EP4158355A2 - Bestimmung krankheitsspezifischer protein-aggregate in stuhlproben - Google Patents

Bestimmung krankheitsspezifischer protein-aggregate in stuhlproben

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EP4158355A2
EP4158355A2 EP21728223.5A EP21728223A EP4158355A2 EP 4158355 A2 EP4158355 A2 EP 4158355A2 EP 21728223 A EP21728223 A EP 21728223A EP 4158355 A2 EP4158355 A2 EP 4158355A2
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EP
European Patent Office
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beta
alpha
synuclein
aggregates
probes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21728223.5A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gültekin TAMGÜNEY
Dieter Willbold
Marlene PILS
Oliver BANNACH
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the invention relates to a method for determining disease-specific protein aggregates in stool samples, in particular based on the selective quantification of, for example, alpha-synuclein or amyloid-beta (A-beta) aggregates comprising the immobilization of alpha-synuclein or A beta capture molecules on a substrate, application of the sample to be examined to the substrate, addition of probes marked for detection, which mark them by specific binding to alpha-synuclein or A-beta aggregates, and detection of the labeled aggregates.
  • A-beta amyloid-beta
  • New rodegenerative diseases such as AD and PD, for example, belong to a heterogeneous group of clinical conditions, the common criterion of which in many cases (but not exclusively) is the aggregation and deposition of a specific protein in the ordered conformation of the beta sheet structure.
  • AD and PD are an ever greater problem in today's society, as more and more people are affected by the increased life expectancy and the disease thus affects the social security systems and their financial sustainability.
  • A-beta peptide deposits are found in the brain and in PD, alpha-synuclein deposits.
  • the A-beta peptide deposits (or peptide fibrils), however, only represent the end stage of a process that begins with the cleavage of monomeric A-beta peptides from APP (amyloid precursor protein), subsequently forms neurotoxic A-beta peptide oligomers and finally or alternatively ends with A-beta peptide fibrils.
  • the main pathological feature of AD is the formation of senile or amyloid plaques, consisting of the A-beta peptide and neurofibrium deposits from the tau protein.
  • the precursor protein of the A-beta peptide, APP is located in the cell wall of neurons.
  • A-beta fragments of different lengths and types such as A-beta 1-40 (A-beta 40), A-beta 1-42 (A-beta 42) or pGluA-beta 3- 42.
  • Such monomeric A-beta peptides arise throughout life, even in a healthy organism.
  • the A-beta deposits in the form of plaques are the trigger for the symptoms of the disease.
  • various studies have indicated that the small, freely diffusing A-beta oligomers in particular have the greatest toxicity and are responsible for the development and progress of AD.
  • aggregates of the A-beta peptide are directly linked to AD pathogenesis.
  • New rodegenerative diseases are usually diagnosed on the basis of neurological examinations.
  • imaging methods such as positron emission tomography (PET) for AD or DaTscan for PD can be used to support the diagnosis.
  • Laboratory diagnostic methods such as ELISA usually detect changes in the concentration of one or more substances in body fluids such as liquor, blood, plasma, serum, saliva or urine caused by illness.
  • the ratio of A-beta 42 to A-beta 40 or the amount of phosphorylated tau can also be determined from CSF samples using ELISA.
  • an absolutely reliable diagnosis of a neurodegenerative disease is often only possible post-mortem through the histopathological detection of disease-specific protein aggregates in the central nervous system, for which tissue sections of the brain are required.
  • the neurological diagnosis of new rodegenerative diseases can often be incorrect in the early stages of these diseases or not recognize them at all because the symptoms of the disease are only weakly pronounced at the early stages of the disease.
  • Imaging methods such as PET or DaTscan are not available everywhere and are expensive, and only a few specific neurodegenerative diseases such as AD or PD can be diagnosed with imaging methods. Above all, taking cerebrospinal fluid and blood samples is invasive and the former is usually very painful for patients.
  • the amounts of various substances in the blood or cerebrospinal fluid of patients were examined and their use as biomarkers was analyzed.
  • One of these substances is the A-beta peptide.
  • the most reliable method appeared to be the determination of the A-beta peptide content in the CSF of patients over a period of 6-24 months. To do this, however, several CSF withdrawals are necessary over a long period of time.
  • Sandwich ELISA measurements serve as a further detection method.
  • A-beta-specific antibodies are used to immobilize the A-beta oligomers.
  • the same antibodies are then also used for detection.
  • monomers do not lead to a signal because the antibody binding site is already occupied by the capture molecules.
  • Specific signals are therefore only generated by dimers or larger oligomers.
  • such a method only enables the quantification of the sum of all aggregates present in a sample and not the characterization of individual aggregates.
  • the ELISA-based methods also lack the necessary sensitivity.
  • the disease-specific protein aggregates mentioned could be a direct biomarker for the respective disease. Diagnostic evidence, however, poses a technical challenge, as these proteins are also produced in a healthy organism. Any detection method must therefore be insensitive to a large excess of normally folded, monomeric protein.
  • DE 10 2011 057 021 A1 describes a method for characterizing and quantifying pathogenic aggregates or oligomers in tissues and body fluids. The disadvantage here, however, is that biopsies are often necessary to examine tissue and body fluids (e.g. for blood or liquor examinations), which is sometimes painful, but at least uncomfortable for the patient, and, as a rule, medical staff for taking samples necessary is.
  • biomarker for protein aggregation disorders, in particular AD and PD, and an ultra-sensitive method for quantifying and characterizing A-beta and alpha-synuclein aggregates.
  • characterizing the biomarker i.e. determining the number, amount and / or size of this substance (biomarker) in an endogenous sample that is not a fluid or tissue, an exact diagnosis of the disease and / or information about the course of the disease and the condition is intended of the patient.
  • Yet another object of the present invention was to provide a method for the selective quantification of pathogenic aggregates which cause and / or characterize a protein aggregation disease, in particular A-beta and alpha-synuclein aggregates of any size and composition, A-beta and To make available alpha-synuclein oligomers and at the same time also small, freely diffusing A-beta and alpha-synuclein oligomers.
  • An essential part of the present invention consists in the diagnosis of new rodegenerative diseases based on the analysis of stool samples.
  • Stool samples are neither a biopsy nor a body fluid.
  • the advantage of taking a stool sample is that it is non-invasive and therefore painless.
  • stool samples can be collected without the presence of a doctor.
  • the stool samples can also be sent for laboratory analysis without the patient having to appear in person at a doctor or in a laboratory.
  • disease-specific protein aggregates are determined simply, reliably and in the most comfortable manner possible for patients, in particular avoiding the need for biopsies and / or the need to consult medical personnel by examining stool samples can be.
  • the present invention therefore particularly relates to methods for the selective quantification of protein aggregates in stool samples as biomarkers for neurodegenerative diseases.
  • the present invention also relates to a method for the selective quantification and / or characterization of A-beta or alpha-synuclein aggregates in stool samples, comprising the following steps: a) Providing a substrate on which the capture molecules are immobilized, b) applying the stool sample to be examined to the substrate, c) adding probes marked for detection which mark them by specific binding to A-beta or alpha-synuclein aggregates , and d) Detection of the marked aggregates by means of high spatial resolution in which each event is determined against the respective background.
  • characterization of the A-beta or alpha-synuclein aggregates or A-beta or alpha-synuclein oligomers means determining the shape, size and / or composition.
  • A-beta or alpha-synuclein oligomers denotes both A-beta or alpha-synuclein aggregates and A-beta or alpha-synuclein oligomers and also small, freely diffusing A. beta or alpha synuclein oligomers.
  • an oligomer is a polymer formed from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 monomers or multiples of that.
  • capture molecules are immobilized on the substrate in order to capture and fix the A-beta or alpha-synuclein aggregates.
  • a material is selected as the substrate which has the lowest possible, unspecific binding capacity, in particular with regard to A-beta or alpha-synuclein oligomers.
  • a substrate made of glass is selected.
  • the capture molecules are antibodies which, in variants of the present invention, are not immobilized covalently, but via hydrophilic and ionic interactions between the capture molecule and substrate surface or covalently via poly-D-lysine, polyethylene glycol (PEG) or dextran.
  • the glass surface is aminated for this purpose, in particular with 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) via the gas phase with toluene and under an argon atmosphere.
  • APTES 3-aminopropyltrietoxysilane
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) -functionalized PEG or NHS-functionalized dextran can then be attached to the amines on the glass surface bind covalently.
  • the capture molecule can be immobilized in variants in the same way, in that the carboxyl groups of PEG or dextran are activated via EDC and NHS.
  • the activated carboxylic acid thus binds amine groups of the capture molecule covalently to the glass surface. Remaining activated carboxylic acid groups can be inactivated via a quench step.
  • the capture molecules can be immobilized via bioaffine systems such as protein-G / A, His-Tag or biotin-avidin, for example by coating the glass surface with protein-G / A, which is then specifically Can bind mouse antibodies as a capture molecule.
  • bioaffine systems such as protein-G / A, His-Tag or biotin-avidin
  • the anti-A-beta or alpha-synuclein antibodies specifically bind an epitope of the A-beta or alpha-synuclein aggregates.
  • the epitope has an amino acid sequence of the amino-terminal part of the A-beta peptide, selected from the subregions A-beta 1-11, A-beta 3-11, or pyroGluA-beta 3-11, for example the human N-terminal epitope with the following sequence: DAEFRHDSGYE (1-11).
  • a blocking step is preferably carried out after the incubation with the capture molecule in order to minimize unspecific bonds between the stool sample and the glass surface that is still free.
  • the substrate covered with capture molecules is wetted with suitable solutions known to the person skilled in the art.
  • a solution of bovine serum albumin (BSA) is used for this.
  • the stool sample to be measured and pretreated is incubated on the substrate prepared in this way.
  • the stool sample is pretreated using one or more of the following methods:
  • enzymes e.g. proteases, nuclease, lipases
  • Customary buffer solutions are suitable for homogenization. Examples of this are Tris-buffered saline solutions (TBS) or phosphate-buffered saline solutions (PBS - phosphate-buffered saline), which are commercially available as standard solutions. These buffer solutions can be mixed with BSA in variants.
  • the buffer solutions also contain antimicrobially active substances in addition to the buffer substance.
  • these are antibacterial and antifungal substances.
  • antibacterial and antifungal substances include azides such as sodium azide, isothiazoline derivatives such as 2-methyl-4-isothiazolin-3-one or 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, or combinations of these substances.
  • An example of a commercially available product is ProClin TM 300 from Sigma-Aldrich (containing 2-methyl-4-isothiazolin-3-one and 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one).
  • a particularly preferred variant of the present invention is to homogenize the stool sample in a first buffer consisting of TBS with ProClin 300 and BSA, then centrifuging it and then diluting the supernatant in a second buffer consisting of TBS or PBS with BSA, detergent and sodium azide.
  • A-beta or alpha-synuclein aggregates are marked by probes which are marked for later detection.
  • anti-A-beta or alpha-synuclein antibodies are used as probes.
  • Capture molecules and probes can be identical.
  • capture molecules and probes differ.
  • different anti-A-beta or alpha-synuclein antibodies can be used as capture molecules and probes.
  • identical capture molecules are used used.
  • catcher molecules can be specific amino acid sequences of the A-beta or alpha-synuclein peptide, e.g. A-beta 1-40 / 42, pyroGluA-beta 3-40 / 42 or pyroGluA-beta 11-40 / 42.
  • Different molecules can also be used as probes, e.g. different anti-A-beta or alpha-synuclein antibodies.
  • capture molecules labeled with fluorescent dyes can be used.
  • a dye is preferably used which does not interfere with the detection. This enables a subsequent control of the structure as well as a normalization of the measurement results.
  • sample vessels in stock which are already prepared by surface coating and fixation of capture molecules and then only have to be used for the examination of a stool sample; it is therefore not absolutely necessary to produce the substrates immediately before each stool sample analysis.
  • stool samples can be stored or frozen before testing. This makes it possible to carry out analyzes on old samples.
  • anti-A-beta antibodies which bind specifically to the N-terminal epitope of the A-beta peptide or alpha-synuclein antibodies which bind to phosphorylated serine 129 on alpha-synuclein are used as probes tie.
  • the probes are characterized in such a way that they emit an optically detectable signal, selected from the group consisting of fluorescence, bioluminescence and chemiluminescence emissions.
  • the probes can also be designed in such a way that the optically detectable signal is a change in their absorption spectrum.
  • the probes are labeled with dyes.
  • dyes Preferably it is here to fluorescent dyes.
  • the probes can differ both in terms of their specific binding to the A-beta or alpha-synuclein aggregates and in terms of their different labeling, e.g. by fluorescent dyes.
  • probes with one another which are suitable for using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) as detection.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • A-beta or alpha-synuclein monomers can in particular be excluded if the probe and capture molecule are identical, or if both recognize an overlapping epitope.
  • probes are used that are specific for a certain A-beta or alpha-synuclein aggregate species, such as A-beta (x-40), A-beta (x-42) or pyro- Glutamate-A-beta (3-x), pyro-glutamate-A-beta (11-x) or alpha-synuclein phosphorylated on serine 129.
  • X is an integer, natural number between 1 and 40 or 42, the person skilled in the art determining the length of the sequence to be used on the basis of his knowledge of the sequence of the A-beta peptide.
  • probes can be used which are specific for certain A-beta or alpha-synuclein aggregate forms, such as A-II or 1-11.
  • A-beat or alpha-synuclein peptides, labeled with fluorescent dyes, can be used as probes.
  • the sample to be examined is a stool sample.
  • the stool samples can go through different processing steps known to the person skilled in the art.
  • the sample is homogenized in a first buffer made of TBS with ProClin 300 and BSA and then centrifuged, and the supernatant is then diluted in a second buffer made of TBS or PBS with BSA, detergent and sodium azide.
  • the present invention thus also provides a method for determining the composition, size and / or shape of A-beta or alpha-synuclein aggregates in stool samples.
  • the process steps mentioned and described above are used here.
  • the marked aggregates are detected by scanning or other types of surface imaging.
  • the detection is preferably carried out with confocal fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in particular in combination with cross-correlation and single-particle immunosolvent laser scanning assay and / or laser scanning microscope (LSM).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • LSM laser scanning microscope
  • the detection is carried out with a confocal laser scanning microscope.
  • a laser focus such as is used, for example, in laser scanning microscopy or an FCS (Fluorescense Correlation Spectroscopy System) is used for this purpose, as well as the corresponding super-resolution variants such as STED or SIM.
  • detection can be carried out using a TI RF microscope, as well as the corresponding super-resolution variants such as STORM or dSTORM.
  • a high spatial resolution is advantageous for the detection.
  • so many data points are collected that it is possible to detect an aggregate in front of a background signal, which is caused, for example, by device-specific noise or other unspecific signals or unspecifically bound probes.
  • a background signal which is caused, for example, by device-specific noise or other unspecific signals or unspecifically bound probes.
  • readout values as there are spatially resolved events such as pixels. Due to the spatial resolution, each event is determined against the respective background and thus represents an advantage over ELISA methods.
  • the information ie the read-out values
  • the information is multiplied, since separate information is obtained for each point, for each aggregate or for each detection event, depending on the respective probe that delivers the signal. So for every event the Signal specificity increased.
  • its composition can also be determined for each detected aggregate, i.e. the type of aggregate, such as A-beta (1-40), A-beta (1-42), pyro-glutamate-A-beta (3-40 / 42, 11-40 / 42) or mixtures thereof.
  • the number of different probes is in principle only limited by possible interference from the fluorescent dyes to be used. 1, 2, 3, 4 or more different probe-dye combinations can be used.
  • Spatially resolved information is essential for the evaluation according to the method according to the invention described above. This can be, for example, the type and / or intensity of the fluorescence.
  • the number of aggregates, their shape, size and / or their composition is determined according to the invention.
  • Information about the size of the oligomers can be obtained directly or indirectly, depending on whether the particles are smaller or larger than the spatial resolution of the imaging method used; in one embodiment, algorithms can be used to minimize background and / or intensity threshold values can be applied.
  • the dyes known to the person skilled in the art can be used as fluorescent dyes.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • conjugates and / or fusion proteins thereof, as well as quantum dots can be used.
  • test results can be objectively compared with one another and are therefore meaningful.
  • At least one, preferably one, internal or at least one, preferably one, external standard is used, in particular for the quantification of A-beta or alpha-synuclein aggregates.
  • both at least one, preferably one, internal standard and at least one, preferably one, external standard are used, which can further increase the accuracy.
  • the method according to the invention is a so-called surface FIDA (surface FIDA - sFIDA).
  • surface FIDA surface FIDA - sFIDA
  • the method according to the invention also enables the precise analysis of the small, freely diffusible A-beta or alpha-synuclein aggregates. Due to their size, which is below their resolution for light microscopes, it was difficult to distinguish these small A-beta or alpha-synuclein oligomers from the background fluorescence (caused e.g. by unspecifically bound antibodies).
  • the method according to the invention also shows a linearity with regard to the number of A-beta or alpha-synuclein aggregates over a large range.
  • Another object of the preliminary invention is the use of the small, freely diffusible A-beta or alpha-synuclein aggregates as biomarkers for the detection and recognition of protein aggregation diseases, in particular AD and PD, in stool samples.
  • the invention also relates to a method for the detection and / or detection of protein aggregation disorders, in particular AD and PD, characterized in that a stool sample from a patient is analyzed using the method according to the invention described above.
  • Characteristic protein misfolding disease are characterized in that a polymer is built up from polypeptide sequences that are identical in terms of their sequence in the corresponding sub-area with the body's own proteins or have a homology of at least 50% over the corresponding sub-area with the body's proteins that have a protein aggregation disease or amyloid degeneration or
  • a generally valid and accepted, fixed reference value is referred to, which is used to compare and determine properties and / or amount, in particular to determine the size and amount of pathogenic aggregates from endogenous proteins.
  • the standard within the meaning of the present invention can used to calibrate devices and / or measurements.
  • protein aggregation disease can also be used to summarize amyloid degenerations and protein misfolding diseases.
  • diseases and the associated endogenous proteins are: A-beta and tau protein for AD, alpha-synuclein for PD or prion protein.
  • Protein for prion diseases such as human Creutzfeld-Jakob disease (CJD), sheep disease scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE).
  • homologous sequences in the context of the invention means that an amino acid sequence has an identity with an amino acid sequence from an endogenous pathogenic aggregate or oligomer that causes a protein aggregation disease of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 , 100%.
  • identity the terms “homologous” or “homology” are used synonymously in the present description.
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison with the aid of the BESTFIT program based on the algorithm of Smith, TF and Waterman, MS (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) calculated using the following parameters for amino acids: Gap creation penalty: 8 and Gap extension penalty: 2; and the following parameter for nucleic acids: Gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the respective entire sequence length, as determined by comparison with the aid of the GAP program based on the algorithm by Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) is calculated by setting the following parameters for amino acids: Gap creation penalty: 8 and Gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids Gap creation penalty: 50 and Gap extension penalty: 3.
  • two amino acid sequences are identical if they have the same amino acid sequence.
  • corresponding sub-region of endogenous proteins is to be understood as meaning that peptide sequence which, according to the definitions according to the invention, is an identical or homologous peptide sequence of a monomer from which the standards according to the invention are built.
  • the standards do not aggregate, preferably through the use of monomeric polypeptide sequences that do not aggregate, since the "corresponding sub-area" of the body's own proteins is not responsible for the aggregation, or that by blocking the for the aggregation do not aggregate responsible groups.
  • Particles which consist of several, preferably identical, building blocks that are not covalently linked to one another and / or non-covalent aggregations of several monomers.
  • the standards have a precisely defined number of epitopes which are covalently linked to one another (directly or via amino acids, spacers and / or functional groups) for the binding of the corresponding probes.
  • Probes for the purposes of the invention are selected from the group consisting of: antibodies, nanobody and affibody. As already shown, different probes can be combined with one another within the scope of the present invention.
  • the number of epitopes is determined by using a polypeptide sequence that is identical in terms of its sequence to that part of the body's own proteins that forms an epitope or has a homology of at least 50% with this part, and the biological Possesses activity of the epitope.
  • the epitopes are epitopes of the A-beta peptide selected from the sub-areas A-beta 1-11, A-beta 3-11 or pyroGluA-beta 3-11, for example human N -terminal epitopes (with the following sequence: DAEFRHDSGYE (1-11).
  • the epitopes for alpha-synuclein are the human full-length protein.
  • the standard molecule according to the invention is preferably a polymer from the polypeptide sequences defined above.
  • an oligomer is a polymer formed from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 monomers (under The above polypeptide sequence is to be understood as a monomer), or multiples thereof, preferably 2 to 16, 4 to 16, 8 to 16, particularly preferably 8 or 16, or multiples thereof.
  • the standards are water soluble.
  • the standards according to the invention are built up from the same polypeptide sequences.
  • the standards according to the invention are built up from different polypeptide sequences.
  • polypeptide sequences as defined above are strung together in a linear conformation.
  • polypeptide sequences as defined above are strung together to form a branched oligomer according to the invention.
  • polypeptide sequences as defined above are strung together to form a cross-linked oligomer according to the invention.
  • Branched or cross-linked oligomers according to the invention can be produced by linking individual building blocks by means of lysine or by means of click chemistry.
  • the invention relates to a standard molecule, containing or composed of copies of the amino-terminal part of the A-beta peptide, selected from the sub-areas A-beta 1- 11, A-beta 3-11, or pyroGluA-beta 3-11, e.g. the human N-terminal epitope (with the following sequence: DAEFRHDSGYE (1-11).
  • the multiplication of the epitopes by functional groups can be carried out before or after the synthesis of the individual building blocks.
  • the covalent linkage of the polypeptide sequences is characteristic of the standards according to the invention.
  • polypeptide sequences to be used in variants according to the invention can be identical to the sequence of the A-beta full-length peptide or show a homology of 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% with the sequence of the A-beta full-length peptide.
  • the standards are constructed as dendrimers.
  • the dendrimers according to the invention are built up from the above-described polypeptide sequences to be used according to the invention and can contain a central framework molecule.
  • the dendrimers according to the invention contain polypeptide sequences which have a sequence which is identical to a part of the A-beta peptide or which shows at least 50% homology to the corresponding part.
  • the term at least 50% homology is also to be understood as meaning a higher homology, selected from the group consisting of 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
  • Standards advantageously with higher solubility in water than pathogenic aggregates or oligomers from endogenous proteins, are formed in one embodiment of the invention from polypeptide sequences which are identical to the N-terminal region of the A-beta peptide or at least 50% homology to show.
  • the amino acid sequence A-beta 1-8, A-beta 1-11, A-beta 1-16, A-beta 3-11 or pyroGluA-beta 3- 11 to understand.
  • a standard molecule according to the invention can contain epitopes for at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more different probes.
  • Epitopes characteristic of different probes can be incorporated into the standards according to the invention in that polypeptide sequences are used which are identical to different regions of the A-beta peptide, or have at least 50% homology thereto, but have the activity of the corresponding epitope.
  • polypeptide sequences are used for this which are identical or have at least 50% homology with the N-terminal region of the A-beta polypeptide, as well as polypeptide sequences which are identical or at least 50% homology with the C-terminus of the A beta polypeptide.
  • the standard molecules contain so-called spacers.
  • a spacer is to be understood as a molecule which is incorporated into the standard molecule via covalent bonds and which has certain physical and / or chemical properties by means of which the properties of the standard molecule are changed.
  • hydrophilic or hydrophobic, preferably hydrophilic spacers are used. Hydrophilic spacers are preferably selected from the group of molecules formed from PEG, sugar, glycerine, poly-L-lysine or beta-alanine.
  • the standards according to the invention contain (further) functional groups.
  • Functional groups are to be understood as meaning molecules that are covalently bound to the standard molecules.
  • the functional groups contain biotin groups. This enables a strong covalent bond to streptavidin. Standard molecules containing biotin groups can thus be bound to molecules containing streptavidin groups. If the standard molecules according to the invention contain biotin and / or streptavidin groups, larger standards can be assembled in this way or several, possibly different standard molecules, can be bound to a framework.
  • the standard molecules contain dyes for spectrophotometric determination and / or aromatic amino acids.
  • Aromatic amino acids are e.g. tryptophan, tyrosine, phenylalanine or histidine, or selected from this group.
  • tryptophan e.g. tryptophan, tyrosine, phenylalanine or histidine, or selected from this group.
  • tryptophan e.g. tryptophan, tyrosine, phenylalanine or histidine, or selected from this group.
  • the present invention further relates to dendrimers containing polypeptides which, with regard to their sequence, are identical in the corresponding sub-region to the endogenous proteins or have a homology of at least 50% over the corresponding sub-range with the endogenous proteins that characterize a protein aggregation disease, for use in the examination of stool samples.
  • the dendrimers can contain any of the above-described features of the standards or any combination thereof.
  • Dendrimers containing a precisely defined number of epitopes for the covalent binding of probes are precisely defined numbers of epitopes for the covalent binding of probes
  • Dendrimers characterized in that they have a higher solubility in water than the pathogenic aggregates from endogenous proteins, which characterize a protein aggregation disease,
  • Dendrimers containing dyes for spectrophotometric determination and / or aromatic amino acids are Dendrimers containing dyes for spectrophotometric determination and / or aromatic amino acids.
  • the present invention also relates to a method of making a standard as described above for use in stool specimen examinations.
  • the standard according to the invention is produced by means of peptide synthesis or recombinant methods, which are known to the person skilled in the art.
  • Another object of the present invention is the use of a standard described above or a dendrimer described above for the quantification in stool samples of pathogenic aggregates or oligomers from endogenous proteins which characterize a protein aggregation disease.
  • the standard is used to quantify A-beta oligomers in stool samples.
  • the standards according to the invention are used for calibration in the sFIDA method, ELISA (sandwich ELISA) or FACS.
  • the present invention relates to a kit for the analysis of stool samples which comprises the standards according to the invention.
  • the compounds and / or components of the kit of the present invention can be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution. Alternatively, some components can be packaged in the same container. Additionally or alternatively, one or more of the components could be adsorbed to a solid support such as a glass plate, chip or nylon membrane, or to the well of a microtiter plate.
  • the kit may also contain instructions for using the kit for any of the embodiments.
  • the standards are used to quantify pathogenic aggregates or oligomers from endogenous proteins in stool samples by: in a first step the standards or the dendrimers are labeled with probes and the
  • the number of probes bound to the standards or dendrimers is determined, in a second step pathogenic aggregates or oligomers from endogenous proteins that characterize a protein aggregation disease are marked with probes, and the number of probes binding to a pathogenic aggregate or oligomer is determined in in a third step, the number of probes binding to a standard or dendrimer in each case
  • Step 1 is compared with that from step 2, and in a fourth step the number and size of the oligomers in the stool sample are determined.
  • the standards according to the invention are used for the calibration of the sFIDA method.
  • the body's own pathogenic aggregates from stool samples eg A-beta or alpha-synuclein aggregates
  • a capture molecule In the case of A-beta or alpha-synuclein aggregates, an N-terminal capture molecule can be used for this purpose.
  • the aggregates are labeled with two different probes.
  • A-beta or alpha-synuclein aggregates for example, A-beta or alpha-synuclein antibodies are used, both of which are bound via an N-terminal binding epitope.
  • the detection probes are marked with, preferably different, fluorescent dyes. This makes them visible in the microscope, e.g. laser scanning microscope.
  • a monomer detection of endogenous polypeptides is excluded by using three different or three differently labeled probes which bind to a similar or the same epitope in the test system.
  • the detection of monomers can be excluded by not evaluating signals with a lower intensity due to an intensity cut-off. Since larger aggregates have several binding sites for the two probes marked with different dyes, a monomer detection can alternatively or additionally be excluded by cross-correlating these signals.
  • the standards according to the invention can be used as internal or external standards in the measurement.
  • the present invention therefore also provides a kit for the selective quantification of a-beta or alpha-synuclein aggregates in stool samples according to the method described above.
  • a kit can contain one or more of the following components:
  • Substrate made of glass which can be coated with a hydrophilic substance, preferably a dextran layer, particularly preferably made of CMD;
  • the compounds and / or components of the kit of the present invention can be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution. Alternatively, some components can be packaged in the same container. Additionally or alternatively, one or more of the components could be adsorbed to a solid support such as a glass plate, chip or nylon membrane, or to the well of a microtiter plate.
  • the kit may also contain instructions for using the kit for any of the embodiments.
  • the capture molecules described above are immobilized on the substrate.
  • the kit can also contain solutions and / or buffers. To protect the dextran surface and / or the capture molecules immobilized on it, they can be covered with a solution or a buffer.
  • the present invention also relates to the use of the method according to the invention for the diagnosis, early diagnosis and / or prognosis of AD or PD by examining stool samples.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for monitoring therapies for AD or PD and for monitoring and / or checking the effectiveness of active ingredients and / or healing methods by examining stool samples. This can be used for clinical tests, studies as well as therapy monitoring. For this purpose, samples are measured according to the method according to the invention and the results are compared.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention and the biomarkers to decide whether a person is to be included in a clinical study.
  • stool samples are measured according to the method according to the invention and the decision is made with regard to a limit value.
  • Another object of the present invention is a method for determining the effectiveness of active ingredients and / or healing methods by means of the method according to the invention, in which the results of stool samples are compared with one another.
  • the stool samples are stool from before or after, or at different times after the administration of the active ingredients or the implementation of the healing process.
  • active substances and / or healing methods are selected, which resulted in a reduction in the A-beta or alpha-synuclein aggregates.
  • the results are compared with a control that was not subjected to the active ingredient and / or therapeutic method.
  • the present invention therefore provides a method for the selective quantification and / or characterization of A-beta or alpha-synuclein aggregates, which are specifically labeled by probes after immobilization on a substrate, the detection of the labeled aggregates with a high spatial resolution takes place, used.
  • the high spatial resolution determines each event against the respective background, so that only the aggregates and no unspecific signals are detected. This is an advantage over the known ELISA method.
  • Greek letters that are actually to be used in designations are occasionally replaced by the written form, e.g. in alpha- Synuclein (SNCA), in order to increase readability and prevent conversion errors. This does not change the meaning.
  • the stool sample To prepare the stool sample, it is first homogenized in a buffer and then centrifuged. Subsequent enzymatic treatments of the supernatant with e.g. proteases, nucleases and lipases and possible precipitations can then be carried out if necessary. Suitable dilutions that result from this should be used for measurement in the sFIDA assay.
  • catcher molecules for particles containing protein aggregates e.g. anti-alpha-synuclein antibodies
  • the capture molecules can all be identical or mixtures of different capture molecules.
  • a blocking step can take place in which the wells are treated with a blocking solution. A further washing step can then optionally be carried out.
  • the stool sample to be examined is then applied to the surface prepared in this way, preferably according to previous preparation instructions. Unspecifically bound substances are removed by washing steps.
  • the particles containing protein aggregates are used for further detection with a probe (eg a fluorescent dye-bound anti-alpha-synuclein antibody which only contains a form of alpha-synuclein pathologically phosphorylated on serine 129 Synuclein binds).
  • a probe eg a fluorescent dye-bound anti-alpha-synuclein antibody which only contains a form of alpha-synuclein pathologically phosphorylated on serine 129 Synuclein binds.
  • Preferred fluorescent dyes could also be quantum dots, among other things.
  • the particles containing protein aggregates are preferably labeled with at least one further probe (for example a fluorescent dye-bound anti-alpha-synuclein antibody which only binds a form of alpha-synuclein which is pathologically phosphorylated to serine 129).
  • the marked aggregates are detected by scanning (e.g. by a laser focus as used in laser scanning microscopy, for example) or by other types of surface imaging (e.g. by a TIRF microscope).
  • this information is even multiplied and for each point, for each aggregate or for each detection event the information can be obtained separately as to which of the probes is delivering signals there. In this way, the specificity of the signal can be increased for each event.
  • the spatially resolved information e.g. the fluorescence intensity
  • the spatially resolved information e.g. the fluorescence intensity
  • algorithms for background minimization can also be used and / or intensity threshold values can also be used for further evaluation.
  • FIG. 1 shows diagrammatically the results of the measurements described in Example 9a).
  • FIG. 2 shows diagrammatically the results of the measurements described in Example 9b).
  • the amination of the glass surface was carried out with APTES and toluene.
  • 250 ⁇ l APTES were dissolved in 5 ml toluene in a crystallizing dish and placed exactly in the middle of the desiccator.
  • a glass plate was then taken out of the packaging and placed upside down in the desiccator. After a vacuum had been drawn for about 10 minutes, the desiccator was flooded with argon via a balloon. After an incubation time of 1 hour, the crystallizing dish was removed and the plate was dried with the vacuum pump attached for 2 hours. The preparation after the amination was not paused because the amination is not stable.
  • the glass surface was aminated beforehand as described above.
  • One mg / ml CMD was activated with 200 mM EDC and 50 mM NHS in 0.1 M MES pH 3.5 and placed on the glass plate and incubated for 30 minutes at room temperature. Unbound dextran was removed by subsequent washing five times with water.
  • the glass surface was aminated beforehand as described above.
  • Bifunctional PEG (MW 3400 Da, NHS / COOH) was used as a spacer.
  • a 4 mM PEG solution was prepared for this. First 20 ⁇ l of PBS were placed in each well and then correspondingly 20 ⁇ l of the prepared PEG solution were added. After an incubation time of 1 hour at room temperature, the wells were washed five times with water. A 10 mM ethanolamine solution was made up for quenching and 20 ml were pipetted into each well. After an incubation period of 15 minutes, it was washed five times with water.
  • the carboxylic acid group was activated using 20 ml of a solution consisting of 200 mM EDC and 50 mM NHS in 0.1 M MES. Following the 30 minute incubation, the wells were washed five times with water. la. No pretreatment is necessary for the non-covalent coating of the glass surface with the capture molecule.
  • the solution of the antibodies was added to the wells and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the carboxylic acid groups of PEG and dextran as described above, the amine groups of the capture molecules were linked with PEG or dextran and thus covalently bound to the glass surface.
  • a 10 mM ethanolamine solution in water was used to quench the unoccupied activated carboxylic acid groups and incubated in the wells for 15 minutes.
  • the capture antibody was dissolved in a suitable buffer, here PBS or carbonate.
  • a suitable buffer here PBS or carbonate.
  • the concentration of 2.5 pg / ml of the capture antibody used was based on the biomarker and was determined in advance by various titration experiments. Incubation took place overnight at 4 ° C.
  • TBS nonionic surfactant; a polyethylene glycol sorbitan fatty acid ester
  • a blocking step took place after the incubation with the capture antibody.
  • BSA, casein or milk powder were dissolved in a concentration between 0.5-5.0% in TBS and incubated in the wells for 90 minutes at room temperature.
  • antibacterial and antifungal substances such as ProClin 300 or sodium azide can be added to the blocking solution.
  • a further washing step can then optionally be carried out (washing five times with TBS and 0.05% Tween 20 and washing five times with TBS).
  • the detection probes here Nab228 (anti-A-beta 1-11) or 211 (anti-alpha-synuclein 121-125) or EP1536Y (anti-phospho-alpha-synuclein (S129)) were each with CF dyes, here CF633- Succinimidyl ester and CF488A succinimidyl ester labeled.
  • the purification was carried out using size exclusion chromatography, as is known to the person skilled in the art. 6. Mark the aggregates with the probes
  • the amount of antibodies used depends on the desired degree of labeling and a high signal-to-noise ratio, which was titrated beforehand during the development of the assay.
  • the probes were added and incubated for 1 hour at room temperature in the dark. Unbound probes were removed by washing five times with TBS.
  • the measurement was carried out here with a Celldiscoverer 7 (Carl Zeiss, Jena, Germany), which has a confocal laser scanning microscope, or a TIRF microscope (Leica, Wetzlar, Germany).
  • the fluorescence intensity of an area of 1000 x 1000 pixels (TIRF) or 2752 x 2208 or 512 x 512 pixels (Celldiscoverer 7) was determined. Since different probes were used, a colocalization analysis was carried out (test where measured values of both probes occurred at the same location (here a radius of approx. 10 nm); e.g. a red-emitting fluorophore and a green-emitting fluorophore can be viewed). In order to obtain representative values, several areas of the glass surface (4 wells) were measured. The measurement was carried out using ZEN software from Carl Zeiss or LAS AF software from Leica.
  • the stool samples can go through different processing steps known to the person skilled in the art.
  • the sample was homogenized in a first buffer of Tris-buffered saline (TBS) with ProClin 300 and BSA and then centrifuged, and the supernatant was then diluted in a second buffer of TBS or PBS with BSA, detergent and sodium azide.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Table 1 b Nine stool samples from different patients were analyzed using the method according to the invention. The stool samples each came from four Parkinson's patients and five control patients (healthy with regard to protein aggregation disorders, different ages). The results are summarized in Table 2. Likewise in Figure 2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur selektiven Quantifizierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten umfassend die Immobilisierung von Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper auf einem Substrat, Auftragen der zu untersuchenden Stuhlprobe auf das Substrat, Hinzufügen von für die Detektion gekennzeichneten Sonden, die durch spezifische Bindung an A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate diese markieren und Detektion der markierten Aggregate.

Description

Bestimmung krankheitsspezifischer Protein-Aggregate in Stuhlproben
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Protei n-Aggregaten in Stuhlproben insbesondere basierend auf der selektiven Quantifizierung von z.B. alpha-Synuclein- bzw. Amyloid-beta-(A-beta)-Aggregaten umfassend die Immobilisierung von alpha-Synuclein- bzw. A-beta-Fängermolekülen auf einem Substrat, Aufträgen der zu untersuchenden Probe auf das Substrat, Hinzufügen von für die Detektion gekennzeichneten Sonden, die durch spezifische Bindung an alpha-Synuclein- bzw. A-beta-Aggregate diese markieren und Detektion der markierten Aggregate.
Charakteristisch für eine Vielzahl von Erkrankungen des zentralen Nervensystems ist das Auftreten von fehlgefalteten, aggregierten Proteinen im Krankheitsverlauf. Als Beispiele seien hier die Parkinson-Krankheit und die Alzheimer-Krankheit genannt. Die Parkinson-Krankheit (PD, lateinisch = Morbus Parkinson) ist gekennzeichnet durch eine pathologische Akkumulation von aggregiertem alpha-Synuclein, wohingegen die Alzheimer-Krankheit (AD, Alzheimersche Demenz, lateinisch = Morbus Alzheimer) durch die pathologische Akkumulation von aggregiertem A-beta und aggregiertem Tau gekennzeichnet ist.
Neu rodegenerative Krankheiten wie AD und PD z.B. gehören zu einer heterogenen Gruppe klinischer Zustände, deren gemeinsames Kriterium in vielen Fällen (aber nicht ausschließlich) eine Aggregation und Ablagerung eines jeweils spezifischen Proteins in der geordneten Konformation von beta- Faltblattstruktur ist. AD und PD stellen in der heutigen Gesellschaft ein immer größeres Problem dar, da durch die gestiegene Lebenserwartung immer mehr Menschen davon betroffen sind und sich die Krankheit somit auf die sozialen Sicherungssysteme und deren Finanzierbarkeit auswirkt.
Pathologische Aggregate, wie z.B. Oligomere oder Fibrillen, aus körpereigenen Proteinen treten in vielen neu rodegenerativen Erkrankungen auf. Bei AD findet man z.B. im Gehirn A-beta-Peptid- Ablagerungen und bei PD alpha-Synuclein-Ablagerungen. Die A-beta-Peptid-Ablagerungen (oder Peptid-Fibrillen) stellen allerdings lediglich das Endstadium eines Prozesses dar, der mit der Abspaltung von monomeren A-beta-Peptiden aus APP (Amyloid Precursor Protein) beginnt, anschließend neurotoxische A-beta-Peptid-Oligomere ausbildet und schließlich oder alternativ mit A- beta-Peptid-Fibrillen endet. Pathologisches Hauptmerkmal der AD ist die Bildung von senilen oder amyloiden Plaques, bestehend aus dem A-beta-Peptid und neu rof i bri Mären Ablagerungen aus dem Tau-Protein. Das Vorläufer-Protein des A-beta-Peptids, das APP, ist in der Zellwand der Neuronen lokalisiert. Durch proteolytischen Abbau und nachträgliche Modifikation entstehen daraus A-beta- Fragmente unterschiedlicher Länge und Art wie z.B. A-beta 1-40 (A-beta 40), A-beta 1-42 (A-beta 42) oder pGluA-beta 3-42. Solche monomeren A-beta-Peptide entstehen während des gesamten Lebens auch im gesunden Organismus.
Gemäß der Amyloid-Kaskaden-Hypothese aus den 1990er Jahren sind die A-beta-Ablagerungen in Form von Plaques die Auslöser der Krankheitssymptome. In den letzten Jahren weisen jedoch unterschiedliche Studien darauf hin, dass besonders die kleinen, frei diffundierenden A-beta- Oligomere die größte Toxizität besitzen und für die Entstehung und den Fortschritt der AD verantwortlich sind. Somit sind Aggregate des A-beta-Peptids unmittelbar mit der AD-Pathogenese verknüpft.
Neu rodegenerative Erkrankungen werden meist anhand von neurologischen Untersuchungen diagnostiziert. Unterstützend für die Diagnose können bei einigen wenigen neu rodegenerativen Erkrankungen bildgebende Verfahren wie z.B. die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) bei AD oder DaTscan bei PD eingesetzt werden. Üblicherweise weisen labordiagnostische Verfahren wie z.B. ELISA krankheitsbedingte Konzentrationsveränderungen einer oder mehrerer Substanzen aus Körperflüssigkeiten wie Liquor, Blut, Plasma, Serum, Speichel oder Urin nach. Für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit kann so auch mittels ELISA aus Liquorproben das Verhältnis von A-beta 42 zu A- beta 40 oder die Menge an phosphoryliertem Tau bestimmt werden. Eine absolut gesicherte Diagnose einer neu rodegenerativen Krankheit ist oftmals jedoch erst post-mortem durch den histopathologischen Nachweis von krankheitsspezifischen Protein-Aggregaten im zentralen Nervensystem möglich, wofür Gewebeschnitte des Gehirns erforderlich sind.
Die neurologische Diagnose von neu rodegenerativen Erkrankungen kann in den Frühstadien dieser Erkrankungen oftmals fehlerhaft sein oder diese gar nicht erkennen, weil die Symptomatik der Erkrankung zu frühen Zeitpunkten der Erkrankung nur schwach ausgeprägt ist. Bildgebende Verfahren wie PET oder DaTscan sind nicht überall zugänglich und teuer, außerdem können nur wenige spezifische neu rodegenerative Erkrankungen wie z.B. AD oder PD mit bildgebenden Verfahren diagnostiziert werden. Vor allem ist die Entnahme von Liquor- und Blutproben invasiv und ersteres in der Regel sehr schmerzhaft für Patienten.
Zum Beispiel wurden die Mengen verschiedener Substanzen im Blut oder Liquor von Patienten untersucht und deren Nutzen als Biomarker analysiert. Eine von diesen Substanzen ist das A-beta- Peptid. Dabei erschien am zuverlässigsten die Bestimmung des A-beta-Peptid-Gehalts im Liquor von Patienten über einen Zeitraum von 6-24 Monaten zu sein. Hierzu sind jedoch über einen langen Zeitraum mehrere Entnahmen von Liquor notwendig.
Trotz dieser unterschiedlichen Ansätze konnte sich bisher noch kein zuverlässiger Biomarker durchsetzen. Erschwerend kommt hinzu, dass für die spezifische Quantifizierung von A-beta- Aggregaten in Abgrenzung zu A-beta-Monomeren und/oder des A-beta-Gesamtgehalts bisher nur wenige Nachweissysteme verfügbar sind. Als ein mögliches Nachweissystem werden bisher ELISAs eingesetzt, in denen die A-beta-Oligomere durch Antikörper detektiert werden. Die darin eingesetzten Antikörper erkennen entweder nur ganz bestimmte Arten von A-beta-Oligomeren oder unspezifisch andere Oligomere, die nicht aus A-beta-Peptiden bestehen, sondern aus ganz anderen Proteinen, was sich auf die Auswertung nachteilig auswirkt.
Als weiteres Nachweisverfahren dienen Sandwich-ELISA-Messungen. Hier werden A-beta-spezifische Antikörper eingesetzt, um die A-beta-Oligomere zu immobilisieren. Die gleichen Antikörper werden anschließend auch zur Detektion eingesetzt. Monomere führen nach diesem Verfahren zu keinem Signal, da die Antikörper-Bindungsstelle schon durch die Fängermoleküle besetzt ist. Spezifische Signale werden somit nur von Dimeren oder größeren Oligomeren erzeugt. In der Auswertung ermöglicht ein solches Verfahren allerdings nur die Quantifizierung der Summe aller in einer Probe vorhandenen Aggregate und nicht die Charakterisierung von Einzelaggregaten. Um einzelne A-beta- Aggregate sicher nachzuweisen und zu quantifizieren, fehlt den ELISA-gestützten Verfahren auch die dazu notwendige Empfindlichkeit.
Die genannten krankheitsspezifischen Protei n-Aggregate könnten ein direkter Biomarker für die jeweilige Krankheit sein. Der diagnostische Nachweis stellt indes eine technische Herausforderung dar, da diese Proteine auch im gesunden Organismus produziert werden. Daher muss ein eventuelles Nachweisverfahren unempfindlich gegenüber einem hohen Überschuss an normal gefaltetem, monomerem Protein sein. In der DE 10 2011 057 021 Al ist ein Verfahren zur Charakterisierung und Quantifizierung von pathogenen Aggregaten oder Oligomeren in Geweben und Körperflüssigkeiten beschrieben worden. Nachteilig dabei ist jedoch, dass für die Untersuchung von Gewebe und Körperflüssigkeiten oftmals Biopsien notwendig sind (z.B. für Blut oder Liquor-Untersuchungen), was für die Patienten zum Teil schmerzhaft, zumindest aber unangenehm ist, und dass in aller Regel für die Probennahme medizinisches Personal notwendig ist.
Es besteht demgemäß Bedarf an weiteren Verfahren zur selektiven Quantifizierung von Biomarkern für neu rodegenerative Krankheiten.
Insbesondere besteht demgemäß Bedarf an Verfahren, die es erlauben krankheitsspezifische Protein-Aggregate einfach, zuverlässig und für Patienten in möglichst angenehmer Art und Weise zu bestimmen, insbesondere unter Vermeidung der Notwendigkeit von Biopsien und/oder der Notwendigkeit von Heranziehung medizinischen Personals.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Verfahren bereitzustellen, die es erlauben krankheitsspezifische Protei n-Aggregate einfach, zuverlässig und für Patienten in möglichst angenehmer Art und Weise zu bestimmen, insbesondere unter Vermeidung der Notwendigkeit von Biopsien.
Ferner war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Biomarker für Proteinaggregationserkrankungen, insbesondere AD und PD, sowie ein ultraempfindliches Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung von A-beta- und alpha-Synuclein-Aggregaten zur Verfügung zu stellen. Durch Charakterisierung des Biomarkers, also Bestimmung der Anzahl, Menge und/oder Größe dieser Substanz (Biomarker) in einer körpereigenen Probe, die keine Flüssigkeit oder Gewebe ist, soll eine genaue Diagnose der Krankheit und/oder Informationen über den Verlauf der Krankheit und den Zustand des Patienten ermöglich werden.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung von pathogenen Aggregaten, die eine Proteinaggregationserkrankung hervorrufen und/oder kennzeichnen, insbesondere von A-beta- und alpha-Synuclein-Aggregaten jeglicher Größe und Zusammensetzung, A-beta- und alpha-Synuclein-Oligomeren und gleichzeitig auch kleinen, frei diffundierenden A-beta- und alpha-Synuclein-Oligomeren zur Verfügbar zu stellen. Diese und weitere Aufgaben, die sich dem Fachmann bei Betrachtung der vorliegende Erfindung Beschreibung erschließen, werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen dargestellten Gegenstände gelöst.
Die abhängigen Ansprüche illustrieren dabei besonders vorteilhafte und bevorzugte Gegenstände.
Ein wesentlicher Teil der vorliegenden Erfindung besteht in der Diagnostik von neu rodegenerativen Erkrankungen basierend auf der Analyse von Stuhlproben. Stuhlproben stellen weder eine Biopsie noch eine Körperflüssigkeit dar. Vorteilhaft an der Entnahme einer Stuhlprobe ist, dass sie nichtinvasiv und somit auch schmerzfrei ist. Ferner können Stuhlproben ohne die Präsenz eines Arztes gesammelt werden. Auch kann die Stuhlproben für die Laboranalyse verschickt werden, ohne dass ein Patient dafür persönlich bei einem Arzt oder in einem Labor erscheinen müsste.
Unerwarteter Weise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass krankheitsspezifische Protei n-Aggregate einfach, zuverlässig und für Patienten in möglichst angenehmer Art und Weise, insbesondere unter Vermeidung der Notwendigkeit von Biopsien und/oder der Notwendigkeit von Heranziehung medizinischen Personals durch Untersuchung von Stuhlproben bestimmt werden können.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung herangezogene diagnostische Analyse von Stuhlproben bei neu rodegenerativen Erkrankungen war für den Fachmann nicht offensichtlich, weil neu rodegenerative Erkrankungen primär als Erkrankungen des Gehirns betrachtet werden und daher bisher nur Liquor oder Blut und dessen Bestandteile analysiert werden.
Die Messung eines Biomarkers, das auf der diagnostischen Analyse von Stuhlproben beruht, ist für neu rodegenerative Krankheiten in der Literatur bislang nicht beschrieben und auch nicht im Einsatz und stellt somit ein Novum dar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind mithin insbesondere Verfahren zur selektiven Quantifizierung von Protei n-Aggregaten in Stuhlproben als Biomarker für neu rodegenerative Krankheiten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung und/oder Charakterisierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten in Stuhlproben umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellen eines Substrats auf dem Fängermoleküle immobilisiert sind, b) Aufträgen der zu untersuchenden Stuhlprobe auf das Substrat, c) Hinzufügen von für die Detektion gekennzeichneten Sonden, die durch spezifische Bindung an A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate diese markieren, und d) Detektion der markierten Aggregate mittels hoher Ortsauflösung bei welcher jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt wird.
Charakterisierung der A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate oder A-beta- bzw. alpha-Synuclein- Oligomere bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung Bestimmung der Form, Größe und/oder Zusammensetzung.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Oligomere sowohl A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate als auch A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Oligomere und auch kleine frei diffundierende A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Oligomere. Oligomer im Sinne der Erfindung ist ein Polymer gebildet aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Monomeren oder Vielfachen davon.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden auf dem Substrat Fängermoleküle immobilisiert, um die A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate zu fangen und fixieren.
Bevorzugt werden als Fängermoleküle Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper eingesetzt.
Als Substrat wird erfindungsgemäß ein Material gewählt, das eine möglichst geringe, unspezifische Bindungskapazität insbesondere bezüglich A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Oligomeren besitzt.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Substrat aus Glas gewählt.
In bevorzugten Varianten der vorliegenden Erfindung sind die Fängermoleküle Antikörper, welche in Varianten der vorliegenden Erfindung nicht kovalent, sondern über hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Fängermolekül und Substratoberfläche oder kovalent über Poly-D- Lysin, Polyethylenglykol (PEG) oder Dextran immobilisiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Glasoberfläche dazu aminiert, insbesondere mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) über die Gasphase mit Toluol und unter Argonatmosphäre. Anschließend können in dieser Ausführungsform N-Hydroxysuccinimid (NHS)-funktionalisiertes PEG oder NHS-funktionalisiertes Dextran an die Amine der Glasoberfläche kovalent binden. Die Immobilisierung des Fängermoleküls kann in Varianten über dieselbe Art und Weise erfolgen, indem die Carboxylgruppen von PEG oder Dextran über EDC und NHS aktiviert werden. Die aktivierte Carbonsäure bindet so Amingruppen des Fängermoleküls kovalent an die Glasoberfläche. Verbleibende aktivierte Carbonsäuregruppen können über einen Quench-Schritt inaktiviert werden.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung kann die Immobilisierung der Fängermoleküle über bioaffine Systeme wie Protein-G/A, His-Tag oder Biotin-Avidin erfolgen, indem z.B. die Glasoberfläche mit Protein-G/A beschichtet wird, welches anschließend spezifisch z.B. an anti-Maus- Antikörper als Fängermolekül binden kann.
Die Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper binden spezifisch ein Epitop der A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate. In einer Alternative der vorliegenden Erfindung hat das Epitop eine Aminosäuresequenz des aminoterminalen Teils des A-beta-Peptids, ausgewählt aus den Teilbereichen A-beta 1-11, A-beta 3-11, oder pyroGluA-beta 3-11, z.B. des humanen N-terminalen Epitops mit folgender Sequenz: DAEFRHDSGYE (1-11).
Sowohl bei der auf kovalenten als auch bei der auf nicht-kovalenten Bindungen beruhenden Beschichtung erfolgt bevorzugt nach der Inkubation mit dem Fängermolekül ein Blocking-Schritt, um unspezifische Bindungen der Stuhlprobe auf noch freie Glasoberfläche zu minimieren. Dazu wird das mit Fängermolekülen belegte Substrat mit geeigneten, dem Fachmann bekannten Lösungen benetzt. In einer bevorzugten Variante wird hierzu eine Lösung von bovinem Serumalbumin (BSA) verwendet.
Die zu vermessende und vorbehandelte Stuhlprobe wird in Varianten der vorliegenden Erfindung auf dem so präparierten Substrat inkubiert.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Stuhlprobe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahren:
Erhitzen (auf eine Temperatur bis zum Siedepunkt der Probe)
Ein oder mehrere Gefrierauftauzyklen,
- Verdünnen mit Wasser oder Puffer,
Behandlung mit Enzymen, z.B. Proteasen, Nuklease, Lipasen,
- Zentrifugieren, Präzipitation,
Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein- Antikörper zu verdrängen.
Homogenisierung und Abtrennung, bevorzugt mittels Zentrifugation, der festen von den flüssigen Bestandteilen der Stuhlprobe unter Zusatz von Wasser oder einer oder mehrerer wässriger Pufferlösungen.
Für die Homogenisierung eignen sich übliche Pufferlösungen. Beispiele hierfür sind Tris-gepufferte Salzlösungen (TBS) oder phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS - phosphate-buffered saline), die als Standardlösungen käuflich erhältlich sind. Diese Pufferlösungen können in Varianten mit BSA versetzt sein oder werden.
In bevorzugten Varianten der vorliegenden Erfindung enthalten die Pufferlösungen neben der Puffersubstanz noch antimikrobiell Wirksame Substanzen. Insbesondere sind dies antibakteriell und antifungal wirkende Substanzen. Beispiele für solche Substanzen sind unter anderem Azide wie Natriumazid, Isothiazolin-Derivate wie 2-Methyl-4-Isothiazolin-3-On oder 5-Chloro-2-Methyl-4- Isothiazolin-3-On oder Kombinationen dieser Stoffe. Ein Beispiel für ein kommerziell erhältliches Produkt ist ProClin™ 300 von Sigma-Aldrich (enthaltend 2-Methyl-4-Isothiazolin-3-On und 5-Chloro- 2-Methyl-4-Isothiazolin-3-On).
Eine besonders bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung ist die Stuhlprobe in einem ersten Puffer aus TBS mit ProClin 300 und BSA zu homogenisieren, dann zu zentrifugieren und den Überstand anschließend in einem zweiten Puffer aus TBS oder PBS mit BSA, Detergens und Natriumazid zu verdünnen.
In einem weiteren Schritt werden A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate von Sonden markiert, die für eine spätere Detektion gekennzeichnet sind.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung werden als Sonden Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein- Antikörper eingesetzt. Fängermoleküle und Sonden können identisch sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich Fängermoleküle und Sonden. So können z.B. unterschiedliche Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper als Fängermoleküle und Sonden eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden gleiche Fängermoleküle eingesetzt.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden gleiche Sonden eingesetzt.
Als Fängermoleküle können aber auch unterschiedliche Moleküle eingesetzt werden, wie z.B. unterschiedliche Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper. Fängermoleküle können spezifische Aminosäuresequenzen des A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Peptids sein, z.B. A-beta 1-40/42, pyroGluA-beta 3-40/42 oder pyroGluA-beta 11-40/42.
Ebenso können als Sonden unterschiedliche Moleküle eingesetzt werden, wie z.B. unterschiedliche Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper.
Zur späteren Qualitätskontrolle der Oberfläche, z.B. Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekülen können Fängermoleküle gekennzeichnet mit Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt werden. Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit der Detektion interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Ebenso ist es möglich auf diese Art und Weise Probengefäße auf Vorrat herzustellen, die also schon durch Oberflächen beschichtung und Fixierung von Fängermolekülen vorbereitet sind und dann für die Untersuchung einer Stuhlprobe nur noch herangezogen werden müssen; eine Herstellung der Substrate unmittelbar vor jeder Stuhlprobenanalyse ist mithin nicht zwingend notwendig.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, dass Stuhlproben vor der Testung gelagert oder eingefroren werden können. Somit ist es möglich, Analysen auch an alten Proben durchzuführen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden als Sonden Anti-A-beta-Antikörper eingesetzt, die spezifisch an das N-terminale Epitop des A-beta-Peptids binden bzw. alpha-Synuclein- Antikörper, die an phosphoryliertes Serin 129 an alpha-Synuclein binden.
Zur Detektion sind die Sonden so gekennzeichnet, dass sie ein optisch detektierbares Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Biolumineszenz- und Chemolumineszenz-Emissionen. Ebenso können die Sonden derart ausgestaltet sein, dass das optisch detektierbare Signal eine Änderung ihres Absorptionsspektrums ist.
In einer Alternative sind die Sonden mit Farbstoffen gekennzeichnet. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Fluoreszenzfarbstoffe.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden mindestens 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr unterschiedliche Sonden eingesetzt. Die Sonden können sich sowohl bezüglich ihrer spezifischen Bindung an die A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate als auch bezüglich ihrer unterschiedlichen Kennzeichnung durch z.B. Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden.
Es können auch Sonden miteinander kombiniert werden, die geeignet sind FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) als Detektion zu verwenden.
Der Einsatz mehrerer, unterschiedlicher Sonden, die durch unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe gekennzeichnet sind, erhöht die Spezifität des bei der Messung erhaltenen Korrelationssignals. Zusätzlich wird dadurch auch das Ausblenden von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Monomeren möglich. Die Detektion von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Monomeren kann insbesondere ausgeschlossen werden, falls Sonde und Fängermolekül identisch sind, oder beide ein überlappendes Epitop erkennen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Sonden eingesetzt, die spezifisch für eine bestimmte A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregatspezies sind, wie z.B. A-beta (x-40), A-beta (x-42) oder Pyro-Glutamat-A-beta (3-x), Pyro-Glutamat-A-beta (11-x) bzw. an Serin 129 phosphoryliertes alpha-Synuclein. X ist eine ganze, natürliche Zahl zwischen 1 und 40 beziehungsweise 42, wobei der Fachmann auf Grundlage seiner Kenntnis der Sequenz des A-beta-Peptids die Länge der zu verwendenden Sequenz bestimmt. In einer weiteren Alternative können Sonden verwendet werden, die spezifisch für bestimmte A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregat-Formen sind, wie z.B. A-ll oder 1-11.
In einer weiteren Alternative können als Sonden A-Beat- bzw. alpha-Synuclein-Peptide, gekennzeichnet mit Fluoreszenzfarbstoffen, verwendet werden.
Im Gegensatz zu bisherigen Untersuchungen des Standes der Technik werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung keine körpereigenen Flüssigkeiten oder Gewebe eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die zu untersuchende Probe eine Stuhlprobe.
Die Stuhlproben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Aufbereitungsschritte durchlaufen. Dazu wird die Probe in einer besonders bevorzugten Variante in einem ersten Puffer aus TBS mit ProClin 300 und BSA homogenisiert und dann zentrifugiert, und der Überstand anschließend in einem zweiten Puffer aus TBS oder PBS mit BSA, Detergens und Natriumazid verdünnt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung, Größe und/oder Form von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten in Stuhlproben. Hierbei werden die oben genannten und beschriebenen Verfahrensschritte eingesetzt.
Die Detektion der markierten Aggregate erfolgt durch Scannen oder andere Arten der Oberflächenabbildung. Die Detektion erfolgt bevorzugt mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere in Kombination mit Kreuzkorrelation und Single-Particle-Immunosolvent Laserscanning-Assay und/oder Laser-Scanning-Mikroskop (LSM).
Die Detektion wird in einer Alternative der vorliegenden Erfindung mit einem konfokalen Laser- Scanning-Mikroskop durchgeführt.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z.B. in der Laser- Scanning-Mikroskopie verwendet wird oder ein FCS (Fluorescense Correlation Spectroscopy System), dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie z.B. STED oder SIM. Alternativ dazu kann die Detektion durch ein TI RF- Mikroskop erfolgen, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie z.B. STORM oder dSTORM.
Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung vorteilhaft. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Aggregates vor einem Hintergrundsignal, welches z.B. durch gerätespezifisches Rauschen oder andere unspezifische Signale oder unspezifisch gebundene Sonden verursacht wird, ermöglicht. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Readout-Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse, wie z.B. Pixel vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA-Verfahren dar.
In einer Alternative werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere unterschiedliche Sonden eingesetzt. Dadurch werden die Informationen, d.h. die ausgelesenen Werte vervielfacht, da für jeden Punkt, für jedes Aggregat oder für jedes Detektionsereignis eine separate Information erhalten wird in Abhängigkeit der jeweiligen Sonde, die das Signal liefert. So wird für jedes Ereignis die Spezifität des Signals erhöht. Dadurch kann für jedes detektierte Aggregat auch seine Zusammensetzung bestimmt werden, d.h. die Art des Aggregats, wie z.B. A-beta (1-40), A-beta (1- 42), Pyro-Glutamat-A-beta (3-40/42, 11-40/42) oder Mischungen daraus.
Die Zahl der unterschiedlichen Sonden wird dabei im Prinzip nur durch eventuelle Interferenzen der zu verwendenden Fluoreszenzfarbstoffe begrenzt. So können 1, 2, 3, 4 oder mehrere unterschiedliche Sonden-Farbstoff-Kombinationen verwendet werden.
Wesentlich für die Auswertung gemäß dem erfindungsgemäßen, oben beschriebenen Verfahren sind ortsaufgelöste Informationen. Dabei kann es sich z.B. um die Art und/oder Intensität der Fluoreszenz handeln. Bei Auswertung dieser Daten für alle eingesetzten und detektierten Sonden wird erfindungsgemäß die Anzahl der Aggregate, deren Form, Größe und/oder deren Zusammensetzung bestimmt. Dabei können Informationen über die Größe der Oligomere direkt oder indirekt erhalten werden, abhängig davon, ob die Partikel kleiner oder größer als die Ortsauflösung der verwendeten Abbildungsverfahren sind, in einer Ausführungsform können Algorithmen zur Hintergrundminimierung eingesetzt werden und/oder Intensität-Schwellenwerte angewendet werden.
Als Fluoreszenzfarbstoffe können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können GFP (Green Fluorescent Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie Quantumdots verwendet werden.
Durch die Verwendung von internen oder externen Standards sind Testergebnisse objektiv miteinander vergleichbar und damit aussagekräftig.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden mindestens ein, bevorzugt ein, interner oder mindestens ein, bevorzugt ein, externer Standard eingesetzt, insbesondere zur Quantifizierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten. In Varianten der vorliegenden Erfindung werden sowohl mindestens ein, bevorzugt ein, interner Standard und mindestens ein, bevorzugt ein, externer Standard eingesetzt, was die Genauigkeit nochmals erhöhen kann.
In Anlehnung an die Analyse der Verteilung der Fluoreszenzintensität (FIDA - Fluorescence Intensity Distribution Analysis) handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein sogenanntes Oberflächen-FIDA (surface-FIDA - sFIDA). Durch gezielte Wahl der Fänger- und Sonden-Moleküle lässt sich bestimmen, welche Größe die Oligomere besitzen müssen, um zur Detektion (Signal) beitragen zu können.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist zusätzlich auch die genaue Analyse der kleinen, frei diffundierbaren A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate möglich. Aufgrund ihrer Größe, die unterhalb ihrer Auflösung für Lichtmikroskope liegt, konnten diese kleinen A-beta- bzw. alpha- Synuclein-Oligomere schwer von der Hintergrundfluoreszenz (verursacht z.B. durch unspezifisch gebundene Antikörper) unterschieden werden.
Neben der extrem hohen Sensitivität zeigt das erfindungsgemäße Verfahren auch eine Linearität in Bezug auf die Anzahl der A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate über einen großen Bereich.
Weiterer Gegenstand der vorläufigen Erfindung ist die Verwendung der kleinen, frei diffundierbaren A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate als Biomarker zum Nachweis und für die Erkennung von Proteinaggregationserkrankungen, insbesondere AD bzw. PD, in Stuhlproben. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erkennung und/oder Nachweis von Proteinaggregationserkrankungen, insbesondere AD und PD, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stuhlprobe eines Patienten mit dem erfindungsgemäßen, oben beschriebenen Verfahren analysiert wird.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung werden interne oder externe Standards eingesetzt. Solche Standards zur Quantifizierung von Oligomeren oder pathogenen Aggregaten, die eine Proteinaggregationserkrankung oder eine amyloide Degeneration oder
Proteinfehlfaltungserkrankung kennzeichnen, sind dadurch gekennzeichnet, dass ein Polymer aus Polypeptid-Sequenzen aufgebaut wird, die bezüglich ihrer Sequenz identisch im entsprechenden Teilbereich mit den körpereigenen Proteinen sind oder eine Homologie von mindestens 50% über den entsprechenden Teilbereich mit den körpereigenen Proteinen aufweisen, die eine Proteinaggregationserkrankung oder eine amyloide Degeneration oder
Proteinfehlfaltungserkrankung kennzeichnen, wobei die Polymere nicht aggregieren.
Als Standard im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine allgemein gültige und akzeptierte, feststehende Bezugsgröße bezeichnet, die zum Vergleichen und Bestimmen von Eigenschaften und/oder Menge dient, insbesondere zur Bestimmung der Größe und Menge von pathogenen Aggregaten aus körpereigenen Proteinen. Der Standard im Sinne der vorliegenden Erfindung kann zum Kalibrieren von Geräten und/oder Messungen verwendet werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können unter dem Begriff „Proteinaggregationserkrankung" auch amyloide Degenerationen und Proteinfehlfaltungserkrankungen zusammengefasst werden. Beispiele solcher Krankheiten und die damit verbundenen körpereigenen Proteine sind: A-beta- und Tau-Protein für AD, alpha-Synuclein für PD oder Prion-Protein für Prion-Erkrankungen, zum Beispiel wie die humane Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), die Schafskrankheit Scrapie und die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE).
„Homologe Sequenzen" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer Aminosäuresequenz aus einem körpereigenem pathogenen Aggregat oder Oligomeren, das eine Proteinaggregationserkrankung hervorruft, von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ,100 % aufweist. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptid -Sequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T.F. und Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptid-Sequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptid-Sequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch, wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.
Unter dem Begriff „entsprechender Teilbereich" körpereigener Proteine ist jene Peptidsequenz zu verstehen, die gemäß den erfindungsgemäßen Definitionen eine identische oder mit der angegebenen Prozentzahl homologe Peptidsequenz eines Monomers, aus dem die erfindungsgemäßen Standards aufgebaut werden, aufweist.
Wesentlich für die erfindungsgemäßen Standards ist, dass die Standards nicht aggregieren, bevorzugt durch die Verwendung von monomeren Polypeptid-Sequenzen, die nicht aggregieren, da der „entsprechender Teilbereich" körpereigener Proteine für die Aggregation nicht verantwortlich ist, oder die durch Blockierung der für die Aggregation verantwortlichen Gruppen nicht aggregieren.
Aggregate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind
Partikel die aus mehreren, bevorzugt gleichen Bausteinen bestehen, die nicht kovalent miteinander verbunden sind und/oder nicht-kovalente Zusammenlagerungen mehrerer Monomere.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besitzen die Standards eine genau definierte Anzahl von Epitopen, die kovalent miteinander verknüpft sind (unmittelbar oder über Aminosäuren, Spacer und/oder funktionelle Gruppen) für die Bindung der entsprechenden Sonden.
Sonden im Sinne der Erfindung werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Nanobody und Affibody. Wie bereits dargestellt, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verschiedene Sonden miteinander kombiniert werden.
Die Zahl der Epitope wird dadurch bestimmt, dass eine Polypeptid-Sequenz verwendet wird, die bezüglich ihrer Sequenz identisch mit jenem Teilbereich der körpereigenen Proteine ist, die ein Epitop bildet bzw. eine Homologie von mindestens 50% mit diesem Teilbereich aufweist, und dabei die biologische Aktivität des Epitops besitzt.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Epitopen um Epitope des A-beta-Peptids ausgewählt aus den Teilbereichen A-beta 1-11, A-beta 3-11 oder pyroGluA-beta 3-11, z.B. des humanen N-terminale Epitops (mit folgender Sequenz: DAEFRHDSGYE (1-11). Bei den Epitopen für alpha-Synuclein handelt es sich um das humane Volllängen-Protein.
Das erfindungsgemäße Standardmolekül ist bevorzugt ein Polymer aus den oben definierten Polypeptid-Sequenzen. Oligomer im Sinne der Erfindung ist ein Polymer gebildet aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Monomeren (unter Monomer ist die o.g. Polypeptid-Sequenz zu verstehen), oder Vielfachen davon, bevorzugt 2 bis 16, 4 bis 16, 8 bis 16, besonders bevorzugt 8 oder 16, oder Vielfachen davon.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung sind die Standards wasserlöslich.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Standards aus gleichen Polypeptid-Sequenzen aufgebaut.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Standards aus unterschiedlichen Polypeptid-Sequenzen aufgebaut.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden solche oben definierte Polypeptid-Sequenzen in einer linearen Konformation aneinandergereiht.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden solche oben definierte Polypeptid-Sequenzen zu einem verzweigten, erfindungsgemäßen Oligomer aneinandergereiht.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden solche oben definierte Polypeptid-Sequenzen zu einem cross-linked, erfindungsgemäßen Oligomer aneinandergereiht.
Verzweigte oder cross-linked, erfindungsgemäße Oligomere können durch Verknüpfung einzelner Bausteine mittels Lysin oder mittels Click-Chemie hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft in einer Alternative ein Standardmolekül, enthaltend oder aufgebaut aus Kopien des aminoterminalen Teils des A-beta-Peptids, ausgewählt aus den Teilbereichen A-beta 1- 11, A-beta 3-11, oder pyroGluA-beta 3-11, z.B. des humanen N-terminale Epitops (mit folgender Sequenz: DAEFRHDSGYE (1-11).
Die Vervielfältigung der Epitope durch funktionelle Gruppen kann vor oder nach der Synthese der einzelnen Bausteine durchgeführt werden. Charakteristisch für die erfindungsgemäßen Standards ist die kovalente Verknüpfung der Polypeptid-Sequenzen.
Die in erfindungsgemäßen Varianten einzusetzenden Polypeptid-Sequenzen können identisch mit der Sequenz des A-beta-Volllängen-Peptids sein oder zeigen eine Homologie von 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% mit der Sequenz des A-beta-Volllängen-Peptid.
Alternativ werden auch zum Aufbau der erfindungsgemäßen Standard-Moleküle Polypeptid- Sequenzen eingesetzt, die identisch mit einem Teilbereich des A-beta-Volllängen-Peptids sind, bzw. eine Homologie von 50, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% mit einem Teilbereich des A-beta-Volllängen- Peptids zeigen.
Wesentlich für die erfindungsgemäß eingesetzten Sequenzen ist ihre Eigenschaft nicht (oder nur gemäß den Bedingungen kontrolliert) zu aggregieren und/oder ihre Aktivität als Epitop.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Standards als Dendrimere aufgebaut. Die erfindungsgemäßen Dendrimere sind aus den oben beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptid-Sequenzen aufgebaut und können ein zentrales Gerüstmolekül enthalten.
Die erfindungsgemäßen Dendrimere enthalten in einer Variante Polypeptid-Sequenzen, die eine Sequenz besitzen, die identisch mit einem Teilbereich des A-beta-Peptids ist, oder eine mindestens 50%ige Homologie zu dem entsprechenden Teilbereich zeigt.
Erfindungsgemäß ist unter dem Begriff mindestens 50%ige Homologie auch eine höhere Homologie zu verstehen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% zu verstehen.
Standards, vorteilhaft mit höherer Löslichkeit im Wässrigen als pathogene Aggregate oder Oligomere aus körpereigenen Proteinen, sind in einer Ausführung der Erfindung aus Polypeptid-Sequenzen gebildet, die identisch mit dem N-terminalen Bereich des A-beta-Peptids sind oder mindestens 50%ige Homologie dazu aufweisen. Erfindungsgemäß ist unter dem N-terminalen Bereich von einem A-beta-Polypeptid die Aminosäuresequenz A-beta 1-8, A-beta 1-11, A-beta 1-16, A-beta 3-11 oder pyroGluA-beta 3-11 zu verstehen.
Ein erfindungsgemäßes Standardmolekül kann Epitope für mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr verschiedene Sonde enthalten.
Epitope charakteristisch für verschiedene Sonden können in die erfindungsgemäßen Standards dadurch eingebaut werden, dass Polypeptid-Sequenzen verwendet werden, die identisch mit unterschiedlichen Bereichen des A-beta-Peptids sind, bzw. mindestens eine 50%ige Homologie dazu aufweisen, aber die Aktivität des entsprechenden Epitops besitzen.
In einer Ausführung werden hierzu Polypeptid-Sequenzen eingesetzt, die identisch sind oder eine mindestens 50%ige Homologie mit dem N-terminalen Bereich des A-beta -Polypeptids aufweisen, sowie Polypeptid-Sequenzen, die identisch bzw. mindestens eine 50%ige Homologie mit dem C- Terminus des A-beta-Polypeptids aufweisen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung enthalten die Standardmoleküle sogenannte Spacer. Unter einem Spacer ist ein Molekül zu verstehen, das über kovalente Bindungen in das Standardmolekül eingebaut ist und bestimmte physikalische und/oder chemische Eigenschaften besitzt, durch welche die Eigenschaften des Standardmoleküls verändert werden. In einer Ausführung der erfindungsgemäßen Standards werden hydrophile oder hydrophobe, bevorzugt hydrophile Spacer, eingesetzt. Hydrophile Spacer werden bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle, gebildet aus PEG, Zucker, Glycerin, Poly-L-Lysin oder beta-Alanin.
Die erfindungsgemäßen Standards enthalten in einer Alternative der vorliegenden Erfindung (weitere) funktionelle Gruppen.
Unter funktionellen Gruppen sind Moleküle zu verstehen, die kovalent an die Standardmoleküle gebunden sind. In einer Variante enthalten die funktionellen Gruppen Biotin-Gruppen. Dadurch wird eine starke kovalente Bindung an Streptavidin ermöglicht. Standardmoleküle enthaltend Biotin- Gruppen können so an Moleküle, enthaltend Streptavidin-Gruppen, gebunden werden. Falls die erfindungsgemäßen Standardmoleküle Biotin und/oder Streptavidin-Gruppen enthalten, können so größere Standards zusammengebaut werden oder mehrere, ggf. unterschiedliche Standardmoleküle, an ein Gerüst gebunden werden.
In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung enthalten die Standardmoleküle Farbstoffe zur spektral photometrischen Bestimmung und/oder aromatische Aminosäuren. Aromatische Aminosäuren sind z.B. Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin oder Histidin, bzw. ausgewählt aus dieser Gruppe. Beispielsweise wird durch den Einbau von Tryptophan eine spektralphotometrische Bestimmung der Konzentration von Standards in Lösung ermöglicht.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Dendrimere enthaltend Polypeptide, die bezüglich ihrer Sequenz identisch im entsprechenden Teilbereich mit den körpereigenen Proteinen sind oder eine Homologie von mindestens 50% über den entsprechenden Teilbereich mit den körpereigenen Proteinen aufweisen, die eine Proteinaggregationserkrankung kennzeichnen, für die Verwendung bei der Untersuchung von Stuhlproben.
Die Dendrimere können jede der oben beschriebenen Merkmale der Standards oder jede beliebige Kombination davon enthalten.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung handelt es sich um
Dendrimere enthaltend eine genau definierte Anzahl von Epitopen für die kovalente Bindung von Sonden,
Dendrimere enthaltend Epitope des A-beta-Peptids,
Dendrimere dadurch gekennzeichnet, dass sie eine höhere Löslichkeit im Wässrigen besitzen, als die pathogenen Aggregate aus körpereigenen Proteinen, die eine Proteinaggregationserkrankung kennzeichnen,
Dendrimere enthaltend funktionelle Gruppen,
Dendrimere enthaltend mindestens ein Spacer-Molekül und/oder
Dendrimere enthaltend Farbstoffe zur spektralphotometrischen Bestimmung und/oder aromatische Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Standards, wie oben beschrieben, für die Verwendung bei Stuhlprobenuntersuchungen.
In einer Ausführung wird der erfindungsgemäße Standard mittels Peptidsynthese oder rekombinanter Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines oben beschriebenen Standards oder eines oben beschriebenen Dendrimers zur Quantifizierung in Stuhlproben von pathogenen Aggregaten oder Oligomeren aus körpereigenen Proteinen, die eine Proteinaggregationserkrankung kennzeichnen.
In einer Ausführung der Erfindung wird der Standard verwendet um A-beta-Oligomere in Stuhlproben zu quantifizieren. Die erfindungsgemäßen Standards werden in einer Ausführung der vorliegenden Erfindung für die Kalibrierung bei der sFIDA-Methode, ELISA (Sandwich-ELISA) oder FACS eingesetzt.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit für die Untersuchung von Stuhlproben, welches die erfindungsgemäßen Standards umfasst. Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z.B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden die Standards zur Quantifizierung von pathogenen Aggregaten oder Oligomeren aus körpereigenen Proteinen in Stuhlproben verwendet indem: in einem ersten Schritt die Standards oder die Dendrimere mit Sonden markiert werden und die
Anzahl der an die Standards oder Dendrimere gebundenen Sonde bestimmt wird, in einem zweiten Schritt pathogene Aggregaten oder Oligomere aus körpereigenen Proteinen, die eine Proteinaggregationserkrankung kennzeichnen, mit Sonden markiert werden, die Zahl der an jeweils ein pathogenes Aggregat oder Oligomer bindende Sonden bestimmt wird, in einem dritten Schritt die Zahl der an jeweils ein Standard oder Dendrimer bindende Sonden aus
Schritt 1 mit der aus Schritt 2 verglichen wird, und in einem vierten Schritt dadurch die Zahl und die Größe der Oligomere in der Stuhlprobe bestimmt wird.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Standards, bevorzugt Dendrimere, für die Kalibrierung der sFIDA-Methode eingesetzt. In einem ersten Schritt werden körpereigene pathogene Aggregate aus Stuhlproben, z.B. A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate durch ein Fängermolekül auf eine Glasfläche immobilisiert. Im Falle von A-beta- bzw. alpha- Synuclein-Aggregaten kann hierzu eine N-terminales Fängermolekül eingesetzt werden. Nach der Immobilisierung werden die Aggregate durch zwei unterschiedliche Sonden markiert. Im Falle von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten werden z.B. A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper eingesetzt, die beide über ein N-terminales Bindeepitop gebunden werden. Die Detektionssonden sind mit, bevorzugt unterschiedlichen, Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Dadurch werden sie im Mikroskop, z.B. Laser-Scanning-Mikroskop sichtbar.
Erfindungsgemäß wird eine Monomer-Detektion von körpereigenen Polypeptiden ausgeschlossen indem im Testsystem drei unterschiedliche bzw. drei unterschiedlich markierte Sonde eingesetzt werden, die an einem ähnlichen bzw. gleichen Epitop binden. Alternativ oder zusätzlich kann die Detektion von Monomeren ausgeschlossen werden indem Signale mit einer niedrigeren Intensität durch ein Intensität-cut-off nicht gewertet werden. Da größere Aggregate mehrere Bindungsstellen für die beiden mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten Sonden besitzen, kann eine Monomer- Detektion alternativ oder zusätzlich durch Kreuzkorrelation dieser Signale ausgeschlossen werden. Die erfindungsgemäßen Standards können als interne oder externe Standards bei der Messung verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist mithin auch ein Kit zur selektiven Quantifizierung von A- beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten in Stuhlproben gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Ein solches Kit kann eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
Substrat aus Glas, das mit einem hydrophilen Stoff beschichtet sein kann, bevorzugt einer Dextranschicht, besonders bevorzugt aus CMD;
Standard;
Fängermolekül;
Sonde;
Substrat mit Fängermolekül.
Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z.B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten.
In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Dextranoberfläche und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet werden. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose, Frühdiagnose und/oder Prognose von AD bzw. PD mittels Untersuchung von Stuhlproben.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung von Therapien der AD bzw. PD sowie zur Überwachung und/oder Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren mittels Untersuchung von Stuhlproben. Dies kann sowohl bei klinischen Tests, Studien als auch beim Therapie-Monitoring eingesetzt werden. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und die Ergebnisse verglichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Biomarker zur Entscheidung ob eine Person in eine klinische Studie aufgenommen wird. Hierzu werden Stuhlproben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und in Bezug auf einen Grenzwert die Entscheidung getroffen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Ergebnisse von Stuhlproben miteinander verglichen werden. Bei den Stuhlproben handelt es sich um Stuhl von vor beziehungsweise nach, oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Gabe der Wirkstoffe beziehungsweise Durchführung des Heilverfahrens. Anhand der Ergebnisse werden Wirkstoffen und/oder Heilverfahren ausgewählt, durch die eine Verringerung der A-beta- bzw. alpha- Synuclein-Aggregate erfolgte. Erfindungsgemäß werden die Ergebnisse mit einer Kontrolle verglichen, die nicht dem Wirkstoff und/oder Heilverfahren unterworfen wurde.
Bei der vorliegenden Erfindung kommt mithin ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung und/oder Charakterisierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten, die nach Immobilisierung auf einem Substrat durch Sonden spezifisch markiert werden, wobei die Detektion der markierten Aggregate mit einer hohen Ortsauflösung erfolgt, zum Einsatz. Dabei wird erfindungsgemäß durch die hohe Ortsauflösung jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt, so dass lediglich die Aggregate und keine unspezifischen Signale detektiert werden. Dies stellt einen Vorteil gegenüber den bekannten ELISA-Verfahren dar. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden gelegentlich eigentlich in Bezeichnungen zu verwendende griechische Buchstaben ersetzt durch die ausgeschriebene Form, z.B. bei alpha- Synuclein (SNCA), um die Lesbarkeit zu erhöhen und Konvertierungsfehlern vorzubeugen. Der Sinngehalt wird dadurch nicht geändert.
Eine besonders bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung lässt sich durch die folgenden acht Punkte beschreiben:
Ähnlich, wie bei einem Sandwich-ELISA-Assay, aber doch in ganz entscheidenden Punkten anders, ist der Grundaufbau dieses gemäß bevorzugter Variante der vorliegenden Erfindung entwickelten sFIDA-Assays:
1. Zur Aufbereitung der Stuhlprobe, wird diese erst in einem Puffer homogenisiert und dann zentrifugiert. Anschließende enzymatische Behandlungen des Überstands mit z.B. Proteasen, Nukleasen und Lipasen und mögliche Präzipitationen können dann bei Bedarf durchgeführt werden. Geeignete Verdünnungen, die hieraus hervorgehen, sollen zur Messung im sFIDA- Assay eingesetzt werden.
2. Auf einer Oberfläche (bevorzugt aus Glas) werden Fängermoleküle für Proteinaggregateenthaltende Partikel (z.B. anti-alpha-Synuclein-Antikörper) gebunden. Die Fängermoleküle können alle identisch oder Mischungen verschiedener Fängermoleküle sein.
3. Nach der Inkubation mit dem Fängermolekül kann ein Blocking-Schritt erfolgen, bei dem die Wells mit einer Blocking-Lösung behandelt werden. Anschließend kann optional ein weiterer Waschschritt erfolgen.
4. Auf die so vorbereitete Oberfläche wird dann die zu untersuchende Stuhlprobe, bevorzugt nach vorherigen Aufbereitungsschriften, aufgetragen. Unspezifisch gebundene Substanzen werden durch Waschschritte entfernt.
5. Die Proteinaggregate-enthaltenden Partikel (z.B. alpha-Synuclein-Aggregate) werden mit einer für die weitere Detektion dienlichen Sonde (z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff-gebundenen anti- alpha-Synuclein-Antikörper, der nur eine pathologisch an Serin 129 phosphorylierte Form von alpha-Synuclein bindet) markiert. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe könnten u.a. auch Quantumdots sein. Bevorzugt werden die Proteinaggregate-enthaltenden Partikel mit mindestens einer weiteren Sonde (z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff-gebunden anti-alpha- Synuclein-Antikörper, der nur eine pathologisch an Serin 129 phosphorylierte Form von alpha- Synuclein bindet) markiert. Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden, die an unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sind, erhöht zum einen die Spezifität des am Ende erhaltenen Korrelationssignals, zum anderen ermöglicht dies auch das Ausblenden von nicht-aggregierten Proteinen (z.B. von monomerem alpha-Synuclein). Besonders, wenn eine der Detektionssonden identisch mit dem Fängermolekül (aus Schritt 2) ist, oder beide ein überlappendes Epitop erkennen, kann die Detektion von nicht-aggregierten Proteinen ausgeschlossen werden.
6. Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Sonden entfernt.
7. Die Detektion der markierten Aggregate erfolgt durch Scannen (z.B. durch einen Laserfocus, wie er beispielsweise in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird) oder durch andere Arten der Oberflächen-Abbildung (z.B. durch ein TIRF-Mikroskop). Je höher die Ortsauflösung dabei ist, desto mehr Datenpunkte entstehen, die jeweils die Detektion eines Aggregates vor einem Hintergrundsignal (z.B. durch gerätespezifisches Rauschen, unspezifische Signale, unspezifisch gebunden Sonden) erlauben. Auf diese Art entsteht nicht nur ein einzelner Readout-Wert (wie dies bei einem ELISA der Fall wäre), sondern so viele Readout-Werte, wie ortsaufgelöste Ereignisse (beispielsweise Pixel) vorhanden sind. Durch den Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden (siehe Schritt 3) wird diese Information sogar vervielfacht und für jeden Punkt, für jedes Aggregat oder für jedes Detektionsereignis kann die Information separat erhalten werden, welche der Sonden dort Signale liefert. So kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.
8. Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen (z.B. die Fluoreszenzintensität) aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um beispielsweise die Anzahl der Aggregate, deren Größe und deren Zusammensetzung zu bestimmen. Dabei können in Varianten der vorliegenden Erfindung auch Algorithmen zur Hintergrundminimierung eingesetzt werden und/oder auch Intensitäts-Schwellenwerte für die weitere Auswertung angewandt werden.
9. Um die Testergebnisse miteinander, insbesondere über Entfernungen, Zeiten und Experimentatoren hinweg, vergleichbar zu machen, können Standards, sowohl interne als auch externe oder eine Kombination aus internen und externen, eingesetzt werden.
Figurenbeschreibung:
Figur 1 zeigt diagrammatisch die Ergebnisse der in Beispiel 9a) beschriebenen Messungen an bzw.
Untersuchungen von Stuhlproben von drei Alzheimer-Patienten einerseits und fünf Kontrollpatienten andererseits.
Figur 2 zeigt diagrammatisch die Ergebnisse der in Beispiel 9b) beschriebenen Messungen an bzw.
Untersuchungen von Stuhlproben von vier Parkinson-Patienten einerseits und fünf Kontrollpatienten andererseits.
Beispiele:
1. Vorbereitung Substrat für kovalente Bindung
Die Aminierung der Glasoberfläche erfolgte mit APTES und Toluol. Hierfür wurden in einer Kristallisierschale 250 pl APTES in 5 ml Toluol gelöst und genau mittig in den Exsikkator gestellt. Anschließend wurde eine Glasplatte aus der Verpackung herausgenommen und kopfüber in den Exsikkator gestellt. Nachdem ca. 10 Minuten lang Vakuum gezogen wurde, wurde der Exsikkator über einen Ballon mit Argon geflutet. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurde die Kristallisierschale entfernt und die Platte mit angehängter Vakuumpumpe für 2 Stunden getrocknet. Die Präparation nach der Aminierung wurde nicht pausiert, da die Aminierung nicht stabil ist.
Für die kovalente Beschichtung mit Dextran wurde die Glasoberfläche vorab wie oben beschrieben aminiert. Ein mg/ml CMD wurden mit 200 mM EDC und 50 mM NHS in 0,1 M MES pH 3,5 aktiviert und auf die Glasplatte gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch anschließendes fünfmaliges Waschen mit Wasser wurde nicht gebundenes Dextran entfernt.
Für die kovalente Beschichtung mit PEG wurde die Glasoberfläche vorab wie oben beschrieben aminiert. Als Spacer wurde bifunktionales PEG (MW 3400 Da, NHS/COOH) verwendet. Dafür wurde eine 4 mM PEG-Lösung hergestellt. Es wurden zunächst 20 pl PBS in jedes Well vorgelegt und anschließend entsprechend 20 mI der angesetzten PEG-Lösung hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Wells fünfmal mit Wasser gewaschen. Zum Quenchen wurde eine 10 mM Ethanolaminlösung angesetzt und 20 mI in jedes Well pipettiert. Nach einer 15 -minütigen Inkubationsdauer wurde fünfmal mit Wasser gewaschen. Die Aktivierung der Carbonsäuregruppe erfolgte mittels 20 mI einer Lösung bestehend aus 200 mM EDC und 50 mM NHS in 0,1 M MES. Im Anschluss an die 30-minütige Inkubation wurden die Wells fünfmal mit Wasser gewaschen. la. Für die nicht kovalente Beschichtung der Glasoberfläche mit Fängermolekül ist keine Vorbehandlung notwendig.
2. Immobilisierung von Antikörpern als Fängermoleküle auf dem beschichteten Substrat (kovalente Bindung).
Die Lösung der Antikörper wurde in die Wells gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die oben beschriebene Aktivierung der Carbonsäuregruppen von PEG und Dextran wurden die Amingruppen der Fängermoleküle mit PEG oder Dextran verknüpft und so kovalent an die Glasoberfläche gebunden. Zum Quenchen der nicht besetzten aktivierten Carbonsäuregruppen wurde eine 10 mM Ethanolaminlösung in Wasser verwendet und für 15 Minuten in den Wells inkubiert.
Für die nicht kovalente Bindung wurde der Fängerantikörper in einem geeigneten Puffer, hier PBS oder Carbonat gelöst. Die eingesetzte Konzentration 2,5 pg/ml des Fängerantikörpers richtete sich dabei je nach Biomarker und wurde vorab durch verschiedene Titrationsexperimente ermittelt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C.
Nach der Fängerantikörper-Inkubation wurden nicht gebundene Antikörper durch fünfmaliges Waschen mit TBS und 0,05% Tween® 20 (nichtionisches Tensid; ein Polyethylenglykol -Sorbitan- Fettsäureester) und fünfmaliges Waschen mit TBS entfernt.
3. Blocking
Sowohl bei der kovalenten als auch bei der nicht kovalenten Bindung erfolgte nach der Inkubation mit dem Fängerantikörper ein Blocking-Schritt. Dafür wurden BSA, Casein bzw. Milchpulver in einer Konzentration zwischen 0, 5-5,0% in TBS gelöst und für 90 Minuten bei Raumtemperatur in den Wells inkubiert.
Alternativ können zu der Blocking-Lösung anti bakterielle und antifungale Substanzen wie ProClin 300 oder Natriumazid zugegeben werden. Anschließend kann optional ein weiterer Waschschritt (fünfmaliges Waschen mit TBS und 0,05% Tween 20 und fünfmaliges Waschen mit TBS) erfolgen.
4. Immobilisierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten auf dem vorbehandelten Substrat Die zu vermessenden Proben wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 °C) bzw. 37 °C auf dem Substrat inkubiert und anschließend fünfmal mit TBS gewaschen.
5. Verknüpfung der Sonden mit Fluoreszenzfarbstoff zu ihrer Kennzeichnung
Die Detektionssonden, hier Nab228 (anti-A-beta 1-11) oder 211 (anti-alpha-Synuclein 121-125) oder EP1536Y (anti-phospho-alpha-Synuclein (S129)) wurden jeweils mit CF Farbstoffen, hier CF633- Succinimidylester und CF488A-Succinimidylester markiert. Die Aufreinigung erfolgte dabei über Größenausschlusschromatographie wie es dem Fachmann bekannt ist. 6. Markierung der Aggregate mit den Sonden
Die Menge der verwendeten Antikörper ist abhängig von dem gewünschten Grad an Markierung und einem hohen Signalrauschverhältnis, welches vorab innerhalb der Assay-Entwicklung titriert wurde. Die Sonden wurden hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Nicht gebundene Sonden wurden durch fünfmaliges Waschen mit TBS entfernt.
7. Detektion der Aggregate und Vermessung der Proben
Die Messung erfolgte hier mit einem Celldiscoverer 7 (Carl Zeiss, Jena, Germany), das über ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verfügt, bzw. ein TIRF Mikroskop (Leica, Wetzlar, Germany). Es wurde die Fluoreszenzintensität einer Fläche von 1000 x 1000 Pixel (TIRF) bzw. 2752 x 2208 oder 512 x 512 Pixel (Celldiscoverer 7) bestimmt. Da unterschiedliche Sonden eingesetzt wurden, wurde eine Kolokalisationsanalyse durchgeführt (Prüfung, wo Messwerte beider Sonden an einem gleichen Ort (hier Umkreis von ca. 10 nm) auftraten; z.B. kann eine rot emittierender Fluorophor und ein grün emittierender Fluorophor betrachtet werden). Um repräsentative Werte zu erhalten, wurden mehrere Bereiche der Glasoberfläche (4 Wells) vermessen. Die Messung erfolgte mittels ZEN Software von Carl Zeiss bzw. LAS AF Software von Leica.
8. Aufbereitung von Stuhlproben
Die Stuhlproben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Aufbereitungsschritte durchlaufen.
Hier wurden die Probe in einem ersten Puffer aus Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) mit ProClin 300 und BSA homogenisiert und dann zentrifugiert, und der Überstand anschließend in einem zweiten Puffer aus TBS oder PBS mit BSA, Detergens und Natriumazid verdünnt.
9. Analyse von Stuhlproben
Es wurden zwei Untersuchungen durchgeführt; einmal in Bezug auf Alzheimer-Patienten und einmal in Bezug auf Parkinson-Patienten. a) Acht Stuhlproben von unterschiedlichen Patienten wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Die Stuhlproben stammten jeweils von drei Alzheimer-Patienten und fünf Kontrollpatienten (gesund bezüglich Proteinaggregationserkrankungen, unterschiedlichen Alters). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Ebenso in Figur 1.
Tabelle 1 b) Neun Stuhlproben von unterschiedlichen Patienten wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Die Stuhlproben stammten jeweils von vier Parkinson-Patienten und fünf Kontrollpatienten (gesund bezüglich Proteinaggregationserkrankungen, unterschiedlichen Alters). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ebenso in Figur 2.
Tabelle 2
Die Ergebnisse beweisen, dass eine deutliche Unterscheidung zwischen den Gruppen möglich ist. Der Durchschnitt an alpha-Synuclein-Oligomeren bei der Alzheimer- bzw. Parkinson-Gruppe war jeweils signifikant höher als bei den jeweiligen Kontrollgruppen. Es konnte also aus den Untersuchungsergebnissen der Stuhlproben auf den Gesundheitszustand der Patienten geschlossen werden.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur selektiven Quantifizierung und/oder Charakterisierung von A-beta- bzw. alpha- Synuclein-Aggregaten in Stuhlproben umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellen eines Substrats auf dem Fängermoleküle immobilisiert sind, b) Aufträgen der zu untersuchenden Stuhlprobe auf das Substrat, c) Hinzufügen von für die Detektion gekennzeichneten Sonden, die durch spezifische Bindung an A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregate diese markieren, und d) Detektion der markierten Aggregate mittels hoher Ortsauflösung bei welcher jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorbehandlung der Stuhlprobe erfolgt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stuhlproben durch Homogenisierung und Abtrennung, bevorzugt mittels Zentrifugation, der festen von den flüssigen Bestandteilen der Stuhlprobe unter Zusatz von Wasser oder einer oder mehrerer wässriger Pufferlösungen vorbehandelt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat aus Glas verwendet wird, wobei das Substrat bevorzugt eine hydrophile Beschichtung aus oder auf Basis von Dextran besitzt.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle kovalent an das Substrat oder an die Beschichtung gebunden sind und bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper sind und bevorzugt spezifisch ein Epitop des A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregats binden.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Peptid-spezifische Sonden eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden Fluoreszenzfarbstoff-gekennzeichnete Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper sind.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr unterschiedliche Sonden eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr Sonden mit unterschiedlich gekennzeichneten Fluoreszenz-Farbstoffen eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Sonde ein Anti-A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Antikörper ist, der spezifisch an das N-terminale Epitop des A-beta-Peptides bzw. an alpha-Synuclein bindet.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie, bevorzugt mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), gegebenenfalls in Kombination mit Kreuzkorrelation und Single-Particle-Immunosolvent Laserscanning-Assay, Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) oder TIRF-Mikroskopie, sowie den entsprechenden superauflösenden Varianten STED, SIM, STORM, dSTORM, durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass ein interner oder externer Standard zur Quantifizierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein- Aggregaten eingesetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, dass der Standard zur Quantifizierung von A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregaten ein Polymer, aufgebaut aus Polypeptid- Sequenzen ist, die bezüglich ihrer Sequenz identisch mit jenem Teilbereich der körpereigenen Proteine sind, der ein Epitop bildet oder eine Flomologie von mindestens 50% über den entsprechenden Teilbereich mit jenen körpereigenen Proteinen aufweisen, die eine Proteinaggregationserkrankung oder eine amyloide Degeneration oder Proteinfehlfaltungserkrankung hervorrufen, wobei die Polymere nicht aggregieren und die Polypeptid-Sequenz die biologische Aktivität des Epitops besitzt.
15. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren zur Behandlung von AD bzw. PD dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 durchgeführt wird und die Wirkstoffe und/oder Heilverfahren nach ihrer Wirkung auf die A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregat-Bildung miteinander verglichen werden, wobei jene Wirkstoffe und/oder Heilverfahren ausgewählt werden, die eine geringere A-beta- bzw. alpha-Synuclein-Aggregat-Bildung im Vergleich mit einer Kontrolle zeigen.
16. Verfahren zur Entscheidung der Aufnahme eines Individuums in eine klinische Studie oder Test, dadurch gekennzeichnet, dass Quantifizierung und/oder Charakterisierung von A-beta- Aggregaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 erfolgt und der gemessene Wert mit einem Schwellenwert verglichen wird.
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