EP3994249A1 - Procede de production in vitro de neurones de mammiferes - Google Patents

Procede de production in vitro de neurones de mammiferes

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Publication number
EP3994249A1
EP3994249A1 EP20735420.0A EP20735420A EP3994249A1 EP 3994249 A1 EP3994249 A1 EP 3994249A1 EP 20735420 A EP20735420 A EP 20735420A EP 3994249 A1 EP3994249 A1 EP 3994249A1
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EP
European Patent Office
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isoforms
cells
weeks
neuronal
vitro production
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20735420.0A
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German (de)
English (en)
Inventor
Maxime FEYEUX
Kevin ALESSANDRI
Magalie LECOURTOIS
Laetitia MIGUEL
Pierre Nassoy
Anne ROVELET LECRUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rouen
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut d'Optique Theorique et Appliquee
Universite de Bordeaux
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rouen
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut d'Optique Theorique et Appliquee
Universite de Bordeaux
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Filing date
Publication date
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the invention relates to a method for the in vitro production of mammalian neurons. More particularly, the method according to the invention makes it possible to produce neurons expressing the 6 isoforms of the Tau protein (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R).
  • the invention finds applications in connection with neurodegenerative diseases, in particular in the field of diagnosis and cell therapy, as well as for the identification and development of new therapeutic treatments.
  • Tau is a multifunctional protein, originally identified as a cytoplasmic protein associated with microtubules. Six isoforms of Tau are expressed in the adult human brain, resulting from the alternative splicing of the MAPT gene. Tau splicing is regulated during development so that only the shorter isoform of Tau is expressed in the fetal brain, unlike the adult brain which expresses all 6 isoforms.
  • tauopathies The accumulation of pathological intracellular deposits of the Tau protein is the hallmark of many neurodegenerative diseases called tauopathies (Sergeant et al., 2008). It is important to note that the protein composition (identity of the Tau isoforms present), the morphology and the anatomical distribution of the intracellular deposits of Tau make it possible to distinguish the different tauopathies.
  • AD Alzheimer's disease
  • the 6 Tau isoforms are abnormally phosphorylated and aggregated.
  • Pick's disease isoforms of Tau 3R predominate, while aggregate forms of Tau 4R are prevalent in corticobasal degeneration and progressive supranuclear palsy.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • the presence of adult Tau isoforms has also been described at the RNA level in cortical neurons derived from iPSC (Ehrlich et al., 2015). However, the corresponding protein isoforms could not be detected. Only the fetal isoform Tau 0N3R was present in these cortical neurons derived from iPSC.
  • the inventors have discovered that it is possible to produce in vitro neurons expressing the 6 isoforms by culturing stem cells in microcompartments. hollow alginate-based cells, allowing a 3D culture, in a culture medium allowing neuronal differentiation.
  • this step is carried out in a bioreactor in which the microcompartments are kept in suspension in said neuronal differentiation medium.
  • the inventors have also demonstrated that by using a particular neuronal differentiation medium comprising sodium chloride, a neuroactive inorganic salt, glycine, L-alanine and L-serine, it is possible to obtain post-mitotic neuronal cells comprising the 6 isoforms of the Tau protein in relatively short times, between 5 and 50 weeks.
  • the inventors have thus developed culture methods making it possible to obtain such neurons after only a few weeks.
  • the subject of the invention is therefore a process for the in vitro production of mammalian neurons expressing the 6 isoforms of the Tau protein (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprising a neuronal differentiation step, according to which one cultivates cellular microcompartments each comprising a hollow hydrogel capsule surrounding post-mitotic neuronal cells and an extracellular matrix, said neuronal differentiation step being carried out in a bioreactor, the cellular microcompartments being kept in suspension in an enclosure of said bioreactor containing a differentiation medium neuronal for a period of between 5 weeks and 100 weeks.
  • a subject of the invention is also a method for the in vitro production of mammalian neurons expressing the 6 isoforms of the Tau protein (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprising a step of neuronal differentiation according to which one cultivates for a period between 5 weeks and 100 weeks, preferably between 5 and 50 weeks, more preferably between 10 and 50 weeks, even more preferably between 25 and 50 weeks, between 25 and 40 weeks, between 25 and 35 weeks, between 25 and 30 weeks, between 20 and 50 weeks, between 20 and 40 weeks, between 20 and 35 weeks, between 20 and 30 weeks, or between 20 and 25 weeks, cellular microcompartments each comprising a hollow hydrogel capsule surrounding post-neuronal cells.
  • mitotics and an extracellular matrix in a neuronal differentiation medium comprising at least one neuroactive inorganic salt, glycine, L-alanine and L-serine.
  • Said compounds are each present at a concentration which maintains the survival and neural functionality of a neuronal cell.
  • the subject of the invention is also unnatural post-mitotic neuronal cells, capable of being obtained by the method according to the invention, in which the 6 isoforms of the Tau protein are expressed.
  • unnatural post-mitotic neuronal cells cells obtained by in vitro culture under controlled conditions of cells capable of differentiating into neuronal cells, such as pluripotent cells, as opposed to cells obtained by sampling from a human subject such as an adult human subject.
  • the subject of the invention is post-mitotic neuronal cells derived from cell culture, capable of being obtained by the method according to the invention, in which the 6 isoforms of the Tau protein 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R and 0N3R are expressed.
  • such post-mitotic neuronal cells exhibit an expression ratio of the isoforms of 3R and 4R of between 1/3 and 3, more preferably between 1 ⁇ 2 and 2, even more preferably between 3 ⁇ 4 and 4/3, ideally at 10% of an equimolar ratio.
  • the 2N, IN and ON isoforms advantageously represent, respectively, more than 3%, more than 17% and less than 90% of the total isoforms, preferably respectively more than 5%, more than 26% and less than 50%, even more preferably. respectively more than 8%, more than 45% and less than 45%, ideally respectively 9%, 54%, and 37%.
  • FIG 1 shows a molecular characterization of iPSCs, NSCs and neurons derived from iPSC.
  • the cells were differentiated for 15, 20 or 25 weeks (w), in DMEM / F12 - Neurobasal (D / N) or BrainPhys medium.
  • FIG 2 shows the detection of 6 adult isoforms of MAPT mRNA in brain extracts.
  • A Schematic representation of the different MAPT isoforms analyzed. The expected sizes for each PCR product were calculated depending on the location of the primers covering exons 1 and 11.
  • B Each peak corresponds to a different MAPT isoform. The Y axis shows fluorescence in arbitrary units and the X axis shows size in bp.
  • FIG 3 shows the expression of mRNA and adult MAPT protein isoforms in neurons derived from iPSC
  • A Representation of the relative expression of the 6 isoforms of MAPT in neurons induced from iPSC after 15 , 20 and 25 weeks of maturation by RT-qPCR analysis. The cells were differentiated for 15, 20 or 25 week (s), in DMEM / F12 - Neurobasal (D / N) or BrainPhys medium.
  • B Western blot analysis of proteins extracted from 25 week neuronal capsules maintained in BrainPhys. Treatment with Lambda phosphatase reveals the presence of 4 isoforms of Tau, corresponding to 1N4R, 1N3R, 0N4R and 0N3R. 2N isoforms are not detectable.
  • FIG 4 shows the quantification of the relative expression of the 6 adult isoforms of MAPT mRNA.
  • MAPT mRNA isoforms were quantified either individually (A) or grouped according to the inclusion of exon 10 (B), or the inclusion of exons 2 and 3 (C).
  • FIG 5 shows the detection and quantification of adult MAPT mRNA isoforms.
  • A ON, IN and 2N
  • B 3R and 4R
  • the neuronal cells were differentiated for 15, 20 or 25 weeks (w), in DMEM / F12 - Neurobasal (D / N) or BrainPhys medium.
  • A, B a schematic representation of the different MAPT mRNA isoforms analyzed, the expected size of the PCR product calculated based on the location of the primers and a representative electropherogram are shown.
  • the Y axis shows fluorescence in arbitrary units and the X axis shows size in bp.
  • C The quantitative values are shown in the tables. Data represent the mean standard deviation (SD) of two or more independent experiments.
  • FIG 6 shows the detection and quantification of adult MAPT mRNA isoforms after exclusion of 0N3R transcripts.
  • A transcripts or 4R-Tau
  • B isoforms in brain extracts or in neural capsules 25 weeks maintained in BrainPhys by RT-qPCR.
  • A The use of the primers ex2 and ex11 made it possible to amplify only the IN and 2N isoforms.
  • B The use of the primers ex1 and ex10 allowed the specific amplification of the 4R isoforms.
  • the present invention relates to a method for culturing and producing post-mitotic neuronal cells expressing the 6 isoforms 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R of the Tau protein.
  • This expression profile is characteristic of adult neurons, and is not particularly found at the embryonic level.
  • methods of in vitro production of neuronal cells have not resulted in the production of neuronal cells expressing these 6 isoforms.
  • the inventors have had the merit of discovering and showing that it is possible to produce such neurons in vitro, at high throughput and within a reasonable time (of the order of a few tens of weeks), by combining a cell culture in 3D to a differentiating medium.
  • cellular microcompartments comprising a hollow outer shell of hydrogel encapsulating the cells and of the extracellular matrix is particularly advantageous and makes it possible, in the context of the present invention, to promote cell differentiation and the maturation of neurons up to the stage. post-mitotic characteristic of adult neurons.
  • Each cell microcompartment comprises a hollow crosslinked hydrogel capsule, in which cells are housed, embedded in an extracellular matrix.
  • the hydrogel capsule contains a single set of cells.
  • single it is meant that the capsule contains only one group of cells, which can be more or less cohesive.
  • a single set of cells refers to a cellular structure three-dimensional in which each cell of said set is in physical contact with at least one other cell of said set.
  • the cells are self-organized into a set of cells positioned in a particular manner with respect to each other to create cellular interactions and communications and to form a three-dimensional microstructure of interest.
  • Each microcompartment thus comprises an outer layer of hydrogel, or hydrogel capsule, containing a set of self-organized cells. Cells can multiply, organize and / or differentiate within the hydrogel capsule.
  • the external hydrogel layer designates a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains swollen by a liquid, and preferably of water.
  • Such an outer hydrogel layer is obtained by crosslinking a hydrogel solution.
  • the polymer (s) of the hydrogel solution are polymers which can be crosslinked when subjected to a stimulus, such as temperature, pH, ions, etc.
  • the hydrogel solution used is biocompatible, in the sense that it is not toxic to the cells.
  • the hydrogel layer advantageously allows the diffusion of dissolved gases (and in particular oxygen and / or carbon dioxide), nutrients, and metabolic waste to allow survival, proliferation, differentiation, maturation of cells and / or the production of molecules or molecular assemblies of interest and / or the recapitulation of cellular behaviors of interest.
  • the polymers in the hydrogel solution can be of natural or synthetic origin.
  • the hydrogel solution contains one or more polymers from sulfonate-based polymers, such as sodium polystyrene sulfonate, acrylate-based polymers, such as sodium polyacrylate, polyethylene glycol diacrylate, gelatin methacrylate compound, polysaccharides, and in particular polysaccharides of bacterial origin, such as gellan gum, or of plant origin, such as pectin or alginate.
  • the hydrogel solution comprises at least alginate.
  • the hydrogel solution only comprises alginate.
  • alginate is understood to mean linear polysaccharides formed from b-D-mannuronate (M) and a-L-guluronate (G), salts and derivatives thereof.
  • G alginate is a sodium alginate, composed of more than 80% of G and less than 20% of M, with an average molecular mass of 100 to 400 kDa (for example: PRONOVA® SLG100) and a total concentration of between 0.5% and 5% by density (weight / volume).
  • the cellular microcompartment is closed. It is the outer hydrogel layer that gives the cell microcompartment its size and shape.
  • the microcompartment can have any shape compatible with the encapsulation of cells.
  • the extracellular matrix layer forms a gel.
  • the extracellular matrix layer comprises a mixture of proteins and extracellular compounds necessary for cell culture, for example of pluripotent cells.
  • the extracellular matrix comprises structural proteins, such as laminin 521, 511 or 421, rentactin, vitronectin, laminins, collagen, as well as growth factors, such as TGF-beta and / or of EGF.
  • the extracellular matrix layer consists of or contains Matrigel® and / or Geltrex®.
  • the microcompartment may contain, instead of the extracellular matrix, an extracellular matrix substitute.
  • An extracellular matrix surrogate is defined as a compound capable of promoting cell attachment and / or survival by interacting with membrane proteins and / or extracellular signal transduction pathways.
  • such a substitute comprises biological polymers and their fragments, in particular proteins (laminins, vitronectins, fibronectins and collagens), non-sulfated (hyaluronic acid) or sulfated glycosaminoglycans (chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate), and synthetic polymers containing units derived from biological polymers or reproducing their properties (RGD motif) and small molecules mimicking attachment to a substrate (Rho-A kinase inhibitors such as Y-27632 or thiazovivin).
  • proteins laminins, vitronectins, fibronectins and collagens
  • non-sulfated hyaluronic acid
  • sulfated glycosaminoglycans chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sul
  • any method of producing cellular microcompartments containing inside a hydrogel capsule of the extracellular matrix and cells can be used for carrying out the preparation method according to the invention.
  • the dimensions of the cellular microcompartment are controlled.
  • the cellular microcompartment according to the invention has a spherical shape.
  • the diameter of such a microcompartment is between 10 ⁇ m and 1 mm, more preferably between 75 and 750 ⁇ m, more preferably between 100 and 500 ⁇ m, even more preferably between 150 and 300 ⁇ m, +/- 10%.
  • the cellular microcompartment according to the invention has an elongated shape.
  • the microcompartment can have an ovoid or tubular shape.
  • the smallest dimension of such an ovoid or tubular microcompartment is between 10 ⁇ m and 1 mm, more preferably between 75 and 750 ⁇ m, more preferably between 100 and 500 ⁇ m, even more preferably between 150 and 300 ⁇ m, + / - 10%.
  • smallest dimension is meant twice the minimum distance between a point on the outer surface of the hydrogel layer and the center of the microcompartment.
  • the thickness of the external hydrogel layer represents 5 to 40% of the radius of the microcompartment.
  • the thickness of the extracellular matrix layer represents 5 to 80% of the radius of the microcompartment and is advantageously hung on the internal face of the hydrogel shell. This matrix layer can fill the space between cells and the hydrogel shell.
  • the "thickness" of a layer is the dimension of said layer extending radially from the center of the microcompartment.
  • post-mitotic neuronal cells expressing the 6 isoforms are obtained within a relatively short production time, and in particular less than 100 weeks, and more preferably less than 50 weeks.
  • the microcompartments are maintained in a neuronal differentiation medium.
  • N2B27 500 ml DMEM / F12, 500mL Neurobasal, 5mL N2 medium complement, 10 mL B27 medium supplement.
  • such a medium is supplemented in a first phase (first 10 to 15 days, neural induction phase) by molecules blocking the signaling pathways linked to BMP2 (such as LDN-193189 or the Noggin protein) and the pathway TGF-beta signaling (such as SB-431542), and / or in an optional second phase by molecules activating the signaling pathways linked to EGF-1 and FGF-2 (amplification phase of neural stem cells), and / or complemented in a terminal differentiation phase by molecules activating neurotrophic signaling pathways (for example the BDNF transduction pathway) and molecules blocking the Notch signal transduction pathways (for example compound E or another inhibitor of gamma-secretase)
  • BMP2 such as LDN-193189 or the Noggin protein
  • TGF-beta signaling such as SB-431542
  • EGF-1 and FGF-2 amplification phase of neural stem cells
  • a terminal differentiation phase by molecules activating neurotrophic signaling pathways (for example the BDNF transduction pathway) and molecules blocking the Not
  • the cellular microcompartments, containing stem cells, possibly already differentiated into post-mitotic neuronal cells, are placed in culture in a particular neuronal differentiation medium, comprising at least one neuroactive inorganic salt, glycine, L-alanine and L-serine said compounds each being present at a concentration which maintains the survival and neural functionality of a neuronal cell.
  • a particular neuronal differentiation medium comprising at least one neuroactive inorganic salt, glycine, L-alanine and L-serine said compounds each being present at a concentration which maintains the survival and neural functionality of a neuronal cell.
  • neuroactive compound is understood to mean a compound, such as an inorganic salt, which significantly affects the neural activity of a cell (by example an electrophysiological activity).
  • Such neural activity can be substantially identical to the neural activity of a wild neuronal cell in its natural environment (in vivo).
  • the at least one neuroactive inorganic salt is selected from the group consisting of sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KC1), calcium chloride (CaC12), magnesium sulfate (MgS04) ), magnesium chloride (MgCL2), ferric nitrate (FeN03), zinc sulfate (ZnS04), cupric sulfate (CuS04), ferric sulfate (FeS04) and combinations thereof.
  • the neuronal differentiation medium comprises sodium chloride and at least one other neuroactive inorganic salt.
  • the sodium chloride concentration is between 20 and 200 mM, preferably between 70 and 150 mM, in particular at 120 mM +/- 10%.
  • the concentration in the other neuroactive inorganic salts is preferably between 0.000001 and 10 mM, 0.000005 and 8 mM, 0.00001 and 6 mM, 0.00005 and 4 mM, 0.00005 and 2 mM, 0.0001 and 1 mM, 0.0005 and 0.5 mM, 0.001 and 0.05 mM, 0.01 and 0.05 mM.
  • Both the glycine concentration and the L-alanine concentration are advantageously between 0.0001 and 0.05 mM.
  • the L-serine concentration is advantageously between 0.001 and 0.03 mM.
  • the culture medium further comprises L-aspartic acid, preferably at a concentration of between 0.00001 and 0.003 mM, and / or L-glutamic acid, preferably at a concentration of between 0.00001 and 0.02 mM, and / or a pH modulating agent, such as an inorganic salt.
  • the modulating agent is an inorganic salt selected from dibasic sodium phosphate, monobasic sodium phosphate and combinations thereof, said agent being advantageously at a concentration of between 0.001 and 1 mM.
  • the modulating agent is sodium bicarbonate, advantageously at a concentration of between 1 and 35 mM.
  • the culture medium can comprise at least one of the following compounds: one or more amino acids, each amino acid advantageously being at a concentration of between 0.001 and 1 mM; one or more vitamins, each vitamin being advantageously at a concentration of between 0.00001 and 1 mM; an additional agent selected from the group consisting of a protein, a neurotrophic factor, a steroid, a hormone, a fatty acid, a lipid, a vitamin, an inorganic sulfate, an organic chemical compound, a monosaccharide, a nucleotide and combinations of these; an energetic substrate, such as sugar, sodium pyruvate and combinations thereof, preferably at a concentration of between 0.1 and 5 mM; and a photosensitive agent, in particular riboflavin (B2) at a concentration between 0.0001 and 0.0006 mM; and / or HEPES at a concentration between 1 and 10 mM.
  • one or more amino acids each amino acid advantageously being at a concentration of between 0.001
  • amino acid (s) are then advantageously chosen from L-alanyl-L-glutamine, L-arginine hydrochloride, L-asparagine-H20, cysteine-H20 hydrochloride, L-Cystine 2HC1, L-histidine-H2O hydrochloride, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine hydrochloride, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-threonine, L tryptophan, L-tyrosine disodium salt dihydrate, L-Valine and combinations thereof.
  • the vitamin (s) are chosen from the group consisting of choline chloride, D-calcium pantothenate (B5), folic acid (B9), i-Inositol, niacinamide (B3), hydrochloride pyridoxine, thiamine hydrochloride, vitamin B 12 (cyanocobalamin), riboflavin (B2) and combinations thereof.
  • the culture medium does not include serum.
  • the osmolarity of the medium is between 280 and 330 Osm / mL.
  • composition of neuronal differentiation medium that can be used for implementing the method according to the invention are described in application WO2014 / 172580.
  • the BrainPhys TM Neuronal Medium marketed by the company STEMCELL Technologies is particularly suitable for use as a neuronal differentiation medium in the process of the invention.
  • the microcompartments are cultured in the cell differentiation medium for a period of between 5 weeks and 100 weeks.
  • the culture step in the differentiation medium is carried out for a period of between 5 and 50 weeks, preferably between 10 and 50 weeks, between 20 and 50 weeks, between 25 and 50 weeks, between 20 and 40 weeks. between 25 and 40 weeks, between 20 and 30 weeks, between 25 and 30 weeks, more preferably between 20 and 25 weeks, even more preferably for approximately 24 weeks, 25 weeks, 26 weeks, 27 weeks, 28 weeks, 29 weeks, 30 weeks, especially for 25 weeks +/- 1 week.
  • all or part of the microcompartments contains neurons expressing the 6 isoforms of the Tau protein (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R).
  • the microcompartments comprising the post-mitotic neuronal cells can be obtained during a step of preculture of cellular microcompartments each comprising a hollow hydrogel capsule surrounding a single cluster of stem cells and the extracellular matrix in a culture medium. capable of inducing cell differentiation within said cellular microcompartments.
  • the cells being advantageously organized in a cyst inside the hydrogel capsules at the end of said preculture step.
  • a cyst denotes at least one layer of pluripotent cells organized around a central lumen.
  • a microcompartment therefore comprises successively, around a central lumen, said layer of pluripotent cells, a layer of extracellular matrix, or of an extracellular matrix substitute, and the external hydrogel layer.
  • Light is generated, at the time of cyst formation, by cells which multiply and develop in layers on the extracellular matrix layer.
  • the lumen contains a liquid and more particularly culture medium.
  • the stem cells used for the preparation of the microcompartments are advantageously pluripotent stem cells of mammals, human or non-human.
  • a pluripotent stem cell, or pluripotent cell is understood to mean a cell which has the capacity to form all the tissues present in the whole organism of origin, without being able to form an entire organism as such.
  • the stem cells are chosen from induced pluripotent stem cells (IPS), embryonic stem cells (ES), transdifferentiated cells and mixtures thereof.
  • IPS induced pluripotent stem cells
  • ES embryonic stem cells
  • Transdifferentiated cells are defined as cells for which differentiation into cells of interest is achieved without going through a pluripotency step. Cells change from their initial state (eg fibroblast or peripheral blood mononuclear cell) to a mature neuron terminal state by forcing expression of a set of terminal state genes without ever transitioning through the pluripotent phenotype.
  • a process for preparing cysts is described in application WO2018 / 096277, as well as culture media favorable to the organization of cells into cysts within microcompartments.
  • neural progenitors are encapsulated in a hydrogel shell, said progenitors being advantageously able to organize in the form of cysts.
  • the cellular microcompartments predominantly contain post-mitotic neuronal cells, said compartments are placed in the neuronal differentiation medium.
  • the microcompartment comprises more than 50% by number of post-mitotic neuronal cells, preferably more than 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%.
  • the neuronal differentiation step is carried out in a bioreactor, the cellular microcompartments being kept in suspension in an enclosure of said bioreactor containing the differentiation medium.
  • the flow through the bioreactor can be as strong as the hydrogel shell can support.
  • the hydrogel shell of cellular microcompartments protects cells from mechanical stresses associated with collisions and prevents fusions of multicellular elements (aggregates, micro-carriers).
  • the microcompartments are suspended in the bioreactor, which allows access to the culture medium and diffusion into the homogeneous microcompartments, as well as good convection.
  • microcompartments make it possible to cultivate the cells in any type of bioreactor, provided with a closed chamber, and in particular in a bioreactor in “batch” feed mode, in “fed” feed mode. batch ”or continuous feeding mode (infusion).
  • the use of these microcompartments is particularly advantageous in the case of culture in continuous feeding mode. Indeed, the cells being protected by the hydrogel shell, it is possible to subject them to continuous flows, without risk of weakening them.
  • the bioreactor comprises a hermetically sealable enclosure. This makes it possible to control the atmosphere inside the bioreactor, and for example to cultivate the microcompartments under an inert atmosphere.
  • the bioreactor may include an enclosure having a volume between 1 mL and 10,000L, preferably between 5 mL and 10,000 L, between 10 mL and 10,000 L, between 100 mL and 10,000 L, between 200 mL and 10,000 L, between 500 mL and 10,000 L.
  • the enclosure has a volume of at least 1 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 10 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 100 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 500 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 1 L.
  • the enclosure has a volume of at least 10 L.
  • the enclosure has a volume of 100 L, or more. Those skilled in the art will know how to adapt the number of microcompartments and the volume of the bioreactor according to requirements.
  • the neural differentiation step is carried out under sterile conditions in order to avoid any contamination by microorganisms.
  • the bioreactor enclosure is closed to prevent contamination, but allows gas exchange with the outside.
  • the neuronal differentiation step it is possible to recover all or part of the cellular microcompartments, in order to recover post-mitotic neurons expressing the 6 isoforms of the Tau protein contained in said microcompartments.
  • the cells can be recovered easily, by simple hydrolysis and / or dissolution of the outer hydrogel layer.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain post-mitotic neuronal cells in which the 6 isoforms 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R of the Tau protein are expressed.
  • the 6 isoforms are proportions substantially identical to the proportions present in wild adult neuronal cells.
  • the post-mitotic neuronal cells recovered from the cellular microcompartments at the end of the differentiation step exhibit an expression ratio of the 3R and 4R isoforms of between 1/3 and 3, more preferably between 1 ⁇ 2 and 2, even more preferably between 3 ⁇ 4 and 4/3, ideally at 10% of an equimolar ratio.
  • the 2N, IN and ON isoforms advantageously represent, respectively, more than 3%, more than 17% and less than 90% of the total isoforms, preferably respectively more than 5%, more than 26% and less than 50%, even more preferably. respectively more than 8%, more than 45% and less than 45%, ideally respectively 9%, 54%, and 37%.
  • the post-mitotic neuronal cells recovered from the cellular microcompartments at the end of the differentiation step comprise the 6 isoforms in the proportions below relative to the total number of the 6 isoforms: between 0.1 and 0.9% of Tisoform 2N4R, in particular 0.16% or 0.9%, between 0.5 and 1% of Tisoform 2N3R, in particular 0.69% or 1%, between 2 and 18% of Tisoform 1N4R, in particular 2 , 19% or 17.6%, between 8 and 23% of Tisoform 0N4R, in particular 9.4% or 22.4%, between 8 and 23% of Tisoform 1N3R, in particular 9.4% or 27.5%, and between 30 and 80% of Tisoform 0N3R, in particular 78.16% or 30.6%.
  • Such post-mitotic neuronal cells can be used for research as well as diagnostic or treatment purposes. These cells, exhibiting an expression profile of the Tau protein substantially identical to that of wild-type adult neuronal cells, are particularly suitable for screening for therapeutic molecules targeting neurodegenerative diseases and / or modifying the pathophysiology of neurons, in particular in humans. .
  • the BC-1 line (WT XY, passages 15-25, MTI-Globalstem, Gaithersburg, MD) was maintained in the absence of feeder cells. Culture plates were covered with Matrigel matrix for 2 hours at 37 ° C (Corning, NY, 1/100, diluted in DMEM medium). BC-1 colonies were dissociated using ReLeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) and then grown in mTESR1 (STEMCELL technologies) supplemented with 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen, Caribstad, CA). The cultures were fed daily and passed every 5-7 days.
  • Neural induction was performed in a 1: 1 mixture of DMEM / F12 and Neurobasal supplemented with B27 and N2 (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA), ImM LDN- 193189 (Sigma Aldrich, St-Louis, MO ,) and IOmM SB431542 (Tocris Biosciences, Bristol, UK). The medium was changed every day for 8 days. Next, the differentiation of the neural stem cells was carried out using the DMEM / F12: Neurobasal mixture (1: 1) supplemented with B27 and N2, or the BrainPhys TM medium supplemented with N2-A and SMI (STEMCELL Technologies).
  • Both media were supplemented with 10 ng / mL of BDNF and GDNF (Cell Guidance Systems Ltd., Cambridge, UK), 10 nM of Compound E (Abcam, Cambridge, UK) and 10 nM trichostatin A (Abcam). Half of the medium was changed daily until the specified ripening period.
  • the sedimented microcompartments were rinsed once in PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) then incubated with Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) for 5 minutes to disintegrate the alginate capsule. After two IX PBS washes, total RNA from cells was extracted using the Nucleospin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH and Co KG, Düren, Germany). Validation experiments were performed on total RNA extracted from normal adult human cerebral cortex (BioChain Institute Inc., Newark, CA).
  • RNA Reverse transcription was performed on 70 ng of RNA, using the Verso cDNA kit (Thermo Fischer Scientific Inc.) and oligo (dT) primers.
  • the primers used in this study are listed in Table 1 below.
  • the relative proportion of the MAPT isoforms was then analyzed by fluorescent PCR, using an unlabeled sense primer and a 6-FAM labeled antisense primer.
  • the PCR products were analyzed on a Genetic Analyzer 3500 automatic sequencer (Applied Biosystems), and the electropherograms analyzed with the GeneMapper Software 5 software.
  • the spheres were rinsed in PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) and then incubated with the Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) for 5 minutes to disintegrate the alginate capsule. After two washes in PBS IX, the spheres were homogenized in Pierce® RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific Inc.) supplemented with a cocktail of protease inhibitors (Sigma-Aldrich), using TissueLyserLT (Qiagen,
  • the proteins were analyzed using the Western blot technique as described previously (Pons et al., 2017). Briefly, the proteins of the dephosphorylated samples were separated by electrophoresis on 10% SDS-PAGE gel, in parallel with lpL of a reference sample containing the 6 protein isoforms of Tau produced in vitro (Sigma Aldrich), then transferred to a membrane. nitrocellulose. The membranes were incubated with the primary antibody: Polyclonal Anti-human Tau (Dako Denmark A / S, Glostrup, Denmark) (1: 50,000) then revealed using chemiluminescent reagents (ECL Clarity, Bio-Rad Laboratories).
  • iPSCs from healthy donors were used. After dissociation, iPSCs cells were encapsulated inside alginate capsules coated with Matrigel as previously described for neural stem cells (NSC) in Alessandri et al, 2016. The capsules were first maintained in medium. mTESR to allow colonies to emerge inside the capsules. Then, the neural induction of iPSCs was carried out by the double inhibition of SMAD until the NSCs reached 100% confluence in the capsules (Feyeux et al., 2012). The efficiency of neural induction was confirmed by the evaluation of the expression of POU5F1 and OTX-1 mRNAs by RT -PCR.
  • the POU5F1 pluripotency gene was highly expressed in iPSCs and almost undetected in NSCs (Fig. 1A).
  • the OTX-1 marker of the NSCs was specifically overexpressed in the NSCs compared to the uninduced iPSCs (Fig. IB).
  • a commonly used medium DMEM / F12 - Neurobasal 1: 1, D / N
  • BrainPhys TM medium which was designed to promote the maturation and synaptic function of neurons derived from iPSC (Bardy et al., 2015).
  • cortical neurogenesis from iPSC follows the same temporal order in vitro as mammalian cortical development and extends at least through day 90 in culture (Espuny-Camacho et al., 2013; Kirwan et al., 2015; Shi et al., 2012), it was arbitrarily decided to characterize the identity of human cortical neurons derived from iPSCs in the experimental procedure after 15, 20 or 25 weeks in culture.
  • CALB1 Calbindin 1
  • RELN Reelin
  • CALB 1 is expressed in cortical layers II and III of the human cerebral cortex and RELN in cortical layer I. As shown in Figures IC and 1D, the expression of CALB 1 and RELN mRNAs was detected in neurons derived from iPSC from 15 weeks of culture regardless of the medium used. Expression of both genes was maintained for up to 25 weeks. As expected, CALB1 and RELN were not detected at a significant level in iPSCs and NSCs.
  • GF AP Gaal fibrillary acidic protein
  • CLDN11 Claudin11
  • iPSC-derived neurons inside Matrigel-coated alginate capsules were able to differentiate into cortical neurons, including upper layer cortical neurons which are generated in later stages. of cortical neurogenesis. It is important to note the presence of oligodendrocytes specifically in the cultures maintained in BrainPhys TM, pointing out that the BrainPhys TM neuronal medium improved neuronal maturation compared to the D / N medium commonly used.
  • the 0N3R and 1N3R isoforms were the most expressed (30.6 and 27.5%), followed by the 0N4R and 1N4R isoforms (22.4 and 17.6%), while the 2N3R and 2N4R isoforms only represented 1 and 0 , 9% of all isoforms.
  • BrainPhys TM promotes the expression of 6 adult mRNA isoforms of MAPT in neurons derived from iPSC and grown inside alginate capsules coated with Matrigel
  • the method was used to assess the expression of adult MAPT isoforms in iPSC-derived neuronal cultures maintained in D / N or in BrainPhys TM medium, over a period of time. maturation of 25 weeks. Consistent with previous studies, analysis of the NSCs revealed a single peak, corresponding to the predicted size of the 0N3R isoform of MAPT (Fig. 3A and Fig. 4A). From 15 weeks of maturation, isoforms containing exon 2 (the 1N3R and 1N4R isoforms) and exon 10 (the 0N4R and 1N4R isoforms) were detected.
  • the experimental procedure allowed the development of neurons expressing the 6 adult MAPT mRNA transcripts, but the 0N3R isoform remained mainly expressed after 25 weeks of maturation (-78%).
  • the expression of the MAPT isoforms was analyzed independently of the 0N3R transcripts.
  • two sets of primers (Fig. 6) were made: the first covering exons 2 and 11 to precisely analyze the 1N3R, 1N4R, 2N3R and 2N4R transcriptions, and the second covering exons 1 and 10 to specifically amplify the 4R-Tau isoforms.
  • Analysis of brain extracts as well as cultures maintained in BrainPhys TM for 25 weeks confirmed the relative proportions of the different MAPT isoforms, thus validating the test.
  • BrainPhys TM expressed the 6 adult MAPT transcripts after 25 weeks of maturation, including the 2N3R and 2N4R isoforms. It is important to note that when the cultures derived from iPSC were stored in D / N medium, only 5 isoforms were expressed. The 2N4R isoform was undetectable. In addition, at each study point, the mRNA levels for each isoform were consistently lower than those observed with BrainPhys TM medium. These data are perfectly consistent with the beneficial role of the BrainPhys TM medium on the maturation state of neurons. Interestingly, in accordance with what has been shown during human brain development (Hefti et al., 2018), a change in the expression of exon 2 and exon 10 was first detected. The inclusion of exon 3 is later.
  • Tau protein isoforms were then evaluated by Western Blot in spheres maintained in BrainPhys TM for 25 weeks.
  • the proteins were or were not dephosphorylated using lambda phosphatase and separated by electrophoresis next to a ladder of recombinant Tau proteins containing the 6 isoforms.
  • Tau proteins migrate as multiple bands between 40 and 60 kDa, due to (i) the presence of multiple isoforms and (ii) the phosphorylation state of the proteins. Phosphatase treatment resulted in a shift of Tau proteins to lower molecular weights.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION IN VITRO DE NEURONES DE MAMMIFERES
DOMAINE TECHNIQUE
L’invention a trait à un procédé de production in vitro de neurones de mammifères. Plus particulièrement, le procédé selon l’invention permet de produire des neurones exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R). L’invention trouve des applications en lien avec les maladies neurodégénératives, notamment dans le domaine du diagnostic et de la thérapie cellulaire, ainsi que pour l’identification et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Tau est une protéine multifonctionnelle, identifiée à l'origine comme une protéine cytoplasmique associée aux microtubules. Six isoformes de Tau sont exprimées dans le cerveau humain adulte, résultant de l'épissage alternatif du gène MAPT. L'épissage de Tau est régulé au cours du développement de telle sorte que seule l’isoforme la plus courte de Tau est exprimée dans le cerveau fœtal, contrairement au cerveau adulte qui exprime les 6 isoformes.
L'accumulation de dépôts intracellulaires pathologiques de la protéine Tau est la marque de nombreuses maladies neurodégénératives appelées tauopathies (Sergeant et al., 2008). Il est important de noter que la composition protéique (identité des isoformes de Tau présentes), la morphologie et la distribution anatomique des dépôts intracellulaires de Tau permettent de distinguer les différentes tauopathies. Dans la maladie d'Alzheimer (MA), les 6 isoformes Tau sont anormalement phosphorylées et agrégées. Dans la maladie de Pick, les isoformes de Tau 3R prédominent, tandis que des formes agrégées de Tau 4R prévalent dans la dégénérescence corticobasale et la paralysie supranucléaire progressive. D’autre part, plus de 50 mutations délétères ont été identifiées au sein du gèn QMAPT chez des patients atteints de démence lobaire frontotemporale liés au chromosome 17 (FTDP-17). Les mutations identifiées conduisent soit à une capacité réduite des protéines Tau à interagir avec les microtubules ou d'autres partenaires, soit à une surproduction d'isoformes 4R, ce qui entraîne un changement dans le rapport entre les isoformes 3R et 4R dans la cellule.
Au cours de la dernière décennie, la technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) a ouvert de nouvelles perspectives dans la modélisation des maladies humaines. Plusieurs groupes ont déjà démontré que les neurones dérivés d'iPSC peuvent être un outil précieux pour étudier les tauopathies. Cependant, l'immaturité relative des neurones issus d'iPSC constitue un défi majeur pour la récapitulation in vitro de la pathologie Tau. De nombreuses études ont montré que les neurones corticaux dérivés d'iPSC de type « sauvage » expriment principalement l'isoforme Tau embryonnaire 0N3R (Biswas et al, 2016 ; Hallmann et al, 2017 ; Imamura et al, 2016 ; Iovino et al, 2015 ; Sato et al, 2018 ; Silva et al, 2016 ; Verheyen et al, 2018, 2015). Même si la plupart de ces études ont décrit une transition de isoforme 0N3R unique vers la production mixte d’isoformes Tau 3R et 4R au cours de la procédure de différenciation, l'isoforme Tau 0N3R reste largement majoritaire. L'allongement du temps de culture jusqu'à 365 jours a permis la détection des isoformes protéiques 0N3R, 0N4R, 1N3R et 1N4R de Tau dans les neurones dérivés d'iPSC (Lovino et al., 2015 ; Sposito et al., 2015), mais toujours avec une prédominance du 0N3R. La présence d'isoformes de Tau adultes a également été décrite au niveau ARN dans les neurones corticaux dérivés d'iPSC (Ehrlich et al., 2015). Cependant, les isoformes protéiques correspondantes n'ont pas pu être détectées. Seule l'isoforme fœtale Tau 0N3R était présente dans ces neurones corticaux dérivés d'iPSC.
Il existe donc un besoin en modèle de neurones adultes, c’est-à-dire exprimant les 6 isoformes de la protéine T, afin de pouvoir étudier les tauopathies, notamment les tauopathies liées à Tau 4R.
RESUME DE L’INVENTION
En travaillant sur la différenciation des neurones et l’expression des différentes isoformes de la protéine Tau chez l’adulte, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de produire in vitro des neurones exprimant les 6 isoformes en cultivant des cellules souches dans des microcompartiments cellulaires creux à base d’alginate, permettant une culture en 3D, dans un milieu de culture permettant la différenciation neuronale. Avantageusement, cette étape est conduite au sein d’un bioréacteur dans lequel les microcompartiments sont maintenus en suspension dans ledit milieu de différenciation neuronale. Les inventeurs ont également mis en évidence qu’en utilisant un milieu de différenciation neuronale particulier comprenant du chlorure de sodium, un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L- serine, il est possible d’obtenir des cellules neuronales post-mitotiques comprenant les 6 isoformes de la protéine Tau dans des temps relativement courts, compris entre 5 et 50 semaines. Les inventeurs ont ainsi mis au point des procédés de culture permettant d’obtenir de tels neurones après seulement quelques semaines.
L’invention a donc pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. L’invention a également pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de de différentiation neuronale selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines, préférentiellement entre 5 et 50 semaines, plus préférentiellement entre 10 et 50 semaines, encore plus préférentiellement entre 25 et 50 semaines, entre 25 et 40 semaines, entre 25 et 35 semaines, entre 25 et 30 semaines, entre 20 et 50 semaines, entre 20 et 40 semaines, entre 20 et 35 semaines, entre 20 et 30 semaines, ou entre 20 et 25 semaines, des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire dans un milieu de différenciation neuronale comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine. Lesdits composés sont chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale.
L’invention a également pour objet des cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine Tau sont exprimées.
Par cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, on entend des cellules obtenues par culture in vitro dans des conditions contrôlées de cellules aptes à se différencier en cellules neuronales, telles que des cellules pluripotentes, par opposition à des cellules obtenues par prélèvement sur un sujet humain tel qu’un sujet humain adulte. Ainsi, l’invention a pour objet des cellules neuronales post-mitotiques issues de culture cellulaire, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine Tau 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R et 0N3R sont exprimées.
Avantageusement, de telles cellules neuronales post-mitotiques présentent un ratio d’expression des isoformes de 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre ½ et 2, encore plus préférentiellement compris entre ¾ et 4/3, idéalement à 10% d’un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, IN et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.
DESCRIPTION DES DESSINS
[Fig 1] montre une caractérisation moléculaire des iPSC, des NSC et des neurones dérivés d’iPSC. Analyse par RT -PCR à 15, 20 et 25 semaines (15s, 20s, 25s), des iPSCs (A), NSCs (B) et neurones différenciés à différents points de différenciation (C-F), en utilisant le marqueur de pluripotence POU5F1 (A), le marqueur des NSC OTX-1 (B), deux marqueurs spécifiques des neurones de la couche supérieure du cortex : CALB1 (C) et RELN (D), GF AP comme marqueur d'astrocyte (E) et le marqueur spécifique des oligodendrocytes CLDN11 (F). Les cellules ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys.
[Fig 2] montre la détection des 6 isoformes adultes d'ARNm de MAPT dans des extraits de cerveau. (A) Représentation schématique des différentes isoformes de MAPT analysées. Les tailles attendues pour chaque produit de PCR ont été calculées en fonction de l'emplacement des amorces couvrant les exons 1 et 11. (B) Chaque pic correspond à une isoforme MAPT différente. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en pb.
[Fig 3] montre l’expression des isoformes d'ARNm et de protéines MAPT adultes dans les neurones dérivés d'iPSC (A) Représentation de l'expression relative des 6 isoformes de MAPT dans les neurones induits à partir d’iPSC après 15, 20 et 25 semaines de maturation par analyse RT-qPCR. Les cellules ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (s), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. (B) L'analyse par Western Blot de protéines extraites de capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys. Le traitement avec la Lambda phosphatase révèle la présence de 4 isoformes de Tau, correspondant à 1N4R, 1N3R, 0N4R et 0N3R. Les isoformes 2N ne sont pas détectables.
[Fig 4] représente la quantification de l'expression relative des 6 isoformes adultes d'ARNm de MAPT Les isoformes d'ARNm de MAPT ont été quantifiées soit individuellement (A), soit regroupées en fonction de l'inclusion de l'exon 10 (B), soit de l’inclusion des exons 2 et 3 (C). (A) Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes.
[Fig 5] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm d MAPT. Analyses spécifiques de la proportion relative des isoformes ON, IN et 2N (A), ou des isoformes 3R et 4R (B) dans les NSC ou dans les neurones dérivés des iPSC par RT-qPCR. Les cellules neuronales ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des différentes isoformes d'ARNm de MAPT analysées, la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces et un électrophérogramme représentatif sont présentés. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en pb. (C) Les valeurs quantitatives sont indiquées dans les tableaux. Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes.
[Fig 6] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm de MAPT après exclusion des transcrits 0N3R. Analyses spécifiques des transcrits 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R (A) ou des isoformes 4R-Tau (B) dans des extraits de cerveau ou dans des capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys par RT-qPCR. (A) L'utilisation des amorces ex2 et exl 1 a permis d'amplifier uniquement les isoformes IN et 2N. (B) L'utilisation des amorces exl et exlO a permis l'amplification spécifique des isoformes 4R. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des différentes isoformes de MAPT analysées et la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces sont présentées. Les valeurs quantitatives correspondantes sont indiquées dans les tableaux de gauche (A : amplification ex2/exl l, B : amplification exl/exlO). Les tableaux de droite (A, B : exl/exl l) présentent les données obtenues lorsque les 6 isoformes d'ARNm de MAPT ont été simultanément amplifiées à l'aide de l'exl-exl 1 (Fig. 4A) et l'expression relative des isoformes 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes ON (A) ou l'expression relative des isoformes 0N4R, 1N4R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes 3R (B).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un procédé de culture et de production de cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R de la protéine Tau. Ce profil d’expression est caractéristique des neurones adultes, et ne se retrouve pas notamment au niveau embryonnaire. Jusqu’à présent, les procédés de production in vitro de cellules neuronales n’avaient pas abouti à la production de cellules neuronales exprimant ces 6 isoformes. Les inventeurs ont eu le mérite de découvrir et montrer qu’il est possible de produire in vitro de tels neurones, à haut débit et dans des délais raisonnables (de l’ordre de quelques dizaines de semaines), en combinant une culture de cellules en 3D à un milieu de différenciation.
L’utilisation de microcompartiments cellulaires comprenant une enveloppe externe creuse d’hydrogel encapsulant les cellules et de la matrice extracellulaire est particulièrement avantageuse et permet, dans le cadre de la présente invention, de favoriser la différentiation cellulaire et la maturation des neurones jusqu’au stade post-mitotique caractéristique des neurones adultes.
Microcompartiment cellulaire
Le procédé selon l’invention met en œuvre des microcompartiments cellulaires renfermant des cellules. Chaque microcompartiment cellulaire comprend une capsule creuse en hydrogel réticulé, dans laquelle sont logées des cellules, noyées dans une matrice extracellulaire.
Dans un mode de réalisation, la capsule d’hydrogel renferme un unique ensemble de cellules. Par unique, on entend que la capsule ne contient qu’un groupe de cellules, qui peut être plus ou moins cohésif. Notamment, un ensemble de cellules unique s’entend d’une structure cellulaire tridimensionnelle dans laquelle chaque cellule dudit ensemble est en contact physique avec au moins une autre cellule dudit ensemble.
Avantageusement, les cellules sont autoorganisées en un ensemble de cellules positionnées de manière particulière les unes par rapport aux autres pour créer des interactions et communications cellulaires et former une microstructure tridimensionnelle d’intérêt. Chaque microcompartiment comprend ainsi une couche externe d’hydrogel, ou capsule d’hydrogel, renfermant un ensemble de cellules autoorganisées. Les cellules peuvent se multiplier, s’organiser et/ou se différencier au sein de la capsule d’hydrogel.
Dans le contexte de l’invention, « la couche externe d’hydrogel », ou « coque d’hydrogel », désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d’une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l’eau. Une telle couche externe d’hydrogel est obtenue par réticulation d’une solution d’hydrogel. Avantageusement, le ou les polymères de la solution d’hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu’une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, la solution d’hydrogel utilisée est biocompatible, en ce sens qu’elle n’est pas toxique pour les cellules. La couche d’hydrogel permet avantageusement la diffusion de gaz dissous (et notamment d’oxygène et/ou de dioxyde de carbone), de nutriments, et de déchets métaboliques pour permettre la survie, la prolifération, la différenciation, la maturation des cellules et/ou la production de molécules ou d’assemblages moléculaires d’intérêt et/ou la récapitulation de comportements cellulaires d’intérêt. Les polymères de la solution d’hydrogel peuvent être d’origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la solution d’hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d’acrylate, tel que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d’origine bactérienne, telle que la gomme gellane, ou d’origine végétale, telles que la pectine ou l’alginate. Dans un mode de réalisation, la solution d’hydrogel comprend au moins de l’alginate. Préférentiellement, la solution d’hydrogel ne comprend que de l’alginate. Dans le contexte de l’invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de b-D- mannuronate (M) et a-L-guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, G alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et une concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume).
Préférentiellement le microcompartiment cellulaire est clos. C’est la couche externe en hydrogel qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le microcompartiment peut avoir n’importe quelle forme compatible avec l’encapsulation de cellules. Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture cellulaire, par exemple de cellules pluripotentes. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que de la laminine 521, 511 ou 421, de rentactine, de la vitronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l’EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel® et/ou de la Geltrex®.
Selon l’invention, le microcompartiment peut contenir, à la place de la matrice extracellulaire, un substitut de matrice extra-cellulaire. Un substitut de matrice extracellulaire s’entend d’un composé capable de favoriser l’attachement et/ou la survie des cellules en interagissant avec les protéines de membrane et/ou les voies de transduction du signal extracellulaire. Par exemple, un tel substitut comprend les polymères biologiques et leurs fragments notamment les protéines (laminines, vitronectines, fibronectines et collagènes), les glycosaminoglycanes non sulfatés (acide hyaluronique) ou sulfatés (chondroïtine sulfate, dermatane sulfate, kératane sulfate, héparane sulfate), et polymères synthétiques contenant des motifs issus des polymères biologiques ou reproduisant leurs propriétés (motif RGD) et les petites molécules mimant l’attachement à un substrat (inhibiteurs de Rho-A kinase tel que Y-27632 ou thiazovivin).
Toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l’intérieur d’une capsule d’hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l’invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and différentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604).
Avantageusement, les dimensions du microcompartiment cellulaire sont contrôlées. Dans un mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme sphérique. Préférentiellement, le diamètre d’un tel microcompartiment est compris entre 10 pm et 1 mm, plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Dans un autre mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme allongée. Notamment, le microcompartiment peut avoir une forme ovoïde ou tubulaire. Avantageusement, la plus petite dimension d’un tel microcompartiment ovoïde ou tubulaire est comprise entre 10 pm et 1 mm, plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Par « plus petite dimension », on entend le double de la distance minimale entre un point situé sur la surface externe de la couche en hydrogel et le centre du microcompartiment.
Dans un mode de réalisation particulier, l’épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon du microcompartiment. L’épaisseur de la couche de matrice extracellulaire représente 5 à 80 % du rayon du microcompartiment et est avantageusement accrochée sur la face interne de la coque en hydrogel. Cette couche de matrice peut combler l’espace entre les cellules et la coque en hydrogel. Dans le contexte de l’invention, « l’épaisseur » d’une couche est la dimension de ladite couche s’étendant radial ement par rapport au centre du microcompartiment.
Milieu de différenciation neuronale
Selon l’invention, des cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoformes sont obtenues dans un délai de production relativement court, et notamment inférieur à 100 semaines, et plus préférentiellement inférieur à 50 semaines. Pour cela, les microcompartiments sont maintenus dans un milieu de différenciation neuronal.
De tels milieux sont connus de l’homme de l’art. Il est notamment possible d’utiliser du milieu dit N2B27 (500 ML DMEM/F12, 500mL Neurobasal, 5mL N2 medium complément, 10 mL B27 medium complément). Avantageusement, un tel milieu est complémenté dans une première phase (10 à 15 premiers jours, phase d’induction neurale) par des molécules bloquant les voies de signalisation liées à BMP2 (telles que le LDN-193189 ou la protéine Noggin) et la voie de signalisation TGF-beta (telles que le SB-431542), et/ou dans une seconde phase optionnelle par des molécules activant les voies de signalisation liées à EGF-1 et FGF-2 (phase d’amplification de cellules souches neurales), et/ou complémenté dans une phase de différenciation terminale par des molécules activant les voies de signalisation neurotrophiques (par exemple la voie de transduction BDNF) et des molécules bloquant les voies de transduction du signal Notch (par exemple le compound E ou un autre inhibiteur de gamma-secretase)
Dans un mode de réalisation particulier, les microcompartiments cellulaires, contenant des cellules souches, éventuellement déjà différentiées en cellules neuronales post-mitotiques, sont mis en culture dans un milieu de différenciation neuronale particulier, comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine lesdits composés étant chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale. L’homme du métier est à même d’adapter les concentrations pour maintenir la survie et la fonctionnalité desdites cellules.
Dans le contexte de l’invention, on entend par composé « neuroactif » un composé, tel qu’un sel inorganique, qui affecte de manière significative l’activité neurale d’une cellule (par exemple une activité électrophysiologique). Une telle activité neurale peut être sensiblement identique à ractivité neurale d’une cellule neuronale sauvage dans son milieu naturel (in vivo).
Dans un mode de réalisation, le au moins un sel inorganique neuroactif est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCl), le chlorure de potassium (KC1), le chlorure de calcium (CaC12), le sulfate de magnésium (MgS04), le chlorure de magnésium (MgCL2), le nitrate ferrique (FeN03), le sulfate de zinc (ZnS04), le sulfate cuivrique (CuS04), le sulfate ferrique (FeS04) et des combinaisons de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, le milieu de différenciation neuronale comprend du chlorure de sodium et au moins un autre sel inorganique neuroactif.
Dans certains modes de réalisation, la concentration en chlorure de sodium est comprise entre 20 et 200 mM, préférentiellement entre 70 et 150 mM, notamment à 120 mM +/- 10%.
La concentration en les autres sels inorganiques neuroactifs est préférentiellement comprise entre 0,000001 et 10 mM, 0,000005 et 8 mM, 0,00001 et 6 mM, 0,00005 et 4 mM, 0,00005 et 2 mM, 0,0001 et 1 mM, 0,0005 et 0.5 mM, 0,001 et 0,05 mM, 0,01 et 0,05 mM.
La concentration en glycine comme la concentration en L-alanine sont avantageusement comprises entre 0,0001 et 0,05 mM. La concentration en L-serine est avantageusement comprise entre 0,001 et 0,03 mM.
Dans un mode de réalisation, le milieu de culture comprend en outre de l'acide L-aspartique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,003 mM, et/ou de l'acide L-glutamique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,02 mM, et/ou un agent de modulation du pH, tel qu’un sel inorganique.
Par exemple, l’agent de modulation est un sel inorganique choisi parmi le phosphate de sodium dibasique, le phosphate de sodium monobasique et des combinaisons de ceux-ci, ledit agent étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 mM. Alternativement, l’agent de modulation est le bicarbonate de sodium, avantageusement à une concentration comprise entre 1 et 35 mM.
De manière alternative ou complémentaire, le milieu de culture peut comprendre au moins un des composés suivants : un ou plusieurs acides aminés, chaque acide aminé étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 mM; une ou plusieurs vitamines, chaque vitamine étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,00001 et 1 mM; un agent supplémentaire choisi dans le groupe consistant en une protéine, un facteur neurotrophique, un stéroïde, une hormone, un acide gras, un lipide, une vitamine, un sulfate minéral, un composé chimique organique, un monosaccharide, un nucléotide et des combinaisons de ceux-ci; un substrat énergétique, tel que le sucre, le pyruvate de sodium et des combinaisons ceux-ci, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,1 et 5 mM; et un agent photosensible, notamment la riboflavine (B2) à une concentration comprise entre 0,0001 et 0,0006 mM; et/ou l'HEPES à une concentration comprise entre 1 et 10 mM.
Par exemple, le ou les acides aminés sont alors avantageusement choisi parmi la L-alanyl-L- glutamine, le chlorhydrate de L-arginine, la L-asparagine-H20, le chlorhydrate de cysteine- H20, la L- Cystine 2HC1, le chlorhydrate de L-histidine-H20, la L-isoleucine, la L-leucine, le chlorhydrate de L-lysine, la L-methionine, la L-phenylalanine, la L-proline, la L-threonine, le L tryptophane, le dihydrate de sel disodique de L-tyrosine, la L- Valine et des combinaisons de ceux-ci.
Par exemple, la ou les vitamines sont choisies dans le groupe constitue par le chlorure de choline, le pantothenate de D-calcium (B5), l'acide folique (B9), le i-Inositol, la niacinamide (B3), le chlorhydrate de pyridoxine, le chlorhydrate de thiamine, la vitamine B 12 (cyanocobalamine), la riboflavine (B2) et des combinaisons de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation, le milieu de culture ne comprend pas de sérum. De manière alternative ou complémentaire, l'osmolarité du milieu est comprise entre 280 et 330 Osm/mL.
Des exemples de composition de milieu de différenciation neuronale pouvant être utilisés pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention sont décrits dans la demande WO2014/172580. Le milieu BrainPhys™ Neuronal Medium commercialisé par la société STEMCELL Technologies est particulièrement adapté pour être utilisé comme milieu de différenciation neuronale dans le procédé de l’invention.
Etapes de culture
Selon l’invention, les microcompartiments sont mis en culture dans le milieu de différenciation cellulaire pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. De manière avantageuse, l’étape de culture dans le milieu de différenciation est conduite pendant une période comprise entre 5 et 50 semaines, préférentiellement entre 10 et 50 semaines, entre 20 et 50 semaines, entre 25 et 50 semaines, entre 20 et 40 semaines entre 25 et 40 semaines, entre 20 et 30 semaines, entre 25 et 30 semaines, plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, encore plus préférentiellement pendant environ 24 semaines, 25 semaines, 26 semaines, 27 semaines, 28 semaines, 29 semaines, 30 semaines, notamment pendant 25 semaines +/- 1 semaine. En effet, les inventeurs ont découvert qu’ après ces laps de temps, tout ou partie des microcompartiments contient des neurones exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R).
Selon G invention, les microcompartiments comprenant les cellules neuronales post-mitotiques peuvent être obtenus lors d’une étape de préculture de microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant un unique amas de cellules souches et de la matrice extracellulaire dans un milieu de culture apte à induire la différenciation cellulaire au sein desdits microcompartiments cellulaires. Les cellules étant avantageusement organisées en cyste à l’intérieure des capsules d’hydrogel à l’issu de ladite étape de préculture.
Dans le contexte de l’invention, on désigne par cyste au moins une couche de cellules pluripotentes organisées autour d’une lumière centrale. Selon l’invention, un tel microcompartiment comprend donc successivement, autour d’une lumière centrale, ladite couche de cellules pluripotentes, une couche de matrice extracellulaire, ou d’un substitut de matrice extra-cellulaire, et la couche externe en hydrogel. La lumière est générée, au moment de la formation du cyste, par les cellules qui se multiplient et se développent en couches sur la couche de matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture.
Les cellules souches utilisées pour la préparation des microcompartiments sont avantageusement des cellules souches pluripotentes de mammifère, humain ou non humain. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s’entend d’une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Notamment, les cellules souches sont choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (IPS), les cellules souches embryonnaires (ES), les cellules transdifférenciées et des mélanges de ceux-ci. Les cellules transdifférenciées s’entendent de cellules pour lesquelles une différenciation en cellules d’intérêt est obtenue sans passer par une étape de pluripotence. Les cellules passent de leur état initial (par exemple fibroblaste ou cellule mononucléée sanguine périphérique) à un état terminal de neurone mâture en forçant l’expression d’un ensemble de gènes de l’état terminal sans jamais transitionner par le phénotype pluripotent.
Un procédé de préparation de cystes est décrit dans la demande WO2018/096277, ainsi que des milieux de culture favorables à l’organisation des cellules en cystes au sein des microcompartiments.
Dans un autre mode de réalisation, des progéniteurs neuraux sont encapsulés dans une coque en hydrogel, lesdits progéniteurs étant avantageusement aptes à d’organiser sous forme de cystes. D’une manière générale, une fois que les microcompartiments cellulaires renferment majoritairement des cellules neuronales post-mitotiques, lesdits compartiments sont placés dans le milieu de différenciation neuronal. Par « majoritairement », on entend que le microcompartiment comprend plus de 50% en nombre de cellules neuronales post-mitotiques, préférentiellement, plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%.
Avantageusement, l’étape de différenciation neuronale est conduite dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant le milieu de différenciation.
Les cellules étant protégées des contraintes pouvant exister au sein du réacteur par la coque d’hydrogel, le flux au travers du bioréacteur peut être aussi fort que la coque d’hydrogel peut le soutenir. En outre, la coque d’hydrogel des microcompartiments cellulaires préserve les cellules des contraintes mécaniques liées aux collisions et prévient les fusions des éléments multicellulaires (agrégats, micro-carriers). Les microcompartiments sont en suspension dans le bioréacteur, ce qui permet un accès au milieu de culture et une diffusion dans les microcompartiments homogènes, ainsi qu’une bonne convection.
L’utilisation de microcompartiments cellulaires permet de cultiver les cellules dans n’importe quel type de bioréacteur, muni d’une enceinte close, et notamment dans un bioréacteur en mode d’alimentation par « batch », en mode d’alimentation par « fed batch » ou en mode d’alimentation continu (perfusion). L’utilisation de ces microcompartiments est particulièrement avantageuse dans le cas de culture en mode d’alimentation continu. En effet, les cellules étant protégées par la coque d’hydrogel, il est possible de les soumettre à des flux continus, sans risque de les fragiliser.
Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend une enceinte pouvant être fermée hermétiquement. Cela permet de contrôler l’atmosphère à l’intérieur du bioréacteur, et par exemple de cultiver les microcompartiments sous atmosphère inerte.
Le bioréacteur peut comporter une enceinte ayant un volume compris entre 1 mL et 10 000L, préférentiellement entre 5 mL et 10.000 L, entre 10 mL et 10.000 L, entre 100 mL et 10.000 L, entre 200 mL et 10.000 L, entre 500 mL et 10.000 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 100 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 500 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume de 100 L, ou plus. L’homme du métier saura adapter le nombre de microcompartiments et le volume du bioréacteur en fonction des besoins.
Préférentiellement, l’étape de différenciation neurale est conduite dans des conditions stériles afin d’éviter toute contamination par des microorganismes. Par exemple, l’enceinte du bioréacteur est close de manière à empêcher les contaminations, mais permet les échanges gazeux avec l’extérieur.
D’une manière générale, l’utilisation d’une enceinte close permet un contrôle fin de l’environnement de culture, sans risque de perturbation par l’environnement extérieur. Il est par ailleurs aisé d’obtenir des produits stériles. Cela permet également un meilleur rendement volumétrique.
A l’issu de l’étape de différenciation neuronale il est possible de récupérer tout ou partie des microcompartiments cellulaires, afin de récupérer des neurones post-mitotiques exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau contenus dans lesdits microcompartiments. Les cellules peuvent être récupérées aisément, par simple hydrolyse et/ou dissolution de la couche externe en hydrogel.
Cellules neuronales et applications
Le procédé selon l’invention permet d’obtenir des cellules neuronales post-mitotiques dans lesquelles les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R de la protéine Tau sont exprimées.
Avantageusement, les 6 isoformes sont des proportions sensiblement identiques aux proportions présentent dans des cellules neuronales adultes sauvages.
Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les microcompartiments cellulaires à l’issue de l’étape de différenciation présentent un ratio d’expression des isoformes 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre ½ et 2, encore plus préférentiellement compris entre ¾ et 4/3, idéalement à 10% d’un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, IN et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.
Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les microcompartiments cellulaires à l’issue de l’étape de différenciation comprennent les 6 isoformes dans les proportions ci-dessous rapport au nombre total des 6 isoformes : entre 0,1 et 0,9 % de Tisoforme 2N4R, notamment 0,16% ou 0,9%, entre 0,5 et 1% de Tisoforme 2N3R, notamment 0,69% ou 1%, entre 2 et 18% de Tisoforme 1N4R, notamment 2,19% ou 17,6%, entre 8 et 23% de Tisoforme 0N4R, notamment 9,4% ou 22,4%, entre 8 et 23% de Tisoforme 1N3R, notamment 9,4% ou 27,5%, et entre 30 et 80% de Tisoforme 0N3R, notamment 78,16% ou 30,6%.
De telles cellules neuronales post-mitotiques peuvent être utilisées aussi bien à des fins de recherche que de diagnostic ou de traitement. Ces cellules, présentant un profil d’expression de la protéine Tau sensiblement identique à celui des cellules neuronales adultes sauvages, sont particulièrement adaptées pour le criblage de molécules thérapeutiques ciblant des maladies neurodégénératives et/ou modifiant la physiopathologie des neurones, notamment chez l’humain.
Exemples
Matériel et méthodes
1. Lignée iPSC et encapsulation La lignée BC-1 (WT XY, passages 15-25, MTI-Globalstem, Gaithersburg, MD) a été maintenue en absence de cellules nourricières. Les plaques de culture ont été recouvertes d'une matrice Matrigel pendant 2 heures à 37°C (Corning, NY, 1/100, dilué dans un milieu DMEM). Les colonies BC-1 ont été dissociées en utilisant du ReLeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) puis cultivées dans du mTESRl (technologies STEMCELL) complémenté avec 1% de pénicilline/streptomycine (Invitrogen, Caribstad, CA ). Les cultures ont été nourries quotidiennement et passées tous les 5 à 7 jours.
La procédure d'encapsulation utilisée est celle décrite dans Alessandri et al, 2016.
2. Production de neurones corticaux matures
L'induction neurale a été réalisée dans un mélange 1 :1 de DMEM/F12 et de Neurobasal complémenté avec B27 et N2 (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA), ImM LDN- 193189 (Sigma Aldrich, St-Louis, MO, ) et IOmM SB431542 (Tocris Biosciences, Bristol, UK). Le milieu a été changé tous les jours pendant 8 jours. Ensuite, la différenciation des cellules souches neurales a été réalisée en utilisant le mélange DMEM/F12:Neurobasal (1 : 1) complémenté avec B27 et N2, ou le milieu BrainPhys™ complémenté avec N2-A et SMI (STEMCELL Technologies). Les deux milieux ont été supplémentés par 10 ng/mL de BDNF et GDNF (Cell Guidance Systems Ltd., Cambridge, Royaume-Uni), 10 nM de Compound E (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et 10 nM de trichostatine A (Abcam). La moitié du milieu a été changée tous les jours jusqu'à la période de maturation spécifiée.
3. Extraction d'ARN
Les microcompartiments (sphères) sédimentés ont été rincés une fois en PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubés avec du Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages PBS IX, l'ARN total des cellules a été extrait à l'aide du kit Nucleospin RNA XS (Macherey- Nagel GmbH and Co KG, Düren, Allemagne). Des expériences de validation ont été effectuées sur l'ARN total extrait de cortex cérébral humain adulte normal (BioChain Institute Inc., Newark, CA).
4. Analyse de la maturation neuronale par RT -PCR
Un total de 250 ng d'ARN a été retro-transcrit à l'aide du kit de transcription inverse RETROscript (Thermo Fischer Scientific Inc.) avec des amorces oligo(dT), conformément aux instructions du fabricant pour la procédure RT -PCR en deux étapes. Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant 1 pL d'ADNc et les amorces appropriées (figure 7). Les produits PCR ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 %.
5. Analyse des isoformes MAPT adultes par RT -PCR fluorescente
La rétrotranscription a été effectuée sur 70 ng d'ARN, à l'aide du kit d'ADNc Verso (Thermo Fischer Scientific Inc.) et des amorces oligo(dT). Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1 ci-dessous. La proportion relative des isoformes d MAPT a ensuite été analysée par PCR fluorescente, à l'aide d'une amorce sens non marquée et d'une amorce anti-sens marquée 6-FAM. Les produits de PCR ont été analysés sur un séquenceur automatique Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), et les électrophérogrammes analysés avec le logiciel GeneMapper Software 5.
[Table 1]
6. Extraction et déphosphorylation des protéines
Les sphères ont été rincées dans du PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubées avec le Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages en PBS IX, les sphères ont été homogénéisées dans un tampon Pierce® RIPA (Thermo Fisher Scientific Inc.) additionnés d’un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich), en utilisant le TissueLyserLT (Qiagen,
Hilden, Allemagne) (agitation rapide (50 Hz, 2 min), microtubes de 1,5 ml contenant deux billes en acier inox de 2 mm). Les échantillons ont ensuite été centrifugés et les lysats collectés. Après
30 min sur glace et centrifugation (11 300 X g, 20 min, 4°C), le surnageant contenant les protéines solubles a été recueilli. Trente pg de protéines totales ont ensuite été traitées avec 80 unités de protéine phosphatase lambda (New England Biolabs, Ipswich, MA) pendant 3 h à
37°C dans un volume final de 50pL. 7. Western Blotting
Les protéines ont été analysées grâce à la technique de Western blot comme décrit précédemment (Pons et al., 2017). Brièvement, les protéines des échantillons déphosphorylés ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%, en parallèle de lpL d’un échantillon de référence contenant les 6 isoformes protéiques de Tau produites in vitro (Sigma Aldrich), puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire : Polyclonal Anti-human Tau (Dako Denmark A/S, Glostrup, Danemark) (1 :50 000) puis révélées à l'aide de réactifs chemiluminescents (ECL Clarity, Bio- Rad Laboratories).
Résultats
1. Développement de neurones corticaux et des lignages gliaux sur matrigel à partir d'iPSC dans des capsules d'alginate
Dans cette étude, des iPSC provenant de donneurs sains ont été utilisés. Après dissociation, les cellules iPSCs ont été encapsulées à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel comme décrit précédemment pour les cellules souches neurales (NSC) dans Alessandri et al, 2016. Les capsules ont d'abord été maintenues dans un milieu mTESR pour permettre aux colonies d'émerger à l'intérieur des capsules. Ensuite, l'induction neurale des iPSCs a été réalisée par la double inhibition de SMAD jusqu'à ce que les NSCs atteignent 100% de confluence dans les capsules (Feyeux et al., 2012). L'efficacité de l'induction neurale a été confirmée par l'évaluation de l'expression des ARNm POU5F1 et OTX-1 par RT -PCR. Comme attendu, le gène de pluripotence POU5F1 était fortement exprimé dans les iPSC et presque non détecté dans les NSC (Fig. 1 A). D'autre part, le marqueur OTX-1 des NSCs était spécifiquement surexprimé dans les NSCs par rapport aux iPSCs non induits (Fig. IB). Une fois que les NSCs ont atteint la confluence, ils ont ensuite été différenciés en neurones corticaux. Deux milieux de culture cellulaire ont été testés : un milieu couramment utilisé (DMEM/F12 - Neurobasal 1 : 1, D/N) ainsi que le milieu BrainPhys™ qui a été conçu pour favoriser la maturation et la fonction synaptique des neurones dérivés d'iPSC (Bardy et al., 2015). Parce que des études antérieures ont montré que la neurogenèse corticale à partir d'iPSC suit le même ordre temporel in vitro que le développement cortical des mammifères et s'étend au moins jusqu'au jour 90 en culture (Espuny-Camacho et al., 2013 ; Kirwan et al., 2015 ; Shi et al., 2012), il a été arbitrairement décidé de caractériser l'identité des neurones corticaux humains dérivés des iPSC dans la procédure expérimentale après 15, 20 ou 25 semaines de culture. L'expression de CALB1 (Calbindin 1) et RELN (Reelin), deux marqueurs spécifiques des neurones corticaux de la couche supérieure, a été évaluée. Les neurones corticaux de la couche supérieure sont générés aux derniers stades de la neurogenèse corticale. CALB 1 est exprimé dans les couches corticales II et III du cortex cérébral humain et RELN dans la couche corticale I. Comme le montrent les figures IC et 1D, l'expression des ARNm CALB 1 et RELN a été détectée dans les neurones dérivés d’iPSC dès 15 semaines de culture quel que soit le milieu utilisé. L'expression des deux gènes a été maintenue jusqu'à 25 semaines. Comme attendu, CALB1 et RELN n'ont pas été détectés à un niveau significatif dans les iPSC et les NSC.
La présence d'astrocytes et d'oligodendrocytes myélinisants dans les cultures a également été étudiée, en évaluant respectivement l'expression des ARNm GF AP (Glial fibrillary acidic protein) et CLDN11 (Claudinl l). L'expression de GF AP a été détectée dès 15 semaines de culture dans les deux conditions expérimentales (Fig. 1E). Par contre, si l'expression de CLDN11 a été facilement détectée dans des capsules cultivées dans le milieu BrainPhys™ dès la 15ème semaine de culture, son expression est demeurée absente dans celles cultivés dans le milieu standard, même au bout de 25 semaines de différenciation (Fig. 1F). Encore une fois, comme attendu, aucun de ces gènes n’est exprimé aux stades iPSC et NSC. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que les neurones issus d'iPSC à l'intérieur des capsules d'alginate tapissées de Matrigel ont pu se différencier en neurones corticaux, y compris les neurones corticaux de la couche supérieure qui sont générés aux derniers stades de la neurogenèse corticale. Il est important de noter la présence d'oligodendrocytes spécifiquement dans les cultures maintenues en BrainPhys™, soulignant que le milieu neuronal BrainPhys™ a amélioré la maturation neuronale par rapport au milieu D/N couramment utilisé.
2. Développement d'une méthode quantitative pour mesurer les 6 isoformes d’ARNm adultes de MAPT : validation dans le cortex cérébral humain
Actuellement, les analyses de l'expression des isoformes d’ARNm de MAPT adultes sont principalement basées sur la seule quantification de l'inclusion de l'exon 10, pour déterminer le rapport 3R/4R, ou l'inclusion des exons 2 et 3, pour évaluer la proportion des isoformes ON, IN ou 2N. Dans la présente étude, une méthode permettant l'analyse simultanée des 6 isoformes ARNm de MAPT adultes individuellement dans une seule réaction PCR pour examiner leur proportion relative pendant la maturation neuronale a été mise au point. A cette fin, un nouveau test a été mis au point, basé sur l'amplification des transcrits MAPT à l'aide d'amorces marquées par fluorescence. Un ensemble d'amorces couvrant les exons 1 et 11 (Fig. 2A), qui devrait permettre l'amplification des 6 isoformes MAPT, a été identifié. Pour valider ce test, des expériences de RT -PCR sur des ARNm extraits de cortex cérébral humain adulte ont été réalisées. L'analyse des électrophérogrammes correspondant aux produits amplifiés par PCR a révélé un profil en 6 pics correspondant aux tailles attendues pour les 6 isoformes d’ARNm adultes de MAPT (Fig. 2B). La proportion relative des différentes isoformes a ensuite été calculée à partir de la hauteur du pic. Les isoformes 0N3R et 1N3R étaient les plus exprimées (30,6 et 27,5 %), suivies des isoformes 0N4R et 1N4R (22,4 et 17,6 %), tandis que les isoformes 2N3R et 2N4R ne représentaient que 1 et 0,9 % de toutes les isoformes.
Ces données ont également permis de déterminer la proportion relative des isoformes ON (53 %), IN (45,1 %) et 2N (1,9 %) et des isoformes 3R (59,1 %) et 4R (40,9 %). Il est important de noter que des données quantitatives similaires ont été obtenues lors de l'analyse indépendante de l'inclusion des exons 2/3 et de l'inclusion de l'exon 10 (Fig. 5 A, B) : les isoformes ON et IN se sont avérées les plus exprimées (52,9% et 45% respectivement), alors que les isoformes 2N ne représentaient que 2 %. En ce qui concerne l'épissage de l'exon 10, la quantification relative des pics indique que le rapport est légèrement en faveur des isoformes 3R, avec 59,9% de 3R- Tau contre 40,1% de 4R-Tau. Ces données sont parfaitement cohérentes avec les études publiées précédemment et valident donc ce nouvel essai.
3. Le BrainPhys™ favorise l'expression des 6 isoformes ARNm adultes de MAPT dans les neurones issus d'iPSC et cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel
Après avoir validé l’essai sur des extraits de cerveau adulte, la méthode a été utilisée pour évaluer l'expression des isoformes adultes MAPT dans des cultures neuronales dérivées d’iPSC maintenues en D/N ou dans un milieu BrainPhys™, sur une période de maturation de 25 semaines. Conformément aux études antérieures, l'analyse des NSCs a révélé un pic unique, correspondant à la taille prévue de l'isoforme 0N3R de MAPT (Fig. 3 A et Fig. 4A). Dès 15 semaines de maturation, des isoformes contenant l'exon 2 (les isoformes 1N3R et 1N4R) et l'exon 10 (les isoformes 0N4R et 1N4R) ont été détectées. Il est intéressant de noter que les cultures maintenues en BrainPhys™ présentaient des niveaux d'expression plus élevés des isoformes 1N3R, 0N4R et 1N4R que les cultures D/N. Après 20 semaines de maturation, une augmentation significative de la quantité de ces espèces a été observée, avec l'apparition de faibles niveaux d'expression de l'isoforme 2N3R dans les deux conditions expérimentales. Au dernier point de l’étude (25 semaines), les niveaux d'expression de ces isoformes ARNm de MAPT adultes ont continué à augmenter. Plus important encore, l'isoforme 2N4R était maintenant détectable dans les cultures maintenues en BrainPhys™. L'analyse quantitative des proportions relatives des isoformes ARNm de MAPT dans des cultures maintenues par BrainPhys™ pendant 25 semaines a révélé que les isoformes 0N4R et 1N3R représentaient chacune 9,4 % de toutes les isoformes présentes, tandis que l'isoforme 1N4R représentait 2,19 %. Les isoformes 2N3R et 2N4R correspondaient respectivement à 0,69 % et 0,16 %. Les isoformes 4R-Tau constituaient donc 11,75 % des transcrits MAPT (Fig. 4B), tandis que les isoformes IN et 2N représentaient respectivement 11,63 % et 0,85 % (Fig. 4C). Comme pour les extraits de cerveau, ces résultats ont été validés par des évaluations indépendantes de l'épissage de l'exon 10 ou des exons 2/3 (Fig. 5C).
La procédure expérimentale a permis le développement de neurones exprimant les 6 transcrits d'ARNm de MAPT adultes, mais l'isoforme 0N3R est restée principalement exprimée après 25 semaines de maturation (-78%). Afin d'exclure que les isoformes 0N3R puissent "piéger" les amorces et donc diminuer l'efficacité de la PCR par rapport aux transcrits moins bien exprimés, l'expression des isoformes de MAPT a été analysée indépendamment des transcrits 0N3R. Pour ce faire, deux jeux d'amorces (Fig. 6) ont été réalisés : la première couvrant les exons 2 et 11 pour analyser précisément les transcriptions 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R, et la seconde couvrant les exons 1 et 10 pour amplifier spécifiquement les isoformes 4R-Tau. L'analyse d'extraits cérébraux ainsi que des cultures maintenues en BrainPhys™ pendant 25 semaines ont confirmé les proportions relatives des différentes isoformes MAPT, validant ainsi le test.
Dans l'ensemble, ces résultats ont montré que les neurones maintenus en BrainPhys™ exprimaient les 6 transcrits MAPT adultes après 25 semaines de maturation, incluant les isoformes 2N3R et 2N4R. Il est important de noter que lorsque les cultures dérivées d'iPSC ont été conservées dans le milieu D/N, seules 5 isoformes été exprimées. L'isoforme 2N4R était indétectable. De plus, à chaque point d’étude, les niveaux d'ARNm pour chaque isoforme étaient systématiquement inférieurs à ceux observés avec le milieu BrainPhys™. Ces données sont parfaitement cohérentes avec le rôle bénéfique du milieu BrainPhys™ sur l'état de maturation des neurones. Fait intéressant, conformément à ce qui a été démontré lors du développement du cerveau humain (Hefti et al., 2018), un changement dans l'expression des exon 2 et exon 10 a d'abord été détecté. L’inclusion de l'exon 3 est plus tardive.
Afin de valider l'efficacité de la traduction des transcrits MAPT adultes dans le modèle expérimental, la production d'isoformes protéiques Tau a ensuite été évaluée par Western Blot dans des sphères maintenues en BrainPhys™ pendant 25 semaines. Les protéines ont été déphosphorylées ou non à l'aide de lambda phosphatase et séparées par éléctrophorèse à côté d'une échelle de protéines Tau recombinante contenant les 6 isoformes. Comme le montre la figure 3B, les protéines Tau migrent sous formes de multiples bandes entre 40 et 60 kDa, en raison (i) de la présence d’isoformes multiples et (ii) de l’état de phosphorylation des protéines. Le traitement à la phosphatase a entraîné un déplacement des protéines Tau vers des poids moléculaires plus faibles. En accord avec l'analyse en ARNm, il a été constaté que l'isoforme 0N3R-Tau était majoritairement détectée dans les capsules de 25 semaines. Cependant, des quantités significatives d'isoformes 0N4R, 1N3R et 1N4R ont également été détectées. En revanche, nous n'avons pas pu observer les isoformes 2N de Tau. Ces isoformes représentant moins de 1 % de toutes les espèces de Tau présentes en ARNm, il est possible que leurs concentrations soient inférieures à la limite de détection dans l’analyse.
CONCLUSIONS
Ces résultats montrent que les neurones dérivés d'iPSC, cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate revêtues de Matrigel présentaient des spécifications de cultures de cellules corticales matures. Plus important encore, à l'aide d'un nouveau test qui permet l'analyse qualitative et quantitative de toutes les isoformes d'ARNm MAPT adultes individuellement, il a été démontré que les neurones maintenus en BrainPhys™ exprimaient les 6 transcrits d'ARNm MAPT adultes après 25 semaines de maturation, rendant ce modèle très approprié pour la modélisation des pathologies Tau et à des fins thérapeutiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale.
2. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon la revendication 1, dans lequel, le milieu de différenciation neuronale comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine.
3. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon la revendication 2, selon lequel le sel inorganique neuroactif est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, le chlorure de magnésium, le nitrate ferrique, le sulfate de zinc, le sulfate cuivrique, le sulfate ferrique et des combinaisons de ceux-ci.
4. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape de différentiation neuronale est conduite pendant une période comprise entre 5 et 50 semaines, préférentiellement entre 10 et 50 semaines, plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, encore plus préférentiellement pendant 25 semaines +/- 1 semaine.
5. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape de différenciation neurale est conduite dans des conditions stériles, l’enceinte du bioréacteur étant avantageusement une enceinte close.
6. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape de préculture selon laquelle les microcompartiments de cellules neuronales post-mitotiques sont obtenus en cultivant des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant un unique amas de cellules souches, à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, et de la matrice extracellulaire dans un milieu de culture apte à induire la différenciation cellulaire au sein desdits microcompartiments cellulaire, les cellules étant avantageusement organisées en cyste à l’intérieure des capsules d’hydrogel à l’issu de ladite étape de préculture.
7. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon la revendication 6, dans lequel les cellules souches sont des cellules souches pluripotentes choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (IPS), les cellules souches embryonnaires (ES), à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, les cellules transdifférenciées et des mélanges de ceux-ci.
8. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape ultérieure selon laquelle à l’issu de l’étape de différentiation neuronale on récupère des neurones post-mitotiques exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau à partir des microcompartiments cellulaires.
9. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les microcompartiments cellulaires ont un diamètre compris entre 10 pm et 1mm, préférentiellement compris entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%.
10. Cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’une des revendications 1 à 8, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine tau sont exprimées.
11. Cellules neuronales post-mitotiques non naturelles selon la revendication 10, lesdites cellules présentant un ratio d’expression des isoformes de 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre ½ et 2, encore plus préférentiellement compris entre ¾ et 4/3, idéalement à 10% d’un ratio équimolaire, les isoformes 2N, IN et ON représentant avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.
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