EP4172623A1 - Verfahren, verwendung des verfahrens sowie kit zum nachweis von bioindikatoren in einer probe - Google Patents

Verfahren, verwendung des verfahrens sowie kit zum nachweis von bioindikatoren in einer probe

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Publication number
EP4172623A1
EP4172623A1 EP21730462.5A EP21730462A EP4172623A1 EP 4172623 A1 EP4172623 A1 EP 4172623A1 EP 21730462 A EP21730462 A EP 21730462A EP 4172623 A1 EP4172623 A1 EP 4172623A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bioindicators
probes
molecules
substrate
capture molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21730462.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver BANNACH
Andreas Kulawik
Christian ZAFIU
Dieter Willbold
Thi Tuyen Bujnicki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP4172623A1 publication Critical patent/EP4172623A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to a method and a kit for detecting bioindicators in a sample, as well as the use of the method for detecting a disease or checking the effectiveness of active ingredients and / or healing methods.
  • Bioindicators such as proteins, viruses, hormones, toxins or pesticides are currently detected using ELISA-like methods as standard. If the concentration of the bio-indicator is particularly low, the so-called SIMOA method can be used.
  • proteins e.g. antibodies
  • viruses but also low molecular weight compounds such as hormones, toxins and pesticides
  • a sample blood serum, milk, urine etc.
  • an antibody is previously marked with an enzyme.
  • the reaction catalyzed by the reporter enzyme serves as evidence of the presence of the antigen.
  • Substrate is converted by the enzyme, the reaction product can usually be detected by a change in color, possibly also by chemiluminescence.
  • the signal strength is a function of the antigen concentration that can be precisely determined with a photometer, so that ELISA can be carried out for multiple measurements and can also be used for quantitative evidence.
  • Horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP) or, more rarely, glucose oxidase (GOD) are mostly used as reporter enzymes.
  • the dye substrate (synonym: chromogen) z.
  • pNPP p-nitrophenyl phosphate
  • oPD o-phenylenediamine
  • the alkaline phosphatase splits off the phosphate residue from the colorless nitrophenyl phosphate and p-nitrophenol is formed, which is pale yellow.
  • the change in concentration of the dye produced by the enzymatic reaction can be followed with a photometer according to Lambert-Beer’s law.
  • the intensity of the color increases with the concentration of the nitrophenol formed and thus also the concentration of the antigen to be determined in the sample in comparison with a dilution series with known concentrations (standard series).
  • the SIMOA Analyzer combines single-molecule analysis with a digital ELISA display. Analytes are captured in solution by antibody-loaded beads instead of target-antibody interaction on an antibody-immobilized solid phase. Pearls - loaded with target or not - are captured in microcavities the size of femto liters and deliver a digital signal (on / off) for analysis.
  • the decisive disadvantage of the methods according to the prior art is based on the fact that, on the one hand, large amounts of sample are required in order to be able to carry out a detection. On the other hand, the methods only have a small dynamic measuring range. The previously known methods can only achieve maximum sensitivity in the picomolar range. SIMOA also has the disadvantage that special reagents (beads) are required for detection and technically complex equipment is required. Furthermore, with SIMOA only an indirect detection of the analyte is possible through enzymatic secondary reactions, whereby many influencing variables can lead to a falsification of the measurement results.
  • the object of the invention is therefore to provide an alternative method for the detection of bioindicators with which the disadvantages of the prior art in particular can be overcome.
  • Another object of the invention is to provide a kit for carrying out the alternative method for the detection of bioindicators.
  • the invention also relates to the use of the method for detecting a disease or for checking the effectiveness of active ingredients and / or healing methods. Solution of the task
  • the object is achieved by a method for the quantitative and / or qualitative determination of bioindicators, comprising the following steps: a) immobilizing catcher molecules for the bioindicators on a substrate, b) bringing the bioindicators of a sample into contact with the catcher molecules, c) immobilizing the Bioindicators on the substrate by binding to capture molecules, d) bringing the bioindicators into contact with probes containing at least one detection molecule, and e) removing non-specifically bound molecules and particles, e.g. B.
  • probes and capture molecules which have affine molecules or molecular parts that bind to at least one specific binding site of the bioindicators and these affine molecules or molecular parts of the probes and scavengers do not overlap with one another.
  • Steps c) and f) can also advantageously be carried out simultaneously.
  • bioindicators marked with probes can be immobilized on the substrate.
  • the probes can therefore be bound to the bioindicators before the bioindicators are brought into contact with the capture molecules and are immobilized on the substrate.
  • bioindicator is understood to mean on the one hand substances and molecules, the concentration of which is dependent on the condition of an organism. If the concentration limit value of the bio-indicator is exceeded or not reached, conclusions can be drawn about a change in the state of the organism (e.g. disease, healing). Cells, genes, gene products, proteins, hormones, DNA, RNA or even enzymes can be named as examples of the substances and molecules.
  • bio-indicator is also understood to mean a substance or a molecule that can change the condition of an organism in concentrations that exceed limit values. Examples of this are hormones.
  • bioindicators that describe the condition of an organism are metabolites. These are proteins or small organic molecules that have already been modified by the body's own enzymes. The change in the metabolite can allow direct conclusions to be drawn about certain diseases.
  • the method is characterized in that, prior to step a), capture molecules for the bioindicators are immobilized on the substrate.
  • bioindicators by bringing the bioindicators into contact with capture molecules, these can be immobilized on the substrate by binding to the capture molecules.
  • non-specifically bound molecules and particles can be removed, for example by washing. It can advantageously be chosen probes which bind to the bioindicators, the probes, e.g. B. only after binding, may be able to emit a specific detection signal.
  • the biological indicators can be brought into contact with the capture molecules and the probes at the same time.
  • the bioindicators can also be brought into contact with the probes before they are brought into contact with the capture molecules.
  • the probes and / or capture molecules have affine molecules or molecular parts which recognize and bind to specific binding sites of the bioindicators.
  • these affine molecules or molecule parts of the probes and catcher molecules should bind to different, specific binding sites of the bioindicators, so that the probes and catchers build up a directed specific binding to the bioindicators.
  • these respective specific affine molecules or molecular parts of the probes and catchers should preferably not overlap.
  • the binding site of the bioindicators for the probes and the scavengers should therefore differ in their peptide sequence by at least 5 amino acids.
  • the present method succeeds in detecting the bioindicators in any samples and in a low concentration range of these bioindicators in a sample, preferably in a range that can be in the femtomolar or even in the sub-femtomolar range. Individual detection can therefore also be carried out without having to laboriously clean the sample.
  • the method can advantageously enable a qualitative detection of bioindicators and / or also a quantification and characterization in any samples. In this way, on the one hand, a direct and absolute quantification of the number of bioindicators and, on the other hand, a characterization of the size distribution of bioindicators is advantageously guaranteed.
  • the method can also be used to carry out a semi-quantitative detection of bioindicators if the concentration of the bioindicator is below or above a previously determined limit value compared to the reference state.
  • any sample also includes buffers with different additives or culture media.
  • the sample can be taken ex vivo from body fluids or be such. Samples from the environment, such as B. water, plant and soil samples, as well as food can be examined directly and the bioindicators are detected.
  • the bioindicators can also be immobilized directly on the substrate without capture molecules.
  • the sample should first be pretreated with the bioindicators so that the biomarker to be examined has been separated from the sample, for example by immunoprecipitation, and is present in a homogeneous manner.
  • the sample with the bioindicators is chemically fixed after the bioindicators have been brought into contact with the probes, e.g. B. by formaldehyde.
  • DNA and RNA binding probes can be added to the sample after or during or before the binding of the probes to the bioindicators.
  • a detergent can be used after the chemical fixation, if necessary to make the membrane of a bioindicator permeable and thereby, for example, to allow probes to penetrate into the interior of the bioindicators while the probes are bound to the bioindicators.
  • the “quantitative determination” means first of all the determination of the concentration of the bioindicators, hence also the determination of their presence and / or absence.
  • the quantitative determination preferably also means the selective quantification of certain types of bioindicators. Such a quantification can be detected using the corresponding specific probes.
  • the “qualitative determination” means the characterization of the bioindicators.
  • An advantageous embodiment of the method is characterized in that the affine molecules or molecule parts of the probes and / or catcher molecules bind to at least two, or more, specific binding sites of the bioindicators, and here again these specific affine molecules or molecule parts of the probes and catchers preferably not overlap.
  • these respective affine molecules or molecule parts of the probes and / or catcher molecules can bind to at least two, or more, specific binding sites of the bioindicators, with these respective affine molecules or molecule parts of the probes and / or catcher molecules on the one hand can bind at least two or more identical or different binding sites of a bioindicator of the same type and / or, on the other hand, bind to at least two, or more, different binding sites of at least two different bioindicators.
  • this has the advantageous effect that, in particular in the case of at least two or more identical binding sites on a bioindicator, the specificity and stability of the binding of the catchers and / or probes to the bioindicator is increased.
  • the advantageous effect is in particular that, for example, two different bioindicators can also be detected simultaneously in one method step or measurement process.
  • This special proof is also referred to as “multiplex” proof in the following.
  • the signals in the multiplex detection for the two different bioindicators can then be evaluated, for example, via two separate evaluation channels for the probe signals, in particular different fluorescence channels.
  • the bioindicators can be marked with one or more probes useful and / or specific for the detection.
  • probes can be used that include at least one specific embodiment of an affine molecule or part of a molecule, which can then recognize and bind to at least one type of a specific binding site of a bioindicator, these affine molecules or parts of the molecule as before explained should not overlap with the affine molecules or molecular parts of the scavengers.
  • probes can be used which comprise at least two or more identical or different configurations of affinity molecules or molecular parts which can recognize and bind to at least two different or identical binding sites of a bioindicator of a type.
  • the affine molecules or molecular parts of the probes which each recognize a specific binding site of the bioindicator and bind to it, can be, for example, monoclonal antibodies, Fab fragments, aptamers, dyes or a construct made up of several of these.
  • the affinity molecules or molecule parts of the probes which each comprise at least two different configurations of an affinity molecule or molecule part, which recognize and bind to at least two binding sites of a bioindicator or two different bioindicators, can for example be bispecific antibodies or aptamers.
  • bioindicators with binding sites for probes and / or catchers are listed by way of example, but not limited thereto. These bioindicators have different epitopes, for example, as binding sites.
  • some affinity molecules or parts of the molecule, in particular antibodies are also listed by way of example, which can bind to the binding sites of the bioindicators, in particular epitopes.
  • the data listed as well data on bioindicators not listed here with their respective binding sites are also known to the person skilled in the art from the literature or product information from manufacturers of, for example, antibodies.
  • bioindicators that are detected with the method according to the invention are listed as examples can be.
  • the binding sites of the bioindicators and the respective suitable affine molecules or molecular parts of the probes and / or scavengers can be determined and produced by methods known to the person skilled in the art.
  • Angiogenesis Factor Panel 1 (ANG-2, FGFb, HB-EGF, HGF, PIGF, VEGF, VEGF- C, PDGFBB), BDNF, Biomarker Panel 1 (ICAM-1, MPO, NGAL, RANTES / CCL5, TIMP-1, VCAM-1), c-MET, C-Peptide, CA 19-9, CA-125, Cathepsin S, CCL-11 / E- otaxin Assay Kit, CEA, Chemokine Panel (IP-10, ITAC, MCP-1, MIP-3b), Chemokine Panel 1 (rat) (MCP-1, MIR-1a, MIP-2, MIP-3a), CorPlex TM Cytokine Panel (IFN-Y, IL-1ß, IL-4, II- 5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-22, TNF o), CRP, CXCL13, cytokines 3-Plex A TNFa, IL-6,
  • FGFb G-CSF, GFAP, GM-CSF, GM-CSF (mouse), HB-EGF, HE4 / WFDC2, HGF, HIV p24, ICAM-1, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ (mouse), IFN- ⁇ (Non-human primate), IFN-y (rate), IFNa, IL-10, IL-10 (mouse), IL-10 (rat), IL-12 p70, IL-12 p70 (mouse), IL-12p40 / IL-23, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17A (mouse), IL-17A / F (mouse), IL-17C, IL-17F (mouse), IL-18, IL-1a , IL-1a (mouse), IL-1 ß, IL-1 ß (mouse), 11-1 ß (non-human primate), IL-1 ß (rate), IL-2 (mouse), IL-2
  • probes with at least two, for example identical, binding sites for one bioindicator a stronger and more specific binding of the probes to the bioindicator can be achieved, which then, for example, a higher stability of the binding compared to a binding with only one binding site on the bioindicator causes, so that, for example, a subsequent stronger washing is possible, as well as a higher specificity of the detection of the bioindicator, since now at least two binding sites must recognize the bioindicator and bind to it.
  • probes with at least two different binding sites for the one bioindicator are also suitable.
  • a catcher which has at least two, preferably identical, specific binding sites for the bioindicator.
  • this multi-specific binding of the catcher to the bioindicator leads to a more stable and specific binding.
  • further process steps can then be carried out, for example, which can be carried out under less gentle conditions for the bound molecules.
  • the detection specificity is also increased here.
  • catchers with at least two different binding sites for the one bioindicator are also suitable.
  • molecules can be used both as probes and as scavengers, each of which binds to the bioindicator via at least two, preferably different, specific binding sites.
  • This configuration enables a further increase in the binding stability and specificity of catcher and probe compared to simple binding of catchers and probes or also compared to bispecific binding of probes or catchers with an identical binding site to the bioindicators.
  • the probe used has at least two different specific binding sites which can be assigned to at least two different bioindicators or which can bind to at least two different bioindicators.
  • at least two different bioindicators can be used in one process step be proven at the same time.
  • the two different bio-indicators are not detected separately from each other, but as a sum of both bio-indicators. This is of interest, for example, if two bioindicators that belong to the same clinical picture are to be detected.
  • capture molecules must then preferably be used, which each have at least two different affine molecules or molecule parts for two different bioindicators, which then each have to the at least two can bind different bioindicators.
  • at least two different bioindicators can be immobilized simultaneously on the substrate with a capture molecule on the substrate and marked with the respective probes, which each specifically bind to one of the bioindicators, for example with a specific binding site, and are detected in one process step.
  • catchers which can bind two different bioindicators at the same time
  • two different catchers can be used, which can then each specifically bind the different bioindicators.
  • both the probes and the catchers used have at least two different binding sites that can bind to at least two different bioindicators.
  • the specificity of the detection of the bioindicators can be increased even further by this embodiment.
  • the detection of at least two different bioindicators in one process step with probes and / or capture molecules that have at least two different binding sites that bind to at least two different bioindicators is referred to as multiplex detection, as explained above.
  • the probes can advantageously contain at least one detection molecule or one part of the molecule which is covalently bound to the molecule or part of the molecule with an affinity for the bioindicators, and preferably by means of fluorescence measurement is detectable and measurable.
  • detection molecules also referred to as direct or indirect reporter molecules, can include, for example, fluorochromes, quantum dots, or fluorescent proteins.
  • the direct reporter molecule is bound directly to the specific binding affine molecule or molecule part of the probe.
  • Indirect reporter molecules have a high affinity for a binding site of a known molecule, which in turn is equipped with one or more fluorochomes. The resulting complex can be used as a probe.
  • An example of a probe with an indirect reporter molecule can be biotin bound to an antibody-streptavidin molecule conjugated with fluorochrome.
  • the group of indirect reporter molecules can include, for example, biotin-streptavidin, complementary DNA strands, DNA and DNA-binding proteins.
  • the probes can have identical affine molecules or molecule parts with different detection molecules (or parts).
  • different affine molecules or molecule parts can be combined with different detection molecules or parts, or alternatively, different affine molecules or parts can be combined with identical detection molecules or parts.
  • the bioindicators can be detected using nanoparticles, in particular using quantum dots (Qdots).
  • Qdots quantum dots
  • these quantum dots are coated with a catcher molecule for the bio-indicator.
  • the capture molecules have affine molecules or molecular parts that bind to at least one specific binding site of the bioindicators.
  • the coated quantum dots are added directly to the sample and bind via the capture molecules specifically the bioindicators in the sample. The advantage here is that the binding can take place very efficiently, since this takes place in solution and can be promoted by mixing / stirring.
  • the sample / quantum dot mixture is applied to a substrate surface, for example a microtiter plate, the surface of which is also coated with a capture molecule which, however, recognizes a different epitope on the bioindicator. Components not bound on the surface are removed by washing. Finally, the surface is microscoped and evaluated using fluorescence microscopy.
  • Another possible variant of the present invention comprises the use of quantum dots which are coated with a capture antibody against the bioindicator.
  • the coated quantum dots are added directly to the sample and bind the bioindicators in the sample.
  • a second antibody is then added, which is labeled with a biotin molecule, for example.
  • Quantum dots and biotinylated antibodies can also be added in the reverse order.
  • the advantage here is that the binding can take place very efficiently, since this takes place in solution and can be promoted by mixing / stirring.
  • the mixture is applied to a microtiter plate, the glass bottom of which is coated with, for example, streptavidin. Components that are not bound to the surface can be removed by washing. Finally, the surface is microscoped and evaluated using fluorescence microscopy.
  • the binding of the bioindicators to the Qdots in their monomeric configuration is favored over their oligomeric configuration, so that preferably the bioindicators can be detected in their monomeric configuration.
  • Qdots Quantum dots
  • Qdots can be purchased on the market.
  • Qdots are small nanoparticles with fluorescent properties. They can comprise nanoparticles with a core-shell material made of, for example, CdSe / ZnS. These can e.g. B. in the range of 2-7 nm. As the diameter increases, the fluorescence can be shifted from blue towards red.
  • carboxy-functionalized Qdots can be used.
  • 0.1 nM QDots Quantum dots
  • a thiol-spacer-acid mixture consists e.g. B. from 550 mM tetramethylammonium hydroxide, 275 mM thiol spacer acid (z. B. 3-mercaptopropionic acid) in z. B. 1 ml of CHC, the resulting aqueous phase being removed.
  • amino-terminated Qdots can be used.
  • 1 mg of dry Qdots are mixed with an amino-spacer-thiol mixture in methanol.
  • This amino-spacer-thiol mixture consists of 100 mg amino-spacer-thiol (e.g. 2,2'-diaminodiethyl disulfide).
  • the mixture is sonicated until the solution absorbs the Qdots. These are centrifuged off and taken up in water. In the aqueous phase there are amino-terminated Qdots.
  • a coupling of monomers or epitopes, generally binding sites for the bioindicators, to the nanoparticles can be carried out.
  • nanoparticles with carboxy termini can be used, which are converted into a reactive NHS ester.
  • the NHS ester is preferably formed with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (for short: EDC) and / or N-hydroxysuccinimide (for short: NHS).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Another variant of the method according to the invention provides for amino-functionalized nanoparticles to react with a maleinimido spacer carboxy, e.g. B. with 6-maleimido-caproic acid or maleimido-PEG (optional length) - COOH.
  • a maleinimido spacer carboxy e.g. B. with 6-maleimido-caproic acid or maleimido-PEG (optional length) - COOH.
  • the above-mentioned NHS ester particles are used to bind streptavidin to the surface of the nanoparticles.
  • the nanoparticles as such, i.e. without the binding site of the bioindicator, are new and thus already solve the problem of the invention: is a particularly preferred starting product with NHS esters on the surface of z.
  • B. Silica Nanoparticles (SINP).
  • Nanoparticles with N-hydroxysuccinimide ester surfaces react, if necessary with elimination of N-hydroxysuccinimide, with the primary amine of the monomer or a synthetic epitope of the bioindicators to be detected.
  • This method is particularly suitable when the amino acid lysine is present one or more times in a peptide sequence of the monomer. This method is particularly suitable when the amino acid is not in the epitope region, i.e. the binding region for antibodies. If there is no lysine, either the N-terminus of the amino acid sequence itself can be used to bind to the Qdot, or the peptide sequences can be used with additionally introduced lysines.
  • Qdots with maleimido groups on the surface react with existing or synthetically introduced thiols (e.g. cysteine) in the protein sequence of the monomer or epitope.
  • existing or synthetically introduced thiols e.g. cysteine
  • Qdots with streptavidin surface bind particularly strongly biotinylated monomers or epitopes.
  • silica dots react with the primary amine of the monomer of the bioindicators to be ironed, optionally with the elimination of N-hydroxysucinimide.
  • Modifications can be carried out easily due to the chemical surface properties.
  • the material of the Qdots is stable in physiological buffer solutions and is considered to be harmless to health.
  • biofunctionalized silica qdots shown above represent stable, precisely size-defined standards with a precisely determinable number of accessible standards
  • Epitopes represent and are therefore also advantageously used as platform technology in diagnostic test procedures or in spiking experiments for the quantitative and qualitative determination of bioindicators.
  • a spatially resolved determination of the probe signal that is to say a spatially resolved detection of the signal which is emitted by the probe. Accordingly, methods based on a non-spatially resolved signal, such as ELISA or sandwich ELISA, are excluded in this embodiment of the invention. Compared to ELISA, the present method is about a thousand times more sensitive, since individual molecules can be counted (digital readout) and not a single integrated signal is generated from a bulk measurement.
  • a high spatial resolution is advantageous for the detection.
  • so many data points are collected that the detection of a bioindicator in front of a background signal, which z. B. caused by device-specific noise, other unspecific signals or unspecifically bound probes is made possible.
  • This way there are so many values read out (read-out values), such as spatially resolved events, such as B. pixels are present.
  • read-out values such as spatially resolved events, such as B. pixels are present.
  • the spatial resolution determines each event against the respective background and thus represents an advantage over ELISA methods without spatially resolved signals.
  • the spatially resolved determination of the probe signal is based on total internal reflection fluorescence microscopy (tirfm) and the examination of a small volume element in the Range from a few femtoliters to below one femtoliters, compared to the volume of the sample of, for example, 10 to 1000 ml, or a volume range above the contact surface of the capture molecules with a height of 500 nm, preferably 300 nm, particularly preferably 250 nm , especially 200 nm.
  • titaniumfm total internal reflection fluorescence microscopy
  • bioindicators are detected which are selected from the group containing or consisting of cells, genes, gene products, proteins, hormones, RNA, enzymes.
  • the material of the substrate is selected from the group containing or consisting of plastic, silicon and silicon dioxide.
  • glass is used as the substrate.
  • the capture molecules are covalently bound to the substrate.
  • a substrate can be used which has a hydrophilic surface.
  • this can be achieved by applying a hydrophilic layer to the substrate before step a).
  • the capture molecules therefore bind, in particular covalently, to the substrate or to the hydrophilic layer with which the substrate is loaded.
  • the hydrophilic layer can be a biomolecule-repellent layer, so that the unspecific binding of biomolecules to the substrate is advantageously minimized.
  • the capture molecules can be immobilized, preferably covalently, on this layer. These are affine towards a characteristic of the bioindicators.
  • the capture molecules can all be identical, or mixtures of different capture molecules can be present.
  • the capture molecules preferably do not include a detection molecule or parts of the molecule which are suitable for detection.
  • the hydrophilic layer can be selected from the group containing or consisting of polyethylene glycol, poly-lysine, preferably poly-D-lysine, and dextran or derivatives thereof, preferably carboxymethyl-dextran (CMD).
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • derivatives are compounds that differ from the parent compounds in some substituents, the substituents being inert to the method according to the invention, i.e. they do not generate a measurement signal which could lead to a falsification of the detection.
  • the surface of the substrate can be functionalized before application of the hydrophilic layer by first hydroxylating the surface and then activating it with amino groups. This activation with amino groups can in an alternative, for example, but not limited to, also take place by bringing the substrate into contact with APTES (3-aminopropyltrietoxysilane) or with ethanolamine.
  • the substrate is brought into contact with APTES in the gas phase; the optionally pretreated substrate is therefore vaporized with APTES.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • the substrate is coated with an aqueous solution of CMD in a concentration of 10 mg / ml or 20 mg / ml and optionally N-ethyl-N- (3-dimethylamine propyl) Car - bodiimid (EDC), (200 mM) and N-hydroxysuccinimide (NHS), (50 mM) incubated and then washed.
  • EDC N-ethyl-N- (3-dimethylamine propyl)
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the carboxymethyl dextran can be covalently bonded to the glass surface, which was first hydroxylated and then functionalized with amino groups.
  • microtiter plates preferably with a glass bottom, can also be used as the substrate. Since the use of concentrated sulfuric acid is not possible when using polystyrene frames, the activation of the glass surface takes place analogously in one embodiment of the invention.
  • catcher molecules can be immobilized, preferably covalently, which have an affinity for a feature of the bioindicator to be detected.
  • This trait can be a protein.
  • the capture molecules can all be identical or mixtures of different capture molecules.
  • the capture molecules, preferably antibodies, are immobilized on the substrate, optionally after activation of the carrier coated with CMD by a mixture of EDC / NHS (200 or 50 mM).
  • the sample to be measured is brought into contact with the substrate prepared in this way and, if necessary, incubated.
  • the body's own fluids or tissue for example, can be used as the sample to be examined.
  • the sample is selected from liquor (CSF), blood, Plasma and urine.
  • CSF liquor
  • Plasma Plasma
  • the samples can go through different preparation steps known to the person skilled in the art.
  • the application of the sample can take place directly on the substrate, for. B. the uncoated substrate, if necessary by covalent bonding. If necessary, the binding takes place on an activated surface of the substrate.
  • the sample can be pretreated according to one or more of the following process steps:
  • Unspecifically bound substances can be removed by washing steps.
  • the immobilized bioindicators can be marked with one or more probes that are useful for further detection.
  • the individual steps can also be carried out according to the invention in a different order.
  • these excess probes need not be removed. This eliminates the need for a washing step and there is also no shift in the equilibrium in the direction of dissociation of the bioindicator-probe complexes or compounds. Due to the spatially resolved detection, the excess probes are not recorded during the evaluation.
  • the binding sites of the bioindicators are epitopes and the capture molecules and / or probes are antibodies and / or antibody parts and / or fragments thereof.
  • probes are used that have at least two different epitopes on the bioindicator with increased Recognize avidity, whereby it should be noted that this is not already occupied by the capture molecules.
  • the capture molecules and the probes differ. So z. B. different antibodies and / or antibody parts and / or fragments can be used as capture molecules and as probes. In a further embodiment of the present invention, different probes are used simultaneously.
  • At least two or more different capture molecules and / or probes are used which, for. B. contain different antibodies and possibly also wear different fluorescent dye markings.
  • the probes are marked in such a way that they emit an optically detectable signal, selected from the group consisting of fluorescence, bioluminescence and chemiluminescence emission and absorption.
  • the probes are preferably labeled with fluorescent dyes.
  • the dyes known to the person skilled in the art can be used as fluorescent dyes.
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • conjugates and / or fusion proteins thereof, as well as quantum dots can be used.
  • capture molecules labeled with fluorescent dyes can be used.
  • a dye is preferably used which does not interfere with the detection of the fluorescent dye of the probe on the bioindicator. This enables a subsequent control of the structure as well as a normalization of the measurement results.
  • the immobilized and marked bioindicators are detected by means of an image of the surface, e.g. B. with laser scanning microscopy.
  • an image of the surface e.g. B. with laser scanning microscopy.
  • Spatial resolution determines a high number of pixels, which can increase the sensitivity and selectivity of the method, since structural features can also be mapped and analyzed.
  • the specific signal increases against the background signal (e.g. unspecifically bound probes).
  • the detection takes place, for example, preferably with spatially resolving fluorescence microscopy through a TIRF microscope, as well as the corresponding super-resolution variants thereof, such as STORM, dSTORM.
  • a laser focus as it is e.g. B. is used in laser scanning microscopy, or an FCS (Fluorescence Correction Spectroscopy System) is used, as well as the corresponding super-resolution variants such as STED, PALM or SIM.
  • FCS Fluorescence Correction Spectroscopy System
  • this information is advantageously multiplied.
  • This multiplication applies to every detection event and leads to a gain in information, since it has additional properties, e.g. B. a second feature disclosed about bioindicators. With such a structure, the specificity of the signal can be increased for each event.
  • the probes can be selected in such a way that the presence of individual bioindicators, such as e.g. B. individual membrane proteins do not influence the measurement result.
  • the probes can be selected in such a way that bioindicators species (phenotypes) can be determined for each individual bioindicator.
  • Additional probes can be selected in such a way that they can differentiate between DNA / RNA-containing bioindicators and thus provide information about the interior of the bioindicators.
  • DNA / RNA-binding fluorophores such as DAPI from Hoechst can be used for this purpose.
  • the spatially resolved information, e.g. B. the fluorescence intensity, all used and detected probes are used to z. B. to determine the number of individual bioindicators, their size and their characteristics.
  • image analysis options include B. the search for local intensity maxima in order to obtain the number of detected bioindicators from the image information and also to be able to determine the particle sizes. Internal and / or external standards can be used to make the test results comparable with one another over distances, times and experimenters.
  • different capture molecules are applied to different areas of the surface of the substrate, such as, for example, a glass or plastic plate with bores for receiving samples (spotted, see FIG. 1).
  • the sample to be examined is then applied and the different bioindicators to be analyzed are immobilized on the respective areas with the aid of the specific capture molecules for the respective different bioindicators.
  • Various probes are used for detection, which specifically recognize the bioindicators to be analyzed and specifically bind to them. These probes can be labeled with the same fluorochrome or with different fluorochromes.
  • the respective areas of the sample plate are read out one after the other (bio-indicator 1, 2, 3, 4, etc.) using fluorescence microscopy.
  • the various bioindicators are then detected in their respective color channels as a function of location or detected in a color channel as a function of location.
  • a mixture of capture molecules is applied to the various areas of the surface of the substrate, such as a glass or plastic plate with holes for receiving samples. Then the sample to be examined with the different bioindicators is applied and the different bioindicators to be analyzed are immobilized on the surface with the aid of the specific catcher molecules for the respective different bioindicators. Various probes that specifically bind to the bioindicators to be analyzed are used for detection. The different probes are each marked with different fluorochromes. Finally, the surface is measured by fluorescence microscopy; the various bioindicators can then be specifically detected in their respective color channels.
  • the present invention also relates to a kit containing one or more of the following components:
  • the monomer of the bioindicator to be examined can preferably be used here as the standard, this monomer preferably being obtained from an organism which has been produced recombinantly or chemically synthesized.
  • the standard must have at least all sequences or structures that are also recognized by the probes and capture molecules used and have an affinity that is as similar as possible, in particular a similar KD value.
  • the compounds and / or components of the kit of the present invention can be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution.
  • some components can be packaged in the same container.
  • one or more of the components could be attached to a solid support, such as e.g. B. a glass plate, a chip or a nylon membrane or on the well of a microtiter plate, be absorbed.
  • the substrate then comprises such a microtiter plate.
  • the kit may also contain instructions for using the kit for any of the embodiments.
  • the capture molecules described above are already immobilized on the substrate.
  • the kit can also contain solutions and / or buffers. To protect the coating and / or the capture molecules immobilized thereon, these can be provided with a layer of a solution or a buffer.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for the detection of bioindicators in any samples for the quantification and thus titer determination of bioindicators.
  • the method can thus also provide evidence of a disease, such as, for. B. cardiovascular, kidney and cancer diseases, provide evidence of an immune response.
  • the method can be used in the development of active ingredients, the direct and absolute quantification of bioindicators, in diagnostics accompanying therapy (target engagement), differential diagnostics, the detection of protein-protein interaction and / or in the typing of bioindicators.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for monitoring therapies with bioindicators and for monitoring and / or checking the effectiveness of active ingredients and / or healing methods.
  • the method can therefore be used in clinical tests, studies and therapy monitoring.
  • samples are measured according to the method according to the invention and the results are compared.
  • Another object of the present invention is the implementation of the method according to the invention for determining the effectiveness of active ingredients against diseased cells.
  • the results are compared with one another based on the characterization of biological indicators in samples.
  • the samples are correspondingly body fluids, taken before or after, or at different times after the administration of the active ingredients or the implementation of the healing process.
  • the results are compared with a control that was not subjected to the active ingredient and / or therapeutic method. Based on the results, active ingredients and / or healing methods are selected.
  • Another object of the present invention is the implementation of the method according to the invention for determining whether a person is included in a clinical study. For this purpose, samples are measured according to the method according to the invention and the decision is made with regard to a limit value.
  • FIG. 1 Sample plate for the simultaneous detection of different bioindicators
  • FIG. 5 Detection of a monomeric protein construct 2ALFA2GFP in different concentrations
  • FIG. 1 shows a sample plate for the simultaneous detection of different biological indicators within an investigation approach.
  • Figure 1 shows a sample plate for the simultaneous detection of different bio indicators within an investigation approach, also called multiplex method, in which the glass surface of the sample plate has four areas, in particular bores or depressions, each of which can be used as a reaction space for the inventive method . This procedure is described in the following as an example.
  • bioindicators are sequentially quantified in a single sample in one test approach.
  • different capture molecules are applied to different areas of the sample plate surface, also referred to as spotted.
  • these are the four differently hatched square areas, in particular bores or depressions in the sample plate.
  • the sample is then applied and the bioindicators to be analyzed are immobilized on the respective area with the help of the specific capture molecules.
  • Various probes that recognize the bioindicators to be analyzed are used for detection. These probes can be labeled with the same fluorochrome or with different fluorochromes.
  • the respective spots are read out one after the other (bio-indicator 1, 2, 3, 4, etc.) using fluorescence microscopy.
  • the various bioindicators are then detected in a location-dependent manner in accordance with their respective color channels or are detected in a location-dependent manner in a color channel.
  • bioindicators are quantified simultaneously in a single sample.
  • a mixture of capture molecules is applied to the areas / bores or depressions of the sample plate provided for this purpose.
  • the sample is then applied to these areas and the bioindicators to be analyzed are immobilized on the surface.
  • Various probes that bind to the bioindicators to be analyzed are used for detection.
  • the different probes are each marked with different fluorochromes.
  • the surface is read out by fluorescence microscopy; the various bioindicators are then detected in their respective color channels.
  • FIG. 2 shows a detection of bioindicators according to the invention using quantum dots (Qdot).
  • Qdots are first coated with a capture molecule (B) for the bio-indicator (A).
  • the Qdots coated with the capture molecules (B) are added directly to the sample in step 1 and specifically bind the bioindicator (A). After an incubation, in step 2 the bioindicator
  • sample plate for example a microtiter plate.
  • the surface of the sample plate (C) is covered with capture molecules (B), which, however, recognize a different binding site on the bio-indicator (A). Components not bound on the surface of the sample plate (C) are removed by washing.
  • the surface (C) is then evaluated with the aid of, for example, fluorescence microscopy, which detects the fluorescent Qdots bound on the surface of the sample plate (C).
  • FIG. 3 shows a detection according to the invention of bioindicators (A) using quantum dots (Qdots) which are coated with a capture molecule (B) for the bioindicator (A).
  • Qdots quantum dots
  • B capture molecule
  • the coated Qdots are added directly to the sample in step 1 and specifically bind the bioindicator (A) from the sample.
  • a second capture molecule (B) is added, which is marked with a biotin molecule (D).
  • the addition of Qdots and biotinylated capture antibodies (B-D) can also be done in reverse order.
  • this mixture of bound bioindicator Qdots is applied in step 3 to the surface of a sample plate (C), for example a microtiter plate.
  • C sample plate
  • the surface of the sample plate (C) is coated with streptavidin (E). Components not bound on the surface of the sample plate (C) are removed by washing. The surface (C) is then evaluated with the aid of, for example, fluorescence microscopy, which detects the fluorescent Qdots bound on the surface of the sample plate (C).
  • FIG. 4 shows a detection of streptavidin in different concentrations.
  • the different streptavidin concentrations are plotted on the abscissa (X-axis), given both as femtomolar (fM) to picomolar (pM) information (upper row of numbers) and in corresponding mg / ml (lower row of numbers).
  • the numerical values of the detection signal from the TIRF microscope are indicated on the ordinate (Y-axis). The numerical values indicate the number of pixels detected.
  • streptavidin can be detected in a decadal dilution series up to 1 femtomolar (fM) or 5 * 10 ⁇ 11 mg / ml.
  • TBS saline tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • RK reaction chambers
  • the surface of the microtiter plate was built up or functionalized.
  • 40 ⁇ l of 1% bovine serum albumin (BSA, Applich) in phosphate-buffered saline solution (PBS, Sigma Aldrich) were placed in the back of the microtiter plate and incubated at 4 ° C. overnight.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate-buffered saline solution
  • the microtiter plate with the reaction chambers (RK) was washed three times with PBS. This was followed by the addition of 20 ⁇ l of 1 mM EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoScientific) as a catcher molecule and an incubation for 30 min at room temperature (RT) for each RK.
  • the RK of the microtiter plate was blocked with 40 ml of 1% BSA in PBS, incubated for 1 h at room temperature and then five times with saline tris (hydroxymethyl) aminomethane (TBS, Serva) with 0.05% Tween -20 (App harsh) (TBS-T) and washed five times with saline tris (hydroxymethyl) aminomethane (TBS).
  • TBS saline tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • TBS-T 0.05% Tween -20
  • TBS-T washed five times with saline tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • the RCs were washed five times with TBS, 70 ml of TBS with 0.03% ProClin (SigmaAldrich) per RC to prevent bacterial growth, and sealed with a film. Since the sample itself is fluorescently marked, it can be detected directly.
  • the sample can be distinguished from the negative control up to a concentration of at least 1 fM or 5 * 10 11 mg / ml.
  • This exemplary embodiment shows that the disadvantages of other methods, such as, for example, the low dynamic measuring range and maximum sensitivity only up to the picomolar range, can be overcome with the method according to the invention.
  • the values of this exemplary embodiment show a dynamic measuring range over 6 log levels and a sensitivity in the femtomolar range.
  • FIG. 5 A and B show a detection of the monomeric protein construct 2ALFA2GFP in different concentrations, namely in a dilution series from 10 pM or 6 * 10 7 mg / ml to 100 fM or 6 * 10 9 mg / ml.
  • the different protein concentrations of 2ALFA2GFP are plotted on the abscissa (X-axis), given both as femtomolar (fM) to picomolar (pM) information (upper row of numbers) and in the corresponding mg / ml (lower row of numbers).
  • the numerical values of the detection signal from the TIRF microscope are indicated on the ordinate (Y-axis). The numerical values indicate the number of pixels detected.
  • the monomeric protein construct 2ALFA2GFP which consists of two ALFA protein parts [11] and two GFP proteins (green fluorescent protein), was used as an example of the detection of a bioindicator.
  • This construct was diluted in a dilution series from 10 picomolar (pM) to 100 femtomolar (fM) in saline tris (hydroxymethyl) aminomethane (TBS) at pH 7.4.
  • the TBS dilution buffer was used as a negative control (0).
  • the ALFA tag and the GFP protein were selected for this protein construct because they bind to their respective single domain antibodies with an affinity in the pi comolar region.
  • the anti-GFP single domain antibody (GFP VHH, recombinant binding protein, gt-250, chromotek) was used as a catcher molecule in a concentration of 5 pg / ml, which was diluted in TBS. 40 ⁇ l of this solution were placed in each of the reaction chambers (RK) and incubated at 4 ° C. overnight. After the incubation, the reaction chambers (RK) were washed five times with TBS-T and five times with TBS. The reaction chambers (RK) were then each blocked with 80 ⁇ l of 1% BSA in TBS, incubated for 1 h at room temperature (RT) and then washed again five times with TBS-T and five times with TBS.
  • RT room temperature
  • the sample (protein construct 2ALFA2GFP) was sequentially diluted in TBS and applied in four copies of 20 ml of sample to the reaction chambers (RK) and incubated at 4 ° C. overnight. After the incubation, the reaction chambers (RK) were washed five times with TBS. This was followed by the addition of the anti-ALFA-CF647 probe (20 ml) and incubation at RT for 1 h. The reaction chambers (RK) were then washed five times with TBS, 80 ml of TBS with 0.03% ProClin (SigmaAldrich) were added to prevent bacterial growth and sealed with a film.
  • Intensity thresholds were set for each channel at 0.001% gray levels of the mean negative control. The number of pixels was then averaged over all images in each reaction chamber and then the mean values of the mean number of pixels of the replica values were determined and the standard deviation indicated. The values are shown in FIG. In FIG. 5 A, the monomeric protein is detected directly via the fluorescence of GFP in channel 488; in FIG. 5 B, the protein is detected in channel 633 via the anti-ALFA-AF647 probe. The detection of the protein via the probe is comparable to the direct detection of the protein via the fluorescent GFP component in its monomeric form. This comparison shows the sensitivity of the method.
  • the results show a linear relationship between the concentration of the protein construct used and the measurement signal.
  • the method according to the invention is suitable for detecting the protein construct in its monomeric configuration up to a concentration of 100 fM or 6 * 10 -9 mg / ml and for distinguishing it from the negative control.
  • the values of this exemplary embodiment show a dynamic measuring range over 3 log levels and a sensitivity in the femtomolar range.
  • This exemplary embodiment also shows that the disadvantages of other methods, such as the low dynamic measuring range and maximum sensitivity only up to the picomolar range, can be overcome with the method according to the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis Bioindikatoren in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a) Aufbringen der Probe enthaltend Bioindikatoren auf ein Substrat, b) Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch spezifische Bindung an die Bioindikatoren diese markieren und c) Nachweis der Bioindikatoren durch Messen eines spezifischen Signals der Sonde, wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis einer Erkrankung oder der Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren sowie ein Kit zum Nachweis von Bioindikatoren in einer Probe.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren, Verwendung des Verfahrens sowie Kit zum Nachweis von Bioindikatoren in einer Probe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie ein Kit zum Nachweis von Bioindikatoren in einer Probe, sowie die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis einer Erkrankung oder der Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren.
Stand der Technik
Gegenwärtig werden Bioindikatoren wie beispielsweise Proteine, Viren, Hormone, Toxine oder Pestizide standardmäßig mit ELISA-ähnlichen Verfahren nachgewiesen. Ist eine besonders niedrige Konzentration des Bioindikators gegeben, kann das sogenannte SIMOA-Verfahren eingesetzt werden.
ELISA-Verfahren:
Mit Hilfe des ELISA können Proteine (z. B. Antikörper) und Viren, aber auch nieder molekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zunutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Ein Antikörper wird zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Reporterenzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Das sog. Substrat wird vom Enzym umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag, eventuell auch durch Chemolumineszenz nachgewiesen wer den. Die Signalstärke ist eine mit einem Photometer sehr genau bestimmbare Funk tion der Antigenkonzentration, so dass ELISA für Mehrfachmessungen ausgeführt und auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann. Als Reporterenzyme werden meistens die Meerrettichperoxidase (HRP, von engl horseradish peroxi- dase), die Alkalische Phosphatase (AP) oder seltener auch die Glucose-Oxidase (GOD) verwendet. Im Falle der Alkalischen Phosphatase wird als Farbstoffsubstrat (synonym: Chromogen) z. B. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) zugegeben, während bei der Peroxidase meistens o-Phenylendiamin (oPD) verwendet wird. Die alkalische Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom farblosen Nitrophenylphosphat ab und es entsteht p-Nitrophenol, welches schwach gelb ist. Die Konzentrationsänderung des durch die enzymatische Reaktion entstandenen Farbstoffs kann nach dem Lam- bert-Beer‘schen Gesetz mit einem Photometer verfolgt werden. Die Intensität der Farbe steigt dabei mit der Konzentration des entstandenen Nitrophenols und damit auch der Konzentration des zu bestimmenden Antigens in der Probe im Vergleich mit einer Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen (Standardreihe).
SIMOA-Verfahren:
Der SIMOA Analyzer kombiniert die Einzelmolekülanalyse mit digitaler ELISA- Anzeige. Analyte werden in Lösung von antikörperbeladenen Kügelchen anstelle von Target-Antikörper-Interaktion an einer Antikörper-immobilisierten Festphase eingefangen. Perlen - mit Target beladen oder nicht - werden in Mikrokavitäten mit Femto- litergröße eingefangen und liefern ein digitales Signal (ein / aus) zur Analyse.
Der entscheidende Nachteil der Verfahren nach dem Stand der Technik liegt darin begründet, dass zum einen große Probenmengen benötigt werden, um eine Detektion durchführen zu können. Zum anderen verfügen die Verfahren nur über einen geringen dynamischen Messbereich. Die bisher bekannten Verfahren können nur eine maximale Sensitivität im picomolaren Bereich erzielen. SIMOA hat weiterhin den Nachteil, dass spezielle Reagenzien (Beads) zum Nachweis erforderlich sind und technisch aufwendige Apparaturen benötigt werden. Weiterhin ist mit SIMOA nur ein indirekter Nachweis des Analyten durch enzymatische Sekundärreaktionen möglich, wodurch viele Einflussgrößen zu einer Verfälschung der Messergebnisse führen kön nen.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein alternatives Verfahren zum Nachweis für Bioindikatoren bereit zu stellen, mit dem insbesondere die Nachteile des Stands der Technik überwunden werden können.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kit zur Durchführung des alternativen Verfahrens zum Nachweis für Bioindikatoren bereit zu stellen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis einer Erkrankung oder der Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren. Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren des Hauptanspruchs, dem Kit nach dem Nebenanspruch sowie der Verwendung des Verfahrens gemäß Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Bioindikatoren, umfassend folgende Schritte: a) Immobilisieren von Fängermolekülen für die Bioindikatoren auf einem Substrat, b) In-Kontaktbringen der Bioindikatoren einer Probe mit den Fängermolekülen, c) Immobilisieren der Bioindikatoren auf dem Substrat durch Bindung an Fängermoleküle, d) In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit Sonden, die mindestens ein Detektionsmolekül enthalten, und e) Entfernen von nicht spezifisch gebundenen Molekülen und Partikeln z. B. durch Waschen, f) Binden der Sonden an die Bioindikatoren, wobei die Sonden in der Lage sind, ein spezifisches Detektionssignal zu emittieren und die Schritte b) und d) gleichzeitig oder d) vor b) erfolgen können und wobei Sonden und Fängermoleküle eingesetzt werden, die affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen, die an wenigstens eine spezifische Bindungsstelle der Bioindikatoren binden und diese affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und Fänger nicht untereinander überlappen.
Auch die Schritte c) und f) können vorteilhaft gleichzeitig durchgeführt werden.
In der weiteren Variante des Verfahrens, in welchem die Bioindikatoren mit den Sonden in Kontakt gebracht werden, bevor diese mit den Fängermolekülen in Kontakt gebracht werden, kann eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Bioindikatoren auf dem Substrat erfolgen. Mithin können die Sonden an die Bioindikatoren gebunden werden, bevor die Bioindikatoren mit den Fängermolekülen in Kontakt gebracht werden und an das Substrat immobilisiert werden.
Damit ist die Aufgabe der Erfindung gelöst.
Im Rahmen der Erfindung werden unter der Bezeichnung Bioindikator zum einen Substanzen und Moleküle verstanden, deren Konzentration abhängig ist vom Zustand eines Organismus. Die Über- oder Unterschreitung eines Konzentrationsgrenzwertes des Bioindikators erlaubt dabei Rückschlüsse auf eine Zustandsänderung des Organismus (z.B.: Erkrankung, Heilung). Zu den Substanzen und Molekülen können beispielhaft Zellen, Gene, Genprodukte, Proteine, Hormone, DNA, RNA oder auch Enzyme genannt werden. Zum anderen wird unter der Bezeichnung Bioindikator auch eine Substanz oder ein Molekül verstanden, das in Grenzwert-überschreiten- den-Konzentrationen den Zustand eines Organismus verändern kann. Hierzu können beispielhaft Hormone genannt werden.
Eine weitere Klasse von Bioindikatoren, die den Zustand eines Organismus beschrei ben sind Metaboliten. Diese sind bereits von körpereigenen Enzymen veränderte Proteine oder kleine organischen Moleküle. Die Veränderung am Metabolit kann direkte Rückschlüsse auf bestimmte Erkrankungen erlauben.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) eine Immobilisierung von Fängermolekülen für die Bioindikatoren auf dem Substrat erfolgt.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung und des erfindungsgemäßen Verfahrens können durch In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit Fängermolekülen diese auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle immobilisiert werden.
In einerweiteren Ausgestaltung der Erfindung und des erfindungsgemäßen Verfahrens können nach dem In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Sonden nicht spezifisch gebundene Moleküle und Partikel beispielsweise durch Waschen entfernt werden. Es können vorteilhaft Sonden gewählt werden, welche an die Bioindikatoren binden, wobei die Sonden, z. B. auch erst nach der Bindung, in der Lage sein können, ein spezifisches Detektionssignal zu emittieren.
Das In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Fängermolekülen und den Sonden kann gleichzeitig erfolgen.
Das In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Sonden kann auch vor dem In- Kontaktbringen mit den Fängermolekülen erfolgen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es weiterhin, die Bioindikatoren vorzugsweise in ihrer monomeren Ausgestaltung nachzuweisen. Die Sonden und/oder Fängermoleküle weisen affine Moleküle oder Molekülteile auf, welche spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren erkennen und an diese binden. Um die Bioindikatoren in ihrer monomeren Ausgestaltung nachweisen zu können, sollten diese affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und Fängermoleküle an unterschiedliche, spezifische Bin dungsstellen der Bioindikatoren binden, so dass die Sonden und Fänger eine gerichtete spezifische Bindung an die Bioindikatoren aufbauen. Dazu sollten diese jeweiligen spezifischen affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und Fänger vorzugsweise nicht überlappen. Die Bindungsstelle der Bioindikatoren für die Sonden und die Fänger sollte sich daher in ihrer Peptidsequenz um wenigstens 5 Aminosäuren unterscheiden.
Mit dem vorliegenden Verfahren gelingt der Nachweis der Bioindikatoren in beliebigen Proben und in einem geringen Konzentrationsbereich dieser Bioindikatoren in einer Probe, vorzugsweise in einem Bereich, der im femtomolaren oder sogar auch im sub-femtomolaren Bereich liegen kann. Es kann mithin auch ein Einzelnachweis erfolgen, ohne die Probe aufwändig reinigen zu müssen.
Außerdem kann das Verfahren vorteilhaft einen qualitativen Nachweis von Bioindikatoren und/oder auch eine Quantifizierung und Charakterisierung in beliebigen Proben ermöglichen. Dadurch wird einerseits eine direkte und absolute Quantifizierung der Anzahl an Bioindikatoren und andererseits eine Charakterisierung der Größenverteilung von Bioindikatoren vorteilhaft gewährleistet. Mit dem Verfahren kann weiterhin auch ein semi-quantitativer Nachweis von Bioindikatoren erfolgen, wenn die Konzentration des Bioindikators im Vergleich zum Referenzzustand unterhalb oder oberhalb eines vorher jeweils bestimmten Grenzwerts liegt.
Der Nachweis der Bioindikatoren erfolgt mit einfachen Schritten unmittelbar an beliebigen Proben. Mit dem Begriff „beliebiger Probe“ sind auch Puffer mit unterschiedlichen Zusätzen oder Kulturmedien gemeint. Außerdem kann die Probe ex vivo aus Körperflüssigkeiten entnommen sein bzw. eine solche sein. Es können Proben aus der Umwelt, wie z. B. Wasser-, Pflanzen- und Bodenproben, sowie Lebensmittel direkt untersucht werden und die Bioindikatoren nachgewiesen werden.
In einer weiteren Variante des Verfahrens kann auch eine direkte Immobilisierung der Bioindikatoren ohne Fängermoleküle auf dem Substrat erfolgen. In dieser Verfahrensvariante sollte die Probe mit den Bioindikatoren zunächst vorbehandelt werden, so dass der zu untersuchende Biomarker, beispielsweise durch eine Immunpräzipitation, aus der Probe abgetrennt wurde und homogen vorliegt.
In einer anderen möglichen Variante des Verfahrens, wird die Probe mit den Bioindikatoren nach dem In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Sonden chemisch fixiert, z. B. durch Formaldehyd.
Optional kann die Probe nach oder während oder vor dem Binden der Sonden an die Bioindikatoren zusätzlich mit DNA und RNA bindenden Sonden versetzt werden.
In einer Ausgestaltung der Erfindung kann nach der chemischen Fixierung ein Deter- genz eingesetzt werden, um gegebenenfalls die Membran eines Bioindikators durchlässig zu machen und dadurch beispielsweise während des Bindens der Sonden an die Bioindikatoren, Sonden ins Innere der Bioindikatoren Vordringen zu lassen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die „quantitative Bestimmung“ zunächst die Bestimmung der Konzentration der Bioindikatoren, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und oder -Abwesenheit.
Bevorzugt bedeutet die quantitative Bestimmung auch die selektive Quantifizierung bestimmter Typen von Bioindikatoren. Eine solche Quantifizierung kann über die entsprechenden spezifischen Sonden nachgewiesen werden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die „qualitative Bestimmung“ die Charakterisierung der Bioindikatoren.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass jeweils die affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fängermoleküle an wenigstens zwei, oder mehr, spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren binden, wobei auch hier wieder diese jeweiligen spezifischen affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und Fänger vorzugsweise nicht überlappen.
In einer weiter möglichen Ausgestaltung des Verfahrens können diese jeweiligen affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fängermoleküle an wenigstens zwei, oder mehr, spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren binden, wobei diese jeweiligen affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fängermoleküle dabei zum einen an wenigstens zwei oder mehr identische oder unterschiedliche Bindungsstellen eines Bioindikators derselben Sorte binden können und/oder zum anderen an wenigstens zwei, oder mehr, unterschiedliche Bindungsstellen von wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren binden können.
Dies hat zum einen die vorteilhafte Wirkung, dass, insbesondere bei wenigstens zwei oder mehr identischen Bindungsstellen an einen Bioindikator, die Spezifität und Stabilität der Bindung der Fänger und/oder Sonden an den Bioindikator erhöht wird.
Bei der möglichen Ausgestaltung von wenigstens zwei oder mehr unterschiedlichen Bindungsstellen, die an wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren binden, besteht die vorteilhafte Wirkung insbesondere darin, dass beispielsweise auch zwei unterschiedliche Bioindikatoren gleichzeitig in einem Verfahrensschritt oder Messprozess nachgewiesen werden können. Dieser besondere Nachweis wird im Folgenden auch als „Multiplex“-Nachweis bezeichnet. Die Auswertung der Signale im Multiplex- Nachweis für die beiden unterschiedlichen Bioindikatoren kann dann beispielsweise über zwei separate Auswertekanäle für die Sondensignale, insbesondere unterschiedliche Fluoreszenz-Kanäle, erfolgen. Es ist jedoch auch möglich die beiden Bioindikatoren mit Hilfe eines gemeinsamen Auswertesignals nachzuweisen, wenn für beide Bioindikatoren ein Summenwert als Auswerteergebnis gewünscht oder ausrei- chend ist. Dies kann beispielsweise dann von Interesse sein, wenn zwei Bioindikatoren nachgewiesen werden sollen, die zu einer gemeinsamen Kategorie gehören, wie beispielsweise zu einem Krankenbild, bei dem diese Bioindikatoren gemeinsam auf- treten.
Die Bioindikatoren können mit einer oder mehreren für die Detektion dienlichen und/oder spezifischen Sonden markiert werden. Dabei können in einer Ausführung des Verfahrens beispielsweise Sonden eingesetzt werden, die wenigstens eine spe zifische Ausgestaltung eines affinen Moleküls oder Molekülteils umfassen, welche dann wenigstens eine Sorte einer spezifischen Bindungsstelle eines Bioindikators erkennen und daran binden können, wobei diese affinen Moleküle oder Molekülteile wie schon zuvor erläutert nicht mit den affinen Molekülen oder Molekülteilen der Fänger überlappen sollten.
In einer anderen Ausführung des Verfahrens können Sonden eingesetzt werden, die wenigstens zwei oder mehr gleiche oder unterschiedliche Ausgestaltungen affiner Moleküle oder Molekülteile umfassen, welche wenigstens zwei unterschiedliche oder gleiche Bindungsstellen eines Bioindikators einer Sorte erkennen und daran binden können.
Die affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden, welche jeweils eine spezifische Bindungsstelle des Bioindikators erkennen und daran binden, können beispielsweise monoklonale Antikörper, Fab-Fragmente, Aptamere, Farbstoffe oder ein Konstrukt aus mehreren dieser sein.
Die affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden, welche jeweils wenigstens zwei unterschiedliche Ausgestaltungen eines affinen Moleküls oder Molekülteils umfassen, welche wenigstens zwei Bindungsstellen eines Bioindikators oder zweier unterschiedlicher Bioindikatoren erkennen und daran binden, können beispielsweise bispezifische Antikörper oder Aptamere sein.
In der folgenden Tabelle 1 werden beispielhaft, jedoch nicht darauf beschränkt, einige mögliche Bioindikatoren mit Bindungsstellen für Sonden und/oder Fängern aufgelistet. Diese Bioindikatoren weisen als Bindungsstellen beispielsweise unterschiedliche Epitope auf. In der Tabelle sind weiterhin beispielhaft einige affine Moleküle o- der Molekülteile, insbesondere Antikörper, aufgeführt, die an die Bindungsstellen der Bioindikatoren, insbesondere Epitope binden können. Die aufgeführten Daten sowie auch Daten zu hier nicht aufgeführten Bioindikatoren mit ihren jeweiligen Bindungsstellen sind dem Fachmann aus der Literatur oder Produktinformationen von Herstellern von beispielsweise Antikörpern bekannt.
Tabelle 1:
*: Aminosäuren Nummer basierend auf der jeweiligen Aminosäurensequenz des Bio-
Indikators
Quellen/ Verweise zur Tabelle 1 :
1) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-alpha-synuclein~103-108-antibody- 11222 1a) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-alpha-synuclein-antibody-11220
2) https://absoluteantibodv.com/product/anti-anaioaenin-26-2f/Ab00400-1.4 Mouse laG1/: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7514035/ 3) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-11228 3a) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-beta-amyloid--1-40-antibody-11230
4) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-11228 4a) https://www.biolegend.com/en-us/products/purified-anti-beta-amyloid-1-42-antibody-11231 5) https://europepmc.org/article/med/8544854
5a) https://absoluteantibodv.com/product/anti-il-2r-alpha-cd25-basiliximab/: https://pub- med.ncbi.nlm.nih.gov/17440057/
6) https://www.thermofisher.com/antibodv/product/Tau-Antibodv-clone-TAU-5-
Monoclonal/AHB0042: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17499212/ 6a) https://www.thermofisher.com/antibodv/product/Phospho-Tau-Thr181-Antibodv-clone-AT270-
Monoclonal/MN1050: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7519852/
7) https://www.thermofisher.com/antibody/product/Tau-Antibody-clone-TAU-5- Monoclonal/AH B0042
7a) https://www.thermofisher.com/antibodv/product/Phospho-Tau-Thr231-Antibodv-clone-AT 180- Monoclonal/MN1040: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21871442/
8) https://www.thermofisher.com/antibody/product/Tau-Antibody-clone-TAU-5- Monoclonal/AHB0042
8a) https://www.biovision.com/tau-13-antibodv-clone-b11e8.html: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4983528/ 9) https://www.nature.com/articles/s41598-018-24463-3
9a) https://www.ptalab.com/Products/TARDBP-Antibodv-60019-2-lq.htm: https://pub- med.ncbi.nlm.nih.gov/22133678/: https://www.scbt.eom/p/tardbp-antibody-h-8
10) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7590909/
10a) https://www.novusbio.com/products/cd30-tnfrsf8-antibody-3b10_nbp2 -22206 Im Folgenden werden beispielhaft weitere, jedoch nicht darauf beschränkt, mögliche Bioindikatoren aufgelistet, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können. Die Bindungsstellen der Bioindikatoren und die jeweils dazu geeigneten affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fänger, können durch dem Fachmann bekannte Verfahren ermittelt und hergestellt werden.
Bioindikatoren:
Angiogenesis Factor Panel 1 (ANG-2, FGFb, HB-EGF, HGF, PIGF, VEGF, VEGF- C, PDGFBB), BDNF, Biomarker Panel 1 (ICAM-1 , MPO, NGAL, RANTES/CCL5, TIMP-1, VCAM-1), c-MET, C-Peptide, CA 19-9, CA-125, Cathepsin S, CCL-11/ E- otaxin Assay Kit, CEA, Chemokine Panel (IP-10, ITAC, MCP-1 , MIP-3b), Chemo- kine Panel 1 (Ratte) (MCP-1, MIR-1a, MIP-2, MIP-3a), CorPlex™ Cytokine Panel (IFN-Y, IL-1ß, IL-4, II-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-22, TNF o), CRP, CXCL13, Cytokine 3-Plex A TNFa, IL-6, IL-10 (C3PA), Cytokine 3-Plex B TNFa, IL-6, IL-17A (C3PB), Cytokine Panel 1 (Maus) (IFN-g, IL-1ß, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, TNF-a), Cytokine Panel 1 (nicht menschlicher Primat) (IFN-g, IL-1 ß, IL-6, IL-8, TNF-a), Cytokine Panel 1 (Ratte) (IFN-y, IL-1ß, IL-2, IL-6, IL-10, KC, TNF-a),
FGFb, G-CSF, GFAP, GM-CSF, GM-CSF (Maus), HB-EGF, HE4/ WFDC2, HGF, HIV p24, ICAM-1 , IFN-y, IFN-y (Maus), IFN-y (Nicht menschlicher Primat), IFN-y (Rate), IFNa, IL-10, IL-10 (Maus), IL-10 (Ratte), IL-12 p70, IL-12 p70 (Maus), IL- 12p40/IL-23, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17A (Maus), IL-17A/F (Maus), IL-17C, IL-17F (Maus), IL-18, IL-1a, IL-1a (Maus), IL-1 ß, IL-1 ß (Maus), 11-1 ß (Nicht menschlicher Primat), IL-1 ß (Rate), IL-2 (Maus), IL-2 (Rate), IL-22 (Maus), IL-22 (Total), IL-23, IL-23 (Maus), IL-28A, IL-3, IL-33, IL-36ß, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6 (Maus), IL-6 (nicht menschlicher Primat), IL-6 (Rate), IL-7, IL-8, IL-8 (nicht menschlicher Primat), IP- 10, ITAC, KC (Ratte), Leptin, LIF, MCP-1, MCP-1 (Rate), MCP-3, MIP-1a, MIP-1ß, MIP-2 (Ratte), MIP-3a (Ratte), MIP-3ß, MMP Panel (MMP-3, MMP-9), MMP-3, MMP-9, MPO, Neuro 4-Plex B, Neurology 2-Plex A (Tau, Aß42), Neurology 3-Plex A (Tau, Aß42, Aß40), Neurology 4-Plex A (NF-Iight®, Tau, GFAP*, UCHL-1*), NF- light®, NF-Iight® Advantage Kit (SR-X), NGAL, NSE, NT-proBNP, PD-1, PD-L1, Platelet-derived growth factor BB, PIGF, pNF-Heavy, PSA, RANTES/CCL5, Tau (Maus), TGFa, TGFß, TIMP-1 , TNFa (Maus), TNFa (nicht menschlicher Primat), TNFa (Rate), TNFß, TRAIL, Troponin-I, UCH-L1 , VCAM-1 , VEGF, VEGF-C. Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Sonden mit wenigstens zwei, beispielsweise identischen Bindungsstellen für den einen Bioindikator, kann eine stärkere und spezi fischere Bindung der Sonden an den Bioindikator erreicht werden, welches dann beispielsweise eine höhere Stabilität der Bindung gegenüber einer Bindung mit nur einer Bindungsstelle am Bioindikator hervorruft, so dass beispielsweise eine anschließende stärkere Waschung möglich wird, sowie auch eine höhere Spezifität des Nachweises des Bioindikators, da nunmehr gleich wenigstens zwei Bindungsstellen den Bioindikator erkennen und an ihn binden müssen. Sonden mit wenigstens zwei unterschiedlichen Bindungsstellen für den einen Bioindikator sind jedoch ebenfalls geeignet.
In einer weiteren möglichen Ausgestaltung des Verfahrens wird ein Fänger eingesetzt, der wenigstens zwei, vorzugsweise identische, spezifische Bindungsstellen für den Bioindikator aufweist. Wie schon zuvor bei der Sonde mit wenigstens zwei identischen Bindungsstelle beschrieben, führt diese mehrspezifische Bindung des Fängers an den Bioindikator zu einer stabileren und spezifischeren Bindung. Für das Verfahren können dann beispielsweise weitere Verfahrensschritte vorgenommen werden, die unter weniger schonenden Bedingungen für die gebundenen Moleküle durchgeführt werden können. Weiterhin wird auch hier die Nachweisspezifität erhöht. Fänger mit wenigstens zwei unterschiedlichen Bindungsstellen für den einen Bioindikator sind jedoch ebenfalls geeignet.
In einer anderen Ausgestaltung des Verfahrens können sowohl als Sonden als auch als Fänger, Moleküle eingesetzt werden, die über jeweils wenigstens zwei, vorzugs weise unterschiedliche, spezifische Bindungsstellen an den Bioindikator binden. Durch diese Ausgestaltung kann eine weitere Erhöhung der Bindungsstabilität und Spezifität von Fänger und Sonde gegenüber einer einfachen Bindung der Fänger und Sonden oder auch gegenüber einer bispezifischen Bindung von Sonden oder Fängern mit identischer Bindungsstelle an die Bioindikatoren erreicht werden.
In einer weiter möglichen Ausgestaltung des Verfahrens weist die eingesetzte Sonde wenigstens zwei unterschiedliche spezifische Bindungsstellen auf, die wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren zugeordnet werden können bzw. an wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren binden können. Mit Hilfe dieser Sonde können so, in einem Verfahrensschritt, wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren gleichzeitig nachgewiesen werden. Die beiden unterschiedlichen Bioindikatoren werden dabei nicht separat voneinander nachgewiesen, sondern als Summenwert beider Bioindikatoren. Dies ist beispielsweise dann von Interesse, wenn zwei Bioindikatoren, die zum selben Krankheitsbild gehören, nachgewiesen werden sollen. In Kombination zu diesen Sonden, mit den wenigstens zwei unterschiedlichen spezifischen Bindungsstellen, für die wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren, müssen dann vorzugsweise Fängermoleküle eingesetzt werden, welche jeweils wenigstens zwei unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile für zwei unterschiedliche Bioindikatoren aufweisen, welche jeweils dann an die wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren binden können. Dadurch können auf dem Substrat mit einem Fängermolekül wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren gleichzeitig auf dem Substrat immobilisiert werden und mit den jeweiligen Sonden, die jeweils spezifisch, mit beispielsweise einer spezifischen Bindungsstelle an jeweils einen der Bioindikatoren binden, markiert und in einem Verfahrensschritt nachgewiesen werden.
Alternativ zu den Fängern, die gleichzeitig zwei unterschiedliche Bioindikatoren binden können, können auch zwei unterschiedliche Fänger eingesetzt werden, die dann jeweils spezifisch die unterschiedlichen Bioindikatoren binden können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens weisen sowohl die Sonden als auch die eingesetzten Fänger wenigstens zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf, die an wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren binden können. Gegenüber der Ausgestaltung, bei der entweder die Sonden oder die Fänger wenigstens zwei unterschiedliche Bindungsstellen für wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren aufweisen, kann durch diese Ausgestaltung die Spezifität des Nachweises der Bioindikatoren noch weiter erhöht werden.
Der Nachweis von wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren in einem Verfahrensschritt mit Sonden und/oder Fängermolekülen, die wenigstens zwei unterschiedliche Bindungsstellen aufweisen, die an wenigstens zwei unterschiedliche Bioindikatoren binden, wird wie schon zuvor erläutert, als Multiplex-Nachweis bezeichnet.
Die Sonden können vorteilhaft darüber hinaus mindestens ein Detektionsmolekül o- der ein Molekülteil enthalten, welches an das für die Bioindikatoren affine Molekül o- der Molekülteil kovalent gebunden ist und vorzugsweise mittels Fluoreszenzmessung detektierbar und messbar ist. Diese Detektionsmoleküle, auch als direkte oder indi rekte Reportermoleküle bezeichnet, können beispielsweise Fluorochrome, Quantumdots, oder fluoreszierende Proteine umfassen. Das direkte Reportermolekül ist direkt an das spezifisch bindende affine Molekül oder Molekülteil der Sonde gebunden. Indirekte Reportermoleküle weisen eine hohe Affinität für eine Bindungsstelle eines bekannten Moleküls auf, welches seinerseits mit einem oder mehreren Fluorochomen ausgestattet ist. Der dabei entstehende Komplex kann als Sonde eingesetzt werden. Ein Beispiel für eine Sonde mit einem indirekten Reportermolekül kann Biotin gebunden an einen Antikörper-Streptavidin Molekül konjugiert mit Fluorochrom sein. Die Gruppe der indirekten Reportermoleküle kann beispielsweise Biotin-Streptavidin, komplementäre DNA Stränge, DNA und DNA bindende Proteine umfassen.
Die Sonden können in einer Ausgestaltung der Erfindung identische affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen (oder Teile) aufweisen.
In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekül teile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alternativ, unterschiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein.
Es können auch Mischungen verschiedener Sonden eingesetzt werden.
Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden, die an unterschiedliche Detektionsmoleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum einen die Spezifität des Sig nals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Bioindikatoren, die sich in einem oder mehreren Merkmalen unterscheiden. Dies kann eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Bioindikatoren ermöglichen.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis der Bioindikatoren unter Verwendung von Nanopartikel, insbesondere unter Verwendung von Quantumdots (Qdots), erfolgen. Diese Quantumdots werden dazu mit einem Fängermolekül für den Bioindikator beschichtet. Die Fängermoleküle weisen dabei, wie schon zuvor beschrieben, affine Moleküle oder Molekülteile auf, die an wenigstens eine spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren binden. Die beschichteten Quantumdots werden direkt in die Probe gegeben und binden über die Fängermoleküle spezifisch die Bioindikatoren in der Probe. Der Vorteil hierbei ist, dass die Bindung sehr effizient erfolgen kann, da diese in Lösung erfolgt und durch Mischen/Rühren begünstigt werden kann. Nach der Inkubation wird das Proben/Quantumdotgemisch auf eine Substratoberfläche, beispielsweise eine Mikrotiterplatte, aufgebracht, deren Oberfläche ebenfalls mit einem Fängermolekül beschichtet ist, welches jedoch ein anderes Epitop auf dem Bioindikator erkennt. Nicht auf der Oberfläche gebundene Bestandteile werden durch Waschen entfernt. Abschließend wird die Oberfläche durch Fluoreszenzmikroskopie mikroskopiert und ausgewertet.
Eine weitere mögliche Variante der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von Quantumdots, die mit einem Fängerantikörper gegen den Bioindikator beschichtet sind. Die beschichteten Quantumdots werden direkt in die Probe gegeben und binden die Bioindikatoren in der Probe. Anschließend wird ein zweiter Antikörper zugegeben, der beispielsweise mit einem Biotin-Molekül markiert ist. Die Zugabe von Quantumdots und biotinyliertem Antikörper kann auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen. Der Vorteil hierbei ist, dass die Bindung sehr effizient erfolgen kann, da diese in Lösung erfolgt und durch Mischen/Rühren begünstigt werden kann. Nach der Inkubation wird das Gemisch auf eine Mikrotiterplatte aufgebracht, deren Glasboden mit beispielsweise Streptavidin beschichtet ist. Nicht auf der Oberfläche gebun dene Bestandteile können durch Waschen entfernt werden. Abschließend wird die Oberfläche durch Fluoreszenzmikroskopie mikroskopiert und ausgewertet.
Bedingt durch die kinetischen und sterischen Gegebenheiten ist die Bindung der Bioindikatoren an die Qdots in ihrer monomeren Ausgestaltung begünstigt gegenüber ihrer oligomeren Ausgestaltung, so dass vorzugsweise die Bioindikatoren in ihrer mo nomeren Ausgestaltung nachgewiesen werden können.
Quantumdots (Qdots) sind käuflich am Markt zu erwerben. Qdots sind kleine Nano- partikel mit fluoreszenten Eigenschaften. Sie können Nanopartikel mit einem Kern- Schalen-Material aus beispielweise CdSe/ZnS umfassen. Diese können z. B. im Bereich von 2-7 nm vorliegen. Mit steigendem Durchmesser, kann die Fluoreszenz von Blau in Richtung Rot verschoben werden.
Bei der Verwendung von Qdots kann auf den zusätzlichen Einsatz von Sonden verzichtet werden. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung können Carboxy-funktionalisierte Qdots eingesetzt werden. Dazu können beispielsweise 0,1 nM QDots (Quantumdots) mit einer Thiol-Spacer-Säure Mischung versetzt werden. Diese Thiol Spacer-Säure Mischung besteht z. B. aus 550 mM Tetramethylammoniumhydroxid, 275mM Thiol- Spacer-Säure (z. B. 3-Merkaptopropionsäure) in z. B. 1 ml CHC , wobei die entstehende wässrige Phase entfernt wird. Diese Lösung wird mit den Qdots vermischt und nach 2 Tagen 50 pL PBS hinzugefügt. Nach dem Ausschütteln wandern die Qdots in die wässrige Phase und man erhält die gewünschten Carboxy funktionalisierten Qdots. In einer anderen Variante können amino-terminierte Qdots eingesetzt werden. Dazu werden 1mg trockene Qdots mit einer Amino-spacer-Thiol Mischung in Methanol versetzt. Diese Amino-spacer-Thiol Mischung besteht aus 100 mg Amino-spacer-Thiol (z. B.: 2,2'-Diaminodiethyl disulfide). Die Mischung wird solange sonifiziert bis die Lösung die Qdots aufnimmt. Diese werden abzentrifugiert und in Wasser aufgenom- men. In der wässrigen Phase befinden sich amino-terminierte Qdots.
In einer weiteren möglichen Ausführung der Erfindung kann eine Kopplung von Monomeren oder Epitopen, allgemein Bindungsstellen für die Bioindikatoren, an die Na- nopartikel durchgeführt werden. Dazu können Nanopartikel mit Carboxy Termini ver- wendet werden, die in einen reaktiven NHS-Ester überführt werden. Die Bildung des NHS-Ester erfolgt vorzugsweise mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimid (kurz: EDC) und/oder N-Hydroxysuccinimid (kurz: NHS). Der NHS-Ester stellt die reaktive Zwischenstufe zur Reaktion mit einem primären Amin dar, das als Monomer der nachzuweisenden Bioindikatoren hinzugefügt wird. Eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, Amino-funktio- nalisierte Nanopartikel mit einem Maleinimido-Spacer-Carboxy reagieren zu lassen, z. B. mit 6-Maleinimido-Capronsäure oder Maleinimido-PEG (optionale Länge)- COOH. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels eingeführt wird, die spezifisch mit Thiolen reagiert. In einer anderen möglichen Variante werden die oben genannten NHS-Ester Partikel dazu verwendet Streptavidin an der Oberfläche der Nanopartikel zu binden. Die Nanopartikel als solche, das heißt ohne die Bindungsstelle des Bioindikators sind neu und lösen somit bereits die Aufgabe der Erfindung: ist dabei ein besonders bevorzugtes Ausgangsprodukt mit NHS-Estern an der Oberfläche von z. B. Silica-Nanopartikel (SINP). ist dabei ein besonders bevorzugtes Ausgangsprodukt mit Maleinimidogruppen an der Oberfläche von z. B. Silica-Nanopartikel (SINP).
Eine Vielzahl der hier jeweils nur einmalig abgebildeten Verbindungen ist selbstverständlich an der Oberfläche der Qdots angeordnet. Diese Anzahl ist vorteilhaft rech- nerisch genau bestimmt und hängt vom Durchmesser des Qdots ab.
Nanopartikel mit N-Hydroxysuccinimidester Oberflächen reagieren gegebenenfalls unter Abspaltung von N-Hydroxysuccinimid mit dem primären Amin des Monomers oder eines synthetischen Epitops der nachzuweisenden Bioindikatoren.
Diese Methode eignet sich besonders wenn die Aminosäure Lysin ein- oder mehr- fach in einer Peptidsequenz des Monomers vorhanden ist. Besonders eignet sich diese Methode, wenn sich die Aminosäure nicht in der Epitopregion, das heißt der Binderegion für Antikörper, befindet. Falls kein Lysin vorhanden ist, kann entweder der N-Terminus der Aminosäuresequenz selbst zur Bindung an den Qdot verwendet werden, oder die Peptidsequenzen mit zusätzlich eingeführten Lysinen verwendet werden.
Qdots mit Maleinimido-Gruppen auf der Oberfläche reagieren gegebenenfalls mit vorhandenen oder synthetisch eingebrachten Thiolen (z. B. Cystein) in der Proteinsequenz des Monomers oder Epitops.
Qdots mit Streptavidin Oberfläche binden besonders stark biotinylierte Monomere o- der Epitope.
Diese Silica-Qdots reagieren gegebenenfalls unter Abspaltung von N-Hydroxy-suc- cinimid mit dem primären Amin des Monomers der nachzu eisenden Bioindikatoren.
Aufgrund der chemischen Oberflächeneigenschaften lassen sich Modifikationen einfach durchführen. Außerdem ist das Material der Qdots stabil in physiologischen Pufferlösungen und gilt als gesundheitlich unbedenklich.
Insbesondere die oben gezeigten biofunktionalisierten Silica-Qdots stellen stabile, exakt größendefinierte Standards mit genau bestimmbarer Anzahl zugänglicher
Epitope dar und werden daher ebenfalls vorteilhaft als Plattformtechnologie in diagnostischen Testverfahren oder in Spiking Experimenten für die quantitative und qualitative Bestimmung von Bioindikatoren angewendet.
In einer bevorzugten Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Son- densignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nicht-ortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen. Im Vergleich zu ELISA ist das vorliegende Verfahren etwa tausendfach empfindlicher, da einzelne Moleküle ausgezählt werden können (digitaler Readout) und nicht ein einzelnes integriertes Signal aus einer Bulkmessung generiert wird.
Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung vorteilhaft. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Bioindikators vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspezifisch ge- bundene Sonden verursacht wird, ermöglicht. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out-Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse, wie z. B. Pixel, vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA-Verfahren ohne ortsaufgelöstem Signal dar. In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf total intern reflection fluorescence microscopy (tirfm) und der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Fem- toliters, im Vergleich zum Volumen der Probe von beispielsweise 10 bis 1000 mI, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit ei- n er Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbesondere 200 nm.
Im Sinne der Erfindung werden Bioindikatoren nachgewiesen, welche ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Zellen, Genen, Genprodukten, Proteinen, Hormonen, RNA, Enzymen. In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung sind die Fängermoleküle kovalent an das Substrat gebunden. Hierzu kann in einer Alternative ein Substrat eingesetzt werden, das eine hydrophile Oberfläche aufweist. In einer Alternative kann dies durch das Aufträgen einer hydrophilen Schicht, noch vor Schritt a), auf das Substrat erreicht werden. Mithin binden die Fängermoleküle, insbesondere kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welchen das Substrat beladen ist. Die hydrophile Schicht kann eine Biomolekül abweisende Schicht sein, so dass die unspezifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat vorteilhaft minimiert wird. Auf diese Schicht können die Fängermoleküle, bevorzugt kovalent immobilisiert werden. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal der Bioindikatoren. Die Fängermoleküle können alle identisch sein, oder es können Mischungen unterschiedlicher Fän- germoleküle vorliegen. Bevorzugt umfassen die Fängermoleküle kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile, die zur Detektion geeignet sind.
In einer Ausführung kann die hydrophile Schicht ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Polyethylenglykol, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Ly- sin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren inert sind, d.h. kein Messsignal erzeugen, welches zu einer Verfälschung der Detektion führen könnte. In einer weiteren möglichen Ausführung der Erfindung kann die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht funktionalisiert werden, indem die Oberfläche zunächst hydroxyliert wird und anschließend mit Aminogruppen aktiviert wird. Diese Aktivierung mit Aminogruppen kann in einer Alternative beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, auch durch In-Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3- Aminopropyltrietoxysilan) oder mit Ethanolamin erfolgen.
Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung können ein oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:
• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,
• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff,
• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen,
• Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,
• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,
• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre. In einer möglichen Alternative erfolgt das in Kontaktbringen des Substrats mit APTES in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit APTES bedampft.
Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), wird das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml und gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Car- bodiimid (EDC), (200 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert und anschließend gewaschen.
Das Carboxymethyl-Dextran kann in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden sein, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen funkti- onalisiert wurde.
Als Substrat können beispielsweise auch Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasober- fläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog.
Auf diese hydrophile Schicht können, bevorzugt kovalent, Fängermoleküle immobilisiert werden, welche affin gegenüber einem Merkmal des zu detektierenden Bioindikators sind. Dieses Merkmal kann ein Protein sein. Die Fängermoleküle können alle identisch sein oder Mischungen verschiedener Fängermoleküle sein. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Fängermoleküle, bevorzugt Antikörper, gegebenenfalls nach einer Aktivierung des mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS (200 bzw. 50 mM), auf dem Substrat immobilisiert.
Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Fängermoleküle gebunden wur- den, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat-Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült.
Die zu vermessende Probe wird mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und gegebenenfalls inkubiert. Als zu untersuchende Probe können beispiels- weise körpereigene Flüssigkeiten oder Gewebe eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Liquor (CSF), Blut, Plasma und Urin. Die Proben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Aufbereitungsschritte durchlaufen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung kann das Aufträgen der Probe unmittelbar auf dem Substrat erfolgen z. B. dem nicht beschichteten Substrat, gegebenen- falls durch kovalente Bindung. Gegebenenfalls erfolgt die Bindung an eine aktivierte Oberfläche des Substrats.
In einer anderen Variante der vorliegenden Erfindung kann eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahrensschritte erfolgen:
• Verdünnen mit Wasser oder Puffer, · Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Proteasen, Nuklease, Lipasen,
• Zentrifugieren,
• Präzipitation,
• Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.
Unspezifisch gebundene Substanzen können durch Waschschritte entfernt werden. In einem weiteren Schritt können die immobilisierten Bioindikatoren mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden markiert werden. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchgeführt werden.
Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Sonden, die nicht an die Bio- Indikatoren gebunden sind, entfernt.
In einer Alternative des Verfahrens müssen diese überschüssigen Sonden nicht entfernt werden. Dadurch entfällt ein Waschschritt und es findet auch keine Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Dissoziation der Bioindikatoren-Sonden-Kom- plexe oder -Verbindungen statt. Durch die ortsaufgelöste Detektion werden die über- schüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst.
In einer Ausführung sind die Bindungsstellen der Bioindikatoren Epitope und die Fängermoleküle und/oder Sonden sind Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente hiervon. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung werden Sonden eingesetzt, die wenigstens zwei verschiedene Epitope auf dem Bioindikator mit erhöhter Avidität erkennen, wobei zu beachten ist, dass diese nicht bereits durch die Fängermoleküle belegt sind. Durch den Einsatz von wenigstens bi-spezifischen oder mehrspezifischen Sonden, die wenigstens zwei oder mehr als zwei Epitope auf dem Bioindikator erkennen, kann in einer vorteilhaften Weise die Spezifität des Nachweises er- höht werden.
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich die Fängermoleküle und die Sonden. So können z. B. unterschiedliche Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente als Fängermoleküle und als Sonden eingesetzt werden. In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Sonden gleichzeitig eingesetzt.
In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei o- der mehr unterschiedliche Fängermoleküle und/oder Sonden eingesetzt, die z. B. unterschiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen tragen.
Zur Detektion sind die Sonden so gekennzeichnet, dass sie ein optisch detektierba- res Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Biolumineszenz- und Chemolumineszenz-Emission sowie Absorption.
Die Sonden sind vorzugsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Fluoreszenz- farbstoffe können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie Quantendots verwendet werden.
Zur Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel beim Nachweis der Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekülen, können Fängermoleküle gekennzeichnet mit Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt werden.
Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit dem Nachweis des Fluoreszenzfarbstoffs der Sonde am Bioindikator interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Die Detektion der immobilisierten und markierten Bioindikatoren erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche, z. B. mit Laser Scanning Mikroskopie. Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohe Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensitivität sowie die Selektivität des Verfahrens erhöht werden können, da strukturelle Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezifische Signal vor dem Hintergrundsignal (z. B. unspezifisch gebundener Sonden). Die Detektion erfolgt beispielweise bevorzugt mit ortsauflösender Fluoreszenz-mikro- skopie durch ein TIRF-Mikroskop, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM, dSTORM.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Corre- lation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM. Durch hoch-sensitive Fluoreszenzmikroskopie können nun alle einzelnen Fluoreszenz-markierten Sonden auf der Oberfläche detektiert und quasi einzeln gezählt werden. Diese erscheinen in den Bilddaten als Pixel mit einem Graustufenwert oberhalb des Hintergrundsignals (digitaler Readout). Damit ergibt sich auch die Menge an nachzuweisenden Zielmolekülen - prinzipiell mit Einzelmolekül-Sensitivität. Im Unterschied zu ELISA entstehen durch dieses Verfahren so viele Auslese-Werte, wie ortsaufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl an unterschiedlichen Sonden wird diese Information vorteilhaft vervielfacht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detekti- onsereignis und führt zu einem Informationsgewinn, da sie weitere Eigenschaften, z. B. ein zweites Merkmal, über Bioindikatoren offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.
Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass die Anwesenheit von einzelnen Bioindikatoren, wie z. B. einzelne Membranproteine, das Messergebnis nicht beein- flussen.
Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass Bioindikatoren Spezies (Pheno- typen) für jeden einzelnen Bioindikator bestimmt werden können.
Zusätzliche Sonden können derart ausgewählt werden, dass sie die Unterscheidung zwischen DNA/ RNA-enthaltenden Bioindikatoren und damit Aufschluss über das In- nere der Bioindikatoren geben können. Beispielweise können hierzu DNA/RNA- bindende Fluorophore wie DAPI von Hoechst verwendet werden. Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen, z. B. die Fluoreszenz-Intensität, aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl einzelner Bioindikatoren, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen.
Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch In- tensitäts-Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden.
Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen Intensitätsma- xima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Bioindikatoren zu erhalten und auch die Partikelgrößen bestimmen zu können. Um die Testergebnisse miteinander über Entfernungen, Zeiten und Experimentatoren hinweg vergleichbar zu machen, können interne und/oder externe Standards eingesetzt werden.
Im Folgenden werden beispielhaft zwei mögliche Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben: a) Konsekutives Verfahren:
In dieser Ausführung des Verfahrens werden simultan mehrere verschiedene Bioindikatoren in einer einzigen Probe quantifiziert.
Dazu werden verschiedene Fängermoleküle jeweils auf verschiedene Bereiche der Oberfläche des Substrats, wie beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffplatte mit Bohrungen zur Aufnahme von Proben, aufgebracht (gespottet, siehe Figur 1). Anschließend wird die zu untersuchende Probe aufgebracht und die zu analysierenden unterschiedlichen Bioindikatoren werden auf den jeweiligen Bereichen mit Hilfe der für die jeweiligen unterschiedlichen Bioindikatoren spezifischen Fängermoleküle immobilisiert. Zur Detektion werden verschiedene Sonden eingesetzt, welche die zu analysierenden Bioindikatoren spezifisch erkennen und an diese spezifisch binden. Diese Sonden können mit demselben Fluorochrom oder mit unterschiedlichen Flu- orochromen markiert sein. Schließlich werden die jeweiligen Bereiche der Probenplatte nacheinander (Bioindikator 1, 2, 3, 4, usw.) durch Fluoreszenzmikoskopie ausgelesen. Die verschiedenen Bioindikatoren werden dann in ihren jeweiligen Farbka- nälen ortsabhängig detektiert oder in einem Farbkanal ortsabhängig detektiert. b) Simultanes Verfahren:
In dieser Ausführung des Verfahrens werden simultan mehrere verschiedene Bioindikatoren in einer einzigen Probe quantifiziert.
Dazu wird ein Gemisch von Fängermolekülen auf die verschiedenen Bereiche der Oberfläche des Substrats, wie beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffplatte mit Bohrungen zur Aufnahme von Proben, aufgebracht. Anschließend wird die zu untersuchende Probe mit den unterschiedlichen Bioindikatoren aufgebracht und die zu analysierenden unterschiedlichen Bioindikatoren werden auf der Oberfläche mit Hilfe der für die jeweiligen unterschiedlichen Bioindikatoren spezifischen Fängermoleküle immobilisiert. Zur Detektion werden verschiedene Sonden eingesetzt, die spezifisch an die zu analysierenden Bioindikatoren binden. Die verschiedenen Sonden sind jeweils mit verschiedenen Fluorochromen markiert. Schließlich wird die Oberfläche durch Fluoreszenzmikroskopie ausgemessen; die verschiedenen Bioindikatoren können dann in ihren jeweiligen Farbkanälen spezifisch detektiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit enthaltend eine oder meh rere der folgenden Komponenten:
- Substrat, optional mit hydrophiler Oberfläche,
- Fängermolekül(e),
- Sonde,
- Substrat mit Fängermolekül,
- Lösungen,
- Standard,
- Puffer.
Als Standard kann hier vorzugsweise das Monomer des zu untersuchenden Bioindikators eingesetzt werden, wobei dieses Monomer vorzugsweise aus einem Organismus gewonnen wird, der rekombinant hergestellt oder chemisch synthetisiert wurde. Der Standard muss zumindest alle Sequenzen bzw. Strukturen aufweisen, die auch von den eingesetzten Sonden und Fängermolekülen erkannt werden und eine möglichst ähnliche Affinität, insbesondere einen ähnlichen KD-Wert, aufweisen. Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein.
Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an ei- nem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Dann umfasst das Substrat eine solche Mikrotiterplatte.
Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine beliebige der Ausführungsformen enthalten. In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle bereits immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Beschichtung und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung odereinem Puffer überschichtet vorliegen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Bioindikatoren in beliebigen Proben zur Quantifizierung und damit Titerbestimmung von Bioindiaktoren.
Vorteilhaft kann das Verfahren damit auch den Nachweis einer Erkrankung, wie z. B. Kardiovaskulären-, Nieren- und Krebserkrankungen, den Nachweis einer Immunant- wort erbringen. Das Verfahren kann in der Wirkstoffentwicklung, der direkten und absoluten Quantifizierung der Bioindikatoren, bei der Therapie begleitenden Diagnostik (target engagement), der Differentialdiagnostik, dem Nachweis von Protein-Protein- Interaktion und/oder bei der Typisierung von Bioindikatoren eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungs- gemäßen Verfahrens zur Überwachung von Therapien mit Bioindikatoren sowie zur Überwachung und/oder die Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren. Das Verfahren kann daher bei klinischen Tests, Studien als auch beim Therapie-Monitoring eingesetzt werden. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und die Ergebnisse verglichen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Wirksamkeit von Wirkstoffen gegen erkrankte Zellen. Dabei werden die Ergebnisse anhand der Charakterisierung von Bi oindikatoren in Proben miteinander verglichen. Bei den Proben handelt es sich entsprechend um Körperflüssigkeiten, entnommen vor beziehungsweise nach, oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Gabe der Wirkstoffe beziehungsweise Durchführung des Heilverfahrens. Erfindungsgemäß werden die Ergebnisse mit einer Kontrolle verglichen, die nicht dem Wirkstoff und/oder Heilverfahren unterworfen wurde. Anhand der Ergebnisse werden Wirkstoffe und/oder Heilverfahren ausgewählt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung des erfin dungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung, ob eine Person in einer klinischen Stu die aufgenommen wird. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und in Bezug auf einen Grenzwert die Entscheidung getroffen.
Spezieller Beschreibungsteil:
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung an Hand von Figuren und Ausfüh rungsbeispielen erläutert, ohne, dass der Gegenstand der Erfindung hierdurch auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt wird.
Figur 1 : Probenplatte zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener Bioindikatoren
Figur 2: Nachweis von Bioindikatoren mit Quantumdots (Qdots)
Figur 3: Nachweis von Bioindikatoren mit Quantumdots (Qdots) in Verbindung mit Biotin/ Streptavidin
Figur 4: Nachweis von Streptavidin in unterschiedlichen Konzentrationen
Figur 5: Nachweis eines monomeren Protein-Konstrukts 2ALFA2GFP in unter schiedlichen Konzentrationen
Figur 1 zeigt eine Probenplatte zum gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Bio indikatoren innerhalb eines Untersuchungsansatzes.
Figur 1 zeigt eine Probenplatte zum gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Bio indikatoren innerhalb eines Untersuchungsansatzes, auch Multiplex-Verfahren genannt, bei dem die Glasoberfläche der Probenplatte vier Bereiche, insbesondere Bohrungen oder Vertiefungen, aufweist, die jeweils als Reaktionsraum für das erfin dungsgemäße Verfahren genutzt werden können. Dieses Verfahren wird im Folgenden beispielhaft beschrieben.
In der folgenden Ausgestaltung des Verfahrens werden konsekutiv in einem Untersuchungsansatz mehrere verschiedene Bioindikatoren in einer einzigen Probe quantifiziert. Dazu werden verschiedene Fängermoleküle auf verschiedene Bereiche der Probenplatten-Oberfläche aufgebracht, auch als gespottet bezeichnet. In Figur 1 sind dies die vier unterschiedlich schraffierten quadratischen Bereiche, insbesondere Bohrungen oder Vertiefungen der Probenplatte. Anschließend wird die Probe aufgebracht, und die zu analysierenden Bioindikatoren werden mit Hilfe der spezifischen Fängermoleküle auf dem jeweiligen Bereich immobilisiert. Zur Detektion werden ver- schiedene Sonden eingesetzt, die die zu analysierenden Bioindikatoren erkennen. Diese Sonden können mit demselben Fluorochrom oder mit unterschiedlichen Flu- orochromen markiert sein. Schließlich werden die jeweiligen Spots nacheinander (Bioindikator 1, 2, 3, 4, usw.) durch Fluoreszenzmikoskopie ausgelesen. Die verschiedenen Bioindikatoren werden dann entsprechend ihren jeweiligen Farbkanälen orts- abhängig detektiert oder in einem Farbkanal ortsabhängig detektiert.
In einer weiteren alternativen Ausführung des Verfahrens werden simultan mehrere Bioindikatoren in einer einzigen Probe quantifiziert. Dazu wird ein Gemisch von Fängermolekülen auf die dafür vorgesehenen Bereiche/ Bohrungen oder Vertiefungen der Probenplatte aufgebracht. Anschließend wird in diese Bereiche die Probe aufge- bracht, und die zu analysierenden Bioindikatoren werden auf der Oberfläche immobilisiert. Zur Detektion werden verschiedene Sonden eingesetzt, die an die zu analysierenden Bioindikatoren binden. Die verschiedenen Sonden sind jeweils mit verschiedenen Fluorochromen markiert. Schließlich wird die Oberfläche durch Fluoreszenzmikroskopie ausgelesen; die verschiedenen Bioindikatoren werden dann in ihren je- weiligen Farbkanälen detektiert.
Figur 2 zeigt einen erfindungsgemäßen Nachweis von Bioindikatoren unter Verwendung von Quantumdots (Qdot). Die Qdots werden zunächst mit einem Fängermolekül (B) für den Bioindikator (A) beschichtet. Die mit den Fängermolekülen (B) beschichteten Qdots werden in Schritt 1 direkt in die Probe gegeben und binden spezi- fisch den Bioindikator (A). Nach einer Inkubation wird in Schritt 2 das Bioindikator
(B)/Qdot-Gemisch auf die Oberfläche einer Probenplatte, beispielsweise eine Mikrotiterplatte, aufgebracht. Die Oberfläche der Probenplatte (C) ist mit Fängermolekülen (B) beschichtet, die jedoch eine andere Bindungsstelle auf dem Bioindikator (A) erkennen. Nicht auf der Oberfläche der Probenplatte (C) gebundene Bestandteile werden durch Waschen entfernt. Anschließend wird die Oberfläche (C) mit Hilfe von beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet, welche die auf der Oberfläche der Probenplatte (C) gebundenen fluoreszierenden Qdots detektiert.
Figur 3 zeigt einen erfindungsgemäßen Nachweis von Bioindikatoren (A) unter Verwendung von Quantumdots (Qdots), die mit einem Fängermoleküle (B) für den Bioindikator (A) beschichtet sind. Die beschichteten Qdots werden in Schritt 1 direkt in die Probe gegeben und binden spezifisch den Bioindikator (A) aus der Probe. Anschlie- ßend wird in Schritt 2 ein zweites Fängermolekül (B) zugegeben, welches mit einem Biotin-Molekül (D) markiert ist. Die Zugabe von Qdots und biotinylierten Fängerantikörpern (B-D), kann auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen. Nach einer Inkubation wird dieses Gemisch gebundener Bioindikator-Qdots in Schritt 3 auf die Oberfläche einer Probenplatte (C), beispielsweise eine Mikrotiterplatte, aufgebracht. Die Oberfläche der Probenplatte (C) ist mit Streptavidin (E) beschichtet. Nicht auf der Oberfläche der Probenplatte (C) gebundene Bestandteile werden durch Waschen entfernt. Anschließend wird die Oberfläche (C) mit Hilfe von beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet, welche die auf der Oberfläche der Probenplatte (C) gebundenen fluoreszierenden Qdots detektiert. Figur 4 zeigt einen Nachweis von Streptavidin in unterschiedlichen Konzentrationen.
Auf der Abszisse (X-Achse) sind die unterschiedlichen Streptavidin-Konzentrationen aufgetragen, angegeben sowohl als femtomolare (fM) bis picomolare (pM) Angabe (obere Zahlenreihe) als auch in entsprechender mg/ml (untere Zahlenreihe) Angabe. Auf der Ordinate (Y-Achse) sind die Zahlenwerte des Detektionssignals, und zwar des TIRF Mikroskops angegeben. Die Zahlenwerte geben die Anzahl der detektierten Pixel an.
Gemäß Figur 4 kann eine Detektion von Streptavidin in einer dekadischen Verdünnungsreihe bis 1 femtomolar (fM) bzw. 5*10'11 mg/ml nachgewiesen werden.
Als Probe wurde fluoreszenzmarkiertes Streptavidin-Alexa Fluor633 verwendet und in salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS) bei pH 7,4 verdünnt. Als Negativkontrolle (0) wurde der zuvor genannte Verdünnungspuffer TBS verwendet. Für das Ausführungsbeispiel wurden kommerzielle Mikrotiterplatten (Greiner Bio-one; Sensoplate Plus) mit 384 Reaktionskammern (RK) und Glasboden verwendet.
Zunächst wurde die Oberfläche der Mikrotiterplatte aufgebaut bzw. funktionalisiert. Hierfür wurde in die RK der Mikrotiterplatte jeweils 40 pl 1%iges Bovines Serumal bumin (BSA, Applichem) in phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, Sigma Aldrich ge geben und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Mikrotiterplatte mit den Reaktionskammern (RK) drei mal mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte je RK die Zugabe von 20 pl 1mM EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoScientific) als Fängermolekül und einer Inkuba tion für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Nach dreimaligen Waschen mit PBS wur den die RK der Mikrotiterplatte mit jeweils 40 mI 1 %iger BSA in PBS geblockt, für 1 h bei RT inkubiert und danach fünfmal mit salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS, Serva) mit 0,05% Tween-20 (Applichem) (TBS-T) und fünfmal mit salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS) gewaschen. Die Probe Streptavidin, konju giert mit Alexa Fluor 633 (ThermoScientific), wurde sequentiell in TBS verdünnt und in vierfacher Ausführung je 20 mI Probe in die RK aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die RK fünfmal mit TBS gewaschen, mit 70 mI TBS mit 0,03% ProClin (SigmaAldrich) je RK versetzt, um bakterielles Wachstum zu verhindern, und mit einer Folie versiegelt. Da die Probe selber fluoreszenz markiert ist, kann sie direkt detektiert werden.
Zum Nachweis der monomeren Proteine wurde eine ortsaufgelöste Mikroskopie durchgeführt. Die Messung erfolgte im TIRF Mikroskop (Leica) mit einem 100 fach Öl Immersionsobjektiv. Hierfür wurde der Glasboden der Mikrotiterplatte reichlich mit Im mersions-Öl bestrichen und die Mikrotiterplatte in die automatisierte Bühne des Mikroskops eingebracht. Danach wurde je RK an 5 x 5 Positionen im Fluoreszenzkanal Ex/Em=633/705 nm je ein Bild (1000 x 100 pixel) konsekutiv aufgenommen, um so viele Datenpunkte zu erhalten, dass die Detektion einzelner Proteinmoleküle vor dem Hintergrundsignal möglich wurde. Es wurde die maximale Laserleistung (100%), eine Belichtungszeit von 500 ms und ein Verstärkungswert von 1000 gewählt. Die Bildda ten wurden danach ausgewertet. Intensitätsschwellenwerte wurde für jeden Kanal bei 0,001% Graustufen der gemittelten Negativkontrolle gesetzt. Anschließend wurde die Anzahl der Pixel über alle Bilder in jeder RK gemittelt und danach die Mittelwerte der mittleren Pixelzahlen der Replikatwerte ermittelt und die Standardabweichung angegeben.
Die Werte sind in Figur 4 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen einen linearen Zusammen hang zwischen der Konzentration und dem Messsignal über 6 Log Stufen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe bis zu einer Konzentration von wenigstens 1 fM bzw. 5*1011 mg/ml von der Negativkontrolle unterschieden werden.
Dieses Ausführungsbeispiel zeigt, dass die Nachteile anderer Verfahren, wie bei spielsweise der geringe dynamische Messbereich und eine maximale Sensitivität nur bis in den picomolaren Bereich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überwunden werden kann. Die Werte dieses Ausführungsbeispiels zeigen einen dynamischen Messbereich über 6 Log Stufen und eine Sensitivität im femtomolaren Bereich.
Figur 5 A und B zeigen einen Nachweis des monomeren Protein-Konstrukts 2ALFA2GFP in unterschiedlichen Konzentrationen und zwar in einer Verdünnungsreihe von 10 pM bzw. 6*107 mg/ml bis 100 fM bzw. 6*109 mg/ml. Auf der Abszisse (X-Achse) sind die unterschiedlichen Protein-Konzentrationen des 2ALFA2GFP auf getragen, angegeben sowohl als femtomolare (fM) bis picomolare (pM) Angabe (obere Zahlenreihe) als auch in entsprechender mg/ml (untere Zahlenreihe) Angabe. Auf der Ordinate (Y-Achse) sind die Zahlenwerte des Detektionssignals, und zwar des TIRF Mikroskops angegeben. Die Zahlenwerte geben die Anzahl der detektierten Pixel an.
Als Beispiel für den Nachweis eines Bioindikators wurde in diesem Ausführungsbei spiel das monomere Protein-Konstrukt 2ALFA2GFP verwendet, welches aus zwei ALFA-Protein-Teilen [11] und zwei GFP-Proteinen (green fluorescent protein) besteht. Dieses Konstrukt wurde in einer Verdünnungsreihe von 10 picomolar (pM) bis 100 femtomolar (fM) in salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS) bei pH 7,4 verdünnt. Als Negativkontrolle (0) wurde der Verdünnungspuffer TBS verwendet. Als Sonde wurde der Einzeldomänenantikörper anti-ALFA, fluoreszenz-konjugiert mit AlexaFluor647, (FluoTag-X2 anti-ALFA, NanoTag) benutzt, der an den ALFA-Teil des 2ALFA2GFP Protein-Konstrukts bindet.
Für dieses Protein-Konstrukt wurden der ALFA-Tag und das GFP-Protein ausge wählt, weil diese an ihre jeweiligen Einzeldomänenantikörper mit einer Affinität im pi comolaren Bereich binden. Konkrete Ausführung
Für das Ausführungsbeispiel wurden kommerzielle Mikrotiterplatten mit 384 Reaktionskammern (RK) und Glasboden (Thermo Scientific) verwendet.
Als Fängermolekül wurde der anti-GFP Einzeldomänenantikörper (GFP VHH, recombinant binding protein, gt-250, chromotek) in einer Konzentartion von 5 pg/ml eingesetzt, der in TBS verdünnt wurde. 40 pl dieser Lösung wurden jeweils in die Re- aktionskammem (RK) gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Reaktionskammern (RK) fünfmal mit TBS-T und fünfmal mit TBS gewaschen. Anschließend wurden die Reaktionskammern (RK) jeweils mit 80 pl 1% BSA in TBS geblockt, für 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und danach wieder fünfmal mit TBS-T und fünfmal mit TBS gewaschen. Die Probe (Protein-Konstrukt 2ALFA2GFP) wurde sequentiell in TBS verdünnt und in vierfacher Ausführung jeweils 20 mI Probe in die Reaktionskammern (RK) aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Reaktionskammern (RK) fünfmal mit TBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe der Sonde anti-ALFA-CF647 (20 mI) und eine Inkubation bei RT für 1 h. Danach wurden die Reaktionskammern (RK) fünfmal mit TBS gewaschen, mit jeweils 80 mI TBS mit 0,03% ProClin (SigmaAldrich) versetzt, um bakterielles Wachstum zu verhindern, und mit einer Folie versiegelt.
Zum Nachweis der monomeren Proteine wurde eine ortsaufgelöste Mikroskopie durchgeführt. Die Messung erfolgte im TIRF Mikroskop (Leica) mit einem 100-fach Öl-Immersionsobjektiv. Hierfür wurde der Glasboden der Mikrotiterplatte reichlich mit Immersions-Öl bestrichen und die Platte in die automatisierte Bühne des Mikroskops eingebracht. Danach wurde je Reaktionskammer (RK) an 5 x 5 Positionen in zwei Fluoreszenzkänalen (Ex/Em=633/715 nm und 488/525 nm) je ein Bild (1000 x 100 pixel) konsekutiv aufgenommen, um so viele Datenpunkte zu erhalten, dass die Detektion einzelner Proteinmoleküle vor dem Hintergrundsignal möglich wurde. Es wurde die maximale Laserleistung (100%), eine Belichtungszeit von 1000 ms und ein Verstärkungswert von 1300 gewählt. Die Bilddaten wurden danach ausgewertet. Intensitätsschwellenwerte wurde für jeden Kanal bei 0,001% Graustufen der gemittel- ten negativ Kontrolle gesetzt. Anschließend wurde die Anzahl der Pixel über alle Bilder in jeder Reaktionskammer gemittelt und danach die Mittelwerte der Mittleren Pixelzahlen der Replikatwerte ermittelt und die Standardabweichung angegeben. Die Werte sind in der Figur 5 gezeigt. In Figur 5 A wird das monomere Protein direkt über die Fluoreszenz von GFP im Kanal 488 detektiert, in Figur 5 B wird das Protein über die Sonde anti-ALFA-AF647 im Kanal 633 detektiert. Der Nachweis des Proteins über die Sonde ist vergleichbar mit dem direkten Nachweis des Proteins über den fluoreszierenden GFP-Anteil in seiner monomeren Ausgestaltung. Dieser Vergleich verdeutlicht die Sensitivität des Verfahrens.
Die Ergebnisse zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen der Konzentration des eingesetzten Protein-Konstrukts und dem Messsignal. Mit diesem Ausführungsbeispiel kann gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren dazu geeignet ist, das Protein-Konstrukt in seiner monomeren Ausgestaltung bis zu einer Konzentration von 100 fM bzw. 6*10-9 mg/ml zu detektieren und von der Negativkontrolle zu unterscheiden. Die Werte dieses Ausführungsbeispiels zeigen einen dynamischen Messbereich über 3 Log Stufen und eine Sensitivität im femtomolaren Bereich.
Auch dieses Ausführungsbeispiel zeigt, dass die Nachteile anderer Verfahren, wie der geringe dynamische Messbereich und eine maximale Sensitivität nur bis in den picomolaren Bereich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überwunden werden können.
Literaturquelle:
[11] Götzke H, et al. “The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bio- Science applications”. Nat Commun. 2019 Sep 27; 10(1):4403. doi: 10.1038/s41467- 019-12301-7. PMID: 31562305; PMCID: PMC6764986.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Bioindikatoren, umfassend folgende Schritte: a) Immobilisieren von Fängermolekülen für die Bioindikatoren auf einem Substrat, b) In-Kontaktbringen der Bioindikatoren einer Probe mit den Fängermolekülen, c) Immobilisieren der Bioindikatoren auf dem Substrat durch Bindung an Fängermoleküle, d) In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit Sonden, die mindestens ein Detektionsmolekül enthalten, und e) Entfernen von nicht spezifisch gebundenen Molekülen und Partikeln z. B. durch Waschen, f) Binden der Sonden an die Bioindikatoren, wobei die Sonden in der Lage sind, ein spezifisches Detektionssignal zu emittieren und die Schritte b) und d) gleichzeitig oder d) vor b) erfolgen können und wobei Sonden und Fängermoleküle eingesetzt werden, die affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen, die an wenigstens eine spezifische Bindungsstelle der Bioindikatoren binden und diese affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und Fänger nicht untereinander überlappen.
2. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fängermoleküle an wenigstens zwei spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren binden.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die affinen Moleküle oder Molekülteile der Sonden und/oder Fängermoleküle an wenigstens zwei spezifische Bindungsstellen der Bioindikatoren binden, wobei diese Bindungsstellen der Sonden und/oder Fängermoleküle an wenigstens zwei identische Bindungsstellen eines Bioindikators binden und/oder an wenigstens zwei unterschiedliche Bindungsstellen von wenigstens zwei unterschiedlichen Bioindikatoren binden.
4. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass durch In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Fängermolekülen, diese auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle immobilisiert werden.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Sonden, nicht spezifisch gebundene Moleküle und Partikel durch Waschen entfernt werden.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Sonden gewählt werden, welche an die Bioindikatoren binden, wobei die Sonden in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsmoleküle der Sonden Fluorochome, und/ oder fluoreszierende Proteine umfassen.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Fängermolekülen und den Sonden gleichzeitig erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontaktbringen der Bioindikatoren mit den Sonden vor dem In-Kontakt- bringen mit den Fängermolekülen erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe vor dem Binden der Sonden an die Bioindikatoren fixiert wird.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an Stelle von Sonden Quantumdots eingesetzt werden, die mit Fängermolekülen beschichtet sind, die affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen, die an wenigstens eine spezifische Bindungsstelle der Bioindikatoren binden.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit Detergenzien behandelt wird.
13. Verfahren nacheinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat Kunststoff, Silizium oder Siliziumdioxid oder bevorzugt Glas umfasst.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat vor dem Immobilisieren von Fängermolekülen auf dem Substrat eine hydrophile Oberfläche aufweist.
16. Verfahren nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Schicht ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus PEG, Poly-Lysin und Dextran oder Derivate hiervon.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Funktionalisierung mit Aminogruppen durch in Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) oder Ethanolamin erfolgt.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) in der Gasphase erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle kovalent an das Substrat oder an die Beschichtung gebunden sind.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsstellen der Bioindikatoren mehrspezifische, vorzugsweise wenigstens bi-spezifische Epitope sind und die affinen Moleküle oder Molekülteile der Fängermoleküle und/oder Sonden mehrspezifische, vorzugsweise wenigstens bi-spezifische, Antikörper oder Teile derselben sind.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie erfolgt.
23. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zum Nachweis einer Erkrankung.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Überwachung von Therapien mit Bioindikatoren und/oder der Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und /oder Heilverfahren oder zur Bestimmung, ob eine Person in eine klinische Studie aufgenommen wird.
25. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche, enthaltend:
Substrat, - Fängermoleküle;
- Sondenmoleküle
26. Kit nach vorhergehendem Anspruch, enthaltend Qdots an Stelle von Sonden, wobei die Qdots mit Fängermolekülen beschichtet sind, die affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen, die an wenigstens eine spezifische Bindungsstelle der
Bioindikatoren binden.
EP21730462.5A 2020-06-25 2021-05-07 Verfahren, verwendung des verfahrens sowie kit zum nachweis von bioindikatoren in einer probe Pending EP4172623A1 (de)

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