EP4093865A1 - Enzyme zum abbau von acrylamid - Google Patents
Enzyme zum abbau von acrylamidInfo
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Classifications
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01004—Amidase (3.5.1.4)
Definitions
- the invention is in the field of the production of food and luxury goods, especially coffee and coffee substitute products.
- New enzymes are provided which are able to convert acrylamide - preferably at temperatures above 50 ° C., in particular in temperature ranges that occur during the production of coffee / coffee substitute products, and / or at a pH value between pH 4 and pH 7, as is customary in the manufacture of coffee / coffee substitute products, - decrease.
- methods for the degradation of acrylamide from preparations selected from semi-finished goods and finished goods are provided.
- the present invention also relates to preparations with a reduced acrylamide content compared to preparations which were not subjected to the method according to the invention for removing acrylamide by means of the enzymes according to the invention.
- acrylamide is also formed here (Anese, M. “Acrylamid in Coffee and Coffee Substitutes, Acrylamid in Food, 2016, pp.181-195).
- the guideline values for acrylamide in the new EU regulation are 400 pg / kg for roasted coffee, 850 pg / kg for soluble coffee, 500 pg / kg for coffee substitute products made exclusively from grain and 4000 pg / kg for products made from chicory.
- Acrylamide is also formed in a large number of (other) processes in the food and luxury food industry. For example, when frying potatoes, acrylamide is produced. It is advantageous or, if necessary, even necessary to partially or completely remove this from the semi-finished or finished goods, in particular to meet the requirements of the EU Regulation (EU 2017/2158) on the one hand and to obtain a safe end product that is harmless to the consumer on the other. Although there are a large number of attempts to determine the acrylamide content in food and drink
- the acrylamide content is after coffee extraction by using a cationic resin to absorb the acrylamide.
- This process requires an additional process step and is time-consuming since the absorption is a kinetically slow step.
- only 50% of the acrylic amide can be removed, and the cationic resin represents an additional cost burden in the process.
- WO 2004/083423 A1 relates to thermally stable amidases isolated from thermophilic organisms, in particular amidases from thermophilic actinomycetes such as Pseudonocardia thermophilia.
- SEQ ID NO. 3 discloses the amino acid sequence of an amidase which allegedly originates from Pseudonocardia thermophilia (corresponds to SEQ ID NO. 56 of this application).
- the genome of Pseudonocardia thermophilia has now been completely sequenced and deposited under the GenBank number FRAP01000003.1
- the genome has an amidase gene locus in the range 50704-52245; the protein is deposited under GenBank SHK14489.1.
- a sequence alignment of the deposited amidase in comparison to the wild-type amidase of SEQ (not according to the invention) ID NO.2 has 100% identity over the entire length of the protein.
- the amino acid sequence according to WO 2004/083423 A1 appears to be incorrect, in particular in the sequence segment of the first approximately 100 N-terminal amino acid residues.
- EP 0272 024 A2 relates to a method for the decomposition of acrylamide using an amidase.
- M. Cha, Eur Food Res Technol (2013) 236: 567-571 relates to the enzymatic control of the acrylamide content in coffee with the aid of enzymes from Ralstonia eutropha and Geobacillus thermoglucasidasius.
- the publication does not name any specific enzyme sequence, currently known enzymes from Ralstonia eutropha have a maximum identity of about 36.4% and currently known enzymes from Geobacillus thermoglucasidasius have a maximum identity of about 53.3%, in each case compared to the enzyme from Pseudonoracdia thermophilia.
- S. Raghavan et al., Microb Cell Fact (2019) 18: 139 relates to the development and application of a transcription sensor for the detection of heterologous production of acrylic acid in E. coli.
- amidase RAPc8 from Geobacillus pallidus is named, which has an identity of about 14% compared to the enzyme from Pseudonoracdia thermophilia and is not related to it.
- T.K. Cheong et al., Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 152-158 relates to the cloning of an amidase from Bacillus stearothermophilus BR388 in E. coli.
- the amidase from Bacillus stearothermophilus BR388 has an identity of about 14% compared to the enzyme from Pseudonoracdia thermophilia and is not related to it.
- A. Karmali et al., Molecular Biotechnology, Vol. 172001 211-212 relates to the exchanges of Thr-103-Ile and Trp-138-Gly in amidase from Pseudomonas aeruginosa.
- the amidase from Pseudomonas aeruginosa has an identity of about
- N.J. Silman et al., J Gen Microbiol (1991) 137 169-178 relates to the undirected evolution of amidase-exposing Methylophilus methylotrophus by growth selection and chemical mutagenesis.
- This amidase has an identity of about 14% compared to the enzyme from Pseudonoracdia thermophilia and is not related to it.
- the primary object of the present invention was to provide suitable enzymes and methods for treating preparations containing acrylamide which are able to reduce the acrylamide content in preparations, preferably by at least 80% by weight compared to the preparation to reduce before the treatment, the enzymes preferably also at high temperatures, such as those prevailing, for example, after steps of scalding, deep-frying, roasting of foodstuffs and luxury foods, and / or at a pH value between pH 4 and pH 7, their Retain enzyme activity and / or have high stability.
- the object of the present invention is primarily achieved by using enzymes (as described herein and in particular in the claims), preferably
- Amidases are provided which are actually able to significantly reduce the amount of acrylamide in a preparation, and this also at temperatures and pH values which are unfavorable for many amidases.
- the present invention relates to such enzymes (as described herein and in particular in the claims), preferably amidases, which up to a temperature of 50 ° C. or more and (also) in a pH range are catalytically active from pH 4 to pH 7.
- a suitable method for degrading acrylamide in a preparation using an enzyme according to the invention is provided, as well as a method for producing a preparation with a reduced acrylamide content.
- preparations with a reduced acrylamide content obtained by a method according to the invention, are provided.
- Figure 1 shows an alignment of SEQ ID NO. 65 (lines “65”) and SEQ ID NO.
- SEQ ID NO. 1 describes the amino acid consensus sequence of enzymes according to the invention.
- SEQ ID NO. 2 describes the (not according to the invention) amino acid sequence of
- SEQ ID NO. 3 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 68 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (D68N).
- SEQ ID NO. 4 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 74 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A74Y).
- SEQ ID NO. 5 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (G445A).
- SEQ ID NO. 6 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 33 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33F).
- SEQ ID NO. 7 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 33 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R).
- SEQ ID NO. 8 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (G445S).
- SEQ ID NO. 9 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 74, 225, 445 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, A74Y, S225T, G445S, A453C).
- SEQ ID NO. 10 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S, A453C).
- SEQ ID NO. 11 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 68, 74, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 12 describes an amino acid sequence according to the invention which has four mutations at positions 68, 74, 445 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (D68N, A74Y, G445S, A453C).
- SEQ ID NO. 13 describes an amino acid sequence according to the invention which has four mutations at positions 33, 68, 74 and 225 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33H, D68N, A74Y, S225T).
- SEQ ID NO. 14 describes an amino acid sequence according to the invention which contains twelve mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 and 507 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33R, W41Y, D68N, A74Y,
- V94I Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P).
- SEQ ID NO. 15 describes an amino acid sequence according to the invention which contains eleven mutations at positions 33, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 and 507 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P).
- SEQ ID NO. 16 describes an amino acid sequence according to the invention which contains eleven mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D).
- SEQ ID NO. 17 describes an amino acid sequence according to the invention which has nine mutations at positions 33, 41, 68, 74, 201, 225, 424, 445, and 448 in comparison with SEQ ID NO.
- SEQ ID NO. 18 describes an amino acid sequence according to the invention which contains twelve mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 and 507 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453C, A507P).
- SEQ ID NO. 19 describes an amino acid sequence according to the invention which contains eleven mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453N).
- SEQ ID NO. 20 describes an amino acid sequence according to the invention which contains eleven mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I,
- SEQ ID NO. 21 describes an amino acid sequence according to the invention which has eleven mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453E).
- SEQ ID NO. 22 describes an amino acid sequence according to the invention which has eleven mutations at positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453K).
- SEQ ID NO. 23 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 454 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, P454N).
- SEQ ID NO. 24 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 457 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, V457G).
- SEQ ID NO. 25 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 424 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, L424V, G445A).
- SEQ ID NO. 26 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 453 in comparison with SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453D).
- SEQ ID NO. 27 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 68, 74, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33Y, D68N, A74Y, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 28 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 68, 74, 175 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, G175A, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 29 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 507 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A507P).
- SEQ ID NO. 30 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453S).
- SEQ ID NO. 31 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 94, 225 and 445 in comparison to
- SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, V94I, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 32 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 317 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33R, D68N, A74Y, S225T, V317I, G445A).
- SEQ ID NO. 33 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 201, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, Y201F, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 34 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 68, 74, 445 and 448 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, M448H).
- SEQ ID NO. 35 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 445 and 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453R).
- SEQ ID NO. 36 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 221, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33R, D68N, A74Y, P221G, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 37 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 217, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, T217R, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 38 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 328 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, D328R, G445A).
- SEQ ID NO. 39 describes an amino acid sequence according to the invention which has five mutations at positions 33, 68, 74, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S).
- SEQ ID NO. 40 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 68, 74, 225, 229 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, D68N, A74Y, S225T, L229C, G445A).
- SEQ ID NO. 41 describes an amino acid sequence according to the invention which has six mutations at positions 33, 41, 68, 74, 225 and 445 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (S33R, W41Y, D68N, A74Y, S225T, G445A).
- SEQ ID NO. 42 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 225 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S225T).
- SEQ ID NO. 43 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 33 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33Y).
- SEQ ID NO. 44 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 317 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (V317I).
- SEQ ID NO. 45 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (A453E).
- SEQ ID NO. 46 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 33 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33H).
- SEQ ID NO. 47 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 33 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (S33H).
- SEQ ID NO. 48 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A453Q).
- SEQ ID NO. 49 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 424 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (L424V).
- SEQ ID NO. 50 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A453C).
- SEQ ID NO. 51 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (A453K).
- SEQ ID NO. 52 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A453S).
- SEQ ID NO. 53 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 454 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A454N).
- SEQ ID NO. 54 describes an amino acid sequence according to the invention which contains a mutation at position 507 in comparison to SEQ ID NO. 2 includes (A507P).
- SEQ ID NO. 55 describes an amino acid sequence according to the invention which has a mutation at position 453 in comparison to SEQ ID NO. 2 contains (A453N).
- SEQ ID NO. 56 corresponds to the protein sequence of Pseudonocardia thermophila as “SEQ ID NO. 3 ”in WO 2004/083423 is disclosed.
- an enzyme for reducing the amount of acrylamide in a preparation comprising or consisting of an amino acid consensus sequence according to SEQ ID NO. 1, where the amino acid consensus sequence is not a sequence according to SEQ ID NO. 2, and wherein the enzyme is an amino acid sequence with a sequence identity of at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence selected from the group consisting of the sequences according to SEQ ID NO. 3 to SEQ ID NO. 55, includes or consists of.
- SEQ ID NO. 1 the amino acid consensus sequence of enzymes according to the invention.
- a consensus sequence describes the amino acid sequence which all enzymes according to the invention have.
- variable positions are marked with Xaa and represent positions in which the enzymes according to the invention can differ from one another.
- Enzymes are biological catalysts that catalyze a particular chemical reaction. In the present case, the degradation of acrylamide by an amidase, the amide bond of the acrylamide is cleaved hydrolytically, so that Acrylic acid and ammonia are formed.
- concentrations of acrylic acid and ammonia or any substances resulting therefrom are so low in the coffee preparation that they do not have any negative effects on the end user. For example, ammonia immediately reacts to form harmless ammonium, which has no effect on the end product.
- the tools for local sequence alignment provided by the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI) use a modified Smith-Waterman algorithm (see http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa / and Smith, TF & Waterman, MS “Identification of common molecular subsequences” Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1): 195-197). Furthermore, when performing the respective pairwise alignment of two sequences using the modified Smith-Waterman algorithm, reference is made to the default parameters currently specified by the EMBL-EBI.
- the query sequence can, however, be longer than the length of the alignment, and the sequences of the query sequence represented in the alignment can be above or below 93%.
- SEQ ID NO. 56 as a query sequence with the SEQ ID NO. 2 as subject Sequence ( Figure 1) 507 amino acids of the total of 513 amino acids in the subject sequence; the sequence coverage is therefore 507/513 (98.8%).
- sequence identity can therefore be used interchangeably with “sequence homology” in the context of the present invention. This always relates to the total length of an enzyme according to the invention compared to the total length of an enzyme for which the sequence identity or sequence homology is determined.
- a preparation refers to all raw, semi-finished and finished goods of food or luxury goods or cosmetics, which include, for example, fried or fried potato products, roasted cereals or products containing such, corn products, coffee products, eg solid or liquid coffee extract and green coffee, chicory extract, grain coffee products, coffee substitute products, snacks, wheat products, cosmetics, baked goods or pastries, e.g. cookies, biscuits, rusks, cereal bars, scones, ice cream cones, waffles, crumpets, gingerbread, crispbread and bread substitute products, pasta, rice, fish products, Meat products, cereals, beer, nuts, complementary foods for children and infants, hair styling products, personal care products, hair care products, and face care products.
- fried or fried potato products roasted cereals or products containing such, corn products, coffee products, eg solid or liquid coffee extract and green coffee, chicory extract, grain coffee products, coffee substitute products, snacks, wheat products, cosmetics, baked goods or pastries, e.g. cookies,
- an enzyme according to the invention does not have a sequence according to SEQ ID NO. 2 includes or consists of. SEQ ID NO.
- the crystal structures 3A1K, 3A1 I, 3IP4 and 2GI3 (https://www.rcsb.org/) were used as templates for the final homology model, which is largely based on the homodimeric structure 3A1K, which is the amidase from Rhodococcus sp. N-771 is based and which in their catalytically active form as
- D68 to A74 (8.3 ⁇ ), D68 to A507 (16.0 ⁇ ).
- the active center as well as L424 and S33 are therefore within a space sphere around G445 with a radius of approx. 13 ⁇ .
- the residues D68 and A74 lie in a loop structure within a space sphere with a radius of 4.2 ⁇ (from the geometric center of both amino acids) or in a space sphere with a radius of 6.5 ⁇ starting from the C-alpha atom of A74. All named distances refer to the C-alpha atoms of the amino acids.
- Sequence according to SEQ ID NO. 1 not only no sequence according to SEQ ID NO. 2, but generally not a sequence of a wild-type amidase from Pseudonocardia thermophila.
- thermophila Other (thermostable) amidases from Pseudonocardia thermophila are described, for example, in WO 2004/083423 A1 (EP 1608746 B1), but these are not
- Enzymes according to the present invention and cannot be seen as wild-type enzymes according to SEQ ID NO 2.
- WO 2004/083423 A1 does not prove that the enzymes described therein in the sense of the present invention are advantageously used in food or luxury foods can be used, in particular not under such temperature and / or pH conditions as described herein.
- Enzymes according to the invention can be obtained starting from the wild-type enzyme in that one or more steps (preferably the directed, or alternatively the undirected, or the directed and undirected) mutation are carried out.
- a directed mutation is the specific change in one or more DNA bases of the enzyme gene, which leads to one or more specific effects on the amino acid sequence.
- Undirected mutation on the other hand, is random mutagenesis in a not precisely selected part of the entire DNA sequence. Subsequent to the undirected mutagenesis it is examined whether the resulting protein has the desired properties.
- the enzyme to be modified can be a wild-type enzyme. This was the case in the considerations and investigations that led to the present invention.
- a wild-type enzyme is to be understood as a naturally occurring, technically unchanged enzyme, which was isolated from nature either as a functional enzyme or its sequence and where the sequence and therefore also the functional enzyme were not changed by human hands .
- the enzyme can be the product of iterative undirected mutagenesis. In another embodiment, the enzyme can be the product of iterative directed mutagenesis.
- mutants were generated starting from a wild-type enzyme, all of which have different mutations at different locations in the enzyme gene. These mutants were then tested for their activity and stability at various pH values and temperatures. From this, in a further mutagenesis step, the enzyme could then be changed in such a way that increased activity and stability compared to the wild-type enzyme resulted.
- the amino acid residues relevant for the catalysis were not mutated, in particular the catalytic triad of the enzyme consisting of a lysine at position 95, a serine at position 170 and a serine at position 194 are not mutated.
- activity is the ability of the enzyme to catalyze the hydrolytic cleavage of the amide bond per unit of time, whereas the stability defines the residual activity of an enzyme under various environmental conditions such as pH value and temperature after a certain time.
- Suitable mutagenesis processes and the necessary conditions and reagents are sufficiently known to the person skilled in the art. Mutations take place at the gene level, for example through the exchange (the substitution), the removal (the deletion) or the addition of bases. These mutations have different effects on the amino acid sequence of the resulting protein. Substitution can lead to so-called "nonsense" mutations, which lead to the protein biosynthesis stopping prematurely and the resulting protein remaining dysfunctional.
- amino acid substitution mutations are identified on the basis of their position and the exchanged amino acid, for example as A143G. This notation means that the amino acid alanine has been exchanged for guanine at position 143 of the N- to C-terminal amino acid sequence. It is very particularly preferred in the context of the present invention if substitution mutations are generated.
- the amino acid sequence ie the amino acid sequence comprised by an enzyme according to the invention or forming an enzyme according to the invention, with a sequence identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence according to SEQ ID NO. 1 or with a sequence according to SEQ ID NO. 1, the amino acid sequence not being a sequence according to SEQ ID NO.
- Amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 41, 68, 74, 94, 175, 201, 225, 317, 424, 445, 448, 453, 454, and 507 an amino acid that is not the Amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 68, 74, 175201, 225,
- an amino acid which does not correspond to the amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 68, 74, 201, 225, 424, 445, 448, 453, and 507 an amino acid which does not correspond to the amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 68, 74, 175, 225, 317, 424, 445, 453, 454 and 507 an amino acid which is not the amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has an amino acid other than the amino acid in at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 68, 225, 424, 445, 453, and 507 the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 33, 424, and 445 an amino acid that is not the amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence has an amino acid in at least one, several or all positions selected from the group consisting of positions 68 and 74 which does not correspond to the amino acid of the corresponding position (s) of the amino acid sequence SEQ ID NO. 2 corresponds.
- the amino acid sequence at position 33 has an arginine or a tyrosine or a histidine or a phenylalanine, and / or at position 41 a tyrosine, and / or at position 68 an asparagine, and / or at position 74 a tyrosine, and / or at position 94 an isoleucine, and / or at position 175 an alanine, and / or at position 201 a phenylalanine, and / or at position 217 an arginine, and / or at position 221 a glycine, and / or at position 225 a threonine, and / or at position 229 a cysteine, and / or at position 317 an isoleucine, and / or at position 328 an arginine, and / or at position 424 a valine, and / or at position 445 an arginine or a
- the amino acid sequence at position 33 has an arginine or a tyrosine, and / or at position 68 an asparagine, and / or at position 74 a tyrosine, and / or at position 201 a phenylalanine, and / or at position 225 a threonine, and / or at position 424 a valine, and / or at position 445 an alanine, and / or at position 448 a histidine, and / or at position 453 an aspartate or a cysteine.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution selected from the group consisting of S33R, S33Y, S33H, S33F, particularly preferably an amino acid substitution S33R, S33H or S33Y.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution W41 Y.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution D68N.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution A74Y.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution V94I.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution G175A. In a further embodiment of the present invention, the amino acid sequence has at least one amino acid substitution Y201 F.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution T217R.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution P221 G.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution S225T.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution L229C. In yet another embodiment of the present invention, the amino acid sequence has at least one amino acid substitution V317I. In a further embodiment of the present invention, the amino acid sequence has at least one amino acid substitution D328R.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution L424V.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution selected from the group consisting of G445A and G445S, preferably an amino acid substitution G445A.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution M448H.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution selected from the group consisting of A453D, A543C, A453N, A453Q, A453E, A453K, A453R and A453S, particularly preferably an amino acid substitution A453D, A453Q, A453N or A453C.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution P454N.
- the amino acid sequence has at least one amino acid substitution V457G. In a further embodiment of the present invention, the amino acid sequence has at least one amino acid substitution A507P.
- amino acid substitutions described herein in particular the amino acid substitutions described above or the amino acids preferably present at the respective positions, can be combined with one another in any way in order to produce enzymes according to the invention obtained, optionally in combination with further substitutions not described herein or amino acids other than the amino acids according to SEQ ID NO. 1 (cf. the "sequence identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence according to SEQ ID NO. 1").
- amino acid substitutions are preferred which are outside functional, in particular outside catalytic (cf. above), areas.
- Another aspect of the invention relates to an enzyme which is not based on the
- Consensus sequence according to SEQ ID NO. 1 is described, but independently of it.
- This further aspect of the invention relates to an enzyme for reducing the amount of acrylamide in a preparation, comprising an amino acid sequence with a sequence identity of at least 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to SEQ ID NO. 2, the amino acid sequence being compared to SEQ ID NO. 2 has at least one amino acid exchange in a position which is in one of the following sequence sections of SEQ ID NO. 2 lies:
- the enzyme according to the invention comprises an amino acid sequence with a sequence identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to SEQ ID NO. 2, the amino acid sequence being compared to SEQ ID NO. 2 has at least the following amino acid exchanges:
- G445S, G445T, G445C, G445N, or G445Q preferably G445A, or G445S;
- the enzyme according to the invention has, in comparison to an enzyme with SEQ ID NO. 2
- a higher (enzyme) activity denotes a higher activity of an enzyme (as defined above) in a sample compared to another enzyme in the corresponding sample.
- a higher residual activity (of an enzyme) denotes the activity of an enzyme (as defined above) in a sample after a specified time compared to another enzyme in the corresponding sample.
- the determination of the activity, residual activity and / or the Tm value is preferably carried out as described in the experimental part.
- the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid exchange, preferably at least two amino acid exchanges, more preferably at least three amino acid exchanges, more preferably at least four amino acid exchanges, more preferably at least five amino acid exchanges, more preferably at least six amino acid exchanges, more preferably at least seven amino acid exchanges, more preferably at least eight amino acid exchanges, more preferably at least nine more amino acid exchanges more preferably at least ten amino acid changes, and most preferably at least eleven amino acid changes.
- the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 at most 23 amino acid exchanges, preferably at most 22 amino acid exchanges, more preferably at most 21 amino acid exchanges, more preferably at most 20
- Amino acid exchanges more preferably at most 19 amino acid exchanges, more preferably at most 18 amino acid exchanges, more preferably at most 17 amino acid exchanges, more preferably at most 16 amino acid exchanges, more preferably at most 15 amino acid exchanges, even more preferably at most 14 amino acid exchanges and most preferably at most 13 amino acid exchanges.
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 additionally has at least one amino acid substitution, selected from the group consisting of the
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least two amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (a); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (b); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c); or the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (c) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (c).
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least two amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c); or the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c).
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least three amino acid exchanges, of which - the first amino acid exchange is in a position in sequence section (a), the second amino acid exchange is also in a position in sequence section (a), and the third amino acid exchange is also in a position in sequence section (a) ; the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (a), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b); - the first amino acid exchange is in a position in sequence section (a), the second amino acid exchange is also in a position in sequence section
- the third amino acid substitution is in a position in sequence segment (c);
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b), and the third amino acid exchange is also in a position in sequence segment (b);
- the first amino acid change is in a position in sequence section (a), the second amino acid change is in a position in sequence section (b), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c);
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c), and the third amino acid exchange is also in a position in sequence segment (c);
- the first amino acid exchange is in a position in sequence section (b), the second amino acid exchange is also in a position in sequence section
- (b) is, and the third amino acid substitution is also in a position in sequence section (b); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b), the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (b), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c); or the first amino acid exchange is in a position in sequence section (c), the second amino acid exchange is also in a position in sequence section (c) and the third amino acid substitution is also in a position in sequence section (c).
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least three amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b); or - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b).
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid replacement in a position which is in one of the following sequence sections of SEQ ID NO. 2 lies:
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid replacement in a position which is in one of the following sequence sections of SEQ ID NO. 2 lies:
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid exchange in a position which is in one of the following sequence sections of SEQ ID NO. 2 lies:
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least two amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (a-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (b-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2) and the second amino acid exchange is also in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid exchange
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least two amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-
- first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1); or the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2) and the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has, in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least three amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (a- 1) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (a-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (a-3); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1); the first amino acid change
- (c-1) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (a-3); - the first amino acid replacement is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid replacement is in a position in sequence segment (a-2), and the third amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange in a position in sequence segment (a-2) and the third amino acid substitution is in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), and the third amino acid
- (c-1) lies; the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-3), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-3), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), and the third amino
- (c-2) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-1); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-2); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino
- (b-2) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-2); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange in a position in sequence segment (c-1) and the third amino acid substitution is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), and the third amino acid
- (b-1) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-3), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (a-3), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1), and the third amino
- the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1);
- the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2);
- - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2);
- the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1);
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the
- (c-2) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (c-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-3), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), the second amino acid exchange in a position in sequence segment (b-1) and the third amino acid substitution is in a position in sequence segment (c-1); the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1), and the third amino acid
- (c-2) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (a-3), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-3), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-3), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (a-3), the second amino acid change is in a position in sequence section (c-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2); the first amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-1), the second amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-1), and the third amino
- the first amino acid change is in a position in sequence section (b-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1);
- the first amino acid change is in a position in sequence section (b-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2);
- - the first amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-1), the second amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino acid replacement is in a position in sequence segment (b-2);
- the first amino acid change is in a position in sequence section (b-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1);
- the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the
- (c-2) lies; the first amino acid change is in a position in sequence section (b-1), the second amino acid change is in a position in sequence section (c-1), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-2); the first amino acid change is in a position in sequence section (b-2), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (c-1); - the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment (c-2); or the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (b-2), the second amino acid exchange in a position in sequence segment (c-1) and the third amino acid substitution is in a position in sequence segment (c-2).
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least three amino acid exchanges, of which the first amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), the second amino acid exchange is in a position in sequence segment (a-1), and the third amino acid exchange is in a position in sequence segment ( b-1) lies; or - the first amino acid change is in a position in sequence section (a-3), the second amino acid change is in a position in sequence section (b-2), and the third amino acid change is in a position in sequence section (b-2).
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one, preferably two, more preferably three or more amino acid exchanges, selected from the group of positions S33, W41, D68, A74, V94, G175, Y201, T217, P221, S225, L229, V317, D328, L424, G445, M448 , A453, P454, C457, and A507, preferably selected from the group of positions S33, W41, D68, A74, V94, G175, Y201, S225, V317, L424, G445, M448, A453, and A507, more preferably selected from the Group of positions S33, W41, D68, A74, V94, Y201, S225, L424, G445, M448, A453, and A507, and most preferably selected from the group of positions S33, W41, D68, A74, V94, Y201, T217, P221, S
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least one, several or all amino acid substitutions selected from positions S33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, and A507; preferably all of the items SS33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, and
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 no amino acid exchange in at least one of the following positions: E24, S25, D26, L27, P28, A32, S33, T35, L37, L38, S40, W41, N42, K43, V44, E45, E46, Y48, A49, E50 , V51, A52, P53, T54,, Q57, S59, W60, T61, R62, P63, A65, E66, D67, D68, K69, A72, W73, V75, Q76, T77, S78.
- amino acid sequence according to the invention is different from SEQ ID NO. 3 according to WO 2004/083423 A1.
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position G445 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N, G445Q, G445D, G445E, G445R and G445R G445H; preferably G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N and G445Q; more preferred G445A and G445S.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position A453 has an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from A453G, A453V, A453L, A453I, A453M, A453P, A453F, A453W, A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453H; preferably A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K and A453H; more preferably A453C, A453D, A453E, A453K, A453N, A453Q, A453R and A453S.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position L424 has an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F, L424W, L424Y, L424S, L424T, L424C, L424N, L424Q, L424D, L424E, L424K and L424H424R; preferably L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F and L424W; more preferred L424V.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position M448 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from M448G, M448A, M448V, M448L, M448I, M448P, M448F, M448W, M448Y, M448S, M448T, M448C, M448N, M448Q, M448D, M448E, M448R, M448K and M448H; preferably M448D, M448E, M448R, M448K and M448H; more preferred M448H.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position A507 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F, A507W, A507Y, A507S, A507T, A507C, A507N, A507Q, A507D, A507E, A507R, A507K; preferably A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F and A507W; more preferred A507P.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position S33 on an amino acid exchange is preferably selected from S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S, S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K and S33H; preferred
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position W41 on an amino acid exchange is preferably selected from W41G, W41A, W41V, W41 L, W41 I, W41M, W41P, W41 F, W41Y, W41S, W41T, W41 C, W41 N, W41 Q, W41 D, W41 E, W41 R, W41 K and W41 H; preferably W41Y, W41S, W41T, W41C, W41N and W41Q; more preferred W41Y.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position D68 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from D68G, D68A, D68V, D68L, D68I, D68M, D68P, D68F, D68W, D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N, D68Q, D68E, D68R, D68K and D68H; preferably D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N and D68Q; more preferred D68N.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position A74 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from A74G, A74V, A74L, A74I, A74M, A74P, A74F, A74W, A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N, A74Q, A74D, A74E, A74R, A74K and A74H; preferably A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N and A74Q; more preferred A74Y.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 in position V94 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F, V94W, V94Y, V94S, V94T, V94C, V94N, V94Q, V94D, V94E, V94R, V94K and V94H; preferably V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F and V94W; more preferred is V94I.
- the amino acid substitution is preferably selected from Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201 M, Y201 P, Y201F, Y201W, Y201S, Y201T, Y201C, Y201N, Y201Q, Y201D, Y201E, Y201R, Y201K and Y201H; preferably Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201M, Y201P, Y201F and Y201 W; preferred Y201 F.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position P221 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221 M, P221F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221C, P221N, P221Q, P221D, P221E, P221R, P221K and
- P221H preferably P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221M, P221F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221C, P221N and P221Q; more preferred P221G and P221Q.
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention has in comparison to SEQ ID NO. 2 in position S225
- amino acid exchange is preferably selected from S225G, S225A, S225V, S225L, S225I, S225M, S225P, S225F, S225W, S225Y, S225T, S225C, S225N, S225Q, S225D, S225E, S225R, S225K and S225H; preferably S225Y, S225T, S225C, S225N and S225Q; more preferred S225T.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position G175 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F, G175W, G175Y, G175S, G175T, G175C, G175N, G175Q, G175D, G175E, G175R and, G175K
- G175H preferably G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F and G175W; more preferred G175A.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position T217 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from T217G, T217A, T217V, T217L, T217I, T217M, T217P, T217F, T217W, T217Y, T217S, T217C, T217N, T217Q, T217D, T217E, T217R and T217K T217H; preferably T217D, T217E, T217R, T217K and T217H; more preferred T217R.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position L229 has an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from L229G, L229A, L229V, L229I, L229M, L229P, L229F, L229W, L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N, L229Q, L229D, L229E, L229K and L229HK and L229HK; preferably L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N and L229Q; more preferred L229C.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position V317 has an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F, V317W, V317Y, V317S, V317T, V317C, V317N, V317Q, V317D, V317E, V317K and V317K; preferably V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F and
- V317W More preferred V317I.
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position D328 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from D328G, D328A, D328V, D328L, D328I, D328M, D328P, D328F, D328W,
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position P454 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from P454G, P454A, P454V, P454L, P454I, P454M, P454F, P454W, P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N, P454Q, P454D, P454E, P454R, P454H; preferably P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N and P454Q; more preferred P454N.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 in position V457 on an amino acid exchange.
- the amino acid substitution is preferably selected from V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F, V457W, V457Y, V457S, V457T, V457C, V457N, V457Q, V457D, V457E, V457R, V457K and V457H; preferably V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F and V457W; more preferred V457G.
- the enzyme according to the invention has, in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid exchange, preferably at least two amino acid exchanges, more preferably at least three amino acid exchanges, more preferably at least four amino acid exchanges, more preferably at least five amino acid exchanges, more preferably at least six amino acid exchanges, more preferably at least seven amino acid exchanges, more preferably at least eight amino acid exchanges, more preferably at least nine amino acid exchanges Amino acid exchanges, and most preferably at least eleven amino acid exchanges, which are independently selected from
- V457G V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F, V457W, V457Y, V457S, V457T, V457C, V457N, V457Q, V457D, V457E, V457R, V457K and V457H; preferably V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F and V457W; more preferred V457G;
- T217G T217A, T217V, T217L, T217I, T217M, T217P, T217F, T217W, T217Y, T217S, T217C, T217N, T217Q, T217D, T217E, T217R, T217K and T217H; preferably T217D, T217E, T217R, T217K and T217H; more preferred T217R;
- P221 G P221A, P221V, P221 L, P221 I, P221 M, P221 F, P221W, P221Y, P221 S, P221T, P221C, P221 N, P221Q, P221 D, P221 E, P221 R, P221 K and P221 H; preferably P221G, P221A, P221V, P221 L, P221 I, P221 M, P221 F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221 C, P221 N and P221Q; more preferred P221 G;
- the enzyme according to the invention has, in comparison to SEQ ID NO. 2 at least one amino acid substitution, preferably at least two amino acid changes, more preferably at least three amino acid changes, more preferably at least four amino acid changes, more preferably at least five amino acid changes, more preferably at least six amino acid changes, more preferably at least seven amino acid changes, more preferably at least eight amino acid changes, more preferably at least nine
- Amino acid exchanges more preferably at least ten amino acid exchanges and most preferably at least eleven amino acid exchanges, which are independently selected from
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least two amino acid exchanges, namely in positions
- V94 and Y201 V94 and S225; V94 and L424; V94 and G445; V94 and M448; V94 and A453; or V94 and A507; - Y201 and S225; Y201 and L424; Y201 and G445; Y201 and M448; or Y201 and A453;
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least two amino acid exchanges, namely in position G445 and in position S33; in position G445 and in position D68; in position G445 and in position A74; in position G445 and in position S225; in position S33 and in position D68; in position S33 and in position A74; in position S33 and in position S225; in position S33 and in position L424; in position S33 and in position M448; in position D68 and in position A74; - in position D68 and in position S225; in position D68 and in position A507; in position A74 and in position S225; in position A74 and in position A507; in position L424 and in position M448
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least three amino acid exchanges, namely in positions
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 has at least three amino acid changes, namely in positions - S33, G448 and A453; or
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 at least two amino acid exchanges, preferably at least three amino acid exchanges, more preferably at least four amino acid exchanges, and most preferably all five amino acid exchanges selected from positions S33, D68, A74, S225, L424, G445 and A453.
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 a sequence identity of at least 86.0%, a sequence identity of at least 87%, a
- amino acid sequence of the enzyme according to the invention in comparison to SEQ ID NO. 2 additionally has at least one amino acid substitution, selected from the group consisting of positions V94I, V317I, and D328R.
- the amino acid sequence of the enzyme according to the invention has a sequence identity of at least 95%, preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, most preferably at least 98% and in particular at least 99% to SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
- WO 2006/040345 already referred to the use of other enzymes (not according to the invention) in food production processes, the effectiveness in the production of acrylic amide-reduced products could not be shown here. It is also possible with the enzyme according to the invention to efficiently and quickly break down acrylamide in a preparation. This is particularly advantageous in continuous or semi-continuous large-scale processes such as the food and luxury goods industry, since this ensures short dwell times in the enzyme treatment and rapid further processing of any easily perishable semi-finished goods.
- the enzyme according to the invention can be used very particularly preferably and advantageously in the manufacture of coffee products / coffee substitutes, since the breakdown of acrylamide is an essential process in order to obtain a safe and harmlessly consumable final food.
- the enzyme is an amidase.
- Amidases or amidohydrolases are a class of enzymes that catalyze the hydrolysis of amide bonds. Amidases occur in abundance in nature and are used in conventional products such as detergents and household cleaners. It has been shown that the use of at least one amidase is advantageous in the context of the present invention, since it cleaves the amide bond of acrylamide with a very simple mechanism which does not require any additional agents or cofactors.
- the enzyme is suitable up to a temperature of 50 ° C.
- catalytic activity means that a detectable cleavage of the amide bond of the acrylamide takes place.
- Activity at temperatures up to 80 ° C is particularly preferred in the context of the present invention, since most proteins and enzymes which are not thermotolerant lose their activity at a temperature above 42 ° C.
- the enzyme is suitable for having catalytic activity in a range from pH 4 to pH 7, and / or is used in such a pH range within the scope of the present invention. According to a further preferred embodiment, the enzyme is suitable for having catalytic activity in a range from pH 4 to pH 7, and / or is used in such a pH range within the scope of the present invention. According to a further preferred embodiment, the enzyme is suitable for having catalytic activity in a range from pH 4 to pH 7, and / or is used in such a pH range within the scope of the present invention. According to a further preferred embodiment, the
- the enzyme has (at least) catalytic activity in a range from pH 4 to pH 6.5, preferably in the range from pH 4.5 to pH 5.5.
- the enzyme can also have catalytic activity outside of these pH ranges or, within the scope of the present invention, be used in such ranges.
- the pH value plays a crucial role in the stability and activity of enzymes. A pH value above or below the optimal pH value usually leads to a partial to a complete loss of activity. It is all the more surprising that an enzyme according to the invention can be used efficiently in an acrylamide degradation step in preparations with a slightly acidic pH.
- the enzyme has up to a temperature of 50 ° C. or more, preferably at least up to a temperature of 60 ° C., particularly preferably at least up to a temperature of 70 ° C., more preferably at least up to one temperature of 80 ° C, (at least) in a range from pH 4 to pH 7, preferably in a range from pH 4 to pH 6.5, preferably in the range from pH 4.5 to pH 5.5, catalytic activity for at least 24 hours, preferably at least 48 hours, particularly preferably at least 72 Hours on.
- the enzyme has up to one
- Temperature of 50 ° C. or more preferably at least up to a temperature of 60 ° C., particularly preferably at least up to a temperature of 70 ° C., more preferably at least up to a temperature of 80 ° C., (at least) in a range of pH 4 to pH 7, preferably in a range from pH 4 to pH 6.5, preferably in the range from pH 4.5 to pH 5.5, catalytic activity.
- the enzyme can also have catalytic activity up to the temperatures mentioned outside these pH ranges and can accordingly be used in such ranges.
- the enzyme comprises or consists of an amino acid sequence with a sequence identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a sequence selected from the group consisting of the sequences according to SEQ ID NO. 3 to SEQ ID NO. 55, preferably from the sequences according to SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22 particularly preferably from the sequences according to SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22nd
- the enzyme is a modified amidase from Pseudonocardia thermophila.
- the organism Pseudonocardia thermophila is characterized by the way it spreads in rather hotter temperature environments such as dung heaps, warm springs or the like.
- the organism belongs to the thermotolerant prokaryotes; it can grow at temperatures between 40 and 50 ° C. Due to its adaptation to warmer environments, its enzymes are also more thermo-tolerant, but not above 50 ° C based on the wild type. It is surprising that starting from an enzyme of the organism Pseudonocardia thermophila, a tolerance in the acidic pH range could be achieved, since Pseudonocardia thermophila is not naturally acid-tolerant.
- Another aspect of the present invention relates to a method for degrading acrylamide, preferably for reducing the amount of acrylamide in a preparation, consisting of or comprising the steps:
- step (ii) providing a mixture, preferably a preparation, containing acrylamide, and adding the enzyme from step (i),
- step (iii) Incubating the mixture resulting from step (ii) for at least 20 minutes, preferably at a temperature in the range from 40 ° C to 80 ° C, preferably at a temperature in the range from 45 ° C to 75 ° C,
- step (iv) optional: heating the incubated mixture resulting from step (iii) so that the enzyme is inactivated, preferably by heating to a temperature of at least 90 ° C. and maintaining a temperature of over 90 ° C. for at least 15 minutes, wherein the mixture is optionally cooled in order to obtain a product which has a lower acrylamide content than the mixture or preparation provided in step (ii).
- Incubation in the context of the present invention means that the mixture provided from step (ii) remains at a specific temperature for a predetermined time. Maintaining the temperature within the meaning of the present invention means that the temperature of the incubated mixture in step (iii) is not or not significantly changed for a defined period. Minor
- the enzyme can be produced recombinantly, with suitable expression organisms and conditions being familiar to the person skilled in the art. Furthermore, the enzyme can be present unpurified as a lysate, partially purified or highly purified. Suitable cleaning methods are known to the person skilled in the art.
- the enzyme according to the invention can be present as a solution or immobilized. Suitable immobilization methods are sufficiently known to the person skilled in the art.
- Inactivation refers to the loss of activity of the enzyme caused by an extremely high temperature and the unfolding of the amino acid chain of the enzyme.
- the inactivated enzyme can then be removed from the preparation using methods familiar to the person skilled in the art, such as, for example, filtration, absorption or adsorption.
- the acrylamide contained in the mixture or preparation initially provided is the product of a Maillard reaction.
- a Maillard reaction can be observed, for example, when deep-frying or frying food and is expressed in typical browning.
- the Maillard reaction is also essential when roasting coffee products in order to obtain the typical roasted taste.
- the product of the Maillard reaction is acrylamide, which is cleaved with the enzyme according to the invention in the course of the process according to the invention.
- the acrylamide contained in the preparation provided is the product of a Maillard reaction and the preparation is a nutrition or pleasure preparation or a cosmetic preparation, or a semi-finished product for the production of such preparations, preferably where the preparation is selected from the group consisting of fried or deep-fried potato products, roasted grain or products containing such, corn products, coffee products, e.g. solid or liquid coffee extracts and green coffee, chicory extracts, grain coffee products, coffee substitute products, Snacks, wheat products, cosmetics, baked goods or pastries, e.g.
- Semi-finished goods are all products that are subjected to a further processing step. These can be roasted coffee extracts, dough, green coffee, potato products, etc., for example. Finished goods, on the other hand, are not processed, but are packaged in their form and given to the consumer. Examples of finished goods are, for example, dissolving coffee, ready-to-use coffee powder, chips, noodles or the like.
- the acrylamide content in the product obtained is ⁇ 2000 pg / kg, preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg, based in each case on the total weight of the product .
- this value range - as far as possible and sensible - preferably also includes 0.
- the specification ⁇ 2000 pg / kg is a value range of 0 to 2000 pg / kg.
- the acrylamide content can or will be around 60%, preferably around 65%, particularly preferably around 70%, further preferably around 75%, particularly preferably around 80%, further preferably around 85%, particularly preferably by 90%, further preferably by 95% and very particularly preferably by 100%, compared to a preparation that was not subjected to the method according to the invention.
- Another aspect of the present invention relates to a method for producing a preparation used for pleasure or nutrition or a cosmetic preparation with a reduced acrylamide content, preferably wherein the preparation is selected from the group consisting of fried or deep-fried potato products, roasted cereals or such containing
- step (ii) providing a preparation or cosmetic preparation used for enjoyment or nutrition, containing acrylamide, and adding the enzyme according to the invention from step (i),
- step (iii) Incubating the preparation resulting from step (ii) for at least 20 minutes, preferably at a temperature in the range from 40 ° C to 80 ° C, preferably at a temperature in the range from 45 ° C to 75 ° C, (iv) optionally heating the incubated preparation resulting from step (iii) so that the enzyme is inactivated, preferably by heating to a temperature of at least 90 ° C. and maintaining a temperature of over 90 ° C. for at least 15 minutes, the incubated preparation is optionally cooled in order to obtain a preparation which has a lower acrylamide content than the preparation provided in step (ii).
- a semi-finished product is further processed into an end product in order to obtain a cosmetic preparation or a pleasure or nutrition.
- a semi-finished product is treated with an enzyme according to the invention in order to obtain a preparation with a reduced acrylamide content.
- This preparation can then be heated above 90 ° C to inactivate the enzyme.
- the inactivated enzyme can then be removed from the preparation using methods familiar to the person skilled in the art, such as, for example, filtration, absorption or adsorption.
- the present invention relates to the use of an enzyme according to the invention for the breakdown of acrylamide and / or for the production of a pleasure or nutrition preparation or cosmetic preparation with a reduced acrylamide content, preferably ⁇ 2000 pg / kg , preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg, in each case based on the total weight of the preparation.
- the acrylamide content can or will be around 60%, preferably around 65%, particularly preferably around 70%, further preferably around 75%, particularly preferably around 80%, further preferably around 85%, particularly preferably around 90%, furthermore preferably by 95% and very particularly preferably by 100% compared to a preparation in which the enzyme according to the invention was not used.
- Another aspect of the present invention relates to a preparation or cosmetic preparation (preferably those as described above) for enjoyment or nutrition, produced or producible by a method according to the invention, the acrylamide content ⁇ 2000 pg / kg, preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg (and / or where the acrylamide content is / is reduced as described above, preferably as described above as preferred), in each case based on the total weight of the preparation.
- Preferred embodiments of the invention are summarized below as sentences 1 to 18:
- Sentence 1 Enzyme for reducing the amount of acrylamide in a preparation, comprising or consisting of an amino acid sequence with a sequence identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% or 99% to one
- Sequence according to SEQ ID NO. 1 or with a sequence according to SEQ ID NO. 1, the amino acid sequence not being a sequence according to SEQ ID NO. 2 is.
- Sentence 2 Enzyme according to Sentence 1, wherein the amino acid sequence is selected at one, several or all positions from the group consisting of positions 33, 41, 68, 74, 94, 175, 201, 217, 221, 225, 229, 317 , 328, 424, 445,
- 448, 453, 454, 457 and 507 has an amino acid which does not correspond to the amino acid of the corresponding position (s) of the sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- Sentence 3 Enzyme according to sentence 1 or 2, wherein the amino acid sequence is selected at least in one, several or all positions from the group consisting of positions 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 and 453 , has an amino acid which does not correspond to the amino acid of the corresponding position (s) of the sequence according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
- Sentence 6 Enzyme for reducing the amount of acrylamide in a preparation, comprising or consisting of an amino acid consensus sequence according to SEQ ID NO. 1, the amino acid sequence not being a sequence according to SEQ ID NO. 2 and wherein the enzyme is an amino acid sequence with a sequence identity of at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence selected from the group consisting of the sequences according to SEQ ID NO. 3 to SEQ ID NO. 41, includes or consists of.
- Sentence 7 Enzyme according to Sentence 6, wherein the enzyme has an amino acid sequence with a sequence identity of at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22, includes or consists of.
- Clause 8 Enzyme according to Clause 6 or 7, wherein the enzyme has an amino acid sequence with a sequence identity of at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22, includes or consists of.
- Sentence 10 Enzyme according to one of the preceding sentences, wherein the enzyme up to a temperature of 50 ° C or more, preferably at least up to a temperature of 60 ° C, particularly preferably at least up to a temperature of 70 ° C, more preferably at least Has catalytic activity up to a temperature of 80 ° C; and / or wherein the enzyme is in a range of pH 4 has catalytic activity up to pH 7, preferably wherein the enzyme has catalytic activity in a range from pH 4 to pH 6.5, more preferably in the range from pH 4.5 to pH 5.5; preferably wherein the enzyme up to a temperature of 50 ° C or more, preferably at least up to a temperature of 60 ° C, particularly preferably at least up to a temperature of
- 70 ° C. more preferably at least up to a temperature of 80 ° C., in a range from pH 4 to pH 7, preferably in a range from pH 4 to pH 6.5, preferably in the range from pH 4.5 to pH 5 , 5, has catalytic activity.
- Sentence 11 Enzyme according to one of the preceding sentences, comprising or consisting of an amino acid sequence with a sequence identity of at least 90%,
- Sentence 12 The enzyme according to any of the preceding sentences, wherein the enzyme is an altered amidase from Pseudonocardia thermophila.
- Sentence 13 A method for the degradation of acrylamide, preferably for reducing the amount of acrylamide in a preparation, consisting of or comprising the steps: (i) providing an enzyme according to one of sentences 1 to 12; (ii) providing a mixture, preferably a preparation, containing acrylamide, and adding the enzyme from step (i); (iii) incubating the mixture resulting from step (ii) for at least 20 minutes, preferably at a temperature in the range from 40 ° C. to 80 ° C., more preferably at a temperature in the range from 45 ° C.
- step (iv) optional: heating the incubated mixture resulting from step (iii) so that the enzyme is inactivated, preferably by heating to a temperature of at least 90 ° C. and maintaining a temperature of over 90 ° C. for at least 15 minutes , and optionally cooling the mixture; in order to obtain a product which has a lower acrylamide content than the mixture or preparation provided in step (ii).
- Sentence 14 optional: heating the incubated mixture resulting from step (iii) so that the enzyme is inactivated, preferably by heating to a temperature of at least 90 ° C. and maintaining a temperature of over 90 ° C. for at least 15 minutes , and optionally cooling the mixture; in order to obtain a product which has a lower acrylamide content than the mixture or preparation provided in step (ii).
- Sentence 14 optional: heating the incubated mixture resulting from step (iii) so that the enzyme is inactivated, preferably by heating to a temperature of at least 90 ° C. and maintaining
- step (ii) a preparation containing acrylamide is provided, wherein the acrylamide contained is preferably the product of a Maillard reaction, and wherein the preparation is a nutrition or pleasure preparation or a cosmetic preparation - processing, or a semi-finished product for the production of such preparations, preferably wherein the preparation is selected from the group consisting of fried or deep-fried potato products, roasted grain or products containing such, corn products, coffee products, e.g. solid or liquid coffee extracts and green coffee, chicory extracts, grain coffee products - th, coffee substitute products, snacks, wheat products, cosmetics, baked goods or pastries, e.g.
- Sentence 15 Method according to one of sentences 13 or 14, the acrylamide content in the product obtained being ⁇ 2000 pg / kg, preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg, each based on the total weight of the product.
- a method for producing a preparation for enjoyment or nutrition or a cosmetic preparation with a reduced acrylamide content preferably wherein the preparation is selected from the group consisting of fried or deep-fried potato products, roasted cereals or products containing such, corn products, coffee products , for example solid or liquid coffee extracts and green coffee, chicory extracts, grain coffee products, coffee substitute products, coffee substitute products, snacks, wheat products, cosmetics, baked goods or pastries, for example cookies, biscuits, rusks, cereal bars, scones, ice cream cones, waffles, crumpets, gingerbread, crispbread and Bread substitute products, noodles, rice, fish products, meat products, cereals, beer, nuts, complementary foods for children and babies, hair styling products, body care products, hair care products, and face care products consisting of or comprising the steps of: (I) (a) providing a product obtained by a method according to one of sentences 13 to 15; and (b) further processing of the product and / or adding one or more further components in order to obtain the preparation
- Sentence 17 Use of an enzyme according to one of sentences 1 to 12 for the breakdown of acrylamide and / or for the production of a preparation for enjoyment or nutrition or a cosmetic preparation with a reduced acrylamide content, preferably ⁇ 2000 pg / kg, preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg, in each case based on the total weight of the preparation.
- Sentence 18 Preparation or cosmetic preparation used for enjoyment or nutrition, produced or producible by a method according to one of sentences 13 to 16, the acrylamide content ⁇ 2000 pg / kg, preferably ⁇ 850 pg / kg, particularly preferably ⁇ 500 pg / kg is based in each case on the total weight of the preparation.
- the genes which code for an amidase and its variants are cloned into the expression plasmid pLE1A17 (Novagen).
- E. coli BL21 (DE3) cells are then transformed with these plasmids.
- the cells are cultivated in ZYM505 medium (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) with the addition of kanamycin (50 mg / l) at 37 ° C. and the enzyme expression when the logarithmic level is reached Growth phase induced with IPTG to 0.1 mM final concentration. After induction, the cells are further cultivated at 30 ° C. for approx. 20 h.
- the cells are harvested by centrifugation and disrupted in lysis buffer (50 mM potassium phosphate, pH 7.2; 2 mM MgCl; 0.5 mg / ml lysozyme; 0.02 U / pL nucleanase).
- lysis buffer 50 mM potassium phosphate, pH 7.2; 2 mM MgCl; 0.5 mg / ml lysozyme; 0.02 U / pL nucleanase.
- the digestion takes place mechanically either by repeated freezing and thawing in liquid nitrogen or by means of ultrasound. After centrifugation and separation of the insoluble constituents, the soluble enzyme-containing crude extract was obtained.
- Amidase unit corresponds to the release of 1 pmol ammonia per minute from 25 mM acrylamide in 50 mM sodium acetate buffer pH 5.5 at 40 ° C.
- the ammonia released was quantified e.g. with the Rapid Ammonia Kit from Megazymes.
- the activities stated in U / mL relate to mL crude extract with an optical density (measured at 600 nm) of 100.
- the activity is determined analogously at other pH values (pH 5.0) and temperatures (50/60 ° C.). The parameters that have changed compared to the standard activity are specified separately.
- the T m 50 value is determined to determine the temperature stability of an amidase.
- an enzyme-containing crude extract is incubated in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.5 to pH 5.5) for 15 minutes at different temperatures in the range from 25 ° C to 85 ° C.
- the crude extracts are then incubated on ice for 15 minutes, centrifuged, and the supernatant is then used Activity determination carried out under standard conditions according to point 1.2.
- the activity value of the untreated sample is set to 100% and all other values are standardized to it.
- the T m 50 value corresponds to the temperature after the treatment of which the enzyme is still 50% active. 1.3.2 Determination of stability at different pH values and temperatures
- the crude extracts at a certain pH value (for example in the range pH 4.5 to 5.5) and a certain temperature (for example in the range from 50 to 75 ° C) over a longer period Incubated period.
- Samples are taken regularly over a period of 24 hours, during which the samples are mixed with 1 volume equivalent of 100 mM NaAc buffer pH 5.5 and immediately frozen in liquid nitrogen. After thawing, the samples are centrifuged and the activity determination is carried out with the supernatant under standard conditions as described under point 1.2. The percentage residual activity is calculated by comparing the activity values determined after incubation with the
- Table 2 Results of the amino acid substitutions in comparison to the enzyme with SEQ ID NO. 11 (according to the invention, but not particularly preferred).
- the HIT criterion describes the property that was selected. On the one hand, this is an increased stability compared to an enzyme with SEQ ID NO. 11, on the other hand an increased activity to an enzyme with the SEQ ID NO. 11.
- Table 4 Results of the saturation mutagenesis and its effect on the stability and activity of the enzymes according to the invention.
- Coffee beans of the type Brazil Arabica are roasted to a color value of 110 according to Neuhaus Neotec Colortest II.
- acrylamide is formed.
- the roasted coffee is ground on the VT6 coffee grinder (Mahlkönig) on level 13.
- the ground coffee is first filled into the percolator of an extraction system and then topped up with 70 liters of water at a temperature of 85 ° C. The mixture is allowed to swell for one hour. The extraction is then started at 85 ° C. There will be 100 L of water through the percolator
- the coffee extract obtained is heated to a temperature of 70 ° C. in the collecting container and kept at this temperature.
- An enzyme according to the invention for example an enzyme according to SEQ
- the enzyme is added in an amount such that an enzyme concentration of 1000 U / L is used.
- the enzyme is added to the extract, stirred and incubated for 30 minutes at 70 ° C. After incubation, the extract is heated to 95 ° C for 15 minutes to inactivate the amidase. The extract is then cooled down and prepared for freeze-drying.
- the object of the present invention was to provide an enzyme which is also suitable for use in a coffee matrix from an economic point of view. For example, at a pH of 4.8 and 1000 U / L of the enzyme used, an acrylamide reduction of 60% was achieved. At a pH of 5.3 and 1000 U / L of the enzyme used, an acrylamide reduction of 90% was achieved. Thus, acrylamide-reduced products with only 554 or 129 pg / kg acrylamide content were obtained.
- the coffee extract is concentrated using freeze concentration or evaporation.
- the concentration is an intermediate step in order to increase the solids content in the extract, since the extract obtained has a solids content of approx. 2 - 6% by weight after the extraction.
- a solids content of at least 20% by weight is required for fluidized bed drying.
- a higher solids content is advantageous for freeze drying, but not absolutely necessary.
- the concentrated extract is then dried by freeze drying or fluidized bed drying and the acrylamide-reduced end product (dried soluble coffee) is thus obtained, which generally has a solids content of approx. 96% by weight.
- chicory can be used as a coffee substitute product.
- the roots of the chicory plant are used for this. This is dried, crushed and roasted like coffee at temperatures between 150 and 200 ° C and then ground. Further processing to the soluble, acrylamide-reduced extract is carried out in the same way as described in Example 2.1.2 for coffee.
- the dried, soluble chicory extract can be used as an end product or as a mixing additive, for example for cereal coffee or coffee mix products.
- the acrylamide reduction is determined by extracting a sample of a certain roasted coffee with hot water. The extract is then divided into two portions and only one portion is treated with amidase and incubated. The second portion is treated the same except for the addition of amidase and serves as a comparison sample. After the incubation time has elapsed, the reaction is stopped by heating it once to a temperature that reliably denatures the enzyme.
- the acrylamide analysis in both extracts is carried out in accordance with DIN EN ISO 18862 using LC-MS / MS. The reduction rate is calculated from the acrylamide contents in the treated sample and in the comparison sample.
- the enzyme preparations were produced analogously to Experiment 1 (see 1.1). The same conditions were used to determine the enzyme activity (see 1 .2) and the enzyme stability (see 1 .3).
- Table 5 Effect of different amino acid substitutions on the activity of SEQ ID NO: 2.
- Table 6 Effect of different amino acid substitutions on the stability of SEQ ID NO.2.
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Abstract
Die Erfindung befindet sich v.a. auf dem Gebiet der Herstellung von Lebens- und Genussmitteln, zum Beispiel von Kaffee- und Kaffeeersatzprodukten. Es werden Enzyme bereitgestellt, die in der Lage sind, Acrylamid – vorzugsweise auch bei Temperaturen über 50°C, insbesondere in Temperaturbereichen, die bei der Herstellung von Kaffee-/Kaffeeersatzprodukten auftreten, und/oder bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7, wie er bei der Herstellung von Kaffee-/Kaffeeersatzprodukten üblich ist, – abzubauen. Weiterhin werden Verfahren zum Abbau von Acrylamid aus Zubereitungen, ausgewählt aus Halbfertigwaren sowie Fertigwaren bereitgestellt. Auch betrifft die vorliegende Erfindung Zubereitungen mit einem reduzierten Acrylamidgehalt im Vergleich zu Zubereitungen, welche nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Entfernen von Acrylamid mittels den erfindungsgemäßen Enzymen unterzogen wurden.
Description
Enzyme zum Abbau von Acrylamid
[0001] Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Herstellung von Lebens- und Genussmitteln, besonders von Kaffee- und Kaffeeersatzprodukten. Es werden neue Enzyme bereitgestellt, die in der Lage sind, Acrylamid - vorzugsweise bei Temperaturen über 50°C, insbesondere in Temperaturbereichen, die bei der Herstel- lung von Kaffee-/Kaffeeersatzprodukten auftreten, und/oder bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7, wie er bei der Herstellung von Kaffee-/Kaffeeersatzpro- dukten üblich ist, - abzubauen. Weiterhin werden Verfahren zum Abbau von Acrylamid aus Zubereitungen, ausgewählt aus Halbfertigwaren sowie Fertigwaren bereitgestellt. Auch betrifft die vorliegende Erfindung Zubereitungen mit einem reduzierten Acrylamidgehalt im Vergleich zu Zubereitungen, welche nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Entfernen von Acrylamid mittels den erfindungsgemäßen Enzymen unterzogen wurden.
[0002] Die Anforderungen von Endverbrauchern an ein konstant sicheres und unbedenklich verzehrbares Lebens- und Genussmittel sind kontinuierlich hoch und stellen spezielle Anforderungen an die Produzenten. Eine neue EU Verordnung aus dem Jahr 2018 (EU 2017/2158) stuft Acrylamid als Prozesskontaminante und potentielles Gesundheitsrisiko für Endverbraucher ein. Demzufolge sind die Lebens- und Genussmittelproduzenten verpflichtet, den Acrylamidgehalt in Lebens- und Genussmitteln unter einem bestimmten Level zu halten oder zu sen- ken. In Tierversuchen wirkt Acrylamid krebserzeugend und erbgutverändernd.
Acrylamid entsteht in allen Brat-, Back- und Frittierprozessen von stärkehaltigen Rohstoffen und ist das Produkt der Erhitzung von Asparagin mit reduzierenden Zuckern (z.B. Glucose und Fructose) im Rahmen der sogenannten Maillard-Re- aktion. [0003] Im besonderen Fall der Produktion von Kaffee- und Kaffeeersatzprodukten beinhalten diese Prozesse das Brühen oder Extrahieren von gerösteten und gemahlenen Kaffeebohnen und deren Ersatzprodukten, wie z.B. Zichorie, Gerste oder Roggen. Beim Rösten werden die Kaffeebohnen typischerweise Temperaturen zwischen 145°C und 250°C unterzogen, wobei komplexe chemische Reaktionen, die Maillard-Reaktion, Karamellisierung und Pyrolyse erfolgen. Durch diese Reaktionen verändern sich die chemischen, physischen und sensorischen Eigenschaften der gerösteten Produkte, welche elementar wichtig für den Geschmack des Getränkes sind. Zudem entstehen weitere Substanzen, die für das Endprodukt wichtig sind, wie zum Beispiel Antioxidantien (Jin et al. „Relationship be- tween antioxidants and acrylamide formation: A review“, Food Research International, 2013, p. 611 - 620). Als unerwünschte Prozesskontaminante durch das Rösten von Kaffee und Kaffeeersatzprodukten wird auch hier Acrylamid gebildet (Anese, M. „Acrylamid in Coffee and Coffee Substitutes, Acrylamid in Food, 2016, p.181 - 195). Die Richtwerte für Acrylamid der neuen EU-Verordnung liegen für Röstkaffee bei 400 pg/kg, für löslichen Kaffee bei 850 pg/kg, für Kaffeeersatzprodukte ausschließlich aus Getreide bei 500 pg/kg und für Produkte aus Zichorie bei 4000 pg/kg.
[0004] Acrylamid entsteht auch bei einer Vielzahl von (anderen) Prozessen in der Lebens- und Genussmittelindustrie. So entsteht beispielsweise beim Frittieren von Kartoffeln Acrylamid. Es ist vorteilhaft oder ggf. sogar nötig, dieses aus der Halbfertigware oder Fertigware teilweise oder vollständig zu entfernen, insbesondere um einerseits den Anforderungen der EU Verordnung (EU 2017/2158) zu genügen und andererseits ein sicheres und für den Verbraucher unbedenkliches Endprodukt zu erhalten. [0005] Zwar gibt es eine Vielzahl von Versuchen den Acrylamidgehalt in Lebens- und
Genussmitteln zu senken, diese sind aber nicht in der Lage, Acrylamid schonend und zu wirtschaftlich vertretbaren Kosten fast vollständig oder vollständig zu entfernen. So wird in der Patentanmeldung EP 3254568 A1 der Acrylamidgehalt
nach der Kaffeeextraktion durch Verwendung eines kationischen Harzes gesenkt, indem das Acrylamid absorbiert wird. Dieses Verfahren benötigt einen zusätzlichen Verfahrensschritt und ist zeitintensiv, da die Absorption ein kinetisch langsamer Schritt ist. Weiterhin könne auch nur ein Anteil von 50% des Ac- rylamids entfernt werden, und das kationische Harz stellt eine zusätzliche Kostenbelastung im Prozess dar.
[0006] Ein weiterer Weg, das Acrylamid zu reduzieren, ist es, die Vorstufen zu reduzieren. Hiermit beschäftigt sich die Patentanmeldung WO 2013/005145 A1 . In dieser wird ein Verfahren zur Reduktion von Asparagin sowie Asparaginsäure offenbart, welches vor dem Röstvorgang ansetzt. Durch die Reduzierung des Asparagin- gehalts vor der Röstung wird zwar der Acrylamidgehalt des Endprodukts reduziert, jedoch wird das Geschmacksprofil des Endproduktes modifiziert. Weiterhin ist dieses Verfahren kostenaufwendig für den Anwender, da zusätzlich eine neue Anlage benötigt wird, um dieses Verfahren durchzuführen. [0007] Einen weiteren Ansatz wählen die Autoren des Patents EP 1745702 B1 , welches sich auch mit der Enzym-unterstützenden Produktion von Kaffee befasst. Hierbei wird die Stärke der Kaffeebohnen enzymatisch abgebaut und schon in ihre einzelnen Bausteine zerlegt, um ein verbessertes Geschmacksprofil im Endprodukt zu erhalten. Hierbei entsteht durch die hohe Verfügbarkeit von Monosacchariden mehr Acrylamid als bei Standardkaffeeprodukten. Hierdurch wird deutlich, dass der richtige Zeitpunkt einer Enzymbehandlung für die Reduzierung des Acrylamidgehalts ausschlaggebend ist.
[0008] WO 2004/083423 A1 betrifft aus thermophilen Organismen isolierte thermisch stabile Amidasen, insbesondere Amidasen von thermophilen Actinomycetes wie z.B. Pseudonocardia thermophilia. Gemäß dem darin offenbarten Sequenzprotokoll wird in WO 2004/083423 A1 als SEQ ID NO. 3 die Aminosäuresequenz einer Amidase offenbart, welche angeblich von Pseudonocardia thermophilia stammt (entspricht SEQ ID NO. 56 dieser Anmeldung). Das Genom von Pseudonocardia thermophilia ist zwischenzeitlich komplett sequenziert und unter der GenBank-Nummer FRAP01000003.1 hinterlegt
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ FRAP01000003). Das Genom weist einen Gen-Lokus einer Amidase im Bereich 50704-52245 auf; das Protein ist unter GenBank SHK14489.1 hinterlegt. Ein Sequenzalignment der hinterlegten Amidase im Vergleich zur Wildtyp Amidase der (nicht-erfindungsgemäßen) SEQ
ID NO.2 weist eine Identität von 100% über die gesamte Länge des Proteins auf. Die Aminosäuresequenz gemäß WO 2004/083423 A1 scheint jedoch fehlerhaft, insbesondere im Sequenzabschnitt der ersten ca. 100 N-terminalen Aminosäurereste. Diese Sequenzungenauigkeiten können vor allem durch die damaligen verfügbaren Sequenzierungsmethoden entstanden sein, sodass die SEQ ID NO.
3 der WO 2004/083423 A1 unter heutigen Gesichtspunkten fehlerhaft ist. Die korrekte Aminosäuresequenz der Wildtyp Amidase aus Pseudonocardia thermo- philia ist somit vielmehr die vorliegende (nicht-erfindungsgemäße) SEQ ID NO. 2. Ein Sequenzalignment von SEQ ID NO. 3 gemäß WO 2004/083423 A1 im Vergleich zur Wildtyp Amidase aus Pseudonocardia thermophilia gemäß der vorliegenden SEQ ID NO. 2 ergibt lediglich 447 von 528 identischen Positionen (Identity: 84,7%) sowie 458 von 528 ähnliche Positionen (Similarity: 86,7%).; das Alignment ist in Abbildung 1 gezeigt.
[0009] Der Abschlussbericht der Technischen Universität Hamburg zu dem Projekt, das anscheinend in Bezug zu der Anmeldung WO 2004/083423 steht, aus Dezember
2005 mit dem Titel "Einsatz von Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen für die enantioselektive Synthese von Amino- und Carbonsäuren AZ 13107' (https://www.dbu.de/projekt_13107/01_db_2409.html) enthält ergänzende Informationen. An diesem Projekt haben die Erfinder der WO 2004/083423 A1 laut Projektbeschreibung mitgearbeitet. Demnach wurden Teile der Proteinsequenz von aus Pseudonocardia thermophilia isolierten Amidasen sequenziert und mit deren Hilfe das mutmaßliche Amidase-Gen im Organismus mittels PCR amplifi- ziert und sequenziert. Bei Versuchen zur Herstellung der rekombinanten Amidase durch Expression in E. coli Wirtssystemen wurde die durch PCR ampli- fizierte Gensequenz in den Arabinose-induzierten Expressionsvektor pBad-Thio-
TOPO kloniert. Die Expression des Proteins mit einer Größe von 54 kDa konnte zwar mittels SDS-PAGE nachgewiesen werden, in enzymatischen Tests mit Substraten, welche vom nativen Protein umgesetzt werden, konnte indes keine Aktivität der rekombinanten Amidase aus Pseudonocardia thermophilia nachge- wiesen werden. Die Offenbarung von WO 2004/083423 A1 ist somit für einen
Fachmann erkennbar nicht ausführbar.
[0010] EP 0272 024 A2 betrifft ein Verfahren zur Zersetzung von Acrylamid unter Verwendung einer Amidase.
[0011] M. Cha, Eur Food Res Technol (2013) 236:567-571 betrifft die enzymatische Kontrolle des Gehalts an Acrylamid in Kaffee mit Hilfe von Enzymen aus Ralsto- nia eutropha und Geobacillus thermoglucasidasius. Die Publikation benennt keine konkrete Enzymsequenz, derzeit bekannte Enzyme aus Ralstonia eu- tropha haben maximal eine Identität von etwa 36,4% und derzeit bekannte Enzyme aus Geobacillus thermoglucasidasius haben maximal eine Identität von etwa 53,3%, jeweils im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermophilia.
[0012] S. Raghavan et al., Microb Cell Fact (2019) 18:139 betrifft die Entwicklung und Anwendung eines Transkriptionssensors zur Detektion von heterologer Produk- tion von Acrylsäure in E. coli. In der Arbeit wird die Amidase RAPc8 aus Geobacillus pallidus benannt, die eine Identität von etwa 14% im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermophilia aufweist und mit diesem nicht verwandt ist.
[0013] T.K. Cheong et al., Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 152-158 betrifft die Klonierung einer Amidase von Bacillus stearothermophilus BR388 in E. coli. Die Amidase von Bacillus stearothermophilus BR388 weist eine Identität von etwa 14% im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermophilia auf und ist mit diesem nicht verwandt.
[0014] A. Karmali et al., Molecular Biotechnology, Vol. 172001 211-212 betrifft die Austausche von Thr-103-lle und Trp-138-Gly in Amidase aus Pseudomonas aerugi- nosa. Die Amidase aus Pseudomonas aeruginosa weist eine Identität von etwa
15% im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermophilia auf und ist mit diesem nicht verwandt.
[0015] N.J. Silman et al., J Gen Microbiol (1991) 137 169-178 betrifft die ungerichtete Evolution von Amidase-expimierendem Methylophilus methylotrophus durch Wachstumsselektion und chemische Mutagenese. Diese Amidase weist eine Identität von etwa 14% im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermophilia auf und ist mit diesem nicht verwandt.
[0016] M.S. Nawaz et al., J Bacteriol 19962397-2401 betrifft die physikalische, biochemische und immunologische Charakterisierung einer thermostabilen Amidase aus Klebsiella pneumoniae. Die Publikation benennt keine konkrete Enzymsequenz, derzeit bekannte Enzyme aus Klebsiella pneumoniae haben maximal eine
Identität von etwa 51 ,2% im Vergleich zum Enzym aus Pseudonoracdia thermo- philia.
[0017] Bei allen Verfahren, welche Enzyme verwenden, ist die Verwendung von Enzymen mit einer genauen Einstellung der Prozessvariablen verbunden. So gibt es für alle Enzyme einen Temperatur- und pH-Bereich (inkl. jeweiligem Optimum), bei der die Katalyse der jeweiligen Reaktion stattfindet oder stattfinden kann. Ein Einsatz außerhalb dieser Bereiche führt in der Regel dazu, dass das Enzym seine katalytische Funktion nicht oder nicht in gewünschtem Maße entfalten kann. Dies ist zum Beispiel oft bei Temperaturen über42°C bei nicht thermophilen Enzymen sowie deutlich sauren oder deutlich basischen pH-Werten der Fall. Eine Schwierigkeit bei Enzymprozessen liegt daher immer in der richtigen Auswahl oder Veränderung der Enzyme, damit diese zu den Prozessbedingungen passen.
[0018] Die primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, geeignete Enzyme sowie Verfahren zur Behandlung von Acrylamid beinhaltenden Zubereitungen be- reitzustellen, welche in der Lage sind, den Acrylamidgehalt in Zubereitungen, vorzugsweise um mindestens 80 Gew.-% im Vergleich zu der Zubereitung vor der Behandlung zu reduzieren, wobei die Enzyme vorzugsweise auch bei hohen Temperaturen, wie sie z.B. nach Schritten des Brühens, Frittierens, Röstens von Lebens- und Genussmitteln vorherrschend sind, und/oder bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7, ihre Enzymaktivität behalten und/oder eine hohe Stabilität aufweisen. Weitere Aufgabenstellungen, die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegen, ergeben sich aus den nachfolgenden Ausführungen und den beigefügten Ansprüchen.
[0019] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird primär gelöst, indem Enzyme (wie hierin und insbesondere in den Ansprüchen beschrieben), vorzugsweise
Amidasen, bereitgestellt werden, die tatsächlich in der Lage sind, die Menge an Acrylamid in einer Zubereitung signifikant zu reduzieren, und dies auch bei Temperaturen und pH-Werten, die für viele Amidasen ungünstig sind.
[0020] Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform solche Enzyme (wie hierin und insbesondere in den Ansprüchen beschrieben), vorzugsweise Amidasen, welche bis zu einer Temperatur von 50°C oder mehr sowie (auch) in einem pH-Bereich von pH 4 bis pH 7 katalytisch aktiv sind.
[0021] Zusätzlich wird ein geeignetes Verfahren zum Abbau von Acrylamid in einer Zubereitung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms (wie hierin und insbesondere in den Ansprüchen beschrieben) bereitgestellt, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung mit einem verringerten Acrylamidgehalt. [0022] Weiterhin werden Zubereitungen mit einem verringerten Acrylamidgehalt, erhalten durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, bereitgestellt.
[0023] Details der vorliegenden Erfindung, bevorzugte und alternative Ausgestaltungen und Aspekte ergeben sich aus den nachfolgenden Ausführungen, den beigefügten Sequenzen und insbesondere den beigefügten Ansprüchen. [0024] Abbildung 1 zeigt ein Alignment von SEQ ID NO. 65 (Zeilen „65“) und SEQ ID
NO. 2 (Zeilen „02“): Identity: 447/528 (84,7%), Similarity: 458/528 (86,7%), Gaps: 41/528 (7,8%), Sequence Coverage: 507/513 (98,8%).
[0025] SEQ ID NO. 1 beschreibt die Aminosäurekonsensussequenz erfindungsgemäßer Enzyme. [0026] SEQ ID NO. 2 beschreibt die (nicht erfindungsgemäße) Aminosäuresequenz der
Wildtyp-Amidase aus Pseudonocardia thermophila.
[0027] SEQ ID NO. 3 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 68 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (D68N).
[0028] SEQ ID NO. 4 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 74 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A74Y).
[0029] SEQ ID NO. 5 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (G445A).
[0030] SEQ ID NO. 6 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 33 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33F). [0031] SEQ ID NO. 7 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 33 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R).
[0032] SEQ ID NO. 8 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an Position 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (G445S).
[0033] SEQ ID NO. 9 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 74, 225, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, A74Y, S225T, G445S, A453C).
[0034] SEQ ID NO. 10 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S, A453C).
[0035] SEQ ID NO. 11 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A).
[0036] SEQ ID NO. 12 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche vier Mutationen an den Positionen 68, 74, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (D68N, A74Y, G445S, A453C). [0037] SEQ ID NO. 13 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche vier Mutationen an den Positionen 33, 68, 74 und 225 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33H, D68N, A74Y, S225T).
[0038] SEQ ID NO. 14 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche zwölf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448, 453 und 507 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, W41Y, D68N, A74Y,
V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P).
[0039] SEQ ID NO. 15 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448, 453 und 507 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P).
[0040] SEQ ID NO. 16 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D).
[0041] SEQ ID NO. 17 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche neun Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 201 , 225, 424, 445, und 448 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, W41Y, D68N, A74Y, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H). [0042] SEQ ID NO. 18 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche zwölf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448, 453 und 507 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453C, A507P).
[0043] SEQ ID NO. 19 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453N).
[0044] SEQ ID NO. 20 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I,
Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453Q).
[0045] SEQ ID NO. 21 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453E).
[0046] SEQ ID NO. 22 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche elf Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201 F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453K). [0047] SEQ ID NO. 23 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 454 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, P454N).
[0048] SEQ ID NO. 24 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 457 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, V457G).
[0049] SEQ ID NO. 25 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 424 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, L424V, G445A).
[0050] SEQ ID NO. 26 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453D).
[0051] SEQ ID NO. 27 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y, D68N, A74Y, S225T, G445A). [0052] SEQ ID NO. 28 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 175 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, G175A, S225T, G445A).
[0053] SEQ ID NO. 29 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 507 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A507P).
[0054] SEQ ID NO. 30 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453S).
[0055] SEQ ID NO. 31 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 94, 225 und 445 im Vergleich zu
SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, V94I, S225T, G445A).
[0056] SEQ ID NO. 32 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 317 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, V317I, G445A). [0057] SEQ ID NO. 33 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 201 , 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, Y201F, S225T, G445A).
[0058] SEQ ID NO. 34 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 445 und 448 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, M448H).
[0059] SEQ ID NO. 35 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 445 und 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453R).
[0060] SEQ ID NO. 36 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 221 , 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, P221G, S225T, G445A). [0061] SEQ ID NO. 37 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 217, 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, T217R, S225T, G445A).
[0062] SEQ ID NO. 38 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 328 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, D328R, G445A).
[0063] SEQ ID NO. 39 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche fünf Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S).
[0064] SEQ ID NO. 40 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 68, 74, 225, 229 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, D68N, A74Y, S225T, L229C, G445A).
[0065] SEQ ID NO. 41 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche sechs Mutationen an den Positionen 33, 41 , 68, 74, 225 und 445 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33R, W41Y, D68N, A74Y, S225T, G445A). [0066] SEQ ID NO. 42 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 225 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S225T).
[0067] SEQ ID NO. 43 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 33 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33Y).
[0068] SEQ ID NO. 44 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 317 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (V317I).
[0069] SEQ ID NO. 45 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453E). [0070] SEQ ID NO. 46 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 33 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33H).
[0071] SEQ ID NO. 47 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 33 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (S33H).
[0072] SEQ ID NO. 48 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453Q).
[0073] SEQ ID NO. 49 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 424 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (L424V).
[0074] SEQ ID NO. 50 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453C). [0075] SEQ ID NO. 51 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453K).
[0076] SEQ ID NO. 52 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453S).
[0077] SEQ ID NO. 53 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 454 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A454N).
[0078] SEQ ID NO. 54 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 507 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A507P).
[0079] SEQ ID NO. 55 beschreibt eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, welche eine Mutation an der Position 453 im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 enthält (A453N).
[0080] SEQ ID NO. 56 entspricht der Protein-Sequenz von Pseudonocardia thermophila wieals „SEQ ID NO. 3“ in WO 2004/083423 offenbart ist.
[0081] Die Aminosäureaustausche der erfindungsgemäßen SEQ ID NO. 3 bis 55 im Vergleich zu SEQ ID NO.2 (Wildtyp-Amidase aus Pseudonocardia thermophila )
5 sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst:
[0082] In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung bereitgestellt, umfassend oder bestehend aus eine(r) Aminosäurekonsensussequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , wobei die Aminosäurekonsensussequenz keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ist, und wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 3 bis SEQ ID NO. 55, umfasst oder daraus besteht. [0083] Wie oben erwähnt, beschreibt SEQ ID NO. 1 die Aminosäurekonsensussequenz erfindungsgemäßer Enzyme. Eine Konsensussequenz beschreibt die Aminosäuresequenz, welche alle erfindungsgemäßen Enzyme besitzen. Die variablen Positionen sind mit Xaa gekennzeichnet und stellen Positionen dar, in denen sich die erfindungsgemäßen Enzyme voneinander unterscheiden können. [0084] Enzyme sind biologische Katalysatoren, die eine bestimmte chemische Reaktion katalysieren. Im vorliegenden Fall, dem Abbau von Acrylamid durch eine Amidase, wird die Amidbindung des Acrylamids hydrolytisch gespalten, sodass
Acrylsäure sowie Ammoniak entstehen. Die Konzentrationen von Acrylsäure und Ammoniak oder ggf. daraus resultierenden Substanzen (im Falle des Weiterrea- gierens von Acrylsäure oder Ammoniak) sind in der Kaffeezubereitung derart gering, dass diese keine negativen Auswirkungen auf den Endverbraucher besit- zen. Zum Beispiel reagiert Ammoniak sofort zu ungefährlichem Ammonium weiter, welches keinerlei Auswirkungen auf das Endprodukt besitzt.
[0085] Wann immer die vorliegende Offenbarung auf Sequenzidentitäten von Aminosäuresequenzen in Form von Prozentangaben Bezug nimmt, beziehen sich diese Angaben auf Werte, wie sie unter Verwendung von EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotide) (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/psa/em- boss_water/nucleotide.html) für Nukleinsäuresequenzen bzw. EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/em- boss_water/) für Aminosäuresequenzen berechnet werden können. Bei dem vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Insti- tute (EBI) zur Verfügung gestellten Tools für lokale Sequenzalignments wird ein modifizierter Smith-Waterman Algorithmus verwendet (siehe http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ und Smith, T.F. & Waterman, M.S. „Identification of common molecular subsequences” Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1 ): 195-197). Ferner wird hierbei bei der Durchführung des jeweiligen paarweisen Alignments zweier Sequenzen unter Verwendung des modifizierten Smith-Waterman Algorithmus auf die vom EMBL-EBI derzeit angegebenen Default Parameter Bezug genommen. Diese lauten (i) für Aminosäuresequenzen: Matrix = BLOSUM62, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5 sowie (ii) für Nukleinsäuresequenzen: Matrix = DNAfull, Gap open penalty = 10 und Gap ex- tend penalty = 0,5. Über die Default Parameter hinaus muss beim Alignment einer zu untersuchenden Sequenz („Query Sequence“, bei EMBOSS die erste Sequenz) mit einer Vergleichssequenz („Subject Sequence“, bei EMBOSS die zweite Sequenz) die Subject Sequence mindestens zu 93% über die Länge des einzelnen Alignments vertreten sein („Sequence Coverage“ mindestens 93%); Aligments mit einer niedrigeren Sequence Coverage der Subject Sequence sind für die Bestimmung der Sequenzidentität im Sinne dieser Anmeldung ausgeschlossen. Die Query Sequence kann jedoch über die Länge des Alignments hinaus länger sein, und die im Alignment vertretenen Sequenzen der Query Sequence können über oder unter 93% liegen. Beispielsweise kommen im Align- ment der SEQ ID NO. 56 als Query Sequence mit der SEQ ID NO. 2 als Subject
Sequence (Abbildung 1) 507 Aminosäuren der insgesamt 513 Aminosäuren der Subject Sequence vor; die Sequence Coverage beträgt also 507/513 (98,8 %).
[0086] Der Ausdruck „Sequenzidentität“ ist daher im Kontext der vorliegenden Erfindung austauschbar mit „Sequenzhomologie“ verwendbar. Dieser bezieht sich immer auf die Gesamtlänge eines erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu der Gesamtlänge eines Enzyms, zu dem die Sequenzidentität oder Sequenzhomologie bestimmt wird.
[0087] Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Zubereitung alle Roh-, Halbfertig- und Fertigwaren von Lebens- oder Genussmitteln oder Kosmetika, welche beispielhaft gebratene oder frittierte Kartoffelprodukte, geröstetes Getreide oder solches enthaltende Produkten, Maisprodukte, Kaffeeprodukte, z.B. fester oder flüssiger Kaffeeextrakt und Rohkaffee, Zichorienextrakt, Getreidekaffeeprodukte, Kaffeeersatzprodukte, Snacks, Weizenprodukte, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Sco- nes, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln, sein können.
[0088] Im Kontext der vorliegenden Erfindung gilt, dass ein erfindungsgemäßes Enzym keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 umfasst oder daraus besteht. SEQ ID NO.
2 beschreibt die Aminosäuresequenz des Wildtyp-Enzyms aus Pseudonocardia thermophila, aus dem die erfindungsgemäßen Enzyme hervorgegangen sind.
[0089] Es wurde ein Homologiemodell der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, also des Wildtyp-Enzymes aus Pseudonocardia thermophila erstellt. Dazu wurde die Software YASARA structure Version 20.10.4. L.64 verwendet mit dem mitgelieferten Makro hm_build.mcr. Es wurden die Standardeinstellungen beibehalten. Die Kristallstrukturen 3A1K, 3A1 I, 3IP4 und 2GI3 (https://www.rcsb.org/) wurden als Templates für das finale Homologiemodell verwendet, welches weitgehend auf der homodimeren Struktur 3A1K basiert, welcher die Amidase aus Rhodococ- cus sp. N-771 zugrunde liegt und welche in ihrer katalytisch aktiven Form als
Homo-Dimer vorliegt (https://www.rcsb.org/structure/3a1k). Ohne an eine wissenschaftliche Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, d.h. das Wildtyp-Enzym aus
Pseudonocardia thermophila, eine Faltstruktur vom Typ PDB 3A1K aufweist. Zum alpha-C-Atom des katalytischen Serins (194) haben folgende Aminosäurereste dabei folgenden Raumabstand: A74 (17.1 A), D68 (21 0Ä), A507 (23.2Ä), G445 (10.6Ä), L424 (11.6Ä), und S33 (21.8Ä). Untereinander haben folgende Reste folgenden Raumabstand: G445 zu L424 (13.1 A), G445 zu S33 (12.0Ä),
D68 zu A74 (8.3Ä), D68 zu A507 (16.0Ä). Innerhalb einer Raumkugel um G445 herum mit einem Radius von ca. 13Ä liegen daher das aktive Zentrum sowie L424 und S33. Die Reste D68 und A74 liegen in einer Loop-Struktur innerhalb einer Raumkugel mit einem Radius von 4.2Ä (vom Geometrischen Mittelpunkt beider Aminosäuren) oder in einer Raumkugel mit einem Radius von 6.5Ä ausgehend von C-alpha Atom von A74. Alle benannten Abstände beziehen sich jeweils auf die C-alpha Atome der Aminosäuren.
[0090] Weiterhin ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform im Kontext der vorliegenden Erfindung generell kein Wildtyp-Enzym aus Pseudonocardia thermophila zu benutzen. D.h., es ist im Rahmen einer Ausführungsform bevorzugt, dass eine
Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 nicht nur keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ist, sondern generell keine Sequenz einer Wildtyp-Amidase aus Pseudonocardia thermophila.
[0091] Andere (thermostabile) Amidasen aus Pseudonocardia thermophila werden z.B. in WO 2004/083423 A1 (EP 1608746 B1) beschrieben, diese sind jedoch keine
Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung und können auch nicht als Wildtypenzym gemäß SEQ ID NO 2 gesehen werden.. Zudem wird in WO 2004/083423 A1 (EP 1608746) nicht belegt, dass die darin beschriebenen Enzyme im Sinne der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise im Lebensmittel- oder Genussmit- telbereich eingesetzt werden können, insbesondere nicht unter solchen Temperatur- und/oder pH-Bedingungen wie hierin beschrieben.
[0092] Erfindungsgemäße Enzyme können ausgehend vom Wildtyp-Enzym dadurch erhalten werden, dass ein oder mehrere Schritte (vorzugsweise der gerichteten, oder alternativ der ungerichteten, oder der gerichteten und ungerichteten) Muta- tion durchgeführt werden. Eine gerichtete Mutation ist die gezielte Veränderung einer oder mehrerer DNA-Basen des Enzymgens, welche zu einer oder mehreren gezielten Auswirkungen auf die Aminosäuresequenz führt. Ungerichtete Mutation ist hingegen die zufällige Mutagenese in einem nicht genau ausgewählten Teil der gesamten DNA-Sequenz. Im Anschluss der ungerichteten Mutagenese
wird untersucht, ob das resultierende Protein die gewünschten Eigenschaften aufweist. Bei dem zu verändernden Enzym kann es sich um ein Wildtyp-Enzym handeln. Dies war bei den Überlegungen und Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, der Fall. Unter einem Wildtyp-Enzym ist im Kontext der vorliegenden Erfindung ein natürlich vorkommendes, technisch unverändertes Enzym zu verstehen, welches entweder als funktionales Enzym oder dessen Sequenz aus der Natur isoliert wurde und wobei die Sequenz und daher auch das funktionale Enzym nicht von menschlicher Hand verändert wurden. In einer Ausführungsform kann das Enzym das Produkt einer iterativen ungerichteten Mutagenese sein. In einerweiteren Ausführungsform kann das Enzym das Produkt einer iterativen gerichteten Mutagenese sein.
[0093] Im Rahmen der den der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden ausgehend von einem Wildtyp-Enzym mehr als 2000 verschiedene Mutanten erzeugt, die alle verschiedene Mutationen an verschiedenen Stellen des Enzym- gens besitzen. Diese Mutanten wurden dann auf ihre Aktivität sowie Stabilität bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen getestet. Hieraus konnte dann in einem weiteren Mutagenese-Schritt das Enzym derartig verändert werden, dass eine erhöhte Aktivität und Stabilität im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym resultierte. Hierbei wurden die für die Katalyse relevanten Aminosäurereste nicht mu- tiert, insbesondere die katalytische Triade des Enzyms bestehend aus einem Lysin an Position 95, einem Serin an Position 170 und einem Serin an Position 194 werden nicht mutiert.
[0094] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt generell für ein erfindungsgemäßes Enzym, dass in der Aminosäuresequenz davon eine, mehrere oder sämtliche, vorzugsweise sämtliche dieser drei Positionen nicht mutiert sind bzw. an Position
95 der hierin beschriebenen erfindungsgemäß definierten Sequenzen vorzugsweise ein Lysin, und/oder an Position 170 der hierin beschriebenen erfindungsgemäß definierten Sequenzen vorzugsweise ein Serin, und/oder an Position 194 der hierin beschriebenen erfindungsgemäß definierten Sequenzen vorzugsweise ein Serin, vorzugsweise an Position 95 ein Lysin, an Position 170 ein Serin und an Position 194 ein Serin vorhanden ist.
[0095] Unter Aktivität wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit des Enzyms zum Katalysieren der hydrolytischen Spaltung der Amidbindung
pro Zeiteinheit bezeichnet, wohingegen die Stabilität die Restaktivität eines Enzyms bei verschiedenen Umgebungsbedingungen wie zum Beispiel pH-Wert und Temperatur nach einer bestimmten Zeit definiert. Geeignete Mutagenese-Ver- fahren sowie die notwendigen Bedingungen und Reagenzien sind dem Fach- mann hinlänglich bekannt. Mutationen finden auf Genebene statt, zum Beispiel durch den Austausch (der Substitution), das Entfernen (der Deletion) oder das Hinzufügen von Basen. Diese Mutationen wirken sich unterschiedlich auf die Aminosäuresequenz des daraus entstehenden Proteins aus. Bei der Substitution kann es zu sogenannten „nonsense“-Mutationen kommen, die dazu führen, dass die Proteinbiosynthese frühzeitig stoppt und dass das daraus resultierende Protein dysfunktional bleibt. Bei der sogenannten „missense“-Mutation ändert sich nur die codierte Aminosäure; diese Mutationen führen zu einer Funktionsänderung im resultierenden Protein und können im besten Fall eine verbesserte Stabilität oder Aktivität des resultierenden Proteins bedingen. In der allgemeinen No- menklatur werden Aminosäuresubstitutions-Mutationen aufgrund ihrer Position und der ausgetauschten Aminosäure gekennzeichnet, zum Beispiel als A143G. Diese Schreibweise bedeutet, dass an Position 143 der N- bis C-terminalen Aminosäuresequenz die Aminosäure Alanin gegen Guanin ausgetauscht wurde. Ganz besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es, wenn Substitutionsmutationen erzeugt werden.
[0096] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz (d.h. die von einem erfindungsgemäßen Enzym umfasste bzw. ein erfindungsgemäßes Enzym bildende Aminosäuresequenz, mit einer Sequenzidentität von mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , wobei die Aminosäuresequenz keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ist) wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 175, 201 , 217, 221 , 225, 229, 317, 328, 424, 445, 448, 453, 454, 457 und 507, eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0097] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 175 201 , 225, 317, 424, 445, 448, 453, 454, und 507 eine Aminosäure, die nicht der
Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0098] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 68, 74, 175201 , 225,
317, 424, 445, 448, 453, und 507, eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0099] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Ami- nosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 68, 74, 201 , 225, 424, 445, 448, 453, und 507 eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0100] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 68, 74, 175, 225, 317, 424, 445, 453, 454 und 507 eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht. [0101] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 68, 225, 424, 445, 453, und 507 eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht. [0102] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 424, und 445 eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0103] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 68, und 74 eine Aminosäure, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) derAminosäu- resequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
[0104] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz an der Position 33 ein Arginin oder ein Tyrosin oder ein Histidin oder ein Phenylalanin, und/oder an der Position 41 ein Tyrosin, und/oder an der Position 68 ein Asparagin, und/oder an der Position 74 ein Tyrosin, und/oder an der Position 94 ein Isoleucin, und/oder an der Position 175 ein Alanin, und/oder an der Position 201 ein Phenylalanin, und/oder an der Position 217 ein Arginin, und/oder an der Position 221 ein Glycin, und/oder an der Position 225 ein Threonin, und/oder an der Position 229 ein Cystein, und/oder an der Position 317 ein Isoleucin, und/oder an der Position 328 ein Arginin, und/oder an der Position 424 ein Valin, und/oder an der Position 445 ein Arginin oder ein Serin, und/oder an der Position 448 ein Histidin, und/oder an der Position 453 ein Aspartat oder ein Cystein oder ein Asparagin oder ein Glutamin oder ein Glutamat oder ein Lysin oder ein Arginin oder ein Serin, und/oder an der Position 454 ein Asparagin, und/oder an der Position 457ein Glycin, und/oder an der Position 507 ein Prolin. [0105] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz an der Position 33 ein Arginin oder ein Tyrosin, und/oder an der Position 68 ein Asparagin, und/oder an der Position 74 ein Tyrosin, und/oder an der Position 201 ein Phenylalanin, und/oder an der Position 225 ein Threonin, und/oder an der Position 424 ein Valin, und/oder an der Position 445 ein Alanin, und/oder an der Position 448 ein Histidin, und/oder an der Position 453 ein Aspartat oder ein Cystein.
[0106] Aus den oben beschriebenen bevorzugten Aminosäuren an den genannten Positionen ergeben sich für den Fall, dass von der Wildtyp-Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ausgegangen wird, folgende bevorzugte Ausführungsformen bzw. Ami- nosäuresubstitutionen:
[0107] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus S33R, S33Y, S33H, S33F, besonders bevorzugt eine Aminosäuresubstitution S33R, S33H oder S33Y. [0108] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution W41 Y.
[0109] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution D68N.
[0110] Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsform dervorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution A74Y.
[0111] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution V94I.
[0112] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution G175A. [0113] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution Y201 F.
[0114] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution T217R.
[0115] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Ami- nosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution P221 G.
[0116] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution S225T.
[0117] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution L229C. [0118] In wiederum einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution V317I.
[0119] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution D328R.
[0120] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution L424V. [0121] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus G445A und G445S, bevorzugt eine Aminosäuresubstitution G445A.
[0122] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution M448H.
[0123] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A453D, A543C, A453N, A453Q, A453E, A453K, A453R und A453S, besonders bevorzugt eine Aminosäuresubstitution A453D, A453Q, A453N oder A453C.
[0124] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution P454N.
[0125] Gemäß wiederum einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution V457G. [0126] In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz mindestens eine Aminosäuresubstitution A507P.
[0127] Aus dem vorliegenden Text ergibt sich für den Fachmann natürlich, dass eine oder mehrere der hierin beschriebenen, insbesondere der oben beschriebenen Aminosäuresubstitutionen bzw. die an den jeweiligen Positionen vorzugsweise vorhandenen Aminosäuren, in beliebiger Weise miteinander kombiniert werden können, um erfindungsgemäße Enzyme zu erhalten, ggf. in Kombination mit weiteren, hierin nicht beschriebenen Substitutionen bzw. anderen Aminosäuren als den Aminosäuren gemäß SEQ ID NO. 1 (vgl. hierzu die erfindungsgemäß beschriebene „Sequenzidentität von mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98% oder 99% zu einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1“). Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind hierbei solche Aminosäuresubstitutionen bevorzugt, die außerhalb funktioneller, insbesondere außerhalb katalytischer (vgl. hierzu oben), Bereiche liegen. [0128] Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Enzym, welches nicht anhand der
Konsensussequenz gemäß SEQ ID NO. 1 beschrieben ist, sondern unabhängig davon. Dieser weitere Aspekt der Erfindung betrifft ein Enzym zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 86%, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu SEQ ID NO. 2, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch aufweist in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(a) Position L424 bis Position A507; bevorzugt in Position G445; (b) Position S33 bis Position A74; oder
(c) Position G175 bis Position L229.
[0129] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Enzym eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu SEQ ID NO. 2, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens folgende Aminosäureaustausche aufweist:
S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S, S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K oder S33H, bevorzugt S33R, S33Y, S33H oder S33F - G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y,
G445S, G445T, G445C, G445N oder G445Q; bevorzugt G445A, oder G445S; und
L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F oder L424W; bevorzugt
[0130] Für diesen weiteren Aspekt der Erfindung gelten die Maßgaben über die Bestimmung von Sequenzidentitäten von Aminosäuresequenzen in Form von Prozentangaben entsprechend der vorstehenden Aspekte und Ausführungsformen unverändert. [0131] In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Enzym im Vergleich zu einem Enzym mit der SEQ ID NO. 2
(i) eine höhere Enzymaktivität bei der katalysierten Freisetzung von Ammoniak aus 25 mM Acrylamid in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 bei 40°C auf;
(ü) eine höhere Enzymaktivität bei der katalysierten Freisetzung von Ammoniak aus 25 mM Acrylamid in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5 bei 40°C auf;
(iü) einen höheren Tm 50-Wert in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 auf;
(iv) einen höheren Tm 50-Wert in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5 auf; und/oder
(v) eine höhere Restaktivität nach Inkubation für 24 h bei 50 °C in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0 auf.
Eine höhere (Enzym-)Aktivität bezeichnet eine höhere Aktivität eines Enzyms (wie oben definiert) in einer Probe im Vergleich zu einem anderen Enzym in entsprechender Probe. Entsprechend bezeichnet eine höhere Restaktivität (eines Enzyms) die Aktivität eines Enzyms (wie oben definiert) in einer Probe nach einer festgelegten Zeit im Vergleich zu einem anderen Enzym in entsprechender Probe. Die Bestimmung der Aktivität, Restaktivität und/oder des Tm-Werts wird dabei vorzugsweise wie im Experimentalteil beschrieben durchgeführt.
[0132] Das erfindungsgemäße Enzym weist im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf, bevorzugt wenigstens zwei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens drei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigs- tens vier Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens fünf Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sechs Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sieben Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens acht Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens neun Aminosäureaustausche, noch
bevorzugter wenigstens zehn Aminosäureaustausche und am bevorzugtesten wenigstens elf Aminosäureaustausche.
[0133] Das erfindungsgemäße Enzym weist im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 höchstens 23 Aminosäureaustausch auf, bevorzugt höchstens 22 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 21 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 20
Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 19 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 18 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 17 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 16 Aminosäureaustausche, bevorzugter höchstens 15 Aminosäureaustausche, noch bevorzugter höchstens 14 Aminosäureaustausche und am bevorzugtesten höchstens 13 Aminosäureaustausche.
[0134] In einer bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung und seiner vorstehenden Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 zusätzlich mindestens einen Aminosäureaustausch auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den
Positionen V94, V317, und D328.
[0135] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche auf, von denen - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt. [0136] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt.
[0137] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche auf, von denen - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzab- schnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(c) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt.
[0138] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; oder - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt.
[0139] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfin- dungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(a-1) Position G445 bis V465; (a-2) Position L424 bis R444; (a-3) Position P487 bis A507; oder
(a-4) Position P466 bis A486.
[0140] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(b-1) Position S33 bis Position P53; oder
(b-2) Position T54 bis Position A74.
[0141] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenz- abschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(c-1) Position G212 bis Position L229;
(c-2) Position G193 bis Position H211 ; oder
(c-3) Position G175 bis Position G192.
[0142] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a- 3) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
2) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a- 3) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
2) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; oder
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt.
[0143] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfin- dungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a- 1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 1) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
2) liegt.
[0144] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfin- dungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2)
liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1)
liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(b-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1)
liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt
(c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1)
liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt.
[0145] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Amino- Säureaustausche auf, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt; oder - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt.
[0146] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Aminosäurese- quenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen, bevorzugt zwei, bevorzugter drei oder mehrere Aminosäureaustausche auf, ausgewählt aus der Gruppe der Positionen S33, W41 , D68, A74, V94, G175 Y201 , T217, P221 , S225, L229, V317, D328, L424, G445, M448, A453, P454, C457, und A507, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Positionen S33, W41 , D68, A74, V94, G175, Y201 , S225, V317, L424, G445, M448, A453, und A507, bevorzugter ausgewählt aus der Gruppe der Positionen S33, W41 , D68, A74, V94, Y201 , S225, L424, G445, M448, A453, und A507, und am bevorzugtesten ausgewählt aus der Gruppe der Positionen S33, W41 , D68, A74, V94, Y201 , S225, L424, G445, M448, A453. [0147] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen, bevorzugt zwei, bevorzugter drei oder mehrere Aminosäureaustausche auf, ausgewählt aus einer der Gruppen der Positionen
S33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, und A507; - S33, D68, A74, S225, L424, G445, A453, und A507;
S33, L424, G445, und A453;
S33, L424, und G445;
L424, und G445;
S33, D68, A74, und A507;
D68, A74, und A507; oder - D68, und A74.
[0148] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen, mehrere oder alle Aminosäureaustausche aufweist, ausgewählt aus den Positionen S33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, und A507; be- vorzugt alle der Positionen SS33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, und
A507; S33, D68, A74, S225, L424, G445, A453, und A507; S33, L424, G445, und A453; S33, L424, und G445; L424, und G445; S33, D68, A74, und A507; D68, A74, und A507; oder D68, und A74.
[0149] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens in einer der folgenden Positionen keinen Aminosäureaustausch auf: E24, S25, D26, L27, P28, A32, S33, T35, L37, L38, S40, W41 , N42, K43, V44, E45, E46, Y48, A49, E50, V51 , A52, P53, T54, , Q57, S59, W60, T61 , R62, P63, A65, E66, D67, D68, K69, A72, W73, V75, Q76, T77, S78. I79, T80, E81 , T82, S83, E84, G85, P86, L87, A88, T91 , V92, A93, V94, K95, P156, S170, S194, I330, N348 und E509 (vgl. Abbildung 1), weiter bevorzugt wenigstens in einer der folgenden Positionen keinen Aminosäureaustausch auf: E24, S25, D26, L27, P28, A32, T35, L37, L38, S40, W41 , N42, K43, V44, E45, E46, Y48, A49, E50, V51 , A52, P53, T54, , Q57, S59, W60, T61 , R62, P63, A65, E66, D67, D68, K69, A72, W73, V75, Q76, T77, S78. I79, T80, E81 , T82, S83, E84, G85, P86, L87, A88, T91 , V92, A93, V94, K95, P156, S170, S194, I330, N348 und E509 (vgl. Abbildung 1), wobei hierbei in einer besonders bevorzugten Ausführungsform an Position S33 keine Substitution zu Alanin vorliegt. Die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz ist verschieden von SEQ ID NO. 3 gemäß WO 2004/083423 A1 . [0150] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position G445 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N, G445Q, G445D, G445E, G445R, G445K und
G445H; bevorzugt G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N und G445Q; bevorzugter G445A und G445S.
[0151] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A453 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus A453G, A453V, A453L, A453I, A453M, A453P, A453F, A453W, A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugt A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugter A453C, A453D, A453E, A453K, A453N, A453Q, A453R und A453S.
[0152] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position L424 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F, L424W, L424Y, L424S, L424T, L424C, L424N, L424Q, L424D, L424E, L424R, L424K und L424H; bevorzugt L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F und L424W; bevorzugter L424V.
[0153] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position M448 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus M448G, M448A, M448V, M448L, M448I, M448P, M448F, M448W, M448Y, M448S, M448T, M448C, M448N, M448Q, M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugt M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugter M448H.
[0154] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A507 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F, A507W, A507Y, A507S, A507T, A507C, A507N, A507Q, A507D, A507E, A507R, A507K, A507H; bevorzugt A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F und A507W; bevorzugter A507P.
[0155] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position S33 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S, S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K und S33H; bevorzugt
S33F, S33R, S33H und S33Y.
[0156] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position W41 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus W41G, W41A, W41V, W41 L, W41 I, W41M, W41P, W41 F, W41Y, W41S, W41T, W41 C, W41 N, W41 Q, W41 D, W41 E, W41 R, W41 K und W41 H; bevorzugt W41Y, W41S, W41T, W41C, W41N und W41Q; bevorzugter W41Y.
[0157] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position D68 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus D68G, D68A, D68V, D68L, D68I, D68M, D68P, D68F, D68W, D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N, D68Q, D68E, D68R, D68K und D68H; bevorzugt D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N und D68Q; bevorzugter D68N.
[0158] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A74 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus A74G, A74V, A74L, A74I, A74M, A74P, A74F, A74W, A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N, A74Q, A74D, A74E, A74R, A74K und A74H; bevorzugt A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N und A74Q; bevorzugter A74Y. [0159] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V94 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F, V94W, V94Y, V94S, V94T, V94C, V94N, V94Q, V94D, V94E, V94R, V94K und V94H; bevorzugt V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F und V94W; bevorzugter V94I ist.
[0160] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position Y201 einen
Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201 M, Y201 P, Y201F, Y201W, Y201S, Y201T, Y201C, Y201N, Y201Q, Y201D, Y201E, Y201R, Y201K und Y201H; bevorzugt Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201M, Y201P, Y201F und Y201 W; bevorzugter Y201 F.
[0161] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position P221 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221 M, P221F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221C, P221N, P221Q, P221D, P221E, P221R, P221K und
P221H; bevorzugt P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221M, P221F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221C, P221N und P221Q; bevorzugter P221G und P221Q.
[0162] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfin- dungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position S225 einen
Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus S225G, S225A, S225V, S225L, S225I, S225M, S225P, S225F, S225W, S225Y, S225T, S225C, S225N, S225Q, S225D, S225E, S225R, S225K und S225H; bevorzugt S225Y, S225T, S225C, S225N und S225Q; bevorzugter S225T.
[0163] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position G175 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F, G175W, G175Y, G175S, G175T, G175C, G175N, G175Q, G175D, G175E, G175R, G175K und
G175H; bevorzugt G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F und G175W; bevorzugter G175A.
[0164] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position T217 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus T217G, T217A, T217V, T217L, T217I, T217M, T217P, T217F, T217W, T217Y, T217S, T217C, T217N, T217Q, T217D, T217E, T217R, T217K und
T217H; bevorzugt T217D, T217E, T217R, T217K und T217H; bevorzugter T217R.
[0165] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position L229 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus L229G, L229A, L229V, L229I, L229M, L229P, L229F, L229W, L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N, L229Q, L229D, L229E, L229R, L229K und L229H; bevorzugt L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N und L229Q; bevorzugter L229C. [0166] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V317 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F, V317W, V317Y, V317S, V317T, V317C, V317N, V317Q, V317D, V317E, V317R, V317K und V317H; bevorzugt V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F und
V317W; bevorzugter V317I.
[0167] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position D328 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus D328G, D328A, D328V, D328L, D328I, D328M, D328P, D328F, D328W,
D328Y, D328S, D328T, D328C, D328N, D328Q, D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugt D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugter D328R.
[0168] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position P454 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt aus P454G, P454A, P454V, P454L, P454I, P454M, P454F, P454W, P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N, P454Q, P454D, P454E, P454R, P454K und P454H; bevorzugt P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N und P454Q; bevorzugter P454N. [0169] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V457 einen Aminosäureaustausch auf. Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch ausgewählt
aus V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F, V457W, V457Y, V457S, V457T, V457C, V457N, V457Q, V457D, V457E, V457R, V457K und V457H; bevorzugt V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F und V457W; bevorzugter V457G.
[0170] In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Enzym im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf, bevorzugt wenigstens zwei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens drei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens vier Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens fünft Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sechs Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sieben Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens acht Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens neun Aminosäureaustausche, noch bevorzugter wenigstens zehn Aminosäureaustausche und am bevorzugtesten wenigstens elf Aminosäureaustausche, welche unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N, G445Q, G445D, G445E, G445R, G445K und G445H; bevorzugt G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N und G445Q; bevorzugter G445A und G445S;
A453G, A453V, A453L, A453I, A453M, A453P, A453F, A453W, A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugt A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugter A453C, A453D, A453E, A453K, A453N, A453Q, A453R und A453S;
L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F, L424W, L424Y, L424S, L424T, L424C, L424N, L424Q, L424D, L424E, L424R, L424K und L424H; bevorzugt L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F und L424W; bevorzugter L424V;
M448G, M448A, M448V, M448L, M448I, M448P, M448F, M448W, M448Y, M448S, M448T, M448C, M448N, M448Q, M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugt M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugter
A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F, A507W, A507Y, A507S, A507T, A507C, A507N, A507Q, A507D, A507E, A507R, A507K, A507H; bevorzugt A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F und A507W; bevorzugter A507P;
P454G, P454A, P454V, P454L, P454I, P454M, P454F, P454W, P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N, P454Q, P454D, P454E, P454R, P454K und P454H; bevorzugt P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N und P454Q; bevorzugter P454N;
V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F, V457W, V457Y, V457S, V457T, V457C, V457N, V457Q, V457D, V457E, V457R, V457K und V457H; bevorzugt V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F und V457W; bevorzugter V457G;
S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S, S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K und S33H; bevorzugt S33F, S33R, S33H und S33Y;
W41G, W41A, W41 V, W41L, W41 I, W41 M, W41 P, W41 F, W41Y, W41S, W41T, W41 C, W41 N, W41 Q, W41 D, W41 E, W41 R, W41 K und W41 H; bevorzugt W41Y, W41S, W41T, W41C, W41 N und W41Q; bevorzugter W41Y;
D68G, D68A, D68V, D68L, D68I, D68M, D68P, D68F, D68W, D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N, D68Q, D68E, D68R, D68K und D68H; bevorzugt D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N und D68Q; bevorzugter D68N;
A74G, A74V, A74L, A74I, A74M, A74P, A74F, A74W, A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N, A74Q, A74D, A74E, A74R, A74K und A74H; bevorzugt A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N und A74Q; bevorzugter A74Y;
V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F, V94W, V94Y, V94S, V94T, V94C, V94N, V94Q, V94D, V94E, V94R, V94K und V94H; bevorzugt V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F und V94W; bevorzugter V94I;
V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F, V317W, V317Y, V317S, V317T, V317C, V317N, V317Q, V317D, V317E, V317R, V317K und V317H;
bevorzugt V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F und V317W; bevorzugter V317I;
D328G, D328A, D328V, D328L, D328I, D328M, D328P, D328F, D328W, D328Y, D328S, D328T, D328C, D328N, D328Q, D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugt D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugter D328R;
Y201 G, Y201A, Y201 V, Y201 L, Y2011, Y201 M, Y201 P, Y201 F, Y201 W, Y201 S, Y201T, Y201C, Y201 N, Y201Q, Y201 D, Y201 E, Y201 R, Y201 K und Y201 H; bevorzugt Y201G, Y201A, Y201V, Y201 L, Y201 I, Y201 M, Y201 P, Y201 F und Y201W; bevorzugter Y201 F; und
S225G, S225A, S225V, S225L, S225I, S225M, S225P, S225F, S225W, S225Y, S225T, S225C, S225N, S225Q, S225D, S225E, S225R, S225K und S225H; bevorzugt S225Y, S225T, S225C, S225N und S225Q; bevorzugter S225T;
G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F, G175W, G175Y, G175S, G175T, G175C, G175N, G175Q, G175D, G175E, G175R, G175K und G175H; bevorzugt G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F und G175W; bevorzugter G175A;
T217G, T217A, T217V, T217L, T217I, T217M, T217P, T217F, T217W, T217Y, T217S, T217C, T217N, T217Q, T217D, T217E, T217R, T217K und T217H; bevorzugt T217D, T217E, T217R, T217K und T217H; bevorzugter T217R;
P221 G, P221A, P221V, P221 L, P221 I, P221 M, P221 F, P221W, P221Y, P221 S, P221T, P221C, P221 N, P221Q, P221 D, P221 E, P221 R, P221 K und P221 H; bevorzugt P221G, P221A, P221V, P221 L, P221 I, P221 M, P221 F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221 C, P221 N und P221Q; bevorzugter P221 G;
L229G, L229A, L229V, L229I, L229M, L229P, L229F, L229W, L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N, L229Q, L229D, L229E, L229R, L229K und L229H; bevorzugt L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N und L229Q; bevorzugter L229C.
[0171] In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Enzym im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch auf, bevorzugt
wenigstens zwei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens drei Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens vier Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens fünft Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sechs Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens sieben Aminosäureaustausche, bevor- zugter wenigstens acht Aminosäureaustausche, bevorzugter wenigstens neun
Aminosäureaustausche, noch bevorzugter wenigstens zehn Aminosäureaustausche und am bevorzugtesten wenigstens elf Aminosäureaustausche, welche unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N, G445Q, G445D, G445E, G445R, G445K und G445H; bevorzugt G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N und G445Q; bevorzugter G445A und G445S;
A453G, A453V, A453L, A453I, A453M, A453P, A453F, A453W, A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugt A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugter A453C, A453D, A453E, A453K, A453N, A453Q, A453R und A453S;
L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F, L424W, L424Y, L424S, L424T, L424C, L424N, L424Q, L424D, L424E, L424R, L424K und L424H; bevorzugt L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F und L424W; bevorzugter L424V;
M448G, M448A, M448V, M448L, M448I, M448P, M448F, M448W, M448Y, M448S, M448T, M448C, M448N, M448Q, M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugt M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugter M448H;
A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F, A507W, A507Y, A507S, A507T, A507C, A507N, A507Q, A507D, A507E, A507R, A507K, A507H; bevorzugt A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F und A507W; bevorzugter A507P;
S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S, S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K und S33H; bevorzugt S33F, S33R, S33H und S33Y;
W41G, W41A, W41 V, W41L, W41 I, W41M, W41P, W41F, W41Y, W41S, W41T, W41 C, W41 N, W41 Q, W41 D, W41 E, W41 R, W41 K und W41 H; bevorzugt W41Y,
W41S, W41T, W41C, W41N und W41Q; bevorzugter W41Y;
D68G, D68A, D68V, D68L, D68I, D68M, D68P, D68F, D68W, D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N, D68Q, D68E, D68R, D68K und D68H; bevorzugt D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N und D68Q; bevorzugter D68N; - A74G, A74V, A74L, A74I, A74M, A74P, A74F, A74W, A74Y, A74S, A74T, A74C,
A74N, A74Q, A74D, A74E, A74R, A74K und A74H; bevorzugt A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N und A74Q; bevorzugter A74Y;
V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F, V94W, V94Y, V94S, V94T, V94C, V94N, V94Q, V94D, V94E, V94R, V94K und V94H; bevorzugt V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F und V94W; bevorzugter V94I;
Y201 G, Y201A, Y201 V, Y201 L, Y2011, Y201 M, Y201 P, Y201 F, Y201 W, Y201 S, Y201T, Y201C, Y201 N, Y201Q, Y201D, Y201E, Y201 R, Y201K und Y201H; bevorzugt Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201M, Y201P, Y201F und Y201W; bevorzugter Y201F; und - S225G, S225A, S225V, S225L, S225I, S225M, S225P, S225F, S225W, S225Y,
S225T, S225C, S225N, S225Q, S225D, S225E, S225R, S225K und S225H; bevorzugt S225Y, S225T, S225C, S225N und S225Q; bevorzugter S225T.
[0172] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche auf, und zwar in Positionen
S33 und W41 ; S33 und D68; S33 und A74; S33 und V94; S33 und Y201 ; S33 und S225; S33 und L424; S33 und G445; S33 und M448; S33 und A453; oder S33 und A507;
W41 und D68; W41 und A74; W41 und V94; W41 und Y201 ; W41 und S225; W41 und L424; W41 und G445; W41 und M448; W41 und A453; oder W41 und A507;
D68 und A74; D68 und V94; D68 und Y201 ; D68 und S225; D68 und L424; D68 und G445; D68 und M448; D68 und A453; oder D68 und A507;
A74 und V94; A74 und Y201 ; A74 und S225; A74 und L424; A74 und G445; A74 und M448; A74 und A453; oder A74 und A507;
V94 und Y201 ; V94 und S225; V94 und L424; V94 und G445; V94 und M448; V94 und A453; oder V94 und A507; - Y201 und S225; Y201 und L424; Y201 und G445; Y201 und M448; oder Y201 und A453;
S225 und L424; S225 und G445; S225 und M448; S225 und A453; oder S225 und A507;
L424 und G445; L424 und M448; L424 und A453; oder L424 und A507; G445 und M448; G445 und A453; oder G445 und A507;
M448 und A453; oder M448 und A507; oder
A453 und A507.
[0173] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Amino- Säureaustausche auf, und zwar in Position G445 und in Position S33; in Position G445 und in Position D68; in Position G445 und in Position A74; in Position G445 und in Position S225; in Position S33 und in Position D68; in Position S33 und in Position A74;
in Position S33 und in Position S225; in Position S33 und in Position L424; in Position S33 und in Position M448; in Position D68 und in Position A74; - in Position D68 und in Position S225; in Position D68 und in Position A507; in Position A74 und in Position S225; in Position A74 und in Position A507; in Position L424 und in Position M448
[0174] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche auf, und zwar in Positionen
S33, W41 und D68; S33, W41 und A74; S33, W41 und V94; S33, W41 und Y201 ; S33, W41 und S225; S33, W41 und L424; S33, W41 und G445; S33, W41 und M448; S33, W41 und A453; S33, W41 und A507;
S33, D68 und A74; S33, D68 und V94; S33, D68 und Y201 ; S33, D68 und S225; S33, D68 und L424; S33, D68 und G445; S33, D68 und M448; S33, D68 und A453; S33, D68 und A507;
S33, A74 und V94; S33, A74 und Y201 ; S33, A74 und S225; S33, A74 und L424; S33, A74 und G445; S33, A74 und M448; S33, A74 und A453; S33, A74 und
A507;
S33, V94 und Y201 ; S33, V94 und S225; S33, V94 und L424; S33, V94 und G445; S33, V94 und M448; S33, V94 und A453; S33, V94 und A507;
S33, Y201 und S225; S33, Y201 und L424; S33, Y201 und G445; S33, Y201 und M448; S33, Y201 und A453; S33, Y201 und A507;
S33, S225 und L424; S33, S225 und G445; S33, S225 und M448; S33, S225 und A453; S33, S225 und A507;
S33, L424 und G445; S33, L424 und M448; S33, L424 und A453; S33, L424 und A507;
S33, G445 und M448; S33, G445 und A453; S33, G445 und A507;
S33, M448 und A453; S33, M448 und A507;
S33, A453 und A507;
W41 , D68 und A74; W41 , D68 und V94; W41 , D68 und Y201 ; W41 , D68 und S225; W41 , D68 und L424; W41 , D68 und G445; W41 , D68 und M448; W41 ,
D68 und A453; W41 , D68 und A507;
W41 , A74 und V94; W41 , A74 und Y201 ; W41 , A74 und S225; W41 , A74 und L424; W41 , A74 und G445; W41 , A74 und M448; W41 , A74 und A453; W41 , A74 und A507; - W41 , V94 und Y201 ; W41 , V94 und S225; W41 , V94 und L424; W41 , V94 und
G445; W41 , V94 und M448; W41 , V94 und A453; W41 , V94 und A507;
W41 , Y201 und S225; W41 , Y201 und L424; W41 , Y201 und G445; W41 , Y201 und M448; W41 , Y201 und A453; W41 , Y201 und A507;
W41 , S225 und L424; W41 , S225 und G445; W41 , S225 und M448; W41 , S225 und A453; A507;
W41 , L424 und G445; W41 , L424 und M448; W41 , L424 und A453; W41 , L424 und A507;
W41 , G445 und M448; W41 , G445 und A453; W41 , G445 und A507;
W41 , M448 und A453; W41 , M448 und A507; - W41 , A453 und A507;
D68, A74 und V94; D68, A74 und Y201 ; D68, A74 und S225; D68, A74 und L424; D68, A74 und G445; D68, A74 und M448; D68, A74 und A453; D68, A74 und A507;
D68, V94 und Y201 ; D68, V94 und S225; D68, V94 und L424; D68, V94 und G445; D68, V94 und M448; D68, V94 und A453; D68, V94 und A507;
D68, Y201 und S225; D68, Y201 und L424; D68, Y201 und G445; D68, Y201 und M448; D68, Y201 und A453; D68, Y201 und A507; - D68, S225 und L424; D68, S225 und G445; D68, S225 und M448; D68, S225 und A453; D68, S225 und A507;
D68, L424 und G445; D68, L424 und M448; D68, L424 und A453; D68, L424 und A507;
D68, G445 und M448; D68, G445 und A453; D68, G445 und A507; - D68, M448 und A453; D68, M448 und A507;
D68, A453 und A507;
A74, V94 und Y201 ; A74, V94 und S225; A74, V94 und L424; A74, V94 und G445; A74, V94 und M448; A74, V94 und A453; A74, V94 und A507;
A74, Y201 und S225; A74, Y201 und L424; A74, Y201 und G445; A74, Y201 und M448; A74, Y201 und A453; A74, Y201 und A507;
A74, S225 und L424; A74, S225 und G445; A74, S225 und M448; A74, S225 und A453; A74, S225 und A507;
A74, L424 und G445; A74, L424 und M448; A74, L424 und A453; A74, L424 und A507; - A74, G445 und M448; A74, G445 und A453; A74, G445 und A507;
A74, M448 und A453; A74, M448 und A507;
A74, A453 und A507;
V94, Y201 und S225; V94, Y201 und L424; V94, Y201 und G445; V94, Y201 und M448; V94, Y201 und A453; V94, Y201 und A507;
V94, S225 und L424; V94, S225 und G445; V94, S225 und M448; V94, S225 und A453; V94, S225 und A507; - V94, L424 und G445; V94, L424 und M448; V94, L424 und A453; V94, L424 und
A507;
V94, G445 und M448; V94, G445 und A453; V94, G445 und A507;
V94, M448 und A453; V94, M448 und A507;
V94, A453 und A507; - Y201 , S225 und L424; Y201 , S225 und G445; Y201 , S225 und M448; Y201 ,
S225 und A453; Y201 , S225 und A507;
Y201 , L424 und G445; Y201 , L424 und M448; Y201 , L424 und A453; Y201 , L424 und A507;
Y201 , G445 und M448; Y201 , G445 und A453; Y201 , G445 und A507; Y201 , M448 und A453; Y201 , M448 und A507;
Y201 , A453 und A507;
S225, L424 und G445; S225, L424 und M448; S225, L424 und A453; S225, L424 und A507;
S225, G445 und M448; S225, G445 und A453; S225, G445 und A507; - S225, M448 und A453; S225, M448 und A507;
S225, A453 und A507;
L424, G445 und M448; L424, G445 und A453; L424, G445 und A507;
L424, M448 und A453; L424, M448 und A507;
L424, A453 und A507;
G445, M448 und A453; G445, M448 und A507; - G445, A453 und A507; oder
M448, A453 und A507.
[0175] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche auf, und zwar in Positionen - S33, G448 und A453; oder
D68, A74, und A507.
[0176] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 mindestens zwei Aminosäureaustausche, bevorzugt mindestens drei Aminosäureaustausche, bevorzugter mindestens vier Aminosäureaustausche, und am bevorzugtesten alle fünf Aminosäureaustausche auf ausgewählt aus Positionen S33, D68, A74, S225, L424, G445 und A453.
[0177] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 eine Sequenzidentität von mindestens 86,0% auf, eine Sequenzidentität von mindestens 87% auf, eine
Sequenzidentität von mindestens 88% auf, bevorzugt von mindestens 89% auf, bevorzugt von mindestens 90% auf, bevorzugt mindestens 92%, noch bevorzugter mindestens 94%, am bevorzugtesten mindestens 96% und insbesondere mindestens 98%.
[0178] In einer bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung und seiner vorstehenden Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 zusätzlich mindestens einen Aminosäureaustausch auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen V94I, V317I, und D328R.
[0179] In bevorzugten Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms eine Sequenzidentität von mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, noch bevorzugter mindestens 97%, am bevorzugtesten mindestens 98% und insbesondere mindestens 99% zu SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46. 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54 oder 55 auf.
[0180] Zwar wurde schon in der WO 2006/040345 auf die Verwendung von anderen (nicht erfindungsgemäßen) Enzymen in Lebensmittelherstellungsprozessen hin- gewiesen, jedoch konnte hier nicht die Wirksamkeit in der Herstellung von Ac- rylamid-reduzierten Produkten gezeigt werden. Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Enzym möglich, Acrylamid in einer Zubereitung effizient und schnell abzubauen. Dies ist besonders vorteilhaft in kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Großmaßstabprozessen wie der Nahrungs- und Genussmittelin- dustrie, da hierdurch kurze Verweilzeiten in der Enzymbehandlung sowie eine schnelle Weiterverarbeitung etwaiger leicht verderblicher Halbfertigwaren gewährleistet ist. Ganz besonders bevorzugt und vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Enzym in der Kaffeeprodukt-/Kaffeeersatzprodukt-Herstellung eingesetzt werden, da der Abbau von Acrylamid ein essentieller Prozess ist, um ein sicheres und unbedenklich verzehrbares finales Lebensmittel zu erhalten.
[0181] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Enzym eine Amidase. Amidasen beziehungsweise Amidohydrolasen sind eine Klasse von Enzymen, die die Hydrolyse von Amidbindungen katalysieren. Amidasen kommen zahlreich in der Natur vor und werden in konventionellen Pro- dukten wie Waschmitteln oder Haushaltsreinigern eingesetzt. Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung von mindestens einer Amidase im Kontext der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ist, da diese mit einem sehr einfachen Mechanismus, welcher keine zusätzlichen Agenzien oder Co-Faktoren benötigt, die Amidbindung von Acrylamid spaltet.
[0182] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym dazu geeignet, bis zu einer Temperatur von 50°C oder mehr, vorzugsweise mindestens bis zu einer Temperatur von 60°C, besonders bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 70°C, weiter bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 80°C kata- lytisch aktiv zu sein, und/oder wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei einer solchen Temperatur eingesetzt. Katalytische Aktivität bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass eine nachweisbare Spaltung der Amidbindung des Acrylamids stattfindet. Eine Aktivität bei Temperaturen bis zu 80°C ist besonders bevorzugt im Kontext der vorliegenden Erfindung, da die meisten Proteine und Enzyme, welche nicht thermotolerant sind, bei einer Temperatur von über 42°C ihre Aktivität verlieren. Mithilfe eines erfindungsgemäßen Enzyms ist es vorteilhafterweise möglich, auch bei Temperaturen von bis zu 80°C eine katalytische Aktivität des Enzyms zu erhalten. Eine derart hohe Temperatur ist bei zahlreichen Prozessen im Lebens- und Genussmittelbereichs erforderlich, da wichtige Gar-, Brüh- sowie Verarbeitungsprozesse bei Temperaturen über
50°C, z.T. bis hin zu 80°C oder mehr, ablaufen.
[0183] In wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym dazu geeignet, in einem Bereich von pH 4 bis pH 7 katalytische Aktivität aufzuweisen, und/oder wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in einem solchen pH-Be- reich eingesetzt. Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weist das
Enzym (wenigstens) in einem Bereich von pH 4 bis pH 6,5, vorzugsweise im Bereich von pH 4,5 bis pH 5,5 katalytische Aktivität auf. Selbstverständlich kann das Enzym auch außerhalb dieser pH-Bereiche katalytische Aktivität aufweisen bzw. im Rahmen der vorliegenden Erfindung in solchen Bereichen eingesetzt werden. Der pH-Wert spielt bei der Stabilität und Aktivität von Enzymen eine entscheidende Rolle. Ein pH-Wert über oder unter dem optimalen pH-Wert führt normalerweise zu einem teilweisen bis hin zu einem kompletten Aktivitätsverlust. Umso überraschender ist es, dass sich ein erfindungsgemäßes Enzym effizient in einem Acrylamidabbau-Schritt in Zubereitungen mit einem leicht sauren pH-Wert einsetzen lässt.
[0184] In einer Ausführungsform weist das Enzym bis zu einer Temperatur von 50°C oder mehr, vorzugsweise mindestens bis zu einer Temperatur von 60°C, besonders bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 70°C, weiter bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 80°C, (wenigstens) in einem Bereich
von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise in einem Bereich von pH 4 bis pH 6,5, vorzugsweise im Bereich von pH 4,5 bis pH 5,5, katalytische Aktivität für mindestens 24 Stunden, vorzugsweise mindestens 48 Stunden, besonders bevorzugt mindestens 72 Stunden auf. [0185] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Enzym bis zu einer
Temperatur von 50°C oder mehr, vorzugsweise mindestens bis zu einer Temperatur von 60°C, besonders bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 70°C, weiter bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 80°C, (wenigstens) in einem Bereich von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise in einem Bereich von pH 4 bis pH 6,5, vorzugsweise im Bereich von pH 4,5 bis pH 5,5, katalytische Aktivität auf. Selbstverständlich kann das Enzym auch außerhalb dieser pH-Bereiche katalytische Aktivität bis zu den genannten Temperaturen aufweisen und dementsprechend in solchen Bereichen eingesetzt werden.
[0186] Im Zusammenhang mit den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen konnten überraschenderweise Enzyme identifiziert werden, deren katalytische Aktivität auch in einem sauren pH-Bereich sowie bei hohen Temperaturen vorhanden ist oder erhalten bleibt. Ganz besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines solchen Enzyms in der Verwendung zum Acrylamidabbau bei der Kaf- fee-/Kaffeeersatzprodukt-Herstellung, z.B. zur Behandlung von Extrakten aus ge- röstetem/n Kaffee/ Kaffeeersatzprodukten. Nach der Extraktion besitzen solche Zubereitungen eine Temperatur von über 50°C, häufig sogar über 70°C oder gar über 80°C. Es ist allgemein bekannt, dass solche Extrakte einen leicht sauren pH-Wert besitzen. Natürlich vorkommende Enzyme weisen unter diesen Bedingungen häufig keine ausreichende katalytische Aktivität auf. Umso vorteilhafter ist es, erfindungsgemäße Enzyme in derartigen Zubereitungen einzusetzen, um Acrylamid effizient unter diesen Bedingungen abzubauen.
[0187] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst oder besteht das Enzym aus eine(r) Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 3 bis SEQ ID NO. 55, vorzugsweise aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22,
besonders bevorzugt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22.
[0188] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Enzym eine veränderte Amidase aus Pseudonocardia thermophila. Der Or- ganismus Pseudonocardia thermophila zeichnet sich durch seine Verbreitungsweise in eher heißeren Temperaturmilieus wie zum Beispiel Misthaufen, warme Quellen oder ähnliches aus. Der Organismus gehört zu den thermotoleranten Prokaryoten; er kann bei Temperaturen zwischen 40 und 50°C wachsen. Durch seine Angepasstheit an wärmere Umgebungen sind dessen Enzyme auch ther- motoleranter, jedoch ausgehend vom Wildtyp nicht über 50°C. Es ist überraschend, dass ausgehend von einem Enzym des Organismus Pseudonocardia thermophila eine Toleranz im sauren pH-Wertbereich erreicht werden konnte, da Pseudonocardia thermophila von Natur aus nicht säuretolerant ist.
[0189] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von Acrylamid, vorzugsweise zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, bestehend aus oder umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms (wie hierin beschrieben, vorzugsweise wie hierin als bevorzugt oder besonders vorteilhaft beschrieben),
(ii) Bereitstellen einer Mischung, vorzugsweise einer Zubereitung, enthaltend Ac- rylamid, und Hinzufügen des Enzyms aus Schritt (i),
(iii) Inkubieren des aus Schritt (ii) resultierenden Gemisches für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C,
(iv) optional: Erhitzen des aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Gemisches, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Temperatur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, wobei das Gemisch optional gekühlt wird, um ein Produkt zu erhalten, das einen geringeren Acrylamid-Gehalt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Mischung bzw. Zubereitung aufweist.
[0190] Inkubieren im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass die bereitgestellte Mischung aus Schritt (ii) bei einer bestimmten Temperatur für eine vorher bestimmte Zeit verweilt. Halten der Temperatur im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass die Temperatur des inkubierten Gemischs in Schritt (iii) für eine definierte Dauer nicht oder nicht wesentlich verändert wird. Geringfügige
Schwankungen in der Temperatur sind hierbei akzeptabel und vom Fachmann einschätzbar.
[0191] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Enzym rekombi- nant hergestellt werden, wobei geeignete Expressionsorganismen sowie -Bedingungen dem Fachmann geläufig sind. Weiterhin kann das Enzym ungereinigt als Lysat, teilweise aufgereinigt oder hoch aufgereinigt vorliegen. Geeignete Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
[0192] Das erfindungsgemäße Enzym kann in einer weiteren Ausführungsform als Lösung oder immobilisiert vorliegen. Geeignete Immobilisierungsverfahren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt.
[0193] Inaktivieren bezeichnet den durch eine extrem hohe Temperatur verursachten Aktivitätsverlust des Enzyms sowie die Entfaltung der Aminosäurekette des Enzyms. In wiederum einer weiteren Ausführungsform kann anschließend das inaktivierte Enzym mit dem Fachmann geläufigen Verfahren, wie zum Beispiel Filt- ration, Absorption oder Adsorption, aus der Zubereitung entfernt werden.
[0194] In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das in der anfangs bereitgestellten Mischung bzw. Zubereitung enthaltene Acrylamid das Produkt einer Maillard-Reaktion. Eine Maillard-Reaktion ist beispielsweise beim Frittieren oder Braten von Lebensmitteln zu beobachten und äußert sich in einer typischen Bräunung. Auch ist die Maillard-Reaktion essentiell beim Rösten von Kaffeeprodukten, um den typischen Röstgeschmack zu erhalten. Als Produkt der Maillard-Reaktion entsteht Acrylamid, welches im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem erfindungsgemäßen Enzym gespalten wird.
[0195] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorlie- genden Erfindung ist das enthaltene Acrylamid der bereitgestellten Zubereitung das Produkt einer Maillard-Reaktion und die Zubereitung eine der Ernährung o- derdem Genuss dienende Zubereitung oder eine kosmetische Zubereitung, oder
eine Halbfertigware zur Herstellung solcher Zubereitungen, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffelprodukten, geröstetem Getreide oder solches enthaltenden Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffee- extrakten und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreidekaffeeprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln.
[0196] Der Unterschied zwischen Halbfertig- und Fertigwaren liegt in ihrem Verarbeitungsgrad. Halbfertigwaren sind alle Produkte, welche noch einem weiteren Verarbeitungsschritt unterzogen werden. Dies können zum Bespiel Röstkaffeeex- trakte, Teige, Rohkaffee, Kartoffelerzeugnisse, etc. sein. Fertigwaren hingegen werden nicht weiterverarbeitet, sondern werden in ihrer Form abgepackt und an den Verbraucher abgegeben. Beispiele für Fertigwaren sind zum Beispiel Löskaffee, gebrauchsfertiges Kaffeepulver, Chips, Nudeln oder ähnliches.
[0197] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorlie- genden Erfindung beträgt der Acrylamidgehalt in dem erhaltenen Produkt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Produkts. Wann immer in der vorliegenden Offenbarung auf einen Wert kleiner als („<“) hingewiesen wird, so umfasst dieser Wertebereich - soweit möglich und sinnvoll - vorzugsweise auch 0. So handelt es sich beispielsweise bei der Angabe < 2000 pg/kg um einen Wertebereich von 0 bis 2000 pg/kg.
[0198] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann bzw. wird der Acrylamidgehalt um 60%, bevorzugt um 65%, besonders bevorzugt um 70%, weiterhin bevorzugt um 75%, besonders bevorzugt um 80%, weiterhin bevorzugt um 85%, besonders bevorzugt um 90%, weiterhin bevorzugt um 95% und ganz besonders bevorzugt um 100% reduziert (werden), im Vergleich zu einer Zubereitung, die nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen wurde.
[0199] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder einer kosmetischen Zubereitung mit reduziertem Acrylamidgehalt, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffelprodukten, geröstetem Getreide oder solches enthaltenden
Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffeeextrakte und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreidekaffeeprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflege mittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln, welches aus den folgenden Schritten besteht oder diese umfasst: (I) (a) Bereitstellen eines Produkts, erhalten durch ein erfindungsgemäßes Verfahren (wie hierin beschrieben, vorzugsweise wie hierin als bevorzugt oder besonders vorteilhaft beschrieben), und
(b) Weiterverarbeiten des Produkts und/oder Hinzufügen eines oder mehrerer weiterer Bestandteile, um die dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder die kosmetische Zubereitung zu erhalten, oder
(II) (i) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms (wie hierin beschrieben, vorzugsweise wie hierin als bevorzugt oder besonders vorteilhaft beschrieben),
(ii) Bereitstellen einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder kosmetischen Zubereitung, enthaltend Acrylamid, und Hinzufügen des erfindungsgemäßen Enzyms aus Schritt (i),
(iii) Inkubieren der aus Schritt (ii) resultierenden Zubereitung für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C,
(iv) optional Erhitzen der aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Zubereitung, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Temperatur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, wobei die inkubierte Zubereitung optional ge- kühlt wird, um eine Zubereitung zu erhalten, die einen geringeren Acrylamid-Ge- halt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Zubereitung aufweist. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Halbfertigware, deren Acrylamidgehalt reduziert wurde, zu einem Endprodukt weiterverarbeitet, um eine dem Genuss oder der Ernährung dienende oder kosmetische Zubereitung zu erhalten. In einer weiteren Ausführungsform wird eine Halbfertigware mit einem erfindungsgemäßen Enzym behandelt, um eine Zubereitung mit einem reduzierten Acrylamidgehalt zu erhalten. Diese Zubereitung kann dann auf über 90°C erhitzt werden, um das Enzym zu inaktivieren. In wiederum einerweiteren Ausführungsform kann anschließend das inaktivierte Enzym mit dem Fachmann geläufigen Verfahren, wie zum Beispiel Filtration, Absorption oder Adsorption, aus der Zubereitung entfernt werden.
[0200] Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms zum Abbau von Acrylamid und/oder zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder kos- metischen Zubereitung mit einem reduzierten Acrylamidgehalt, vorzugsweise von < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung. In einerweiteren Ausführungsform kann bzw. wird der Acrylamidgehalt um 60%, bevorzugt um 65%, besonders bevorzugt um 70%, weiterhin bevorzugt um 75%, besonders bevor- zugt um 80%, weiterhin bevorzugt um 85%, besonders bevorzugt um 90%, weiterhin bevorzugt um 95% und ganz besonders bevorzugt um 100% im Vergleich zu einer Zubereitung, in der nicht das erfindungsgemäße Enzym verwendet wurde, reduziert (werden).
[0201] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder kosmetische Zubereitung (vorzugsweise solche wie oben beschrieben), hergestellt oder herstellbar durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der Acrylamidgehalt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg ist (und/oder wobei der Acrylamid- Gehalt wie oben beschrieben, vorzugsweise wie oben als bevorzugt beschrie- ben, reduziert wird/ist), jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
[0202] Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind nachfolgend als Sätze 1 bis 18 zusammengefasst:
Satz 1. Enzym zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, umfassend oder bestehend aus eine(r) Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer
Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , wobei die Aminosäuresequenz keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ist.
Satz 2. Enzym nach Satz 1 , wobei die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 175, 201 , 217, 221 , 225, 229, 317, 328, 424, 445,
448, 453, 454, 457 und 507, eine Aminosäure besitzt, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
Satz 3. Enzym nach Satz 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens an einer, mehreren oder sämtlichen Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 33, 41 , 68, 74, 94, 201 , 225, 424, 445, 448 und 453, eine Aminosäure besitzt, die nicht der Aminosäure der entsprechenden Position(en) der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
Satz 4. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, wobei die Aminosäuresequenz an der Position 33 ein Arginin oder ein Tryptophan oder ein Histidin oder ein Phe- nylalanin besitzt, und/oder an der Position 41 ein Tryptophan besitzt, und/oder an der Position 68 ein Asparagin besitzt, und/oder an der Position 74 ein Tryptophan besitzt, und/oder an der Position 94 ein Isoleucin besitzt, und/oder an der Position 175 ein Alanin besitzt, und/oder an der Position 201 ein Phenylalanin besitzt, und/oder an der Position 217 ein Arginin besitzt, und/oder an der Position 221 ein Glycin besitzt, und/oder an der Position 225 ein Threonin besitzt, und/oder an der Position 229 ein Cystein besitzt, und/oder an der Position 317 ein Isoleucin besitzt, und/oder an der Position 328 ein Arginin besitzt, und/oder an der Position 424 ein Valin besitzt, und/oder an der Position 445 ein Alanin besitzt, und/oder an der Position 448 ein Histidin besitzt, und/oder an der Position 453 ein Aspartat oder ein Cystein oder ein Asparagin oder ein Glutamin oder ein Glutamat oder ein Lysin oder ein Arginin oder ein Serin oder ein Asparagin besitzt, und/oder an der Position 454 ein Asparagin besitzt, und/oder an der Position 457 ein Glycin besitzt, und/oder an der Position 507 ein Prolin besitzt.
Satz 5. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, wobei die Aminosäuresequenz an der Position 33 ein Arginin oder ein Tryptophan besitzt, und/oder an der Position 68 ein Asparagin besitzt, und/oder an der Position 74 ein Tryptophan besitzt, und/oder an der Position 201 ein Phenylalanin besitzt, und/oder an der Position 225 ein Threonin besitzt, und/oder an der Position 424 ein Valin besitzt, und/oder an der Position 445 ein Alanin besitzt, und/oder an der Position 448 ein Histidin besitzt, und/oder an der Position 453 ein Aspartat oder ein Cystein besitzt.
Satz 6. Enzym zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, umfassend oder bestehend aus eine(r) Aminosäurekonsensussequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , wobei die Aminosäuresequenz keine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 ist und wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 3 bis SEQ ID NO. 41 , umfasst oder daraus besteht. Satz 7. Enzym nach Satz 6, wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22, umfasst oder daraus besteht.
Satz 8. Enzym nach Satz 6 oder 7, wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22, umfasst oder daraus besteht.
Satz 9. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, wobei das Enzym eine Amidase ist.
Satz 10. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, wobei das Enzym bis zu einer Temperatur von 50°C oder mehr, vorzugsweise mindestens bis zu einer Temperatur von 60°C, besonders bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 70°C, weiter bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 80°C katalytische Aktivität aufweist; und/oder wobei das Enzym in einem Bereich von pH 4
bis pH 7 katalytische Aktivität aufweist, vorzugsweise wobei das Enzym in einem Bereich von pH 4 bis pH 6,5, weiter vorzugsweise im Bereich von pH 4,5 bis pH 5,5 katalytische Aktivität aufweist; vorzugsweise wobei das Enzym bis zu einer Temperatur von 50°C oder mehr, vorzugsweise mindestens bis zu einer Tempe- ratur von 60°C, besonders bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von
70°C, weiter bevorzugt mindestens bis zu einer Temperatur von 80°C, in einem Bereich von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise in einem Bereich von pH 4 bis pH 6,5, vorzugsweise im Bereich von pH 4,5 bis pH 5,5, katalytische Aktivität aufweist.
Satz 11. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, umfassend oder bestehend aus eine(r) Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 3 bis SEQ ID NO. 41 , vorzugsweise aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22, besonders bevorzugt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 und SEQ ID NO. 22.
Satz 12. Enzym nach einem der vorangehenden Sätze, wobei das Enzym eine veränderte Amidase aus Pseudonocardia thermophila ist. Satz 13. Verfahren zum Abbau von Acrylamid, vorzugsweise zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, bestehend aus oder umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen eines Enzyms nach einem der Sätze 1 bis 12; (ii) Bereitstellen einer Mischung, vorzugsweise einer Zubereitung, enthaltend Acrylamid, und Hinzufügen des Enzyms aus Schritt (i); (iii) Inkubieren des aus Schritt (ii) resultieren- den Gemisches für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, weiter bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C; (iv) optional: Erhitzen des aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Gemisches, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Tem- peratur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, und optional Kühlen des Gemisches; um ein Produkt zu erhalten, das einen geringeren Acrylamid-Gehalt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Mischung bzw. Zubereitung aufweist.
Satz 14. Verfahren nach Satz 13, wobei in Schritt (ii) eine Zubereitung enthaltend Acrylamid bereitgestellt wird, wobei das enthaltene Acrylamid vorzugsweise das Produkt einer Maillard-Reaktion ist, und wobei die Zubereitung eine der Ernährung oder dem Genuss dienende Zubereitung oder eine kosmetische Zuberei- tung ist, oder eine Halbfertigware zur Herstellung solcher Zubereitungen, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffelprodukten, geröstetem Getreide oder solches enthaltenden Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffeeextrakten und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreidekaffeeproduk- ten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpfle- gemittel, und Gesichtspflegemitteln.
Satz 15. Verfahren nach einem der Sätze 13 oder 14, wobei der Acrylamidgehalt in dem erhaltenen Produkt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg beträgt, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Produkts.
Satz 16. Verfahren zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder einer kosmetischen Zubereitung mit reduziertem Acrylamidgehalt, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffelprodukten, geröstetem Getreide o- der solches enthaltenden Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffeeextrakten und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreide- kaffeeprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarsty- lingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln bestehend aus oder umfassend die Schritte: (I) (a) Bereitstellen eines Produkts, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Sätze 13 bis 15; und (b) Weiterverarbeiten des Produkts und/oder Hinzufügen eines oder mehrerer weiterer Bestandteile, um die dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder die kosmetische Zubereitung zu erhalten; oder (II) (i) Bereitstellen eines Enzyms
nach einem der Sätze 1 bis 9; (ii) Bereitstellen einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder kosmetischen Zubereitung, enthaltend Acrylamid, und Hinzufügen des Enzyms aus Schritt (i); (iii) Inkubieren der aus Schritt (ii) resultierenden Zubereitung für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei ei- ner Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C; (iv) optional: Erhitzen der aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Zubereitung, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Temperatur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, und optional Kühlen der Zubereitung; um eine Zubereitung zu erhalten, die einen geringeren
Acrylamid-Gehalt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Zubereitung aufweist.
Satz 17. Verwendung eines Enzyms nach einem der Sätze 1 bis 12 zum Abbau von Acrylamid und/oder zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder kosmetischen Zubereitung mit einem reduzierten Ac- rylamidgehalt, vorzugsweise von < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
Satz 18. Dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder kosmetische Zubereitung, hergestellt oder herstellbar durch ein Verfahren gemäß einem der Sätze 13 bis 16, wobei der Acrylamidgehalt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg ist, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
[0203] Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mithilfe ausgewählter nicht limitierender Beispiele näher erläutert. 1 . Entwicklung eines Enzyms zum Abbau von Acrylamid in Kaffee:
1.1 Herstellung von Enzympräparaten
[0204] Die Gene, welche für eine Amidase und ihre Varianten kodieren, werden in das Expressionsplasmid pLE1A17 (Novagen) kloniert. Mit diesen Plasmiden werden anschließend Zellen von E. coli BL21 (DE3) transformiert.
[0205] Die Zellen werden in ZYM505 Medium ( F . William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234)) unter Zugabe von Kanamycin (50 mg/l) bei 37°C kultiviert und die Enzymexpression beim Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase mit IPTG auf 0,1 mM Endkonzentration induziert. Die Zellen werden nach der Induktion für ca. 20 h bei 30°C weiter kultiviert.
[0206] Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in Lysepuffer aufgeschlossen (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,2; 2 mM MgCL; 0,5 mg/mL Lysozym; 0,02 U/pL Nucleanase). Der Aufschluss erfolgt mechanisch entweder durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff oder mittels Ultraschall. Nach Zentrifugation und Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wurde der lösliche enzymhaltige Rohextrakt erhalten.
1.2 Bestimmung der Enzymaktivität
[0207] Für die Standard-Bestimmung der Amidase Aktivität wird die Freisetzung von Ammoniak aus Acrylamid bei einem pH-Wert von pH 5,5 und 40°C verfolgt. Eine
Amidase-Unit entspricht dabei der Freisetzung von 1 pmol Ammoniak pro Minute aus 25 mM Acrylamid in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 bei 40°C. Die Quantifizierung des freigesetzten Ammoniaks erfolgte z.B. mit dem Rapid Ammonia Kit von Megazymes. Die Aktivitäten angegeben in U/mL beziehen sich auf mL Rohextrakt mit einer optischen Diche (gemessen bei 600 nm) von 100.
[0208] Die Aktivität wird analog bei anderen pH-Werten (pH 5,0) und Temperaturen (50/60°C) bestimmt. Die gegenüber der Standard Aktivität veränderten Parameter werden dabei extra angegeben.
1.3 Bestimmung der Enzymstabilität 1.3.1 Bestimmung der Tm-Werte bei verschiedenen pH-Werten
[0209] Für die Erfassung der Temperaturstabilität einer Amidase wird der Tm 50-Wert bestimmt. Dazu wird ein enzymhaltiger Rohextrakt in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,5 bis pH 5,5) für 15 Minuten bei unterschiedlichen Temperaturen im Bereich von 25°C bis 85°C inkubiert. Anschließend werden die Rohextrakte für 15 Minuten auf Eis inkubiert, zentrifugiert, und mit dem Überstand wird dann die
Aktivitätsbestimmung unter Standardbedingungen gemäß Punkt 1.2 durchgeführt. Der Aktivitätswert der unbehandelten Probe wird auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte darauf normiert. Der Tm50-Wert entspricht der Temperatur, nach deren Behandlung das Enzym noch 50% aktiv ist. 1.3.2 Bestimmung der Stabilität bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen
[0210] Für die Untersuchungen zur Langzeitstabilität der Enzyme werden die Rohextrakte bei einem bestimmten pH-Wert (z.B. im Bereich pH 4,5 bis 5,5) und einer bestimmten Temperatur (z.B. im Bereich von 50 bis 75 °C) über einen längeren Zeitraum inkubiert. Es erfolgt eine regelmäßige Probennahme über einen Zeit- raum von 24 h, bei der die Proben mit 1 Volumenäquivalent 100 mM NaAc-Puffer pH 5,5 versetzt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Nach dem Auftauen werden die Proben zentrifugiert, und mit dem Überstand werden die Aktivitätsbestimmung unter Standardbedingungen entsprechend der Beschreibung unter Punkt 1.2 durchgeführt. Die Berechnung der prozentualen Restaktivi- tät erfolgt durch Vergleich der nach Inkubation ermittelten Aktivitätswerte mit der
Aktivität der unbehandelten Probe zum Zeitpunkt 0 h, wobei der Aktivitätswert der unbehandelten Probe auf 100% gesetzt wird und die nach Inkubation ermittelten Aktivitätswerte als prozentuale Restaktivität in Bezug dazu angegeben werden. 1.4 Untersuchungen der Enzymvarianten
[0211] Basierend auf der Wildtyp-Sequenz mit der SEQ ID NO. 2 wurden Einzelmutanten erzeugt und von diesen eine Auswahl an Aminosäuresubstitutionen miteinander kombiniert.
Tabelle 1 : Ergebnisse der Stabilitäts- und Aktivitätsbestimmungen (Standard-Bestimmung)
Stabilität Stabilität Aktivität
[0212] Wenn keine Daten in den Tabellen angegeben sind oder der Begriff n.b. (für „nicht bestimmt“) verwendet wird, wurden diese für die entsprechende Enzymvariante nicht erfasst.
[0213] Man erkennt, dass für die erfindungsgemäßen Enzyme die Stabilität bei Temperaturen über 50°C, sowie eine Aktivität bei hohen Temperaturen und einem sauren pH-Wert erreicht werden konnte. [0214] Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass die erfindungsgemäßen Enzyme, insbesondere die hierin als bevorzugt beschriebenen Enzyme, auch im Übrigen für die hierin, insbesondere einleitend, beschriebenen Zwecke und Anforderungen besonders geeignet sind.
1 .5 Untersuchung verschiedener Aminosäuresubstitutionen und deren Einfluss auf die Stabilität und Aktivität des Enzyms
[0215] Das Enzym mit der SEQ ID NO. 11 . wurde als Template benutzt und auf dessen Basis Einzelmutanten erzeugt. Die einzelnen Aminosäuresubstitutionen zeigen verschiedene Auswirkungen auf Aktivität und Stabilität der Enzyme. Für diese Charakterisierung wurden die Mutanten basierend auf den zwei Kriterien Stabili- tät und Aktivität selektiert. Die jeweiligen Eigenschaften hängen stark von den ausgetauschten Aminosäuren und deren Positionen ab. Insbesondere aus diesen Untersuchungen ergaben sich die erfindungsgemäß besonders geeigneten Enzyme (wie hierin beschrieben).
Tabelle 2: Ergebnisse der Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zum Enzym mit der SEQ ID NO. 11 (erfindungsgemäß, aber nicht besonders bevorzugt). Das HIT- Kriterium beschreibt jeweils die Eigenschaft auf die selektiert wurde. Einerseits ist dies eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu einem Enzym mit der SEQ ID NO. 11 , andererseits eine erhöhte Aktivität zu einem Enzym mit der SEQ ID NO. 11 .
1 .6 Untersuchung verschiedener Kombinationen von Mutationen und deren Auswir kung auf die Aktivität und Stabilität der Enzymvarianten
[0216] Es wurden verschiedene Einzelmutanten ausgehend von SEQ ID NO. 11 erzeugt und eine Auswahl von Aminosäuresubstitutionen wurde in Rekombinationsbanken miteinander kombiniert. Eine Auswahl von geeigneten Varianten wurde dann auf Stabilität und Aktivität untersucht.
Tabelle 3: Ergebnisse der verschiedenen Kombination von Aminosäuresubstitutionen und deren Auswirkung auf die Stabilität und Aktivität erfindungsgemäßer Enzyme
Stabilität Stabilität Aktivität
1 .7 Sättigungsmutagenese an Position 453
[0217] Es wurden sämtliche Aminosäuresubstitutionen an Position 453 in der Variante mit der SEQ ID NO. 16 untersucht. Dabei wurden Varianten mit erhöhter Aktivität erhalten, welche das Resultat einer verbesserten löslichen Expression in E. coli sind. Die Stabilität der Enzyme konnte erhalten werden.
Tabelle 4: Ergebnisse der Sättigungsmutagenese und deren Auswirkung auf die Stabilität und Aktivität erfindungsgemäßer Enzyme.
Stabilität Stabilität Aktivität
2. Herstellung beispielhafter erfindunqsqemäßer Produkte:
2.1 Verfahren zur Herstellung eines Acrylamid-reduzierten Kaffeeproduktes
2.1.1 Herstellung eines Kaffeeextraktes
[0218] Kaffeebohnen der Kaffeesorte Brazil Arabica werden auf einen Farbwert von 110 nach Neuhaus Neotec Colortest II geröstet. Durch das Rösten der Kaffeebohnen bei Temperaturen zwischen 145°C und 230°C wird Acrylamid gebildet. Der geröstete Kaffee wird auf der Kaffeemühle VT6 (Mahlkönig) auf Stufe 13 gemahlen. Der gemahlene Kaffee wird zunächst in den Perkolator einer Extraktionsanlage gefüllt und dann mit 70 L Wasser aufgefüllt, welches eine Temperatur von 85°C hat. Das Gemisch wird für eine Stunde quellen gelassen. Anschließend wird die Extraktion bei 85°C gestartet. Es werden 100 L Wasser durch den Perkolator bei
85°C und 6 bar Überdruck in einen Auffang behälter gefahren. Durch das heiße Wasser werden die löslichen Bestandteile des Kaffees herausgelöst, unter anderem auch Acrylamid.
2.1.2 Enzymatische Behandlung des Kaffeeextraktes
[0219] Im Anschluss an die Extraktion wird der erhaltene Kaffeeextrakt im Auffangbehälter auf eine Temperatur von 70°C erhitzt und bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wird ein erfindungsgemäßes Enzym, z.B. ein Enzym gemäß SEQ
ID NO. 22, hinzugegeben. Das Enzym wird in einer Menge hinzugegeben, dass eine Enzymkonzentration von 1000 U/L eingesetzt wird.
[0220] Das Enzym wird zum Extrakt gegeben, gerührt und für 30 Minuten bei 70°C inkubiert. Nach der Inkubation wird der Extrakt 15 Minuten lang auf 95°C erhitzt, um die Amidase zu inaktivieren. Der Extrakt wird dann heruntergekühlt und für die Gefriertrocknung vorbereitet.
[0221] Abhängig vom pH-Wert des Kaffeeextraktes werden unterschiedliche Reduktionsraten bezogen auf die Menge an Acrylamid erreicht. Je nach eingesetzter Menge des Enzyms können auch Acrylamidkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze erreicht werden. Jedoch war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Enzym bereitzustellen, welches sich auch unter wirtschaftlichen Punkten für den Einsatz in einer Kaffeematrix eignet. Bei z.B. einem pH von 4,8 und 1000 U/L des eingesetzten Enzyms wurde eine Acrylamidreduktion von 60% erreicht. Bei einem pH von 5,3 und 1000 U/L des eingesetzten Enzyms wurde eine Acrylamidreduktion von 90% erreicht. So wurden Acrylamid-reduzierte Produkte mit lediglich 554 bzw. 129 pg/ kg Acrylamid-Gehalt erhalten.
2.1.3 Weiterverarbeitung des Kaffeeextraktes nach Enzymbehandlung
[0222] Nach der Extraktion und der Enzymbehandlung wird der Kaffeeextrakt mithilfe der Gefrierkonzentration oder durch Eindampfen konzentriert. Die Konzentration ist ein Zwischenschritt, um den Feststoffgehalt im Extrakt zu erhöhen, da der erhaltene Extrakt nach der Extraktion einen Feststoffgehalt von ca. 2 - 6 Gew.-%. Für die Wirbelschichttrocknung wird ein Feststoffgehalt von mindestens 20 Gew.- % benötigt. Für die Gefriertrocknung ist ein höherer Feststoffgehalt vorteilhaft, allerdings nicht unbedingt notwendig.
[0223] Anschließend wird der konzentrierte Extrakt durch Gefrier- oder Wirbelschichttrocknung getrocknet und somit das Acrylamid-reduzierte Endprodukt (getrockneter Löskaffee) erhalten, welches in der Regel einen Feststoffgehalt von ca. 96 Gew.-% besitzt. 2.2 Verfahren zur Herstellung eines Acrylamid-reduzierten Kaffeeersatzproduktes
[0224] Als Kaffeeersatzprodukt kann z.B. die Zichorie verwendet werden. Hierfür wird die Wurzel der Zichorien Pflanze verwendet. Diese wird getrocknet, zerkleinert und wie Kaffee bei Temperaturen zwischen 150 und 200°C geröstet und anschließend gemahlen. Die Weiterverarbeitung zum löslichen, Acrylamid-redu- zierten Extrakt erfolgt auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 2.1 .2 für Kaffee beschrieben.
[0225] Der getrocknete, lösliche Zichorien Extrakt kann als Endprodukt oder als Mischzusatz, für z.B. Getreidekaffee oder Kaffee-Mixprodukte verwendet werden.
3. Bestimmung von Acrylamid-Gehalten sowie der Acrylamid-Reduktion: [0226] Die Acrylamid-Reduktion wird bestimmt, indem eine Probe eines bestimmten gerösteten Kaffees mit heißem Wasser extrahiert wird. Anschließend wird der Extrakt in zwei Portionen aufgeteilt und nur eine Portion mit Amidase behandelt und inkubiert. Die zweite Portion wird, bis auf den Zusatz von Amidase gleichbehandelt und dient als Vergleichsprobe. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Re- aktion durch einmaliges Erhitzen auf eine Temperatur, die das Enzym sicher denaturiert, gestoppt. Die Acrylamid Analyse in beiden Extrakten erfolgt gemäß DIN EN ISO 18862 mit LC-MS/MS. Aus den Acrylamid-Gehalten in der behandelten Probe und in der Vergleichsprobe wird die Reduktionsrate berechnet.
4. Sensorische Evaluierung:
Vergleichende sensorische Untersuchungen von verschiedenen Kaffeeextrakten und Extrakten von Kaffee-Ersatzstoffen durch ein geschultes Sensorik Panel ergaben keine wahrnehmbaren sensorischen Unterschiede zwischen den unbehandelten und den behandelten Extrakten.
5. Untersuchung verschiedener Aminosäuresubstitutionen und deren Einfluss auf die
Stabilität und Aktivität von SEQ ID NO.2:
[0227] Die Enzympräparate wurden analog Experiment 1 hergestellt (s. 1.1). Es wurden die gleichen Bedingungen für die Bestimmung der Enzymaktivität (s. 1 .2) und der Enzymstabilität (s. 1 .3) verwendet.
[0228] Basierend auf der Wildtyp-Sequenz mit der SEQ ID NO. 2 wurde der Einfluss verschiedener Aminosäuresubstitutionen und deren Einfluss auf die Aktivität (Tabelle 4) und die Stabilität (Tabelle 5) im Vergleich zur SEQ ID NO.2 bestimmt.
Tabelle 5: Auswirkung unterschiedlicher Aminosäuresubstitutionen auf die Aktivität von SEQ ID NO:2.
Tabelle 6: Auswirkung unterschiedlicher Aminosäuresubstitutionen auf die Stabilität von SEQ ID NO.2.
Claims
1. Ein Enzym zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % oder 99 % zu SEQ ID NO. 2, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch aufweist in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(a) Position L424 bis Position A507; bevorzugt in Position G445;
(b) Position S33 bis Position A74; oder (c) Position G175 bis Position L229.
2. Das Enzym nach Anspruch 1 , welches im Vergleich zu einem Enzym mit der SEQ ID NO. 2
(i) eine höhere Enzymaktivität bei der katalysierten Freisetzung von Ammoniak aus 25 mM Acrylamid in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 bei 40°C aufweist; (ii) eine höhere Enzymaktivität bei der katalysierten Freisetzung von Ammoniak aus
25 mM Acrylamid in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5 bei 40°C aufweist;
(iii) einen höheren Tm 50-Wert in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 aufweist;
(iv) einen höheren Tm 50-Wert in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5 aufweist; und/oder (v) eine höhere Restaktivität nach Inkubation für 24 h bei 50 °C in 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0 aufweist.
3. Das Enzym nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche aufweist, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; oder
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt. 4. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch aufweist in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(a-1) Position G445 bis V465; (a-2) Position L424 bis R444;
(a-3) Position P487 bis A507; oder
(a-4) Position P466 bis A486.
5. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch aufweist in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(b-1) Position S33 bis Position P53; oder (b-2) Position T54 bis Position A74.
6. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen Aminosäureaustausch aufweist in einer Position, welche in einem der folgenden Sequenzabschnitte von SEQ ID NO. 2 liegt:
(c-1) Position G212 bis Position L229;
(c-2) Position G193 bis Position H211; oder (c-3) Position G175 bis Position G192.
7. Das Enzym nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche aufweist, von denen
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-
2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-
3) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a- 3) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt;
der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-
2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a-3) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzab- schnitt (b-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b- 2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b-2) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-1) liegt und der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c-2) liegt.
8. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens drei Aminosäureaustausche aufweist, von denen der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(a) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzab- schnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; - der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (a) liegt, der zweite Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt; der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (b) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(b) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzab- schnitt (c) liegt; oder der erste Aminosäureaustausch in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt, der zweite Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt
(c) liegt, und der dritte Aminosäureaustausch ebenfalls in einer Position in Sequenzabschnitt (c) liegt.
9. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens in einer der folgenden Positio- nen keinen Aminosäureaustausch aufweist: E24, S25, D26, L27, P28, A32, S33,
T35, L 37, L38, S40, W41 , N42, K43, V44, E45, E46, Y48, A49, E50, V51 , A52, P53, T54, Q57, S59, W60, T61 , R62, P63, A65, E66, D67, D68, K69, A72, W73, V75, Q76, T77, S78, I79, T80, E81 , T82, S83, E84, G85, P86, L87, A88, T91 , V92, A93, V94, K95, P156, S170, S194, I330, N348 und E509.
10. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz verschieden ist von SEQ ID NO. 3 gemäß WO 2004/083423 A1 .
11 . Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position G445 einen Aminosäureaustausch aufweist.
12. Das Enzym nach Anspruch 10, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N, G445Q, G445D, G445E, G445R, G445K und G445H; bevorzugt G445A, G445V, G445L, G445I, G445M, G445P, G445F, G445W, G445Y, G445S, G445T, G445C, G445N und G445Q; bevorzugter
G445A und G445S.
13. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A453 einen Aminosäureaustausch aufweist.
14. Das Enzym nach Anspruch 12, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus A453G, A453V, A453L, A453I, A453M, A453P, A453F, A453W, A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugt A453Y, A453S, A453T, A453C, A453N, A453Q, A453D, A453E, A453R, A453K und A453H; bevorzugter A453C, A453D, A453E, A453K, A453N, A453Q, A453R und A453S.
15. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position L424 einen Aminosäureaustausch aufweist.
16. Das Enzym nach Anspruch 14, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F, L424W, L424Y,
L424S, L424T, L424C, L424N, L424Q, L424D, L424E, L424R, L424K und L424H; bevorzugt L424G, L424A, L424V, L424I, L424M, L424P, L424F und L424W; bevorzugter L424V.
17. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäurese- quenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position M448 einen Aminosäureaustausch aufweist.
18. Das Enzym nach Anspruch 16, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus M448G, M448A, M448V, M448L, M448I, M448P, M448F, M448W, M448Y, M448S, M448T, M448C, M448N, M448Q, M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugt M448D, M448E, M448R, M448K und M448H; bevorzugter
M448H.
19. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A507 einen Aminosäureaustausch aufweist.
20. Das Enzym nach Anspruch 18, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F, A507W, A507Y, A507S, A507T, A507C, A507N, A507Q, A507D, A507E, A507R, A507K, A507H; bevorzugt A507G, A507V, A507L, A507I, A507M, A507P, A507F und A507W; bevorzugter A507P.
21. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position S33 einen Aminosäureaustausch aufweist.
22. Das Enzym nach Anspruch 20, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus S33G, S33A, S33V, S33L, S33I, S33M, S33P, S33F, S33W, S33Y, S33S,
S33T, S33C, S33N, S33Q, S33D, S33E, S33R, S33K und S33H; bevorzugt S33F, S33R, S33H und S33Y.
23. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position W41 einen Aminosäureaus- tausch aufweist.
24. Das Enzym nach Anspruch 22, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus W41G, W41A, W41V, W41 L, W41 I, W41M, W41P, W41 F, W41Y, W41S, W41T, W41 C, W41 N, W41Q, W41 D, W41 E, W41 R, W41 K und W41 H; bevorzugt W41Y, W41 S, W41T, W41 C, W41 N und W41 Q; bevorzugter W41Y.
25. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position D68 einen Aminosäureaustausch aufweist.
26. Das Enzym nach Anspruch 24, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus D68G, D68A, D68V, D68L, D68I, D68M, D68P, D68F, D68W, D68Y, D68S, D68T, D68C, D68N, D68Q, D68E, D68R, D68K und D68H; bevorzugt D68Y,
D68S, D68T, D68C, D68N und D68Q; bevorzugter D68N.
27. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position A74 einen Aminosäureaustausch aufweist.
28. Das Enzym nach Anspruch 26, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus A74G, A74V, A74L, A74I, A74M, A74P, A74F, A74W, A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N, A74Q, A74D, A74E, A74R, A74K und A74H; bevorzugt A74Y, A74S, A74T, A74C, A74N und A74Q; bevorzugter A74Y.
29. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V94 einen Aminosäureaustausch aufweist.
30. Das Enzym nach Anspruch 28, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F, V94W, V94Y, V94S, V94T,
V94C, V94N, V94Q, V94D, V94E, V94R, V94K und V94H; bevorzugt V94G, V94A, V94L, V94I, V94M, V94P, V94F und V94W; bevorzugter V94I ist.
31. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position Y201 einen Aminosäureaus- tausch aufweist.
32. Das Enzym nach Anspruch 30, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus Y201G, Y201A, Y201V, Y201L, Y201 I, Y201M, Y201P, Y201F, Y201W, Y201S, Y201T, Y201C, Y201N, Y201Q, Y201D, Y201E, Y201R, Y201K und Y201 H; bevorzugt Y201 G, Y201A, Y201 V, Y201 L, Y2011, Y201 M, Y201 P, Y201 F und Y201W; bevorzugter Y201F.
33. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position P221 einen Aminosäureaustausch aufweist.
34. Das Enzym nach Anspruch 32, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221M, P221F, P221W, P221Y,
P221S, P221T, P221C, P221N, P221Q, P221D, P221E, P221R, P221K und P221H; bevorzugt P221G, P221A, P221V, P221L, P221 I, P221M, P221F, P221W, P221Y, P221S, P221T, P221C, P221N und P221Q; bevorzugter P221G und P221Q.
35. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position S225 einen Aminosäureaustausch aufweist.
36. Das Enzym nach Anspruch 34, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus S225G, S225A, S225V, S225L, S225I, S225M, S225P, S225F, S225W, S225Y, S225T, S225C, S225N, S225Q, S225D, S225E, S225R, S225K und
S225H; bevorzugt S225Y, S225T, S225C, S225N und S225Q; bevorzugter S225T.
37. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 mindestens zwei Aminosäureaustausche, bevorzugt mindestens drei Aminosäureaustausche, bevorzugter mindestens vier
Aminosäureaustausche, und am bevorzugtesten alle fünf Aminosäureaustausche aufweist ausgewählt aus Positionen S33, D68, A74, S225 und G445.
38. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position G175 einen Aminosäureaus- tausch aufweist.
39. Das Enzym nach Anspruch 37, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F, G175W, G175Y, G175S, G175T, G175C, G175N, G175Q, G175D, G175E, G175R, G175K und G175H; bevorzugt G175A, G175V, G175L, G175I, G175M, G175P, G175F und G175W; bevorzugter G175A.
40. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position T217 einen Aminosäureaustausch aufweist.
41 . Das Enzym nach Anspruch 39, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus T217G, T217A, T217V, T217L, T217I, T217M, T217P, T217F, T217W,
T217Y, T217S, T217C, T217N, T217Q, T217D, T217E, T217R, T217K und T217H; bevorzugt T217D, T217E, T217R, T217K und T217H; bevorzugter T217R.
42. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäurese- quenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position L229 einen Aminosäureaustausch aufweist.
43. Das Enzym nach Anspruch 41 , wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus L229G, L229A, L229V, L229I, L229M, L229P, L229F, L229W, L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N, L229Q, L229D, L229E, L229R, L229K und L229H; bevorzugt L229Y, L229S, L229T, L229C, L229N und L229Q; bevorzugter L229C.
44. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V317 einen Aminosäureaustausch aufweist.
45. Das Enzym nach Anspruch 43, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F, V317W, V317Y, V317S, V317T, V317C, V317N, V317Q, V317D, V317E, V317R, V317K und V317H; bevorzugt V317G, V317A, V317L, V317I, V317M, V317P, V317F und V317W; bevorzugter V317I.
46. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position D328 einen Aminosäureaustausch aufweist.
47. Das Enzym nach Anspruch 45, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus D328G, D328A, D328V, D328L, D328I, D328M, D328P, D328F, D328W,
D328Y, D328S, D328T, D328C, D328N, D328Q, D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugt D328E, D328R, D328K und D328H; bevorzugter D328R.
48. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position P454 einen Aminosäureaus- tausch aufweist.
49. Das Enzym nach Anspruch 47, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus P454G, P454A, P454V, P454L, P454I, P454M, P454F, P454W, P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N, P454Q, P454D, P454E, P454R, P454K und P454H, ; bevorzugt P454Y, P454S, P454T, P454C, P454N und P454Q; bevor- zugter P454N.
50. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 in Position V457 einen Aminosäureaustausch aufweist.
51. Das Enzym nach Anspruch 49, wobei der Aminosäureaustausch ausgewählt ist aus V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F, V457W, V457Y, V457S, V457T, V457C, V457N, V457Q, V457D, V457E, V457R, V457K und V457H; bevorzugt V457G, V457A, V457L, V457I, V457M, V457P, V457F und V457W; bevorzugter V457G.
52. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens zwei Aminosäureaustausche aufweist in Positionen
S33 und W41 ; S33 und D68; S33 und A74; S33 und V94; S33 und Y201 ; S33 und S225; S33 und L424; S33 und G445; S33 und M448; S33 und A453; oder
S33 und A507;
W41 und D68; W41 und A74; W41 und V94; W41 und Y201 ; W41 und S225; W41 und L424; W41 und G445; W41 und M448; W41 und A453; oder W41 und A507; - D68 und A74; D68 und V94; D68 und Y201 ; D68 und S225; D68 und L424; D68 und G445; D68 und M448; D68 und A453; oder D68 und A507;
A74 und V94; A74 und Y201 ; A74 und S225; A74 und L424; A74 und G445; A74 und M448; A74 und A453; oder A74 und A507;
V94 und Y201 ; V94 und S225; V94 und L424; V94 und G445; V94 und M448; V94 und A453; oder V94 und A507;
Y201 und S225; Y201 und L424; Y201 und G445; Y201 und M448; oder Y201 und A453;
S225 und L424; S225 und G445; S225 und M448; S225 und A453; oder S225 und A507; - L424 und G445; L424 und M448; L424 und A453; oder L424 und A507;
G445 und M448; G445 und A453; oder G445 und A507;
M448 und A453; oder M448 und A507; oder AA453 und AA507.
53. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz im Vergleich zu SEQ ID NO. 2 wenigstens einen, mehrere oder alle Aminosäureaustausche aufweist, ausgewählt aus den Positionen S33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, und A507; bevorzugt alle der Positionen S33, D68, A74, G175, S225, L424, G445, A453, und A507; S33, D68, A74, S225,
L424, G445, A453, und A507; S33, L424, G445, und A453; S33, L424, und G445; L424, und G445; S33, D68, A74, und A507; D68, A74, und A507; oder D68, und A74.
54. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO. 2 von mindestens 90% aufweist, bevorzugt mindestens 92%, noch bevorzugter mindestens 94%, am bevorzug- testen mindestens 96% und insbesondere mindestens 98%.
55. Das Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, noch bevorzugter mindestens 97%, am bevorzugtesten mindestens 98% und insbesondere mindestens 99% zu SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35,
36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46. 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54 oder 55 aufweist.
56. Ein Verfahren zum Abbau von Acrylamid, vorzugsweise zur Reduktion der Menge an Acrylamid in einer Zubereitung, bestehend aus oder umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 55;
(ü) Bereitstellen einer Mischung, vorzugsweise einer Zubereitung, enthaltend Acrylamid, und Hinzufügen des Enzyms aus Schritt (i);
(iü) Inkubieren des aus Schritt (ii) resultierenden Gemisches für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, weiter bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C;
(iv) optional: Erhitzen des aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Gemisches, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Temperatur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, und optional Kühlen des Gemisches; um ein Produkt zu erhalten, das einen geringeren Acrylamid-Gehalt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Mischung bzw. Zubereitung aufweist.
57. Das Verfahren nach Anspruch 56, wobei in Schritt (ii) eine Zubereitung enthaltend Acrylamid bereitgestellt wird, wobei das enthaltene Acrylamid vorzugsweise das Produkt einer Maillard-Reaktion ist, und wobei die Zubereitung eine der Ernährung oder dem Genuss dienende Zubereitung oder eine kosmetische Zubereitung ist, oder eine Halbfertigware zur Herstellung solcher Zubereitungen, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffelprodukten, geröstetem Getreide oder solches enthaltenden Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffeeextrakten und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreidekaffeeprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nu-
dein, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln.
58. Das Verfahren nach Anspruch 56 oder 57, wobei der Acrylamidgehalt in dem erhaltenen Produkt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg beträgt, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Produkts.
59. Ein Verfahren zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder einer kosmetischen Zubereitung mit reduziertem Acrylamidgehalt, vorzugsweise wobei die Zubereitung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gebratenen oder frittierten Kartoffel Produkten, geröstetem Getreide o- der solches enthaltenden Produkten, Maisprodukten, Kaffeeprodukten, z.B. festen oder flüssigen Kaffeeextrakten und Rohkaffee, Zichorienextrakten, Getreidekaffeeprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Kaffeeersatzprodukten, Snacks, Weizenprodukten, Kosmetika, Backwaren oder Feingebäck, z.B. Plätzchen, Kekse, Zwieback, Getreideriegel, Scones, Eiswaffeln, Waffeln, Crumpets, Lebkuchen, Knäckebrot und Brotersatzprodukte, Nudeln, Reis, Fischerzeugnisse, Fleischerzeugnisse, Cerealien, Bier, Nüsse, Beikost für Kinder und Säuglinge, Haarstylingprodukte, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, und Gesichtspflegemitteln bestehend aus oder umfassend die Schritte:
(I) (a) Bereitstellen eines Produkts, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 54 bis 56; und
(b) Weiterverarbeiten des Produkts und/oder Hinzufügen eines oder mehrerer weiterer Bestandteile, um die dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder die kosmetische Zubereitung zu erhalten; oder
(II) (i) Bereitstellen eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 55;
(ii) Bereitstellen einer dem Genuss oder der Ernährung dienenden Zubereitung oder kosmetischen Zubereitung, enthaltend Acrylamid, und Hinzufügen des Enzyms aus Schritt (i);
(iii) Inkubieren der aus Schritt (ii) resultierenden Zubereitung für mindestens 20 Minuten, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40°C bis 80°C, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 75°C;
(iv) optional: Erhitzen der aus Schritt (iii) resultierenden inkubierten Zubereitung, so dass eine Inaktivierung des Enzyms erfolgt, vorzugsweise durch Erhitzen auf eine Temperatur von mindestens 90°C und Halten einer Temperatur von über 90°C für mindestens 15 Minuten, und optional Kühlen der Zubereitung;
um eine Zubereitung zu erhalten, die einen geringeren Acrylamid-Gehalt als die in Schritt (ii) bereitgestellte Zubereitung aufweist.
60. Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 55 zum Abbau von Acrylamid und/oder zur Herstellung einer dem Genuss oder der Ernährung die- nenden Zubereitung oder kosmetischen Zubereitung mit einem reduzierten Acrylamidgehalt, vorzugsweise von < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
61. Dem Genuss oder der Ernährung dienende Zubereitung oder kosmetische Zu- bereitung, hergestellt oder herstellbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 56 bis 59, wobei der Acrylamidgehalt < 2000 pg/kg, bevorzugt < 850 pg/kg, besonders bevorzugt < 500 pg/kg ist, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
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