EP4097255A1 - Procede de pcr multiplexe pour la detection de microorganismes et son utilisation - Google Patents

Procede de pcr multiplexe pour la detection de microorganismes et son utilisation

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EP4097255A1
EP4097255A1 EP21705886.6A EP21705886A EP4097255A1 EP 4097255 A1 EP4097255 A1 EP 4097255A1 EP 21705886 A EP21705886 A EP 21705886A EP 4097255 A1 EP4097255 A1 EP 4097255A1
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EP
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pair
primers
primer
seq
sequence
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Pending
Application number
EP21705886.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Franck Tarendeau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean DX SAS
Original Assignee
Ocean DX SAS
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Filing date
Publication date
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Publication of EP4097255A1 publication Critical patent/EP4097255A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to the field of the detection and amplification of at least one nucleic acid of interest, in particular in infectious diagnosis.
  • the invention thus relates to a method for amplifying at least two distinct nucleic acid sequences present in a sample from a pair of primers 1 amplifying a first nucleic acid (A) and at least one pair of primers. hybrids or chimeras 2 amplifying a second nucleic acid (B).
  • the first primer such as a forward primer of primer pair 2 further comprises in 5 'the sequence of the first primer of primer pair 1
  • the second primer of primer pair 2 further comprises in 5 ′ the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the invention also relates to the primers, a kit capable of implementing said method and its uses.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Coli is suspected, a pair of primer allowing the amplification of a nucleic acid specific for E. Coli can be used.
  • the origin of the infection is not known, it is necessary to use pairs of primers specific to each of the pathogens to be detected.
  • a so-called simplex PCR approach a single pair of primers is used and a PCR reaction must be reproduced as many times as necessary with respect to the number of viruses, bacteria or yeasts that one wishes to identify as responsible for the infection. .
  • PCR approach multiplex, all the pairs of primers are added in a single reaction and all the pathogens sought will be identified at one time.
  • Multiplex PCR is a PCR allowing the simultaneous amplification of several different nucleic acid sequences from the same biological sample. It allows several targeted amplifications to be carried out in a single reaction. Multiplex PCR is therefore particularly suitable in infectious diagnosis. During infectious diagnosis, pairs of different primers are used to target several bacteria, viruses or yeasts during the same PCR reaction in the presence of the target biological sample.
  • the pairs of primers used in multiplex PCR need to be highly optimized so that all the primers can work at the same temperature during PCR, making it possible in particular to avoid the phenomenon of cross reactions.
  • multiplex PCR is able to reveal at least one pathogen in community-acquired pneumonia in 77% of hospitalized patients, compared to 39% by culture (NJ Gadsby CD Russell MP McHugh Comprehensive molecular testing for respiratory pathogens in community -acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2016).
  • it can detect up to three times more pathogens in the stool than traditional methods (CR Stensvold HV Nielsen Comparison of microscopy and PCR for detection of intestinal parasites in Danish patients supports an incentive for molecular screening platforms. J Clin Microbiol 2012).
  • a single test can demonstrate the presence in the sample of several infectious agents in less than two hours.
  • Today, panels are already offered to clinicians for meningitis, sexually transmitted infections, respiratory infections and infectious enterocolitis.
  • multiplex PCR is limited to the detection of a predefined quantity of pathogens, of which the pairs of primers targeting at least one fragment of a specific gene for said pathogens are included in the panel.
  • the detection kit can comprise a very large number of primers therefore making it possible to detect a large quantity of microorganisms.
  • a pathogen is detected by a pair of primers whose amplicon is specific to said pathogen.
  • a high concentration of different primers in a single test generates a contradictory deleterious effect.
  • a phenomenon of competition between the primers appears, resulting in an inhibition of the primers.
  • nonspecific amplifications are much more likely due to the multitude of primers used. Consequently, multiplexing that is too high induces very poor detection sensitivity.
  • the invention aims to solve the problems and drawbacks of the prior art and in particular to avoid or limit the degradation of the sensitivity of the multiplex PCR which can result in the non-amplification or poor amplification of targeted nucleic acids because of the phenomenon of competition between the primers when they are present in one and the same test in too large quantities as well as to suppress or limit the degradation of the sensitivity of the multiplex PCR linked to the nonspecific amplifications which consume undesirably the reagents of 'amplification.
  • the invention relates to a method for amplifying at least two distinct nucleic acid sequences of interest present in a sample from a pair of primers 1 capable of amplifying a first sequence of acids. nucleic acids of interest (A) and at least one pair of hybrid primers 2 capable of amplifying a second sequence of nucleic acids of interest (B), said method comprising the following steps: a. bringing the sample into contact with the pair of primers 1 capable of amplifying the first sequence of nucleic acids (A) and the pair of primers 2 capable of amplifying the second sequence of nucleic acids (B),
  • the one pair of primers consisting of a first primer and a second primer capable of amplifying a nucleic acid corresponding to the first nucleic acid sequence (A)
  • the pair of primers consisting of a 2 first primer and a second primer capable of amplifying a nucleic acid corresponding to the second nucleic acid sequence (B)
  • B the pair of primers consisting of a 2 first primer and a second primer capable of amplifying a nucleic acid corresponding to the second nucleic acid sequence
  • the sequence of the first primer of the pair of primers 2 further comprises in 5 'the sequence of the first primer of the pair of primer 1 and the sequence of the second primer of the pair of primers 2 furthermore comprises, in 5 ′, the sequence of the second primer of the pair of primers 1.
  • the sequence of the first primer of the pair of primers 2 (called chimeric or hybrid) further comprises, at 5 ′, the sequence of the first or of the second primer of the pair of primer 1 and the sequence of the second primer of primer pair 2 further comprises in 5 'the sequence of the first or second primer of primer pair 1.
  • the concentration of the pair of primers 2 is less than or equal to that of the pair of primers 1, more preferably less.
  • the method according to the invention can also comprise a third pair of primers B, a fourth pair of primers 4 etc., each comprising a first primer, the sequence of which further comprises, at 5 ′, the sequence of the first or of the second. primer of the pair of primers 1 and a second primer, the sequence of which also comprises, in 5 ′, the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the second primer targeting the first nucleic acid sequence (A) can also contain in its 5 ′ region the sequence of the first primer targeting this same nucleic acid (A).
  • the first oligonucleotide of the pair of primers 1, 2, 3 or 4 can be a forward or reverse primer and the second oligonucleotide of the pair of primers 1, 2, 3 or 4 can be an reverse or forward primer.
  • the method according to the invention is a multiplex PCR and makes it possible to carry out differential quantitative amplifications, that is to say that the targets are not amplified in the same way leading to differences in quantities produced for the same number. cycle between targets.
  • Said PCR according to the invention is also called Relay PCR or PCR according to the invention in the remainder of the description.
  • the PCR according to the invention makes it possible in particular to detect and identify microorganisms such as bacteria, viruses, yeasts involved in infectious diseases. Diseases can be detected in a subject such as an animal or human, or in a plant.
  • the invention also relates to the primers and kits comprising specific primers, a detection kit capable of implementing the method of the invention and its use for detecting the microorganisms present during infectious diseases.
  • FIG. 1 represents the principle of the PCR Relay according to the invention.
  • FIG. 2A represents a standard Duplex (multiplex with 2 targets) PCR assay with a pair of primers 1 targeting Staphylococcus aureus and a pair of primers 2 targeting Escherichia coli.
  • the ratio of primer torque 1: primer pair 2 is equal to 1: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Escherichia coli.
  • gray amplification curves targeting a specific gene of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 2B represents a relay PCR assay according to the invention comprising a pair of primers 1 targeting Staphylococcus aureus and a pair of primers 2 targeting Escherichia coli.
  • the ratio of primer torque 1: primer torque 2 is equal to 10: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Escherichia coli.
  • gray amplification curves targeting a specific gene of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 2C represents a relay PCR assay according to the invention comprising a pair of primers 1 targeting Staphylococcus aureus and a pair of primers 2 targeting Escherichia coli.
  • the ratio of primer torque 1: primer pair 2 is equal to 1: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Escherichia coli.
  • gray amplification curves targeting a gene specific for Staphylococcus aureus.
  • FIG. 3A represents a standard Duplex PCR assay with a pair of primers 1 targeting Klebsiella pneumoniae and a pair of primers 2 targeting Staphylococcus aureus.
  • the ratio of primer torque 1: primer pair 2 is equal to 1: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Klebsiella pneumoniae.
  • gray amplification curves targeting a specific gene of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 3B represents a relay PCR assay according to the invention comprising a pair of primers 1 targeting Klebsiella pneumoniae and a pair of primers 2 targeting Staphylococcus aureus.
  • the ratio of primer torque 1: primer torque 2 is equal to 10: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Klebsiella pneumoniae.
  • gray amplification curves targeting a specific gene of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 3C represents a relay PCR assay according to the invention comprising a pair of primers 1 targeting Klebsiella pneumoniae and a pair of primers 2 targeting Staphylococcus aureus.
  • the ratio of primer torque 1: primer pair 2 is equal to 1: 1.
  • black amplification curves targeting a specific gene for Klebsiella pneumoniae.
  • gray amplification curves targeting a specific gene of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 4 represents the structure of a pair of primers used in standard PCR capable of amplifying a target sequence, for example A comprising a sense primer of sense sequence FW1 and an antisense primer of sequence RT1; and the structure of a pair of hybrid or chimeric primers according to the invention used in Relay PCR capable of amplifying a target sequence, for example B.
  • the pair of hybrid or chimeric primers comprises a sense primer of sequence FW1 + FW2 and an antisense primer of sequence RT1 + RT2.
  • the FW2 sequence is capable of hybridizing with a region of the target sequence B, the FW1 sequence corresponds to the sequence of the sense primer of the primer pair 1 present in greater concentration in the mixture, and said sequences FW1 and FW2 are contiguous to form a single forward primer between 12 and 140 nucleotides in length.
  • the pair of hybrid or chimeric primers also comprises an antisense primer of sequence RT1 + RT2, the sequence RT2 is complementary to a region of the target sequence B, the sequence RT1 corresponds to the sequence of the antisense primer of the pair of primer 1 present in greater concentration in the mixture, said sequences FW1 and FW2 are contiguous to form a single primer with a length of between 12 and 140 nucleotides.
  • the pair of primers 1 present in greater concentration in the mixture is capable of amplifying the amplicon generated by the pair of primer 2, during the first cycle, and therefore of also amplifying the target sequence B.
  • the pair of primers 1 is capable of amplifying the target sequence A but also the target sequence B from the second cycle of PCR.
  • Figure 5 shows the sequence of the bacterial 16S gene.
  • Said sequence comprises: 9 variable regions specific to each species, and 10 regions conserved between species, contiguous to said variable regions. Variable regions are numbered VI through V9.
  • the conserved regions make it possible to define, according to the knowledge of those skilled in the art, the nucleotide sequence of the sense and antisense primers capable of hybridizing to these conserved regions surrounding at least one variable region of interest (for example VI to V2) .
  • Figure 6 is an agarose gel representing PCR results according to the standard Duplex (2-target multiplex) method or according to the method of the present invention Duplex Relais. Under all conditions, 100 copies of the Klebsiella pneumoniae genome were added. Lane 1: amplicon of the 5 ′ region of the 16S gene (amplicon covering the variable areas VI to V2) obtained with primers targeting areas conserved contiguous to said variable areas in high concentration (PCR control). 2: amplicon of the central region of the 16S gene (amplicon covering the variable areas V4 to V6) obtained with primers targeting areas conserved contiguous to said variable areas in high concentration (PCR control).
  • 3 standard multiplex PCR amplicon of the 5 ′ (V1-V2) and central (V4-V6) regions of the 16S gene with two pairs of primers targeting each variable zone respectively, the primers being in high concentrations.
  • 4 2 amplicon regions of 16S gene according to the method of the present invention Duplex Relay where the first pair of primers target the 5 'region (V1-V2) and the 2nd pair of primers or chimeric hybrid comprises a sequence capable of targeting the central region (V4-V6) but also the sequence of the first pair of primers, said primers are used at high (first pair of primers) and low concentrations (second pair of primers) respectively.
  • the arrows indicate the amplification or non-amplification of the amplicon of interest (here the V1-V2 region of the 16S gene).
  • FIG. 7 is an agarose gel representing results of PCR according to the standard Triplex (3-target multiplex) method or according to the method of the present invention (Triplex Relais). Under all conditions 100 copies of the Klebsiella pneumoniae genome were added. 1: amplicons obtained with a standard Triplex PCR, the primers being at ImM each. 2: amplicons obtained with a Triplex Relay PCR where the chimeric or hybrid primers were used at a low concentration of 0.04 mM.
  • the Triplex Relais amplicons V4-V6 and V7-V9 are slightly larger than their standard Triplex counterpart because of the length of the chimeric primers which increase their size after polymerization.
  • FIG. 8 is an agarose gel representing results of PCR according to the relay multiplex PCR method comprising a single standard primer in high concentration. Under all conditions 100 copies of the Klebsiella pneumoniae genome were added. 1: amplicons obtained with a Duplex Relay PCR comprising a pair of primer 1 in high concentration targeting the V1-V2 region of the 16S gene and a pair of primer 2 hybrids or chimeras in low concentration targeting the V7-V9 region of the 16S gene .
  • amplicons obtained with a Duplex Relay PCR comprising a pair of primer 1 targeting the V1-V2 region of the 16S gene consisting of a sense primer in high concentration and a hybrid or chimeric antisense primer in low concentration comprising 5 ' the sequence of the sense primer and a pair of primer 2 hybrids or chimeras in low concentration targeting the V7-V9 region of the 16S gene.
  • the reverse primer of the first pair as well as the sense and reverse primers of the second pair are hybrid or chimeric primers. Only the directional primer of the primer pair 1 is present in high concentration.
  • the term “patient” is understood to mean a subject who may be a human being or an animal, preferably a human being or a mammal.
  • the subject is a human patient, regardless of age or sex. Newborns, infants and children are also included.
  • diagnosis means a test which aims to detect and identify one or more pathology (s), in particular the detection and identification of infectious diseases in a subject or a plant in order to be able to administer to the subject or to the plant a treatment corresponding to the pathology.
  • the term “pair of primers” or “pair of oligonucleotides” means two oligonucleotides making it possible to amplify a target sequence in the context of a PCR.
  • primer or “oligonucleotide” or “primer” is meant within the meaning of the invention a short segment of nucleic acids of one to several tens of nucleotides. Said primers are capable of hybridizing with a complementary sequence. In the context of the invention, they are capable of hybridizing with a fragment of the target sequence.
  • the target sequence can be a sequence of nucleic acids (DNA or RNA).
  • FW1 sequence means the sequence of an oligonucleotide of one to a few tens of nucleotides, in particular the sequence of a sense primer capable of hybridizing with the sequence complementary to the sequence d 'interest.
  • RT1 sequence means the sequence of an oligonucleotide of one to several tens of nucleotides, in particular the sequence of an antisense primer capable of hybridizing with the sequence complementary to the sequence of interest.
  • the term “pair of primers capable of amplifying a nucleic acid sequence of interest” means a pair of primers comprising a sense primer and an antisense primer capable of amplifying a determined sequence of interest by PCR.
  • the nucleic acid sequence of interest can be a sequence present in the variable part of the 16S gene of a bacterium. Said primers being designed to target said sequence of interest according to the general knowledge of those skilled in the art.
  • the term “amplification” is understood to mean the amplification of the target sequence during a PCR reaction and therefore the increase in the number of copies of the target sequence.
  • the primers hybridize with the complementary sequence denatured beforehand, followed by the elongation of the strands by the action of the polymerase. The reaction continues with several successive cycles making it possible to increase the number of copies of the amplicon.
  • amplicon is intended to mean a nucleic acid fragment corresponding to the sequence amplified during PCR and delimited by the two primers used. The amplicon is therefore a copy of the target sequence.
  • hybrid primer or “chimeric primer” means a primer comprising a nucleic acid sequence capable of hybridizing with a strand complementary to the target sequence and at 5 ′ an acid sequence. nucleic acid corresponding to the sequence of a primer belonging to another pair of primer, for example the sequence of a forward or reverse primer of another pair of primer.
  • the pair of primers 2, B and 4 consists of hybrid or chimeric primers.
  • the primer pair 1 comprises a “standard” primer and a hybrid or chimeric primer.
  • the first oligonucleotide of the pair of primers 2 comprises a sequence capable of hybridizing with a specific nucleic acid sequence (target B) and at 5 ′ a nucleic acid sequence corresponding to the sequence of the first oligonucleotide of the pair of primers 1 capable of hybridizing with another specific nucleic acid sequence (target A).
  • concentration ratio is understood to mean the concentration ratio of the pair of primers 1 relative to a second pair of primers such as the pair of primers 2.
  • a ratio of 1: 1 corresponds to an identical concentration of the first couple and the second couple and a ratio of 10: 1 corresponds to a concentration 10 times greater of the first couple compared to the second.
  • the subject of the invention is therefore a novel so-called multiplex PCR method.
  • So-called standard multiplex PCRs are known which make it possible to identify a very large number of target sequences.
  • Such standard multiplex PCRs require the presence in high concentration of each pair of primers targeting a particular nucleic acid.
  • each pair of primers is therefore present at the same high concentration during the multiplex PCR reaction. From at least 4 or 5 pairs of different primers, the reaction conditions begin to deteriorate.
  • the appearance of a phenomenon of competition between the primers results in an inhibition of the specific hybridizations of the primers.
  • nonspecific amplifications can occur by the multiplicity of primers used.
  • standard multiplex PCRs have very poor detection sensitivity.
  • the invention relates to a novel multiplex PCR method known as the Multiplex Relay PCR (or Relay PCR).
  • a novel multiplex PCR method known as the Multiplex Relay PCR (or Relay PCR).
  • Relay PCR either the method according to the invention, a single pair of primers or a single primer is used in high concentration, all the other primers are in very low concentration. Thanks to the invention, it is possible to maintain an extreme sensitivity for all the targeted nucleic acids.
  • nucleic acids it is also possible to promote the amplification of certain nucleic acids over others (quantitative amplification asymmetry or differential quantitative amplification), in particular the nucleic acids of target A, over others. These nucleic acids preferentially amplified will thus be present in greater quantity. In diagnosis, favoring certain nucleic acids has a medical advantage because some nucleic acids are more informative than others.
  • the invention relates to a method for amplifying at least two distinct nucleic acid sequences of interest present in a sample from a pair of primers 1 capable of amplifying a first sequence of nucleic acids of interest ( A) and at least one pair of primers 2 capable of amplifying a second nucleic acid sequence of interest (B), said method comprising the following steps: a. bringing the sample into contact with the pair of primers 1 capable of amplifying the first sequence of nucleic acids (A) and the pair of primers 2 capable of amplifying the second sequence of nucleic acids (B), i .
  • the pair of primers 1 consisting of a first primer and a second primer capable of amplifying a nucleic acid corresponding to the first nucleic acid sequence (A)
  • the pair of primers 2 consisting of a first primer and a second primer capable of amplifying a nucleic acid corresponding to the second nucleic acid sequence (B)
  • B second nucleic acid sequence
  • the sequence of the first primer of the pair of primers 2 further comprises in 5 'the sequence of the first primer of the pair of primer 1 and the sequence of the second primer of the pair of primers 2 further comprises in 5 ′ the sequence of the second primer of the pair of primers 1.
  • step c. The amplification of the first and second nucleic acid sequence (A and B) is carried out by an amplification reaction based on a polymerization (elongation) of the nucleic acid sequence ( A) and the nucleic acid sequence (B) present in the sample
  • the sequence of the first primer of the pair of primers 2 further comprises, in 5 ′ the sequence of the first primer or of the second primer of the pair of primers 1 and the sequence of the second primer of the pair of primers 2 further comprises, in 5 ′, the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the sequence of the first primer of the primer pair 2 and the sequence of the first or second primer of the primer pair 1 are contiguous and the sequence of the second primer of the primer pair 2 and the sequence of the first or the second primer of the pair of primers 1 are contiguous.
  • said sequences are not contiguous but are spaced apart by a few nucleotides with a spacer (or “linker” or “spacer”) of a size between 1 and 12 nucleotides.
  • the method according to the invention is characterized in that: the sequence of the second primer of the pair of primers 1 further comprises in 5 ′ the sequence of the first primer of said pair of primer 1, said sequences are contiguous and the sequence of the first primer of primer pair 2 further comprises in 5 'the sequence of the first primer of primer pair 1 and the sequence of the second primer of primer pair 2 further comprises further 5 'the sequence of the first primer of the pair of primers 1, said sequences are contiguous.
  • sequence of the second primer of the pair of primers 1 further comprises, at 5 ′, the sequence of the first primer of said pair of primer 1 and / or the sequence of the first primer of the pair of primers 2 further comprises in 5 'the sequence of the first primer of primer pair 1 and the sequence of the second primer of primer pair 2 further comprises in 5 ′ the sequence of the first primer of primer pair 1, said sequences are spaced a few nucleotides apart with a spacer (or “linker” or “spacer”) of a size of between 3 and 12 nucleotides.
  • the method uses: at least one pair of primers 1 capable of amplifying a target sequence A comprising: a sense primer of sequence FW1 complementary to a fragment of target sequence A, said primer being of a size between 6 and 70 nucletoids, and an antisense primer of sequence RT1 complementary to a fragment of the target sequence A, said primer being of a size between 6 and 70 nucletoids, and at least one pair of primers 2 capable of amplifying a target sequence B comprising: a forward primer of sequence FW1 or RT1 and of sequence FW2, the sequence FW2 being complementary to a fragment of the target sequence B, said sequences FW1 or RT1 and FW2 being contiguous to form a single primer with a size of between 12 and 140 nucletoids, and an antisense primer of sequence FW1 or RT1 and of RT2 sequence, the RT2 sequence being complementary to a fragment of the target sequence B, said FW1 or RT1 and RT2 sequence being complementary to a fragment of the
  • the invention also relates to a pair of hybrid or chimeric primers comprising: a sense primer (or first oligonucleotide) of sequence FW1 or RT1 and of sequence FW2, the sequence FW2 is complementary to a fragment of the target sequence B, the FW1 or RT1 sequence corresponds respectively to the sequence of the sense or antisense primer of primer pair 1 present in greater concentration in the mixture, said sequences FW1 or RT1 and FW2 are contiguous to form a single sense primer d 'a length of between 12 and 140 nucleotides, and an antisense primer (or second oligonucleotide) of sequence FW1 or RT1 and sequence RT2, the sequence RT2 is complementary to a fragment of the target sequence B, the sequence RT1 or FW1 corresponds respectively to the sequence of the antisense or sense primer of the primer pair 1 present in an equal or greater concentration in the mixture, said sequences FW1 or RT1 and FW2 are contiguous to form
  • the invention also relates to a pair of hybrid or chimeric primers comprising: a sense or antisense primer (or first oligonucleotide) of sequence FW1 or RT1, the FW1 or RT1 sequence is complementary to a fragment of the target sequence A, present in greater concentration in the mixture, said sequences are between 6 and 70 nucleotides in length, and a hybrid sense or antisense primer or chimera (or second oligonucleotide) of sequence FW1 and of sequence RT1 or of sequence RT1 and of sequence FW1, said primers being present in a lower concentration compared to the first oligonucleotide of sequence FW1 or RT1 in the mixture, said sequences FW1 and RT1 or RT1 and FW1 are contiguous to form a single primer between 12 and 140 nucleotides in length.
  • a sense or antisense primer or first oligonucleotide of sequence FW1 or RT1 sequence is complementary to a
  • the PCR reaction takes place in a mixture comprising a pair of primers 1 capable of hybridizing and amplifying a first sequence of nucleic acids (A) and a pair of primers 2 capable of hybridizing and amplifying a second sequence of nucleic acids (B) as is the case for a standard Duplex PCR.
  • the Duplex Relay PCR differs from the standard Duplex PCR by the fact of using hybrid or chimeric primers for the second pair of primers, and possibly for a forward or reverse primer of the first pair of primers.
  • the primer pair 1 is able to also amplify the amplicon generated by the primer pair 2 and therefore the target sequence B.
  • the Duplex Relay PCR comprises in particular bringing the sample into contact with the reaction mixture comprising the pair of primers 1 capable of amplifying the nucleic acid sequence (A) and the pair of primers 2 capable of amplifying the second sequence of nucleic acids (B).
  • the pair of primers 1 consists of a first sense primer (for example of sequence FW1) and of a second antisense primer (for example of sequence RT1) capable of each hybridizing to the sequence complementary to one of the strands. of nucleic acid (A) and amplifying the sequence corresponding to the sequence of the complementary strand between the two primers. Said complementary sequence being the target sequence (A).
  • the pair of primers 2 consists of a first sense primer (for example of sequence FW1-FW2) and of a second antisense primer (for example of sequence RT1-RT2) capable of each hybridizing to the complementary sequence d '' one of the strands of the nucleic acid (B) and amplifying the sequence corresponding to the sequence of the complementary strand between the two primers.
  • Said complementary sequence being the target sequence (B).
  • the reaction mixture includes all the reagents and conditions necessary to perform PCR amplification. Said reagents possibly being initially present in the reaction mixture or added after bringing the sample into contact.
  • the reagents required include in particular dNTPs and the polymerase that a person skilled in the art will be able to choose depending on the PCR and the reaction conditions.
  • the polymerase is the polymerase from Thermophilus aquaticus or the so-called Klenow fragment of this polymerase.
  • a PCR cycle includes a denaturation step which aims to separate the double strand in order to obtain two single strands followed by the hybridization step.
  • the primers will recognize the complementary sequence present on one of the single strands previously denatured and will then hybridize.
  • An elongation step follows which allows the polymerases to synthesize the complementary strand of the single strand. This strand is synthesized from the free dNTPs present in the reaction medium. The duration of this step depends on the length of the sequence to be amplified.
  • the PCR reaction continues with a second cycle, third cycle etc. which each include the same steps. At the end of the PCR, an amplification of the sequence between the primers is thus obtained. Said sequence corresponding to the amplicon.
  • the amplification of the first and second nucleic acid sequence is based on an amplification of the target nucleic acid sequence (A) and of the target nucleic acid sequence (B) present in the sample, preferably simultaneous amplification of the target nucleic acid sequence (A) and the target nucleic acid sequence (B) present in the sample.
  • the method according to the invention is characterized in that the first primer of the pair of primers 2 further comprises in 5 ′ the sequence of the first primer of the pair of primers 1, and the second primer of the pair of primers 2 comprises furthermore in 5 'the sequence of the second primer of pair of primers 1.
  • the sequences of the first primer of pair 2 and of the first primer of pair 1 are contiguous and the sequences of the second primer of pair 2 and of the second primer of pair 1 are also contiguous.
  • the second primer of the pair of primers 2 further comprises, in 5 ′ the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the sequences of the first primer of the pair 2 and of the first primer of couple 1 are contiguous and the sequences of the first or second primer of couple 2 and of the second primer of couple 1 are also contiguous.
  • the first primer of the pair of primers 2 comprises a sequence of nucleic acids capable of hybridizing with the sequence complementary to the sequence to be amplified, such as the target sequence (B) and, in addition, in 5 ′ the sequence of the first or second primer of the pair of primers 1, and the second primer of the pair of primers 2 comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the sequence complementary to the sequence to be amplified, such as the target sequence ( B) and in addition, at 5 ′, the sequence of the first or second primer of the pair of primers 1.
  • the nucleic acid sequence capable of hybridizing with the complementary sequence to be amplified, such as the target sequence (B) being separate for primer 1 and primer 2.
  • primer 1 can be a forward primer and primer 2 a reverse primer.
  • the first pair of primers is able to amplify the first sequence (A) and the second sequence (B) from the second cycle of PCR.
  • the first pair of primers is able to amplify the first sequence (A) and the second pair of primers is able to amplify the second sequence (B).
  • nucleic acid sequences are generated comprising the sequence of the first primer of the first pair and the sequence complementary to sequence (A), nucleic acid sequences comprising the sequence of second primer of the first pair and the sequence complementary to sequence (A), nucleic acid sequences comprising the sequence of the first primer of the second pair and the sequence complementary to sequence (B), and nucleic acid sequences comprising the sequence of the second primer of the second pair and the sequence complementary to sequence (B).
  • the first primer of the second pair comprises the sequence of the first primer of the first pair and of a sequence capable of hybridizing to sequence (B) and the second primer of the second pair comprises the sequence of the second primer of the first pair and of a sequence capable of hybridizing to sequence (B ).
  • the pair of primers 1 is able to amplify the nucleic acid sequences generated during the first cycle (FIG. 1).
  • the sequence of the first primer of the first pair is chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5
  • the sequence of the second primer of the first pair is chosen from among SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6
  • the sequence of the first primer of the second pair is chosen from SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9
  • the sequence of the second primer of the second pair is chosen from SEQID NO: 8 or SEQID NO: 10.
  • the 16S gene comprises conserved regions and variable regions, in particular 9 variable regions and 10 conserved regions (cf. FIG. 5). Variable regions are numbered VI through V9 and are all surrounded by conserved regions. Those skilled in the art, by virtue of their general knowledge, are perfectly able to determine said regions on the 16S gene. Tremblay et al. 2015 (Frontiers in Microbiology) describes, for example, one of these many methods for amplifying and sequencing these regions in order to identify the bacteria present in a sample.
  • the sequences of interest correspond to variable sequences of a single gene or of at least two distinct genes, more preferably the sequences of interest correspond to the variable sequences of the 16S gene and said primers. are capable of hybridizing with at least ten nucleotides of a conserved sequence of the 16S gene.
  • the sense primer can hybridize with at least ten nucleotides of a sequence conserved from the 16S gene in 5 'of a variable sequence of said 16S gene and the antisense primer can hybridize with at least ten nucleotides of a conserved sequence of the 16S gene at B 'of a variable sequence of said 16S gene.
  • the inventors have designed primers making it possible to hybridize specifically on the conserved regions contiguous with the variable regions of interest such as V1-V2, V3, V4-V6 and V7-V9.
  • the amplicon generated corresponds to the sequences of the variable regions V1-V2 or V3 or V4-V6 or V7-V9, the sequence of which is specific to a pathogen.
  • the sequence of the first primer (sense primer) of the first pair is chosen from SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 24;
  • the sequence of the second primer (reverse primer) of the first pair is chosen from SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.
  • the sequence of the first primer (sense primer) of the first pair is SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and the sequence of the second primer (antisense primer) of the first pair is chosen from SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.
  • the sequence of the first primer (sense primer) of the second pair is chosen from SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: S4 or SEQ ID NO: 35; the sequence of the second primer of the second pair is chosen from SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, or SEQ ID NO: 38. Said sequences being listed in Table IB below.
  • the first pair of primers targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consists of: a forward primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27.
  • the second pair of hybrid or chimeric primers targeting the variable regions V4 to V6 of the 16S gene consists of: - a forward primer having at least 70% sequence homology with SEQ
  • the second pair or the third pair of primers targeting the variable regions V7 to V9 of the 16S gene consists of: a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 and an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38.
  • the sequence homology of 70% concerns, in particular the first ten nucleotides in 3 'of said sequence.
  • the first pair of primers targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consists of: a sense primer of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and an antisense primer SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 26 or
  • the second pair of hybrid or chimeric primers targeting the variable regions V4 to V6 of the 16S gene consists of: a sense primer of SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 and of an antisense primer SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the second pair or the third pair of primers targeting the variable regions V7 to V9 of the 16S gene consists of: a sense primer of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 and an antisense primer SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38.
  • the concentration of the pair of primers 2 may be less than, greater than or equal to that of the pair of primers 1. It is thus possible to favor or not a pair of primers over another. and therefore the amplification of a sequence of interest.
  • the concentration of the pair of primers 2 is less than or equal to that of the pair of primers 1, more preferably less.
  • the concentration of the pair of primers 2 is lower than that of the pair of primers 1, the pair of primers 2 is disadvantaged with respect to the first pair.
  • the amplicons generated by the pair of primers 1 will thus be present in greater quantity.
  • sequencing is then carried out, the amplicons of target A will be over-represented and will therefore be sequenced preferentially. Obtaining their sequence will then be faster.
  • the method according to the invention makes it possible to generate a quantity of amplicons by the pair of primers 1 at least 4 times greater than the amplicons generated by the pair of primers 2.
  • the amplicons generated by the second pair will therefore be present in lower quantity and will come out slower during sequencing.
  • the concentration ratio between the pair of primers 1 and the pair of primers 2 is between 1: 1 and 1000: 1, even more preferably between 1: 1 and 100: 1.
  • the concentration ratio between the pair of primers 1 and the pair of primers 2 is equal to 10: 1, more preferably equal to 25: 1.
  • Such a ratio can, for example, correspond to a concentration of the pair of primers 1 equal to ImM and a concentration of the pair of primers 2 equal to 0.1 mM or 0.04 mM.
  • the method according to the invention may further comprise the sample contacting with a 3 rd pair of primers adapted to amplify a 3 rd nucleic acid sequence (C).
  • the first primer of the pair of primers 3 comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the complementary sequence (C) and, in addition, at 5 ′ the sequence corresponding to the sequence of the first primer or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the second primer of the pair of primers 3 comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the complementary sequence (C) and, in addition, in 5 'the sequence corresponding to the sequence of the first or of the second primer of primer pair 1.
  • the method according to the invention thus comprises 3 pairs of different primers making it possible to amplify 3 different target nucleic acid sequences, in particular an A sequence, a B sequence and a C sequence.
  • Said method is a so-called Triplex Relay PCR.
  • Sequences B and C are preferably amplified by hybrid or chimeric sense and antisense primers each comprising the sequence of the sense primer of primer pair 1 present in greater concentration and the sequence of the sense or antisense primer of pair d primer 1 present in highest concentration.
  • the method according to the invention uses: at least one pair of primers 1 capable of amplifying a target sequence A comprising:
  • a reverse primer complementary sequence RT1 to a fragment of the target sequence A said primer being of a size between 6 and 70 nuclétoides, and at least one pair of primers hybrids or chimeras 2 capable of amplifying a target sequence B comprising:
  • sequence FW1 or RT1 and of sequence FW2 being complementary to a fragment of the target sequence B, said sequence FW1 or RT1 and FW2 being contiguous to form a single primer with a size of between 12 and 140 nucletoids, and
  • a reverse primer of FW1 sequence or sequence RT1 and RT2 RT2 sequence being complementary to a fragment of the target sequence B, said FW1 sequence RT1 or RT2 and being contiguous to form a single primer of a size between 12 and 140 nucletoids, and at least one pair of primers B capable of amplifying a target sequence C comprising:
  • sequence FW1 and FW3 being complementary to a fragment of the target sequence C, said sequence FW1 and FW3 being contiguous to form a single primer with a size of between 12 and 140 nucletoids
  • an antisense primer of sequence FW1 or RT1 and sequence RT3 the RT3 sequence being complementary to a fragment of the target sequence C, said sequence FW1 or RT1 and RT3 being contiguous to form a single primer with a size of between 12 and 140 nucletoides.
  • the concentration of the primer pair 3 is less than or greater than or equal to that of the primer pair 1 and / or the concentration of the primer pair 2 is less than or greater than or equal to that of the primer pair 1. It is thus possible to favor or not a pair of primers over another.
  • the concentration of the primer pair 3 is less than that of the primer pair 1 and / or the concentration of the primer pair 2 is less than that of the primer pair 1.
  • the concentration of the pair of primers 1 is greater than that of the second and / or of the third pair of primers and the concentration of the pair of primers 2 is equal to that of the pair of primers 3.
  • the concentration of the pair of primers 1 is greater than that of the second and third pair of primers and the concentration of the pair of primers 2 is greater than that of the pair of primers 3.
  • the first couple is favored over the second and the second is also favored over the third.
  • the method according to the invention can further comprise the bringing the sample into contact with a fourth pair of so-called hybrid or chimeric primers capable of amplifying a fourth sequence of nucleic acids (D).
  • the first primer of the pair of primers 4 comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the complementary sequence (D) and, in addition, in 5 'the sequence corresponding to the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the second primer of the pair of primers 4 comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the complementary sequence (D) and, in addition, in 5 'the sequence corresponding to the sequence of the first or of the second primer of primer pair 1.
  • the concentration of the fourth pair of primers is less than or equal to the concentration of the pair of primers 1 and the concentration of the second, third and fourth pair is identical.
  • the method according to the invention can further comprise bringing the sample into contact with an n th pair of primers capable of amplifying an n th sequence of nucleic acids.
  • the first primer of the pair of primers n comprises a sequence of nucleic acids capable of hybridizing with the target complementary sequence and, in addition, in 5 'the sequence corresponding to the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the second primer of the pair of primers n comprises a nucleic acid sequence capable of hybridizing with the target complementary sequence and, in addition, in 5 'the sequence corresponding to the sequence of the first or of the second primer of the pair of primers 1.
  • the concentration of the n th pair of primers is less than or equal to the concentration of the pair of primers 1 and the concentration of the second, of the third, of the fourth pair and of the n th pair is identical.
  • n is understood to mean a natural integer which is a positive number making it possible to count objects each counting as one.
  • an integer has a unique successor, that is, an integer immediately above it, and the list of natural integers is infinite.
  • reaction medium making it possible to implement the method according to the invention can comprise one or more specific probe (s) coupled to a fluorophore whose emission spectrum is different from the others.
  • each product of the PCR reaction is measured in real time by said specific probe (s).
  • the method according to the invention further comprises a step of quantifying the amplicons by using probes coupled to a fluorophore, preferably so-called TaqMan probes.
  • the method according to the invention comprises a step of detecting amplicons and therefore microorganisms by fluorescent probes, fluorescent labeling, melting curve, nested PCR, quantitative PCR, reverse-transcription PCR or by sequencing of DNA.
  • the method further comprises a step of sequencing the amplified nucleic acids or amplicons.
  • the method according to the invention makes it possible to detect and identify microorganisms (bacteria, yeasts, viruses, etc.) involved in at least one infectious disease, preferably bacteria.
  • microorganisms bacteria, yeasts, viruses, etc.
  • the method according to the invention can also be used for the diagnosis of genetic diseases, in oncology and in general in molecular biology.
  • the invention relates to a kit comprising a pair of primers 1 comprising SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 and a pair of primers 2 comprising SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10.
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of: ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, a pair of primers 2 targeting the V4-V6 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, a pair of primers 2 targeting the V7-V9 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38,
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, a pair of primers 2 targeting the variable regions V4-V6 of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33, a pair of primers 3 targeting the variable regions V7-V9 of the 16S gene consisting of:
  • ⁇ a sense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35, and
  • an antisense primer having at least 70% sequence homology with SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38.
  • the kit according to any one of the preceding embodiments comprises primers whose sequence homology of 70% relates, in particular, to the first ten nucleotides in 3 ′ of said sequence.
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • the invention relates to a kit comprising: a pair of primers 1 targeting the V1-V2 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • a pair of primers 2 targeting the V4-V6 variable regions of the 16S gene consisting of:
  • kit according to the invention is suitable for implementing the method according to the invention.
  • the invention also relates to the use of the kit according to the invention for detecting the microorganisms present during infectious diseases, such as bacteria, viruses or yeasts.
  • the invention relates to the use of the kit for diagnosing an infectious disease in a subject or a plant.
  • the invention also relates to the use of the kit according to the invention for detecting at least one genetic disease or at least one cancer.
  • Example Example 1 of the method according to the invention for the amplification of two sequences of a specific gene for Staphylococcus aureus and Escherichia coli Figures 2A / 2B / 2C
  • the Relay PCR reactions were carried out as follows: 0.2 mM of dNTP, 4 mM of MgCl2, 0.05 units of FastStart polymerase (Roche) and the buffer according to the conditions of the supplier.
  • the TaqMan probes for primer pair 1 were 0.25 mM while those for primer pair 2 were 0.1 mM.
  • the pairs of primers were set at different concentrations: ImM for the standard duplexes, ImM for the pair of primers 1 in the Duplex-Relays and 0, lmM or ImM for the pair of primers 2 in the Duplex-Relays.
  • the cycles were as follows: denaturation at 95 ° C 10min then 55 cycles at 95 ° C 15sec / 55 ° C 15sec / 68 ° C 15sec. About 100 equivalent genome copies of each of the bacteria tested were added to the mixes to carry out the amplifications.
  • the amplification of the two sequences of interest was carried out by a standard duplex PCR, by PCR Relay according to the invention with a ratio of primer pair 1: primer pair 2 equal to 10: 1 and by Relay PCR according to the invention. the invention with a ratio of primer torque 1: primer pair 2 equal to 1: 1.
  • the pair of primers making it possible to amplify the specific sequence of the Staphylococcus aureus gene consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and the pair making it possible to amplify Escherichia coli consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the results are shown in Figure 2A and Table 3. The inventors thus observed a superposition of Cqs (number of cycles initiating detection of the fluorescence signal) meaning that an identical quantity of bacterial genome has been added to the PCR mix. . In addition, as many amount of Escherichia coli and Staphylococcus aureus amplicons were generated.
  • the pair of primers 1 consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 and the pair of primers 2 consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the first pair of primers makes it possible to amplify the specific sequence of the Staphylococcus aureus gene and the second pair of hybrid or chimeric primers makes it possible to amplify the specific sequence of the Escherichia coli gene.
  • the results are shown in FIG. 2B and Table 3. The inventors thus observed a Cq shift of the curves between the amplicons Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
  • SA values for Staphylococcus aureus
  • EC values for Esche ri chia coli.
  • Example 2 of the method according to the invention for the amplification of two sequences of a specific gene for Klebsiella pneumoniae and for Staphylococcus aureus Figures 3A / 3B / 3C
  • the amplification of the two sequences of interest was carried out by a standard Duplex PCR, and by Duplex-Relay PCR according to the invention with a ratio of primer pair 1: primer pair 2 equal to 10: 1 and by PCR Duplex-Relay according to the invention with a ratio of primer torque 1: primer pair 2 equal to 1: 1.
  • the two pairs of primers were put in strong concentration.
  • the pair of primers making it possible to amplify the specific sequence of the Klebsiella pneumoniae gene consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and the pair making it possible to amplify Staphylococcus aureus consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the results are represented in FIG. 3A and Table 4.
  • the inventors thus observed a superposition of the Cqs (number of cycles initiating detection of the fluorescence signal) meaning that an identical quantity of bacterial genome has indeed been added to the PCR mix. .
  • as many amount of Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus amplicons were generated.
  • the pair of primers 1 consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and the pair of primers 2 consists of the primers of sequences SEQ ID NO : 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the first pair of primers makes it possible to amplify the specific sequence of the Klebsiella pneumoniae gene and the second pair of chimeric primers makes it possible to amplify the specific sequence of the Staphylococcus aureus gene.
  • the results are shown in FIG. 3B and Table 4. The inventors thus observed a Cq shift of the curves between the amplicons Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus.
  • the delay caused by the Duplex-Relay PCR was 1.99 cycles (35.35-33.36) for the primer ratio 10: 1, ie approximately a factor of 4 (2 L 1.99). It leads to a difference in quantity of approximately 4 times less amplicons relating to the Staphylococcus aureus gene compared to amplicons of Klebsiella pneumoniae.
  • the primer pairs used are identical to those used in Relay PCR (10: 1 ratio).
  • the results are presented in FIG. 3C and Table 4. The inventors also observed a Cq shift of the curves between the amplicons Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus.
  • the delay caused by the Duplex-Relay PCR was 2.59 cycles (36.43-33.84), or approximately a factor of 6 (2 L 2.59). It leads to a difference in the quantity of approximately 6 times less amplicons relating to the Staphylococcus aureus gene compared to the amplicons of Klebsiella pneumoniae. [Table 4]
  • KP values for Klebsiella pneumoniae SA: values for Staphylococcus aureus
  • Example 3 of the method according to the invention compared with a standard multiplex PCR for the amplification of two sequences of a 16S gene of Klebsiella pneumoniae (FIG. 6)
  • the Relay PCR reactions were carried out as follows: 0.2mM of dNTP, 4mM of MgCl2, 0.05 units of FastStart polymerase (Roche) and the buffer according to the conditions of the supplier.
  • the pairs of primers were set at different concentrations: ImM for the standard simplex, ImM for the standard Duplex, ImM for the pair of primers 1 in the Duplex Relays and 0.04 mM for the pair of primers 2 in the Duplex Relays .
  • the cycles were as follows: denaturation at 95 ° C 10min then 65 cycles at 95 ° C 15sec / 55 ° C 15sec / 68 ° C 30sec. About 100 equivalent genome copies of Klebsiella pneumoniae were added to the mixes to achieve amplifications.
  • Line 1 represents the amplicon of the 5 'region of the 16S gene (covering the variable areas VI to V2) (PCR control).
  • Line 2 represents the amplicon of the central region of the 16S gene (covering the variable areas V4 to V6) (PCR control).
  • Lane 3 represents the standard multiplex PCR amplicons of the V1-V2 and V4-V6 regions of the 16S gene.
  • Line 4 represents the amplicons of the V1-V2 and V4-V6 regions of the 16S gene with the method according to the present invention (PCR multiplex relay),
  • the two pairs of primers were placed in high concentration (Row 3).
  • the pair of primers making it possible to amplify the V1V2 sequence of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 and the couple making it possible to amplify the V4-V6 sequence of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 23.
  • the results are shown in Figure 6.
  • the inventors observed (line 3 and left arrow) that there is no amplicon of the V1-V2 region of the 16S gene demonstrating that the standard conditions of multiplexed PCR do not. are not compatible with the simultaneous amplification of the 2 regions of the 16S gene.
  • the pair of primers 1 consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 and the pair of primers 2 consists of the primers of sequences SEQ ID NO : 28 and SEQ ID NO: 33.
  • the first pair of primers makes it possible to amplify the V1-V2 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae and the second pair of chimeric primers makes it possible to amplify the V4-V6 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae.
  • the results are represented in FIG. 6.
  • the inventors have thus observed that the conditions of the relay PCR make it possible to simultaneously co-amplify the 2 regions of the 16S gene (Line 4) and that the amplicons of the V1-V2 region are in addition. large quantity than those in the region central (stronger signal for the V1-V2 amplicon while its size is smaller).
  • the method according to the present invention makes it possible to co-amplify the two targeted regions, unlike a standard multiplex PCR.
  • the particular structure of the chimeric primers according to the present invention thus makes it possible to overcome the problems of the prior art, in particular of multiplex PCR.
  • Example 4 of the method according to the invention compared with a standard multiplex PCR for the amplification of three sequences of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae (FIG. 7)
  • the Relay PCR reactions were carried out as follows: 0.2 mM of dNTP, 4 mM of MgCl2, 0.05 units of FastStart polymerase (Roche) and the buffer according to the conditions of the supplier.
  • the primer pairs were set at different concentrations: ImM for standard Triplexes, ImM for primer pair 1 in Triplex Relays and 0.04 mM for primer pair 2 and primer pair 3 in Triplexes Relay.
  • the cycles were as follows: denaturation at 95 ° C 10min then 65 cycles at 95 ° C 15sec / 55 ° C 15sec / 68 ° C 18sec. About 100 equivalent genome copies of Klebsiella pneumoniae were added to the mixes to carry out the amplifications.
  • the pair of primers making it possible to amplify the specific sequence (V1-V2) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16
  • the couple making it possible to amplify the specific sequence (V4-V6) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 23
  • the pair making it possible to amplify the specific sequence (V7-V9) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae is consisting of the primers of sequences SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25.
  • the pair of primers making it possible to amplify the specific sequence (V1V2) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16
  • the pair making it possible to amplify the specific sequence (V4-V6) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 33
  • the pair making it possible to amplify the specific sequence (V7-V9) of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequences SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36 .
  • the primers of the pair targeting the V1-V2 region are placed in high concentration while the hybrid or chimeric primers of the other pairs are placed in low concentration. The results are shown in Figure 7.
  • the Triplex Relais is capable of amplifying the 3 regions of the 16S gene of Klebsiella pneumo niae, namely region VI to V2 (343pb), region V7 to V9 (413 bp in standard Duplex PCR and 447 bp in Duplex Relay PCR) and region V4 to V6 (509 bp in standard Duplex PCR and 543 bp in Relay Duplex PCR).
  • the method according to the present invention makes it possible to co-amplify the three targeted regions.
  • Example 5 of the process according to the invention with a pair of primer 1 comprising a primer in high concentration and a hybrid or chimeric primer in low concentration (FIG. 8).
  • the two Relay PCR reactions were carried out as follows: 0.2 mM of dNTP, 4 mM of MgCl2, 0.05 units of FastStart polymerase (Roche) and the buffer according to the conditions of the supplier.
  • the primers were put at different concentrations: ImM for the two primers of pair 1 and 0.04 mM for the pair of primers 2.
  • the primers were put at different concentrations: ImM for the first standard primer of couple 1, 0.04 m M for the second chimeric primer of couple 1, and 0.04 mM for the chimeric primers of couple 2.
  • the cycling was as follows: denaturation at 95 ° C 10min then 55 cycles at 95 ° C 15sec / 55 ° C 15sec / 68 ° C 45sec. About 100 equivalent genome copies of Klebsiella pneumoniae were added to the mixes to carry out the amplifications.
  • the pair of primers making it possible to amplify the V1-V2 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 in high concentration
  • the torque allowing to amplify the V7-V9 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of chimeric primers of sequences SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36 in low concentration.
  • a single primer of pair 1 was put in high concentration, SEQ ID NO: 14, the other primer being a hybrid primers put in low concentration SEQ ID NO: 26 .
  • the pair of primers making it possible to amplify the V1V2 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of sequence SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 26, the couple making it possible to amplify the V7-V9 region of the 16S gene of Klebsiella pneumoniae consists of the primers of the sequences SEQID NO: 34 and SEQID NO: 37.
  • the results are represented in FIG. 8.
  • the inventors observed that under the 2 conditions, the amplicons corresponding to the V1-V2 regions (343 bp for the first Duplex Relay PCR (line 1) and t349 bp for the second Duplex Relay PCR (line 2) and V7-V9 (447 bp for the first Duplex Relay PCR (line 1) and 453 bp for the second Duplex Relay PCR (line 2) are well amplified.
  • V7-V9 447 bp for the first Duplex Relay PCR (line 1) and 453 bp for the second Duplex Relay PCR (line 2) are well amplified.
  • the fact of using a single primer of couple 1 in high concentration seems to facilitate PCR Relay according to the present invention even more.
  • the brightness of the V1-V2 amplicon band identical to that of the V7-V9 band suggests that the amount of VI-V2 amplicon is much greater. to that of the V7-V9 amplicons, the V1-V2 amplicons being smaller

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces (1) et d'un couple d'amorces (2). En particulier, la première amorce du couple d'amorces (2) comprend en outre en (5') la séquence de la première amorce du couple d'amorces (1), et la deuxième amorce du couple d'amorces (2) comprend en outre en (5') la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces (1). L'invention concerne également un kit et un kit de détection apte à mettre en oeuvre ledit procédé et ses utilisations.

Description

PROCEDE DE PCR MULTIPLEXE POUR LA DETECTION DE MICROORGANISMES
ET SON UTILISATION
Domaine de l'invention
L'invention se rapporte au domaine de la détection et de l'amplification d'au moins un acide nucléique d'intérêt, en particulier dans le diagnostic infectieux. L'invention concerne ainsi un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 amplifiant un premier acide nucléique (A) et d'au moins un couple d'amorces hybrides ou chimères 2 amplifiant un deuxième acide nucléique (B). En particulier, la première amorce telle qu'une amorce sens du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. L'invention concerne également les amorces, un kit apte à mettre en œuvre ledit procédé et ses utilisations.
État de la technique
Ces dernières années, le diagnostic infectieux a fortement évolué, notamment par l'utilisation des méthodes de biologie moléculaire telles que l'amplification génomique ou Polymerase Chain Reaction (PCR). La PCR remplace de plus en plus les méthodes sérologiques et microbiologiques classiques, telles que la mise en culture des bactéries ou les tests ELISA. Les avantages de la PCR sont nombreux, le test est rapide, sensible et spécifique. Malgré un coût encore assez important et donc réservé aux analyses difficiles ou à certains laboratoires d'analyse, la spécificité et la sensibilité du diagnostic par PCR remplacera à terme les analyses classiques qui sont mises en œuvre en première intention. La PCR standard permet d'amplifier un acide nucléique d'intérêt à partir d'un couple d'amorces déterminé. Dans le diagnostic infectieux, par exemple, lors d'une suspicion d'infection à E. Coli, un couple d'amorce permettant l'amplification d'un acide nucléique spécifique à E. Coli peut être utilisé. Lorsque l'origine de l'infection n'est pas connue, il est nécessaire d'utiliser des couples d'amorces spécifiques à chacun des pathogènes que l'on souhaite détecter. Dans une approche PCR dite simplex, un seul couple d'amorce est utilisé et il faut reproduire autant de fois que nécessaire une réaction PCR vis à vis du nombre de virus, bactéries ou levures que l'on souhaite identifier comme responsables de l'infection. Dans une approche PCR dite multiplexe, tous les couples d'amorces sont ajoutés en une seule réaction et tous les pathogènes recherchés seront identifiés en une seule fois.
La PCR multiplexe est une PCR permettant d'amplifier simultanément plusieurs séquences d'acides nucléiques différentes à partir d'un même échantillon biologique. Elle permet d'effectuer plusieurs amplifications ciblées dans une seule et même réaction. La PCR multiplexe est donc particulièrement adaptée dans le diagnostic infectieux. Lors du diagnostic infectieux, des couples d'amorces différents sont utilisés pour cibler plusieurs bactéries, virus ou levures lors d'une même réaction PCR en présence de l'échantillon biologique cible.
Toutefois, les couples amorces utilisés en PCR multiplexe nécessitent d'être fortement optimisées afin que toutes les amorces puissent travailler à la même température pendant la PCR, permettant notamment d'éviter le phénomène de réactions croisées.
À titre d'exemple, la PCR multiplexe est capable de révéler au moins un pathogène lors de pneumonie communautaire chez 77 % des patients hospitalisés, par rapport à 39 % par culture (NJ Gadsby CD Russell MP McHugh Comprehensive molecular testing for respiratory pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2016). Lors de diarrhées, elle permet de détecter jusqu'à trois fois plus de pathogènes dans les selles que les méthodes traditionnelles (CR Stensvold HV Nielsen Comparison of microscopy and PCR for détection of intestinal parasites in Danish patients supports an incentive for molecular screening platforms. J Clin Microbiol 2012). Ainsi, un seul test peut mettre en évidence la présence dans l'échantillon de plusieurs agents infectieux en moins de deux heures. Aujourd'hui, des panels sont déjà proposés aux cliniciens pour les méningites, les infections sexuellement transmissibles, les infections respiratoires et l'entérocolite infectieuse.
Néanmoins, la PCR multiplexe est limitée à la détection d'une quantité de pathogènes prédéfinie, dont les couples d'amorces ciblant au moins un fragment d'un gène spécifique desdits pathogènes sont inclus dans le panel. Afin d'étendre le panel de détection, le kit de détection peut comprendre un nombre très important d'amorces permettant donc de détecter une grande quantité de microorganismes. Ainsi, plus on souhaite augmenter le nombre de pathogènes ciblés dans un panel, plus on aura tendance à augmenter le nombre de couples d'amorces. De manière générale, un pathogène est détecté par un couple d'amorce dont l'amplicon est spécifique audit pathogène. Or, une forte concentration d'amorces différentes dans un unique test engendre un effet délétère contradictoire. Ainsi, il apparaît un phénomène de compétition entre les amorces ayant pour conséquence une inhibition des amorces. De plus les amplifications aspécifiques sont beaucoup plus probables par la multitude d'amorces utilisées. Par conséquent, des multiplexages trop élevés induisent une très mauvaise sensibilité de détection.
Il est également connu par les travaux d'I. Afonina et al. en 2007 (Primers with 5' flaps improve real-time PCR) que l'ajout en 5' d'une séquence non complémentaire de la cible de l'amorce améliore l'efficacité d'amplifications PCR. Cependant, ces ajouts de séquence ne règlent pas le problème d'amplification aspécifique ou de perte de sensibilité liées aux fortes concentrations d'amorces utilisées classiquement lors de PCR multiplexes.
L'invention vise à résoudre les problématiques et inconvénients de l'art antérieur et notamment éviter ou limiter la dégradation de la sensibilité de la PCR multiplexe qui peut se traduire par la non-amplification ou une mauvaise amplification d'acides nucléiques ciblés à cause du phénomène de compétition entre les amorces lorsqu'elles sont présentes dans un seul et même test en trop grande quantités ainsi que de supprimer ou limiter la dégradation de la sensibilité de la PCR multiplexe liée aux amplifications aspécifiques qui consomment de façon non-désirée les réactifs d'amplification.
Description de l'invention
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces hybrides 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la première séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B),
■ le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence d'acide nucléique (A), le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence d'acide nucléique (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), en réalisant une réaction d'amplification basée sur une transcription spécifique de la séquence d'acides nucléiques (A) et de la séquence d'acides nucléiques (B) présent dans l'échantillon, caractérisé en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Selon une variante, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 (dit chimère ou hybride) comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Préférentiellement, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1, plus préférentiellement inférieure.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre un troisième couple d'amorces B, un quatrième couple d'amorces 4 etc., comprenant chacun une première amorce dont la séquence comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et une deuxième amorce dont la séquence comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Selon une autre variante, la deuxième amorce ciblant la première séquence d'acide nucléique (A) peut lui aussi contenir en sa région 5' la séquence de la première amorce ciblant ce même acide nucléique (A).
Par exemple, le premier oligonucléotide du couple d'amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce sens ou antisens et le deuxième oligonucléotide du couple d'amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce antisens ou sens. Préférentiellement, le procédé selon l'invention est une PCR multiplexe et permet de réaliser des amplifications quantitatives différentielles, c'est-à-dire que les cibles ne sont pas amplifiées de la même manière conduisant à des différences de quantités produites pour un même nombre de cycle entre les cibles. Ladite PCR selon l'invention est également dénommée PCR Relais ou PCR selon l'invention dans la suite de la description.
La PCR selon l'invention permet notamment de détecter et identifier des microorganismes tels que des bactéries, virus, levures impliquées dans des maladies infectieuses. Les maladies peuvent être détectées chez un sujet tel qu'un animal ou un humain, ou chez un végétal.
Selon un second aspect, l'invention concerne également les amorces et kits comprenant des amorces spécifiques, un kit de détection apte à mettre en oeuvre le procédé de l'invention et son utilisation pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses.
L'invention est à présent décrite en détails en regard des figures décrites ci-après. Les figures ne sont qu'illustratives de certains modes de réalisation de l'invention et ne sont pas limitatives.
Figures
La Figure 1 représente le principe de la PCR Relais selon l'invention.
La Figure 2A représente un essai de PCR Duplex (multiplex à 2 cibles) standard avec un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 2B représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 2C représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 3A représente un essai de PCR Duplex standard avec un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 3B représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 3C représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus.
La Figure 4 représente la structure d'un couple d'amorces utilisé en PCR standard apte à amplifier une séquence cible, par exemple A comprenant une amorce sens de séquence sens FW1 et une amorce antisens de séquence RT1 ; et la structure d'un couple d'amorces hybrides ou chimères selon l'invention utilisé en PCR Relais apte à amplifier une séquence cible, par exemple B. Le couple d'amorces hybrides ou chimères comprend une amorce sens de séquence FW1+FW2 et une amorce antisens de séquence RT1+RT2. La séquence FW2 est apte à s'hybrider avec une région de la séquence cible B, la séquence FW1 correspond à la séquence de l'amorce sens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, et lesdites séquences FW1 et FW2 sont contigües pour former une seule amorce sens d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. Le couple d'amorces hybrides ou chimères comprend aussi une amorce antisens de séquence RT1+RT2, la séquence RT2 est complémentaire d'une région de la séquence cible B, la séquence RT1 correspond à la séquence de l'amorce antisens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences FW1 et FW2 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. À partir du second cycle de PCR, le couple d'amorces 1 présent en plus grande concentration dans le mélange est capable d'amplifier l'amplicon généré par le couple d'amorce 2, lors du premier cycle, et donc d'amplifier également la séquence cible B. Ainsi, le couple d'amorces 1 est capable d'amplifier la séquence cible A mais également la séquence cible B à partir du second cycle de PCR.
La Figure 5 représente la séquence du gène 16S bactérien. Ladite séquence comprend : 9 régions variables et spécifiques à chaque espèce, et 10 régions conservées entre les espèces, contiguës auxdites régions variables. Les régions variables sont numérotées VI à V9. Les régions conservées permettent de définir, selon les connaissances de l'homme du métier, la séquence nucléotidique des amorces sens et antisens aptes à s'hybrider sur ces régions conservées entourant au moins une région variable d'intérêt (par exemple VI à V2).
La Figure 6 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode Duplex (multiplex à 2 cibles) standard ou selon le procédé de la présente invention Duplex Relais. Dans toutes les conditions, 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. Ligne 1 : amplicon de la région 5' du gène 16S (amplicon couvrant les zones variables VI à V2) obtenus avec des amorces ciblant des zones conservées contigües auxdites zones variables en forte concentration (PCR contrôle). 2 : amplicon de la région centrale du gène 16S (amplicon couvrant les zones variables V4 à V6) obtenus avec des amorces ciblant des zones conservées contigües auxdites zones variables en forte concentration (PCR contrôle). 3 : amplicon en PCR multiplexe standard des régions 5' (V1-V2) et centrale (V4-V6) du gène 16S avec deux couples d'amorces ciblant respectivement chaque zone variable, les amorces étant en forte concentrations. 4 : amplicon des 2 régions du gène 16S selon le procédé de la présente invention en Duplex Relais où le premier couple d'amorces cible la région 5' (V1-V2) et le 2nd couple d'amorces hybrides ou chimères comprend une séquence apte à cibler la région centrale (V4-V6) mais également la séquence du premier couple d'amorce, lesdites amorces sont utilisées à des hautes (premier couple d'amorce) et basses concentrations (deuxième couple d'amorces) respectivement. Les flèches indiquent l'amplification ou la non- amplification d'amplicon d'intérêt (ici la région V1-V2 du gène 16S).
La Figure 7 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode Triplex (multiplex à 3 cibles) standard ou selon le procédé de la présente invention (Triplex Relais). Dans toutes les conditions 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. 1 : amplicons obtenus avec une PCR Triplex standard, les amorces étant à ImM chacune. 2 : amplicons obtenus avec une PCR Triplex Relais où les amorces chimères ou hybrides ont été utilisés à une faible concentration de 0,04 mM. Les amplicons V4-V6 et V7-V9 de la Triplex Relais sont légèrement plus grands que leur correspondant en Triplex standard à cause de la longueur des amorces chimères qui augmentent leur taille après polymérisation.
La Figure 8 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode PCR multiplexe Relais comprenant une seule amorce standard en forte concentration. Dans toutes les conditions 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. 1 : amplicons obtenus avec une PCR Duplex Relais comprenant un couple d'amorce 1 en forte concentration ciblant la région V1-V2 du gène 16S et un couple d'amorce 2 hybrides ou chimères en faible concentration ciblant la région V7-V9 du gène 16S. 2 : amplicons obtenus avec une PCR Duplex Relais comprenant un couple d'amorce 1 ciblant la région V1-V2 du gène 16S constitué d'une amorce sens en forte concentration et d'une amorce antisens hybride ou chimère en faible concentration comprenant en 5' la séquence de l'amorce sens et un couple d'amorce 2 hybrides ou chimères en faible concentration ciblant la région V7-V9 du gène 16S. Ainsi, l'amorce antisens du premier couple ainsi que les amorces sens et antisens du deuxième couple sont des amorces hybrides ou chimères. Seule l'amorce sens du couple d'amorce 1 est présente en forte concentration.
Définitions
Par « patient », on entend au sens de l'invention un sujet qui peut être un être humain ou un animal, de préférence un être humain ou un mammifère. De préférence, le sujet est un patient humain, quel que soit son âge ou son sexe. Les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants sont également inclus.
Par « diagnostic », on entend au sens de l'invention un test qui vise à détecter et identifier une ou des pathologie(s), en particulier la détection et l'identification de maladies infectieuses chez un sujet ou un végétal afin d'être en mesure d'administrer au sujet ou au végétal un traitement correspondant à la pathologie.
Par « couple d'amorces » ou « couple d'oligonucléotides » on entend au sens de l'invention deux oligonucléotides permettant d'amplifier une séquence cible dans le cadre d'une PCR.
Par « amorce » ou « oligonucléotide » ou « primer », on entend au sens de l'invention un court segment d'acides nucléiques de un à quelques dizaines de nucléotides. Lesdites amorces sont aptes à s'hybrider avec une séquence complémentaire. Dans le cadre de l'invention, ils sont aptes à s'hybrider avec un fragment de la séquence cible. La séquence cible peut être une séquence d'acides nucléiques (ADN ou ARN).
Par « séquence FW1 », on entend au sens de l'invention la séquence d'un oligonucléotide de une à quelques dizaines de nucléotides, en particulier la séquence d'une amorce sens apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence d'intérêt.
Par « séquence RT1 » on entend au sens de l'invention la séquence d'un oligonucléotide de une à quelques dizaines de nucléotides, en particulier la séquence d'une amorce antisens apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence d'intérêt.
Par « couple d'amorces apte à amplifier une séquence d'acides nucléiques d'intérêt » on entend au sens de l'invention un couple d'amorces comprenant une amorce sens et une amorce antisens apte à amplifier une séquence déterminée d'intérêt par PCR. À titre d'exemple, la séquence nucléique d'intérêt peut être une séquence présente dans la partie variable du gène 16S d'une bactérie. Lesdites amorces étant dessinées pour cibler ladite séquence d'intérêt selon les connaissances générales de l'homme du métier.
Par « amplification », on entend au sens de l'invention, l'amplification de la séquence cible lors d'une réaction PCR et donc l'augmentation du nombre de copies de la séquence cible. Les amorces s'hybrident avec la séquence complémentaire préalablement dénaturée, suivi de l'élongation des brins par l'action de la polymérase. La réaction se poursuit avec plusieurs cycles successifs permettant d'augmenter le nombre de copies de l'amplicon.
Par « amplicon », on entend au sens de l'invention, un fragment d'acide nucléique correspondant à la séquence amplifiée lors de la PCR et délimité par les deux amorces utilisées. L'amplicon est donc une copie de la séquence cible.
Par « amorce hybride » ou « amorce chimère », on entend au sens de l'invention une amorce comprenant une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec un brin complémentaire de la séquence cible et en 5' une séquence d'acides nucléiques correspondant à la séquence d'une amorce appartenant à un autre couple d'amorce, par exemple la séquence d'une amorce sens ou antisens d'un autre couple d'amorce. Dans le cadre de l'invention, le couple d'amorces 2, B et 4 est constitué d'amorces hybrides ou chimères. Selon une variante de l'invention, le couple d'amorce 1 comprend une amorce « standard » et une amorce hybride ou chimère. Par exemple, le premier oligonucléotide du couple d'amorces 2 comprend une séquence apte à s'hybrider avec une séquence d'acides nucléiques spécifique (cible B) et en 5' une séquence d'acides nucléiques correspondant à la séquence du premier oligonucléotide du couple d'amorces 1 apte à s'hybrider avec une autre séquence d'acides nucléiques spécifique (cible A).
Par « ratio de concentration », on entend au sens de l'invention, le rapport de concentration du couple d'amorces 1 par rapport à un deuxième couple d'amorces tel que le couple d'amorces 2. Par exemple, un ratio de 1:1 correspond à une concentration identique du premier couple et du deuxième couple et un ratio de 10:1 correspond à une concentration 10 fois plus importante du premier couple par rapport au deuxième.
Description détaillée de l'invention
L'invention a donc pour objet un nouveau procédé de PCR dite multiplexe. Il est connu des PCR multiplexes dites standard qui permettent d'identifier un très grand nombre de séquences cibles. De telles PCR multiplexes standard nécessitent la présence en forte concentration de chaque couple d'amorces ciblant un acide nucléique particulier. En PCR multiplexe standard, chaque couple d'amorces est donc présent à la même forte concentration lors de la réaction PCR multiplexe. À partir d'au moins 4 ou 5 couples d'amorces différents, les conditions de réaction commencent à se dégrader. En outre, l'apparition d'un phénomène de compétition entre les amorces a pour conséquence une inhibition des hybridations spécifiques des amorces. De plus, des amplifications aspécifiques peuvent survenir par la multiplicité des amorces utilisées. Il en résulte que les PCR multiplexes standard ont une très mauvaise sensibilité de détection.
L'invention concerne un nouveau procédé PCR multiplexe dit PCR multiplexe Relais (ou PCR Relais). Dans la PCR multiplexe Relais, soit le procédé selon l'invention, un seul couple d'amorces ou une seule amorce est utilisée en forte concentration, toutes les autres amorces sont en très faible concentration. Grâce à l'invention, il est possible de conserver une sensibilité extrême pour tous les acides nucléiques ciblés.
Il est aussi possible de favoriser l'amplification de certains acides nucléiques par rapport à d'autres (asymétrie d'amplification quantitative ou amplification quantitative différentielle), en particulier les acides nucléiques de la cible A, par rapport aux autres. Ces acides nucléiques amplifiés de façon préférentielle seront ainsi présents en plus grande quantité. En diagnostic, privilégier certains acides nucléiques présente un avantage médical du fait que certains acides nucléiques sont plus informatifs que d'autres.
Ainsi, l'invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la première séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B), i. le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence d'acide nucléique (A), ii. le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence d'acide nucléique (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), caractérisée en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Lors de l'étape c., l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), est réalisée par une réaction d'amplification basée sur une polymérisation (élongation) de la séquence d'acides nucléiques (A) et de la séquence d'acides nucléiques (B) présent dans l'échantillon
Selon une variante, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce ou de la deuxième amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Préférentiellement, la séquence de la première amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües. Selon une variante, lesdites séquences ne sont pas contiguës mais espacées de quelques nucléotides avec un espaceur (ou « linker » ou « spacer ») d'une taille comprise entre 1 et 12 nucléotides.
Selon une autre variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que : la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce dudit couple d'amorce 1, lesdites séquences sont contiguës et la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, lesdites séquences sont contiguës.
Selon une autre variante, la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce dudit couple d'amorce 1 et/ou la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, lesdites séquences sont espacées de quelques nucléotides avec un espaceur (ou « linker » ou « spacer ») d'une taille comprise entre 3 et 12 nucléotides.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé met en œuvre : au moins un couple d'amorces 1 apte à amplifier une séquence cible A comprenant : une amorce sens de séquence FW1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence RT1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une séquence cible B comprenant : une amorce sens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence FW2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, lesdites séquences FW1 ou RT1 et RT2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides.
Ainsi, l'invention se rapporte également à un couple d'amorces hybrides ou chimères comprenant : une amorce sens (ou premier oligonucléotide) de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence FW2 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, la séquence FW1 ou RT1 correspond respectivement à la séquence de l'amorce sens ou antisens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 sont contigües pour former une seule amorce sens d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides, et une amorce antisens (ou deuxième oligonucléotide) de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, la séquence RT1 ou FW1 correspond respectivement à la séquence de l'amorce antisens ou sens du couple d'amorce 1 présente en concentration égale ou supérieur dans le mélange, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides.
Selon une variante, l'invention se rapporte également à un couple d'amorces hybrides ou chimères comprenant : une amorce sens ou antisens (ou premier oligonucléotide) de séquence FW1 ou RT1, la séquence FW1 ou RT1 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible A, présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences sont d'une longueur comprise entre 6 et 70 nucléotides, et une amorce sens ou antisens hybride ou chimère (ou deuxième oligonucléotide) de séquence FW1 et de séquence RT1 ou de séquence RT1 et de séquence FW1, lesdites amorces étant présente en plus faible concentration par rapport au premier oligonucléotide de séquence FW1 ou RT1 dans le mélange, lesdites séquences FW1 et RT1 ou RT1 et FW1 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides.
Lors d'une PCR Duplex Relais, selon la présente invention, la réaction de PCR s'opère dans un mélange comprenant un couple d'amorces 1 apte à s'hybrider et amplifier une première séquence d'acides nucléiques (A) et un couple d'amorces 2 apte à s'hybrider et amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques (B) comme cela est le cas pour une PCR Duplex standard. Toutefois, la PCR Duplex Relais se distingue de la PCR Duplex standard par le fait d'utiliser des amorces hybrides ou chimères pour le deuxième couple d'amorces, et éventuellement pour une amorce sens ou antisens du premier couple d'amorces.
Ainsi, à partir du second cycle de PCR, le couple d'amorce 1 est apte à amplifier également l'amplicon généré par le couple d'amorce 2 et donc la séquence cible B.
La PCR Duplex Relais comprend notamment la mise en contact de l'échantillon avec le mélange réactionnel comprenant le couple d'amorces 1 apte à amplifier la séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B).
Le couple d'amorces 1 est constitué d'une première amorce sens (par exemple de séquence FW1) et d'une deuxième amorce antisens (par exemple de séquence RT1) capable de s'hybrider chacune à la séquence complémentaire d'un des brins de l'acide nucléique (A) et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (A).
Le couple d'amorces 2 est constitué d'une première amorce sens (par exemple de séquence FW1-FW2) et d'une deuxième amorce antisens (par exemple de séquence RT1-RT2) capable de s'hybrider chacune à la séquence complémentaire d'un des brins de l'acide nucléique (B) et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (B).
En outre, le mélange réactionnel comprend l'ensemble des réactifs et conditions nécessaires pour réaliser une amplification PCR. Lesdits réactifs pouvant être initialement présents dans le mélange réactionnel ou ajoutés après la mise en contact de l'échantillon. Les réactifs nécessaires comprennent notamment des dNTPs et la polymérase que l'homme du métier sera en mesure de choisir en fonction de la PCR et des conditions de la réaction. Préférentiellement, la polymérase est la polymérase de Thermophilus aquaticus ou le fragment dit Klenow de cette polymérase.
Une fois l'ensemble des constituants présent dans le mélange réactionnel, l'amplification peut débuter.
Il est connu de l'homme du métier les différentes étapes d'une réaction PCR. Un cycle de PCR comprend une étape de dénaturation qui vise à séparer le double brin afin d'obtenir deux simples brins suivis de l'étape d'hybridation. Lors de cette étape, les amorces vont reconnaître la séquence complémentaire présente sur un des simples brins préalablement dénaturés et vont alors s'hybrider. S'ensuit une étape d'élongation qui permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire du simple brin. Ce brin est synthétisé à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend de la longueur de la séquence à amplifier.
La réaction PCR se poursuit avec un deuxième cycle, troisième etc. qui comprennent chacun les mêmes étapes. À la fin de la PCR, on obtient ainsi une amplification de la séquence comprise entre les amorces. Ladite séquence correspondant à l'amplicon.
Ainsi, l'amplification de la première et deuxième séquence d'acides nucléiques est basée sur une amplification de la séquence d'acides nucléiques cible (A) et de la séquence d'acides nucléiques cible (B) présent dans l'échantillon, préférentiellement une amplification simultanée de la séquence d'acides nucléiques cible (A) et de la séquence d'acides nucléiques cible (B) présent dans l'échantillon.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Les séquences de la première amorce du couple 2 et de la première amorce du couple 1 sont contigües et les séquences de la deuxième amorce du couple 2 et de la deuxième amorce du couple 1 sont également contigües.
Selon une variante, la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Les séquences de la première amorce du couple 2 et de la première amorce du couple 1 sont contigües et les séquences de la première ou de la deuxième amorce du couple 2 et de la deuxième amorce du couple 1 sont également contigües.
Préférentiellement, la première amorce du couple d'amorces 2 comprend une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5' la séquence de la première ou deuxième amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5' la séquence de la première ou deuxième amorce du couple d'amorces 1. La séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire à amplifier, telle que la séquence cible (B) étant distincte pour l'amorce 1 et l'amorce 2. En particulier l'amorce 1 peut être une amorce sens et l'amorce 2 une amorce antisens.
Préférentiellement, le premier couple d'amorces est apte à amplifier la première séquence (A) et la deuxième séquence (B) à partir du deuxième cycle de PCR. En effet lors du premier cycle de PCR, le premier couple d'amorces est apte à amplifier la première séquence (A) et le deuxième couple d'amorces est apte à amplifier la deuxième séquence (B). À la fin du premier cycle de PCR, il est généré des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la première amorce du premier couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la deuxième amorce du premier couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la première amorce du deuxième couple et la séquence complémentaire de la séquence (B), et des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la deuxième amorce du deuxième couple et la séquence complémentaire de la séquence (B).
Or, la première amorce du deuxième couple comprend la séquence de la première amorce du premier couple et d'une séquence apte à s'hybrider à la séquence (B) et la deuxième amorce du deuxième couple comprend la séquence de la deuxième amorce du premier couple et d'une séquence apte à s'hybrider à la séquence (B). Ainsi, lors du deuxième cycle, le couple d'amorces 1 est apte à amplifier les séquences d'acides nucléiques générées lors du premier cycle (Figure 1).
Selon un mode de réalisation, la séquence de la première amorce du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :5, la séquence de la deuxième amorce du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 ou SEQ ID NO :6, la séquence de la première amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :7 ou la SEQ ID NO :9, la séquence de la deuxième amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQID NO :8 ou la SEQID NO :10. Lesdites séquences étant listées dans le tableau 1 ci-dessous.
[Tableau IA] À des fins de diagnostic, il est d'intérêt de cibler les régions variables du gène 16S présent chez toutes les bactéries.
Le gène 16S comprend des régions conservées et des régions variables, en particulier 9 régions variables et 10 régions conservées (cf. Figure 5). Les régions variables sont numérotées de VI à V9 et sont toutes entourées par des régions conservées. L'homme du métier de par ses connaissances générales est parfaitement en mesure de déterminer lesdites régions sur le gène 16S. Tremblay et al. 2015 (Frontiers in Microbiology) décrit par exemple une de ces nombreuses méthodes pour amplifier et séquencer ces régions afin d'identifier les bactéries présentes dans un échantillon.
Aussi, selon un mode de réalisation préféré, les séquences d'intérêts correspondent à des séquences variables d'un gène unique ou d'au moins deux gènes distincts, plus préférentiellement les séquences d'intérêts correspondent aux séquences variables du gène 16S et lesdites amorces sont apte à s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S. Préférentiellement, l'amorce sens peut s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S en 5' d'une séquence variable dudit gène 16S et l'amorce antisens peut s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S en B' d'une séquence variable dudit gène 16S.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont dessiné des amorces permettant de s'hybrider spécifiquement sur les régions conservées contiguës aux régions variables d'intérêt tel que V1-V2, V3, V4-V6 et V7-V9. Ainsi l'amplicon généré correspond aux séquences des régions variables V1-V2 ou V3 ou V4-V6 ou V7-V9, dont la séquence est spécifique à un pathogène.
Selon un mode de réalisation préféré, la séquence de la première amorce (amorce sens) du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 et SEQ ID NO :24 ; la séquence de la deuxième amorce (amorce antisens) du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :27.
Préférentiellement, la séquence de la première amorce (amorce sens) du premier couple est la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15 et la séquence de la deuxième amorce (amorce antisens) du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :26 et la SEQ ID NO :27.
La séquence de la première amorce (amorce sens) du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :S4 ou SEQ ID NO :35 ; la séquence de la deuxième amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, ou SEQ ID NO :38. Lesdites séquences étant listées dans le tableau IB ci-dessous.
[Tableau IB]
Préférentiellement, le premier couple d'amorces ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27. Préférentiellement, le deuxième couple d'amorces hybrides ou chimères ciblant les régions variables V4 à V6 du gène 16S est constitué : - d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ
ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33.
Préférentiellement, le deuxième couple ou le troisième couple d'amorces ciblant les régions variables V7 à V9 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38. Préférentiellement, l'homologie de séquence de 70% concerne, en particulier les dix premiers nucléotides en 3' de ladite séquence.
Plus préférentiellement, le premier couple d'amorces ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou
SEQ ID NO :27.
Préférentiellement, le deuxième couple d'amorces hybrides ou chimères ciblant les régions variables V4 à V6 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33. Préférentiellement, le deuxième couple ou le troisième couple d'amorces ciblant les régions variables V7 à V9 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38.
Lors du procédé selon l'invention, la concentration du couple d'amorces 2 peut être inférieure, supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d'amorces par rapport à un autre et donc l'amplification d'une séquence d'intérêt.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1, plus préférentiellement inférieure. Lorsque, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure à celle du couple d'amorces 1, le couple d'amorces 2 est défavorisé par rapport au premier couple. Les amplicons générés par le couple d'amorces 1 vont ainsi être présents en plus grande quantité. Lorsqu'un séquençage est ensuite réalisé, les amplicons de la cible A seront surreprésentés et seront donc séquencés de façon préférentielle. L'obtention de leur séquence en sera alors plus rapide.
Le procédé selon l'invention permet de générer une quantité d'amplicons par le couple d'amorces 1 au moins 4 fois plus importante que les amplicons générés par le couple d'amorces 2. Les amplicons générés par le deuxième couple seront donc présents en plus faible quantité et sortiront moins vite lors du séquençage.
Préférentiellement, le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1, encore plus préférentiellement entre 1:1 et 100:1. Selon un mode particulièrement avantageux, le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est égal à 10:1, plus préférentiellement égal à 25 :1. Un tel ratio peut par exemple correspondre à une concentration du couple d'amorces 1 égale à ImM et une concentration du couple d'amorces 2 égale à 0,lmM ou 0,04mM.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la mise en contact de l'échantillon avec un 3ème couple d'amorces apte à amplifier une 3ème séquence d'acides nucléiques (C). La première amorce du couple d'amorces 3 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première amorce ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces 3 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Le procédé selon l'invention comprend ainsi 3 couples d'amorces différents permettant d'amplifier 3 séquences d'acides nucléiques cibles différentes notamment une séquence A, une séquence B et une séquence C. Ledit procédé est une PCR dites Triplex Relais.
Les séquences B et C sont préférentiellement amplifiées par des amorces sens et antisens hybrides ou chimères comprenant chacune la séquence de l'amorce sens du couple d'amorce 1 présent en plus grande concentration et la séquence de l'amorce sens ou antisens du couple d'amorce 1 présent en plus grande concentration.
Ainsi, le procédé selon l'invention met en oeuvre : au moins un couple d'amorces 1 apte à amplifier une séquence cible A comprenant :
■ une amorce sens de séquence FW1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et
■ une amorce antisens de séquence RT1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et au moins un couple d'amorces hybrides ou chimères 2 apte à amplifier une séquence cible B comprenant :
■ une amorce sens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence FW2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, ladite séquence FW1 ou RT1 et FW2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et
■ une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, ladite séquence FW1 ou RT1 et RT2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et au moins un couple d'amorces B apte à amplifier une séquence cible C comprenant :
■ une amorce sens de séquence FW1 et de séquence FW3, la séquence FW3 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible C, ladite séquence FW1 et FW3 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et
■ une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT3, la séquence RT3 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible C, ladite séquence FW1 ou RT1 et RT3 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides.
Lors du procédé, la concentration du couple d'amorce 3 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1 et/ou la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d'amorces par rapport à un autre. Préférentiellement, la concentration du couple d'amorce 3 est inférieure à celle du couple d'amorces 1 et/ou la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure à celle du couple d'amorces 1.
Préférentiellement, la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à celle du deuxième et/ou du troisième couple d'amorces et la concentration du couple d'amorces 2 est égale à celle du couple d'amorces 3.
Selon un mode de réalisation, la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à celle du deuxième et troisième couple d'amorces et la concentration du couple d'amorces 2 est supérieure à celle du couple d'amorces 3. Ainsi, le premier couple est favorisé par rapport au deuxième et le deuxième est également favorisé par rapport au troisième.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la mise en contact de l'échantillon avec un quatrième couple d'amorces dites hybrides ou chimères apte à amplifier une quatrième séquence d'acides nucléiques (D). La première amorce du couple d'amorces 4 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces 4 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Préférentiellement, la concentration du quatrième couple d'amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d'amorces 1 et la concentration du deuxième, du troisième et du quatrième couple est identique.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la mise en contact de l'échantillon avec un nième couple d'amorces apte à amplifier une nième séquence d'acides nucléiques. La première amorce du couple d'amorces n comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces n comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
Préférentiellement, la concentration du nième couple d'amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d'amorces 1 et la concentration du deuxième, du troisième, du quatrième couple et du nième couple est identique.
Par « n », on entend au sens de l'invention un entier naturel qui est un nombre positif permettant de dénombrer des objets comptant chacun pour un. Ainsi, un nombre entier a un successeur unique, c'est-à-dire un entier qui lui est immédiatement supérieur, et la liste des entiers naturels est infinie.
En outre, le milieu réactionnel permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs sonde(s) spécifique(s) couplée(s) à un fluorophore dont le spectre d'émission est différent des autres. Ainsi, chaque produit de la réaction PCR est mesuré en temps réel par la ou lesdites sonde(s) spécifique(s).
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de quantification des amplicons par l'utilisation de sondes couplées à un fluorophore, préférentiellement des sondes dites TaqMan.
De telles sondes selon l'invention sont listées dans le tableau 2 ci-dessous.
[Tableau 2]
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de détection des amplicons et donc des microorganismes par sondes fluorescentes, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée, PCR quantitative, Reverse-transcription PCR ou par séquençage d'ADN.
Lorsque la détection des amplicons est faite par séquençage, le procédé comprend en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés ou amplicons.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention permet de détecter et identifier des microorganismes (bactéries, levures, virus etc.) impliqués dans au moins une maladie infectieuse, préférentiellement des bactéries.
Le procédé selon l'invention peut aussi être utilisé pour le diagnostic des maladies génétiques, en oncologie et de façon générale en biologie moléculaire.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un kit comprenant un couple d'amorces 1 comprenant la SEQ ID N°1 et la SEQ ID N°2 ou la SEQ ID N°3 et la SEQ ID N°4 ou la SEQ ID N°5 et la SEQ ID N°6 et un couple d'amorces 2 comprenant la SEQ ID N°7 et la SEQ ID N°8 ou la SEQ ID N°9 et la SEQ ID N°10.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : ■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38,
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33, un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35, et
■ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38.
Préférentiellement, le kit selon l'un des quelconques modes de réalisation précédents comprend des amorces dont l'homologie de séquence de 70% concerne, en particulier les dix premiers nucléotides en 3' de ladite séquence.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID
NO :33, Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38,
Selon un autre mode réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID
NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33, un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID
NO :38. Préférentiellement, le kit selon l'invention est apte à mettre en oeuvre le procédé selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses, tels des bactéries, des virus ou des levures. Préférentiellement, l'invention concerne l'utilisation du kit pour diagnostiquer une maladie infectieuse chez un sujet ou un végétal.
L'invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour détecter au moins une maladie génétique ou au moins un cancer.
Exemple Exemple 1 du procédé selon l'invention pour l'amplification de deux séquences d'un gène spécifique de Staphylococcus aureus et d 'Escherichia coli (figures 2A/2B/2C)
Matériels et méthode
Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCI2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les sondes TaqMan pour le couple d'amorces 1 étaient à 0,25mM alors que celles pour le couple d'amorces 2 à 0,lmM. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations : ImM pour les Duplex standard, ImM pour le couple d'amorces 1 dans les Duplex-Relais et 0,lmM ou ImM pour le couple d'amorces 2 dans les Duplex-Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 55 cycles à 95°C 15sec/55°C 15sec/68°C 15sec. Environ 100 copies génomes équivalents de chacune des bactéries testées étaient ajoutées aux mix pour réaliser les amplifications.
Résultats
L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR standard en duplex, par PCR Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces l:couple d'amorces 2 égale à 1:1.
Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte concentration. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4 et le couple permettant d'amplifier Escherichia coli est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2. Les résultats sont représentés dans la Figure 2A et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu'une quantité identique de génome bactérien à bien été ajoutée au mix PCR. De plus, autant de quantité d'amplicons Escherichia coli et Staphylococcus aureus ont été générés.
Lors de la PCR Duplex-Relais avec un ratio 10:1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:3 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus et le deuxième couple d'amorces hybride ou chimères permet d'amplifier la séquence spécifique du gène d’Escherichia coli. Les résultats sont représentés dans la Figure 2B et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,09 cycles (35.27-33.18) pour un ratio d'amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2L1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 4 fois moins d'amplicons relatifs au gène d'Escherichia coli par rapport aux amplicons de Staphylococcus aureus.
Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d'amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la Figure 2C et le Tableau 3. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex- Relais était de 1,79 cycles (35.68-33.89), soit environ un facteur 3,5 (2L1,79). La quantité différentielle d'amplicons était là encore observée pour des facteurs similaires.
[Tableau B]
M. Cq= moyenne des Cq.
SD. Cq= déviation standard de Cq.
SA : valeurs pour Staphylococcus aureus EC : valeurs pour Esche ri chia coli.
Exemple 2 du procédé selon l'invention pour l'amplification de deux séquences d'un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae et de Staphylococcus aureus (figures 3A/3B/3C)
Le matériel et méthode est identique à celui décrit en Example 1. Résultats
L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR Duplex standard, et par PCR Duplex-Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Duplex-Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 1:1. Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte concentration. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple permettant d'amplifier Staphylococcus aureus est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4. Les résultats sont représentés dans la Figure 3A et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu'une quantité identique de génome bactérien a bien été ajoutée au mix PCR. De plus, autant de quantité d'amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus ont été générés.
Lors de la PCR Relais avec un ratio 10:1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae et le deuxième couple d'amorces chimères permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus. Les résultats sont représentés dans la Figure 3B et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 1,99 cycles (35.35-33.36) pour le ratio d'amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2L1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 4 fois moins d'amplicons relatifs au gène Staphylococcus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d'amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la Figure 3C et le Tableau 4. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,59 cycles (36.43-33.84), soit environ un facteur 6 (2L2,59). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 6 fois moins d'amplicons relatifs au gène Staphylococcus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. [Tableau 4]
M. Cq= moyenne des Cq.
SD. Cq= déviation standard de Cq.
KP : valeurs pour Klebsiella pneumoniae SA : valeurs pour Staphylococcus aureus
Exemple 3 du procédé selon l'invention comparé à une PCR multiplexe standard pour l'amplification de deux séquences d'un gène 16S de Klebsiella pneumoniae (figure 6)
Matériel & Méthode Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCI2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations : ImM pour les simplex standard, ImM pour les Duplex standard, ImM pour le couple d'amorces 1 dans les Duplex Relais et 0,04mM pour le couple d'amorces 2 dans les Duplex Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 65 cycles à 95°C 15sec/55°C 15sec/68°C 30sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications.
Résultats
L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR Duplex standard (Figure 6, ligne 3), et par PCR Duplex-Relais selon l'invention (Figure 6, ligne 4) avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 25:1 .
La ligne 1 représente l'amplicon de la région 5' du gène 16S (recouvrant les zones variables VI à V2) (PCR contrôle).
La ligne 2 représente l'amplicon de la région centrale du gène 16S (recouvrant les zones variables V4 à V6) (PCR contrôle).
La ligne 3 représente les amplicons en PCR multiplexe standard des régions V1-V2 et V4-V6 du gène 16S.
La ligne 4 représente les amplicons des régions V1-V2 et V4-V6 du gène 16S avec la méthode selon la présente invention (PCR multiplexe Relais),
Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte concentration (Ligne 3). Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence V1V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 et le couple permettant d'amplifier la séquence V4-V6 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :23. Les résultats sont représentés dans la Figure 6. Les inventeurs ont observé (ligne 3 et flèche de gauche) qu'il n'y a pas d'amplicon de la région V1-V2 du gène 16S démontrant que les conditions standard de PCR multiplexe ne sont pas compatibles avec l'amplification simultanée des 2 régions du gène 16S.
Lors de la PCR Relais avec un ratio 25 :1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :28 et SEQ ID NO :33. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la région V1-V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae et le deuxième couple d'amorces chimères permet d'amplifier la régionV4-V6 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae. Les résultats sont représentés dans la Figure 6. Les inventeurs ont ainsi observé que les conditions de la PCR relais permettent de co-amplifier simultanément les 2 régions du gène 16S (Ligne 4) et que les amplicons de la région V1-V2 sont en plus grande quantité que ceux de la région central (signal plus intense pour l'amplicon V1-V2 alors que sa taille est plus petite).
Par conséquent, la méthode selon la présente invention permet de co-amplifier les deux régions ciblées à l'inverse d'une PCR multiplexe standard. La structure particulière des amorces chimères selon la présente invention permet ainsi de surmonter les problématiques de l'art antérieur, en particulier de la PCR multiplexe.
Exemple 4 du procédé selon l'invention comparé à une PCR multiplexe standard pour l'amplification de trois séquences du gène 16S de Klebsiella pneumoniae (figure 7)
Matériel & Méthode
Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCI2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations : ImM pour les Triplex standard, ImM pour le couple d'amorces 1 dans les Triplex Relais et 0,04mM pour le couple d'amorces 2 et le couples d'amorces 3 dans les Triplex Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 65 cycles à 95°C 15sec/55°C 15sec/68°C 18sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications.
Résultats
Dans le cadre de la PCR Triplex standard, les trois couples d'amorces ont été mis en forte concentration (Ligne 1). Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique (V1-V2) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16, le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V4-V6) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :23 et le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V7-V9) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :25.
Dans le cadre de la PCR Triplex Relais (ligne 2), le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique (V1V2) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16, le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V4-V6) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :28 et SEQ ID NO :33 et le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V7-V9) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :36. Les amorces du couple ciblant la région V1-V2 sont mises en forte concentration alors que les amorces hybrides ou chimères des autres couples sont mises en faible concentration. Les résultats sont représentés dans la Figure 7.
Les inventeurs ont observé que les régions ciblées étaient mal amplifiées par la Triplex stan dard, notamment les régions variables VI et V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae. A l'in verse, la Triplex Relais est capable d'amplifier les 3 régions du gène 16S de Klebsiella pneumo niae à savoir la région VI à V2 (343pb), la région V7 à V9 (413 bp en PCR Duplex standard et 447 bp en PCR Duplex Relais)et la région V4 à V6 (509 bp en PCR Duplex standard et 543 bp en PCR Duplex relais).
Par conséquent, la méthode selon la présente invention permet de co-amplifier les trois ré gions ciblées.
Exemple 5 du procédé selon l'invention avec un couple d'amorce 1 comprenant une amorce en forte concentration et une amorce hybride ou chimère en faible concentration (figure 8).
Matériel & Méthode
Les deux réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCI2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Dans la première condition de Duplex Relais les amorces étaient mises à différentes concentrations : ImM pour les deux amorces du couple 1 et 0,04mM pour le couple d'amorces 2. Dans la deuxième condition de Duplex Relais les amorces étaient mises à différentes concentrations : ImM pour la première amorce standard du couple 1, 0,04m M pour la deuxième amorce chimère du couple 1, et 0.04mM pour les amorces chimères du couple 2. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 55 cycles à 95°C 15sec/55°C 15sec/68°C 45sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications.
Résultats
Dans le cadre de la première PCR Duplex Relais (Ligne 1), le couple d'amorces permettant d'amplifier la région V1-V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 en forte concentration, le couple permettant d'amplifier la région V7-V9 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces chimères de séquences SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :36 en faible concentration.
Dans le cadre de la deuxième PCR Duplex Relais (Ligne 2), une seule amorce du couple 1 a été mise en forte concentration, SEQ ID NO :14, l'autre amorce étant une amorces hybrides mises en faible concentration SEQ ID NO :26. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la région V1V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :26, le couple permettant d'amplifier la région V7-V9 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué desamorcesde séquences SEQID NO :34etSEQID NO :37. Les résultats sont représentés dans la Figure 8. Les inventeurs ont observé que dans les 2 conditions, les amplicons correspondant aux régions V1-V2 (343 bp pour la première PCR Duplex Relais (ligne 1) e t349pb pour la deuxième PCR Duplex relais (ligne 2) et V7-V9 (447 bp pour la première PCR Duplex Relais (ligne 1) et 453pb pour la deuxième PCR Duplex relais (ligne 2) sont bien amplifiées. Toutefois on remarque que le fait d'utiliser une seule amorce du couple 1 en forte concentration semble encore plus faciliter la PCR Relais selon la présente invention. De plus, la brillance de la bande des amplicons V1-V2 identique à celle de la bande V7-V9 suggère que la quantité d'amplicon VI- V2 est bien supérieure à celle des amplicons V7-V9, les amplicons V1-V2 étant plus petits. Cette variation du procédé de l'invention conserve donc l'amplification privilégiée de la région pour laquelle une amorce en forte concentration est utilisée.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B), i. le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence (A), ii. le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acides nucléiques (A et B), caractérisé en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la séquence de la première amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües
[Revendication B] Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième amorce du couple 1 est une amorce hybride comprenant en 5' la séquence de la première amorce du couple 1, lesdites séquences sont contiguës.
[Revendication 4] Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1.
[Revendication 5] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1.
[Revendication 6] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 100:1, préférentiellement 25:1.
[Revendication 7] Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre la mise en contact de l'échantillon avec un couple d'amorces 3 apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 3ème séquence d'acides nucléiques (C), caractérisé en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 3 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 3 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
[Revendication 8] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à la concentration du deuxième et/ou troisième couple.
[Revendication 9] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d'amorces 2 est égale à celle du couple d'amorces 3.
[Revendication 10] Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, comprenant en outre la mise en contact de l'échantillon avec un couple d'amorces 4 apte à amplifier une 4ème séquence d'acides nucléiques (D), caractérisé en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 4 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 4 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.
[Revendication 11] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d'amorces 4 est inférieure à la concentration du couple d'amorces 1.
[Revendication 12] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d'amorces 2, du couple d'amorces 3 et du couple d'amorces 4 est identique.
[Revendication 13] Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés.
[Revendication 14] Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'amplification des séquences d'acide nucléique d'intérêt permet de détecter et identifier au moins un microorganisme impliqué dans au moins une maladie infectieuse.
[Revendication 15] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les microorganismes sont identifiés par sondes fluorescentes, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée, PCR quantitative, Reverse-transcription PCR ou par séquençage d'ADN.
[Revendication 16] Kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33,
[Revendication 17] Kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38.
[Revendication 18] Kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33, un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué :
■ d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et
■ d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38,
[Revendication 19] Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 16 à 18 pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 15 et détecter au moins un microorganisme présent lors d'au moins une maladie infectieuse.
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