EP4100745A1 - Procede de capture et d'identification d'agglutinats cellulaires pour la detection d'anticorps anti-erythrocytaires multiplexe - Google Patents

Procede de capture et d'identification d'agglutinats cellulaires pour la detection d'anticorps anti-erythrocytaires multiplexe

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Publication number
EP4100745A1
EP4100745A1 EP21704212.6A EP21704212A EP4100745A1 EP 4100745 A1 EP4100745 A1 EP 4100745A1 EP 21704212 A EP21704212 A EP 21704212A EP 4100745 A1 EP4100745 A1 EP 4100745A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibodies
solid support
erythrocyte
detection method
sample
Prior art date
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Pending
Application number
EP21704212.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pauline FOLLET
Pierre Lebrun
Christophe Olivier
David Poirier
Vianney Souplet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innobiochips SAS
Original Assignee
Innobiochips SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Innobiochips SAS filed Critical Innobiochips SAS
Publication of EP4100745A1 publication Critical patent/EP4100745A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters

Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro detection and diagnostic methods using in particular samples of biological origin.
  • the methods more particularly concerned relate to the detection of anti-erythrocyte antibodies participating in the determination of the blood group.
  • the detection of anti-erythrocyte antibodies in biological samples remains of paramount importance, in particular in immunohaematology, in the field of blood transfusion, and in particular for the determination of blood groups or the assessment of the risk in the recipient.
  • anti-erythrocyte antibodies encompasses, in clinical practice, a large number of so-called regular or irregular antibodies, generally directed against antigenic patterns expressed on the surface of erythrocyte cells.
  • the antigens linked to the ABO blood group are oligosaccharide units.
  • the purpose of grouping AB O is thus to determine four blood groups according to the presence or absence of two antigens, A and B, on the surface of red blood cells. Each individual is alternately from group A if he has motif A, from group B if he has motif B, from group AB if he has motifs A and B, from group O if he has neither of the 2 reasons A or B.
  • each patient has in his serum or plasma the antibody (s) corresponding to the antigens that he does not have (so-called “Landsteiner” law).
  • a group A subject carrying the A antigen has anti-B antibodies.
  • Subject B carrying the B antigen has anti-A antibodies.
  • An AB subject carrying the A and B antigens does not have anti-A or anti-B antibodies.
  • a group O subject carrying no A or B antigens has anti-A and anti-B antibodies.
  • - a globular test known as Beth-Vincent, consisting in looking for antigens A (ABOI) and B (AB02) with the following monoclonal reagents: anti-A (anti-ABOl), anti-B (anti-AB02) and anti -AB (anti-AB03);
  • a plasma test called Simonin or Simonin-Michon, consisting of looking for anti-A and anti-B antibodies with the A1 and B test red blood cells, at least one of these red blood cells must be of the Rhesus phenotype (RH) negative.
  • RH Rhesus phenotype
  • anti-erythrocyte antibodies are also involved in transfusion safety, they recognize: Rhesus, Kell, MNS, P, Lutheran, Lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido / Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cramer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
  • an individual's serum may contain antibodies directed against one or more of the antigens listed above. These antibodies appear during antigenic stimulation by foreign red blood cells, for example following immunization against one or more antigens during a blood transfusion or even during pregnancy by a maternal immune reaction directed against the antigens. Fetal erythrocytes not belonging to the maternal group, especially during childbirth. These so-called irregular (or immune) antibodies are most often of the IgG isotype.
  • RAI Irregular Agglutinins
  • TIA Indirect anti-globulin test
  • the objective will be to assign the patients the red blood cells with the best compatibility.
  • the search for anti-erythrocyte antibodies in immunohaematology is based on the agglutination of test red blood cells whose phenotype is known. There are a large number of variations of these techniques. They can be manual, on an opaline plate, in a tube or microplate well, in a gel column, or fully automated.
  • WO85 / 01354 and WO02 / 16942 teach a method of detecting antibodies in blood, comprising a step of adsorbing an antigen onto a solid surface.
  • EP0223978A1 teaches a device for determining a blood group, consisting of a solid substrate, and one or more antibodies reactive with erythrocyte antigenic determinants.
  • US2007077605 teaches an optical device of the bio-disc type, suitable for determining a blood group.
  • WO2007 / 051844A1 and WO2008148886A1 teach devices or methods for identifying anti-erythrocyte antibodies in a sample, comprising contacting groups of beads, or particles.
  • WO2009007649A1 teaches a device for determining a blood group, comprising a support including a reactive zone consisting of a porous membrane and an absorbent membrane.
  • WO2012010666 teaches a method of detecting anti-erythrocyte antibodies, comprising contacting a sample with magnetic particles carrying said erythrocytes.
  • WO2019158726A1 teaches a detection device, consisting of a support and a hydrophobic porous membrane comprising beads complexed with an antibody or antigen.
  • the invention aims precisely to meet all of these needs.
  • the inventors propose to take advantage of the fact that antibody biochips can be used as a system for sorting agglutinated cells.
  • the originality of this approach is based on the fact that the capture, on antibody deposits, of agglutinated cells, is capable of producing a more intense signal and of different morphology than that generated by non-agglutinated cells.
  • the inventors were able to determine the cellular phenotypes involved in the agglutination and therefore the nature of the antibody initially present in the test sample.
  • This technology can be advantageously implemented in the context of the search for regular anti-erythrocyte antibodies such as anti-ABO group antibodies, or irregular ones.
  • This application is of particular interest for carrying out the indirect plasma test or Simonin test and carrying out a Research for Irregular Agglutinins (RAI).
  • RAI Irregular Agglutinins
  • Such multiplexed applications may include or consist, in particular, of the detection of: several types of anti-erythrocyte antibodies in a sample; of several types of anti-red blood cell antibodies in several samples.
  • these applications can therefore allow the simultaneous detection of several parameters, in one or more samples.
  • the present invention relates to an in vitro method for detecting anti-erythrocyte antibodies in a sample, comprising at least the following steps: a) bringing said sample into contact with one or more erythrocyte (s) test (s) or suspension of erythrocyte (s) test (s) of known phenotype, under conditions liable to induce haemagglutination, so as to obtain a reaction mixture; b) contacting said reaction mixture with a solid support containing a plurality of delimited adsorption zones having previously fixed antibodies or antibody fragments capable of binding antigenic determinants present on said erythrocyte (s) test (s) ; c) determining the presence or absence of a hemagglutination reaction on at least one of said adsorption zones, so as to detect the presence or absence of anti-erythrocyte antibodies in said sample; said steps a) and b) being carried out separately or simultaneously.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the said anti-erythrocyte antibodies to be detected are capable of specifically binding antigenic determinants chosen from the following systems or antigens: AB O, Rhesus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diego, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido / Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
  • antigenic determinants chosen from the following systems or antigens: AB O, Rhesus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diego, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the said anti-erythrocyte antibodies to be detected are capable of specifically binding antigenic determinants of the ABO system.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the said antibodies or antibody fragments of the adsorption zone are monoclonal or polyclonal antibodies chosen from: anti-A antibodies (ABOI) , anti-B antibodies (AB02), anti-AB antibodies (AB03), anti-H antibodies (H1), anti-D antibodies (RH1), anti-C antibodies (RH2), anti- antibodies c (RH4), anti-E antibodies (RH3), anti-e antibodies (RH5), anti-K antibodies (KEL1), anti-k antibodies (KEL2), anti-Kpb antibodies (KEL4), anti-Fya antibodies (FY1), anti-Fyb antibodies (FY2), anti-Jka antibodies (JK1), anti-Jkb antibodies (JK2), anti-S antibodies (MNS3), anti-s antibodies (MNS4), anti-Lea antibodies (LE1), anti-Leb antibodies (LE2), anti-M antibodies (MNS1), anti-N antibodies (MNS2), anti-A
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that at least two of the adsorption zones of the solid support each fix a plurality antibody and / or antibody fragment (s) capable of binding a distinct erythrocyte antigenic determinant.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the sample is a biological sample chosen from: a human serum, a human plasma, a human sample of whole blood.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that at least two of the adsorption zones of the solid support are spaced from each other by at least 100 ⁇ m, and / or that said zones d 'adsorption define an area of at least 10,000 ⁇ m2.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said solid support is a plastic support, and said adsorption zones are hydrophilic.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said plurality of delimited absorption zones forms a wall inclined relative to the rest of all or part of said solid support; for example, which comprises an inclined plane which forms an angle with a horizontal plane made up of all or part of said solid support, and in particular an angle with a horizontal plane made up of all or part of a zone of said solid support not fixing antibody and / or antibody fragment (s).
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said plurality of delimited absorption zones is planar, conical or hemispherical.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the antibodies or fragments of antibodies capable of binding the antigenic determinants are attached to the delimited adsorption zones, in a non-covalent manner.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the areas of adsorption of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more binding polymers comprising a polysaccharide backbone.
  • - carboxylic acid groups of the form -X-COOH, where X represents a linear or branched alkyl chain, substituted or not, comprising from 1 to 6 carbon atoms.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said solid support is, at least in part, functionalized with one or more linker polymers comprising one or more positively charged groups. pH of said reaction mixture.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the presence or absence of a hemagglutination reaction on said, or said, adsorption zone (s) is determined by comparison with a reference zone distinct from said, or said, zone (s) of said solid support.
  • step c) of determination is carried out after a step of sedimentation of said reaction mixture on said solid support.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that step c) of determination is carried out after a step of centrifugation of said solid support.
  • Figure 1 illustration of the general principle of the invention, applied to the determination of anti-erythrocyte antibodies in a sample.
  • Figure 2 illustration of a biochip / plate plan, or network of deposits, including at the bottom of the well one or more spots (or delimited adsorption areas), made up of anti-ABO and 3 anti-D antibodies.
  • Spot A represents an anti-ABOL deposit.
  • Spot B represents an anti-AB02 deposit.
  • Spot DI represents a deposit of anti D.
  • Spot D2 represents a deposit of anti D.
  • Spot D3 represents a deposit of anti D.
  • Figure 3 Photographic images of the bottom of the well in the presence of human plasma samples.
  • 3A result of a test using an AB sample.
  • 3B result of a test using a sample A.
  • 3C result of a test using a B sample.
  • 3D result of a test using an O sample.
  • Figure 4 Photographic images of the bottom of the well in the presence of human plasma samples.
  • 4A result of a test from a negative irregular sample.
  • 4B result of a test from a negative irregular sample.
  • 4C result of a test from a positive irregular sample.
  • 4D test result from a positive irregular sample.
  • plural such as “plurality of adsorption zones” implies the presence of "at least two”; this term can therefore, for example, designate 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or even more than 10.
  • erythrocyte red blood cell
  • red blood cell red blood cell
  • antigenic determinant present on erythrocytes encompasses not only any antigenic determinant present physiologically on the surface of erythrocytes, in particular any blood group determinant, but also any other determinant present on the surface of said erythrocytes, in particular not -physiological, and / or resulting from immunological reactions, relating to innate or acquired immunity, such as antibodies, or fragments of antibodies, or elements belonging to the complement system.
  • sample used in particular to designate a biological sample, encompasses in particular any sample likely to have been obtained beforehand from an individual, which includes any bodily fluid or fraction of bodily fluid, or tissue biopsy, which is susceptible.
  • erythrocytes and / or anti-erythrocyte antibodies physiological or pathological, regular or irregular.
  • a biological sample can denote herein any blood sample, or blood sample pellet, and / or any other preparation derived from blood, such as a whole blood sample, serum or plasma, lymph or cerebrospinal fluid.
  • a sample is also likely to include a sample of saliva, sweat, tears, milk, or urine.
  • antibody or antibody fragment encompasses all molecules of the immunoglobulin type, as well as any immunologically active part of said immunoglobulins, such as molecules containing one or more sites of interaction with a specific antigen of said immunoglobulins.
  • this term is not only limited to whole, regular (natural) or irregular antibodies, but also encompasses antibody fragments and their synthetic or recombinant variants. Unless otherwise indicated, this term therefore encompasses both so-called natural and non-natural antibodies, or synthetic, obtained recombinantly or not.
  • Antibodies are conventionally defined by two heavy chains linked together by a disulfide bridge, and each heavy chain is itself linked to a light chain by one or more disulfide bridges.
  • this term therefore encompasses all the antibodies, or fragments of said antibodies, comprising one of the five main classes of heavy chain, chosen from IgM, IgD, IgG, IgA and IgE; or one of the two types of light chain chosen from lambda (1) and kappa (k).
  • synthetic antibody encompasses all the antibodies obtained in vitro and comprising at least one fragment of a variable region of antibodies.
  • the synthetic antibodies can thus be chosen from the following constructions: Fab, a F (ab) '2, single domain antibody (sdAb), ScFv, Fab-scFv, ScFv-Fc, Sc (Fv) 2, diabody, di-diabody , triabody, tetrabody, pentabody, unibody, minibody, maxibody, nanobody, Small Modular Immunopharmaceutical (SMIP), and fragments comprising variable regions such as variable light (VF) and heavy (HF) chains.
  • SMIP Small Modular Immunopharmaceutical
  • fragments comprising variable regions such as variable light (VF) and heavy (HF) chains.
  • VF variable light
  • HF heavy chains.
  • anti-erythrocyte antibody or “anti-erythrocyte antibody” here designates any antibody, regular or irregular, directed against at least one antigenic determinant present on the
  • regular antibody or “natural antibody” here designates any anti erythrocyte antibody capable of being naturally present in an individual, therefore apart from any pathology and exposure to an external antigen.
  • This type of antibody generally includes all ABO (eg anti-A and anti-B) and H antibodies.
  • interleukin here denotes any anti-erythrocyte antibody which is not systematically present in subjects lacking the corresponding antigen.
  • non-AB O antibodies are conventionally defined as irregular antibodies, which includes in particular the following antibodies: anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K , anti-k, anti-Cw, anti-Kpa, anti-Kpb, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, anti-Fea, anti-Feb, anti-M, anti-N, anti -S, anti-s, anti-Fua, anti-Fub.
  • hemagglutination denotes, according to its usual meaning, all the agglutination reactions comprising the binding of anti-erythrocyte antibodies on antigenic structures present on the surface of red blood cells, and capable of causing, directly or indirectly , the formation of an aggregate of red blood cells. This term therefore encompasses both direct, indirect and passive hemagglutination reactions.
  • the present invention relates to an in vitro method for detecting anti-erythrocyte antibodies in a sample, comprising at least the following steps: a) bringing said sample into contact with one or more erythrocyte (s) test (s) or suspension of erythrocyte (s) test (s) of known phenotype, under conditions liable to induce haemagglutination, so as to obtain a reaction mixture; b) contacting said reaction mixture with a solid support containing a plurality of delimited adsorption zones having previously fixed antibodies or antibody fragments capable of binding antigenic determinants present on said erythrocyte (s) test (s) ; c) determining the presence or absence of a hemagglutination reaction on at least one of said adsorption zones, so as to detect the presence or absence of anti-erythrocyte antibodies in said sample; said steps a) and b) being carried out separately or simultaneously.
  • steps a) and b) are carried out separately.
  • steps a) and b) are carried out simultaneously.
  • the in vitro detection method can be characterized in that it comprises the following steps: a) contacting (i) a solid support containing a plurality of delimited adsorption zones having previously fixed antibodies or antibody fragments capable of binding antigenic determinants present on test erythrocyte (s), with (ii) a sample and (iii) one or more of said erythrocyte ( s) test (s) or suspension of erythrocyte (s) test (s) of known phenotype, under conditions liable to induce haemagglutination; then b) determining the presence or absence of a hemagglutination reaction on at least one of said adsorption zones, so as to detect the presence or absence of anti-erythrocyte antibodies in said sample .
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the said anti-erythrocyte antibodies to be detected are regular or irregular antibodies.
  • These antibodies are capable of specifically binding erythrocyte surface antigens.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the said anti-erythrocyte antibodies to be detected are capable of specifically binding antigenic determinants chosen from the following systems or antigens: ABO, Rhesus, Kell, MNS , P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diego, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido / Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen , Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
  • said anti-erythrocyte antibodies to be detected may be able to specifically bind antigenic determinants chosen from the AB O and Rhesus systems or antigens.
  • said anti-erythrocyte antibodies to be detected are capable of specifically binding antigenic determinants of the ABO system.
  • said anti-erythrocyte antibodies to be detected can be anti-A antibodies, anti-B antibodies, or anti-H antibodies.
  • the antibodies likely to be detected are so-called regular antibodies.
  • the anti-erythrocyte antibodies to be detected are chosen from IgM, IgD, IgG, IgA and IgE; in particular chosen from IgM and IgG.
  • the biological sample can in particular be any sample capable of containing anti-erythrocyte antibodies, and in particular any biological fluid, such as a sample of blood, in particular of whole blood, or of a blood derivative, such as plasma or blood. serum, urine, cerebrospinal fluid, lymph, saliva, or a tissue sample, such as biopsied tissue, a cell, or a collection of cells, or combinations thereof.
  • a blood derivative designates any product, in particular fluid, obtained from a blood sample.
  • the sample to be analyzed can also be a culture medium and / or a culture supernatant.
  • the sample Before being analyzed, the sample can undergo one or more preliminary treatment steps, such as dilution, centrifugation, heat and / or chemical treatment, cell lysis (for example by one or more chaotropic agents, one or more reducing agents and / or by heating), extraction, addition of an unlabeled detection ligand or their combinations.
  • preliminary treatment steps such as dilution, centrifugation, heat and / or chemical treatment, cell lysis (for example by one or more chaotropic agents, one or more reducing agents and / or by heating), extraction, addition of an unlabeled detection ligand or their combinations.
  • the sample may also be a mixture of at least two samples which may be of the same or different nature, from the same individual or from different individuals.
  • a mixture of samples of a different nature there may be mentioned a mixture of blood and serum, a mixture of blood and plasma, a mixture of serum and plasma, or else a mixture of blood, serum and plasma.
  • a preferred sample according to the invention is a sample or a mixture of samples of blood and / or derived from blood.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the sample is a biological sample chosen from: a human serum, a human plasma, a human sample of whole blood.
  • the in vitro detection method according to the invention may involve a step of contacting a sample with one or more test erythrocyte (s) or test erythrocyte suspension (s) of known phenotype.
  • the in vitro detection method according to the invention can thus be characterized in that it comprises at least the following steps: a) bringing a sample into contact with one or more test erythrocyte (s) ( s) or suspension of erythrocyte (s) test (s) of known phenotype, under conditions liable to induce haemagglutination, so as to obtain a reaction mixture; b) contacting said reaction mixture with a solid support containing a plurality of delimited adsorption zones having previously fixed antibodies or antibody fragments capable of binding antigenic determinants present on said erythrocyte (s) test (s) ; c) determining the presence or absence of a haemagglutination reaction on the adsorption areas brought into contact with said sample, so as to detect the presence or absence of anti-erythrocyte antibodies in said sample; said steps a) and b) being carried out separately or simultaneously.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the presence or absence of a hemagglutination reaction on said, or said, adsorption zone (s) is determined by comparison with a reference zone distinct from said solid support.
  • said separate reference zone from said solid support may comprise or consist of a separate delimited adsorption zone, and / or a separate compartment, and / or a separate spot.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the determination step is carried out after a step of sedimentation of said reaction mixture on said solid support.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that the determination step is carried out after a step of centrifugation of said solid support.
  • the in vitro detection methods according to the invention are particularly suitable for the implementation of the Simonin test, and in particular in the form of multiplexed methods.
  • the in vitro detection methods according to the invention are particularly suitable for the detection of anti-erythrocyte antibodies, and in particular of antibodies directed against antigenic determinants of the ABO system.
  • the antibodies attached to the adsorption zones delimited by the solid support are in particular chosen from anti-A antibodies (ABOI), anti-B antibodies (AB02), anti-AB antibodies (AB03).
  • the test erythrocytes of known phenotype are in particular chosen from erythrocytes expressing the antigenic determinants A1 and B.
  • the said erythrocyte (s) -test (s) have a known or determinable Rhesus phenotype.
  • all or part of this or these test erythrocyte (s) is of Rhesus negative phenotype.
  • at least one of these test erythrocyte (s) is of Rhesus (D) negative phenotype.
  • the solid support suitable for the invention comprises at least two delimited adsorption zones each fixing antibodies or fragments of antibodies capable of binding antigenic determinants of erythrocytes. distinct.
  • a solid support suitable for the implementation of an in vitro method according to the invention contains a plurality of delimited adsorption zones, said adsorption zones binding antibodies or antibody fragments capable of binding antigenic determinants of erythrocytes.
  • a solid support very particularly suitable for the invention is a solid support of multiplex type, that is to say a support capable of detecting one or more anti-erythrocyte antibodies (for example two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen or more than fifteen), on one or more samples as described in the present application, and this simultaneously or not, during a multiplex analysis process.
  • one or more anti-erythrocyte antibodies for example two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen or more than fifteen
  • Such a solid support can be in particular in the form of a plate, a microplate, a slide, beads, a membrane or a strip of several wells or of a single well.
  • a solid support may be in the form of a microplate or a strip of several wells or of a single well.
  • a solid support can be any material suitable for carrying out the analysis method, such as a plastic or other than plastic support.
  • Such a solid support is for example a support based on a polymer or a mixture of polymers.
  • a suitable solid support according to the invention is, for example, a support made of polystyrene, polypropylene, poly (meth) acrylate, polybutadiene or their combinations.
  • an appropriate solid support is based on polystyrene, such as: a breakable or non-breakable microplate of the COSTAR High binding type, or any other breakable or non-breakable polystyrene microplate and having a high binding power.
  • solid support suitable according to the invention is for example an inorganic support, such as glass, and / or a metallic support.
  • a suitable solid support is a membrane, for example a membrane of nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidene fluoride), nylon or their combinations.
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • a solid support suitable for the process comprises a single compartment.
  • Said single compartment may be a compartment comprising one or several walls.
  • said single compartment can be devoid of walls, and then be assimilated to the solid support itself.
  • the bottom of the compartment can then consist of the upper face of the solid support.
  • An example of such a solid support comprising a single compartment with or without one or more walls is a strip or a membrane.
  • said single compartment can be devoid of walls while being separated from the other compartments by a zone which makes it possible to avoid mixing between 2 adjacent samples, for example a hydrophobic zone.
  • a solid support for example a slide or a membrane
  • a single compartment typically at least one (for example one or two) solid support is used per sample to be analyzed.
  • a solid support suitable for the method comprises a plurality of compartments.
  • a solid support comprises at least two compartments
  • said compartments can be isolated from each other, so that they do not communicate with each other, or in a limited manner, that is to say so that the different compositions or solutions used for the analysis cannot circulate from one compartment to another during the analysis, or at least not freely.
  • a solution for example a sample added in one compartment does not go into the other compartments, or in a limited manner.
  • the compartment or compartments comprise or consist of a bottom and one or more walls, said wall or walls isolating the compartment or compartments from each other so that they do not communicate with each other.
  • An example of a compartment is a well.
  • a solid support comprises for example a plurality of wells, for example a set of at least 2 wells.
  • a solid support is, for example, a microplate.
  • the microplate can be a 96-well or a 384-well microplate.
  • a solid support suitable for the process comprises a plurality of delimited adsorption zones. Said delimited adsorption zones can in particular comprise, or even consist of, spots.
  • a bounded absorption zone does not necessarily have a single defined shape.
  • a delimited adsorption zone can thus comprise one or more spots, spaced evenly or not, and comprising at least one antibody or antibody fragments capable of binding antigenic determinants of erythrocytes, bound to the surface. of said support, and / or where appropriate of said compartment, in particular by non-covalent physicochemical interactions (in particular of weak bond type, for example ionic, van der Waals, hydrogen and / or hydrophobic) and / or by covalent bonds.
  • the delimited adsorption zones of the solid support in particular the deposits of antibodies or antibody fragments
  • the delimited adsorption zones of the solid support can be obtained manually or by any device, in particular any device suitable for the preparation of microarrays, such as a device with or without contact, in particular any device making it possible to deposit volumes smaller than one microliter, such as piezoelectric or solenoid valve systems.
  • spot denotes here a delimited adsorption zone, or part of a delimited adsorption zone of the solid support, for example of a compartment of the solid support, comprising at least the said compound of interest linked to the surface of said solid support (or even, where appropriate, of said compartment), in particular by non-covalent physicochemical interactions (in particular of weak bond type, for example ionic, van der Waals, hydrogen and / or hydrophobic) and / or by covalent bonds, generally obtained by depositing at least one drop of a solution containing a determined quantity of said compound (s) of interest (s) at a specific location on the surface of said support and / or the said compartment.
  • weak bond type for example ionic, van der Waals, hydrogen and / or hydrophobic
  • a spot may be of discoidal, cylindrical or approximately discoidal or cylindrical shape, for example oval, in particular when a solid support is a microplate or a slide.
  • a spot can be square or rectangular in shape (this can be in particular a strip), for example when a solid support is a membrane, or of any other form.
  • a solid support can thus comprise at least two, or even three, delimited adsorption zones, for example three zones, four zones or five zones, or at least six zones.
  • a solid support can thus comprise at least three spots, for example three spots, four spots or five spots, or at least six spots.
  • said antibodies or antibody fragments of the adsorption zone are monoclonal or polyclonal antibodies chosen from: anti-A antibodies (ABOI), anti-B antibodies (AB02), anti-B antibodies.
  • -AB AB03
  • anti-H antibodies (Hl) anti-D antibodies (RH1), anti-C antibodies (RH2), anti-c antibodies (RH4), anti-E antibodies (RH3) , anti-e antibodies (RH5), anti-K antibodies (KEL1), anti-k antibodies (KEL2), anti-Kpb antibodies (KEL4), anti-Fya antibodies (FY1), anti- Fyb (FY2), anti-Jka antibodies (JK1), anti-Jkb antibodies (JK2), anti-S antibodies (MNS3), anti-s antibodies (MNS4), anti-Lea antibodies (LE1), anti-Leb antibodies (LE2), anti-M antibodies (MNS1), anti-N antibodies (MNS2), anti-Pl antibodies, anti-Kpa antibodies (KEL)
  • said antibodies or antibody fragments of the adsorption zone are monoclonal or polyclonal antibodies chosen from: anti-A antibodies (ABOI), anti-B antibodies (AB02), anti-B antibodies.
  • -AB AB03
  • anti-D antibodies RH1
  • anti-C antibodies RH2
  • anti-c antibodies RH4
  • anti-E antibodies RH3
  • anti-e antibodies RH5
  • anti-K antibodies KEL1
  • anti-k antibodies KEL2
  • anti-Kpb antibodies KEL4
  • anti-Fya antibodies FY1, anti-Fyb antibodies (FY2), anti- Jka (JK1), anti-Jkb antibodies (JK2), anti-S antibodies (MNS3)
  • anti-s antibodies MNS4)
  • anti-Lea antibodies L1
  • anti-Leb antibodies L2
  • anti-M antibodies MNS1
  • anti-N antibodies MNS2
  • anti-Lua antibodies anti-
  • Such antibodies or antibody fragments from the adsorption zone are, for example, monoclonal or polyclonal antibodies, such as those likely to be available for sale from Diagast, Merck, Quotient or Biorad, and chosen from: - anti-A monoclonal antibodies (ABOI), anti-B monoclonal antibodies (AB02), anti-AB monoclonal antibodies (AB03) which are said to be murine IgMs,
  • MNS2 - anti-N monoclonal antibodies
  • RH1 anti-D monoclonal antibodies
  • RH2 anti-C monoclonal antibodies
  • RH4 anti-c monoclonal antibodies
  • RH3 anti-e monoclonal antibodies
  • RH5 anti-Cw antibodies
  • KEL1 anti-K monoclonal antibodies
  • JK1 anti-Jka monoclonal antibodies
  • JK2 anti-Jkb monoclonal antibodies
  • MNS3 anti-S monoclonal antibodies
  • MNS4 anti-Pl monoclonal antibodies which are said to be human IgMs
  • RH1 anti-D monoclonal antibodies
  • KEL2 anti-k monoclonal antibodies
  • FY1 anti-Fya monoclonal antibodies
  • MNS1 anti-M monoclonal antibodies
  • KEL4 anti-Kpb antibodies
  • KEL3 anti-Lua antibodies
  • LAI anti-Lub antibodies
  • FY2 anti-Fyb antibodies
  • L1 anti-Lea
  • L2 anti-Leb antibodies
  • At least two of the adsorption zones of the solid support each bind a plurality of antibodies and / or antibody fragment (s) capable of binding a distinct erythrocyte antigenic determinant.
  • At least two of the delimited adsorption zones (for example spots) comprising said antibodies or antibody fragments of the solid support are spaced apart from each other by at least 100 ⁇ m, which may include in particular at least 100 ⁇ m. minus 200, 300, 400,500, 600, 700, 800, 900 or 1000 pm.
  • said adsorption zones define an area of at least 10,000 ⁇ m 2 , which may in particular include at least 100,000, 20,000, 30,000, 40,000, or 50,000 ⁇ m 2 .
  • said adsorption zones comprise or consist of zones (in particular spots) of 50 to 500 ⁇ m in maximum dimension (in particular in diameter), which comprises, 50, 60, 70, 80, 90 , 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 pm.
  • at least two of the adsorption zones of the solid support are spaced from each other by at least 100 ⁇ m, and / or that said adsorption zones define an area of at least 10,000 ⁇ m 2 .
  • said adsorption zones are hydrophilic or hydrophobic.
  • said solid support is a plastic support, and said adsorption zones are hydrophilic.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said plurality of delimited absorption zones form a wall inclined relative to the rest of all or part of said solid support.
  • the in vitro detection method according to the invention can be characterized in that said plurality of delimited absorption zones is planar, conical or hemispherical.
  • the antibodies or antibody fragments capable of binding the antigenic determinants are attached to the delimited adsorption zones, covalently.
  • the antibodies or antibody fragments capable of binding the antigenic determinants are attached to the defined adsorption zones, non-covalently.
  • the adsorption zones of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more binding polymers, the said binding polymer (s) immobilizing the said antibodies or fragments. antibodies capable of binding antigenic determinants.
  • the areas of adsorption of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more binding polymers, covalently or non-covalently.
  • binding polymers may for example consist of binding polymers mentioned in WO2012 / 052874.
  • the adsorption zones of the solid support are, at least in part, functionalized with one or more linker polymers comprising a polysaccharide backbone.
  • polysaccharide backbone as defined here encompasses any structure formed by a set of sugars (or saccharide units), linked together by osidic bonds, in particular O-osidic bonds.
  • This polysaccharide backbone can in particular be linear or branched. According to certain embodiments, it comprises from 80 to 600 saccharide units, and in particular from 150 to 350 saccharide units.
  • the adsorption zones of the solid support are, at least in part, functionalized with one or more linker polymers comprising a polysaccharide backbone provided with aromatic groups and / or carboxylic acid groups, substituted or not.
  • the areas of adsorption of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more linker polymers comprising a polysaccharide backbone provided:
  • - carboxylic acid groups of the form -X-COOH, where X represents a linear or branched alkyl chain, substituted or not, comprising from 1 to 6 carbon atoms.
  • the adsorption zones of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more binding polymers attached to said substrate (in particular to said delimited adsorption zone) in a non- covalent, and comprising a polysaccharide skeleton provided:
  • the adsorption zones of the solid support are, at least in part, functionalized by one or more binding polymers attached to said substrate (in particular to said delimited adsorption zone) in a non- covalent, and comprising a polysaccharide skeleton provided:
  • - carboxylic acid groups of the form -X-COOH, where X represents a linear or branched alkyl chain, substituted or not, comprising from 1 to 6 carbon atoms; and
  • binding polymer (s) immobilizing said antibodies or antibody fragments capable of binding said antigenic determinants.
  • said solid support is, at least in part, functionalized with one or more linker polymers comprising one or more groups positively charged at the pH of said reaction mixture.
  • Anti-A (ABOI) and anti-B (AB02) antibodies were deposited at the bottom of the microtiter plate wells to form a plurality of demarcated adsorption zones.
  • the samples (human plasmas) to be tested are brought into contact with test red blood cells in the wells.
  • the wells containing the test red blood cells and the samples are then centrifuged for 2 min at 2000 g. After centrifugation, the supernatant is removed and the bottom of the wells is imaged.
  • the presence or absence of agglutination may or may not be detected at each antibody deposit by visual analysis or by image analysis.
  • Three different anti-D antibodies were deposited at the bottom of the wells of microtiter plates to form a plurality of demarcated adsorption zones.
  • the samples (human plasma) to be tested are brought into contact with one or more test red blood cells in source plate wells.
  • the wells containing the test red blood cells and the samples are then centrifuged for 2 min at 800 g.
  • the supernatant is removed, then 2 washes in PBS are carried out. After the last centrifugation, the supernatant is removed.
  • the resulting pellet is resuspended in LISS buffer. To this mixture is added anti human globulin before depositing in the well of the biochip.
  • the wells are then centrifuged for 2 minutes at 2000 g.
  • Anti-A (ABOI), anti-B (AB02) and 3 anti-D antibodies, obtained from culture media were purified beforehand. Each well of a previously functionalized microtiter plate was printed with these antibodies diluted in PBS buffer.
  • a contactless deposition robot using piezoelectric technology) with a deposition system generating drops of 500 ⁇ L is used.
  • the plates are then dried using a thermo ventilator for 10 minutes at 80 ° C. and then directly saturated with 200 ⁇ L of a solution of 5% milk in PBS for 1 hour at room temperature.
  • the plates are then washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS.
  • the wells are finally emptied, dried for 1 hour at 37 ° C. before being wrapped and sealed in the presence of a sachet of desiccant in an aluminum bag.
  • test red cells A 100 ⁇ L of undiluted human plasma are mixed with 50 ⁇ L of a red blood cell suspension containing 0.5% of blood cells from patient A (test red cells A) and 0.5% of blood cells from patient B (red blood cells tests B). The mixture is transferred to a well in which antibodies have been deposited beforehand.
  • the plates are centrifuged for 2 minutes at 2000 g at 4 ° C.
  • the supernatant is removed and then a PB S washing step is carried out.
  • the bottoms of the wells of the microtiter plate are then imaged.
  • FIG. 3A corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample from a patient AB. Regular and homogeneous spots are observed on the anti-A and anti B deposits, indicating the absence of agglutination.
  • FIG. 3B corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample from a patient A. Regular and homogeneous spots are observed on the anti-A deposits and irregular and very intense spots are observed on the deposits. anti B. This indicates the absence of agglutination of test A red blood cells but agglutination of test B red blood cells.
  • Figure 3C corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample from a patient B. Spots regular and homogeneous spots are observed on anti-B deposits and irregular and very intense spots are observed on anti-A deposits. This indicates the absence of agglutination of the B test red cells but agglutination of the A test red cells.
  • Figure 3D corresponds to a biochip incubated in the presence of a sample from a patient O. Only irregular and very intense spots are observed, both on the anti-A deposits but also on the anti-B deposits. This indicates agglutination of test A and B red blood cells.
  • Figure 4A corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample from a patient without irregular antibodies. Regular and homogeneous spots are observed on the anti-D deposits, indicating the absence of agglutination.
  • FIG. 4B corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a second sample obtained from a patient not possessing an irregular antibody. Regular and homogeneous spots are observed on the anti-D deposits, indicating the absence of agglutination.
  • FIG. 4C corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample obtained from a patient possessing irregular anti-K antibodies. Irregular and very intense spots are observed on anti-D deposits. This indicates agglutination of the test red blood cells and therefore the presence of irregular antibodies.
  • FIG. 4D corresponds to a photo of a biochip incubated in the presence of a sample obtained from a patient possessing irregular anti-D antibodies. Irregular and very intense spots are observed on anti-D deposits. This indicates agglutination of the test red blood cells and therefore the presence of irregular antibodies.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro de détection d'anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes: a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d'érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d'induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d'adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d'anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s); c) déterminer la présence ou l'absence d'une réaction d'hémagglutination sur au moins l'une des dites zones d'adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l'absence d'anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.

Description

Description
Titre : PROCEDE DE CAPTURE ET D’IDENTIFICATION D ’AGGLUTINATS CELLULAIRES POUR LA DETECTION D’ANTICORPS ANTI- ERYTHROCYTAIRES MULTIPLEXE
Domaine technique
La présente invention concerne le domaine des procédés de détection et de diagnostic in vitro mettant notamment en œuvre des échantillons d’origine biologique. Les procédés plus particulièrement concernés ont trait à la détection d’anticorps anti-érythrocytaires participant à la détermination du groupe sanguin.
La détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans des échantillons biologiques demeure d’une importance capitale, notamment en immunohématologie, dans le domaine de la transfusion sanguine, et tout particulièrement pour la détermination de groupes sanguins ou l’évaluation du risque chez le receveur.
La recherche d’anticorps anti-érythrocytaires englobe, en pratique clinique, un nombre important d’anticorps dits réguliers ou irréguliers, généralement dirigés contre des motifs antigéniques exprimés à la surface des cellules érythrocytaires.
Les antigènes liés au groupe sanguin ABO sont des motifs oligosaccharidiques. Le groupage AB O a ainsi pour but de déterminer quatre groupes sanguins selon la présence ou non de deux antigènes, A et B, à la surface des globules rouges. Chaque individu est alternativement du groupe A s’il possède le motif A, du groupe B s’il possède le motif B, du groupe AB s’il possède les motifs A et B, du groupe O s’il ne possède aucun des 2 motifs A ou B.
De plus, chaque patient possède dans son sérum ou plasma le ou les anticorps correspondant aux antigènes qu’il n’a pas (loi dite de “ Landsteiner ”). Un sujet de groupe A portant l’antigène A, dispose d’anticorps anti-B. Un sujet B portant l’antigène B, dispose d’anticorps anti-A. Un sujet AB portant les antigènes A et B, ne dispose pas d’anticorps anti-A ni anti- B. Un sujet de groupe O ne portant aucun antigène A ou B, dispose des anticorps anti-A et anti-B.
Les conséquences d’une détection erronée d’anticorps anti-érythrocytaires anti-A ou anti-B sont majeures, au même titre qu’une mauvaise définition du groupe ABO. En effet, si les anticorps anti-A (ou anti-B) du receveur se fixaient sur les antigènes A (ou B) des globules rouges du donneur, ils provoqueraient l’agglutination de ces cellules, voire leur destruction. Cette agglutination entraînerait l’échec de la transfusion, et dans certains cas, des réactions cliniques graves, voire dramatiques, pouvant conduire au décès du patient concerné. C’est pourquoi, lors d’une transfusion, la compatibilité entre groupes sanguins doit absolument être respectée.
Les exigences de fiabilité relatives à ce type de tests sont donc extrêmes. L’Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l'arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale, paru au Journal Officiel de la République Française (JORF), impose que la réalisation d’un groupage sanguin ABO repose sur deux épreuves complémentaires :
- une épreuve globulaire, dite de Beth- Vincent, consistant à rechercher les antigènes A (ABOI) et B (AB02) avec les réactifs monoclonaux suivants : anti-A (anti-ABOl), anti-B (anti-AB02) et anti-AB (anti-AB03) ;
- une épreuve plasmatique (sérique), dite de Simonin ou Simonin-Michon, consistant à rechercher les anticorps anti-A et anti-B avec les hématies-tests Al et B, au moins l’une de ces hématies devant être de phénotype Rhésus (RH) négatif.
C’est la concordance de ces épreuves qui détermine le groupe ABO du patient.
D’autres anticorps anti-érythrocytaires sont également impliqués dans la sécurité transfusionnelle, ils reconnaissent : Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cramer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
En dehors de situations pathologiques, telles que des maladies auto-immunes, le sérum d’un individu peut contenir des anticorps dirigés contre un ou plusieurs des antigènes listés ci- dessus. Ces anticorps apparaissent à l’occasion d’une stimulation antigénique par des globules rouges étrangers, par exemple suite à une immunisation contre un ou plusieurs antigènes lors d’une transfusion sanguine ou encore lors d’une grossesse par réaction immunitaire maternelle dirigée contre les antigènes érythrocytaires fœtaux n’appartenant pas au groupe maternel, notamment lors de l’accouchement. Ces anticorps dits irréguliers (ou immuns) sont le plus souvent d’isotype IgG.
La recherche de ces anticorps dits irréguliers est appelée Recherche d’Agglutinines Irrégulières (RAI), test de Coombs indirect ou Test indirect à l’anti-globuline (TIA). Ces tests visent à détecter la présence d’anticorps dirigés contre des marqueurs érythrocytaires étrangers. Ces tests reposent sur l’agglutination d’hématies tests, dont les phénotypes sont connus, par le plasma du patient et après ajout d’anti-globuline humaine. De nombreux types de globules rouges sont alors utilisés dans les tests. La comparaison des résultats permettant de déduire la ou les spécificités des anticorps.
Dans un contexte transfusionnel, l’objectif sera d’attribuer aux patients les culots globulaires présentant la meilleure compatibilité.
Technique antérieure
La recherche d’anticorps anti-érythrocytaire en immunohématologie est basée sur l’agglutination d’hématies tests dont le phénotype est connu. Il existe un grand nombre de variantes de ces techniques. Elles peuvent être manuelles, sur plaque d’opaline, en tube ou en cupule de microplaque, en colonne de gel, ou complètement automatisées. Ces tests bien que très efficaces n’ont pas significativement évolué depuis 60 ans et présentent certaines limites : le résultat final correspond au cumul de plusieurs résultats uniques obtenus pour chaque anticorps testés, de nombreux tests doivent être répétés, ce qui demande une traçabilité exemplaire ; la multiplication des tests entraîne un allongement des délais de résultats ; la multiplication des tests demande d’avoir recours à des prises d’échantillons différentes, ce qui peut influencer sur la fiabilité du test et nécessite un volume important de sang, ce qui peut être problématique chez certains patients (par exemple les nourrissons et les patients fortement anémiés).
Pourtant, de nombreux laboratoires/sociétés ont essayé de miniaturiser et de combiner les tests à mettre en œuvre. Cependant, les résultats obtenus par ces techniques sont difficilement corrélables avec les techniques traditionnelles.
WO85/01354 et WO02/16942 enseignent une méthode de détection d’anticorps dans le sang, comprenant une étape d’adsorption d’un antigène sur une surface solide. EP0223978A1 enseigne un dispositif pour déterminer un groupe sanguin, constitué d’un substrat solide, et d’un ou plusieurs anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques érythrocytaires. US2007077605 enseigne un dispositif optique de type bio-disque, adapté à la détermination d’un groupe sanguin.
W02007/051844A1 et WO2008148886A1 enseignent des dispositifs ou procédés d’identification d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant une mise en contact avec des groupes de billes, ou particules.
W02009007649A1 enseigne un dispositif pour déterminer un groupe sanguin, comprenant un support incluant une zone réactive constituée d’une membrane poreuse et d’une membrane absorbante.
W02012010666 enseigne un procédé de détection d’anticorps anti-érythrocytes, comprenant la mise en contact d’un échantillon avec des particules magnétiques portant lesdits érythrocytes.
WO2019158726A1 enseigne un dispositif de détection, constitué d’un support et d’une membrane poreuse hydrophobe comprenant des billes complexées à un anticorps ou antigène.
Exposé de l’invention
Il subsiste un besoin de développer de nouveaux procédés pour la détection d’anticorps anti érythrocytaires. En particulier, il subsiste un besoin de développer de nouveaux procédés qui demeurent applicables en clinique, en banques de sang et laboratoires d’analyses médicales. Il demeure aussi un besoin de développer des procédés adaptables aux techniques haut-débit automatisées, plus particulièrement des procédés qui permettent la détection multiplexe d’anticorps anti-érythrocytaires.
Il demeure aussi un besoin de développer des procédés qui soient acceptables sur le plan réglementaire en biologie médicale, et tout particulièrement qui satisfassent les conditions d’une épreuve plasmatique de type « Simonin » ou RAI (Recherche d’Agglutinines Irrégulières).
L’invention vise précisément à répondre à l’ensemble de ces besoins.
Résumé de l’invention
Pour répondre à ces besoins, les inventeurs proposent de tirer parti du fait que les biopuces à anticorps puissent être mises à profit comme système de triage de cellules agglutinées. En particulier, l’originalité de cette approche repose sur le fait que la capture, sur des dépôts d’anticorps, de cellules agglutinées, est apte à produire un signal plus intense et de morphologie différente que celui généré par des cellules non agglutinées.
Connaissant la nature des anticorps déposés, notamment d’anticorps monoclonaux, sur le support, ainsi que leur spécificité vis-à-vis des antigènes d’intérêt, les inventeurs ont pû déterminer les phénotypes cellulaires impliqués dans l’agglutination et donc la nature des anticorps initialement présents dans l’échantillon testé.
Cette technologie peut être avantageusement mise en œuvre dans le cadre de la recherche d’anticorps anti-érythrocytaires réguliers tels que des anticorps anti-groupe ABO, ou irréguliers. Cette application trouve un intérêt tout particulier pour la réalisation de l’épreuve plasmatique indirecte ou épreuve de Simonin et la réalisation d’une Recherche d’ Agglutinines Irrégulières (RAI).
De manière surprenante, les inventeurs démontrent ainsi que ce procédé présente une fiabilité au moins comparable aux tests sur colonne de gel habituellement mis en œuvres en immuno-hématologie, tout en demeurant compatible avec des applications multiplexes.
De telles applications multiplexes peuvent comprendre ou consister, notamment, en la détection: de plusieurs types d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon ; de plusieurs types d’anticorps anti-érythrocytaires dans plusieurs échantillons. Avantageusement, ces applications peuvent donc permettre la détection simultanée de plusieurs paramètres, dans un ou plusieurs échantillons.
Ainsi, selon son aspect principal, la présente invention concerne un procédé in vitro de détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes : a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ; c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants: AB O, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABOI), des anticorps anti-B (AB02), des anticorps anti-AB (AB03), des anticorps anti-H (Hl), des anticorps anti- D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-Pl, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LUI), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distincts.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 pm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 pm2.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
Selon un mode de réalisation, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées forme une paroi inclinée par rapport au reste de toute ou partie du dit support solide ; par exemple, qui comporte un plan incliné qui forme un angle avec un plan horizontal constitué de toute ou partie du dit support solide, et notamment un angle avec un plan horizontal constitué de toute ou partie d’une zone du dit support solide ne fixant pas d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps.
Selon certains modes de réalisation, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées est plane, conique ou hémisphérique.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non-covalente. Selon certains modes de réalisation particuliers, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupements chargés positivement au pH du dit mélange réactionnel.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite, ou les dites, zone(s) d’adsorption(s) est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte de la dite, ou les dites, zone(s) du dit support solide.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
L’invention est décrite plus en détail ci-après.
Description des figures Figure 1 : illustration du principe général de l’invention, appliqué à la détermination d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon.
Figure 2 : illustration d’un plan de biopuce/plaque, ou réseau de dépôts, incluant au fond de puits un ou plusieurs spots (ou zones d’adsorptions délimitées), constitués d’anticorps anti- ABO et 3 anti-D. Le spot A représente un dépôt d’anti-ABOl. Le spot B représente un dépôt d’anti-AB02. Le spot DI représente un dépôt d’anti D. Le spot D2 représente un dépôt d’anti D. Le spot D3 représente un dépôt d’anti D.
Figure 3 : images photographiques du fond de puits en présence d’échantillons plasmatiques humains. En 3A, résultat d’un test à partir d’un échantillon AB. En 3B, résultat d’un test à partir d’un échantillon A. En 3C, résultat d’un test à partir d’un échantillon B. En 3D, résultat d’un test à partir d’un échantillon O.
Figure 4 : images photographiques du fond de puits en présence d’échantillons plasmatiques humains. En 4A, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier négatif. En 4B, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier négatif. En 4C, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier positif. En 4D, résultat d’un test à partir d’un échantillon irrégulier positif.
Description détaillée
DÉFINITIONS GF.NER AT,F,S
Le terme « pluralité », tel que « pluralité de zones d’adsorption », implique la présence d’ « au moins deux » ; ce terme peut donc, par exemple, désigner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, voire plus de 10.
Les termes « érythrocyte », « hématie » ou « globule rouge » sont utilisés ici indifféremment.
Le terme « déterminant antigénique présent sur les érythrocytes » englobe non seulement tout déterminant antigénique présent de manière physiologique à la surface des érythrocytes, en particulier tout déterminant de groupe sanguin, mais aussi de tout autre déterminant présent à la surface des dits érythrocytes en particulier non-physiologique, et/ou résultant de réactions immunologiques, relevant de l’immunité innée ou acquise, telles que des anticorps, ou fragments d’anticorps, ou d’éléments appartenant au système du complément. Le terme « échantillon », notamment employé pour désigner un échantillon biologique, englobe en particulier tout échantillon susceptible d’avoir été préalablement obtenu chez un individu, ce qui inclut tout fluide corporel ou fraction de fluide corporel, ou biopsie de tissu, qui soit susceptible d’inclure des érythrocytes et/ou des anticorps anti-érythrocytes, physiologiques ou pathologiques, réguliers ou irréguliers. Tout particulièrement, un « échantillon biologique » peut désigner ici tout échantillon de sang, ou culot d’échantillon de sang, et/ou toute autre préparation dérivée du sang, telle qu’un échantillon de sang total, le sérum ou le plasma, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien. Un échantillon est également susceptible d’inclure un échantillon de salive, de sueur, de larme, de lait ou d’urine.
Le terme « anticorps ou fragment d’anticorps» englobe l’ensemble des molécules de type immunoglobuline, ainsi que toute partie immunologiquement active des dites immunoglobulines, telles que les molécules contenant un ou plusieurs sites d’interaction à un antigène spécifique des dites immunoglobulines. A ce titre, ce terme n’est pas seulement limité aux anticorps entiers, réguliers (naturels) ou irréguliers, mais englobe également les fragments d’anticorps et leurs variants synthétiques ou recombinants. Sauf indication contraire, ce terme englobe donc à la fois les anticorps dits naturels et non-naturels, ou synthétiques, obtenus de manière recombinante ou non. Les anticorps sont classiquement définis par deux chaînes lourdes reliées entre elles par un pont disulfure, et chaque chaîne lourde est elle-même reliée à une chaîne légère par un ou plusieurs ponts disulfures. Sauf indication contraire, ce terme englobe donc l’ensemble des anticorps, ou fragments des dits anticorps, comprenant Tune des cinq principales classes de chaîne lourde, choisies parmi les IgM, IgD, IgG, IgA et IgE ; ou encore l’un des deux types de chaîne légère choisis parmi les chaînes lambda (1) et kappa (k).
Le terme « anticorps synthétique » englobe l’ensemble des anticorps obtenus in vitro et comprenant au moins un fragment d’une région variable d’anticorps. Les anticorps synthétiques peuvent ainsi être choisis parmi les constructions suivantes: Fab, a F(ab)’2, single domain antibody (sdAb), ScFv, Fab-scFv, ScFv-Fc, Sc(Fv)2, diabody, di-diabody, triabody, tetrabody, pentabody, unibody, minibody, maxibody, nanobody, Small Modular Immunopharmaceutical (SMIP), et les fragments comprenant des régions variables tels que chaînes variables légères (VF) et lourdes (HF). Le terme « anticorps anti-érythrocytaire » ou « anticorps anti-érythrocyte » désigne ici tout anticorps, régulier ou irrégulier, dirigé contre au moins un déterminant antigénique présent sur les érythrocytes.
Le terme « anticorps régulier », ou « anticorps naturel », désigne ici tout anticorps anti érythrocytaire susceptible d’être naturellement présent chez un individu, donc en dehors de toute pathologie et d’exposition à un antigène extérieur. Ce type d’anticorps englobe généralement l’ensemble des anticorps ABO (ex. anti-A et anti-B) et H.
Le terme « anticorps irrégulier », désigne ici tout anticorps anti-érythrocytes qui n'est pas systématiquement présent chez les sujets dépourvus de l'antigène correspondant. De manière générale, la plupart des anticorps non- AB O sont classiquement définis comme anticorps irréguliers, ce qui inclut notamment les anticorps suivants :anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, anti-k,anti-Cw, anti-Kpa, anti-Kpb, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, anti- Fea, anti-Feb, anti-M, anti-N, anti-S, anti-s, anti-Fua, anti-Fub.
Fe terme « hémagglutination » désigne, selon son sens usuel, l’ensemble des réactions d’agglutination comprenant la fixation d’anticorps anti-érythrocytaires sur des structures antigéniques présentes à la surface des globules rouges, et susceptibles d’entraîner, directement ou indirectement, la formation d’un agrégat d’hématies. Ce terme englobe donc à la fois les réactions d’hémagglutination directe, indirecte et passive.
PROCEDES
Ainsi, selon son aspect principal, la présente invention concerne un procédé in vitro de détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes : a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ; c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorptions, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
Selon un mode de réalisation, les étapes a) et b) sont réalisées séparément.
Selon un mode de réalisation, les étapes a) et b) sont réalisées simultanément.
Lorsque les étapes a) et b) sont réalisées simultanément, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact (i) un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur des érythrocyte(s) test(s), avec (ii) un échantillon et (iii) un ou plusieurs des dits érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination ; puis b) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorption, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon.
Le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont des anticorps réguliers ou irréguliers.
Ces anticorps sont susceptibles de lier spécifiquement des antigènes de surface des érythrocytes.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants : ABO, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59. Ainsi, les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter peuvent être aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes AB O et Rhésus.
Préférentiellement, lesdits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
Ainsi, les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter peuvent être des anticorps anti-A, des anticorps anti-B, ou des anticorps anti-H.
Tout particulièrement, les anticorps susceptibles d’être détectés sont des anticorps dits réguliers.
Selon certains modes de réalisation, les anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont choisis parmi les IgM, IgD, IgG, IgA et IgE ; en particulier choisis parmi les IgM et IgG.
L'échantillon biologique peut être notamment tout échantillon susceptible de contenir des anticorps anti-érythrocytaires, et en particulier tout fluide biologique, tel qu'un échantillon de sang, notamment de sang total, ou de dérivé de sang, tel que le plasma ou le sérum, T urine, le liquide céphalorachidien, la lymphe, la salive, ou un échantillon de tissu, tel qu'un tissu obtenu par biopsie, une cellule ou un ensemble de cellules, ou leurs combinaisons. Un dérivé de sang désigne tout produit, en particulier fluide, obtenu à partir d'un échantillon de sang. L'échantillon à analyser peut également être un milieu de culture et/ou un surnageant de culture. Avant d'être analysé, l'échantillon peut subir une ou plusieurs étapes préalables de traitement, tels que dilution, centrifugation, traitement thermique et/ou chimique, lyse cellulaire (par exemple par un ou plusieurs agents chaotropiques, un ou plusieurs agents réducteurs et/ou par chauffage), extraction, ajout d'un ligand de détection non marqué ou leurs combinaisons.
L'échantillon peut également être un mélange d'au moins deux échantillons qui peuvent être de même nature ou de nature différente, issus d’un même individu ou d’individus différents. A titre d'exemple de mélange d'échantillons de nature différente, on peut citer un mélange de sang et de sérum, un mélange de sang et de plasma, un mélange de sérum et de plasma, ou encore un mélange de sang, sérum et plasma.
Un échantillon préféré selon l'invention est un échantillon ou un mélange d'échantillons de sang et/ou dérivé du sang. En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
Lorsque le procédé in vitro de détection selon l’invention est mis en œuvre sous un format multiplexe, par exemple pour l’analyse (simultanée ou non) de plusieurs anticorps anti érythrocytaires, celui-ci peut impliquer une étape de mise en contact d’un échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut ainsi être caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ; c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur les zones d’adsorptions mises en contact avec le dit échantillon, de sorte à détecter la présence ou l’absence des anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite, ou les dites, zone(s) d’adsorption(s) est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte du dit support solide. Selon certains modes de réalisation, la dite zone de référence distincte du dit support solide peut comprendre ou consister en une zone d’adsorption délimitée distincte, et/ou un compartiment distinct, et/ou un spot distinct. En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
En particulier, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que l’étape de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
Les procédés in vitro de détection selon l’invention sont particulièrement adaptés à la mise en œuvre du test de Simonin, et notamment sous la forme de procédés multiplexes.
Selon ces modes de réalisation particuliers, les procédés in vitro de détection selon l’invention sont particulièrement adaptés à la détection d’anticorps anti-érythrocytaires, et notamment d’anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques du système ABO. Selon ces modes de réalisation particuliers, les anticorps fixés aux zones d’adsorption délimitées du support solide, sont notamment choisis parmi des anticorps anti-A (ABOI), des anticorps anti-B (AB02), des anticorps anti-AB (AB03) ; les érythrocytes-tests de phénotype connu, sont notamment choisis parmi des érythrocytes exprimant les déterminants antigéniques Al et B.
En particulier, dans le cadre de la mise en œuvre du test de Simonin, le ou les dits érythrocyte(s)-test(s) sont de phénotype Rhésus connu ou déterminable.
Selon certains modes de réalisation, tout ou partie de ce ou ces érythrocyte(s) test(s) est de phénotype Rhésus négatif. Ainsi, selon certains de ces modes de réalisation, au moins l’un de ces érythrocyte(s) test(s) est de phénotype Rhésus (D) négatif.
Préférentiellement, dans le cadre de la mise en œuvre du test de Simonin, le support solide convenant à l’invention comprend au moins deux zones d’adsorption délimitées fixant chacune des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes distincts.
Des variantes du support solide susceptible d’être mis en œuvre dans les procédés de détection sont développées ci-après.
SUPPORTS MIS EN ŒUVRE DANS LES PROCÉDÉS Un support solide convenant à la mise en œuvre d’un procédé in vitro selon l’invention contient une pluralité de zones d’adsorption délimitées, les dites zones d’adsorption fixant des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes.
Un support solide convenant tout particulièrement à l’invention est un support solide de type multiplexe, soit un support apte à détecter un ou plusieurs anticorps anti-érythrocytaires (par exemple deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze ou plus de quinze), sur un ou plusieurs échantillons tels que décrits dans la présente demande, et ce de manière simultanée ou non, au cours d’un procédé d’analyse multiplexe.
Un tel support solide peut être notamment sous la forme d'une plaque, d'une microplaque, d'une lame, de billes, d'une membrane ou d’une barrette de plusieurs puits ou d’un seul puits. De préférence, un tel support solide peut être mis sous la forme d’une microplaque ou d’une barrette de plusieurs puits ou d’un puits seul.
Un support solide peut être en toute matière appropriée pour la mise en œuvre du procédé d'analyse, tel qu’un support plastique ou autre que plastique.
Un tel support solide est par exemple un support à base d'un polymère ou d'un mélange de polymères. Un support solide approprié selon l'invention est, par exemple, un support en polystyrène, polypropylène, poly(méth)acrylate, polybutadiène ou leurs combinaisons. De préférence, un support solide approprié est à base de polystyrène tels que : une microplaque sécable ou non de type COSTAR High binding, ou tout autre microplaque de polystyrène sécable ou non et présentant un haut pouvoir de fixation.
Un autre type de support solide approprié selon l'invention est par exemple un support inorganique, tel que le verre, et/ou un support métallique.
Un autre exemple de support solide approprié est une membrane, par exemple une membrane en nitrocellulose, PVDF (Polyfluorure de vinylidène), nylon ou leurs combinaisons.
Selon un mode de réalisation, un support solide convenant au procédé comprend un unique compartiment. Le dit compartiment unique peut être un compartiment comprenant une ou plusieurs parois. Alternativement, le dit compartiment unique peut être dépourvu de parois, et s'assimiler alors au support solide lui-même. Le fond du compartiment peut alors consister en la face supérieure du support solide. Un exemple d'un tel support solide comprenant un unique compartiment comportant ou non une ou plusieurs parois est une lame ou une membrane.
Alternativement, le dit compartiment unique peut être dépourvu de parois tout en étant séparé des autres compartiments par une zone qui permet d’éviter le mélange entre 2 échantillons adjacents par exemple une zone hydrophobe.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention où un support solide (par exemple une lame ou une membrane) comprend un unique compartiment, typiquement, au moins un (par exemple un ou deux) support solide est utilisé par échantillon à analyser.
Selon un mode de réalisation, un support solide convenant au procédé comprend une pluralité de compartiments.
Lorsqu'un support solide comprend au moins deux compartiments, les dits compartiments peuvent être isolés les uns des autres, de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux, ou de manière limitée, c'est-à-dire de sorte que les différentes compositions ou solutions utilisées pour l'analyse ne puissent pas circuler d'un compartiment à un autre pendant l'analyse, ou tout du moins pas librement.
Ainsi, selon un mode de réalisation du dit support solide, une solution (par exemple un échantillon) ajoutée dans un compartiment ne va pas dans les autres compartiments, ou de manière limitée. Par exemple, le ou les compartiments comprennent ou sont constitués d'un fond et d'une ou plusieurs parois, la ou lesdites parois isolant le ou les compartiments les uns des autres de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux.
Un exemple de compartiment est un puits.
Un support solide comprend par exemple une pluralité de puits, soit par exemple un ensemble d’au moins 2 puits.
Un support solide est par exemple une microplaque.
La microplaque peut être une microplaque de 96 puits ou de 384 puits. Un support solide convenant au procédé comprend une pluralité de zones d’adsorption délimitées. Les dites zones d’adsorption délimitées peuvent notamment comprendre, voire consister en, des spots.
Une zone d’adsorption délimitée n’est pas nécessairement d’une unique forme définie. A ce titre, une zone d’adsorption délimitée peut ainsi comprendre un ou plusieurs spots, espacés de manière régulière ou non, et comprenant au moins un anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques d’érythrocytes, lié à la surface dudit support, et/ou le cas échéant du dit compartiment, notamment par des interactions physico-chimiques non covalentes (en particulier de type liaisons faibles, par exemple, ioniques, van der Waals, hydrogène et/ou hydrophobe) et/ou par des liaisons covalentes.
De manière non-exhaustive, les zones d’adsorption délimitées du support solide, en particulier les dépôts d’anticorps ou fragments d’anticorps, peuvent être obtenus manuellement ou par tout dispositif, notamment tout dispositif apte à la préparation de microarrays, tel qu’un dispositif avec ou sans contact, en particulier tout dispositif permettant de déposer des volumes inférieurs au microlitre tels que des systèmes piézoélectrique ou électrovanne.
Le terme « spot » désigne ici une zone d’adsorption délimitée, ou une partie d’une zone d’adsorption délimitée du support solide, par exemple d’un compartiment du support solide, comprenant au moins le dit composé d'intérêt lié à la surface dudit support solide (voire, le cas échéant, du dit compartiment), notamment par des interactions physico-chimiques non covalentes (en particulier de type liaisons faibles, par exemple, ioniques, van der Waals, hydrogène et/ou hydrophobe) et/ou par des liaisons covalentes, généralement obtenus par le dépôt d'au moins une goutte d'une solution contenant une quantité déterminée dudit ou desdits composé(s) d'intérêt(s) à un endroit précis à la surface du dit support et/ou du dit compartiment.
Un spot peut être de forme discoïdale, cylindrique ou approximativement discoïdale ou cylindrique, par exemple ovale, en particulier lorsqu'un support solide est une microplaque ou une lame. Alternativement, un spot peut être de forme carrée ou rectangulaire (ce peut être en particulier une bande), par exemple lorsqu'un support solide est une membrane, ou de tout autre forme.
Un support solide peut ainsi comprendre au moins deux, voire trois, zones d’adsorption délimitées, par exemple trois zones, quatre zones ou cinq zones, ou au moins six zones.
Un support solide peut ainsi comprendre au moins trois spots, par exemple trois spots, quatre spots ou cinq spots, ou au moins six spots.
Selon un mode de réalisation, les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABOI), des anticorps anti-B (AB02), des anticorps anti-AB (AB03), des anticorps anti-H (Hl), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-Pl, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LUI), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
Selon un mode de réalisation, les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABOI), des anticorps anti-B (AB02), des anticorps anti-AB (AB03), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti- Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-Pl, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LUI), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
De tels anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, tels que ceux susceptibles d’être disponibles à la vente chez Diagast, Merck, Quotient ou Biorad, et choisis parmi : - des anticorps monoclonaux anti-A (ABOI), des anticorps monoclonaux anti-B (AB02), des anticorps monoclonaux anti-AB (AB03) qui seraient des IgM murins,
- des anticorps monoclonaux anti-N (MNS2) qui seraient des IgG murins,
- des anticorps monoclonaux anti-D (RH1), des anticorps monoclonaux anti-C (RH2), des anticorps monoclonaux anti-c (RH4), des anticorps monoclonaux anti-E (RH3), des anticorps monoclonaux anti-e (RH5), des anticorps anti-Cw (RH8), des anticorps monoclonaux anti-K (KEL1) des anticorps monoclonaux anti-Jka (JK1), des anticorps monoclonaux anti-Jkb (JK2), des anticorps monoclonaux anti-S (MNS3), des anticorps monoclonaux anti-s (MNS4), des anticorps monoclonaux anti-Plqui seraient des IgM humains,
- des anticorps monoclonaux anti-D (RH1), des anticorps monoclonaux anti-k (KEL2), des anticorps monoclonaux anti-Fya (FY1), des anticorps monoclonaux anti-M (MNS1) qui seraient des IgG humains,
- des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LUI), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Fyb (FY2), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2).
Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distinct.
Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption délimitées (par exemple des spots) comprenant les dits anticorps ou fragments d’anticorps du support solide sont espacées entre elles d’au moins 100 pm, ce qui peut englober notamment au moins 200, 300, 400 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 pm.
Selon certains modes de réalisation, les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 pm2, ce qui peut englober notamment au moins 100000, 20000, 30000, 40000, ou 50000 pm2.
Selon certains modes de réalisation, les dites zones d’adsorption comprennent ou consistent en des zones (notamment des spots) de 50 à 500 pm de dimension maximale (notamment de diamètre), ce qui comprend, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 pm. Selon un mode de réalisation, au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 pm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 pm2.
Selon un mode de réalisation, les dites zones d’adsorption sont hydrophiles ou hydrophobes. Selon un mode de réalisation, le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
Selon un mode de réalisation, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées forme une paroi inclinée par rapport au reste de toute ou partie du dit support solide.
Selon certains modes de réalisation, le procédé in vitro de détection selon l’invention peut être caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées est plane, conique ou hémisphérique.
Selon un mode de réalisation, les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière covalente.
Selon un mode de réalisation, les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non- covalente.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison, le ou les dit(s) polymère(s) de liaison immobilisant les dits anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques.
Ainsi, selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison, de manière covalente ou non-covalente. De manière non-exhaustive, de tels polymères de liaison peuvent être par exemple être constitués de polymères de liaison mentionnés dans WO2012/052874.
Aussi, selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique.
Le terme « squelette polysaccharidique » tel que défini ici englobe toute structure formée par un ensemble de sucres (ou unités saccharidiques), liés entre eux par des liaisons osidiques, en particulier O-osidiques. Ce squelette polysaccharidique peut notamment être linéaire ou ramifié. Selon certains modes de réalisation, il comprend de 80 à 600 unités saccharidiques, et en particulier de 150 à 350 unités saccharidiques.
Selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu de groupements aromatiques et/ou de groupements acides carboxyliques, substitués ou non.
Selon certains modes de réalisation, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison fixés au dit substrat (en particulier à la dite zone d’adsorption délimitée) de manière non-covalente, et comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou - de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison fixés au dit substrat (en particulier à la dite zone d’adsorption délimitée) de manière non-covalente, et comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
- le dit ou les dit(s) polymère(s) de liaison immobilisant les dits anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les dits déterminants antigéniques.
Selon certains modes de réalisation, le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupements chargés positivement au pH du dit mélange réactionnel.
Exemple de préparation des plaques et de mise en œuvre du procédé pour l’épreuve de Simonin
Des anticorps anti-A (ABOI) et anti-B (AB02) ont été déposés au fond des puits de plaques de microtitration pour former une pluralité de zones d’adsorption délimitées.
Les échantillons (plasmas humains) à tester sont mis en contact avec des hématies tests dans les puits. Les puits contenant les hématies tests et les échantillons sont alors centrifugés 2 min à 2000g. A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré puis le fond des puits est imagé.
La présence ou l’absence d’agglutination pourra être détectée ou non au niveau de chaque dépôts d’anticorps par analyse visuelle ou par analyse d’image.
96 échantillons plasmatiques ont été testés dans le cadre de la détection d’anticorps anti ABO. La simple analyse visuelle de la répartition des agglutinais sur les différents anticorps montre une corrélation de 100% avec les techniques standards.
Exemple de préparation des plaques et de mise en œuvre du procédé pour la RAI
Trois anticorps anti-D différents ont été déposés au fond du puits de plaques de microtitration pour former une pluralité de zone d’adsorption délimitées. Les échantillons (plasma humains) à tester sont mis en contact avec une ou plusieurs hématies tests dans des puits de plaques source. Les puits contenant les hématies tests et les échantillons sont alors centrifugés 2 min à 800g.
A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré, puis 2 lavages en PBS sont effectués. A l’issue de la dernière centrifugation, le surnageant est retiré.
Le culot résultant est re-suspendu dans du tampon LISS. A ce mélange est ajouté de l’anti globuline humaine avant le dépôt dans le puits de la biopuce.
Les puits sont alors centrifugés 2 minutes à 2000g.
A l’issue de la centrifugation, le surnageant est retiré, un lavage au PBS-Tween (PBST) est effectué puis le fond des puits est imagé.
32 échantillons plasmatiques ont été testés dans le cadre de la détection d’anticorps irrégulier.
La simple analyse visuelle de la séparation montre une corrélation de 87% avec les techniques standards.
Matériel & méthodes.
Fabrication des biopuces
Des anticorps anti-A (ABOI), anti-B (AB02) et 3 anti-D, issus de milieux de cultures ont été préalablement purifiés. Chaque puit d’une plaque de microtitration préalablement fonctionnalisée a été imprimée avec ces anticorps dilués en tampon PBS.
Un robot de dépôt sans contact utilisant une technologie piézoélectrique) avec un système de dépôt générant des gouttes de 500pL est utilisé. Les plaques sont ensuite séchées à l’aide d’un thermo ventilateur 10 minutes à 80°C puis directement saturées par 200pL d’une solution de lait à 5% dans du PBS pendantl heure à température ambiante. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec 200pL de PBS. Les puits sont finalement vidés, séchés lh à 37°C avant d’être emballés et sellés en présence d’un sachet de desséchant dans un sac d’aluminium.
Le plan des biopuces fabriquées (ou réseau de dépôts) au fond de chaque puits des microplaques est présenté en figure 2.
Détection d’anticorps réguliers dans des plasmas humains
Pour le test, 100pL de plasma humain non dilué sont mélangés à 50pL d’une suspension globulaire contenant 0,5% de globules issu d’un patient A (hématies tests A) et 0,5% de globules issu d’un patient B (hématies tests B). Le mélange est transféré dans un puits dans lequel des anticorps ont été préalablement déposés.
Les plaques sont centrifugées 2 minutes à 2000g à 4°C.
Le surnageant est éliminé puis une étape de lavage en PB S est effectuée. Les fonds des puits de la plaque de microtitration sont ensuite imagés.
Détection d’anticorps irréguliers dans des plasmas humains
Pour le test, 50pL de plasma humain non dilué sont mélangés à 40pL d’hématies O test à 0,8%. Le mélange est incubé 15min à 37°C puis centrifugé 2min à 800g. Le surnageant est retiré. Deux fois successives, le culot est re-suspendu dans 100pL de PBS et centrifugé. Après la dernière centrifugation, le surnageant est retiré et les hématies sont re-suspendues dans 60pL de tampon LISS, mélange auquel est additionné 60pL d’anti globuline humaine. Ce mélange est déposé dans le puits de la biopuce qui est ensuite centrifugé 2min à 2000g. Le surnageant est retiré, puis le puits est lavé par 200pL de PB ST à 0,1%.
Les fonds des puits de la plaque de microtitration sont ensuite imagés.
Résultats
L’analyse visuelle des résultats est possible en observant les photos des fonds de puits (Figure 3). Des spots circulaires et homogènes sont observés au niveau de zones d’adsorption délimitées. Ils montrent l’absence d’agglutination. A l’opposé, la présence de larges agglutinais très supérieurs à la taille des dépôts d’origine et très inhomogènes indiquent une agglutination positive. La figure 3A correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient AB. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-A et d’anti B, indiquant l’absence d’agglutination.
La figure 3B correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient A. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-A et des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti B. Ceci indique l’absence d’agglutination des hématies tests A mais une agglutination des hématies tests B. La figure 3C correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient B. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-B et des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-A. Ceci indique l’absence d’agglutination des hématies tests B mais une agglutination des hématies tests A.
La figure 3D correspond à une biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient O. Seuls des spots irréguliers et très intenses sont observés, à la fois sur les dépôts d’anti-A mais aussi d’anti-B. Ceci indique l’agglutination des hématies tests A et B.
Cette analyse a été effectuée sur 23 échantillons plasmatiques congelés et a montré une efficacité de 100% sur les 96 échantillons testés.
Détection d’anticorps irréguliers dans des plasmas humains
Résultats
L’analyse visuelle des résultats est possible en observant les photos des fonds des puits (Figure 4). Des spots circulaires et homogènes sont observés au niveau de zones d’adsorption délimitées. Ils montrent l’absence d’agglutination. A l’opposé, la présence de larges agglutinais très supérieurs à la taille des dépôts d’origine et très inhomogènes et plus intenses indiquent une agglutination positive.
La figure 4A correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient ne possédant pas d’anticorps irrégulier. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-D, indiquant l’absence d’agglutination.
La figure 4B correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un deuxième échantillon issu d’un patient ne possédant pas d’anticorps irrégulier. Des spots réguliers et homogènes sont observés sur les dépôts d’anti-D, indiquant l’absence d’agglutination. La figure 4C correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient possédant des anticorps irréguliers anti-K. Des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-D. Ceci indique une agglutination des hématies tests et donc la présence d’anticorps irréguliers. La figure 4D correspond à une photo de biopuce incubée en présence d’un échantillon issu d’un patient possédant des anticorps irréguliers anti-D. Des spots irréguliers et très intenses sont observés sur les dépôts d’anti-D. Ceci indique une agglutination des hématies tests et donc la présence d’anticorps irréguliers.
Cette analyse a été effectuée sur 32 échantillons plasmatiques congelés et a montré une efficacité de 87% sur les 32 échantillons testés.

Claims

Revendications
1. Procédé in vitro de détection d’anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon, comprenant au moins les étapes suivantes : a) mettre en contact le dit échantillon avec un ou plusieurs érythrocyte(s) test(s) ou suspension d’érythrocyte(s) test(s) de phénotype connu, dans des conditions susceptibles d’induire une hémagglutination, de sorte à obtenir un mélange réactionnel ; b) mettre en contact le dit mélange réactionnel avec un support solide contenant une pluralité de zones d’adsorption délimitées ayant préalablement fixé des anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier des déterminants antigéniques présents sur les dits érythrocyte(s) test(s) ; c) déterminer la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur au moins l’une des dites zones d’adsorption, de sorte à détecter la présence ou l’absence d’anticorps anti-érythrocytaires dans le dit échantillon ; les dites étapes a) et b) étant réalisées séparément ou simultanément.
2. Le procédé in vitro de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques choisis parmi les systèmes ou antigènes suivants : ABO, Rhésus, Kell, MNS, P, Lutheran, lewis, Duffy, Kidd, Diégo, Cartwright, Xg, Scianna, Dombrock, Colton, Landsteiner-Wiener, Chido/Rodgers, Hh, Kx, Gerbich, Cromer, Knops, Indian, OK, RAPH, John Milton Hagen, Li, Globoside, GIL, Rh-associated glycoprotein, Forssmann, JR, LAN, VEL, CD59.
3. Le procédé in vitro de détection selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les dits anticorps anti-érythrocytaires à détecter sont aptes à lier spécifiquement des déterminants antigéniques du système ABO.
4. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dits anticorps ou fragments d’anticorps de la zone d’adsorption sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux choisis parmi : des anticorps anti-A (ABOI), des anticorps anti-B (AB02), des anticorps anti-AB (AB03), des anticorps anti-D (RH1), des anticorps anti-C (RH2), des anticorps anti-c (RH4), des anticorps anti-E (RH3), des anticorps anti-e (RH5), des anticorps anti-K (KEL1), des anticorps anti-k (KEL2), des anticorps anti-Kpb (KEL4), des anticorps anti-Fya (FY1), des anticorps anti- Fyb (FY2), des anticorps anti-Jka (JK1), des anticorps anti-Jkb (JK2), des anticorps anti-S (MNS3), des anticorps anti-s (MNS4), des anticorps anti-Lea (LE1), des anticorps anti-Leb (LE2), des anticorps anti-M (MNS1), des anticorps anti-N (MNS2), des anticorps anti-Pl, des anticorps anti-Kpa (KEL3), des anticorps anti-Lua (LUI), des anticorps anti-Lub (LU2), des anticorps anti-Cw (RH8).
5. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide fixent chacune une pluralité d’anticorps et/ou fragment(s) d’anticorps apte(s) à lier un déterminant antigénique érythrocytaire distincts.
6. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon biologique choisi parmi : un sérum humain, un plasma humain, un échantillon humain de sang total.
7. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’au moins deux des zones d’adsorption du support solide soient espacées entre elles d’au moins 100 pm, et/ou que les dites zones d’adsorption définissent une aire d’au moins 10000 pm2.
8. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dit support solide est un support plastique, et les dites zones d’adsorption sont hydrophiles.
9. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la dite pluralité de zones d’absorption délimitées forme une paroi inclinée par rapport au reste de toute ou partie du dit support solide.
10. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps ou fragments d’anticorps aptes à lier les déterminants antigéniques sont fixés aux zones d’adsorption délimitées, de manière non-covalente.
11. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les zones d’adsorption du support solide sont, au moins en partie, fonctionnalisées par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un squelette polysaccharidique pourvu :
- de groupements aromatiques de la forme -X-CONH-Z, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et Z représente une fonction aryle ; et/ou
- de groupements acides carboxyliques de la forme -X-COOH, où X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, substituée ou non, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
12. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le dit support solide est, au moins en partie, fonctionnalisé par un ou plusieurs polymères de liaison comportant un ou plusieurs groupements chargés positivement au pH du dit mélange réactionnel.
13. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence ou l’absence d’une réaction d’hémagglutination sur la dite zone d’adsorption est déterminée par comparaison avec une zone de référence distincte du dit support solide.
14. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de sédimentation du dit mélange réactionnel sur le dit support solide.
15. Le procédé in vitro de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape c) de détermination est réalisée après une étape de centrifugation du dit support solide.
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