckplatte kann in einer vorteilhaften Ausgestaltung eine Vielzahl von Öffnungen oder Fenstern aufweisen, durch die eine optische Beobachtung der Probengefäße möglich ist, und die in einem, beispielsweise rechteckigen, zentralen Bereich der Abdeckplatte angeordnet sind. In dieser
Ausgestaltung ist es möglich, die Proben in Echtzeit (real-time) simultan zur thermischen Behandlung zu analysieren (z.B. sog. Real-time PCR). Beispielsweise können jeweils zwischen zwei
Behandlungszyklen optische Messwerte, z.B. Fluoreszenz-Messwerte, erfasst werden.
Die zweite Temperiervorrichtung kann mindestens ein an der Abdeckplatte angeordnetes Heizelement und mindestens ein Kühlelement umfassen, wobei das mindestens eine Kühlelement in einem den zentralen Bereich der Abdeckplatte, der die Öffnungen oder Fenster aufweist, umgebenden
Peripheriebereich angeordnet ist. Vorteilhaft sind mehrere Kühlelemente im Peripheriebereich angeordnet.
Das mindestens eine Heizelement kann auf oder in zwischen den Öffnungen oder Fenstern verlaufenden Stegen der Abdeckplatte angeordnet sein.
In einer möglichen Ausgestaltung kann die Abdeckplatte aus einem pulvermetallurgisch hergestellten kupfer- oder silberhaltigen, mindestens ein Refraktärmetall umfassenden Werkstoff bestehen. Diese Materialien haben den Vorteil einer hohen Wärmeleitfähigkeit bei einer gleichzeitig vergleichsweise niedrigen Wärmekapazität. Die Wärmeleitfähigkeit des Werkstoffs, aus dem die Abdeckplatte gebildet ist, beträgt vorteilhaft zwischen 160 und 500 W/mK und die Wärmekapazität zwischen 150 und 300 J/kgK.
Die erste Temperiervorrichtung kann mindestens ein mit dem Probenblock in Kontakt stehendes thermoelektrisches Element, z.B. ein Peltier-Element, und eine mit dem mindestens einen
thermoelektrischen Element in Kontakt stehende Wärmesenke aufweisen. Vorteilhaft umfasst die Vorrichtung mehrere Peltier-Elemente. Das erfindungsgemäße Verfahren zur thermischen Behandlung von Proben in Probengefäßen mit dem Ziel der DNA-Vermehrung umfasst die folgenden Schritte:
Anordnen der Probengefäße in einem Aufnahmebereich eines Probenblocks;
Verschließen der Probengefäße;
Abdecken der Probengefäße mit einer Abdeckplatte, derart, dass die Probengefäße zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte angeordnet sind;
Regeln einer Temperatur des Probenblocks mittels einer Regeleinheit und einer mit dem Probenblock thermisch gekoppelten ersten Temperiervorrichtung, die von der Regeleinheit zur Einstellung der Temperatur des Probenblocks gesteuert wird; und
Regeln einer Temperatur der Abdeckplatte mittels der Regeleinheit und einer mit dem Probenblock thermisch gekoppelten zweiten Temperiervorrichtung, die von der Regeleinheit zur Einstellung der Temperatur der Abdeckplatte gesteuert wird,
wobei die Temperatur der Abdeckplatte und die Temperatur des Probenblocks aufeinander abgestimmt geregelt werden.
Der Schritt des Verschließens der Probengefäße kann vor oder nach dem Anordnen der Probengefäße in dem Aufnahmebereich des Probenblocks durchgeführt werden. Das Verschließen der Probengefäße kann mittels einzelner, jeweils einem Probengefäß zugeordneter, vorzugsweise optisch transparenter, Verschlüsse oder, falls die Probengefäße in einer Mikrotiterplatte zusammengefasst sind, mittels einer, vorzugsweise optisch transparenten, Dichtfolie oder Dichtmatte erfolgen. Die verschlossenen
Probengefäße werden mit der Abdeckplatte abgedeckt.
Um eine aufeinander abgestimmte Regelung der Temperaturen der Abdeckplatte und des
Probenblocks zu erzielen, sind verschiedene Vorgehensweisen möglich. Drei Beispiele werden im Folgenden angegeben.
Zum Beispiel können die Temperatur der Abdeckplatte und die Temperatur des Probenblocks derart aufeinander abgestimmt geregelt werden, dass die Temperatur der Abdeckplatte gleich oder größer als die Temperatur des Probenblocks ist und dass eine Differenz zwischen der Temperatur der
Abdeckplatte und der Temperatur des Probenblocks einen, insbesondere vorgegebenen, Höchstwert nicht überschreitet. Der Höchstwert kann von der Regeleinheit vorgegeben werden und beispielsweise in einem Speicher der Regeleinheit abgelegt sein. Wie bereits erwähnt, kann der Höchstwert beispielsweise ein Bruchteil der Differenz zwischen dem Maximalwert und dem Minimalwert des Soll- Temperaturverlaufs des Probenblocks bzw. der Proben betragen, z.B. einen Wert von wenigen Grad Kelvin.
Alternativ oder zusätzlich kann die Temperatur des Probenblocks gemäß einem vorgegebenen Soll- Temperaturverlauf geregelt werden, wobei die Temperatur der Abdeckplatte unter Verwendung einer Führungsgröße geregelt wird, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur des Probenblocks, einer Ist-Temperatur des Probenblocks oder einer von der Regeleinheit zur Einstellung der Temperatur des Probenblocks an die erste Temperiervorrichtung ausgegebenen Stellgröße.
Der vorgegebene Soll-Temperaturverlauf des Probenblocks kann beispielsweise ein zyklischer Temperaturverlauf zur Durchführung der PCR in den Proben sein.
Alternativ kann die Temperatur der Abdeckplatte gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf geregelt werden, wobei die Temperatur des Probenblocks unter Verwendung einer Führungsgröße geregelt wird, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur der Abdeckplatte, einer Ist-Temperatur der Abdeckplatte oder einer von der Regeleinheit zur Einstellung der Temperatur der Abdeckplatte an die zweite Temperiervorrichtung ausgegebenen Stellgröße.
Eine Anordnung zur Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens nach einer der angegebenen Ausgestaltungen und Varianten umfasst eine, beispielsweise als Thermocycler ausgestaltete, Vorrichtung nach einer der zuvor beschriebenen Ausgestaltungen und eine Vielzahl von
Probengefäßen, die thermisch zu behandelnde Proben enthalten, wobei die Probengefäße in einer Mikrotiterplatte zusammengefasst sind, und wobei die Mikrotiterplatte in einem Aufnahmebereich des Probenblocks angeordnet und von der Abdeckplatte überdeckt ist. Auf diese Weise ist die
Mikrotiterplatte sandwichartig zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte angeordnet.
Besonders vorteilhaft kommen die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren bei Verwendung von in Mikrotiterplatten zusammengefassten Probengefäßen für geringe Probenvolumina im niedrigen Mikroliterbereich zum Einsatz, beispielsweise solchen wie in DE 600 26 834 T2 und DE 699 14 220 T2 beschrieben. Trotz der verhältnismäßig geringen Kontaktfläche zwischen dem Heizblock und den einzelnen, in der Mikrotiterplatte gebildeten Probengefäßen und trotz des relativ geringen Abstandes der Abdeckplatte zu den in der Mikrotiterplatte enthaltenen Proben ist mit der beschriebenen Vorrichtung und dem beschriebenen Verfahren die schnelle und präzise Einstellung der Probentemperaturen gemäß einem vorgegebenen, für die PCR erforderlichen
Temperaturverlauf möglich. In einer möglichen Ausgestaltung beträgt das Volumen eines einzelnen Probengefäßes der Mikrotiterplatte oder der in einem einzelnen Probengefäß aufgenommenen Probe zwischen 10 bis 20 pl. Die Probengefäße können als Wells oder Vertiefungen der Mikrotiterplatte ausgestaltet sein. Die Wandstärke der in der Mikrotiterplatte zusammengefassten Probengefäße kann, zumindest in einem zur Aufnahme einer flüssigen Probe bestimmten Bereich, so gewählt sein, dass sie nicht mehr als 100 pm, vorteilhaft zwischen 10 und 40 pm, beträgt.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele beschrieben. Gleiche Bezugszeichen geben hier gleiche Teile der dargestellten Vorrichtung an.
Es zeigen: Fig. 1 ein Diagramm des zeitlichen Temperaturverlaufs eines Probenblocks, einer
Abdeckplatte und einer in einer Mikrotiterplatte enthaltenen, zwischen dem Probenblock und der Abdeckplatte angeordneten Probe in einem herkömmlichen Thermocycler während eines PCR-Zyklus;
Fig. 2 eine schematische Schnitt-Darstellung einer Vorrichtung für die thermische Behandlung von Proben;
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Aufsicht auf die Vorrichtung gemäß Fig. 2; und
Fig. 4 eine schematische Darstellung des zeitlichen Temperaturverlaufs des Probenblocks, der
Abdeckplatte und einer Probe in der Vorrichtung gemäß Fig. 2 und 3.
Wie eingangs beschrieben, weisen herkömmliche Thermocycler einen Probenblock auf, der zur Aufnahme für Probengefäße mit thermisch zu behandelnden Proben in Probegefäßen bestimmt und eingerichtet ist. Zur Durchführung von PCR-Verfahren, insbesondere auch in Real-time-PCR- Anwendungen mit gleichzeitiger Analyse der Probe, werden die Probengefäße und eine die
Probengefäße abdichtende Abdeckung, z.B. eine Dichtfolie, mit einer Abdeckplatte überdeckt, die beheizt wird, um eine Kondensatbildung an der Abdeckung zu vermeiden. Mikrotiterplatten mit
Probengefäßen für geringe Probenvolumina besitzen entsprechend auch eine geringe Gesamthöhe.
Die bei einer solchen Anordnung an dem Probenblock, der Abdeckplatte und in den Proben bei einem herkömmlichen Thermocycler mit einer Temperaturregelung des Probenblocks und der Abdeckplatte nach dem Stand der Technik auftretenden Temperaturen sind in dem in Fig. 1 dargestellten Diagramm veranschaulicht.
Die Temperatur des Probenblocks (durchgezogene Linie) wird gemäß einem vorgegebenen
Temperaturverlauf für einen Zyklus der PCR geregelt: In einer ersten Zeitspanne wird der Probenblock auf 95 °C geheizt (Denaturierungsphase), anschließend wird der Probenblock auf 50 °C abgekühlt (Primerhybridisierungsphase) und für eine zweite Zeitspanne auf dieser Temperatur gehalten.
Anschließend wird der Probenblock wieder auf eine Temperatur von 72 °C aufgeheizt
(Amplifikationsphase). Im Anschluss an diese dritte Zeitspanne wird der Probenblock erneut auf 95 °C geheizt und ein neuer Zyklus beginnt. Die Temperatur der beheizbaren Abdeckplatte (gestrichelte Linie) wird konstant auf 95 °C gehalten. Die gepunktete Linie gibt den Verlauf der Probentemperatur wieder. Es ist ersichtlich, dass der Einfluss der beheizten Abdeckplatte auf die Temperatur der Proben dazu führt, dass die Temperatur der Proben nicht präzise dem Verlauf der Temperatur des Probenblocks folgt. Besonders nachteilig ist, dass die Proben die für die Primerhybridisierungsphase gewünschte Endtemperatur von 50 °C nicht erreichen, sondern auf einer tatsächlichen Endtemperatur von etwa 60 °C verbleiben.
In Fig. 2 ist ein Beispiel für eine erfindungsgemäße, verbesserte Vorrichtung zur Temperierung von Proben schematisch in einer Schnitt-Darstellung gezeigt. Die Vorrichtung weist einen Probenblock 4 auf, an dessen Unterseite Temperierelemente 5 angeordnet sind, die mit dem Probenblock 4 in thermischem Kontakt stehen, um diesen zu heizen oder zu kühlen. Die Temperierelemente 5 können beispielsweise als Peltier-Elemente ausgestaltet sein. Auf ihrer vom Probenblock 4 abgewandten Rückseite stehen die Temperierelemente 5 in Kontakt mit einer Wärmesenke 6. Im vorliegenden Beispiel umfasst die Wärmesenke 6 eine Vielzahl von Kühlkörpern zur Ableitung von Wärme von den Temperierelementen 5. Die Temperierelemente 5 sind also sandwichartig zwischen dem Probenblock 4 und der Wärmesenke 6 angeordnet. Der Probenblock 4 ist aus einem Material mit hoher
Wärmeleitfähigkeit, z.B. aus Silber oder aus Aluminium, ausgebildet. Dadurch wird eine schnelle Einsteilbarkeit der Temperatur des Probenblocks 4 mittels der Temperierelemente 5 ermöglicht.
Auf seiner Vorderseite, die der mit den T emperierelementen 5 in Kontakt stehenden Rückseite gegenüberliegt, weist der Probenblock 4 einen Aufnahmebereich für Probengefäße 9 auf. Die
Probengefäße 9 sind im vorliegenden Beispiel in einer Mikrotiterplatte 3 zusammengefasst. Die hier verwendete Mikrotiterplatte 3 ist eine Mikrotiterplatte für kleine Volumina. Der Aufnahmebereich des Probenblocks 4 weist entsprechend eine gegen die Rückseite der Mikrotiterplatte 3 anliegende Oberfläche mit Vertiefungen zur Aufnahme der Probengefäße 9 auf.
Die Mikrotiterplatte 3 ist durch eine Dichtfolie 10 abgedeckt, die die einzelnen, als Wells in der
Mikrotiterplatte ausgestalteten, Probengefäße 9 dicht verschließt. Die Mikrotiterplatte 3 mit der Dichtfolie 10 ist von einer Abdeckplatte 2 überdeckt. Die Abdeckplatte 2 ist thermisch mit einer Temperiervorrichtung gekoppelt, die ein oder mehrere Heizelemente 1 umfasst. Im vorliegenden Beispiel ist ein einziges, flächiges Heizelement 1 vorhanden. Das oder die Heizelemente 1 können zum Beispiel als Widerstandsheizelemente ausgestaltet sein.
In Fig. 3 ist eine Ansicht der Vorrichtung von oben schematisch dargestellt. In dieser Darstellung ist erkennbar, dass das Heizelement 1 eine Vielzahl von Öffnungen 12 aufweist, durch die optische Messungen, z.B. Fluoreszenzmessungen, an in den Probengefäßen 9 der Mikrotiterplatte 3
enthaltenen Proben möglich ist. Die Abdeckplatte 2 kann aus einem für Messstrahlung transparenten Material bestehen. Alternativ und vorteilhafterweise kann sie aus einem für die Messstrahlung nicht transparenten Material bestehen, das neben einer guten Wärmeleitfähigkeit eine geringe
Wärmekapazität besitzt. Geeignete Materialien sind Refraktärmetalle und Refraktärmetall-Legierungen, z.B. pulvermetallurgisch hergestellte kupfer- oder silberhaltige, mindestens ein Refraktärmetall umfassende Werkstoffe. Als Refraktärmetalle werden üblicherweise hochschmelzende, unedle Metalle der 4., 5. und 6. Nebengruppe des Periodensystems der Elemente, z.B. Titan, Zirkonium, Hafnium, Vanadium, Niob, Tantal, Chrom, Molybdän und Wolfram, sowie auch ein oder mehrere dieser Metalle enthaltende Legierungen verstanden. Vorteilhaft für die Anwendung als Material der Abdeckplatte 2 sind solche Refraktärmetalle oder Legierungen, die eine Wärmeleitfähigkeit im Bereich zwischen 160 und 400 W/mK und eine Wärmekapazität zwischen 150 und 300 J/kgK aufweisen. In Frage kommt beispielsweise ein Wolfram-Kupfer-Sinterwerkstoff mit einer Wärmeleitfähigkeit zwischen 160 und 230 W/mK und einer Wärmekapazität zwischen 200 und 250 J/kgK. In diesem Fall weist die Abdeckplatte 2 mit den Öffnungen 12 des Heizelements 1 fluchtende Öffnungen auf, durch die Messstrahlung aus den Probengefäßen der Mikrotiterplatte 3 hindurch erfasst werden kann. Die Dichtfolie 10 besteht aus einem für Messstrahlung transparenten Polymer.
Die Temperiervorrichtung für die Abdeckplatte 2 umfasst neben dem Heizelement 1 auch mehrere Kühlelemente 1 1 . Die Kühlelemente 1 1 sind im vorliegenden Beispiel an der Peripherie der
Abdeckplatte 2 angeordnet. Sie können beispielsweise Peltier-Elemente, Wärmerohre (engl.
Fachbegriff: Heatpipes) oder Fluid-Kühlungen, z.B. Wasser- oder Luftkühlungen, umfassen.
Die Vorrichtung zur thermischen Behandlung der in der Mikrotiterplatte 3 enthaltenen Proben umfasst weiter eine Regeleinheit 13, die mit den Temperierelementen 5 zur Einstellung der Temperatur des Probenblocks 4 und mit dem Heizelement 1 und den Kühlelementen 1 1 zur Einstellung der Temperatur der Abdeckplatte 2 elektrisch verbunden ist. Die Regeleinheit 13 kann eine elektrische oder elektronische Regelschaltung, insbesondere mit einem Mikrocontroller mit einem Software zur Ausführung einer Temperaturregelung enthaltenden Datenspeicher, umfassen. Die Regeleinheit 13 ist dazu eingerichtet die Temperatur der Abdeckplatte 2 und die Temperatur des Probenblocks 4 aufeinander abgestimmt zu regeln. Im vorliegenden Beispiel umfasst die Regeleinheit 13 zwei Regler, nämlich einen ersten Regler 7 zur Regelung der Temperatur des Probenblocks 4 und einen zweiten Regler 8 zur Regelung der Temperatur der Abdeckplatte.
Der erste Regler 7 ist dazu eingerichtet, anhand einer Führungsgröße, die den Soll-Temperaturverlauf des PCR-Zyklus repräsentiert, und einer die aktuelle Ist-Temperatur des Probenblocks 4
repräsentierenden Regelgröße eine Stellgröße zu ermitteln und an die Temperierelemente 5 auszugeben, um die Temperatur des Probenblocks 4 auf den Wert der Führungsgröße einzustellen.
Die Regelgröße kann beispielsweise von einem die aktuelle Ist-Temperatur des Probenblocks 4 erfassenden Temperaturfühler (nicht in der Fig. 2 und 3 gezeigt) zur Verfügung gestellt werden. Der erste Regler 7 ist weiter dazu eingerichtet, ein die Ist-Temperatur des Probenblocks 4
repräsentierendes Signal an den zweiten Regler 8 auszugeben. Das Signal kann beispielsweise die Führungsgröße des ersten Reglers 7, die Regelgröße des ersten Reglers 7 oder die von dem ersten Regler 7 ausgegebene Stellgröße oder ein aus einer von diesen Größen abgeleitetes Signal sein.
Der zweite Regler 8 ist dazu ausgestaltet, anhand einer aus dem von dem Regler 7 erhaltenen, die Ist- Temperatur des Probenblocks 4 repräsentierenden Signal abgeleiteten Führungsgröße und einer die aktuelle Ist-Temperatur der Abdeckplatte 2 repräsentierenden Regelgröße eine Stellgröße zu ermitteln und an das Heizelement 1 und/oder an die Kühlelemente 1 1 auszugeben, um die Temperatur der Abdeckplatte 2 auf den Wert der Führungsgröße einzustellen. Die Regelgröße kann beispielsweise eine von einem (nicht in Fig. 2 und 3 eingezeichneten) Temperaturfühler erfasste Temperatur der Abdeckplatte 2 sein. Die Führungsgröße für den zweiten Regler 8 kann basierend auf dem von dem ersten Regler 7 zur Verfügung gestellten Signal derart ermittelt werden, dass sie einer Soll-Temperatur der Abdeckplatte 2 entspricht, die gleich der Ist-Temperatur des Probenblocks 4 ist oder um wenige Kelvin, z.B. 2 bis 10 K, höher liegt als die Ist-Temperatur des Probenblocks 4.
Im Folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur thermischen Behandlung von Proben in
Probengefäßen mit dem Ziel der DNA-Vermehrung beschrieben. Im hier beschriebenen
Ausführungsbeispiel wird das Verfahren mittels der in Fig. 2 und 3 dargestellten Vorrichtung durchgeführt. Zunächst werden die Proben enthaltende Probengefäße 9, die in der Mikrotiterplatte 3 zusammengefasst sind, in den Aufnahmebereich des Probenblocks 4 angeordnet. Zuvor oder anschließend werden die Probengefäße 9 verschlossen, z.B. mittels einer Dichtfolie 10, die auf die Mikrotiterplatte 3 aufgelegt oder aufgeklebt wird. Anschließend werden die Probengefäße 9 mit der Abdeckplatte 2 abgedeckt. Die Mikrotiterplatte 3 ist dann sandwichartig zwischen dem Probenblock 4 und der Abdeckplatte 2 angeordnet. Mittels der Regeleinheit 13 werden die Temperatur der
Abdeckplatte 2 und die Temperatur des Probenblocks 4 aufeinander abgestimmt geregelt, so dass die Proben einen gewünschten, z.B. einen der DNA-Vermehrung mittels PCR dienenden,
Temperaturverlauf durchlaufen. Hierzu kann die Regeleinheit 13 die Temperatur der Abdeckplatte 2 und des Probenblocks so aufeinander abgestimmt regeln, dass die Temperatur der Abdeckplatte 2 gleich oder größer als die Temperatur des Probenblocks 4 ist, und dass die Differenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte 2 und der Temperatur des Probenblocks einen Höchstwert nicht überschreitet. Dieser Höchstwert kann im vorliegenden Ausführungsbeispiel wenige Kelvin, z.B. 2 bis 10 K, betragen.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel erfolgt die Regelung der Temperatur der Abdeckplatte 2 in Abhängigkeit von der Temperatur des Probenblocks 4. Mittels des ersten Reglers 7 der Regeleinheit 13 wird zur thermischen Behandlung der Proben die Temperatur des Probenblocks 4 gesteuert, nämlich im vorliegenden Beispiel gemäß einem für die Zyklen der PCR vorgegebenen Verlauf. Hierzu regelt der erste Regler 7 die mit dem Probenblock 4 thermisch gekoppelten Temperierelemente 5 unter
Verwendung einer den gewünschten Soll-Temperaturverlauf der PCR-Zyklen entsprechenden
Führungsgröße und einer mittels eines Temperaturfühlers erfassten, die aktuelle Ist-Temperatur des Probenblocks 4 repräsentierenden Regelgröße. Aus der Führungs- und der Regelgröße ermittelt der Regler 7 eine Stellgröße, die er an die Temperierelemente 5 ausgibt, um die Temperatur des
Probenblocks 4 auf den Wert der Führungsgröße einzustellen.
Der erste Regler gibt außerdem ein die Ist-Temperatur des Probenblocks 4 repräsentierendes Signal an den zweiten Regler 8 aus, das beispielsweise die Führungsgröße des ersten Reglers 7, die
Regelgröße des ersten Reglers 7 oder die von dem ersten Regler 7 ausgegebenen Stellgröße oder ein aus einem dieser Größen abgeleitetes Signal ist. Der zweite Regler 8 ermittelt aus dem Signal seine Führungsgröße, z.B. im einfachsten Fall durch Addition eines eine gewünschte Temperaturdifferenz zwischen dem Probenblock 4 und der Abdeckplatte 2 repräsentierenden Betrags zu dem Wert des Signals. Die so ermittelte Führungsgröße entspricht einer Soll-Temperatur der Abdeckplatte 2, die um die gewünschte Temperaturdifferenz höher ist als die aktuelle Ist-Temperatur des Probenblocks 4. Der zweite Regler regelt basierend auf der ermittelten Führungsgröße und einer die aktuelle Ist-Temperatur der Abdeckplatte 2 repräsentierenden Regelgröße, die beispielsweise mittels eines Temperaturfühlers ermittelt werden kann, die Temperatur der Abdeckplatte 2. Hierzu kann sie eine Stellgröße an das Heizelement 1 und/oder an die Kühlelemente 1 1 ausgeben, um die Temperatur der Abdeckplatte 2 auf den Wert der Führungsgröße einzustellen.
Die Verläufe der Temperaturen des Probenblocks 4, der Abdeckplatte 2 und einer in der Mikrotiterplatte 3 enthaltenen Probe im Laufe des beschriebenen Verfahrens sind in Fig. 4 in einer schematischen Darstellung veranschaulicht. Die Temperatur des Probenblocks 4 (durchgezogene Linie) folgt dem vorgegebenen Temperaturverlauf für einen Zyklus der PCR. Er entspricht im Wesentlichen dem Temperaturverlauf des Probenblocks mit der Denaturierungsphase, der Primerhybridisierungsphase und der Amplifikationsphase, wie er in Fig. 1 gezeigt ist. Im Unterschied zu dem in Fig. 1 gezeigten Beispiel nach dem Stand der Technik bleibt die Temperatur der Abdeckplatte 2 der in den Fig. 2 und 3 dargestellten Vorrichtung nicht konstant auf einem hohen Wert. Vielmehr ist mittels der beschriebenen, von der Temperatur des Probenblocks 4 abhängigen Regelung die Temperatur der Abdeckplatte 2 (gestrichelte Linie) jederzeit an den Temperaturverlauf des Probenblocks 4 angepasst, so dass eine Temperaturdifferenz zwischen der Abdeckplatte 2 und dem Probenblock 4 einen Höchstwert von 10 K nicht überschreitet. Aus der Fig. 4 ist ersichtlich, dass als Folge dieser Temperaturregelung der Abdeckplatte 2 die Temperatur der Probe (gepunktete Linie) im Wesentlichen mit erheblich
verbesserter Geschwindigkeit und Präzision dem Temperaturverlauf des Probenblocks 4 folgt.
Insbesondere ist zu vermerken, dass auch während des zweiten Zeitabschnitts des Zyklus, d.h.
während der Primerhybridisierungsphase, die Endtemperatur der Probe nach einer kurzen
Abkühlungsphase den durch den Probenblock 4 vorgegebenen Wert erreicht.
Die Erfindung umfasst eine Vielzahl von Varianten und Abwandlungen des hier beschriebenen Ausführungsbeispiels. Beispielsweise ist es auch möglich, dass ein Temperaturfühler, der die aktuelle Ist-Temperatur des Probenblocks erfasst, ein die Ist-Temperatur des Probenblocks repräsentierendes Signal an den zweiten Regler der Regeleinheit ausgibt, um die Führungsgröße des zweiten Reglers abzuleiten.
In einer weiteren Abwandlung des hier ausführlich dargestellten Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung und eines Verfahrens zur thermischen Behandlung von Proben ist es möglich, dass ein mit den Temperierelementen für den Probenblock verbundener erster Regler die Temperatur des Probenblocks in Abhängigkeit von der durch einen zweiten Regler geregelten Temperatur der Abdeckplatte regelt. In diesem Fall wird dem zweiten Regler eine den Verlauf der PCR-Zyklen wiedergebende Führungsgröße vorgegeben, während der erste Regler vom zweiten Regler ein die Ist-Temperatur der Abdeckplatte repräsentierendes Signal erhält, anhand dessen die Führungsgröße des ersten Reglers für die Temperaturregelung des Probenblocks ermittelt wird.
Eine Vielzahl weiterer Varianten ist denkbar, ohne dass vom Erfindungsgedanken abgewichen wird.

Claims

Patentansprüche
1 . Vorrichtung zur thermischen Behandlung von in Probengefäßen enthaltenen Proben, umfassend: einen Probenblock (4) mit einem Aufnahmebereich für die Probengefäße (9);
eine erste Temperiervorrichtung, die mit dem Probenblock (4) thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur des Probenblocks (4) einzustellen;
eine Abdeckplatte (2) für in dem Aufnahmebereich des Probenblocks (4) angeordnete Probengefäße
(9);
eine zweite Temperiervorrichtung, die mit der Abdeckplatte (2) thermisch gekoppelt ist und dazu eingerichtet ist, eine Temperatur der Abdeckplatte (2) einzustellen; und
eine Regeleinheit (13), die mit der ersten und der zweiten Temperiervorrichtung verbunden ist, und dazu eingerichtet ist, die erste und die zweite Temperiervorrichtung zu steuern,
dadurch gekennzeichnet, dass die Regeleinheit (13) dazu eingerichtet ist, die Temperatur des
Probenblocks (4) und die Temperatur der Abdeckplatte (2) mittels der ersten und der zweiten
Temperiervorrichtung aufeinander abgestimmt zu regeln.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 ,
wobei die Regeleinheit (13) dazu eingerichtet ist, die Temperatur der Abdeckplatte (2) und die
Temperatur des Probenblocks (4) derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass die Temperatur der Abdeckplatte (2) gleich oder größer als die Temperatur des Probenblocks (4) ist, und dass eine Differenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte (2) und des Probenblocks (4) einen, insbesondere vorgegebenen, Höchstwert nicht überschreitet.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
wobei die Regeleinheit (13) dazu eingerichtet ist, die Temperatur der Abdeckplatte (2) und die
Temperatur des Probenblocks (4) derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass die Temperatur der Abdeckplatte (2) von der Temperatur des Probenblocks (4) abhängt.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei die Regeleinheit (13) einen ersten Regler (7) umfasst, der dazu eingerichtet ist, mittels der ersten Temperiervorrichtung die Temperatur des Probenblocks (4), insbesondere zyklisch, gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf zu regeln.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4,
wobei die Regeleinheit (13) einen zweiten Regler (8) umfasst, der dazu eingerichtet ist, mittels der zweiten Temperiervorrichtung die Temperatur der Abdeckplatte (2) unter Verwendung einer
Führungsgröße zu regeln, und wobei die Führungsgröße von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur des Probenblocks (4), einer Ist-Temperatur des Probenblocks (4) oder einer von dem ersten Regler (7) ausgegebenen Stellgröße.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
wobei die Regeleinheit (13) dazu ausgestaltet ist, die Temperatur der Abdeckplatte (2) und die
Temperatur des Probenblocks (4) derart aufeinander abgestimmt zu regeln, dass die Temperatur des Probenblocks (4) von der Temperatur der Abdeckplatte (2) abhängt.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6,
wobei die Regeleinheit (13) einen ersten Regler (7) umfasst, der dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks (4) mittels der ersten Temperiervorrichtung zu regeln, und wobei die Regeleinheit (13) einen zweiten Regler (8) umfasst, der dazu eingerichtet ist, mittels der zweiten
Temperiervorrichtung die Temperatur der Abdeckplatte (8), insbesondere zyklisch, gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf zu regeln,
und wobei der erste Regler (7) dazu eingerichtet ist, die Temperatur des Probenblocks (4) unter Verwendung einer Führungsgröße zu regeln, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll- Temperatur der Abdeckplatte (2), einer Ist-Temperatur der Abdeckplatte (2) oder einer von dem zweiten Regler (8) ausgegebenen Stellgröße.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
wobei die Abdeckplatte (2) eine planare Vorderfläche aufweist, und dazu eingerichtet ist, gegen im Aufnahmebereich des Probenblocks (4) angeordnete Probengefäße (9) derart anzuliegen, dass die Probengefäße (9) sandwichartig zwischen dem Probenblock (4) und der Abdeckplatte (2) angeordnet sind.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Abdeckplatte (2) eine Vielzahl von Öffnungen (12) oder Fenstern aufweist, durch die eine optische Beobachtung der Probengefäße (9) möglich ist, und die in einem, beispielsweise rechteckigen, zentralen Bereich der Abdeckplatte (2) angeordnet sind.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9,
wobei die zweite Temperiervorrichtung mindestens ein an der Abdeckplatte (2) angeordnetes
Heizelement (1) und mindestens ein Kühlelement (1 1 ) umfasst, und wobei das mindestens eine Kühlelement (1) in einem den zentralen Bereich der Abdeckplatte (2), der die Öffnungen (12) oder Fenster aufweist, umgebenden Peripheriebereich angeordnet sind.
1 1 . Vorrichtung nach Anspruch 10,
wobei das mindestens eine Heizelement (1) auf oder in zwischen den Öffnungen (12) oder Fenstern verlaufenden Stegen der Abdeckplatte (2) angeordnet sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 ,
wobei die Abdeckplatte (2) aus einem pulvermetallurgisch hergestellten kupfer- oder silberhaltigen, mindestens ein Refraktärmetall umfassenden Werkstoff besteht.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
wobei die erste Temperiervorrichtung mindestens ein mit dem Probenblock in Kontakt stehendes thermoelektrisches Element (5) und eine mit dem mindestens einen thermoelektrischen Element in Kontakt stehende Wärmesenke (6) aufweist.
14. Verfahren zur thermischen Behandlung von Proben in Probengefäßen mit dem Ziel der DNA- Vermehrung, umfassend:
Anordnen der Probengefäße (9) in einem Aufnahmebereich eines Probenblocks (4);
Verschließen der Probengefäße (9), beispielsweise mit einer Dichtfolie (10);
Abdecken der Probengefäße (9) mit einer Abdeckplatte (2), derart, dass die Probengefäße (9) zwischen dem Probenblock (4) und der Abdeckplatte (2) angeordnet sind;
Regeln einer Temperatur des Probenblocks (4) mittels einer Regeleinheit (13) und einer mit dem Probenblock (4) thermisch gekoppelten ersten Temperiervorrichtung, die von der Regeleinheit (13) zur Einstellung der Temperatur des Probenblocks (4) gesteuert wird; und
Regeln einer Temperatur der Abdeckplatte (2) mittels der Regeleinheit und einer mit dem Probenblock (4) thermisch gekoppelten zweiten Temperiervorrichtung, die von der Regeleinheit (13) zur Einstellung der Temperatur der Abdeckplatte (2) gesteuert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der Abdeckplatte (2) und die Temperatur des
Probenblocks (4) aufeinander abgestimmt geregelt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14,
wobei die Temperatur der Abdeckplatte (2) und die Temperatur des Probenblocks (4) derart aufeinander abgestimmt geregelt werden, dass die Temperatur der Abdeckplatte (2) gleich oder größer als die Temperatur des Probenblocks (4) ist und dass eine Differenz zwischen der Temperatur der Abdeckplatte (2) und der Temperatur des Probenblocks (4) einen, insbesondere vorgegebenen, Höchstwert nicht überschreitet.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15,
wobei die Temperatur des Probenblocks (4) gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf geregelt wird, und wobei die Temperatur der Abdeckplatte (2) unter Verwendung einer Führungsgröße geregelt wird, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur des Probenblocks (4), einer Ist-Temperatur des Probenblocks (4) oder einer von der Regeleinheit (13) zur Einstellung der Temperatur des Probenblocks (4) an die erste Temperiervorrichtung ausgegebenen Stellgröße.
17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15,
wobei die Temperatur der Abdeckplatte (2) gemäß einem vorgegebenen Soll-Temperaturverlauf geregelt wird, und wobei die Temperatur des Probenblocks (4) unter Verwendung einer Führungsgröße geregelt wird, die von einer der folgenden Größen abhängt: einer Soll-Temperatur der Abdeckplatte (2), einer Ist-Temperatur der Abdeckplatte (4) oder einer von der Regeleinheit (13) zur Einstellung der Temperatur der Abdeckplatte (2) an die zweite Temperiervorrichtung ausgegebenen Stellgröße.
18. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 14 bis 17, umfassend eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und
eine Vielzahl von Probengefäßen (9), die thermisch zu behandelnde Proben enthalten, wobei die Probengefäße (9) in einer Mikrotiterplatte (3) zusammengefasst sind, und wobei die Mikrotiterplatte (3) in einem Aufnahmebereich des Probenblocks (4) angeordnet und von der Abdeckplatte (2) überdeckt ist.
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