EP4142938A1 - Plaquette de test et système de test biologique automatisé - Google Patents

Plaquette de test et système de test biologique automatisé

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Publication number
EP4142938A1
EP4142938A1 EP21721148.1A EP21721148A EP4142938A1 EP 4142938 A1 EP4142938 A1 EP 4142938A1 EP 21721148 A EP21721148 A EP 21721148A EP 4142938 A1 EP4142938 A1 EP 4142938A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
test
test plate
wafer
inlet
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21721148.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Benoît TUCOULAT
Julius DEWAVRIN
Victor TING
Christelle BARAKAT
Sounderya NAGARAJAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Withings SAS
Original Assignee
Withings SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Withings SAS filed Critical Withings SAS
Publication of EP4142938A1 publication Critical patent/EP4142938A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/0638—Valves, specific forms thereof with moving parts membrane valves, flap valves

Definitions

  • This document generally relates to diagnostic devices by nucleic acid amplification, in particular from a biological sample such as drops of blood, urine, saliva and sweat. More specifically, the present invention relates to test platelets, used in an automated biological test system for identifying the presence of an infectious microorganism (bacteria, virus, etc.). However, the proposed device and method can be applied to the detection of other biological markers which may reveal any other type of pathology, including cancer.
  • LAMP Loop-mediated isothermal amplification
  • RT-LAMP Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification
  • test wafer for single use, in a biological test system intended to detect the presence of one or more pathogenic species (eg a nucleic acid sequence of interest), the wafer of test including:
  • an inlet for receiving a biological sample to be tested in liquid form the inlet preferably being sealable or reclosable
  • first reaction zone containing a porous media arranged in a second housing and containing a first test reaction mixture in lyophilized form, the first reaction mixture allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest
  • test plate being configured to bring the biological sample to be tested in the extraction membrane, then afterwards rinsing, drying and elution of said extraction membrane, bringing the resulting eluate to the reaction zones, in order, after reaction, to deduce a result therefrom through the reading zone.
  • the testing process can be automated and secure.
  • the test wafer is inserted into an analysis station which performs actions corresponding to the above process.
  • the drying of the extraction membrane is done in situ by an air flow which circulates in the channels and the housing which contains the extraction membrane, thanks to the air inlets / outlets.
  • the membrane can, additionally or alternatively, be dried by a heating device. Any manipulation is avoided during the test, the wafer remains placed in the analysis station, everything takes place under the control of the station, the latter preferably having a closed cover during the course of the test. As the membrane is quickly and properly dried, this increases the reliability and speed of the test.
  • extraction membrane designates here a porous organ making it possible to momentarily absorb the nucleic acids contained in the sample to be tested, to retain these nucleic acids during one or more rinsing operations intended to eliminate chemical species such as proteins or debris, including lysis buffer residues, whereupon an eluent with a higher ionic affinity with said nucleic acids makes it possible to capture these nucleic acids and to carry them towards the reaction / amplification zones.
  • wafer should be taken here in a very broad sense, the wafer is here a support which can take any geometric shape.
  • the second reaction zone makes it possible to confirm the correct progress of the reaction.
  • the second control reaction mixture allows, for example, the amplification and detection of at least one non-specific nucleic acid sequence, commonly found in all samples (positive control). This makes it possible in particular to verify that the extraction has proceeded well, and that the eluate has indeed reached the reaction zones and that the amplification reaction has taken place.
  • the second mix can be a negative control that does not normally activate, unless the cartridge has shown a malfunction (eg RNA contamination in that control disc).
  • the test wafer can include a positive control disc and a negative control disc.
  • test plate and the biological test system can be used in particular by an isothermal method of amplification of nucleic acid known as "LAMP” or “RT-LAMP", but other methods may be used.
  • a pathogenic species can be a microorganism such as a virus or a bacterium, the nucleic acid sequence of interest thus being specific to the pathogenic species to be detected.
  • the term “body” of the wafer the term “substrate” or “body-substrate” can also be used.
  • the body of the wafer is of the monolithic type.
  • the recovery tank can be designed to collect not only the biological sample, but also the rinsing liquid (s) having rinsed, the extraction membrane before its elution, and the rinsing liquid (s). remains of the biological sample as an eluate after treatment.
  • the recovery tank receives the sample first, then the rinse aid, and finally the eluate from the reaction zones. Thanks to the recovery tank, no liquid comes out of the pad, only air can come out of the pad. This avoids any contamination of the environment and / or the following test.
  • one and / or the other of the following provisions, taken individually or in combination, may optionally be used in addition.
  • test wafer may further comprise at least a first volume of first rinsing liquid, and a volume of eluent, contained directly in housings of the body or contained in sachets arranged in housings of the body.
  • the volumes of rinsing liquid and eluent are loaded on board the blister pack.
  • the analysis station is thus relatively simple, and only a pneumatic connection is required between the wafer and the analysis station.
  • the liquids (rinsing and eluent) being on board the wafer, they may be different depending on the nature of the biological test and the nucleic acid species of interest that one seeks to reveal, the analysis station remaining the same.
  • the parameters and the software operating the station can be updated by downloading but the hardware of the station remains unchanged.
  • the wafer is monolithic and contains in a single body the following elements: the extraction membrane, one or two reaction zones (or even more), the volumes of rinsing liquid and of eluent, the recovery tank , and the result reading area.
  • the eluent contained in the eluent volume is distilled RNase-free water and the eluent volume has a volume between 30 microliters and 50 microliters.
  • This water known as "DNase / RNase free water" elutes the nucleic acid species retained in the extraction membrane and carries them towards the reaction zones.
  • eluent a compound known under the Ibuffer TM name of Optigene TM (10x Buffer (500mM Tris-HCl (pH 8.1 @ 25 ° C), 300mM KCI, 300mM (NH4) 2 SO4 and 1% Triton X-100)).
  • the test wafer may further include a second volume of a second rinsing liquid, the first and second volumes of rinsing liquid having a volume between 100 microliters and 300 microliters.
  • This volume of a second rinse aid is used to complete the first rinse before drying.
  • no liquid is present in the analysis station.
  • a single wafer edge recovery tank this recovery tank being configured to collect all liquids.
  • the rinsing liquid (s) which were used to rinse the extraction membrane before its elution are trapped in the single recovery tank and not can not come out of the wafer (only air can come out of the wafer), thus avoiding any contamination of the environment and / or of the next test.
  • the rinsing and elution fluids not to be loaded onto the wafer, but to be received on the wafer from the analysis station.
  • the blister pack is then very simple, it does not contain any liquid before use.
  • the reservoir contains and traps the fluids used during the test, namely the rinsing and elution fluids as well as the remains of the initial biological sample.
  • test wafer may further include at least two valves, preferably of the membrane type, to direct a flow of fluid from the extraction membrane selectively to the recovery tank or to the reaction zone (s).
  • valves are used to direct the flow of fluids inside the wafer, especially when using a reduced number of pneumatic connections between the analysis station and the wafer.
  • the valves are on board the wafer but their orders are made from the analysis station.
  • test wafer may further comprise an auxiliary reservoir arranged adjacent to the first, and where appropriate to the second, reaction zone (s) so as to be able to supply the first and second reaction zones with eluate. capillary pumping reaction.
  • a capillary supply of the reaction zones is thus provided from the auxiliary reservoir, without the flow of eluate passing through the porous media of the reaction zones and leaving the lyophilized reagents out of the reaction zones.
  • This also allows finer control over the volume of eluate which soaks the porous media and hydrates the reaction mixtures, which increases the repeatability of the test. It is also possible to ensure that the porous media occupy substantially almost the entire space of the housing to avoid dead volumes which would dilute the reaction mixtures too much.
  • a small air evacuation passage can be provided around the periphery of the porous medium.
  • the porous media of each of said first and second reaction mixtures is formed from a paper substrate in general disk form. A material and a shape available at competitive cost is thus used.
  • the porous media of each of said first and second reaction mixtures is formed as a paper disc with a radial projection for capillary pumping
  • the second and third housings which enclose them have a single inlet / outlet port in which passes the radial projection, in other words the second and third housings are in a cul-de-sac configuration.
  • Only the radial projection that protrudes from the disc is bathed by the eluate flow.
  • the discs are not bathed by the eluate flow, they are supplied with eluate by capillary pumping. This makes it possible to limit the diffusion of the lyophilized reagents out of the discs.
  • the body of the wafer is formed from a translucent plastic material, such as polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cycloolefin copolymer (COC) or Cycloolefin Polymers (COP).
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • COC cycloolefin copolymer
  • COP Cycloolefin Polymers
  • the channels and housings can be formed by machining into the body of the test wafer. According to another aspect, the channels and the housings can be obtained by molding.
  • test wafer may further comprise a membrane or a ventilation valve, arranged on at least one of the air outlets, to pass air to the atmosphere and not to pass liquid.
  • a Gore tex TM type capsule can advantageously prevent any liquid spillage while still allowing air to pass through.
  • an intermediate air outlet arranged near the inlet of the recovery tank, to facilitate the drying of the membrane after the passage of the rinsing liquids.
  • this facilitates the advancement of the eluate after elution by expelling the air through this orifice, in the configuration of a single recovery tank.
  • ribs are provided in the recovery tank. This provides control over the advance of the liquid front in the recovery tank.
  • an absorbent pad to capture liquids arriving in the tank (typically by capillarity) and avoid liquid leakage through the air outlet (including when air is injected into the test plate).
  • the absorbent pad makes it possible to capture amplicons which would reach the recovery tank and thus prevent the latter from escaping from the recovery tank to contaminate the wafer or the station.
  • An air passage can be provided around the perimeter of the absorbent pad to allow free circulation of air up to the air outlet.
  • the recovery tank also makes it possible to reduce the force necessary to move the fluids in the cartridge (by capillary action).
  • the test plate may have a generally flat parallelepipedal shape, with two main faces and in which the air inlet and the inlet for receiving a biological sample to be tested (ET) are arranged on a single main face.
  • ET biological sample to be tested
  • the air inlet and the inlet receiving the biological sample to be tested are merged and together form a single fluid inlet.
  • all the functional interfaces namely the inputs and the elements activated by the push buttons, are arranged on a single main face. This provides simplicity of construction and design of the analysis station. According to one aspect, all the functional interfaces, namely the inputs and the elements activated by the push buttons, are grouped together on one side of the main face (for example grouped together over three quarters of a length of the face or half ). This allows a portion of the wafer to remain outside the analysis station cover, allowing you to always identify the wafer being processed (the cover will be described later).
  • all the interfaces of the wafer with the analysis station are on the same side, and the other side of the wafer is provided with a rectangular sealing membrane of uniform thickness.
  • This sealing membrane may be of the “PCR adhesive film” type or of the “PSA tape TM” type. There is thus a simplicity of production and of the design of the analysis station. Different adhesives can be used: one for the discs and one for the rest of the test pad.
  • a biological sample to be tested ET
  • test wafer may further include a wafer identification feature.
  • the identification element makes it possible to precisely identify the wafer and the test performed, data which can be associated in such a way. reliable to a patient from which the biological sample to be tested is obtained.
  • the identification of the wafer by the station also makes it possible to adapt the test sequence to the wafer (drying time, heating temperature, heating time, etc.).
  • the wafer can be configured to receive, by plugging in, a collection container containing a biological sample to be tested. This eliminates a risk associated with spilling a biological sample contained in a standard collection tube into the inlet of the wafer to receive a biological sample.
  • the test wafer may further include a check valve on the air inlet. This avoids a risk of liquid reflux through the air inlet during the introduction of the biological sample to be tested.
  • the test wafer may further include a non-return valve on the inlet for receiving the biological sample to be tested. This avoids a risk of liquid reflux through this orifice.
  • non-return valves or non-return valve or even 'check valve'
  • fluid air or liquid
  • reverse flow that is to say an exit of fluid (air or liquid) to the outside of the pad. Note that, throughout the proposed process, nothing can exit the wafer except air on the air outlet downstream of the tank.
  • the first housing, the second housing and the third housing are arranged close to each other, preferably in a surface thermal interaction zone at most equal to 5 cm 2 or 4 cm 2 . It is thus possible to heat the extraction membrane and the reaction discs by a single thermal activation module in the analysis station.
  • the test wafer comprising two main faces, opposite, and all the functional interfaces for the test (that is to say the inlet for sample, inlet of air, the rinsing volumes, the valves, the reaction zones) are located on only one of the two main faces.
  • an assembly comprising a test plate as described above and a rigid support on which the test plate is mounted, the rigid support completely covering the main face not having the functional interfaces.
  • the rigid plate When installed in the station, the rigid plate is positioned between the test pad and the cover.
  • the rigid plate has a thickness typically between 0.5mm and 2mm.
  • a test equipment comprising a test wafer as described above, and a collection container comprising a sealed inlet and a sealed outlet, both arranged in the lower part of the collection container, and a cover with hermetic closure.
  • the collection container can be plugged into the test wafer, and the test wafer can include two needles arranged respectively opposite the sealed entry and the sealed exit, the needles passing through the covers during the plugging operation.
  • a biological test system comprising an analysis station, and one or more test wafers as described above, the analysis station comprising at least one pneumatic connector configured to be coupled to the. air inlet and / or air outlet.
  • the analysis station includes at least one of the following features:
  • the base can include an indentation of complementary shape to a main face of the test wafer, so that the test wafer can be positioned by simply fitting into the indentation and removed by exerting a force in the direction opposite to the indentation.
  • the footprint may comprise an interface zone for the air pump, one or more actuators, the optical analysis device and the heater, the interface zone being configured to cooperate with a functional interface of the device. main face of the cartridge.
  • the optical analysis device and the heating device are for example arranged at the level of the imprint close to one another, preferably in a thermal interaction zone of surface at most equal to 4 cm 2 .
  • the analysis station may include a cover, mounted to rotate relative to the base, for example using a hinge, which configured to, in the open position, allow an operator to fit and remove the wafer. test in the impression and, in the closed position, press the wafer into the impression.
  • the hood can be locked by a hood locking system.
  • a Hall effect sensor can be used to detect the closed position of the cover and allow the lock to be triggered.
  • the analysis station may further include: a control unit for controlling the various components of the station and wireless communication means for communicating the test results to an external device (mobile phone, tablet, computer).
  • a control unit for controlling the various components of the station and wireless communication means for communicating the test results to an external device (mobile phone, tablet, computer).
  • a biological test method implemented in a test wafer as described above, the method comprising:
  • 51- pass the biological sample to be tested (ET) in liquid form through the extraction membrane, and direct it downstream to the recovery tank,
  • the drying of the extraction membrane is done in situ by a flow of air which circulates in the channels and the housing which contains the extraction membrane. This ensures that there is no more liquid, ie that the membrane has been thoroughly dried, so that only the eluent provided for this purpose is thus afterwards entrained towards the reaction zones, which contributes to the reliability of the test process.
  • drying step S3 it can be provided before the drying step S3:
  • S65- wait for it to cool or proceed with active cooling by activating, for example, a Peltier cell or by means of a convector means,
  • 58- determine a result.
  • a step of cooling the reaction zones to room temperature before optical reading is provided.
  • steps S1 to S8 above are carried out when the wafer is in position in the base provided for this purpose, without moving or handling the wafer.
  • a first optical reference reading is provided before heating, which can be carried out in order to make the “zero” of the optical system.
  • the result is assigned to a patient file in a one-to-one way to the plate, therefore to the biological sample and therefore to its donor, ie the patient. It is thus possible to process a large number of samples without risking an incorrect assignment of the results.
  • test plate for single use, in a biological test system intended to detect the presence of one or more pathogenic species (eg a nucleic acid sequence of interest), the test plate comprising:
  • an inlet for receiving a biological sample to be tested (ET) in liquid form the inlet preferably being sealable or reclosable
  • reaction zone containing a porous media arranged in a second housing and containing a first test reaction mixture in lyophilized form, said reaction mixture allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest
  • a result reading zone comprising at least the reaction zone, the test plate being configured to bring the biological sample to be tested in the extraction membrane, then after rinsing, drying and elution of said extraction membrane , bring the resulting eluate into the reaction zone, in order, after reaction, to deduce a result therefrom through the reading zone.
  • test plate can be simplified and the control zone dispensed with.
  • Another, simpler way can be used to verify that the eluate has arrived in the reaction zone.
  • a station camera can transparently monitor the operations taking place in the wafer.
  • a station pressure sensor can be placed in parallel with the air inlet or the air outlet.
  • a capacitive sensor of the station can detect fluid movements.
  • a limit switch or an optical encoder can detect the position of actuators.
  • a force sensor can detect a force applied by actuators (via motor current, for example).
  • FIG. 1 is a general block view of a biological test system according to the present invention
  • FIG. 2 is a schematic view of a first embodiment of a test plate according to the present invention
  • FIG. 3 is a perspective view of the first embodiment of a test plate according to the present invention.
  • FIG. 4 is a perspective view from the opposite side of the plate of figure 2, with the closure membrane separated
  • FIG. 5 is a perspective view in transparency of an analysis station compatible with the first embodiment
  • FIG. 6 is a partial perspective view seen from below of the station of Figure 5
  • FIG. 7 is a schematic view of a second embodiment of a test plate
  • FIGS. 8A and 8B are schematic front and side views respectively of a third embodiment of a test plate
  • FIG. 9A and 9B illustrate a collection container according to two particular embodiments
  • FIG. 10 illustrates a schematic elevational view of a test plate according to one of the possible examples, in a variant adapted to receive the collection container of Figure 9,
  • FIG. 11 is a schematic view of a fourth embodiment of a test plate
  • FIG. 12 illustrates the method implemented in various embodiments of the wafer and / or the analysis station
  • FIG. 13A and 13B are detail views illustrating a membrane-type valve
  • FIG. 14 is a detail view illustrating a sachet of liquid on board the wafer and pushed by a piston of the analysis station
  • FIG. 16 is a partial detail view illustrating the device for optical reading of the reaction zones.
  • FIG. 17 to 21 illustrate a fifth embodiment of a test plate, with in particular:
  • FIG. 17 is a plan view from the dorsal face of the wafer, from the upper side in the test position in the station,
  • FIG. 18 is a plan view from the opposite side of the wafer, with the interface and activation elements,
  • FIG. 19 is a sectional view with the wafer and the heating / cooling and optical reading device
  • FIG. 20 is a perspective view of the heating / cooling and optical reading device
  • FIG. 21 is a top view of the heating / cooling and optical reading device
  • FIG. 22 is a top view of the analysis station, cover open,
  • FIGS 23a, 23b and 23c illustrate two views of the test plate associated with a rigid plate and a view of the test plate with its rigid plate in position in the test station (open cover).
  • an ST biological test system which comprises an analysis station 8, a test wafer 1 and a collection container 40.
  • the test strip 1 is intended for single use; there are therefore as many test plates as there are unit tests to be carried out.
  • the collection container 40 is of the standard type, however, we will see later that another, more specific type of collection container can be used.
  • the collection container 40 is used to collect a biological sample, for example saliva, a nasopharyngeal swab, or urine, or even sweat.
  • a biological sample for example saliva, a nasopharyngeal swab, or urine, or even sweat.
  • the proposed system is aimed in particular at the processing of human samples, it is not excluded to use the proposed system for processing samples taken from animals.
  • the collection of the biological sample in the collection container 40 consists in depositing a sample of crude body fluid originating from the human being or animal in a lysis buffer (to rupture the membranes of the biological cells), then shaking the sample. collection vessel for a sufficient time of one to several minutes, after which a predefined amount of ethanol is poured into the vessel to freeze the sample in a prepared sample state. Note that it suffices to take a small amount of raw body fluid, typically a volume between 0.1 milliliter and 1 milliliter is sufficient for multiple types of tests.
  • the biological sample in collection container 40 thus prepared (denoted ET) is then poured into an inlet orifice of the plate marked 12. Following which this inlet orifice is closed again, ie this inlet is sealed with a plug. or even a sealing of an airtight closure membrane.
  • the inlet port 12 of the wafer is provided with a non-return valve.
  • This valve allows entry into the plate but prohibits reverse movement.
  • the valve can be mounted on the inlet port by a retaining ring, for example.
  • the valve can be a silicone valve, such as a "duckbill valve”, “dome valve”, “umbrella valve”, etc.
  • the plate 1 now containing the biological sample to be treated (we also say 'to be tested', hence the name 'test plate'), is placed on a test station in the analysis station 8 which then has its cover 80 open. Then the door (the cover) is closed and a user initiates a treatment cycle, i.e. a test cycle. At the end of said cycle, a test result is given by the analysis station, in a form which will be described later.
  • the test wafer and the analysis station can have various functions and characteristics; several exemplary embodiments are presented below.
  • the result is obtained within a few tens of minutes. Most often the result is obtained in less than 1 hour. For many types of tests, the result is obtained in less than 50 minutes all inclusive.
  • Such a system can be used in the context of an analytical laboratory, but, in view of its simplicity and the speed of its implementation, this biological test system can be used beyond, in a very broad context. , namely in a pharmacy, in a doctor's office, in a general care facility, in a quarantine and release system from quarantine.
  • This biological test system can also be used in a veterinary vehicle to test animals.
  • FIGS. 2 to 6 illustrate a first embodiment of a test plate 1 and of an analysis station 8 compatible with its processing.
  • the present test wafer comprises a body 10, which can also be called a substrate. Channels and housings seen below are formed in the wafer body.
  • the term “wafer” should be taken here in a very broad sense, the wafer is here a support which can take any geometric shape. By abuse of language we can also call it 'chip' or 'chip' term which comes from the logic 'Lab-on-a-chip'. Instead of the test plate, one could also use “cartridge” or “cassette”. All the processing operations carried out on the biological sample to be tested are carried out in this wafer, in particular the extraction of the DNA / RNA molecules for rinsing elution, the wafer also comprising at least one zone for reading the result.
  • the test plate has a generally flat parallelepipedal shape, with two main faces, namely a first main face 10A called the interaction face and a second main face 10B called the rear face.
  • a peripheral slice 10C forming the other four faces extends between the two main faces.
  • the thickness of the plate marked H1 is between 3 mm and 20 mm.
  • the length L1 is between 20 mm and 80 mm and the width W1 is between 10 mm and 60 mm.
  • the geometric configuration can be similar to a credit card format, but with a slightly greater thickness.
  • the wafer is identified by an identification element 27 of the wafer, which can be arranged on the wafer (i.e. QR Code) or in the wafer as in the case of an RFID, NFC or equivalent chip.
  • the identifying element can be even simpler, such as color coding or mechanical coding.
  • the identification element 27, when it is digital, makes it possible to uniquely identify the test wafer, and secondarily to store the result in the identification element 27 at the end of the test before opening the test. the door / cover 80.
  • the biological sample being associated with an individual from which this biological sample comes, which makes it possible to associate the biological sample, the plate and the donation in a one-to-one manner.
  • the RFID or NFC chip also makes it possible to identify that a plate is correctly mounted in the station. This may condition the activation of the station lock.
  • the wafer is obtained by removing it from a block of homogeneous parallelepipedal material. Milling and drilling operations are carried out from the rear face 10B to obtain the aforementioned channels and housings.
  • the body of the wafer is formed from a translucent plastic material, such as polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cycloolefin copolymer (COC) or Cycloolefin Polymers (COP).
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • COC cycloolefin copolymer
  • COP Cycloolefin Polymers
  • the wafer with all its channels and housings can also be obtained directly from molding, without reworking.
  • the chosen substrate forms an effective barrier to contain the fluids considered, it does not allow or absorb air and liquids from rinsing which will be discussed later.
  • a closing membrane 59 for example a bio-compatible adhesive plastic film, is glued.
  • a rear cover for example by ultrasonic welding.
  • a rigid plate described later, can act as a rear cover. Said rigid plate may have dimensions greater than the plate itself.
  • the channels are generally identified by the reference 13.
  • the channels circulates fluid which may be liquid or air.
  • the channels have a small cross section compared to the dimensions of the housings.
  • there is a so-called upstream reservoir denoted 11 which forms a reservoir for the temporary storage of the biological sample to be tested ET; this space is a coil in the example shown.
  • This recovery tank 18 is downstream of the channels transporting liquid fluids and this recovery tank is sized to contain: the volume of the biological sample to be tested input + the rinsing liquid volumes + eluate volume.
  • the volume of this recovery tank 18 is between 0.1 milliliter and 2 milliliters.
  • the recovery tank 18 extends from an inlet end 18a to a bottom 18b.
  • the recovery reservoir 18 contains an absorbent pad 180.
  • This absorbent pad exhibits a blotting effect and captures liquids. It is expected that the absorbent pad 180 does not occupy all of the volume available in the recovery tank 18, and to leave at least one air passage 181 between the pad 180 and the walls of the tank so that air can. escape through the outlet port 16.
  • An outlet channel 160 may connect the air passage 181 to the air outlet 16.
  • a 13h channel connects the air inlet 14 to the space forming upstream reservoir 11.
  • Another channel 13a connects the space forming upstream reservoir 11 to a first housing 24 containing an element called an extraction membrane which will be seen below.
  • Another channel 13b connects the housing 24 to a bypass valve 52. From there, another channel 13f connects the valve outlet to the zone containing the reactants, in particular to an auxiliary reservoir 38.
  • Another channel 13c extending the channel 13b connects the bypass valve inlet to another valve 51 which allows or stops the passage of fluid downstream towards the recovery tank 18, ending at an air outlet 17.
  • Another channel 13e extends the channel 13d and opens into the recovery tank 18.
  • Channels 13s, 13u, 13k respectively connect the housings marked 74,75,76 to the channel 13a upstream of the housing 24 of the extraction membrane.
  • a channel 13f connects the outlet of the bypass valve 52 to an auxiliary reservoir 38 interposed between the housings 72, 73.
  • a channel 13g connects the auxiliary tank 38 and opens in the vicinity of the inlet end 18a of the recovery tank 18.
  • a channel 13j places the bottom portion 18b of the recovery tank 18 in communication with the atmosphere via an air outlet 16.
  • an inlet 12 is provided to receive the biological sample to be tested AND in liquid form.
  • This entry is sealable or reclosable with a stopper.
  • this inlet is equipped with a non-return valve.
  • an inlet reservoir 11 which is in the example shown as a housing in the form of a coil.
  • the wafer includes an air inlet marked 14. Air can thus be sent into the wafer, in particular by the analysis station.
  • the air inlet 14 and the inlet 12 receiving the biological sample to be tested AND are merged and together form a single fluid inlet.
  • the wafer includes an extraction membrane marked 2.
  • the extraction membrane can be a silica membrane or cellulose membrane.
  • the extraction membrane has a porous structure, i.e. an alveolar structure. The function of the extraction membrane is to isolate DNA / RNA molecules and remove proteins and other short-molecule wastes as will be described below.
  • the silica matrix of the extraction membrane is capable of selectively fixing DNA / RNA under conditions of high ionic strength and at pH ⁇ 7.
  • the impurities are removed by rinsing and after drying, the molecules of DNA and RNA sequences are eluted in a solution at low ionic strength and at pH> 7.
  • the silica matrix can be in a glass powder, glass / silica particle or glass fiber format.
  • the rinsing also makes it possible to remove the lysis buffer residues and the drying makes it possible to remove the ethanol residues.
  • the eluent should not be contaminated with lysis buffer or flushing liquid, which may otherwise inhibit the amplification reaction.
  • the extraction membrane 2 occupies the entire housing 24 in which it is arranged in the direction transverse to the flow of fluids which are passed through the extraction membrane 2. In other words, the flow of fluid flow (rinsing, drying, elution) cannot bypass the extraction membrane 2.
  • the GF / F Whatman membrane from Sigma-Aldrich TM source can be chosen for the extraction membrane.
  • the GF / D Whatman membrane from Sigma-Aldrich TM source can be chosen for the extraction membrane, which has larger pores than the Whatman GF / F membrane and allows an accelerated flow.
  • the length of the membrane may be of the order of 10 mm, its width may be between 3 mm and 5 mm, and its thickness may be between 0.3 mm and 0.6 mm.
  • the wafer includes processing liquids that are predisposed on the wafer, that is, present on the wafer itself. We can say that they are on board or on board the plate.
  • These volumes / products are contained directly in housings of the body 10 or contained in bags 37 which are arranged in housings of the body. In the sachet / blister configuration, these sachets are prepared in advance and have a very precise capacity.
  • the liquid of interest is contained in this sachet, for example in aluminum film, and there is no direct contact between the body of the wafer and the liquid of interest before actual use by piercing / tearing of the sachet. .
  • the presence of the second rinsing liquid R2 is optional. Indeed, depending on the type of test, the housing 75 may remain unused or be absent, only one rinsing liquid is used.
  • the first and second volumes of rinsing liquid R1, R2 have a volume of between 100 microliters and 300 microliters.
  • the invention also works for smaller rinse volumes and also for larger volumes.
  • volume of eluent it can be between 30 microliters and 50 microliters. Again, the invention also works for smaller eluent volumes and also for larger eluent volumes.
  • a particular water will preferably be chosen, namely distilled water free of RNase and DNase, ie free of RNase and DNase, called “DNase / RNase free water”.
  • a Tris / EDTA buffer is used.
  • eluent one can also choose as eluent a compound known under the name Ibuffer TM of Optigene TM.
  • the eluent may also contain salts useful for the reaction.
  • the eluent has low ionic strength and has a pH> 7.
  • the wafer comprises two routing valves which serve to direct or stop a flow of fluid circulating in the channels 13.
  • the two valves make it possible to direct a flow of fluid from the extraction membrane 2 selectively to the recovery tank 18 or to the reaction zones.
  • a first valve 51 can selectively close access to the recovery tank 18. Upstream of the first valve 51 is the channel 13c and downstream is the channel 13d (Fig 4).
  • a second valve 52 can selectively open access to the reaction zones. Upstream of the second valve 52 is the channel 13b and downstream is the channel 13f (Fig 4).
  • valves 51, 52 are in the illustrated example membrane type valves.
  • a deformable membrane selectively opens or closes a passage between two neighboring orifices, the membrane being placed in a closed housing, the two orifices being the only passageways available for the fluid.
  • Figures 13A and 13B illustrate a deformable membrane 51, which selectively opens or closes a passage between two channels 131, 132.
  • the deformable membrane delimits a chamber 151 from the bottom.
  • the body of the wafer delimits the chamber 151 on the sides and on the top, except at the places where the channels open, with a first port 131a (first mouth) and a second port 132a (second mouth).
  • first port 131a first mouth
  • second port 132a second mouth
  • FIG. 13A the deformable membrane 51 is at rest (flat shape at rest) and the passage between the two mouths 131a, 132a is open (circulation in dotted arrow).
  • Figure 13B under the effect of a mechanical pushing action by the element denoted 94, the deformable membrane 51 is flexed and comes to bear on the ports (two mouths) 131a, 132a; the passage is between the two mouths 131a, 132a is then closed.
  • the membrane valve has been shown in a normally open configuration, but it is also possible to use a membrane of the normally closed configuration.
  • the air outlet 16 is arranged at the bottom or in communication with the bottom of the recovery tank, while the intermediate air outlet 17 is arranged near the inlet of the recovery tank.
  • One and the other can be fitted with a Goretex TM or equivalent capsule which prevents any liquid spillage while allowing air to pass through.
  • the Goretex TM capsule is optional.
  • the wafer comprises a first reaction zone 31 containing a porous medium 35 containing a first test reaction mixture 33, and a second reaction zone 32 containing a porous medium 35 containing a second control reaction mixture 34.
  • the first and second reaction zones are respectively arranged in the second housing 72 in the third housing 73.
  • an auxiliary reservoir 38 arranged adjacent to the first and second housings 72, 73 to indirectly supply the porous media.
  • the porous media of the reaction zones 31,32, i.e. the disks of the first and second reaction mixtures 33,34 are supplied with eluate by the arrival of this eluate in the auxiliary reservoir 38, without this eluate passing through the disks.
  • each reaction mixture disc 33, 34 there is provided a radial projection 33a, 33b for the capillary pumping function. Only the radial projection 33a, 33b is bathed directly by the eluate flow. The discs are not bathed by the eluate flow, they are supplied with eluate by capillary pumping.
  • the second and third housings 72, 73 which enclose the discs have a single input / output port through which the radial projection passes, in other words said housings are in a cul-de-sac configuration. It is noted that the contact interfaces between the disks and the reservoir are minimized, as are the dead volumes around the disks so as to limit the diffusion of the reagents contained on the disks.
  • the GF / DVA Whatman references from Cytiva TM can be chosen for both test and control discs.
  • the discs have a diameter between 5 mm and 6 mm and a thickness between 0.7 mm and 1 mm.
  • each disc occupies the entire housing in which it is placed; there is no clearance or space available where the eluent could lodge.
  • the integrated reagents are in one example: H20, dNTPs, 10x isothermal buffer, MgS04, betaine, intercalating agent, primer mix, Bst 2.0 W S enzyme, and AMV-RT enzyme (polymerase and reverse transcriptase enzymes).
  • H20 H20
  • dNTPs 10x isothermal buffer
  • MgS04 betaine
  • intercalating agent primer mix
  • primer mix Bst 2.0 W S enzyme
  • AMV-RT enzyme polymerase and reverse transcriptase enzymes.
  • this could be the WarmStart LAMP Kit from New England Biolabs TM.
  • the test reaction mixture contained in the porous media thus comprises, in one example, the reverse transcriptase which makes it possible to transcribe the RNA into DNA, the set of primers specific to the DNA of the pathogen, the DNA polymerase, a buffer isothermal containing deoxynucleotide triphosphates (dNTP), necessary for DNA amplification, MgSO4 acting as a cofactor and catalyst of the reaction, as well as betaine, an additive often used to improve the amplification of DNA sequences. Finally, a fluorophore or colorimetric probe is included to reveal the amplification reaction when it takes place.
  • dNTP deoxynucleotide triphosphates
  • the first and second reaction mixtures 33,34 are in lyophilized form. This shape is stable and allows long storage of new pads before use.
  • the first and second reaction mixtures 33,34 are in general disk form.
  • the porous media 35 is formed from paper. Its ability to absorb water free of RNase and / or DNAase (eluent) is known, controlled and repeatable, which contributes to the reliability of the test.
  • the result is read by an optical measurement, in particular a first optical device 98 arranged in the analysis station 8 opposite the first reaction zone 31 and a second optical device 99 arranged in the analysis station. analysis 8 facing the second reaction zone 32.
  • an illumination element 98a common or not, and an imaging device, an optical sensor or photodiodes are provided for. receive radiation reflected (or transmitted) by the porous media of the first and second reaction mixtures 33, 34.
  • the fluorescence properties of the porous media where the nucleic acids have multiplied are used.
  • Said first and second reaction mixtures allowing the amplification and detection of one or more nucleic acid sequences.
  • a result reading zone comprising at least the first and second reaction zones 31, 32.
  • the reading zone is as wide as the plate itself. If the substrate used for the body is not transparent or not sufficiently translucent, a specific transparent window can be provided for reading the result.
  • the fluorescence response of the first and second zones is determined reaction to deduce a test result.
  • the first test zone amplifies the DNA specific to the pathogen sought.
  • the second area (control disc) is to amplify the non-specific RNA from the sample. Indeed, the two reaction mixtures are identical apart from the set of primers put in place. In the case of control, these are primers not specific to the desired virus (desired pathogen) but cooperating with an RNA sequence still present in the sample / incident eluate.
  • the purpose of the control is to confirm that both the extraction step as well as the amplification step have gone well, thus eliminating the option of a false negative.
  • the fluorescence response intensity of the test disc can be translated into an index ranging from 0 to 1.
  • reaction mixtures can be optically analyzed after reactions, either by reflectivity measurement or by transmissivity measurement (emitter and receiver on either side of the wafer).
  • an optical reference reading is carried out before heating, to make it possible to make the "zero" of the optical system, under ambient radiation conditions and with the wafer as it is in transparency. After reaction heating and cooling, the new optical measurements are taken with the reference measurement before heating as reference (differential method).
  • Analysis station 8 comprises a frame 89 comprising structural columns 88.
  • Analysis station 8 is in the form of a parallelepiped box. In one example, this box is close to a cubic shape. In one example, the side of this cubic shape has a length of between 25 cm and 40 cm. However, the analysis station could have some form.
  • the maximum width, length or depth of the analysis station 8 is less than 40 cm, or less than 20cm, or even less than 12cm (between 11cm and 12cm).
  • the analysis station 8 comprises a bottom stage 81, an intermediate stage 82 and an upper stage 83.
  • the analysis station 8 includes a base 86 configured to receive a test wafer 1 and subject it to a series of operations.
  • the base 86 is arranged in the top plate 83 and includes guides for positioning the wafer precisely where desired for a mechanical, pneumatic, thermal and optical interface between the wafer and the station to occur.
  • the base 86 includes a recess 87 of complementary shape to the main face of the cartridge which includes the functional interfaces.
  • the cartridge can therefore easily fit into the recess 87, thus ensuring easy and correct positioning of the cartridge in the station.
  • the analysis station 8 comprises a cover 80 mounted on the frame by means of a hinge, for example by means of a pivoting movement of the Y8 axis (hinge type).
  • a cover 112 locking system is provided. In fact, when the test operations are in progress on a test wafer, the cover is closed and locked. When the test is finished and the result is obtained, the locking system unlocks the hood. An operator can then open the cover, remove the test wafer and place a new test wafer to process on the base.
  • the cover 80 typically does not include a functional interface relating to the fluidic or pneumatic circuit. In other words, the cover does not house a component configured to interact with test board 1 during a test. This simplifies the design of the analysis station 8.
  • a Hall effect sensor is used to detect the closed state of the hood.
  • the sensor data conditions the activation of the lock.
  • NFC / RFID signal indicating that the test pad is in place
  • a signal from the Hall effect sensor indicating that the hood is closed to trigger the hood lock.
  • the analysis station 8 comprises an air pump 85. It can be a pressure-generating pump or a vacuum-generating pump, depending on the wafer / station configurations.
  • the analysis station 8 comprises a heating device 96.
  • the heating device can be supplemented by a cooling device, such as a fan, a heat sink (finned heat exchanger for example, the heat sink being for example positioned above fan) and / or a Peltier cell (the same as for heating, for example), to force cooling.
  • Analysis station 8 includes a temperature sensor 97 to regulate the control of the heater.
  • the heating device can be a heating resistor, a Peltier effect cell, or even comprise one or more bodies, typically black bodies (s), arranged near the reaction zones and infrared lighting to heat the ( said black body (s).
  • the station controls the heating device to have a plateau at a certain temperature and for a certain duration.
  • the bearing temperature is between 50 ° C and 70 ° C. In one example, the bearing temperature is 65 ° C.
  • the duration of the plateau is between 20 minutes and 40 minutes.
  • the analysis station can be operated with a predetermined dwell time (parameter). In an alternative mode, the end of the plateau can depend on the optical analysis of the reaction zones, for example the result can be read before the predefined time, or in the opposite case, the optical analysis of the reaction zones can make it possible to 'identify an error.
  • the analysis station 8 includes a control unit 100, the block diagram of which is shown in Figure 15.
  • the analysis station 8 includes an optical analysis device 98.99 to determine the result, as already mentioned above.
  • the analysis station 8 comprises wireless communication means 116. These means make it possible to transmit the result to a remote entity.
  • the analysis station 8 can include, on the intermediate plate 82, one or more actuators 91-95 to push on the volumes and / or activate the controlled valves, according to the various embodiments. More precisely, a first actuator 91 makes it possible to exert a mechanical action on the volume of the first rinsing volume 61. A second actuator 92 makes it possible to exert a mechanical action on the volume of the second rinsing volume 62. A third actuator 93 allows to exert a mechanical action on the volume of eluent 63. A fourth actuator 94 makes it possible to exert a mechanical action on the first valve 51. A fifth actuator 95 makes it possible to exert a mechanical action on the second valve 52. The actuators can be called 'pushers'.
  • Analysis station 8 includes at least one pneumatic connector 66 configured to mate with air inlet 14 of the wafer.
  • a pneumatic pipe 67 is provided to connect the air pump 85 to the pneumatic connector 66.
  • the pneumatic connector (s) can be connected to different air inlets or outlets.
  • the analysis station 8 includes a user interface in the form of a control button 108, 109 and / or a touch screen.
  • the analysis station 8 may include a device 105 for reading the identification element 27 of the wafer (s).
  • the analysis station 8 can include a camera 102. This camera can be used to check the movement of liquids in the wafer.
  • FIG 14 there is illustrated the discharge of a liquid from rinsing contained in a bag 37.
  • the upper end of the actuator 94 pushes on the bag / bag.
  • a Led 98a illuminates a disc 35 and the radiation received in return is picked up by one or more photodiodes 98. On the other disc, the same process takes place with one or more photodiodes 99.
  • the test board 1 can be mounted on a rigid support 39 which can protrude from the station when the test board is installed there.
  • the rigid support is a plate (for example parallelepipedal) whose width and length dimensions are greater than that of the test wafer but whose thickness dimension is less than that of the test wafer. This means that one 10B of the main faces 10A, 10B of the test wafer (ie the main face not having a functional interface) can be fully included on the rigid support.
  • Such a rigid support 39 makes it possible to easily handle the wafer 1 without touching the main face 10 with the functional interface, allows the test wafer 1 to be easily removed from the station 8 (it suffices to grasp the rigid part and pull in the direction opposite to the imprint 87) and offers, on the side of the rigid support opposite to the test plate 1, a free surface on which information can appear, such as the identification element 27 of the test plate 1.
  • test plate 1 can be glued or welded to the rigid support 39.
  • one end 39 ′ of the rigid support can remain accessible (“visible portion") for a user.
  • the identification element 27 (or part of it) of the test plate in particular when it is an alphanumeric reference, a bar code , a QR code or other elements that need to be visible to an operator, which is therefore visible by the operator even when the cartridge is installed in the station. This allows for easy, fast, and non-hardware failure prone cartridge identification verification.
  • the thickness of the rigid support is for example between 0.5mm and 33mm, or 1mm and 2mm.
  • the cover 80 when it is closed around the axis Y8 comes into contact with the rigid support 39 to press the test plate 1 into the cavity 87 and thus ensure the functionality of the interface between the test plate and the interface zone 90 of the station 8.
  • rigid it is meant sufficiently rigid to be able to handle the wafer; but the rigid support may bend slightly (credit card type).
  • FIG. 12 the steps of the method have been illustrated.
  • a standard collection vessel 40 eg saliva was collected, then lysed and then inhibited with ethanol. This produced a ready-to-test biological sample, which was poured into inlet 12 and which is located in upstream reservoir 11.
  • the first step of interest consists of:
  • the biological sample ET passes the biological sample to be tested ET in liquid form through the extraction membrane 2.
  • the biological sample ET is pushed, thanks to an overpressure of air, from the upstream tank 11 to the recovery tank 18 , through the extraction membrane 2.
  • the first valve 51 is open while the second valve 52 is closed.
  • air outlet 16 allows the air present in the recovery tank to escape as the recovery tank fills with liquid.
  • a second rinsing pass can be used, by means of step:
  • S25- pass a second rinsing liquid R2 through the extraction membrane 2, and direct it downstream to the recovery tank.
  • Step S3 can also include: heating the membrane, to speed up drying. This heating step can be alternative or complementary to the step of passing air through the extraction membrane to dry it.
  • the extraction membrane is then eluted, in a step denoted S4.
  • an optical reference reading is made before heating, to make it possible to make the "zero" of the optical system, under ambient radiation conditions and with the wafer as it is in transparency,
  • the method provides for assigning the result (step S9) to a PF patient record.
  • FIG. 7 illustrates a second exemplary embodiment.
  • FIG. 7 illustrates a second exemplary embodiment.
  • the volumes are not on-board, ie the rinsing fluids R1, R2 and elution 23 are not on-board on the wafer, but are received on the wafer from the analysis station 8
  • the plate is then very simple, it does not contain any liquid before use.
  • the recovery tank 18 contains and traps the liquids used during the test, namely the rinsing and elution liquids as well as the remains of the initial biological sample.
  • the analysis station 8 then comprises micro-dosers, respectively 56, 57, 58 for the three fluids R1, R2, eluent 23, the result of the 3 microdosages is then found in three intermediate buffers 50.
  • the analysis station 8 then comprises selection valves, respectively 53, 54, 55 for supplying overpressure air to the channels of the three fluids.
  • the three channels meet downstream in a single output channel.
  • FIGS. 8A and 8B illustrate a third exemplary embodiment.
  • the channels inside the wafer have been simplified.
  • a common trunk of channel 13z is successively connected from upstream to downstream to the following elements from upstream to downstream:
  • the first valve 51 is opened and the second valve 52 is closed.
  • the second valve 52 is opened and the first valve 51 is closed.
  • the eluent stream passes through the media of reaction mixtures 33,34.
  • Figures 9 to 11 illustrate a fourth embodiment.
  • FIGS 9 to 11 illustrate a fourth embodiment.
  • elements are identical or similar to what has been described for the first exemplary embodiment.
  • the collection container is not standard.
  • the collection container 4 comprising an inlet 41 and an outlet 42, both arranged in the lower part of the collection container, and a hermetically sealed lid 43.
  • Each of these entry and exit 41, 42 is sealed in new condition, i.e. a seal 64 hermetically seals each of these entry and exit.
  • a chimney 44 is provided forming an internal channel in the container and bringing in air which will arrive through the inlet 41 at the top of the container.
  • the container 4 is designed to cooperate with the test plate 1 by plugging in.
  • test plate 1 On the test plate 1, there is provided a first needle 45 arranged respectively facing the sealed entry 41, and a second needle 46 arranged respectively facing the sealed outlet 42.
  • the needles 45,46 pierce the lids 64 and put in communication on the one hand:
  • the station blows air in the air inlet 14, the air rises in the chimney and pushes the biological sample towards the outlet 42 of the container, the biological sample liquid then flows from the interior of the container 4 into the inlet 12 of the plate.
  • the same result is obtained by creating a negative pressure downstream.
  • each collection container is configured to be plugged into a test plate, thus forming a single-use [test plate + collection container] pair, therefore intended to be discarded after use.
  • the 4ST collection container comprises two spaces pre-filled respectively with lysis and ethanol and which can be selectively placed in communication. More specifically, the container is delivered with a volume of lysis in a main compartment and a volume of ethanol in an annex compartment 47. The sample of raw body fluid is then deposited using a sealable swab 49 in the main compartment. Then the lid 43 is closed tightly and the collection container 4ST is shaken. Lysis buffer disrupts the membranes of biological cells. Then we pierce the annex compartment 47 to let the ethanol flow so that it mixes with the lysed liquid. For this purpose, a pointed or cutting element 48 is provided which can be moved by manual action on a button protected in an orifice.
  • the interfaces of the wafer with the analysis station are on a first side, ie of a first main face 10A and the inlet 12 to receive a biological sample at tester ET is arranged on the second side, ie on the second main face 10B.
  • the pad does not have an on-board valve.
  • the selection or routing valves are located in the analysis station 8.
  • the air pump works under negative pressure instead of over pressure. We 'pull' instead of 'push'.
  • the wafer has four air inlets, the entry 14 already commented on to advance the biological sample in the wafer.
  • Another input 142 is connected to the channel on which arrives the first rinsing volume 61, R1.
  • Another input 143 is connected to the channel on which arrives the second rinsing volume 62, R2.
  • Another input 144 is connected to the channel on which arrives the first elution volume 63,23.
  • a channel can be provided special for drying in which case there is a fifth air inlet 145. Only one of the upstream solenoid valves 146 is open at a time, the others remain closed.
  • the second upstream valve is opened and downstream the valve 1472 connected to the outlet 16.
  • the third upstream valve is opened instead.
  • the first downstream valve 1471 and the fifth upstream valve are opened.
  • FIG. 17 to 22 illustrate a fifth embodiment
  • the fifth example should be appreciated as a variation of the first example.
  • these elements are identical or similar to what has been described for the first exemplary embodiment.
  • the test plate has a general flat parallelepipedal shape, with two main faces, namely a first main face 10A called the interaction face, containing all the interfaces and a second main 10B called the rear face, not containing no functional interface.
  • the thickness of the wafer is between 2mm and 8mm.
  • the length is between 30 mm and 80 mm (for example between 70 mm and 80 mm) and the width is between 10 mm and 60 mm (for example between 40 mm and 60 mm).
  • check valve a non-return valve
  • the recovery tank 18 contains an absorbent pad 180. This absorbent pad has a blotting effect and captures liquids. The absorbent pad does not occupy all of the available volume in the recovery tank, an air passage between the pad and the walls of the tank allows air to escape through outlet 16.
  • a heating and reading device generally marked 120 is arranged opposite the first main face 10A of the wafer. More precisely, as illustrated in FIG. 19, in the analysis position, the optical reading device faces the reading zones 31 32.
  • a first heating portion 96a is provided in front of the housing 24 of the extraction membrane 2 and a second heating portion 96 in front of the reaction zones, in particular below the housings 72,73.
  • the first heating portion 96a is intended to heat the extraction membrane (2) to a temperature between 50 ° C and 60 ° C. This step is denoted S30 in FIG. 12.
  • first housing 24, the second housing 72 and the third housing 73 are arranged close to each other.
  • the thermal interaction zone denoted 126 covers the three dwellings raised 24,73,73.
  • the thermal interaction zone 126 has a surface area at most equal to 4 cm 2 (or even 5 cm 2 ).
  • the thermal interaction zone 126 can be 3 cm 2 .
  • the heating and reading device can be equipped with one or more heating and cooling elements.
  • a single rinsing liquid reservoir 61 is provided.
  • the functional interfaces namely the inputs and the elements activated by the push buttons
  • all the functional interfaces namely the inputs and the elements activated by the push buttons, are grouped together in an interface zone marked 190 in figure 22, on one side of the main face, the interface zone. 190 being localized.
  • the interface zone 190 is located in the cavity 87, and more precisely at the bottom of the cavity 87. It is noted that the complement of the interface zone 190 on the main face could be found at least in part at the bottom. outside the analysis station. In an example described above, this complement is part of the rigid support 39. It is thus possible to design a very compact analysis station.
  • the analysis station 8 can also include a thermal interaction zone. This means that, in the cavity 87, the heater 96 (in particular the intermediate bodies), the optical analysis device are also included in an area which is less than 4 cm2.
  • the optical transmission and reception cells 98, 99 are arranged on the heating and reading device 120.
  • the components and the optical reading method are identical or similar to what has been described for the first exemplary embodiment.
  • auxiliary reservoir 38 interposed between the housings 72, 73 has here a diamond shape and not a circular one. This allows optimal flooding of the reaction discs.
  • the test plate is monolithic and contains in a single body the following elements: the extraction membrane, one or two reaction zones, the rinsing liquid and eluent volumes, the recovery tank, and the result reading area.
  • the overpressure or depression created by the air pump 85 may be between 100 mbar and 500 mbar. This overpressure or depression can be adapted as a function of the portion of the cycle (rinsing, elution, drying).
  • ribs 19 may be provided in the recovery tank, which makes it possible to control the advance of the liquid front in the recovery tank.
  • the ribs 19 are located in the lower part of the recovery tank when the wafer is in the test position on the station 8, the grooves 19 form mini dams which oppose a hydrodynamic resistance to the progression of liquids in the recovery tank 18.
  • the recovery tank 18 is a single wafer-board recovery tank, this recovery tank 18 being configured to collect all liquids and trap them inside the wafer. None comes out of the plate. Only air can come out of the pad. This avoids any contamination of the environment and / or the following test.
  • the analysis station interfaces with a smartphone or tablet 28.
  • the analysis station can interface with a server 29.
  • the analysis station is updated by downloading.
  • the settings and certain parts of the software can thus be updated by downloading from a server.
  • linear actuators are used.
  • the present bioassay system and its platelets may well be used for following methods:
  • RPA Recombinase polymerase amplification, or RT-RPA
  • HDA Helicase dependent amplification
  • RCA Rolling circle amplification
  • RT-RCA Rolling circle amplification
  • NASBA Nucleic acid sequence-based amplification, or RT-NASBA
  • TMA Transcription mediated amplification, or RT-TMA.

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Abstract

Plaquette de test (1) à usage unique dans un système de test biologique destiné à déterminer la présence d'une ou plusieurs séquences d'acide nucléique, la plaquette de test comprenant un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements, une entrée (12) pour recevoir un échantillon à tester, une entrée d'air (14), une membrane d'extraction (2), des zones de réaction (31,32) contenant un media poreux (35) avec des premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l'amplification et la détection de la ou des espèces d'acide nucléique, une sortie d'air (16,17), un réservoir de récupération (18), la plaquette étant configurée pour amener l'échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d'extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d'extraction, amener l'éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture. Procédé et système associés.

Description

Plaquette de test et système ae test biologique automatisé
Le présent document est relatif généralement aux dispositifs de diagnostic par amplification d’acide nucléique, notamment, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des plaquettes de test, utilisées dans un système de test biologique automatisé destiné à identifier la présence d’un microorganisme infectieux (bactérie, virus, etc.). Toutefois, le dispositif et la méthode proposés peuvent être appliqués à la détection d’autres marqueurs biologiques pouvant révéler d’autre types de pathologie quelconque, cancer y compris.
S’agissant des tests de diagnostic basés sur la détection par amplification de l’ADN/ARN d’un microorganisme infectieux, on connaît les tests PCR usuels (PCR pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) nécessitant des cycles en température, qui sont longs et coûteux à mettre en oeuvre (nécessitent l’utilisation de thermocycleurs onéreux).
Dans les tests de diagnostic plus rapide, il a été utilisé récemment un type de test dit LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification), pour lequel il n’est plus nécessaire d’effectuer plusieurs cycles en température. Un plateau de mise en température suffit d’où le qualificatif d’« isotherme ».
C’est dans ce contexte qu’est apparu un besoin de proposer un système de test biologique qui permet de traiter un grand nombre d’échantillons de façon fiable et rapide, qui convienne pour un test de type isotherme, sans exclure toutefois de l’appliquer à d’autres types de tests.
À cet effet, il est donc proposé une plaquette de test, pour usage unique, dans un système de test biologique destiné à détecter la présence d’une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :
- un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- optionnellement au moins une entrée d’air,
- une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement,
- une première zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un deuxième logement et contenant un premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- de préférence, au moins une deuxième zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un troisième logement et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (positif ou négatif) sous forme lyophilisée,
- optionnellement au moins une sortie d’air,
- optionnellement un réservoir de récupération, - une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction, et le cas échéant la deuxième zone de réaction, la plaquette de test étant configurée pour amener l'échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
Grâce aux dispositions exposées ci-dessus, le processus du test peut être automatisé et sécurisé. La plaquette de test est insérée dans une station d’analyse qui déroule des actions correspondant au processus ci-dessus. Notamment le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction, grâce aux entrées/sorties d’air. La membrane peut, complémentairement ou alternativement, être séchée par un dispositif de chauffage. On évite toute manipulation pendant le test, la plaquette reste placée dans la station d’analyse, tout se déroule sous le contrôle de la station, cette dernière ayant de préférence un capot fermé pendant le déroulement du test. La membrane étant rapidement et correctement séchée, cela augmente la fiabilité et la rapidité du test.
Le terme « membrane d’extraction » désigne ici un organe poreux permettant d’absorber momentanément les acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester, de retenir ces acides nucléiques pendant une ou plusieurs opérations de rinçage destinées à éliminer des espèces chimiques telles protéines ou débris, résidus de tampon de lyse y compris, suite à quoi un éluant à plus forte affinité ionique avec lesdits acides nucléiques permet de capter ces acides nucléiques et de les entraîner vers les zones de réaction/d’amplification.
Le terme « plaquette » doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique.
On note que la deuxième zone de réaction dite zone de contrôle, permet de confirmer le bon déroulement de la réaction. Le deuxième mélange réactionnel de contrôle permet par exemple l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques non spécifique, se trouvant communément dans tous les échantillons (contrôle positif). Ceci permet de vérifier notamment que l’extraction s’est bien déroulée, et que l’éluat est bien parvenu aux zones de réaction et que la réaction d'amplification s’est bien déroulée. Alternativement, le deuxième mélange peut être un contrôle négatif qui ne s’active normalement pas, sauf si la cartouche a présenté un disfonctionnement (par exemple une contamination d’ARN dans ce disque de contrôle). Dans un mode de réalisation, la plaquette de test peut comporter un disque de contrôle positif et un disque de contrôle négatif.
La plaquette de test et le système de test biologique peuvent être utilisés notamment par une méthode isotherme d’amplification d’acide nucléique dite « LAMP » ou « RT-LAMP », mais d’autres méthodes sont possiblement utilisables.
Une espèce pathogène peut être un microorganisme tel qu’un virus ou une bactérie, la séquence d’acides nucléiques d’intérêt étant ainsi spécifique à l’espèce pathogène à détecter.
Pour le « corps » de la plaquette, on peut aussi utiliser le terme de « substrat », ou « corps-substrat ».
Avantageusement, le corps de la plaquette est de type monolithique.
S’agissant du réservoir de récupération, on note que ce dernier peut être prévu pour recueillir non seulement l’échantillon biologique, mais aussi le ou les liquide(s) de rinçage ayant rincé, la membrane d’extraction avant son élution, et les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement. Typiquement, le réservoir de récupération reçoit d’abord l’échantillon, puis le liquide de rinçage et enfin l’éluat provenant des zones de réaction. Grâce au réservoir de récupération, aucun liquide ne ressort de la plaquette, seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Dans divers modes de réalisation de l’invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l’une et/ou à l’autre des dispositions suivantes, prises isolément ou en combinaison.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins un premier volume de premier liquide de rinçage, et un volume d’éluant, contenus directement dans des logements du corps ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du corps.
Les volumes de liquide de rinçage et d’éluant sont embarqués à bord de la plaquette. La station d’analyse est ainsi relativement simple, et seule une connexion pneumatique est nécessaire entre la plaquette et la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces d’acide nucléique d’intérêt que l’on cherche à révéler, la station d’analyse restant la même. Eventuellement, les paramètres et le logiciel faisant fonctionner la station peuvent être mis à jour par téléchargement mais le matériel de la station reste inchangé.
Selon un aspect, la plaquette est monolithique et contient dans un seul corps les éléments suivants : la membrane d’extraction, une ou deux zones de réaction (voire plus), les volumes de liquide de rinçage et d’éluant, le réservoir de récupération, et la zone de lecture de résultat.
Selon un aspect, l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'RNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Cette eau, dite « DNase/RNase free water», vient éluer les espèces d’acide nucléique retenues dans la membrane d’extraction et les entraîner vers les zones de réaction.
Selon un aspect, on peut choisir comme éluant un composé connu sous le nom d’Ibuffer™ d’Optigene™ (10x Buffer (500mM Tris-HCI (pH 8.1 @ 25 °C), 300mM KCI, 300mM (NH4)2 S04 and 1% Triton X-100)).
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un deuxième volume d’un deuxième liquide de rinçage, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Ce volume d’un deuxième liquide de rinçage permet de compléter le premier rinçage avant le séchage. On a ainsi 3 volumes de liquide embarqués à bord de la plaquette. Avantageusement, aucun liquide n’est présent dans la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces cibles.
Selon un aspect, il peut être prévu un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération étant configuré pour recueillir tous les liquides. Ainsi non seulement les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement, mais aussi le ou les liquides de rinçage qui ont été utilisés pour rincer la membrane d’extraction avant son élution sont piégés dans le réservoir de récupération unique et ne peuvent pas ressortir de la plaquette (seul de l’air peut ressortir de la plaquette), évitant ainsi toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Selon un aspect alternatif, il peut être prévu que les fluides de rinçage et d’élution ne soient pas embarqués sur la plaquette, mais soient reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins deux valves, de préférence de type membrane, pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la ou les zones de réaction.
Ces valves permettent de diriger les flux de fluides à l’intérieur de la plaquette notamment lorsqu’on utilise un nombre réduit de connexions pneumatiques entre la station d’analyse et la plaquette. Les valves sont embarquées à bord de la plaquette mais leurs commandes sont faites depuis la station d’analyse.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un réservoir auxiliaire agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant à la deuxième, zone(s) de réaction de manière à pouvoir alimenter en éluat les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire.
On fournit ainsi une alimentation par capillarité des zones de réaction depuis le réservoir auxiliaire, sans que le flux d’éluat ne traverse les media poreux des zones de réaction et ne sorte les réactifs lyophilisés des zones de réaction. Cela permet aussi de contrôler plus finement le volume d'éluat qui imbibe les médias poreux et hydrate les mélanges réactionnels, ce qui augmente la répétabilité du test. On peut aussi faire en sorte que les médias poreux occupent sensiblement presque tout l'espace du logement pour éviter les volumes morts qui viendraient trop diluer les mélanges réactionnels. Il peut être prévu un petit passage d’évacuation d’air sur le pourtour du média poreux.
Selon un aspect, le media poreux de chacun des dits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé d’un substrat papier sous forme générale de disque. On utilise ainsi un matériau et une forme disponibles à coût compétitif.
Selon un aspect, le media poreux de chacun desdits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé comme un disque en papier avec une projection radiale pour le pompage capillaire, les deuxième et troisième logements qui les renferment ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit les deuxième et troisième logements sont en configuration de cul-de-sac. Seule la projection radiale qui dépasse du disque est baignée par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. Cela permet de limiter la diffusion des réactifs lyophilisés hors des disques.
Selon un aspect, le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
On a ainsi une lecture du résultat aisée par transparence, le corps de la plaquette ne faisant pas obstacle. On note que la lecture optique est réalisée sans déplacer la plaquette qui reste en place sur l’embase.
Selon un aspect, les canaux et les logements peuvent être formés par usinage dans le corps de la plaquette de test. Selon un autre aspect, les canaux et les logements peuvent être obtenus de moulage.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre une membrane ou un clapet de ventilation, agencé sur au moins une des sorties d’air, pour laisser passer de l’air vers l’atmosphère et ne pas laisser passer de liquide.
Une capsule de type Gore tex™ peut avantageusement empêcher tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.
Selon un aspect, il est prévu une sortie d’air intermédiaire agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération, pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage.
On évite que le flux de séchage ne traverse le réservoir sur sa longueur.
De plus cela facilite l'avancée de l'éluat après élution en chassant l'air par cet orifice, dans la configuration de réservoir de récupération unique.
Selon un aspect, il est prévu des nervures dans le réservoir de récupération. Ceci procure une maîtrise de l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération.
Selon un aspect, il est prévu dans le réservoir de récupération un tampon absorbant pour capturer les liquides arrivant dans le réservoir (typiquement par capillarité) et éviter une fuite de liquide par la sortie d’air (y compris lorsque de l’air est injecté dans la plaquette de test). En particulier, le tampon absorbant permet de capturer des amplicons qui atteindrait le réservoir de récupération et ainsi éviter que ces derniers ne puissent s’échapper du réservoir de récupération pour contaminer la plaquette ou la station. Il peut être prévu un passage d’air sur le pourtour du tampon absorbant pour permettre la libre circulation de l’air jusqu’à la sortie d’air. Le réservoir de récupération permet aussi de diminuer la force nécessaire pour déplacer les fluides dans la cartouche (par capillarité).
Selon un aspect, la plaquette de test peut présenter une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales et dans laquelle l’entrée d’air et l’entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sont agencées sur une seule face principale.
Ceci procure une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse.
Selon un aspect optionnel, l’entrée d’air et l’entrée recevant l’échantillon biologique à tester sont confondues et forment ensemble une entrée unique de fluide.
Selon un aspect, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont agencées sur une seule face principale. Ceci procure une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse. Selon un aspect, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont regroupées d’un seul côté de la face principale (par exemple regroupés sur les trois quarts d’une longueur de la face ou la moitié). Cela permet d’avoir une partie de la plaquette qui reste à l’extérieure du capot de la station d’analyse, ce qui permet de toujours pouvoir identifier la plaquette en cours de traitement (le capot sera décrit par la suite).
Selon un aspect, il est prévu que toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté, et l’autre côté de la plaquette est muni d’une membrane de scellement rectangle et d’épaisseur uniforme. Cette membrane de scellement peut être du type “film adhésif PCR” ou du type ‘PSA tape™’. On a ainsi une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse. Des adhésifs différents peuvent être utilisés : un pour les disques et un autre pour le reste de la plaquette de test.
Selon un aspect, il peut être prévu que les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale et l’entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) est agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un élément d’identification de la plaquette.
Grâce à cela, l’élément d’identification permet d’identifier précisément la plaquette et le test pratiqué, données qui peuvent être associées de manière fiable à un patient duquel provient l’échantillon biologique à tester. L’identification de la plaquette par la station permet également d’adapter la séquence de test à la plaquette (temps de séchage, température de chauffe, temps de chauffe, etc...).
Selon un aspect, la plaquette peut être configurée pour recevoir, par enfichage, un récipient de collecte contenant un échantillon biologique à tester. On supprime ainsi un risque lié au déversement d’un échantillon biologique contenu dans un tube de collecte standard dans l’entrée de la plaquette pour recevoir un échantillon biologique.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un clapet anti-retour sur l’entrée d’air. On évite ainsi un risque de reflux de liquide par l’entrée d’air lors de l'introduction de l’échantillon biologique à tester.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un clapet anti-retour sur l’entrée de réception de l’échantillon biologique à tester. On évite ainsi un risque de reflux de liquide par cet orifice.
Ces deux clapets anti-retour (ou valve anti-retour ou encore ‘check valve’) autorisent une entrée de fluide (air ou liquide) vers l’intérieur de la plaquette et empêche le flux inverse c’est-à-dire une sortie de fluide (air ou liquide) vers l’extérieur de la plaquette. On remarque que, dans tout le processus proposé, rien ne peut sortir de la plaquette à part de l’air sur la sortie d’air en aval du réservoir.
Selon un aspect, le premier logement, le deuxième logement et le troisième logement sont agencés à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone d’interaction thermique de surface au plus égale à 5 cm2 ou 4cm2. On peut ainsi chauffer la membrane d’extraction et les disques réactionnels par un seul module d’activation thermique dans la station d’analyse.
Selon un aspect, la plaquette de test comprenant deux faces principales, opposées, et toutes les interfaces fonctionnelles pour le test (c’est-à-dire l’entrée pour échantillon, entrée d’air, les volumes de rinçage, les valves, les zones de réactions) sont situées sur une seule des deux faces principales.
Selon un aspect, il est proposé un ensemble comprenant une plaquette de test telle que décrite précédemment et un support rigide sur lequel la plaquette de test est montée, le support rigide recouvrant intégralement la face principale n’ayant pas les interfaces fonctionnelles. Lorsqu’installé dans la station, la plaque rigide est positionnée entre la plaquette de test et le capot. La plaque rigide a une épaisseur typiquement comprise entre 0,5 mm et 2mm.
Selon un aspect, il est proposé un équipement de test comprenant une plaquette de test telle que décrite précédemment, et un récipient de collecte comprenant une entrée operculée et une sortie operculée, toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle à fermeture hermétique.
Selon un aspect, le récipient de collecte peut être enfiché sur la plaquette de test, et la plaquette de test peut comprendre deux aiguilles agencées respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée et de la sortie operculée, les aiguilles traversant les opercules durant l’opération d’enfichage.
Selon un aspect, il est proposé un système de test biologique, comprenant une station d’analyse, et une ou plusieurs plaquettes de test telles que décrites précédemment, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.
On a ainsi un raccordement simple lors du mouvement d’insertion de la plaquette dans la position de test. Un seul mouvement à savoir descendre la plaquette dans l’embase de test en translation, suffit pour réaliser l’accouplement entre station et plaquette.
Selon un aspect, la station d’analyse comprend au moins l’une des caractéristiques suivantes :
- une unité de commande,
- une pompe à air,
- un ou plusieurs actionneurs (pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées),
- un dispositif d’analyse optique (pour déterminer le résultat),
- un dispositif de chauffage,
- des moyens de communication sans fil,
- un lecteur d’identifiant,
- un système de verrouillage de capot.
Selon un aspect, il est proposé une station d’analyse pour plaquette de test telle que décrit précédemment ou selon un ensemble tel que décrit précédemment, la station d’analyse comprenant :
- une pompe à air,
- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur des volumes et/ou activer des valves commandées,
- un dispositif d’analyse optique pour déterminer des résultats,
- un dispositif de chauffage,
- une embase configurée pour recevoir la plaquette de test.
L’embase peut comprendre une empreinte de forme complémentaire à une face principale de la plaquette de test, de sorte que la plaquette de test puisse être positionnée par simple emboîtement dans l’empreinte et retirée en exerçant une force de direction opposée à l’empreinte. L’empreinte peut comprend une zone d’interface pour la pompe à air, l’un ou plusieurs actionneurs, le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage, la zone d’interface étant configurée pour coopérer avec une interface fonctionnelle de la face principale de la cartouche.
Le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage sont par exemple agencés au niveau de l’empreinte à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone de d’interaction thermique de surface au plus égale à 4 cm2. La station d’analyse peut comprendre un capot, monté à rotation par rapport à l’embase, par exemple à l’aide d’une charnière, qui configuré pour, en position ouverte, permettre à un opérateur d’emboîter et déboîter la plaquette de test dans l’empreinte et, en position fermée, plaquer la plaquette dans l’empreinte. Le capot peut être verrouillé par un système de verrouillage de capot. Un capteur à effet Hall peut être utilisé pour détecter la position fermée du capot et autoriser le déclenchement du verrouillage.
La station d’analyse peut comprendre en outre : une unité de commande pour piloter les différents composants de la station et des moyens de communication sans fil pour communiquer les résultats de test à un dispositif externe (téléphone portable, tablette, ordinateur).
Selon un aspect, il est proposé un procédé de test biologique mis en oeuvre dans une plaquette de test telle que décrite précédemment, le procédé comprenant :
51- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
52- faire passer un premier liquide de rinçage dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
53- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction, pour la sécher,
54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction.
De manière avantageuse, le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction. On s’assure ainsi qu’il n’y a plus de liquide, i.e. que la membrane a été bien asséchée, pour que seulement de l’éluant prévu à cet effet ne soit ainsi après entraîné vers les zones de réaction, ce qui contribue à la fiabilisation du processus de test.
Selon un aspect, il peut être prévu avant l’étape de séchage S3:
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.
Selon un aspect, il peut être prévu en outre :
55- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction à une température prédéfinie,
56- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S65- attendre que cela refroidisse ou procéder à un refroidissement actif par l’activation par exemple d’une cellule Peltier ou au moyen d’un moyen convecteur,
57- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
58- déterminer un résultat. Selon un aspect particulier, on prévoit une étape de refroidissement des zones de réaction à température ambiante avant la lecture optique.
Avantageusement, les étapes S1 à S8 ci-dessus sont réalisées lorsque la plaquette est en position dans l’embase prévue à cet effet, sans déplacement ni manipulation de la plaquette.
Selon un aspect particulier, on prévoit une première lecture optique de référence avant chauffage, qui peut être réalisée afin de faire le « zéro » du système optique.
Selon un aspect, il peut être prévu en outre :
S9- affecter le résultat à un dossier patient.
L’identification de la plaquette étant liée de manière bi-univoque à l’échantillon biologique et à son donneur, le résultat est affecté à un dossier patient de manière bi-univoque à la plaquette, donc à l’échantillon biologique et donc à son donneur, i.e. le patient. On peut ainsi traiter de très nombreux échantillons sans risquer de se tromper dans l’affectation des résultats.
Selon un autre aspect, il est donc proposé une plaquette de test, pour usage unique, dans un système de test biologique destiné à détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :
- un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- au moins une entrée d’air, et au moins une sortie d’air,
- une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement,
- une zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un deuxième logement et contenant un premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, ledit mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- un réservoir de récupération,
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la zone de réaction, la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans la zone de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
Pour réaliser des tests en très grand nombre, lorsque le test est déjà bien connu, on peut simplifier la plaquette de test et se passer de la zone de contrôle. On peut utiliser un autre moyen plus simple pour vérifier que l’éluat est arrivé dans la zone de réaction. Par exemple, une caméra de la station peut surveiller par transparence les opérations qui se déroulent dans la plaquette.
Par exemple, un capteur de pression de la station peut être placé en parallèle de l’entrée d’air ou de la sortie d’air. Par exemple, un capteur capacitif de la station peut détecter des déplacements de fluides. Par exemple, un capteur de fin de course ou un encodeur optique peut détecter la position des actionneurs. Par exemple, un capteur de force peut détecter un effort appliqué par les actionneurs (via le courant du moteur, par exemple). On a ainsi une solution particulièrement économique concernant la plaquette avec un seul disque de réaction, la plaquette étant un consommable du point de vue du système de test. L’ensemble des caractéristiques optionnelles décrites ci-dessus peuvent être appliquées à cette configuration mono zone de réaction.
D’autres aspects, buts et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de plusieurs modes de réalisation de l’invention, donnés à titre d’exemple non limitatif. L’invention sera également mieux comprise en regard des dessins joints sur lesquels :
- la figure 1 est une vue générale synoptique d’un système de test biologique selon la présente invention,
- la figure 2 est une vue schématique d’un premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,
- la figure 3 est une vue en perspective du premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,
- la figure 4 est une vue en perspective depuis le côté opposé de la plaquette de la figure 2, avec la membrane de fermeture séparée,
- la figure 5 est une vue en perspective et en transparence d’une station d’analyse compatible avec le premier exemple de réalisation,
- la figure 6 est une vue partielle en perspective vu de dessous de la station de la figure 5,
- la figure 7 est une vue schématique d’un deuxième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- les figures 8A et 8B sont des vues schématiques respectivement de face et de côté d’un troisième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- les figures 9A et 9B illustrent un récipient de collecte selon deux modes de réalisation particulier,
- la figure 10 illustre une vue schématique en élévation d’une plaquette de test selon l’un des exemples possibles, dans une variante adaptée à recevoir le récipient de collecte de la figure 9,
- la figure 11 est une vue schématique d’un quatrième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- la figure 12 illustre le procédé mis en oeuvre dans divers exemples de réalisation de la plaquette et/ou de la station d’analyse,
- les figures 13A et 13B sont des vues de détail illustrant une valve de type membrane,
- la figure 14 est une vue de détail illustrant un sachet de liquide embarqué sur la plaquette et poussé par un piston de la station d’analyse,
- la figure 15 est une vue système centrée sur une illustration schématique fonctionnelle de la station d’analyse, - la figure 16 est une vue de détail partielle illustrant le dispositif de lecture optique des zones de réaction.
- Les figures 17 à 21 illustrent un cinquième exemple de réalisation d’une plaquette de test, avec notamment :
- la figure 17 est une vue en plan depuis la face dorsale de la plaquette, du côté supérieur en position de test dans la station,
- la figure 18 est une vue en plan depuis la face opposée de la plaquette, avec les éléments d’interface et d’activation,
- la figure 19 est une vue en coupe avec la plaquette et le dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,
- la figure 20 est une vue en perspective du dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,
- la figure 21 est une vue de dessus du dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,
- la figure 22 est une vue de dessus de la station d’analyse, capot ouvert,
- les figures 23a, 23b et 23c illustrent deux vues de la plaquette de test associée à une plaque rigide et une vue de la plaquette de test avec sa plaque en rigide en position dans la station de test (capot ouvert).
Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. Pour des raisons de clarté de l’exposé, certaines dimensions peuvent ne pas être représentées à l’échelle.
Système - généralités
Selon la vue synoptique présentés à la figure 1 , il est proposé un système de test biologique ST qui comprend une station d’analyse 8, une plaquette de test 1 et un récipient de collecte 40.
La plaquette de test 1 est prévue pour usage unique ; il y a donc autant de plaquettes de test que de tests unitaires à réaliser. Dans l’exemple représenté ici, le récipient de collecte 40 est de type standard, toutefois, nous verrons plus loin qu’un autre type de récipient de collecte, plus spécifique, peut être utilisé.
Le récipient de collecte 40 est utilisé pour recueillir un échantillon biologique, par exemple de la salive, un prélèvement naso-pharyngé, ou de l’urine, voire de la sueur. Bien que le système proposé s’adresse en particulier au traitement d’échantillons humains, il n’est pas exclu d’utiliser le système proposé pour traiter des échantillons prélevés sur des animaux. Optionnellement, pour certains types de tests, on peut être amené à recueillir du sang ou de la lymphe comme un échantillon biologique à tester.
Le recueil de l’échantillon biologique dans le récipient de collecte 40 consiste à déposer un prélèvement de fluide corporel brut provenant de l’être humain ou animal dans un tampon de lyse (pour rompre les membranes des cellules biologiques), puis d’agiter le récipient de collecte pendant un temps suffisant de une à plusieurs minutes, suite à quoi on verse une quantité prédéfinie d’éthanol dans le récipient pour figer l’échantillon dans un état d’échantillon préparé. On note qu’il suffit de prélever une quantité faible de fluide corporel brut, typiquement un volume entre 0,1 millilitre et 1 millilitre suffit pour de multiples types de tests.
L’échantillon biologique dans récipient de collecte 40 ainsi préparé (noté ET) est ensuite versé dans un orifice d’entrée de la plaquette repéré 12. Suite à quoi on rebouche cet orifice d’entrée, i.e. on rend hermétique cette entrée par un bouchon voire un scellement de membrane de fermeture étanche.
Selon une autre configuration optionnelle et avantageuse, l’orifice d’entrée 12 de la plaquette est muni d’un clapet anti-retour. Ce clapet autorise une entrée dans la plaquette mais interdit le mouvement inverse. Le clapet peut être monté sur l’orifice d’entrée par une bague de retenue, par exemple. Le clapet peut être une valve en silicone, comme une « duckbill valve », « dôme valve », « umbrella valve », etc.
La plaquette 1 contenant désormais l’échantillon biologique à traiter (on dit aussi ‘à tester’, d’où le nom de ‘plaquette de test’), est placé sur un poste de test dans la station d’analyse 8 qui a alors son capot 80 ouvert. Ensuite la porte (le capot) est refermée et un utilisateur déclenche un cycle de traitement, i.e. un cycle de test. A la fin dudit cycle, un résultat de test est donné par la station d’analyse, sous une forme qui sera décrite plus loin. La plaquette de test et la station d’analyse peuvent présenter diverses fonctions et caractéristiques ; plusieurs exemples de réalisation sont présentés ci-après.
Le résultat est obtenu dans un temps de quelques dizaines de minutes. Le plus souvent le résultat est obtenu dans un temps inférieur à 1 heure. Pour de nombreux types de test, le résultat est obtenu en moins de 50 minutes tout compris.
Un tel système peut être utilisé dans le contexte d’un laboratoire d’analyse, mais, au vu de sa simplicité et la rapidité de sa mise en oeuvre, ce système de test biologique peut être utilisé au-delà, dans un contexte très large, à savoir dans une pharmacie, dans un cabinet médical, dans un établissement de soins généraux, dans un système de mise en quarantaine et libération de quarantaine. Ce système de test biologique peut aussi être utilisé dans un véhicule de vétérinaire pour tester des animaux.
Plaquette - premier exemple
Les figures 2 à 6 illustrent un premier exemple de réalisation de plaquette de test 1 et de station d’analyse 8 compatible à son traitement.
La plaquette de test présente comprend un corps 10, qu’on peut aussi appeler substrat. Des canaux et des logements vus plus loin sont formés dans le corps de plaquette.
D’une façon générale, le terme ‘plaquette’ doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique. Par abus de langage on peut aussi l’appeler ‘chip’ ou ‘puce’ terme qui vient de la logique ‘Lab-on-a-chip’. En lieu et place de plaquette de test, on pourrait aussi utiliser « cartouche » ou « cassette ». L’ensemble des opérations de traitement pratiqué sur l’échantillon biologique à tester sont réalisés dans cette plaquette, notamment l’extraction des molécules ADN/ARN rinçage élution, la plaquette comprenant également au moins une zone de lecture du résultat.
Dans l’exemple illustré, la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale 10A dite face d’interaction et une deuxième principale 10B dite face arrière. De plus, une tranche périphérique 10C formant les quatre autres faces s’étend entre les deux faces principales. Dans l’exemple illustré, l’épaisseur de la plaquette notée H1 est comprise entre 3 mm et 20 mm. La longueur L1 est comprise entre 20 mm et 80 mm et la largeur W1 est comprise entre 10 mm et 60 mm. La configuration géométrique peut s’apparenter à un format carte de crédit avec toutefois une épaisseur un peu plus importante.
La plaquette est identifiée par un élément d’identification 27 de la plaquette, qui peut être agencé sur la plaquette (i.e. QR Code) ou dans la plaquette comme dans le cas d’une puce RFID, NFC ou équivalents. L’élément d’identification peut être même plus simple, comme un codage couleur ou un codage mécanique. L’élément d’identification 27, lorsqu’il est numérique, permet d’identifier unitairement sans ambiguïté la plaquette de test, et accessoirement de stocker le résultat dans l’élément d’identification 27 à la fin du test avant l’ouverture de la porte/capot 80.
Par ailleurs, l’échantillon biologique étant associé à un individu duquel provient cet échantillon biologique, ce qui permet d’associer de façon bi- univoque l’échantillon biologique, la plaquette et le donner.
La puce RFID ou NFC permet aussi d’identifier qu’une plaquette est bien montée dans la station. Cela peut conditionner l’activation du verrouillage de la station.
Dans l’exemple illustré, la plaquette est obtenue par enlèvement de manière à partir d’un bloc de matière homogène parallélépipédique. On pratique depuis la face arrière 10B des fraisages et des perçages pour obtenir les canaux et logements susmentionnés.
Le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
Au lieu de partir d’un bloc homogène parallélépipédique, on peut partir d’une forme moulée où les principaux logements sont déjà formés de moulage et seuls des perçages de petit diamètre restent à faire.
On peut aussi obtenir directement de moulage la plaquette avec tous ses canaux et logements, sans reprise d’usinage.
En outre, au lieu d’une méthode par enlèvement de matière, on peut utiliser un procédé de fabrication additive de type impression 3D.
On note que le substrat choisi forme une barrière efficace pour contenir les fluides considérés, il ne laisse pas passer ni n’absorbe l’air et les liquides de rinçage dont il va être question plus loin.
Canaux, réservoirs et logements
Sur face arrière 10B, pour fermer les canaux et les logements, on vient coller une membrane de fermeture 59, par exemple un film plastique adhésif bio-compatible. Alternativement, on peut prévoir de souder un capot arrière, par exemple par soudure ultrasons. Une plaque rigide, décrite plus loin, peut faire office de capot arrière. Ladite plaque rigide peut avoir des dimensions supérieures à la plaquette proprement dit.
Ainsi les canaux et les logements sont généralement isolés de l’environnement extérieur. Les canaux sont repérés de manière générale par la référence 13. Dans ces canaux circule du fluide qui peut être du liquide ou de l’air. Les canaux ont une section transversale petite au regard des dimensions des logements. Parmi les logements, on trouve un réservoir dit amont et noté 11 qui forme un réservoir pour le stockage temporaire de l’échantillon biologique à tester ET ; cet espace est un serpentin dans l’exemple illustré.
Mais il pourrait avoir une autre forme. On trouve aussi un réservoir aval aussi appelé réservoir de récupération repéré 18. Ce réservoir de récupération 18 est en aval des canaux transportant des fluides liquides et ce réservoir de récupération est dimensionné pour contenir : le volume de l’échantillon biologique à tester entrée + les volumes de liquide de rinçage + le volume d’éluat. Le volume de ce réservoir de récupération 18 est compris entre 0,1 millilitre et 2 millilitres. Le réservoir de récupération 18 s’étend d’une extrémité d’entrée 18a à un fond 18b.
Selon une configuration optionnelle, le réservoir de récupération 18 contient un tampon absorbant 180. Ce tampon absorbant présente un effet buvard et capture les liquides. Il est prévu que le tampon absorbant 180 n’occupe pas tout le volume disponible dans le réservoir de récupération 18, et de laisser au moins un passage d’air 181 entre le tampon 180 et les parois du réservoir afin que de l’air puisse s’échapper par l’orifice de sortie 16. Un canal de sortie 160 peut relier le passage d’air 181 à la sortie d’air 16.
Pour en revenir aux canaux et en référence notamment à la figure 4, un canal 13h relie l’entrée d’air 14 à l’espace formant réservoir amont 11.
Un autre canal 13a relie l’espace formant réservoir amont 11 à un premier logement 24 contenant un élément appelé membrane d’extraction qui sera vu plus loin.
Un autre canal 13b relie le logement 24 à une valve de dérivation 52. A partir de là, un autre canal 13f relie la sortie de valve à la zone contenant les réactants, notamment à un réservoir auxiliaire 38.
Un autre canal 13c prolongeant le canal 13b relie l’entrée de valve de dérivation à une autre valve 51 qui autorise ou stoppe le passage de fluide vers l’aval en direction du réservoir de récupération 18, en se terminant à une sortie d’air 17. Un autre canal 13e prolonge le canal 13d et débouche dans le réservoir de récupération 18. Des canaux 13s,13u,13k relient respectivement les logements repérés 74,75,76 au canal 13a en amont du logement 24 de la membrane d’extraction.
Un canal 13f relie la sortie de la valve de dérivation 52 à un réservoir auxiliaire 38 interposé entre les logements 72,73.
De plus un canal 13g relie le réservoir auxiliaire 38 et débouche au voisinage de l’extrémité d’entrée 18a du réservoir de récupération 18.
Enfin un canal 13j met en communication la portion de fond 18b du réservoir de récupération 18 avec l’atmosphère via une sortie d’air 16.
Concernant les canaux 13, de petites flèches en traits pointillés illustrent à la figure 4 le sens de circulation du fluide (liquide et/ou air) dans ces canaux. Les termes ‘amont’ et ‘aval’ font référence aux sens de circulation indiqués. Généralement il n’y a pas de circulation à double sens dans les canaux 13.
Comme déjà évoqué, il est prévu une entrée 12 pour recevoir l’échantillon biologique à tester ET sous forme liquide. Cette entrée est scellable ou refermable par bouchon. En variante cette entrée est équipée d’un clapet anti retour. Ainsi après déversement de l’échantillon biologique et fermeture, la plaquette peut être retournée sans aucun risque de répandre une partie de l’échantillon biologique.
Une fois versé dans la plaquette, le liquide de l’échantillon biologique est contenu dans un réservoir d’entrée 11 , qui se présente dans l’exemple illustré comme un logement en forme d’un serpentin.
De plus, la plaquette comprend une entrée d’air repérée 14. De l’air peut être ainsi envoyé dans la plaquette, notamment par la station d’analyse.
Dans un exemple de réalisation non représenté aux figures, l’entrée d’air 14 et l’entrée 12 recevant l’échantillon biologique à tester ET sont confondues et forment ensemble une entrée unique de fluide.
Membrane d’extraction, liquides de traitement et valves
De plus, la plaquette comprend une membrane d’extraction repérée 2. La membrane d’extraction peut être une membrane de silice ou membrane de cellulose. La membrane d’extraction présente une structure poreuse, c’est-à- dire une structure alvéolaire. La fonction de la membrane d’extraction est l’isolation des molécules ADN/ARN et l’élimination des protéines et autres déchets à molécules courtes comme il va être décrit ci-après.
Dans un exemple, la matrice en silice de la membrane d’extraction est capable de fixer sélectivement les ADN/ARN en condition de force ionique élevée et en pH < 7. Les impuretés sont éliminées par des rinçages et après séchage, les molécules d’ADN et séquences ARN sont élués dans une solution en force ionique faible et à pH > 7. La matrice en silice peut être sous un format de poudre de verre, de particules de verre/silice ou de fibres en verre. En particulier, le rinçage permet également d’élimer les résidus de tampon de lyse et le séchage permet d’éliminer les résidus d’éthanol. L’éluant ne doit pas être contaminé par le tampon de lyse ou le liquide de rinçage, qui peuvent autrement inhiber la réaction d’amplification. Pour plus de détails sur les membranes d’extraction utilisées ici, on pourra se référer au document EP1463744.
On note que la membrane d’extraction 2 occupe tout le logement 24 dans lequel elle est disposée dans la direction transversale à l’écoulement des fluides que l’on fait passer dans la membrane d’extraction 2. Autrement dit, le flux d’écoulement des fluides (rinçage, séchage, élution) ne peut pas contourner la membrane d’extraction 2.
On peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/F Whatman de source Sigma-Aldrich™. Selon un autre exemple, on peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/D Whatman de source Sigma- Aldrich™, qui a des pores plus gros que la membrane GF/F Whatman et permet un écoulement accéléré.
Par exemple, la longueur de la membrane peut être de l’ordre de 10 mm, sa largeur peut être comprise entre 3 mm et 5 mm et son épaisseur peut être comprise entre 0,3 mm et 0,6 mm.
De plus, la plaquette comprend des liquides de traitement qui sont prédisposés sur la plaquette, c’est-à-dire présents sur la plaquette elle-même. On peut dire qu’ils sont embarqués ou à bord de la plaquette.
Dans l’exemple illustré, il est prévu un premier volume 61 de liquide de rinçage R1 agencé dans le logement 74, un deuxième volume 62 d’un deuxième liquide de rinçage R2 agencé dans le logement 75, et un volume 63 d’éluant 23 agencé dans le logement 76. Ces volumes/produits sont contenus directement dans des logements du corps 10 ou contenus dans des sachets 37 lesquels sont agencés dans des logements du corps. Dans la configuration sachet/blister, ces sachets sont préparés en avance et ont une contenance bien précise. Le liquide d’intérêt est contenu dans ce sachet, par exemple en film d’aluminium, et il n’y a pas de contact direct entre le corps de la plaquette et le liquide d’intérêt avant utilisation effective par percement/déchirement du sachet.
Le contenu de ces volumes de liquide peut être déversé et dirigé vers la membrane d’extraction 2 au travers des canaux susmentionnés 13s,13u,13k comme il sera vu plus tard, en réponse à une activation.
On remarque que la présence du deuxième liquide de rinçage R2 est optionnelle. En effet, en fonction du type de test, le logement 75 peut rester inutilisé ou être absent, un seul liquide de rinçage est utilisé.
Dans l’exemple illustré, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage R1, R2 ont un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Bien entendu, l’invention fonctionne aussi pour des volumes de rinçage plus petits et aussi pour des volumes plus grands.
Concernant le volume d’éluant, il peut être compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Là aussi, l’invention fonctionne aussi pour des volumes d’éluant plus petits et aussi pour des volumes d’éluant plus grands.
Concernant l’éluant, on choisira de préférence une eau particulière, à savoir une eau distillée exempte de RNase et de DNase, i.e. dépourvue de RNase et DNase, dite « DNase/RNase free water». Dans un autre exemple on utilise un tampon Tris/EDTA. Pour l’éluant, on peut aussi choisir comme éluant un composé connu sous le nom d’Ibuffer™ d’Optigene™. De plus, l’éluant peut aussi contenir des sels utiles pour la réaction.
L’éluant présente une force ionique faible et présente un pH > 7.
Pour plus de détails sur le type d’éluant utilisé ici, on pourra se référer au document EP1463744.
En outre, dans l’exemple illustré, la plaquette comprend deux valves de routage qui servent à diriger ou stopper un flux de fluide circulant dans les canaux 13.
Plus précisément, les deux valves permettent de diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction 2 sélectivement vers le réservoir de récupération 18 ou vers les zones de réaction.
Une première valve 51 peut sélectivement fermer l’accès au réservoir de récupération 18. En amont de la première valve 51 se trouve le canal 13c et en aval se trouve le canal 13d (Fig 4).
Une deuxième valve 52 peut sélectivement ouvrir l’accès vers les zones de réaction. En amont de la deuxième valve 52 se trouve le canal 13b et en aval se trouve le canal 13f (Fig 4).
Les valves 51 , 52 sont dans l’exemple illustré des valves de type membrane. En effet une membrane déformable vient sélectivement ouvrir ou fermer un passage entre deux orifices voisins, la membrane étant placée dans un logement fermé, les deux orifices étant les seules voies de passages disponibles pour le fluide.
Les figures 13A et 13B illustrent une membrane déformable 51 , qui ouvre ou ferme sélectivement un passage entre deux canaux 131, 132.
La membrane déformable délimite par le bas une chambre 151. Le corps de la plaquette délimite sur les côtés et sur le haut la chambre 151 , sauf aux endroits où débouchent les canaux, avec un premier port 131a (première embouchure) et un deuxième port 132a (deuxième embouchure). En figure 13A la membrane déformable 51 est au repos (forme plate au repos) et le passage entre les deux embouchures 131a, 132a est ouvert (circulation en flèche pointillée). En figure 13B sous l’effet d’une action mécanique de poussée par l’élément noté 94, la membrane déformable 51 est fléchie et vient porter sur les ports (deux embouchures) 131a, 132a ; le passage est entre les deux embouchures 131a, 132a est alors fermé.
La valve membrane a été illustrée dans une configuration normalement ouverte, mais il est aussi possible d’utiliser une membrane de configuration normalement fermée.
La sortie d’air 16 est agencée au fond ou en communication avec le fond du réservoir de récupération, tandis que la sortie d’air intermédiaire 17 est agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération. L’une et l’autre peuvent être équipées d’une capsule Goretex™ ou équivalente qui empêche tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.
Pour la sortie d’air 16 du fond de réservoir, en fonction de la configuration du réservoir et notamment s’il a un volume excédentaire par rapport au besoin de stockage, la capsule Goretex™ est optionnelle.
On note qu’il pourrait y avoir seulement la sortie d’air 16 du fond de réservoir mais pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage, et l’avancement de l’éluat par le canal 13g on dispose la sortie d’air intermédiaire 17 qui elle doit être équipée d’une capsule Goretex™ ou équivalente.
Zones de réaction et zone de lecture
De plus, la plaquette comprend une première zone de réaction 31 contenant un media poreux 35 contenant un premier mélange réactionnel de test 33, et une deuxième zone de réaction 32 contenant un media poreux 35 contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle 34.
Les première et deuxième zones de réaction sont agencées respectivement dans le deuxième logement 72 dans le troisième logement 73.
Dans l’exemple illustré, il est prévu un réservoir auxiliaire 38 agencé de manière adjacente aux premier et deuxième logements 72,73 pour alimenter indirectement les media poreux. Ainsi les médias poreux des zones de réaction 31,32, i.e. les disques des premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 sont alimentés en éluat par l’arrivée de cet éluat dans le réservoir auxiliaire 38, sans que cet éluat ne traverse les disques.
Selon une disposition optionnelle avantageuse, dans chaque disque de mélange réactionnel 33,34, il est prévu une projection radiale 33a, 33b pour la fonction de pompage capillaire. Seule la projection radiale 33a, 33b est baignée directement par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. On note que les deuxième et troisième logements 72,73 qui renferment les disques ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit lesdits logements sont en configuration de cul-de-sac. On note que les interfaces de contact entre les disques et le réservoir sont minimisées, tout comme les volumes morts autour des disques de manière à limiter la diffusion des réactifs contenus sur les disques.
On peut choisir pour les deux disques de test et de contrôle les références GF/DVA Whatman de source Cytiva™ (précédemment GE HEalthcare™ Life Sciences™). Par exemple, les disques ont un diamètre compris entre 5 mm et 6 mm et une épaisseur comprise entre 0.7 mm et 1 mm.
Selon un exemple, chaque disque occupe tout le logement dans lequel il est placé ; il n’y a pas de jeu ou de d’espace disponible où de l’éluant pourrait se loger. Selon une variante, on prévoit que l’air contenu initialement dans le disque puisse s’échapper lors de la réhydratation du disque. Par exemple une gorge est ménagée sous les disques et un passage de fuite pour faciliter cet échappement d’air.
Les réactifs intégrés sont dans un exemple : H20, dNTPs, 10x tampon isotherme, MgS04, bétaine, agent intercalant, mélange d’amorces, enzyme Bst 2.0 W S, et enzyme AMV-RT (enzymes polymérase et reverse transcriptase). Dans un exemple, il peut s’agir du WarmStart LAMP Kit de New England Biolabs™.
Le mélange réactionnel de test contenu dans le media poreux comprend ainsi, dans un exemple, la transcriptase inverse qui permet de transcrire l’ARN en ADN, le jeu d’amorces spécifiques à l’ADN du pathogène, l’ADN polymérase, un tampon isotherme contenant des désoxynucléotides triphosphates (dNTP), nécessaires à l’amplification ADN, du MgS04 agissant comme un cofacteur et catalyseur de la réaction, ainsi que de la bétaine, additif souvent utilisé pour améliorer l’amplification des séquences ADN. Enfin, un fluorophore ou une sonde colorimétrique est incluse afin de révéler la réaction d’amplification quand celle-ci a lieu.
Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 se présentent sous forme lyophilisée. Cette forme est stable et autorise un stockage long des plaquettes neuves avant leur utilisation.
Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 se présentent sous une forme générale de disque.
Selon une disposition optionnelle avantageuse, le media poreux 35 est formé en papier. Sa capacité d’absorption d’eau exempte d’ARNase et/ou d’ADNase (éluant) est connue, maîtrisée et répétable, ce qui contribue à la fiabilité du test.
La lecture du résultat est faite par une mesure optique, notamment un premier dispositif optique 98 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la première zone de réaction 31 et un deuxième dispositif optique 99 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la deuxième zone de réaction 32. Il est prévu dans la station d’analyse 8 un élément d’illumination 98a, commun ou non et un appareil d’imagerie, un capteur optique ou des photodiodes pour recevoir des rayonnements réfléchis (ou transmis) par les media poreux des premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34.
Dans l’exemple illustré, on utilise les propriétés de fluorescence des media poreux où les acides nucléiques se sont multipliés.
Lesdits premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l'amplification et la détection d’une ou plusieurs séquences d'acide nucléique.
On note qu’il est prévu une zone de lecture de résultat, comprenant au moins les première et deuxième zones de réaction 31,32. Dans le cas où le corps est formé en matière translucide, on peut considérer que la zone de lecture est aussi large que la plaquette elle-même. Si le substrat utilisé pour le corps n’est pas transparent ou pas suffisamment translucide, on peut prévoir une fenêtre spécifique transparente pour la lecture du résultat.
On détermine la réponse en fluorescence des première et deuxième zones de réaction pour en déduire un résultat de test.
Plus précisément, on compare la réponse en fluorescence de chaque disque avant et après chauffage. Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est faible alors le test est déclaré nul.
Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est faible, alors le test est déclaré négatif.
Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est élevée aussi, alors le test est déclaré positif.
En effet, la première zone de test amplifie l’ADN spécifique au pathogène recherché. La deuxième zone (disque de contrôle) consiste à amplifier l’ARN non spécifique provenant de l’échantillon. En effet, les deux mélanges réactionnels sont identiques mis à part le jeu d’amorces mis en place. Dans le cas du contrôle, il s’agit d’amorces non spécifiques au virus recherché (agent pathogène recherché) mais coopérant à une séquence ARN toujours présente dans l’échantillon/l’éluat incident. Le but du contrôle étant de confirmer qu’à la fois l’étape d’extraction ainsi que l’étape d’amplification se sont bien déroulées, permettant ainsi d’éliminer l’option d’un faux négatif.
Il n’est pas exclu de délivrer un résultat plus riche qu’un résultat binaire. A condition que la réponse en fluorescence du disque de contrôle soit élevée, l’intensité de réponse en fluorescence du disque de test peut être traduite en un index allant de 0 à 1.
Il faut noter qu’en lieu et place d’une mesure de réponse en fluorescence, on pourrait aussi utiliser d’autres méthodes optiques, comme une méthode de colorimétrie, une méthode de photométrie, une méthode de coefficient de transparence.
Il faut aussi noter qu’on peut analyser optiquement les mélanges réactionnels après réactions, soit par mesure de réflectivité, soit par mesure de transmissivité (émetteur et récepteur de part et d’autre de la plaquette).
Il faut aussi noter qu’on réalise une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence. Après chauffage réaction et refroidissement, les nouvelles mesures optiques sont prises avec comme référence la mesure de référence avant chauffage (méthode différentielle).
Station d’analyse
La station d’analyse 8 comprend un châssis 89 comprenant des colonnes de structure 88. La station d’analyse 8 se présente comme une boite parallélépipédique. Dans un exemple, cette boite est proche d’une forme cubique. Dans un exemple, le côté de cette forme cubique présente une longueur comprise entre 25 cm et 40 cm. La station d’analyse pourrait toutefois présenter une forme quelconque. La largeur, longueur ou profondeur maximale de la station d’analyse 8 est inférieure à 40 cm, ou inférieure à 20cm, voire inférieure à 12cm (comprise entre 11cm et 12cm).
Dans l’exemple illustré, la station d’analyse 8 comprend une platine de fond 81 , une platine intermédiaire 82 et une platine supérieure 83.
La station d’analyse 8 comprend une embase 86 configurée pour recevoir une plaquette de test 1 et la soumettre à une série d’opérations. L’embase 86 est agencée dans la platine supérieure 83 et comprend des guides pour positionner la plaquette précisément à l’endroit souhaité pour qu’une interface mécanique, pneumatique, thermique et optique entre la plaquette et la station se produise.
Par exemple, l’embase 86 comprend une empreinte 87 de forme complémentaire à la face principale de la cartouche qui comprend les interfaces fonctionnelles. La cartouche peut donc s’emboîter aisément dans l’empreinte 87, assurant ainsi un positionnement facile et correct de la cartouche dans la station.
La station d’analyse 8 comprend un capot 80 monté sur le châssis grâce à une articulation, par exemple grâce à un mouvement pivotant d’axe Y8 (type charnière).
Il est prévu un système de verrouillage de capot 112. En effet, lorsque les opérations de test sont en cours sur une plaquette de test, le capot est fermé et verrouillé. Lorsque le test est fini et que le résultat est obtenu, le système de verrouillage déverrouille le capot. Un opérateur peut alors ouvrir le capot, enlever la plaquette de test et placer sur l’embase une nouvelle plaquette de test à traiter.
Le capot 80 ne comprend typiquement pas d’interface fonctionnelle concernant le circuit fluidique ou pneumatique. En d’autres termes, le capot ne loge pas de composant configuré pour interagir avec la plaquette de test 1 pendant un test. Cela permet de simplifier la conception de la station d’analyse 8.
Un capteur à effet Hall est utilisé pour détecter l’état de fermeture du capot. La donnée du capteur conditionne l’activation du verrouillage. Ainsi, il faut un signal NFC/RFID indiquant que la plaquette de test est en place et un signal du capteur à effet Hall indiquant que le capot est fermé pour déclencher le verrouillage du capot.
La station d’analyse 8 comprend une pompe à air 85. Ce peut être une pompe génératrice de surpression ou génératrice de dépression, suivant les configurations plaquette/station.
La station d’analyse 8 comprend un dispositif de chauffage 96. Le dispositif de chauffage peut être complémentée par un dispositif de refroidissement, tel qu’un ventilateur, un dissipateur (échangeur à ailettes par exemple, le dissipateur étant par exemple positionné au-dessus du ventilateur) et/ou une cellule Peltier (la même que pour chauffer par exemple), pour forcer le refroidissement. La station d’analyse 8 comprend un capteur de température 97 pour réguler la commande du dispositif de chauffage. Le dispositif de chauffage peut être une résistance chauffante, une cellule à effet Peltier, ou encore comprendre un ou plusieurs corps, typiquement des corps noir(s), disposé(s) à proximité des zones de réaction et un éclairage infrarouge pour chauffer le(s)dit(s) corps noir(s). La station commande le dispositif de chauffage pour avoir un palier à une certaine température et sur une certaine durée. Par exemple, la température de palier est comprise entre 50 °C et 70 °C. Dans un exemple, la température de palier est de 65 °C. La durée du palier est comprise entre 20 minutes et 40 minutes. La station d’analyse peut fonctionner avec une durée de palier prédéterminée (paramètre). Dans un mode alternatif, la fin de palier peut dépendre de l’analyse optique des zones de réaction, par exemple le résultat peut être lu avant la durée prédéfinie, ou dans le cas opposé, l’analyse optique des zones de réaction peut permettre d’identifier une erreur.
La station d’analyse 8 comprend une unité de commande 100, dont le synoptique est présenté à la figure 15.
La station d’analyse 8 comprend un dispositif d’analyse optique 98,99 pour déterminer le résultat, comme déjà évoqué plus haut.
La station d’analyse 8 comprend des moyens de communication sans fil 116. Ces moyens permettent de transmettre le résultat à une entité distante.
La station d’analyse 8 peut comprendre, sur la platine intermédiaire 82, un ou plusieurs actionneurs 91-95 pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées, suivant les différents exemples de réalisation. Plus précisément, un premier actionneur 91 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du premier volume de rinçage 61. Un deuxième actionneur 92 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du deuxième volume de rinçage 62. Un troisième actionneur 93 permet d’exercer une action mécanique sur le volume d’éluant 63. Un quatrième actionneur 94 permet d’exercer une action mécanique sur la première valve 51. Un cinquième actionneur 95 permet d’exercer une action mécanique sur la deuxième valve 52. Les actionneurs peuvent être appelés ‘poussoirs’.
La station d’analyse 8 comprend au moins un connecteur pneumatique 66 configuré pour être accouplé à l’entrée d’air 14 de la plaquette. Il est prévu une tuyauterie pneumatique 67 pour relier la pompe à air 85 au connecteur pneumatique 66.
Dans d’autres configurations, le ou les connecteur(s) pneumatique(s) peuvent être raccordés à différentes entrées ou sorties d’air.
La station d’analyse 8 comprend une interface utilisateur sous forme de bouton de commande 108, 109 et/ou d’écran tactile.
La station d’analyse 8 peut comprendre un dispositif de lecture 105 de l’élément d’identification 27 de la plaquette / des plaquettes.
La station d’analyse 8 peut comprendre une caméra 102. Cette caméra peut être utilisée pour vérifier le déplacement des liquides dans la plaquette.
En référence à la figure 14, on a illustré le déversement d’un liquide de rinçage contenu dans un sachet 37. L’extrémité supérieure de l’actionneur 94 vient pousser sur la poche/le sachet. Il est prévu des picots 36 dans le fond du logement 74. Lorsqu’on presse le sachet 37, lesdits picots 36 s’y enfoncent et viennent déchirer le sachet libérant ainsi le liquide y contenu qui s’écoule dans le canal 131.
En référence à la figure 16, on a illustré plus en détails le dispositif d’analyse optique et sa disposition vis-à-vis des disques 35.
Une Led 98a illumine un disque 35 et le rayonnement reçu en retour est capté par une ou plusieurs photodiodes 98. Sur l’autre disque, le même processus se déroule avec une ou plusieurs photodiodes 99.
Support rigide de la plaquette
En référence aux Figures 23a-c, la plaquette de test 1 peut être montée sur un support rigide 39 qui peut dépasser de la station lorsque la plaquette de test y est installée. Dans un mode de réalisation, le support rigide est une plaque (par exemple parallélépipédique) dont les dimensions en largeur et en longueur sont supérieures à celle de la plaquette de test mais dont la dimension en épaisseur est inférieure à celle de la plaquette de test. Cela signifie que l’une 10B des faces principales 10A, 10B de la plaquette de test (à savoir la face principale ne comportant pas d’interface fonctionnelle) peut être entièrement comprise sur le support rigide. Un tel support rigide 39 permet de manipuler aisément la plaquette 1 sans toucher la face principale 10 avec l’interface fonctionnelle, permet de retirer aisément la plaquette de test 1 de la station 8 (il suffit de saisir la partie rigide et de tirer en direction opposée à l’empreinte 87) et offre, du côté du support rigide opposé à plaquette de test 1 , une surface libre sur laquelle peuvent figurer des informations, comme l’élément d’identification 27 de la plaquette de test 1.
En particulier, il n’est pas nécessaire de prévoir de système d’éjection et d’insertion automatisé de la plaquette, ce qui permet de s’affranchir de moteur et autres composants mécaniques/électriques. La compacité de la station 8 s’en trouve améliorée.
La plaquette de test 1 peut être collée ou soudée sur le support rigide 39.
Lorsque la plaquette de test 1 est mise en place dans la station 8 et que le capot 80 est fermé, une extrémité 39’ du support rigide peut rester accessible (« portion visible ») pour un utilisateur. Sur l’extrémité visible peut être déporté l’élément d’identification 27 (ou une partie de celui-ci) de la plaquette de test (en particulier lorsqu’il s’agit d’une référence alphanumérique, d’un code-barre, d’un QR code ou autres éléments nécessitant d’être visible pour un opérateur), qui est donc visible par l’opérateur même quand la cartouche est installée dans la station. Cela permet une vérification de l’identification de la cartouche qui est simple, rapide et non-sujette à des pannes de matériel.
L’épaisseur du support rigide est par exemple comprise entre 0,5mm et 3 3mm, ou 1 mm et 2mm.
Le capot 80, lors de sa fermeture autour de l’axe Y8 vient au contact du support rigide 39 pour plaquer la plaquette de test 1 dans l’empreinte 87 et assurer ainsi la fonctionnalité de l’interface entre la plaquette de test et la zone d’interface 90 de la station 8.
Par rigide, il est signifié suffisamment rigide pour pouvoir manipuler la plaquette ; mais le support rigide peut se courber légèrement (type carte de crédit).
Procédé
Sur la figure 12, on a illustré les étapes du procédé. Dans le premier exemple où on utilise un récipient de collecte 40 standard, on a recueilli un par exemple de la salive, puis on l’a lysé puis on l’a inhibé avec de l’éthanol. On a ainsi obtenu un échantillon biologique prêt à tester, que l’on a versé dans l’entrée 12 et qui se trouve dans le réservoir amont 11.
La première étape d’intérêt consiste à :
51- faire passer échantillon biologique à tester ET sous forme liquide dans la membrane d’extraction 2. En pratique on pousse, grâce à une surpression d’air, l’échantillon biologique ET, depuis le réservoir amont 11 vers le réservoir de récupération 18, au travers de la membrane d’extraction 2. La première valve 51 est ouverte alors que la deuxième valve 52 est fermée.
Les acides nucléiques et d’autres espèces moléculaires sont retenus par la membrane d’extraction 2.
On note que la sortie d’air 16 permet à l’air présent dans le réservoir de récupération de s’échapper au fur et à mesure que le réservoir de récupération se remplit de liquide.
Ensuite on va procéder au rinçage, dans une étape notée S2.
52- faire passer un premier liquide de rinçage R1 dans la membrane d’extraction 2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération 18. Optionnellement, on peut utiliser une deuxième passe de rinçage, au moyen de l’étape :
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage R2 dans la membrane d’extraction 2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.
Ensuite on va procéder au séchage, dans une étape notée S3.
53- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction 2, pour la sécher. La station envoie de l’air sous pression dans l’entrée d’air 14 qui parcours les canaux 13h, 11 , 13a, 13b, 13c, 13e, 13j. L’air peut sortir au fond du réservoir par la sortie 16 mais aussi l’air peut sortir par la sortie d’air intermédiaire 17. L’étape S3 peut aussi inclure : faire chauffer la membrane, pour accélérer le séchage. Cette étape de chauffage peut être alternative ou complémentaire à l’étape de passage d’air dans la membrane d’extraction pour la sécher. On procède ensuite à l’élution de la membrane d’extraction, dans une étape notée S4.
54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction 2, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers les première et deuxième zones de réaction 31 ,32. La première valve 51 est fermée alors que la deuxième valve 52 est ouverte.
D’autres étapes interviennent ensuite :
S45- optionnellement on fait une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence,
55- chauffer au moins les première et deuxième zones de réaction 31 ,32 à une température prédéfinie,
56- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S65- laisser refroidir ou ventiler pour refroidir afin de revenir à la température ambiante,
57- éclairer les première et deuxième zones de réaction 31,32, et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
58- déterminer un résultat.
Pour finir, le procédé prévoit d’affecter le résultat (étape S9) à un dossier patient PF.
Deuxième exemple de réalisation
La figure 7 illustre un deuxième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Dans le deuxième exemple de réalisation, les volumes ne sont pas embarqués, i.e. les fluides de rinçage R1,R2 et d’élution 23 ne sont pas embarqués sur la plaquette, mais sont reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse 8. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir de récupération 18 contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.
La station d’analyse 8 comprend alors des micro-doseurs, respectivement 56, 57, 58 pour les trois fluides R1, R2, éluant 23, le résultat des 3 microdosages se retrouve alors dans trois buffers intermédiaires 50. La station d’analyse 8 comprend alors des valves de sélection, respectivement 53, 54, 55 pour alimenter en air en surpression les canaux des trois fluides. Les trois canaux se rejoignent en aval dans un canal de sortie unique. Il y a une seule interface pneumatique 66 avec la plaquette, au niveau de l’entrée d’air 14.
Troisième exemple de réalisation
Les figures 8A et 8B illustrent un troisième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation. Les canaux internes à la plaquette ont été simplifiés. Un tronc commun de canal 13z est relié successivement de l’amont vers l’aval aux éléments suivants de l’amont vers l’aval :
- l’entrée d’air 14,
- le volume d’éluant 23,
- le volume du deuxième liquide de rinçage R2,
- le volume du premier liquide de rinçage R1,
- l’entrée 12 de l’échantillon biologique,
- la membrane d’extraction 2 dans son logement 24.
En aval, on retrouve, deux branches qui divergent, chacune étant ouverte ou fermée par respectivement les première et deuxième valves 51,52.
Pour les rinçages et le séchage on ouvre la première valve 51 et on ferme la deuxième valve 52.
Pour l’amenée de l’éluat vers les première et deuxième zones de réaction, on ouvre la deuxième valve 52 et on ferme la première valve 51.
Dans cet exemple, le flux d’éluant traverse les media des mélanges réactionnels 33,34. Mais on pourrait aussi avoir un réservoir auxiliaire comme précédemment décrit.
Quatrième exemple de réalisation
Les figures 9 à 11 illustrent un quatrième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Selon la présente invention, dans son quatrième exemple de réalisation illustré, le récipient de collecte n’est pas standard. Le récipient de collecte 4 comprenant une entrée 41 et une sortie 42, toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle 43 à fermeture hermétique.
Chacune de ces entrée et sortie 41 ,42 est operculée à l’état neuf, i.e. un opercule 64 scelle hermétiquement chacune de ces entrée et sortie.
Il est prévu une cheminée 44 formant un canal interne au récipient et amenant de l’air qui va arriver par l’entrée 41 en partie supérieure du récipient.
Le récipient 4 est prévu pour coopérer avec la plaquette de test 1 par enfichage.
Sur la plaquette de test 1, il est prévu une première aiguille 45 agencée respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée 41, et une deuxième aiguille 46 agencée respectivement en vis-à-vis de la sortie operculée 42.
Lorsque l’on vient enficher le récipient 4 sur la plaquette, les aiguilles 45,46 percent les opercules 64 et mettent en communication d’un part :
- l’entrée d’air 14 avec l’entrée 41 et la cheminée 44, et d’autre part :
- la sortie 42 avec l’entrée 12 d’échantillon biologique.
Pour vider le contenu du récipient de collecte 4, la station souffle de l’air dans l’entrée d’air 14, l’air remonte dans la cheminée et pousse l’échantillon biologique vers la sortie 42 du récipient, le liquide d’échantillon biologique s’écoule alors depuis l’intérieur du récipient 4 dans l’entrée 12 de la plaquette. Grâce à ce procédé, il n’y a aucun risque de déverser à l’extérieur du liquide d’échantillon biologique. Au lieu d’utiliser une pression relative positive en amont, on obtient le même résultat en créant une dépression en aval.
Selon le présent exemple, on utilise une pluralité de récipients de collecte à usage unique, chaque récipient de collecte est configuré pour être enfiché sur une plaquette de test, formant ainsi un couple [plaquette de test + récipient de collecte] à usage unique, donc destiné à être jeté après usage.
Selon une variante du récipient de collecte illustré à la figure 9B, le récipient de collecte 4ST comprend deux espaces pré-emplis respectivement de lyse et d’éthanol et pouvant être mis sélectivement en communication. Plus précisément, le récipient est livré avec un volume de lyse dans un compartiment principal et un volume d’éthanol dans un compartiment annexe 47. On vient ensuite déposer grâce à un écouvillon scellable 49 le prélèvement de fluide corporel brut dans le compartiment principal. Ensuite on referme le couvercle 43 hermétiquement et on secoue le récipient de collecte 4ST. Le tampon de lyse rompt les membranes des cellules biologiques. Puis on vient percer le compartiment annexe 47 pour faire s’écouler l’éthanol afin qu’il se mélange avec le liquide lysé. A cet effet il est prévu un élément pointu ou tranchant 48 déplaçable par une action manuelle sur un bouton protégé dans un orifice.
On forme ainsi un kit de collecte très pratique.
Dans ce quatrième exemple, comme visible sur la figure 10, les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale 10A et l’entrée 12 pour recevoir un échantillon biologique à tester ET est agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale 10B.
A l’inverse, on remarque que pour les trois premiers exemples, toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté
10A.
Comme illustré dans la figure 11 , d’autres caractéristiques sont visibles, qui peuvent être indépendantes de la configuration du récipient de collecte. Ici, la plaquette n’a pas de valve embarquée. Les valves de sélection ou routage sont localisées dans la station d’analyse 8. De plus la pompe à air travaille en dépression au lieu de en surpression. On ‘tire’ au lieu de ‘pousser’.
Plus précisément, la plaquette dispose de quatre entrées d’air, l’entrée 14 déjà commentée pour faire avancer l’échantillon biologique dans la plaquette. Une autre entrée 142 est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume de rinçage 61, R1. Une autre entrée 143 est reliée au canal sur lequel arrive le deuxième volume de rinçage 62, R2. Une autre entrée 144 est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume d’élution 63,23. Il peut être prévu un canal spécial pour le séchage auquel cas on a une cinquième entrée d’air 145. Une seule des électrovannes 146 amont est ouverte à la fois, les autres restent fermées.
En aval, nous avons deux sorties d’air, une première sortie d’air 16 au fond du réservoir de récupération 18 et une deuxième sortie d’air 16b reliée fluidiquement au réservoir auxiliaire 38. Il peut y avoir une sortie d’air pour le séchage, notée 16c, en communication fluide avec l’aval du logement 24 de la membrane d’extraction 2. Une seule des électrovannes 147 amont est ouverte à la fois, pour générer une dépression dans un des circuits de canaux.
Pour rincer la membrane avec le premier liquide de rinçage, on ouvre la deuxième vanne amont et en aval la vanne 1472 reliée à la sortie 16. Pour rincer la membrane avec le deuxième liquide de rinçage, on ouvre à la place la troisième vanne amont. Pour sécher la membrane, on ouvre la première vanne aval 1471 et la cinquième vanne amont.
Pour l’élution, on ouvre la quatrième vanne amont et la troisième en aval 1473 reliée à la sortie.
Cinquième exemple de réalisation
Les figures 17 à 22 illustrent un cinquième exemple de réalisation
Il faut apprécier le cinquième exemple comme une variation du premier exemple. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
D’une manière générale, certains éléments ont des positions différentes dans ce cinquième exemple, mais le schéma de principe des canaux et des logements reste similaire.
Comme pour le premier exemple, la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale 10A dite face d’interaction, contenant toutes les interfaces et une deuxième principale 10B dite face arrière, ne contenant aucune interface fonctionnelle. L’épaisseur de la plaquette est comprise entre 2 mm et 8 mm. La longueur est comprise entre 30 mm et 80 mm (par exemple entre 70 mm et 80 mm) et la largeur est comprise entre 10 mm et 60 mm (par exemple entre 40 mm et 60 mm).
L’échantillon à tester ET est introduit par l’orifice d’entrée 12. A cet endroit, il est prévu un clapet anti-retour (‘check valve’).
Le réservoir de récupération 18 contient un tampon absorbant 180. Ce tampon absorbant présente un effet buvard et capture les liquides. Le tampon absorbant n’occupe pas tout le volume disponible dans le réservoir de récupération, un passage d’air entre le tampon et les parois du réservoir permet à de l’air de s’échapper par l’orifice de sortie 16.
Un dispositif de chauffage et de lecture repéré généralement 120 est disposé en vis-à-vis de de la première face principale 10A de la plaquette. Plus précisément, comme illustré à la figure 19, en position d’analyse, le dispositif de lecture optique fait face aux zones de lecture 31 32.
Pour le chauffage, il est prévu une première portion de chauffage 96a en face du logement 24 de la membrane d’extraction 2 et une deuxième portion de chauffage 96 en faces des zones de réaction, notamment en dessous des logements 72,73.
La première portion de chauffage 96a est prévue pour chauffer la membrane d’extraction (2) à une température comprise entre 50 °C et 60 °C. Cette étape est notée S30 à la figure 12.
Dit autrement, le premier logement 24, le deuxième logement 72 et le troisième logement 73 sont agencés à proximité les uns des autres. La zone de d’interaction thermique notée 126 recouvre les trois logements suscités 24,73,73.
La zone d’interaction thermique 126 présente une surface au plus égale à 4 cm2 (voire 5 cm2). Par exemple la zone d’interaction thermique 126 peut faire 3 cm2.
Le dispositif de chauffage et de lecture peut être équipé d’un ou plusieurs éléments de chauffage et de refroidissement.
Dans ce cinquième exemple, il est prévu un seul réservoir de liquide de rinçage 61.
On remarque que dans ce cinquième exemple, les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont agencées sur une seule face principale (10A). De plus, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont regroupées dans une zone d’interface repérée 190 à la figure 22, d’un seul côté de la face principale, la zone d’interface 190 étant localisée. La zone d’interface 190 est située dans l’empreinte 87, et plus précisément au fond de l’empreinte 87. On note que le complément de la zone d’interface 190 sur la face principale pourrait se retrouver au moins en partie à l’extérieur de la station d’analyse. Dans un exemple décrit précédemment, ce complément est une partie du support rigide 39. On peut ainsi concevoir une station d’analyse très compacte.
En miroir de la zone d’interaction thermique de la plaquette, la station d’analyse 8 peut comprendre elle aussi une zone d’interaction thermique. Cela signifie que, dans l’empreinte 87, le dispositif de chauffage 96 (en particulier les corps intermédiaires), le dispositif d’analyse optique sont eux-aussi compris dans une zone qui fait moins de 4 cm2.
Les cellules optiques 98, 99 d’émission et réception sont agencées sur le dispositif de chauffage et de lecture 120. Les composants et le procédé de lecture optique sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Par ailleurs on remarque que le réservoir auxiliaire 38 interposé entre les logements 72,73 présente ici une forme losange et non pas circulaire. Ceci permet d’inonder de façon optimales les disques réactionnels.
Divers autres aspects
Dans le premier exemple de réalisation, ainsi que le 3ème, ainsi que le 4ème ainsi que le 5ème, la plaquette de test est monolithique et contient dans un seul corps les éléments suivants : la membrane d’extraction, une ou deux zones de réaction, les volumes de liquide de rinçage et d’éluant, le réservoir de récupération, et la zone de lecture de résultat.
On note qu’il est possible d’utiliser les récipients de collecte particuliers 4, 4ST décrits au quatrième exemple dans le contexte et l’implémentation des autres exemples.
On note qu’il n’y a pas de source électrique à bord de la plaquette, seulement des composés et réactifs chimiques pré-stockés sous forme lyophilisée et les cas échéant des liquides. La surpression ou la dépression créée par la pompe à air 85, relativement à la pression atmosphérique peut être comprise entre 100 mbar et 500 mbars. Cette surpression ou dépression peut être adaptée en fonction de la portion de cycle (rinçage, élution, séchage).
On note qu’il peut être prévu des nervures 19 dans le réservoir de récupération, ce qui permet de maîtriser l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération. Les nervures 19 se trouvent en partie basse du réservoir de récupération lorsque la plaquette est en position de test sur la station 8, les rainures 19 forment des mini barrages qui opposent une résistance hydrodynamique à la progression des liquides dans réservoir de récupération 18.
On note qu’il peut être prévu que le réservoir de récupération 18 est un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération 18 étant configuré pour recueillir tous les liquides et les piéger à l’intérieur de la plaquette. Rien ne ressort de la plaquette. Seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Grâce à une liaison sans fil 196, la station d’analyse s’interface avec un Smartphone ou une tablette 28.
De plus, la station d’analyse peut s’interfacer avec un serveur 29. Avantageusement, la station d’analyse est mise à jour par téléchargement.
En particulier, les paramétrages et certaines parties du logiciel peuvent ainsi être mis à jour par téléchargement depuis un serveur.
Concernant les actionneurs 91-95 agencés dans la station, on utilise des actionneurs linéaires. On peut par exemple choisir parmi : - un vérin système pneumatique qui vient directement actionner un piston destiné à pousser sur la membrane ou le volume de liquide à solliciter mécaniquement,
- un vérin électrique ou un moteur pas-à-pas avec un pignon crémaillère ou un mécanisme vis-écrou
- un solénoïde ou électro-aimant
- un empilage d’étage piezo-électrique, notamment pour les valves membranes.
Bien que la description ait cite principalement la méthode LAMP (Loop- mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop- mediated isothermal amplification), le présent système de test biologique et ses plaquettes peuvent tout-à-fait être utilisés pour les méthodes suivantes :
RPA : Recombinase polymerase amplification, ou RT-RPA,
HDA : Helicase dépendant amplification, ou RT-HDA, RCA : Rolling circle amplification, ou RT-RCA,
SDA : Strand displacement amplification, ou RT-SDA,
NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification, ou RT-NASBA,
TMA : Transcription mediated amplification, ou RT-TMA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Plaquette de test (1), pour usage unique, dans un système de test biologique (ST) destiné à détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes, la plaquette de test comprenant :
- un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements (24,72,73), lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable, - au moins une entrée d’air (14),
- une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24),
- une première zone de réaction (31) contenant un media poreux (35) agencé dans un deuxième logement (71) et contenant un premier mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- de préférence, une deuxième zone de réaction (32) contenant un media poreux (35) agencé dans un troisième logement (72) et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (34) sous forme lyophilisée, - au moins une sortie d’air (16,17),
- un réservoir de récupération (18),
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction (31), et le cas échéant la deuxième zone de réaction (32), la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
2. Plaquette de test selon la revendication 1 , comprenant en outre au moins un premier volume (61 ) de premier liquide de rinçage (R1 ), et un volume (63) d’éluant (23), contenus directement dans des logements (74,75) du corps (10) ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du corps.
3. Plaquette de test selon la revendication 2, dans lequel l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'ARNase et/ou d’ADNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 50 microlitres.
4. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant en outre un deuxième volume (62) d’un deuxième liquide de rinçage (R2), les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres.
5. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant en outre au moins deux valves (51 , 52), de préférence de type membrane, pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction (2) sélectivement vers le réservoir de récupération (18) ou vers la ou les zone(s) de réaction (31 , 32).
6. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant en outre un réservoir auxiliaire (38) agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ) de manière à pouvoir alimenter en éluat (23) les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire.
7. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel le corps (10) est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
8. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 7, comprenant en outre une membrane ou un clapet de ventilation, agencé sur au moins une des sorties d’air (16,17), pour laisser passer de l’air vers l’atmosphère et ne pas laisser passer de liquide.
9. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle il est prévu une sortie d’air intermédiaire (17) agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération, pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage.
10. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 9, présentant une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales (10A,10B) avec l’entrée d’air (14) et l’entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sont agencées sur une seule face principale (10A).
11. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 10 comprenant en outre un élément d’identification (27) de la plaquette.
12. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 11 , caractérisé en qu’elle est configurée pour recevoir, par enfichage, un récipient de collecte (4) contenant un échantillon biologique à tester.
13. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 12, comprenant en outre un clapet anti-retour sur l’entrée d’air (14).
14. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 13, comprenant en outre un clapet anti-retour sur l’entrée (12) de réception de l'échantillon biologique à tester.
15. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 13, dans lequel le premier logement (24), le deuxième logement (72) et le troisième logement (73) sont agencés à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone de d’interaction thermique (126) de surface au plus égale à 4 cm2.
16. Plaquette de test selon l’une des revendication 1 à 15, comprenant deux faces principales (10A, 10B), opposées, et toutes les interfaces fonctionnelles pour le test sont situées sur une seule (10A) des deux faces principales.
17. Plaquette de test selon la revendication 16, dans lequel les interfaces fonctionnelles sont situées sur un même côté de la face principale (10A), par exemple une même moitié de la face principale.
18. Ensemble comprenant une plaquette de test selon la revendication 16 ou 17, et un support rigide (39) sur lequel la plaquette de test est montée, le support rigide recouvrant intégralement la face principale (10B) n’ayant pas les interfaces fonctionnelles.
19. Ensemble selon la revendication 18, dans lequel le support rigide a une épaisseur comprise entre 0,5mm et 2mm.
20. Equipement de test comprenant une plaquette de test selon la revendication 12, et un récipient de collecte (4) comprenant une entrée operculée (41) et une sortie operculée (42), toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle (43) à fermeture hermétique.
21. Equipement de test selon la revendication 20, dans lequel le récipient de collecte est enfiché sur la plaquette de test, et dans lequel plaquette de test comprend deux aiguilles (45,46) agencées respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée et de la sortie operculée, les aiguilles traversant les opercules durant l’opération d’enfichage.
22. Système de test biologique, comprenant :
- une station d’analyse (8),
- une ou plusieurs plaquettes de test (1) selon l’une quelconque des revendications 1 à 17 ou un ensemble selon la revendication 18 ou 19, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique (66) configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.
23. Système de test biologique selon la revendication 22, dans lequel la station d’analyse (8) comprend au moins l’une des caractéristiques suivantes :
- une unité de commande (100),
- une pompe à air (85),
- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées (91-95),
- un dispositif d’analyse optique pour déterminer le résultat (98,99)
- un dispositif de chauffage (96),
- des moyens de communication sans fil (116),
- un lecteur d’identifiant (105),
- un système de verrouillage de capot (112) et, par exemple, un capteur à effet Hall pour détecter la fermeture du capot.
24. Station d’analyse (8) pour plaquette de test (1) selon l’une quelconque des revendications 1 à 17 ou un ensemble selon la revendication 18 ou 19, la station d’analyse comprenant :
- une pompe à air (85),
- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur des volumes et/ou activer des valves commandées (91-95),
- un dispositif d’analyse optique pour déterminer des résultats (98,99) - un dispositif de chauffage (96),
- une embase (86) configurée pour recevoir la plaquette de test, dans laquelle l’embase comprend une empreinte (87) de forme complémentaire à une face principale de la plaquette de test, de sorte que la plaquette de test puisse être positionnée par simple emboîtement dans l’empreinte et retirée en exerçant une force de direction opposée à l’empreinte, dans laquelle l’empreinte comprend une zone d’interface pour la pompe à air, l’un ou plusieurs actionneurs, le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage, la zone d’interface étant configurée pour coopérer avec une interface fonctionnelle de la face principale de la cartouche.
25. Station d’analyse (8) selon la revendication 24, dans laquelle le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage sont agencés au niveau de l’empreinte à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone de d’interaction thermique de surface au plus égale à 4 cm2.
26. Station d’analyse selon la revendication 24 ou 25, comprenant un capot, monté à rotation par rapport à l’embase, par exemple à l’aide d’une charnière, et configuré pour, en position ouverte, permettre à un opérateur d’emboîter et déboîter la plaquette de test dans l’empreinte et, en position fermée, plaquer la plaquette dans l’empreinte.
27. Station d’analyse selon l’une quelconque des revendications 24 à 26, comprenant en outre :
- une unité de commande (100),
- des moyens de communication sans fil (116).
28. Procédé de test biologique mis en oeuvre dans une plaquette de test selon la revendication 1 , le procédé comprenant :
51- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
52- faire passer un premier liquide de rinçage (R1) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18),
53- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction (2), pour la sécher,
54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction (2), et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ,32).
29. Procédé selon la revendication 28, comprenant en outre, avant l’étape de séchage :
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage (R2) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18).
30. Procédé selon la revendication 28 ou 29, dans lequel, pendant l’étape de séchage S3, on chauffe (S30) la membrane d’extraction (2) à une température comprise entre 50 °C et 60 °C.
31. Procédé selon l’une des revendications 28 à 30, comprenant en outre à la suite :
55- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ,32) à une température prédéfinie,
56- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S65- attendre que cela refroidisse ou procéder à un refroidissement actif par l’activation d’une cellule Peltier ou au moyen d’un moyen convecteur,
57- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
58- déterminer un résultat.
32. Procédé selon la revendication 30, comprenant en outre à la suite :
59- affecter le résultat à un dossier patient (PF).
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