EP4217714A1 - Procédé d'analyse d'un échantillon biologique avec analyse de conformité initiale - Google Patents

Procédé d'analyse d'un échantillon biologique avec analyse de conformité initiale

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EP4217714A1
EP4217714A1 EP21798408.7A EP21798408A EP4217714A1 EP 4217714 A1 EP4217714 A1 EP 4217714A1 EP 21798408 A EP21798408 A EP 21798408A EP 4217714 A1 EP4217714 A1 EP 4217714A1
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EP
European Patent Office
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analysis
biological sample
measurement
value
biological
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Pending
Application number
EP21798408.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Dominique Decaux
Emilie BISCEGLIA
Guillaume Perrin
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Publication date
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    • G03H2001/005—Adaptation of holography to specific applications in microscopy, e.g. digital holographic microscope [DHM]

Definitions

  • the present invention relates to the field of the analysis of biological samples by imaging, and more particularly relates to the control of the conformity of a biological sample within the framework of the analysis of biological agents in the biological sample.
  • a biological sample consists of a suspension of biological agents or a mixture of suspensions of biological agents.
  • Biological agents are, for example, microorganisms (bacteria, yeasts, moulds, etc.).
  • the analysis of a biological agent in the biological sample can comprise the identification of said biological agent or the determination of a characteristic of this biological agent, such as for example the minimum inhibitory concentration of an antibiotic which would be effective at against said biological agent.
  • the biological sample called inoculum in its initial state, is placed in a receptacle, or well, at least partially transparent through which the analysis instrument can carry out measurements of optical properties of the biological sample.
  • the well contains a nutrient medium and also one or more reagents, such as an enzymatic substrate or antibiotics, intended to interact with biological agents present in the biological sample.
  • reagents such as an enzymatic substrate or antibiotics
  • a plurality of wells are provided to each receive the inoculum, each of the wells being provided with different reagents or with the same reagent at different concentrations. Depending on the nature of the biological agents present in the inoculum, these react with certain reagents, and not with other reagents, or at certain concentrations and not at others.
  • the reagents consist of different antibiotics at different concentrations, and the biological agents will multiply in the wells containing the antibiotics to which they are not sensitive or in which the concentration of antibiotics is insufficient, or on the contrary will see their development more or less hampered in the wells containing the antibiotics to which they are sensitive in sufficient concentrations.
  • the biomass i.e. the quantity of biological material present in each well, directly influences the optical properties of the biological sample present in each well, since the biological agents themselves present different optical properties from the solution. in which they are suspended.
  • the transmittance of the biological sample is affected by the evolution of the concentration of biological agents.
  • methods for the analysis of biological samples had been developed based on the determination of the evolution over time, during an incubation phase, of the overall transmittance (or absorbance, which is equivalent) of a well filled with the biological sample, in order to determine a turbidity measurement, typically expressed in McFarland (McF).
  • McFarland McFarland
  • This turbidity measurement is directly representative of the biomass of biological agents in the biological sample.
  • an emitting diode illuminates the sample with a light beam of known intensity, and a point photodiode arranged opposite the emitting diode with respect to the sample makes it possible to determine the light intensity received after the light beam has passed through the biological sample.
  • such a transmittance measurement has a fairly low sensitivity, such that it is not possible to measure a turbidity of less than 0.05 McF, or even less than 0.1 McF.
  • the inoculum is prepared by an operator who introduces biological agents in suspension in a saline solution or by diluting a biological sample (urine or positive blood culture for example) so as to obtain a bacterial concentration between 10 7 and 10 9 CFU/ml.
  • the dilution in the saline suspension must initially correspond to a particular range to allow analysis. This compliance range can be expressed directly as a turbidity value for the attention of the operator preparing the inoculum, possibly with a preliminary value which is later rediluted.
  • a preliminary suspension must be calibrated between 0.5 and 0.63 McF for bacteria as biological agents or between 1.8 and 2.2 McF for yeasts as than biological agents.
  • a transmittance meter is typically used to verify that the turbidity of the pre-suspension is within the required compliance range.
  • This preliminary suspension is then further diluted, for example with a factor of 20 to analyze Gram- bacteria or with a factor of 10 to analyze Gram+ bacteria.
  • the initial conformity of the inoculum for bacteria requires a biomass concentration (expressed in turbidity) between 0.025 McF and 0.0315 McF for Gram-bacteria and between 0.05 McF and 0.063 McF for Gram + bacteria. Lower concentrations are commonly used in other protocols. As a result, the concentration of biological agents in an inoculum is initially below the detection limit of instruments measuring transmittance.
  • the inoculum does not initially have the expected qualities, and therefore does not comply with the requirements of the analysis process.
  • This mismatch between the qualities of the initial inoculum and those expected is not immediately perceptible.
  • the only measurement available is the global transmittance, and its low sensitivity does not initially make it possible to get out of the measurement background noise. It takes a certain incubation time, typically several hours corresponding for example to several cycles of bacterial division, for the concentration to increase and for the transmittance to come out of the background noise of the measurement.
  • the loss of time caused by the late aspect of error detection can be extremely detrimental, in particular when the results of the analysis are awaited to treat a patient.
  • the erroneous results can lead to erroneous diagnoses, and therefore to inadequate treatments for a patient.
  • the invention therefore aims to make it possible to have a method and an analysis instrument making it possible to ensure, without loss of time, the reliability of the final analysis results.
  • the invention proposes a method for analyzing a biological sample by means of an analysis instrument, in which, following the placement of the biological sample in an analysis receptacle in a field of view of a holographic imager the receptacle comprising at least one reagent intended to interact with biological agents present in the biological sample, the method comprises the following steps implemented repeatedly for a plurality of instants measurement of a measurement duration:
  • the method comprising, for a plurality of instants of measurement of the measurement duration included in a first half and a second half of the measurement duration:
  • the method further comprising, for at least one measurement instant included in a first half of the measurement duration, an initial conformity check of the sample biological comprising the comparison of the value of the distribution parameter with at least one threshold value defining a limit of a compliance range, and in the case where the value Whenever the distribution parameter is outside the compliance range, the measuring instrument issues a biological sample non-compliance alert.
  • said threshold value is a low threshold value corresponding to a low limit of the range of compliance, and in the case where the value of the distribution parameter is lower than the low threshold value, the measuring instrument emits an alert of non-compliance of the biological sample and/or said threshold value is a corresponding high threshold value at an upper limit of the compliance range, and in the case where the value of the distribution parameter is greater than the upper threshold value, the measuring instrument issues an alert of non-compliance of the biological sample;
  • the initial conformity check of the biological sample is implemented for at least one instant of measurement included in the first quarter of the measurement duration;
  • the initial conformity check of the biological sample is implemented for at least one instant of measurement included in the first hour of the measurement duration, or in the first 30 minutes of the measurement duration;
  • the distribution parameter is derived from a number of biological agents appearing in the holographic image
  • an area of the holographic image is between 5 and 20 times larger than a typical size of the biological agents of the biological sample
  • the presence or absence of biological agents in an area is determined by comparing a gray level value of the area with a threshold, or by comparing a pattern of the area with reference patterns from a database;
  • the holographic image is a hologram or an image reconstructed from a hologram
  • the analysis receptacle has at least two opposite transparent faces, and the holographic imager is configured so that the field of view extends over a depth of field of at least 100 iim between the two opposite transparent faces of the receptacle 'to analyse.
  • the invention also relates to an analysis instrument comprising a holographic imager with a field of view configured to acquire a holographic image and data processing means, the analysis instrument being configured to receive a biological sample in a receptacle of analysis in the field of view of a holographic imager, the receptacle comprising at least one reagent intended to interact with biological agents present in the biological sample, and to implement, in accordance with the steps of the invention, for a plurality of instants of measurement of the duration of measurement included in a first half and a second half of the duration of measurement:
  • the determination of the value of the distribution parameter comprising the determination, for each of a plurality of zones of the hologram, of the presence or not of biological agents in said zone, an analysis criterion of the biological sample from which the analysis results are obtained at the end of the measurement duration being a value of the distribution parameter representative of the quantitative spatial distribution d biological agents, and
  • an initial conformity check of the biological sample comprising the comparison of the value of the distribution parameter with at least one low threshold value, and in if the value of the distribution parameter is lower than the low threshold value, the measuring instrument emits an alert of non-compliance of the biological sample.
  • FIG. 1 shows an example of an analysis card comprising a plurality of receptacles in the form of wells that can be used for the placement of a biological sample to be analyzed, according to a possible embodiment of the invention
  • FIG. 2 schematically shows an example of a holographic imager that can be used in an analysis instrument according to a possible embodiment of the invention
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the steps of the analysis method according to a possible embodiment of the invention.
  • the method of analyzing a biological sample is carried out using an analysis instrument comprising a holographic imager with a field of view, the analysis instrument being configured to receive a biological sample in an analysis receptacle in the field of view of the holographic imager.
  • the biological analysis here is an in vitro analysis.
  • FIG. 1 shows an example of an analysis card 1 comprising a plurality of analysis receptacles 2 in the form of wells that can be used for placing a biological sample to be analyzed.
  • the analysis receptacles 2 are here organized according to a network two-dimensional on a plane, each receptacle 2 being associated with different analysis conditions, typically by means of different reagents present in the analysis receptacles 2.
  • the reagents consist of different antibiotics at different concentrations.
  • the use of an analysis card 1 is not required, but such an analysis card makes it possible to carry out a plurality of tests in a standardized manner during the same analysis period.
  • Each analysis receptacle 2 is at least partially transparent to at least one wavelength of light, visible or not, and preferably is at least partially transparent to the visible spectrum. This transparency allows the analysis of the biological sample contained therein by optical means such as the holographic imager.
  • an analysis receptacle 2 has at least two opposite transparent faces, so as to have a transparent axis for the propagation of light. These two opposite transparent faces are for example separated by less than 5 mm.
  • such an analysis card 1 may for example comprise a conduit 5 intended to be immersed in a volume 3 of inoculum prepared in a tube 4.
  • the inoculum is prepared by an operator who introduces biological agents, for example taken from a culture in a Petri dish by means of a stick or a swab, suspended in a saline solution, with a dilution corresponding to a determined range of turbidity, for example between 0.5 and 0.63 McF for bacteria as biological agents or else between 1.8 and 2.2 McF for yeasts as biological agents, the range depending on the type of analysis performed and the measuring instrument.
  • This preliminary suspension is then further diluted, for example with a factor of 20, or even 100, to analyze Gram- bacteria or with a factor of 10, or even 100, to analyze Gram+ bacteria.
  • This subsequent dilution can in particular be automated, and therefore be carried out by the measuring instrument after the tube 4 has been placed in the analysis instrument.
  • Other specific turbidity ranges can be used, depending on the protocols used.
  • the desired dilution can be obtained in one go, or as in the example above, in several times.
  • conduit 5 is then immersed in the volume 3 of inoculum resulting from the preparation in tube 4, and the assembly is introduced into the analysis instrument. Of course, all or part of these preparation steps can be automated.
  • the inoculum travels through the conduit 5, then by a fluidic circulation circuit provided in the analysis card 1, is distributed between the analysis receptacles 5. This movement of the inoculum in the conduit 5 and the card d analysis 1 can be caused by capillarity and/or depressurization of the air present at the open end of the tube 4.
  • the air present in the analysis card 1 which is at atmospheric pressure, leaves the analysis card 1 through the tube 5 at through the inoculum 3 and gives way to the inoculum 3 which thus rises through the tube 5 into the analysis card 1.
  • the biological sample constituted by the inoculum is then in place in an analysis receptacle 2.
  • the analysis instrument includes a holographic imager with a field of view configured to acquire a holographic image of that field of view.
  • the acquisition of a holographic image allows a significant depth of field, and therefore a very good detection sensitivity of biological agents.
  • the holographic imager is placed facing an analysis receptacle 2.
  • FIG. 2 schematically represents a holographic imager 10 in line arranged so that the field of view 11 of said holographic imager 10 is contained in the volume of biological sample contained in an analysis receptacle 2.
  • the analysis card 1, and therefore the analysis receptacles 2 that it comprises, is placed in an object plane of the holographic imager 10.
  • the holographic imager 10 defines an imaging axis 16, simplified here by a straight line corresponding to the optical axis but which may consist of a set of successive straight lines defining the light path, in depending on the configuration of the optical components of the holographic imager 10.
  • a light source 14 configured to illuminate the analysis receptacle 2 in the field of view (or "field-of-view") of the holographic imager 10 by means of an illumination beam of sufficiently coherent light.
  • the light source 14 can produce the illumination light, or simply be the termination of an optical fiber conveying this illumination light, optionally provided with a diaphragm or iris.
  • the illumination beam has the conventional characteristics for holographic imaging, without particular additional constraints.
  • the illumination beam can thus be monochromatic (for example with a wavelength around 640-670 nm) or possibly be composed of several wavelengths, for example used one after the other.
  • an image sensor 12 On the other side of the analysis receptacle 2, here on the optical axis 16, is an image sensor 12, which is a digital sensor such as for example a CMOS or CCD sensor.
  • the image sensor 12 is placed on an image plane of the holographic imager 10, and is configured to acquire a hologram, that is to say a spatial distribution of intensity of the interferences caused by interactions between the inoculum placed in the field of view 11 and the illumination beam.
  • the holographic imager 10 is here provided with a set of optical components 18 arranged between the analysis receptacle 2 and the digital image sensor 12 such as for example a microscope objective 18a and a tube lens 18b in the example shown.
  • An optical component such as the microscope objective 18a is however optional, the invention not being limited to holographic microscopy with lens.
  • the arrangement described here is of course a non-limiting example. Any holographic imager 10 can be used, with different optical components (with or without a microscope objective, etc.). Thus, as soon as a holographic imager 10 can acquire an image in which the interference patterns generated by the biological sample appear, this imager is suitable for implementing the method.
  • the holographic imager 10 is configured so that the field of view 11 extends over a depth of field of at least 100 ⁇ m in the analysis receptacle 2, along the optical axis 16, and preferably at least 150 ⁇ m, and more preferably at least 250 ⁇ m.
  • the analysis receptacle 2 comprises two opposite transparent faces organized along the optical axis 16, and the depth of field extends over at least 100 ⁇ m between the two opposite transparent faces of the analysis receptacle, and preferably at least 150 ⁇ m, and more preferably at least 250 ⁇ m.
  • the field of view 11 is understood as being the space in which the presence of biological agents can be determined from a hologram imaging said field of view 11.
  • the measuring instrument also includes components for processing data, such as a processor, memory, communication buses, etc. Insofar as these other components are specific only by the process that they implement and by the instructions that they contain, they are not detailed below.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the steps of the analysis method, which follow prior placement (step S1) of the biological sample in an analysis receptacle 2 in the field of view 11 of the imager holographic 10, detailed above.
  • the method comprises a plurality of cycles (steps S02) consisting of steps implemented repeatedly for a plurality of measurement instants of a measurement duration:
  • the analysis criterion of the biological sample can be any criterion derived from measurements on the acquired images which makes it possible to carry out the analysis of the biological sample, such as for example the monitoring of a measurement of turbidity by transmittance, as in prior art.
  • the method comprises, for at least one instant of measurement included in a first half of the measurement duration:
  • step S02a an acquisition (step S02a) of a holographic image of the biological sample by the holographic imager 10,
  • step S02b a determination, (step S02b) from the acquired holographic image, of a value of a distribution parameter representative of the quantitative spatial distribution of biological agents in the field of view 11.
  • the image acquired at each instant of measurement of the duration of measurement is a holographic image of the biological sample
  • the criterion of analysis of the biological sample is a value of a distribution parameter representative of the quantitative spatial distribution of biological agents in the field of view 11 of the holographic imager 10.
  • the analysis results (step S06) can be obtained from the values of the parameter of distribution determined for each instant of measurement.
  • the acquisition of a holographic image of the biological sample and that the determination of the distribution parameter are carried out only for measurement instants in the beginning (included in a first half) of the measurement duration , and not for subsequent measurement instants (in a second half of the measurement duration).
  • the values of the distribution parameter are only used for checking the initial conformity, and not for obtaining the analysis results, which are then obtained by another criterion for analyzing the biological sample.
  • the measurement instants for which the initial conformity check is not implemented it is possible for the measurement instants for which the initial conformity check is not implemented, to use a non-holographic imager to acquire the images making it possible to determine this other analysis criterion, or to use the holographic imager to acquire non-holographic images, or even to acquire holographic images without determining a distribution value, but by determining other analysis criteria from the acquired holographic images.
  • the holographic imager 10 acquires a hologram, which has the advantage of offering a great depth of field, and therefore a great sensitivity for detecting biological agents in the biological sample. .
  • the light source 14 When acquiring a hologram, the light source 14 emits a reference illumination beam, which can be translated into a reference plane wave propagating in the Z direction along the imaging axis 16.
  • the wave scattered by the biological agents and the reference background interfere on the image sensor 12 to form the hologram. Since a digital image sensor 12 is only sensitive to the intensity of the electromagnetic field, the hologram corresponds to the spatial intensity distribution of the total field corresponding to the addition of scattered background and reference background. .
  • the holographic image used may be the hologram or may be an image reconstructed by calculation of backpropagation from the hologram, using a propagation algorithm for example based on Rayleigh Sommerfeld's diffraction theory.
  • Using the hologram without reconstruction makes it possible to benefit from a high detection sensitivity, because each biological agent appears in the hologram surrounded by rings corresponding to the interference figures caused by the presence of said biological agents, thus facilitating detection. the presence of these biological agents.
  • the non-reconstruction saves time and computational resources.
  • using a reconstructed image has other advantages, such as making it possible to precisely locate, possibly in three dimensions, the biological agents appearing in the reconstructed image.
  • the acquired holographic image contains representations of the biological agents in the field of view 11, spatially distributed in the holographic image.
  • the holographic image thus makes it possible to preserve the quantitative distribution of biological agents in the field of view 11.
  • a plurality of biological agents are present in the field of view 11 at a plurality of positions, a plurality of representations of these biological agents will be present at a plurality of locations in the holographic image. It is therefore possible to determine a distribution parameter representative of the quantitative spatial distribution of biological agents in the field of view 11.
  • the distribution parameter does not only take account of the overall biomass of the sample estimated from an overall effect affecting a characteristic of the sample, as an analysis criterion such as transmittance could do, but accounts for the spatial distribution of biological agents in sample 1, and therefore the concentration of biological agents , thanks to the two-dimensional information of the image holographic.
  • the distribution parameter is thus constructed from the consideration of this quantitative spatial distribution in the holographic image, a reflection of the quantitative spatial distribution in the sample.
  • This distribution parameter is for example a number of biological agents in the field of view 11 and appearing in the holographic image, or for example a proportion of the extent of the holographic image occupied by biological agents. For example, it is possible to count the number of biological agents in the holographic image.
  • the interference patterns typically appear as rings around a biological agent.
  • a ring is a particularly easy shape to identify by means of a shape recognition algorithm, and it is therefore possible to analyze the holographic image in order to identify all the rings appearing therein, corresponding to as many biological agents .
  • the method can comprise the determination, for each of a plurality of zones of the holographic image, typically several thousand zones, of the presence or absence of biological agents in said zone.
  • the size of the zone is chosen to be small enough to make it possible to isolate biological agents without however necessarily cutting off the representation of the latter.
  • the area can be between 5 and 20 times larger than the typical size of the biological agents sought.
  • the distribution parameter can then correspond to a number of zones with the presence of biological agents for example, or more easily correspond to a number of zones where the biological agents are absent, which is easier to highlight.
  • the determination of the presence or absence of a biological agent in an area of the holographic image can for example be determined by comparing the average gray level (or light intensity) in an area with a gray level threshold. It is also possible to carry out a comparison of the pattern of the zone with a database of reference patterns corresponding to a plurality of appearances of biological agents, and to identify the reference pattern presenting the greatest similarity with the area pattern.
  • the characteristics associated with this reference pattern are considered to be those of the zone pattern, which makes it possible, in addition to detecting the presence of biological agents in the zone, to deduce additional characteristics, such as the individual growth of the biological agents, depending on the characteristics of the appearances entered in the database.
  • the cycles (steps S02) of acquiring holographic images and determining distribution parameters are repeated for each analysis receptacle 2 for at least one measurement instant of a plurality of measurement instants of a measurement duration. As mentioned above, it is possible to repeat the cycles (steps S02) of acquiring holographic images and determining the value of the distribution parameter for all the instants of measurement.
  • the distribution parameters thus determined can then be used to generate the analysis results. These results can for example be a temporal monitoring of the evolution of the distribution parameters, or identification indications which are derived therefrom.
  • the measurement time typically extends over several hours, and corresponds to the monitoring time considered necessary to highlight different changes in the biomass in the analysis receptacles 2 in order to identify the differences interactions between biological agents and reagents.
  • the method comprises an initial compliance check (step S03) of the biological sample placed implemented from at least one distribution parameter, in order to verify that the biological sample initially exhibits the expected qualities, and therefore complies with the requirements of the analysis method.
  • This initial conformity check of the biological sample can be implemented once at the start of the measurement duration, or can be implemented for a plurality of one instant of measurement from the start of the measurement duration: the first half of the measurement duration, preferably the first quarter of the measurement duration, or the first hour, preferably the first 30 minutes or more preferably the first 15 minutes of the measurement duration.
  • the initial compliance check is based on a value of the distribution parameter determined at the start of the measurement duration, so that a non-compliance can be detected as soon as possible.
  • the initial conformity check comprises comparing the value of the distribution parameter with at least one threshold value defining a limit of a conformity range, and in the event that the value of the distribution parameter is outside the conformity range , the measuring instrument issues an alert of non-compliance (S05) of the biological sample.
  • the threshold value may be a low threshold value, and in the event that the value of the distribution parameter is lower than the low threshold value (step S04), the measuring instrument issues an alert of non-compliance of the biological sample (step S05).
  • the threshold value can be a high threshold value, greater than the value low threshold, and during the initial compliance check, the value of the distribution parameter is compared with this high threshold value, , and if the value of the distribution parameter is greater than the high threshold value, the measuring instrument emits an alert of non-compliance of the biological sample.
  • the low threshold value corresponds to a low limit of a compliance range of the distribution parameter
  • the high threshold value corresponds to an upper limit of the compliance range of the distribution parameter.
  • This conformity range corresponds to the range in which the initial value of the distribution parameter must lie so that the analysis can be carried out, and in particular to allow non-erroneous interpretation of the analysis results.
  • the compliance range therefore depends on the type of analysis that is done and the settings of the measuring instrument. For example, for an antibiogram of Gram+ bacteria, the compliance range can correspond to a turbidity value between 0.05 and 0.063 McF, and can correspond to a turbidity value between 0.025 and 0.032 McF, for an antibiogram of bacteria Gram- or even less depending on the prescribed dilution values. As soon as the initial value of the distribution parameter is not in the compliance range (below the low threshold value or above the high threshold value), the biological sample does not initially exhibit the expected qualities and is therefore improper.
  • the compliance range can be half-open, and for example extend from the low limit without high limit, or vice versa.
  • the alert of non-compliance of the biological sample can take several forms.
  • the analysis instrument includes an electro-acoustic transducer, and the output of the non-compliance alert includes the emission of sounds to an operator to warn him of the non-compliance.
  • the emission of the non-compliance alert may comprise the emission of a light signal intended for the operator.
  • the analysis instrument typically comprises a man-machine interface provided with a display screen, and the emission of the non-compliance alert can comprise the display on the screen of a message warning an operator of the non-compliance of the inoculum, preferably by indicating the value of the distribution parameter.
  • Other types of alerts can be provided, the important thing being to warn the operator of the analysis instrument that the sample is initially non-compliant, so that it can be remedied as quickly as possible.
  • the biological sample can be analyzed with the obtaining of valid analysis results (step S06) at the end of the measurement duration, whether these analysis results are obtained from values of the distribution parameter or of another analysis criterion.
  • the validity of the final analysis results is therefore conditional on the conformity of the initial sample. It is also possible, when the biological sample is non-compliant, that the issuance of the non-compliance alert includes the stopping of the analysis by the analysis instrument.

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Abstract

Un procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument d'analyse, comprenant, à la suite de la mise en place de l'échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse dans un champ de vue d'un imageur holographique (S01), les étapes suivantes (S02) mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure : - acquisition (S02a) d'une image holographique de l'échantillon biologique, - détermination, (S02b) à partir de l'image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue, le procédé comprenant, pour au moins un instant de mesure compris dans la première heure de la durée de mesure, un contrôle de conformité initiale (S03) comprenant la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec une plage de conformité, et l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité (S05) si ladite valeur est en dehors.

Description

Procédé d'analyse d'un échantillon biologique avec analyse de conformité initiale
Domaine technique
La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse d'échantillons biologiques par imagerie, et plus particulièrement concerne le contrôle de la conformité d'un échantillon biologique dans le cadre de l’analyse d’agents biologiques dans l’échantillon biologique.
Arrière-plan technologique
L'analyse d'échantillons biologiques par imagerie fait appel à un instrument d'analyse optique dans lequel sont introduits les échantillons biologiques à analyser. Un échantillon biologique est constitué par une suspension d’agents biologiques ou par un mélange de suspensions d’agents biologiques. Les agents biologiques sont par exemple des microorganismes (bactéries, levures, moisissure, etc.). L’analyse d’un agent biologique dans l’échantillon biologique peut comprendre l’identification dudit agent biologique ou la détermination d'une caractéristique de cet agent biologique, comme par exemple la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique qui serait efficace à l'encontre dudit agent biologique.
L’échantillon biologique, appelé inoculum dans son état initial est disposé dans un réceptacle, ou puits, au moins partiellement transparent à travers lequel l'instrument d'analyse peut procéder à des mesures de propriétés optiques de l’échantillon biologique. Le puits contient un milieu nutritif et également un ou plusieurs réactifs, tels qu’un substrat enzymatique ou des antibiotiques, destinés à interagir avec des agents biologiques présents dans l’échantillon biologique. Généralement, une pluralité de puits sont prévus pour recevoir chacun de l’inoculum, chacun des puits étant muni de réactifs différents ou d'un même réactif à des concentrations différentes. En fonction de la nature des agents biologiques présents dans l’inoculum, ceux-ci réagissent avec certains réactifs, et pas avec d'autres réactifs, ou à certaines concentrations et pas à d'autres. Par exemple, dans le cadre d'un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations, et les agents biologiques vont se multiplier dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils ne sont pas sensibles ou dans lesquels la concentration en antibiotiques est insuffisante, ou verront au contraire leur développement plus ou moins entravés dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils sont sensibles à des concentrations suffisantes. Ces différences d'interactions entre les agents biologiques et les réactifs se traduisent donc par des évolutions différentes de la biomasse dans les puits. La biomasse, c'est-à-dire la quantité de matière biologique présente dans chaque puits, influe directement les propriétés optiques de l'échantillon biologique présent dans chaque puits, puisque les agents biologiques présentent eux-mêmes des propriétés optiques différentes de la solution dans laquelle ils sont en suspension.
En particulier, la transmittance de l’échantillon biologique est affectée par l’évolution de la concentration en agents biologiques. Pour cette raison, il avait été développé des procédés d'analyse d'échantillons biologiques basés sur la détermination de l'évolution au cours du temps, lors d'une phase d'incubation, de la transmittance globale (ou absorbance, ce qui est équivalent) d'un puits rempli de l'échantillon biologique, afin d'en déterminer une mesure de turbidité, exprimée typiquement en McFarland (McF). Cette mesure de turbidité est directement représentative de la biomasse d'agents biologiques dans l'échantillon biologique. Pour ce faire, une diode émettrice éclaire l’échantillon avec un faisceau lumineux d’intensité connue, et une photodiode ponctuelle disposée à l'opposé de la diode émettrice par rapport à l'échantillon permet de déterminer l’intensité lumineuse reçue après que le faisceau lumineux ait traversé l’échantillon biologique. Toutefois, une telle mesure en transmittance présente une sensibilité assez faible, de sorte qu'il n'est pas possible de mesurer une turbidité inférieure à 0,05 McF, voire inférieure à 0,1 McF.
E'inoculum est préparé par un opérateur qui introduit des agents biologiques en suspension dans une solution saline ou en diluant un échantillon biologique (urine ou hémoculture positive par exemple) de façon à obtenir une concentration bactérienne entre 107 et 109 UFC/ml. Fa dilution dans la suspension saline doit initialement correspondre à une plage particulière pour permettre l’analyse. Cette plage de conformité peut être exprimée directement en valeur de turbidité à l’attention de l’opérateur préparant l’inoculum, éventuellement avec une valeur préalable qui est plus tard rediluée. A titre d'exemple, pour certains protocoles, une suspension préalable doit être calibrée entre 0,5 et 0,63 McF pour des bactéries en tant qu' agents biologiques ou encore entre 1,8 et 2,2 McF pour des levures en tant qu' agents biologiques. Un appareil de mesure de transmittance est typiquement utilisé pour vérifier que la turbidité de la suspension préalable se trouve dans la plage de conformité requise. Cette suspension préalable est ensuite diluée encore, par exemple avec un facteur 20 pour analyser des bactéries Gram- ou avec un facteur 10 pour analyser des bactéries Gram+. Ainsi, dans cet exemple, la conformité initiale de l’inoculum pour des bactéries requiert une concentration de biomasse (exprimée en turbidité) comprise entre 0,025 McF et 0,0315 McF pour des bactéries Gram- et comprise entre 0,05 McF et 0,063 McF pour des bactéries Gram +. Des concentrations plus faibles sont couramment utilisées dans d'autres protocoles. Il en résulte que la concentration en agents biologiques dans un inoculum est initialement inférieure à la limite de détection des instruments mesurant la transmittance.
Or, en raison des manipulations effectuées par l'opérateur, il existe un risque d'erreur, ou tout du moins que l'inoculum ne présente pas initialement les qualités attendues, et donc n'est pas conforme aux exigences du procédé d'analyse. En outre, il existe toujours la possibilité d’un dysfonctionnement d’une partie de l’instrument d’analyse, par exemple une partie mécanique en charge de transporter l'inoculum jusqu'aux puits. Cette inadéquation entre les qualités de l’inoculum initiale et celles attendues n’est pas immédiatement perceptible. En effet, la seule mesure disponible est la transmittance globale, et sa faible sensibilité ne permet pas initialement de sortir du bruit de fond de mesure. Il faut un certain temps d’incubation, typiquement plusieurs heures correspondant par exemple à plusieurs cycles de division bactérienne, pour que la concentration augmente et que la transmittance sorte du bruit de fond de la mesure.
Lorsque l'inoculum n'est pas conforme, deux cas principaux se présentent alors :
- soit la concentration initiale en agents biologiques était tellement faible que la croissance de la biomasse d'agents biologiques ne sera pas détectée même après plusieurs heures d’incubation (par exemple dans un puits témoin doté uniquement d’un milieu nutritif sans autre réactif) : l’instrument d’analyse rapportera alors une erreur et l’opérateur devra à nouveau préparer un nouvel inoculum ;
- soit la concentration initiale en agents biologiques était non conforme (trop faible ou trop élevée), mais suffisamment élevée pour que la croissance de la biomasse d'agents biologiques soit détectée après plusieurs heures d'incubation : aucune erreur ne sera alors rapportée par l’instrument d’analyse, mais les résultats d’analyse (par exemple la concentration minimale inhibitrice, appelée « CMI », pour un test de résistance aux antibiotiques) seront erronés.
Dans le premier cas, la perte de temps engendrée par l’aspect tardif de la détection d'erreur peut être extrêmement préjudiciable, en particulier lorsque les résultats de l'analyse sont attendus pour traiter un patient. Dans le second cas, les résultats erronés peuvent mener à des diagnostiques erronés, et donc à des traitements inadéquats pour un patient.
Présentation de l'invention L'invention vise donc à permettre de disposer d'un procédé et d'un instrument d’analyse permettant de s'assurer, sans perte de temps, de la fiabilité des résultats finaux d'analyse.
A cet effet, l'invention propose un procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d’un instrument d’analyse, dans lequel, à la suite de la mise en place de l’échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse dans un champ de vue d'un imageur holographique le réceptacle comprenant au moins un réactif destiné à interagir avec des agents biologiques présents dans l'échantillon biologique, le procédé comprend, les étapes suivantes mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- acquisition d'une image de l'échantillon biologique,
- détermination, à partir de l’image acquise, d’un critère d’analyse de l’échantillon biologique, et obtention de résultats d’analyse à partir du critère d’analyse de l’échantillon biologique à la fin de la durée de mesure, le procédé comprenant, pour une pluralité d'instants de mesure de la durée de mesure compris dans une première moitié et une seconde moitié de la durée de mesure :
- une acquisition d'une image holographique de l'échantillon biologique par l'imageur holographique,
- une détermination, à partir de l'image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d’agents biologiques dans le champ de vue, la détermination de la valeur du paramètre de répartition comprenant la détermination, pour chacune d'une pluralité de zones de l'image holographique, de la présence ou non d'agents biologiques dans ladite zone, le critère d'analyse de l'échantillon biologique à partir duquel sont obtenus les résultats d'analyse étant une valeur du paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d’agents biologiques, et le procédé comprenant en outre pour au moins un instant de mesure compris dans une première moitié de la durée de mesure, un contrôle de conformité initiale de l’échantillon biologique comprenant la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec au moins une valeur seuil définissant une limite d’une plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est en dehors de la plage de conformité, l’instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l’échantillon biologique.
L’invention est avantageusement complétée par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs différentes combinaisons possibles :
- ladite valeur seuil est une valeur seuil basse correspondant à une limite basse de la plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est inférieure à la valeur seuil basse, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l'échantillon biologique et/ou ladite valeur seuil est une valeur seuil haute correspondant à une limite haute de la plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est supérieure à la valeur seuil haute, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l'échantillon biologique ;
- le contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique est mis en œuvre pour au moins un instant de mesure compris dans le premier quart de la durée de mesure ;
- le contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique est mis en œuvre pour au moins un instant de mesure compris dans la première heure de la durée de mesure, ou dans les premières 30 minutes de la durée de mesure ;
- le paramètre de répartition est dérivé d’un nombre d’agents biologiques apparaissant dans l’image holographique ;
- une zone de l’image holographique est entre 5 et 20 fois plus grande qu’une taille typique des agents biologiques de l’échantillon biologique ;
- la présence ou non d’agents biologiques dans une zone est déterminée en comparant une valeur de niveau de gris de la zone avec un seuil, ou en comparant un motif de la zone avec des motifs de référence d’une base de données ;
- l'image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme ;
- le réceptacle d’analyse présente au moins deux faces transparentes opposées, et l’imageur holographique est configuré pour que le champ de vue s'étende sur une profondeur de champ d'au moins 100 iim entre les deux faces transparentes opposées du réceptacle d'analyse.
L’invention concerne également un instrument d’analyse comprenant un imageur holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l’instrument d’analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse dans le champ de vue d'un imageur holographique, le réceptacle comprenant au moins un réactif destiné à interagir avec des agents biologiques présents dans l’échantillon biologique, et pour mettre en œuvre, conformément aux étapes de l'invention, pour une pluralité d'instants de mesure de la durée de mesure compris dans une première moitié et une seconde moitié de la durée de mesure :
- une acquisition d'une image holographique de l'échantillon biologique,
- une détermination, à partir de l'image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue, la détermination de la valeur du paramètre de répartition comprenant la détermination, pour chacune d'une pluralité de zones de l'hologramme, de la présence ou non d’agents biologiques dans ladite zone, un critère d’analyse de l’échantillon biologique à partir duquel sont obtenus les résultats d’analyse à la fin de la durée de mesure étant une valeur du paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques, et
- pour au moins un instant de mesure compris dans une première moitié d’une durée de mesure, un contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique comprenant la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec au moins une valeur seuil basse, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est inférieure à la valeur seuil basse, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l'échantillon biologique.
Présentation des figures
D’autres caractéristiques, buts et avantages de l’invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 montre un exemple de carte d'analyse comportant une pluralité de réceptacles sous forme de puits pouvant être utilisée pour la mise en place d’un échantillon biologique à analyser, selon un mode de réalisation possible de l’invention ;
- la figure 2 montre schématiquement un exemple d'imageur holographique pouvant être utilisé dans un instrument d’analyse selon un mode de réalisation possible de l’invention ;
- la figure 3 est un diagramme illustrant des étapes du procédé d’analyse selon un mode de réalisation possible de l’invention.
Description détaillée
Le procédé d'analyse d'un échantillon biologique est mené au moyen d'un instrument d'analyse comprenant un imageur holographique avec un champ de vue, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse dans le champ de vue de l’imageur holographique. L’analyse biologique est ici une analyse in vitro.
La figure 1 montre un exemple de carte d'analyse 1 comportant une pluralité de réceptacles d’analyse 2 sous forme de puits pouvant être utilisée pour la mise en place d’un échantillon biologique à analyser. Les réceptacles d’analyse 2 sont ici organisés selon un réseau bidimensionnel sur un plan, chaque réceptacle 2 étant associé à des conditions d'analyse différentes, typiquement au moyen de réactifs différents présents dans les réceptacles d’analyse 2. Par exemple, dans le cadre d'un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations. L'utilisation d’une carte d’analyse 1 n’est pas requise, mais une telle carte d’analyse permet de procéder pendant une même durée d’analyse à une pluralité de test de façon standardisée.
Chaque réceptacle d'analyse 2 est au moins partiellement transparent à au moins une longueur d’onde de lumière, visible ou non, et de préférence est au moins partiellement transparent pour le spectre visible. Cette transparence permet l'analyse de l'échantillon biologique qui y est contenu par des moyens optiques tels que l’imageur holographique. De préférence, et comme visible sur la figure 1 , un réceptacle d'analyse 2 présente au moins deux faces transparentes opposées, de sorte à présenter un axe transparent pour la propagation de la lumière. Ces deux faces transparentes opposées sont par exemple distantes de moins 5 mm.
Afin de permettre le remplissage des réceptacles d'analyse 2, une telle carte d'analyse 1 peut par exemple comporter un conduit 5 destiné à être plongé dans un volume 3 d’inoculum préparé dans un tube 4. Comme expliqué précédemment, l'inoculum est préparé par un opérateur qui introduit des agents biologiques, par exemple prélevés d’une culture dans une boîte de Petri au moyen d’un tige ou d’un écouvillon, en suspension dans une solution saline, avec une dilution correspondant à une plage déterminée de turbidité, par exemple entre 0,5 et 0,63 McF pour des bactéries en tant qu’ agents biologiques ou encore entre 1,8 et 2,2 McF pour des levures en tant qu’ agents biologiques, la plage dépendant du type d’analyse effectuée et de l’instrument de mesure. Cette suspension préalable est ensuite diluée encore, par exemple avec un facteur 20, voire 100, pour analyser des bactéries Gram- ou avec un facteur 10, voire 100, pour analyser des bactéries Gram+. Cette dilution ultérieure peut notamment être automatisée, et donc être effectuée par l’instrument de mesure après la mise en place du tube 4 dans l’instrument d’analyse. Bien entendu d’autres plages déterminées de turbidité peuvent être utilisées, en fonction des protocoles utilisés. La dilution désirée peut être obtenue en une fois, ou comme dans l’exemple ci-dessus, en plusieurs fois.
Une extrémité du conduit 5 est alors plongée dans le volume 3 d’inoculum résultant de la préparation dans le tube 4, et l'ensemble est introduit dans l'instrument d'analyse. Bien entendu, tout ou partie de ces étapes de préparation peuvent être automatisées. L'inoculum voyage à travers le conduit 5, puis par un circuit de circulation fluidique ménagé dans la carte d'analyse 1, se répartit entre les réceptacles d'analyse 5. Ce déplacement de l'inoculum dans le conduit 5 et la carte d'analyse 1 peut être causé par capillarité et/ou par une dépressurisation de l'air présent à l'extrémité ouverte du tube 4. Par exemple avec la dépressurisation, l'air présent dans la carte d'analyse 1 , qui est à pression atmosphérique, sort de la carte d'analyse 1 par le tube 5 à travers l'inoculum 3 et laisse sa place à l'inoculum 3 qui remonte ainsi par le tube 5 dans la carte d’analyse 1. A l’inverse, il est possible de procéder à une application d’une pression d'air s'exerçant sur l'inoculum par l'intermédiaire de l'extrémité ouverte du tube 4 pour provoquer la remontée du tube 5 par l’inoculum 3. L’échantillon biologique constitué par l'inoculum est alors en place dans un réceptacle d'analyse 2.
L'instrument d'analyse comprend un imageur holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique de ce champ de vue. L’acquisition d’une image holographique permet une profondeur de champ importante, et donc une très bonne sensibilité de détection des agents biologiques. Lors de l’acquisition d’une image holographique, l'imageur holographique est placé face à un réceptacle d'analyse 2. A titre d'exemple non limitatif, la figure 2 représente schématiquement un imageur holographique 10 en ligne disposé de sorte que le champ de vue 11 dudit imageur holographique 10 se trouve contenu dans le volume d'échantillon biologique contenu dans un réceptacle d'analyse 2. La carte d'analyse 1, et donc les réceptacles d’analyse 2 qu’elle comprend, est placée dans un plan objet de l’imageur holographique 10. L'imageur holographique 10 définit un axe d'imagerie 16, simplifié ici par une droite correspondant à l’axe optique mais qui peut consister en un ensemble de droites successives définissant le trajet lumineux, en fonction de la configuration des composants optiques de l’imageur holographique 10.
D’un côté du réceptacle d’analyse 2, ici sur l’axe optique 16, se trouve une source lumineuse 14 configurée pour illuminer le réceptacle d’analyse 2 dans le champ de vue (ou « fïeld-of-view ») de l'imageur holographique 10 au moyen d'un faisceau d'illumination de lumière suffisamment cohérente. La source lumineuse 14 peut produire la lumière d'illumination, ou être simplement la terminaison d'une fibre optique acheminant cette lumière d'illumination, éventuellement pourvue d'un diaphragme ou iris. Le faisceau d'illumination présente les caractéristiques conventionnelles pour l'imagerie holographique, sans contraintes additionnelle particulière. Le faisceau d'illumination peut ainsi être monochromatique (par exemple avec une longueur d’onde autour de 640-670 nm) ou possiblement être composé de plusieurs longueurs d’onde, par exemple utilisées l’une après l’autre.
De l’autre côté du réceptacle d’analyse 2, ici sur l’axe optique 16, se trouve un capteur d’image 12, qui est un capteur numérique comme par exemple un capteur CMOS ou CCD. Le capteur d’image 12 est placé sur un plan image de l’imageur holographique 10, et est configuré pour acquérir un hologramme, c'est-à-dire une distribution spatiale d'intensité des interférences causées par des interactions entre l'inoculum placé dans le champ de vue 11 et le faisceau d’illumination.
L'imageur holographique 10 est ici muni d'un ensemble d'organes optiques 18 disposés entre le réceptacle d’analyse 2 et le capteur d’image numérique 12 comme par exemple un objectif de microscope 18a et une lentille de tube 18b dans l'exemple illustré. Un organe optique tel que l’objectif de microscope 18a est cependant optionnel, l’invention n’étant pas limitée à la microscopie holographique avec lentille. L’arrangement décrit ici est bien entendu un exemple non limitatif. Tout imageur holographique 10 peut être utilisé, avec différents organes optiques (avec ou sans objectif de microscope, etc.). Ainsi, dès lors qu'un imageur holographique 10 peut acquérir une image dans laquelle apparaissent les motifs d’interférence générées par l’échantillon biologique, cet imageur convient à la mise en œuvre du procédé. De préférence toutefois, l'imageur holographique 10 est configuré pour que le champ de vue 11 s'étende sur une profondeur de champ d'au moins 100 um dans le réceptacle d'analyse 2, le long de l'axe optique 16, et de préférence sur au moins 150 um, et de préférence encore sur au moins 250 um. Typiquement, le réceptacle d'analyse 2 comprend deux faces transparentes opposées organisées le long de l'axe optique 16, et la profondeur de champ s'étend sur au moins 100 um entre les deux faces transparentes opposées du réceptacle d'analyse, et de préférence sur au moins 150 um, et de préférence encore sur au moins 250 um. Le champ de vue 11 s'entend comme étant l'espace dans lequel la présence d'agents biologiques peut être déterminée à partir d'un hologramme imageant ledit champ de vue 11.
L’instrument de mesure comprend également des composants permettant de traiter des données, tel qu'un processeur, une mémoire, des bus de communication, etc. Dans la mesure où ces autres composants ne sont spécifiques que par le procédé qu'ils mettent en œuvre et par les instructions qu'ils contiennent, ils ne sont pas détaillés dans la suite.
La figure 3 est un diagramme illustrant des étapes du procédé d'analyse, qui font suite à une mise en place (étape SI) préalable de l'échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse 2 dans le champ de vue 11 de l'imageur holographique 10, détaillée plus haut. Le procédé comprend une pluralité de cycles (étapes S02) constitués d'étapes mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- acquisition d'une image de l'échantillon biologique,
- détermination, à partir de l’image acquise, d’un critère d’analyse de l’échantillon biologique.
Ces cycles sont typiquement répétés selon une période allant de une minute à 30 minutes, en fonction de la rapidité de l’instrument d’analyse, du nombre d’échantillons biologiques traités en parallèle, et par exemple en fonction du nombre de réceptacles d'analyse 2 dans une carte d’analyse 1. La durée de mesure s'étend sur plusieurs heures, et typiquement plus de 10 heures, résultants en plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'instants de mesure. Le critère d'analyse de l'échantillon biologique peut être tout critère dérivé de mesures sur les images acquises qui permet de faire l’analyse de l’échantillon biologique, comme par exemple le suivi d’une mesure de turbidité par transmittance, comme dans l’art antérieur.
Toutefois, le procédé comprend, pour au moins un instant de mesure compris dans une première moitié de la durée de mesure :
- une acquisition (étape S02a) d'une image holographique de l'échantillon biologique par l’imageur holographique 10,
- une détermination, (étape S02b) à partir de l'image holographique acquise, d'une valeur d’un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d’agents biologiques dans le champ de vue 11.
Il est possible que l'image acquise à chaque instant de mesure de la durée de mesure soit une image holographique de l'échantillon biologique, et que pour chaque image acquise, le critère d’analyse de l’échantillon biologique soit une valeur d’un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue 11 de l'imageur holographique 10. Dans ce cas, les résultats d'analyse (étape S06) peuvent être obtenus à partir des valeurs du paramètre de répartition déterminés pour chaque instant de mesure.
Il est également possible que l'acquisition d'une image holographique de l'échantillon biologique et que la détermination du paramètre de répartition ne soient menées que pour des instants de mesure dans le début (compris dans une première moitié) de la durée de mesure, et non pas pour des instants de mesure compris ensuite (dans une seconde moitié de la durée de mesure). Dans ce cas, les valeurs du paramètre de répartition ne sont utilisées que pour le contrôle de la conformité initiale, et non pas pour obtenir les résultats d’analyse, qui sont alors obtenus par un autre critère d'analyse de l'échantillon biologique. A cet égard, il est possible pour les instants de mesure pour lesquels le contrôle de la conformité initiale n'est pas mis en œuvre, d'utiliser un imageur non holographique pour acquérir les images permettant de déterminer cet autre critère d'analyse, ou d'utiliser l'imageur holographique pour acquérir des images non-holographiques, ou bien encore d'acquérir des images holographiques sans déterminer une valeur de répartition, mais en déterminant d’autres critères d’analyse à partir des images holographiques acquises. Lors de l'acquisition d'une image holographique, l'imageur holographique 10 acquiert un hologramme, ce qui présente l’avantage d’offrir une grande profondeur de champ, et donc une grande sensibilité de détection des agents biologiques dans l'échantillon biologique. Lors de l’acquisition d’un hologramme, la source lumineuse 14 émet un faisceau d’illumination de référence, qui peut être traduite par une onde plane de référence se propageant dans la direction Z le long de l'axe d'imagerie 16. Les agents biologiques présents dans le champ de vue 11 à l'intérieur du réceptacle d'analyse 2, par leurs propriétés de diffraction, diffusent la lumière de référence incidente. L'onde diffusée par les agents biologiques et fonde de référence interfèrent sur le capteur d’image 12 pour former l’hologramme. Puisqu'un capteur d'image 12 numérique n'est sensible qu'à l'intensité du champ électromagnétique, l'hologramme correspond à la distribution spatiale d'intensité du champ total correspondant à l'addition de fonde diffusée et de fonde de référence. L'image holographique exploitée peut être l'hologramme ou peut être une image reconstruite par calcul de rétropropagation à partir de l'hologramme, en utilisant un algorithme de propagation par exemple basé sur la théorie de la diffraction de Rayleigh Sommerfeld. Utiliser l'hologramme sans reconstruction permet de bénéficier d'une grande sensibilité de détection, car chaque agent biologique apparaît dans l'hologramme entouré d’anneaux correspondant aux figures d’interférences causées par la présence desdits agents biologiques, facilitant d’autant la détection de la présence de ces agents biologiques. En outre, la non-reconstruction permet un gain de temps et de ressource de calcul. Toutefois, utiliser une image reconstruite présente d'autres avantages, comme celui de permettre de localiser précisément, possiblement en trois dimensions, les agents biologiques apparaissant dans l’image reconstruite.
L’image holographique acquise contient des représentations des agents biologiques dans le champ de vue 11, réparties spatialement dans l'image holographique. L'image holographique permet ainsi de conserver la répartition quantitative d’agents biologiques dans le champ de vue 11. Ainsi, si une pluralité d’agents biologiques sont présents dans le champ de vue 11 à une pluralité de positions, une pluralité de représentations de ces agents biologiques seront présentes à une pluralité d’emplacements de l’image holographique. Il est donc possible de déterminer un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue 11. Ainsi, le paramètre de répartition ne rend pas compte de la seule biomasse globale de l'échantillon estimée à partir d'un effet global affectant une caractéristique de l'échantillon, comme pouvait le faire un critère d'analyse tel que la transmittance, mais rend compte de la répartition spatiale des agents biologiques dans l'échantillon 1, et donc la concentration d'agents biologiques, grâce à l'information bidimensionnelle de l'image holographique. Le paramètre de répartition est ainsi construit à partir de la prise en compte de cette répartition spatiale quantitative dans l'image holographique, reflet de la répartition spatiale quantitative dans l'échantillon.
Ce paramètre de répartition est par exemple un nombre d'agents biologiques dans le champ de vue 11 et apparaissant dans l'image holographique, ou par exemple une proportion de l’étendue de l’image holographique occupée par des agents biologiques. Il est par exemple possible de compter le nombre d’agents biologiques dans l’image holographique. Lorsque l'image holographique est un hologramme, les figures d'interférence apparaissent typiquement sous forme d'anneaux autour d'un agent biologique. Un anneau est une forme particulièrement aisée à identifier au moyen d'un algorithme de reconnaissance de forme, et il est donc possible d'analyser l'image holographique afin d'y recenser tous les anneaux y apparaissant, correspondant à autant d’agents biologiques.
Afin de simplifier cette détermination du paramètre de répartition, le procédé peut comprendre la détermination, pour chacune d'une pluralité de zones de l'image holographique, typiquement plusieurs milliers de zones, de la présence ou non d’agents biologiques dans ladite zone. La taille de la zone est choisie suffisamment petite pour permettre d'isoler des agents biologiques sans toutefois couper nécessairement la représentation de ceux-ci. Par exemple, la zone peut être entre 5 et 20 fois plus grande que la taille typique des agents biologiques recherchés. Le paramètre de répartition peut alors correspondre à un nombre de zones avec présence d’agents biologiques par exemple, ou plus facilement correspondre à un nombre de zones où les agents biologiques sont absents, ce qui est plus facile à mettre en évidence.
La détermination de la présence ou non d’un agent biologique dans une zone de l’image holographique peut par exemple être déterminée par comparaison du niveau de gris moyen (ou d’intensité lumineuse) dans une zone avec un seuil de niveau de gris. Il est également possible de procéder à une comparaison du motif de la zone avec une base de données de motifs de référence correspondants à une pluralité d’apparences d’agents biologiques, et d’identifier le motif de référence présentant la plus grande similarité avec le motif de zone. Les caractéristiques associées à ce motif de référence sont considérées comme étant celles du motif de zone, ce qui permet, outre de détecter la présence d’agents biologiques dans la zone, de déduire des caractéristiques supplémentaires, tel que la croissance individuelle des agents biologiques, en fonction des caractéristiques des apparences renseignées dans la base de données.
Les cycles (étapes S02) d’acquisition d’images holographiques et de détermination de paramètres de répartition sont répétés pour chaque réceptacle d'analyse 2 pour au moins un instant de mesure d'une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure. Comme évoqué plus haut, il est possible de répéter les cycles (étapes S02) d'acquisition d'images holographiques et de détermination de valeur du paramètre de répartition pour tous les instants de mesure. Les paramètres de répartition ainsi déterminés peuvent alors être utilisés pour générer les résultats d'analyse. Ces résultats peuvent par exemple être un suivi temporel de l'évolution des paramètres de répartition, ou des indications d'identification qui en sont dérivées. La durée de mesure, ou durée d'incubation, s'étend typiquement sur plusieurs heures, et correspond au temps de suivi considéré comme nécessaire pour mettre en évidence des évolutions différentes de la biomasse dans les réceptacles d'analyse 2 afin de dégager les différences d'interactions entre les agents biologiques et les réactifs. Toutefois, au début de cette durée de mesure, et plus précisément pour au moins un instant de mesure compris dans la première moitié de la durée de mesure, de préférence dans le premier quart de la durée de mesure, ou dans la première heure de la durée de mesure, de préférence dans les premières 30 minutes de la durée de mesure, et de préférence encore dans les premières 15 minutes de la durée de mesure, le procédé comprend un contrôle de conformité initiale (étape S03) de l’échantillon biologique mis en œuvre à partir d’au moins un paramètre de répartition, afin de vérifier que l'échantillon biologique présente initialement les qualités attendues, et donc est conforme aux exigences du procédé d’analyse. Ce contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique peut être mis en œuvre une unique fois au début de la durée de mesure, ou peut être mis en œuvre pour une pluralité d'un instant de mesure du début de la durée de mesure : la première moitié de la durée de mesure, de préférence le premier quart de la durée de mesure, ou la première heure, de préférence les premières 30 minutes ou de préférence encore les premières 15 minutes de la durée de mesure.
Le contrôle de conformité initiale se base sur une valeur du paramètre de répartition déterminé au début de la durée de mesure, afin qu'une non-conformité puisse être détectée au plus tôt. Le contrôle de conformité initiale comprend la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec au moins une valeur seuil définissant une limite d’une plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est en dehors de la plage de conformité, l’instrument de mesure émet une alerte de non-conformité (S05) de l’échantillon biologique.
La valeur seuil peut être une valeur seuil basse, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est inférieure à la valeur seuil basse (étape S04), l’instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l’échantillon biologique (étape S05). Alternativement ou de préférence en complément, la valeur seuil peut être une valeur seuil haute, supérieure à la valeur seuil basse, et lors du contrôle de conformité initiale, la valeur du paramètre de répartition est comparée avec cette valeur seuil haute, , et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est supérieure à la valeur seuil haute, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l’échantillon biologique. La valeur seuil basse correspond à une limite basse d’une plage de conformité du paramètre de répartition, tandis que la valeur seuil haute correspond à une limite haute de la plage de conformité du paramètre de répartition.
Cette plage de conformité correspond à la plage dans laquelle doit se trouver la valeur initiale du paramètre de répartition pour que l'analyse puisse être menée, et en particulier pour permettre une interprétation non erronée des résultats d'analyse. La plage de conformité dépend donc du type d’analyse qui est faite et des réglages de l’instrument de mesure. Par exemple, pour un antibiogramme de bactéries Gram+, la plage de conformité peut correspondre à une valeur de turbidité comprise entre 0,05 et 0,063 McF, et peut correspondre à une valeur de turbidité comprise entre 0,025 et 0,032 McF, pour un antibiogramme de bactéries Gram-, voire moins en fonction des valeurs de dilution prescrites. Dès lors que la valeur initiale du paramètre de répartition n’est pas dans la plage de conformité (en deçà de la valeur seuil basse ou dessus de la valeur seuil haute), l'échantillon biologique ne présente pas initialement les qualités attendues et est donc non conforme. La plage de conformité peut être semi-ouverte, et par exemple s'étendre à partir de la limite basse sans limite haute, ou inversement.
L'alerte de non-conformité de l'échantillon biologique peut revêtir plusieurs formes. Typiquement, l’instrument d’analyse comprend un transducteur électroacoustique, et l’émission de l'alerte de non-conformité comprend l'émission de sons à destination d'un opérateur pour l'avertir de la non-conformité. De même, l'émission de l'alerte de non-conformité peut comprendre l'émission d'un signal lumineux à destination de l'opérateur. L'instrument d'analyse comprend typiquement une interface homme-machine dotée d'un écran d'affichage, et l'émission de l'alerte de non-conformité peut comprendre l'affichage sur l'écran d'un message prévenant un opérateur de la non-conformité de l'inoculum, de préférence en indiquant la valeur du paramètre de répartition. D'autres types d'alertes peuvent être prévues, l'important étant de prévenir l'opérateur de l'instrument d'analyse que l'échantillon est initialement non conforme, afin qu’il puisse y être remédier au plus vite.
Dans le cas où l'échantillon biologique est initialement conforme, c'est-à-dire lorsque la valeur initiale du paramètre de répartition est comprise dans la plage de conformité, c'est-à-dire typiquement supérieure à la valeur seuil basse et inférieur à la valeur seuil haute, il peut être procédé à l’analyse de l’échantillon biologique avec l’obtention de résultats d’analyse (étape S06) valides à la fin de la durée de mesure, que ces résultats d’analyse soient obtenus à partir des valeurs du paramètre de répartition ou d'un autre critère d'analyse. La validité des résultats d’analyse finaux est donc conditionnée à la conformité de l’échantillon initial. Il est d’ailleurs possible, lorsque l'échantillon biologique n'est pas conforme, que l'émission de l'alerte de non- conformité comprenne l’arrêt de l’analyse par l’instrument d’analyse. En effet, d’une part il est inutile de continuer l’analyse alors que la non-conformité initiale de l’échantillon biologique montre dès le début de la durée de mesure que les résultats d'analyse finaux ne seront pas fiables, et d'autre part pour empêcher que ne soient déterminés résultats d'analyse finaux qui, non fiables, peuvent présenter des dangers lors de leur interprétation.
L’invention n’est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux figures annexées. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers caractéristiques techniques ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l’invention.

Claims

Revendications
1. Procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument d'analyse, dans lequel, à la suite de la mise en place de l’échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse (2) dans un champ de vue (11) d’un imageur holographique (SOI), le réceptacle comprenant au moins un réactif destiné à interagir avec des agents biologiques présents dans l’échantillon biologique, le procédé comprend les étapes suivantes (S02) mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d’instants de mesure d’une durée de mesure :
- acquisition d’une image de l’échantillon biologique,
- détermination, à partir de l'image acquise, d'un critère d'analyse de l'échantillon biologique, et obtention de résultats d’analyse (S06) à partir du critère d’analyse de l’échantillon biologique à la fin de la durée de mesure, caractérisé en ce que le procédé comprend, pour une pluralité d’instants de mesure de la durée de mesure compris dans une première moitié et une seconde moitié de la durée de mesure :
- une acquisition (S02a) d’une image holographique de l’échantillon biologique par l’imageur holographique,
- une détermination, (S02b) à partir de l’image holographique acquise, d’une valeur d’un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue, la détermination de la valeur du paramètre de répartition comprenant la détermination, pour chacune d’une pluralité de zones de l’image holographique, de la présence ou non d’agents biologiques dans ladite zone, le critère d’analyse de l’échantillon biologique à partir duquel sont obtenus les résultats d’analyse étant une valeur du paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques et le procédé comprenant en outre pour au moins un instant de mesure compris dans une première moitié de la durée de mesure, un contrôle de conformité initiale (S03) de l'échantillon biologique comprenant la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec au moins une valeur seuil définissant une limite d’une plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est en dehors de la plage de conformité, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité (S05) de l'échantillon biologique.
2. Procédé d’analyse selon la revendication 1, dans lequel ladite valeur seuil est une valeur seuil basse correspondant à une limite basse de la plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est inférieure à la valeur seuil basse, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité (S05) de l’échantillon biologique et/ou ladite valeur seuil est une valeur seuil haute correspondant à une limite haute de la plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est supérieure à la valeur seuil haute, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité de l'échantillon biologique.
3. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique est mis en œuvre pour au moins un instant de mesure compris dans le premier quart de la durée de mesure.
4. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le contrôle de conformité initiale de l'échantillon biologique est mis en œuvre pour au moins un instant de mesure compris dans la première heure de la durée de mesure, ou dans les premières 30 minutes de la durée de mesure.
5. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le paramètre de répartition est dérivé d'un nombre d'agents biologiques apparaissant dans l'image holographique.
6. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une zone de l’image holographique est entre 5 et 20 fois plus grande qu’une taille typique des agents biologiques de l’échantillon biologique.
7. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la présence ou non d’agents biologiques dans une zone est déterminée en comparant une valeur de niveau de gris de la zone avec un seuil, ou en comparant un motif de la zone avec des motifs de référence d’une base de données.
8. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme.
9. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réceptacle d’analyse (2) présente au moins deux faces transparentes opposées, et l’imageur holographique (10) est configuré pour que le champ de vue s'étende sur une profondeur de champ d'au moins 100 iim entre les deux faces transparentes opposées du réceptacle d'analyse
10. Instrument d' analyse comprenant un imageur holographique (10) avec un champ de vue (11) configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse (2) dans le champ de vue (11) d’un imageur holographique (10), le réceptacle comprenant au moins un réactif destiné à interagir avec des agents biologiques présents dans l'échantillon biologique, et pour mettre en œuvre, conformément aux revendications précédentes, pour une pluralité d’instants de mesure de la durée de mesure compris dans une première moitié et une seconde moitié de la durée de mesure :
- une acquisition (S02a) d’une image holographique de l’échantillon biologique,
- une détermination, (S02b) à partir de l’image holographique acquise, d’une valeur d’un paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques dans le champ de vue, la détermination de la valeur du paramètre de répartition comprenant la détermination, pour chacune d'une pluralité de zones de l'hologramme, de la présence ou non d’agents biologiques dans ladite zone, un critère d’analyse de l’échantillon biologique à partir duquel sont obtenus les résultats d’analyse à la fin de la durée de mesure étant une valeur du paramètre de répartition représentatif de la répartition spatiale quantitative d'agents biologiques, et pour au moins un instant de mesure compris dans une première moitié d’une durée de mesure un contrôle de conformité initiale (S03) de l'échantillon biologique comprenant la comparaison de la valeur du paramètre de répartition avec au moins une valeur seuil définissant une limite d’une plage de conformité, et dans le cas où la valeur du paramètre de répartition est en dehors de la plage de conformité, l'instrument de mesure émet une alerte de non-conformité (S05) de l'échantillon biologique.
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