EP4415733A1 - Combinaison d'e. faecalis et d'un agent anti-inflammatoire et ses utilisations dans la prevention et/ou traitement des maladies respiratoires - Google Patents

Combinaison d'e. faecalis et d'un agent anti-inflammatoire et ses utilisations dans la prevention et/ou traitement des maladies respiratoires

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EP4415733A1
EP4415733A1 EP22802942.7A EP22802942A EP4415733A1 EP 4415733 A1 EP4415733 A1 EP 4415733A1 EP 22802942 A EP22802942 A EP 22802942A EP 4415733 A1 EP4415733 A1 EP 4415733A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cncm
strain
faecalis
inflammatory
combination
Prior art date
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Pending
Application number
EP22802942.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Muriel Thomas
Pascale Serror
Alexandre DAVID-HACHETTE
Jennifer PALOMO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Universite Paris Saclay
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Universite Paris Saclay
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech, Universite Paris Saclay, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • the invention relates to the combination of at least one bacterial strain of the species Enterococcus faecalis and an anti-inflammatory agent, a composition comprising them and its uses as a medicament, in particular for preventing and /or treat respiratory diseases.
  • corticosteroids are in particular based on broad-spectrum immunity modulators, such as corticosteroids. These are certainly very effective as a one-time treatment, but can lead to deleterious side effects when taken regularly. For example, inhaled corticosteroids can cause growth retardation in children, suppression of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and an increased risk of osteoporosis. In addition, some patients refractory to corticosteroids receive high doses causing severe side effects such as metabolic disorders or an increased risk of cardiovascular disease (De ludicibus et al. Molecular mechanism of glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2011. 17: 1095-108; Ora et al. Advances with glucocorticoids in the treatment of asthma: state of the art. Expert Opin Pharmacother 2020. 21: 2305-2316).
  • An objective of the present invention is therefore to provide a solution which is simple, effective and economical for reducing the doses of anti-inflammatory treatment necessary and/or for increasing their effectiveness and thus preventing and/or treating respiratory diseases. .
  • the inventors have identified that the combination of an active ingredient based on bacteria of the species Enterococcus faecalis (hereinafter E. faecalis) and another active ingredient based on anti-inflammatory agents, preferably glucocorticoids, induce a synergistic effect making it possible to reduce the doses of useful glucocorticoid administered to a patient, including patients refractory to glucocorticoids.
  • E. faecalis Enterococcus faecalis
  • anti-inflammatory agents preferably glucocorticoids
  • the inventors have thus observed that the strains alone at an MOI of 10 (i.e. 10 E. faecalis cells for 1 eukaryotic cell) or that low-dose budesonide (0.1 nM) did not induce an effect, in vitro, on the release of interleukin-8 (IL-8) induced by Tumor Necrosis Factor (TNF)-a on human cells of pulmonary origin BEAS-2B.
  • MOI 10 E. faecalis cells for 1 eukaryotic cell
  • 0.1 budesonide 0.1 nM
  • the combination of glucocorticoids and E. faecalis bacteria is thus of particular interest in reducing the useful concentration of glucocorticoids used in first intention.
  • the invention is therefore particularly suitable for patients suffering from chronic inflammatory diseases and preferentially exhibiting resistance to corticosteroids.
  • the invention relates to the combination of two active principles, that is to say at least one bacterial strain of the species E. faecalis (i) and an anti-inflammatory agent (ii) for its use as a medicament in humans. or the animal.
  • the invention also relates to the culture supernatant obtained from one of the bacterial strains of E. faecalis and combined with an anti-inflammatory agent.
  • the invention relates particularly to a composition
  • a composition comprising the combination of at least one bacterial strain of the species E. faecalis (and/or its supernatant) (i) and an anti-inflammatory agent ( ii) and at least one acceptable excipient (iii).
  • Said acceptable excipient preferably being a pharmaceutically acceptable excipient in the case of a product intended to be used as a medicament for human use or veterinary use.
  • the composition is then a pharmaceutical composition comprising a strain of E. faecalis and an anti-inflammatory agent and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention is thus particularly suitable for using said combination or said composition according to the invention as a medicament.
  • the present invention is useful in the prevention and / or treatment of inflammatory diseases, in particular respiratory diseases, more particularly chronic such as allergy, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), or rhinitis allergic.
  • respiratory diseases more particularly chronic such as allergy, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), or rhinitis allergic.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease (ICI), such as Crohn's disease or ulcerative colitis
  • ICI inflammatory bowel disease
  • secondary inflammation caused by a primary infection, for example bacterial, parasitic but also viral such as influenza, infant bronchiolitis, or SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome).
  • Figure 1 shows the dose-effect of budesonide on BEAS-2B cells.
  • FIG. 2 shows the in vitro effect of the E. faecalis and budesonide combination on BEAS-2B cells.
  • BEAS-2B cells were co-incubated with TNF-a (lpg/ml) alone or with a strain of E. faecalis (CNCM 1-4969; 1-5701; 1-5699) MOI 10:1, and/or 0.1nM budesonide, or 0.5nM budesonide. After 6 h of incubation, the concentration of IL-8 was measured in the supernatant by ELISA. The levels of IL-8 are expressed as a percentage of the level of IL-8 induced by a 6 h stimulation with TNF- ⁇ .
  • Figure 3 represents the ex vivo effect of the combination E. faecalis CNCM 1-4969 and budesonide on the explants of mouse lungs.
  • Explants of mouse lungs were cultured alone with E. faecalis (CNCM 1-4969) 50 CFU, and/or 0.1 nM budesonide, or 0.5 nM budesonide.
  • bacteria within the meaning of the invention, is meant a unicellular microorganism capable of reproducing by cell division. Bacteria are classified by family, genus, species. Each bacterial species includes a diversity of bacterial strains. The bacterial strain according to the invention belongs to the Enterococcaceae family, to the genus Enterococcus and the species faecalis.
  • bacterial strain or “strain” within the meaning of the invention, we therefore mean a specific bacterial strain but also all the bacteria derived from the strain or obtained from the strain or corresponding to the bacterial strain and having the same metabolic functions, for example, at least one bacterium taken from a colony derived from the strain.
  • bacterial strain according to the invention also means one of the strains deposited under the number CNCM 1-4969 on April 14, 2015 at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM), 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15 , France, but also under the number CNCM 1-5701 and CNCM 1-5699 deposited on June 16, 2021 at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM), 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France as well as the strains derived.
  • derived strain within the meaning of the invention, is meant a bacterial strain having a strong similarity with one of the bacterial strains deposited under the number CNCM I-4969, or CNCM 1-5701 or CNCM 1-5699 .
  • the derived strain comprises a nucleotide sequence having at least 99% identity of ANI with the nucleotide sequence of the chromosome of at least one of the strains CNCM 1-4969, or CNCM 1-5701 or CNCM 1-5699, plus preferentially, at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97% , at least 99.98%, at least 99.99% identity of ANI with the nucleotide sequence of the chromosome of one of the strains CNCM 1-4969, or CNCM 1-5701 or CNCM 1-5699.
  • ANI means in the sense of the invention the average percentage identity of the nucleotides calculated from the two-by-two comparison of all the chromosomal sequences of the two bacterial strains.
  • the genomic DNA can be extracted from a pure bacterial culture derived from said strain of interest, followed by the sequencing of the DNA using various well-known methods, for example Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore, then the genome is sequenced and assembled by bioinformatics and the sequences obtained are analyzed. Finally, the sequences of Chromosomes of interest are compared two by two to calculate the ANI.
  • the culture supernatant of the bacterial strain according to the invention optionally comprising cellular compounds of said strain and / or cellular debris of said strain, and / or metabolites and/or molecules secreted by said strain.
  • Human within the meaning of the invention means a human patient.
  • Said human patient can belong to any age group, i.e. the patient can be an infant, a baby, a child, an adolescent or an adult. It is known that children, babies, infants and the elderly are more susceptible to respiratory diseases, especially asthma.
  • humans are resistant and/or refractory to treatments with corticosteroids, for example budesonide.
  • patient resistant and/or refractory to treatment with corticosteroids is meant, within the meaning of the invention, a patient to whom a treatment based on corticosteroids is administered, who does not respond to said treatment, that is that is, the patient does not observe a reversal of the progression of the inflammation or a reversal or regression of the progression of the disease.
  • prevention within the meaning of the invention, is meant the reduction to a lesser degree of the risk or the probability of occurrence of a given phenomenon, that is to say, in the context of the present invention of inflammation, preferably respiratory diseases, for example asthma.
  • treatment within the meaning of the invention, is meant a reduction in the progression of the disease, a stabilization, a reversal or regression, or even an interruption or inhibition of the progression of the inflammation, preferentially of respiratory diseases , for example asthma. In the context of the invention, these terms also apply to one or more symptoms of said diseases of the present invention.
  • respiratory disease within the meaning of the invention, here is meant diseases of the respiratory system or causing breathing disorders.
  • acceptable excipient within the meaning of the invention is meant any compound making it possible to facilitate the shaping of the composition and not modifying the nature of the biological activity of the active principle.
  • An acceptable excipient can be a solvent, buffer, saline solution, plasticizer, lubricant, dispersing medium, agents delaying absorption, flow agent, isotonic agent.
  • it is a pharmaceutically excipient acceptable which are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients known to those skilled in the art and suitable for human and/or veterinary use. The excipient will thus be chosen according to the route of administration, for example suitable for oral, intravenous, intramuscular, topical administration, etc.
  • spontaneous administration means both administration in the form of a single pharmaceutical formulation combining the two active principles, E. faecalis and an anti-inflammatory agent such as a corticosteroid, and separate administration two separate pharmaceutical formulations each containing one of the two active ingredients taken simultaneously or at very short intervals (maximum approximately 1 hour).
  • the present invention therefore consists of a new product which combines two active ingredients, hereinafter referred to as the combination according to the invention, on the one hand strains of E. faecalis and on the other hand an anti-inflammatory agent, in particular a corticosteroid, thus making it possible to potentiate the anti-inflammatory effect of the corticosteroid and to reduce its useful concentration and thus reduce the undesirable effects in patients.
  • an anti-inflammatory agent in particular a corticosteroid
  • the present invention therefore relates to a combination comprising at least one bacterial strain of the species Enterococcus faecalis (i) and at least one anti-inflammatory agent (ii) for its use as a medicament in humans or animals.
  • the inventors have previously discovered and isolated bacterial strains of E. faecalis from mouse lungs, human faeces or cheeses, for which the inventors have identified anti-inflammatory properties.
  • E. faecalis is an enterococcus which occurs naturally in the digestive tract of humans and animals. It is notably responsible for nosocomial infections and can cause bacteraemia, endocarditis, as well as infections of the urinary tract, prostate or epididymis.
  • a multilocus genomic typing (MLST) method based on the analysis of the nucleotide sequence of 7 loci ( ⁇ 3 kb out of 3.5 Mb) of the core genome, has made it possible to define more than 1000 genomic types (ST for Sequence type ) (Ruiz-Garbajosa 2006; Neumann 2019). The STs then possessing at least 6 alleles on the 7 loci are considered as belonging to the same Clonal Complex (CC). Finally, next-generation sequencing has made it possible to develop a method for genomic typing at the genome scale (cgMLST for core genome multilocus sequence typing) which, for E. faecalis, uses 1972 loci, i.e. more than half of the genome (Neumann 2019), which made it possible to confirm the previous data obtained with MLST genotyping.
  • cgMLST for core genome multilocus sequence typing which, for E. faecalis, uses 1972 loci, i.e. more than half of the genome (Neumann 2019), which made it possible to confirm the previous data
  • said strains of the species E. faecalis preferentially belong to the CC40 or CC21 genomic group.
  • said strain present in the combination according to the invention comprises a 16S rRNA sequence of SEQ ID NO:1.
  • the strain is chosen from the strain deposited under the number CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 and CNCM 1-5699.
  • the CNCM 1-5699 strain belongs to the Clonal Complex 21, more particularly to the ST21 genomic types and has a chromosome of 2843733 bp (base pair).
  • Strain CNCM 1-5701 and strain CNCM 1-4969 both belong to Clonal Complex 40, respectively to genomic type ST284 and ST40, and their chromosome has 2982831 bp and 3056663 bp respectively.
  • the bacterial strain or optionally the mixture of bacterial strains present in the combination according to the invention can be in any form producing the expected effects and the efficacy described in the present application.
  • the strain can be in living form (cultivable or not), dead, semi-living, attenuated or inactivated.
  • semi-living is meant a bacterium with low physiological activity whose ability to proliferate is reduced, temporarily or permanently.
  • inactivated designates a bacterium which is no longer capable, temporarily or permanently, of proliferating.
  • dead designates a bacterium which is no longer capable, definitively, of proliferating.
  • Dead or inactivated bacteria may have intact or ruptured cell membranes.
  • inactivated also designates the extracts and lysates of bacteria obtained. It is particularly advantageous to use such forms in the pharmaceutical compositions of the invention.
  • the combination according to the invention comprises a bacterium of E. faecalis and/or the culture supernatant obtained from one of the bacterial strains of E. faecalis according to any of the embodiments described above.
  • the combination comprises a supernatant
  • this can be obtained from one of the strains deposited under the number CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 and CNCM 1-5699 or from a mixture of several strains of 'E. faecalis, preferably from a mixture of the strains deposited under the number CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 and CNCM 1-5699.
  • the combination according to the invention comprises at least one bacterial strain and/or a culture supernatant according to one of the embodiments described above, and an anti-inflammatory agent.
  • the anti-inflammatory agent is preferably a corticosteroid type agent.
  • the anti-inflammatory agent is a corticosteroid, this is preferably budesonide.
  • Corticosteroids designate both hormones synthesized by the adrenal glands and anti-inflammatory drugs.
  • the term relates to anti-inflammatory drugs.
  • These are synthetic hormones used in therapy for their anti-inflammatory properties. They can be effective in the short term, medium term and longer term in the treatment of inflammatory and/or autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and certain respiratory disorders.
  • the combination of E. faecalis and the anti-inflammatory agent is intended to be administered simultaneously or spread over time as a drug.
  • compositions preferably a pharmaceutical composition.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising the combination according to the invention and at least one acceptable excipient, preferably a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the composition may optionally comprise a physiologically acceptable medium, that is to say a medium which is compatible with the microorganism but also the body of the individual to whom said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water, buffer, saline solutions. In particular, said medium is compatible with oral administration.
  • a physiologically acceptable medium that is to say a medium which is compatible with the microorganism but also the body of the individual to whom said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water, buffer, saline solutions.
  • said medium is compatible with oral administration.
  • the composition comprises at least one bacterial strain of the species E. faecalis, preferably chosen from the strain deposited under the number CNCM 1-4969, CNCM 1-5701, CNCM 1-5699 and their mixture; and/or the culture supernatant obtained from said strains and at least one acceptable excipient and/or a physiologically acceptable medium.
  • composition according to the invention may comprise, in addition to the combination according to the invention, at least one additional compound.
  • the additional compound can be an ingredient, a molecule, a third active principle, a microorganism, a bacterium or a mixture of bacteria.
  • composition according to the invention is in any form acceptable for administration to a patient, preferably a human or animal (non-human) patient.
  • a patient preferably a human or animal (non-human) patient.
  • the composition according to the invention is also aimed at veterinary uses.
  • composition can be in any suitable form.
  • the composition according to the invention may be in a form chosen from a powder, powder to be nebulized, microencapsulated powder, microencapsulated powder to be nebulized, capsule, capsule, tablet, pastille, granules, solution, solution to be nebulized, emulsion, emulsion nebuliser, suspension, nebuliser suspension, ampule, suppository, inhaler and a syrup, more preferably in the form of an inhaler such as a nebuliser device.
  • the composition according to the invention is in solid, liquid or freeze-dried form, more preferably liquid capable of being nebulized or solid in powder form.
  • composition When the composition is in liquid form, it comprises the anti-inflammatory agent and at least one bacterial strain according to the invention and/or derived strain and/or a physiologically acceptable culture medium for said bacteria, which allows them to be store, such as, for example, BHI medium, or an equivalent medium containing no product derived from animal origin.
  • the anti-inflammatory agent and the bacterial strains according to the invention and/or the derived strain may be present in lyophilized form, and may also comprise excipients such as for example microcrystalline cellulose, lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum, calcium lactate, magnesium sulphate, sodium citrate, calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, maltodextrin, galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, pectins, beta-glucans, lactoglobulins, isomaltooligosaccharides, polydextroses, mannitol, sorbitol, glycerol, silica dioxide, magnesium stearate, cysteine, mannose, galactose, anhydrous glucose, glucose monoydrate and/or mixtures thereof.
  • excipients such as for example microcrystalline cellulose, lac
  • the composition according to the invention is in a form suitable for oral, nasal, parenteral, rectal, sublingual, ocular, auricular, intramuscular, intravenous, inhaled or cutaneous administration, more preferably by nasal or inhaled route. using a nebulizer.
  • the composition may comprise 0.05 mg to 4 mg per day, preferably from 0.25 mg to 4 mg per day.
  • the composition may comprise from 0.1 mg to 4 mg per day, preferably from 0.5 mg to 4 mg per day.
  • the composition may comprise from 0.05 mg to 2 mg per day, preferably from 0.25 mg to 2 mg per day.
  • the composition comprises at least 10 3 colony-forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered, preferably from 10 4 to 10 9 CFU, more preferably from 10 5 to 10 7 CFU .
  • CFU colony-forming units
  • this corresponds to a daily dose of bacteria to be administered, regardless of the weight of the person or the animal.
  • this dose is administered all at once.
  • the useful composition then comprises at least 10 3 , preferably from 10 4 to 10 9 CFU of bacteria per daily dose to be administered, even more preferably from 10 5 to 10 7 CFU.
  • Said bacteria are a mixture of bacteria corresponding to or derived from one of the strains according to the invention, including the derived strains.
  • CFU Cold Forming Unit
  • UFC Cold Forming Unit
  • the daily dose is measured per gram or milliliter of the composition according to the final invention.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of live bacteria or not, said mixture comprising at least live bacteria
  • the composition preferably comprises at least 1% of live bacteria (in number) , more preferentially, at least 10% of living bacteria (by number), even more preferentially at least 50% of living bacteria (by number).
  • the live bacteria are a mixture of bacteria corresponding to one of the strains according to the invention, including the derived strains, preferentially belonging to the Clonal Complex CC40 or CC21, more preferentially a strain having a 16S RNA sequence of SEQ ID NO:1.
  • the composition according to the invention including it may in particular comprise a content of it between 0.1 and 99% by weight. , in particular from 5 to 95% by weight, in particular from 10 to 90% by weight and more particularly from 15 to 85% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a composition according to the invention may comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 5 to 95%, in particular from 10 to 90% by weight, more particularly from 15 to 85% by weight, of supernatant relative to the total weight of the composition.
  • the composition When the composition is intended for therapeutic use, the composition comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient, the composition according to the invention is then a pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable excipient here means an excipient whose administration to an individual is not accompanied by significant deleterious effects.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are well known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the ingredient(s) included in the composition according to the invention and according to any of the embodiments described above.
  • Said pharmaceutical composition is a medicine.
  • the invention relates to a pharmaceutical kit comprising at least an E. faecalis strain, preferably the CNCM 1-4969 or CNCM 1-5701 or CNCM 1-5699 strain or their mixture and a co rti co steroid preferably budesonide, for simultaneous administration or spread over time.
  • E. faecalis strain preferably the CNCM 1-4969 or CNCM 1-5701 or CNCM 1-5699 strain or their mixture
  • a co rti co steroid preferably budesonide
  • the E. faecalis strain and the co rti co steroid such as budesonide can be present in the form of a single pharmaceutical formulation combining the two active principles 1) E. faecalis and 2) the corticosteroid, or else two distinct formulations each comprising one of the active principles (thus allowing simultaneous or sequential administration).
  • asthma asthma
  • bronchitis including infectious and eosinophilic bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), such as COPD (chronic obstructive pulmonary disease), cystic fibrosis, pulmonary fibrosis including cryptogenic fibrosing alveolitis, fibrosis idiopathic lung disease, idiopathic interstitial lung disease, fibrosis complicating antineoplastic therapy and chronic infection, including tuberculosis and aspergillosis and other fungal infections; vasculitis and thrombotic disorders of the pulmonary vascular system and pulmonary arterial hypertension; antitussive activity including the treatment of chronic cough associated with inflammatory and secretory diseases of the airways and iatrogenic cough
  • composition according to the invention also targets respiratory pathologies having "immune deregulations" common with those observed in asthma, such as the induction of certain cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) and mucosal dysregulations (hyper production of mucus) and changes in the bronchial epithelium.
  • cytokines IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17
  • mucosal dysregulations hyper production of mucus
  • the uses of the composition according to the present invention encompass the prevention and treatment of chronic respiratory diseases, for example asthma, COPD and rhinitis. Even more particularly, the uses of the composition according to the present invention relate to the prevention and treatment of asthma.
  • the use of the strain of the invention and the composition comprising it can therefore be used in particular effectively to prevent the onset of asthma in patients known for their predisposition for this pathology (for example, patients with a family predisposition to the development of asthma).
  • the composition according to the invention is also useful in a disease chosen from Crohn's disease, ulcerative colitis, ulcerative colitis - hemorrhagic, diverticulitis, esophagitis, gastritis, pancreatitis, peptic ulcer and irritable bowel syndrome.
  • composition according to the invention is of particular interest when humans or animals are resistant and/or refractory to corticosteroids.
  • the combination or the composition according to the invention can be produced by any means well known to those skilled in the art.
  • the strain according to the invention is produced by culture, for example, in a growth medium known to those skilled in the art (for example, a BHI medium: “Brain-Heart Infusion”) from 8 hours to 3 days, at a temperature of 30-37°C, with or without pH adjustment.
  • a BHI medium “Brain-Heart Infusion”
  • the fermentation broth containing the bacterial cells is collected.
  • the broth can be used as is, concentrated or freeze-dried.
  • the bacteria will be collected, for example by centrifugation then resuspended in a suitable buffer, for example PBS (“phosphate buffered saline”).
  • Bacterial concentration can be established using a flow cytometer or other equivalent method.
  • the bacteria can then be nebulized from the liquid form or the freeze-dried form.
  • a solvent may be added to facilitate nebulization.
  • Example 1 Minimum dose of budesonide alone on BEAS-2B cells.
  • Budesonide is a corticosteroid with in vitro and in vivo anti-inflammatory properties and is used in humans, in particular in the treatment of asthma.
  • BEAS-2B Human bronchial cells
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇
  • the BEAS-2B cells then respond by releasing IL-8 into the medium.
  • the IL-8 assay after 6 h makes it possible to estimate the state of cell activation, which can be reduced by adding an anti-inflammatory agent.
  • the inventors have thus identified a dose of budesonide which induces little or no anti-inflammatory effect in the BEAS-2B model, namely 0.1 nM.
  • Example 2 In vitro anti-inflammatory effects of the combination according to the invention.
  • the inventors then sought to test the effects of the combination according to the invention, namely E. faecalis and budesonide, on the BEAS-2B model.
  • the strains are, initially, added alone.
  • the 3 strains CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 and CNCM 1-5699 at an MOI of 10:1 show no effect on the release of IL-8 induced by TNF-a ( Figure 2), at like the O.lnM dose of budesonide.
  • the effect of the combination of budesonide 0.1nM and CNCM 1-4969 or CNCM 1-5701 causes an inhibition of 30%, whereas budesonide alone and CNCM 1-4969 or CNCM I-5701 alone do not have of effect thus demonstrating a synergy of action of the combination according to the invention with respect to budesonide or E. faecalis administered alone (FIG. 2).
  • the inhibition with a 5 times higher dose of budesonide alone is 50%.
  • Example 3 Test of the ex vivo anti-inflammatory effects of the combination according to the invention.
  • the inventors continued their work on the potentiating effect of f. faecalis in a more complex model of axenic mouse lung explants in ex vivo culture. These explants have a basal production of different cytokines, which can be modified by the presence of immunomodulatory elements.
  • the combination according to the invention makes it possible to obtain an anti-inflammatory effect greater than that obtained with a dose 50 times higher of budesonide alone, again demonstrating the synergistic effect of the combination according to the invention (FIG. 3).

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Abstract

La présente invention concerne l'association d'au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis et d'un agent anti-inflammatoire, d'une composition les comprenant et de ses utilisations comme médicament, en particulier destiné à prévenir et/ou le traiter les maladies respiratoires.

Description

COMBINAISON D'E. FAECAUS ET D'UN AGENT ANTIINFLAMMATOIRE ET SES UTILISATIONS DANS LA PREVENTION ET/OU TRAITEMENT DES MALADIES RESPIRATOIRES
[0001] Domaine technique
[0002] L'invention concerne l'association d'au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis et d'un agent anti-inflammatoire, d'une composition les comprenant et de ses utilisations comme médicament, en particulier pour prévenir et/ou traiter les maladies respiratoires.
[0003] Etat de l'art
[0004] Les maladies inflammatoires respiratoires chroniques telles que l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la rhinite allergique, l'arthrite rhumatoïde, mais encore les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI ) touchent des millions de personnes dans le monde. Ces maladies chroniques ont un impact fort sur la qualité de vie des patients pour lesquels aucun traitement curatif n'est disponible.
[0005] La prévalence de ces maladies augmente fortement dans les pays occidentaux, ce qui constitue un problème médical, social et économique majeur. Les traitements actuels sont essentiellement symptomatiques et visent à traiter ou éventuellement prévenir les crises qui surviennent par période, permettant d'améliorer la qualité de vie des patients.
[0006] Ces traitements sont notamment basés sur des modulateurs de l'immunité à large spectre, tels que les corticostéroïdes. Ces derniers sont certes, très efficaces en traitement ponctuel, mais peuvent entraîner des effets secondaires délétères lors d'une prise régulière. Par exemple, les corticoïdes inhalés peuvent causer un retard de croissance chez l'enfant, la suppression de l'axe hypothalamique pituitaire surrénalien et un risque accru d'ostéoporose. De plus, certains patients, réfractaires aux corticostéroïdes, reçoivent de fortes doses causant des effets secondaires sévères tels que des désordres métaboliques ou un risque accru de maladies cardiovasculaires (De ludicibus et al. Molecular mechanism of glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2011. 17: 1095-108; Ora et al. Advances with glucocorticoids in the treatment of asthma: state of the art. Expert Opin Pharmacother 2020. 21: 2305-2316).
[0007] Alors que la résistance congénitale aux corticostéroïdes est rare, la résistance acquise est plus fréquente. La résistance congénitale résulte de mutations du gène du récepteur des glucocorticoïdes, alors que la résistance acquise est multifactorielle. Peu importe la forme, la résistance aux glucocorticoïdes est un problème thérapeutique grave limitant la réponse chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques. La résistance acquise peut être attribuée à des modifications du microenvironnement cellulaire, qui seraient des conséquences d'une inflammation chronique. De multiples facteurs ont ainsi été identifiés, notamment des altérations de la signalisation en aval de l'action des cytokines, le stress oxydatif, l'hypoxie et les facteurs dérivés du sérum.
[0008] Des recherches ont également été menées dans le microbiote. Une souche spécifique d'E. faecalis a ainsi été découverte et isolée pour ses propriétés anti-inflammatoires telle que décrites dans la demande de brevet FR 1650656. Celle-ci possède des propriétés tout à fait avantageuses dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires telles que l'asthme.
[0009] Il existe donc un besoin médical fort pour de nouvelles solutions thérapeutiques permettant d'augmenter la réponse des tissus aux glucocorticoïdes et ainsi permettre de diminuer les doses de traitement d'agents anti-inflammatoires nécessaires et/ou d'augmenter leur efficacité.
[0010] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution qui soit simple, efficace et économique pour diminuer les doses de traitement anti-inflammatoire nécessaires et/ou pour augmenter leur efficacité et ainsi prévenir et/ou traiter les maladies respiratoires.
[0011] Résumé de l'invention
[0012] Pour répondre à cet objectif, les inventeurs ont identifié que l'association d'un principe actif basé sur des bactéries de l'espèce Enterococcus faecalis (ci-après E. faecalis) et d'un autre principe actif basé sur des agents anti-inflammatoires, préférentiellement des glucocorticoïdes, induit un effet synergique permettant de diminuer les doses de glucocorticoïde utile administrées à un patient, y compris des patients réfractaires aux glucocorticoïdes.
[0013] Les inventeurs ont ainsi observé que les souches seules à une MOI 10 (soit 10 cellules d’E. faecalis pour 1 cellule eucaryote) ou que le budésonide à faible dose (0,lnM) n'induisait pas d'effet, in vitro, sur la libération d'interleukine-8 (IL-8) induite par le Tumor Necrosis Factor (TNF)-a sur des cellules humaines d'origine pulmonaire BEAS-2B.
[0014] En revanche, lors de la co-incubation de la même dose de budésonide (0,lnM) en combinaison avec les souches d’E. faecalis (MOI 10), les inventeurs ont observé un effet synergique correspondant à 32% de l'inhibition de libération de l'IL-8, alors que l'inhibition de libération de l'IL-8 obtenue avec une dose 5 fois supérieure de budésonide seul (soit 0,5 nM) est de 55%. Ainsi, pour obtenir un effet similaire, il est nécessaire d'utiliser des doses extrêmement fortes de budésonide entraînant également de forts effets secondaires.
[0015] L'étude de l'effet potentialisateur d'E. faecalis sur un modèle plus complexe d'explants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo a permis de confirmer les résultats in vitro en observant un effet anti-inflammatoire supérieur de la combinaison selon l'invention (budésonide 0, lnM + E. faecalis) à l'effet anti-inflammatoire obtenu avec une dose 50 fois supérieure de budésonide seul (5 nM).
[0016] L'association de glucocorticoïdes et de bactéries E. faecalis est ainsi particulièrement d'intérêt pour réduire la concentration utile de glucocorticoïdes utilisés en première intention. L'invention est donc particulièrement adaptée à des patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques et présentant préférentiellement, une résistance aux corticostéroïdes.
[0017] Ainsi, l'invention concerne la combinaison de deux principes actifs, soit au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis (i) et un agent anti-inflammatoire (ii) pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.
[0018] L'invention vise aussi le surnageant de culture obtenu à partir d'une des souches bactériennes d'E. faecalis et combiné avec un agent anti-inflammatoire.
[0019] Enfin, l'invention se rapporte particulièrement à une composition comprenant la combinaison d'au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis (et/ou son surnageant) (i) et d'un agent anti-inflammatoire (ii) et d'au moins un excipient acceptable (iii). Ledit excipient acceptable étant préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable lorsqu'il s'agit d'un produit destiné à être utilisé comme médicament pour un usage humain ou un usage vétérinaire. La composition est alors une composition pharmaceutique comprenant une souche d'E. faecalis et d'un agent anti-inflammatoire et d'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0020] L'invention est ainsi particulièrement adaptée pour utiliser ladite combinaison ou ladite composition selon l'invention comme médicament. En effet, la présente invention est utile dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier des maladies respiratoires, plus particulièrement chroniques telles que l'allergie, l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), ou la rhinite allergique.
[0021] D'autres pathologies inflammatoires chroniques sont également d'intérêt telles que l'arthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI ), telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse ; l'inflammation excessive secondaire provoquée par une primo-infection, par exemple bactérienne, parasitaire mais également virale telle que la grippe, la bronchiolite du nourrisson, ou les SRAS (Syndrome Aiguë Respiratoire Sévère).
[0022] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
[0023] Brève description des Figures
[0024] La Figure 1 représente l'effet-dose du budésonide sur les cellules BEAS-2B. Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec différentes doses de Budésonide (1,5 ; 0,75 ; 0,5 ; 0,1 nM). Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de 6h par le TNF-a. Les résultats correspondent à la moyenne + SEM d'au moins 3 expériences, n=6-12 réplicats techniques. * p<0.05 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle TNF-a. La condition « medium » correspond au témoin négatif, montrant que les cellules ne produisent pas d'IL- 8 en absence de TNF-a.
[0025] La Figure 2 représente l'effet in vitro de la combinaison E. faecalis et du budésonide sur les cellules BEAS-2B. Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec une souche d’E. faecalis (CNCM 1-4969 ; 1-5701 ; 1-5699) MOI 10:1, et/ou O.lnM de Budésonide, ou 0.5nM de budésonide. Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant par ELISA. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de 6h par le TNF-a. Les résultats correspondent à la médiane de 3 expériences, n=9 réplicats techniques. * p<0.05 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle TNF-a, par un test non paramétrique Kruskal-Wallis suivi d'un post-test de Dunn.
[0026] La Figure 3 représente l'effet ex vivo de la combinaison E. faecalis CNCM 1-4969 et du budésonide sur les expiants de poumons de souris. Des expiants de poumons de souris ont été mis en culture seuls avec E. faecalis (CNCM 1-4969) 50 CFU, et/ou O.lnM de Budésonide, ou 0.5nM de budésonide. Après 24h d'incubation, la concentration de différentes cytokines a été mesurée dans le surnageant par dosage multiplex à technologie Luminex. Les niveaux de cytokine sont exprimés en pourcentage du taux mesuré dans la condition milieu à 24h. Les résultats correspondent à la moyenne + SEM d'une expérience, n = 3 réplicats biologiques par condition. * p<0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle milieu.
[0027] Description détaillée de l'invention
[0028] Définition [0029] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. La souche bactérienne selon l'invention appartient à la famille Enterococcaceae, au genre Enterococcus et l'espèce faecalis.
[0030] Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Préférentiellement, on entend également par souche bactérienne selon l'invention, une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969 le 14 avril 2015 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, mais également sous le numéro CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 déposées le 16 juin 2021 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ainsi que les souches dérivées.
[0031] Par « souche dérivée » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec l'une des souches bactériennes déposées sous le numéro CNCM I- 4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699. Préférentiellement, la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique du chromosome d'au moins une des souches CNCM 1-4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699, plus préférentiellement, au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique du chromosome de l'une des souches CNCM 1-4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699.
[0032] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences chromosomiques des deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome est séquencé et assemblé par bioinformatique et les séquences obtenues sont analysées. Enfin, les séquences des chromosomes d'intérêt sont comparées deux à deux pour calculer l'ANI.
[0033] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention comprenant éventuellement des composés cellulaires de ladite souche et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.
[0034] Par « Homme » au sens de l'invention, on entend un patient humain. Ledit patient humain peut appartenir à n'importe quelle classe d'âge, c'est-à-dire que le patient peut être un nourrisson, un bébé, un enfant, un adolescent ou un adulte. Il est connu que les enfants, les bébés, les nourrissons et les personnes âgées sont plus sensibles aux maladies respiratoires, notamment l'asthme. Préférentiellement, l'Homme est résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes, par exemple le budésonide.
[0035] Par « patient résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes », on entend au sens de l'invention un patient à qui l'on administre un traitement à base de corticostéroïdes, qui ne répond pas audit traitement, c'est-à-dire que l'on n'observe pas chez le patient une inversion de la progression de l'inflammation ou une inversion ou régression de la progression de la maladie.
[0036] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme.
[0037] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.
[0038] Par « maladie respiratoire » au sens de l'invention, on entend ici les maladies de l'appareil respiratoire ou provoquant des troubles de la respiration.
[0039] Par « excipient acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient acceptable peut être un solvant, tampon, solution saline, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, agent isotonique. Préférentiellement, il s'agit d'excipient pharmaceutiquement acceptable qui sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels et connus de l'homme du métier et apte à un usage humain et/ou vétérinaire. L'excipient sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration, par exemple approprié pour une administration orale, intraveineuse, intramusculaire, topique etc.
[0040] Par « administration simultanée », on entend aussi bien l'administration sous forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs, E. faecalis et un agent anti-inflammatoire tel qu'un corticostéroïde, que l'administration séparée des deux formulations pharmaceutiques distinctes contenant chacune l'un des deux principes actifs en prise simultanée ou à très faible intervalle (au maximum environ 1 heure).
[0041] Combinaison selon l'invention
[0042] La présente invention consiste donc en un nouveau produit qui combine deux principes actifs, ci-après dénommé la combinaison selon l'invention, d'une part des souches de E. faecalis et d'autre part un agent anti-inflammatoire, en particulier un corticostéroïde, permettant ainsi de potentialiser l'effet anti-inflammatoire du corticoïde et d'en réduire la concentration utile et ainsi réduire les effets indésirables chez les patients.
[0043] La présente invention a donc pour objet une combinaison comprenant au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis (i) et au moins un agent antiinflammatoire (ii) pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.
[0044] Les inventeurs ont précédemment découvert et isolé des souches bactériennes d'E. faecalis à partir de poumons de souris, de matières fécales humaines ou de fromages, pour lesquels les inventeurs ont identifié des propriétés anti-inflammatoires.
[0045] E. faecalis est un entérocoque présent naturellement dans le tube digestif des humains et des animaux. Il est notamment responsable d'infections nosocomiales et peut causer des bactériémies, endocardites, ainsi que des infections du tractus urinaire, de la prostate ou de l'épididyme.
[0046] Du fait de la grande diversité génétique au sein de l'espèce E. faecalis. Une méthode de typage génomique multilocus (MLST), basée sur l'analyse de la séquence nucléotidique de 7 loci (~3 kb sur 3,5 Mb) du core génome, a permis de définir plus de 1000 types génomiques (ST pour Sequence type) (Ruiz-Garbajosa 2006 ; Neumann 2019). Les ST possédant alors au moins 6 allèles sur les 7 loci sont considérés comme appartenant à un même Complexe Clonal (CC). Enfin, un séquençage de nouvelle génération a permis de développer une méthode de typage génomique à l'échelle du génome (cgMLST pour core genome multilocus sequence typing) qui, pour E. faecalis, utilise 1972 loci soit plus de la moitié du génome (Neumann 2019), ce qui a permis de confirmer les précédentes données obtenues avec le génotypage MLST.
[0047] En l'espèce, lesdites souches de l'espèce E. faecalis appartiennent préférentiellement au groupe génomique CC40 ou CC21.
[0048] Selon un autre objet préféré, ladite souche présente dans la combinaison selon l'invention comprend une séquence d'ARNr 16S de SEQ ID NO :1.
[0049] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la souche est choisie parmi la souche déposée sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699.
[0050] La souche CNCM 1-5699 appartient au Complexe Clonal 21, plus particulièrement au types génomiques ST21 et possède un chromosome de 2843733 pb (paire de base). La souche CNCM 1-5701 et la souche CNCM 1-4969 appartiennent toutes deux au Complexe Clonal 40, respectivement au type génomique ST284 et ST40, et leur chromosome possède respectivement 2982831 pb et 3056663 pb.
[0051] La souche bactérienne ou éventuellement le mélange de souches bactériennes présent(e) dans la combinaison selon l'invention peut être sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée.
[0052] Ces formes peuvent être obtenues par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.
[0053] Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi, le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues. Il est particulièrement avantageux d'utiliser de telles formes dans les compositions pharmaceutiques de l'invention.
[0054] Selon une variante, la combinaison selon l'invention comprend une bactérie d'E. faecalis et/ou le surnageant de culture obtenu à partir d'une des souches bactériennes d'E. faecalis selon l'un des quelconques modes de réalisation décrit précédemment.
[0055] Lorsque la combinaison comprend un surnageant, celui-ci peut être obtenu à partir d'une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 ou d'un mélange de plusieurs souches d'E. faecalis, préférentiellement d'un mélange des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699.
[0056] Ainsi, la combinaison selon l'invention comprend au moins une souche bactérienne et/ou un surnageant de culture selon l'un des modes de réalisation précédemment décrits, et un agent anti-inflammatoire.
[0057] L'agent anti-inflammatoire est préférentiellement un agent de type corticostéroïde. Lorsque l'agent anti-inflammatoire est un corticostéroïde, celui-ci est préférentiellement le budésonide.
[0058] Les corticostéroïdes désignent à la fois des hormones synthétisées par les glandes surrénales et des médicaments anti-inflammatoires. Dans le sens de la présente invention le terme se rapporte aux médicaments anti-inflammatoires. Il s'agit d'hormones de synthèse utilisées en thérapie pour leurs propriétés anti-inflammatoires. Elles peuvent être efficaces à court terme, à moyen terme et à plus long terme dans le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé et certains troubles respiratoires.
[0059] Préférentiellement, la combinaison d'E. faecalis et de l'agent anti-inflammatoire est destinée à être administrée de façon simultanée ou étalée dans le temps en tant que médicament.
[0060] Composition selon l'invention
[0061] La combinaison précédemment décrite est avantageusement administrée dans une composition, préférentiellement une composition pharmaceutique.
[0062] Ainsi, l'invention concerne une composition comprenant la combinaison selon l'invention et au moins un excipient acceptable, préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0063] La composition peut éventuellement comprendre un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu qui est compatible avec le microorganisme mais également l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau, de tampon, solutions salines. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale. [0064] Ainsi, la composition comprend au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis, préférentiellement choisie parmi la souche déposée sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701, CNCM 1-5699 et leur mélange ; et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.
[0065] Eventuellement, la composition selon l'invention peut comprendre en sus de la combinaison selon l'invention, au moins un composé additionnel. Le composé additionnel peut être un ingrédient, une molécule, un troisième principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries.
[0066] La composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un patient, préférentiellement un patient humain ou animal (non-humain). Ainsi, la composition selon l'invention vise également les usages vétérinaires.
[0067] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre à nébuliser, poudre microencapsulée, poudre microencapsulée à nébuliser, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, solution, solution à nébuliser, émulsion, émulsion à nébuliser, suspension, suspension à nébuliser, ampoule, suppositoire, inhalateur et un sirop, plus préférentiellement sous une forme d'inhalateur tel qu'un appareil de nébulisation.
[0068] De façon préférée, la composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée, plus préférentiellement liquide apte à être nébulisée ou solide sous forme de poudre.
[0069] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle comprend l'agent antiinflammatoire et au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou souche dérivée et/ou un milieu de culture physiologiquement acceptable pour lesdites bactéries, qui permet de les conserver, comme, par exemple le milieu BHI, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.
[0070] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, l'agent antiinflammatoire et les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcristalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta- glucanes, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, le dioxide de silice, le stéarate de magnésium, la cystéine, le mannose, le galactose, le glucose anhydre, le monoydrate de glucose et/ou leurs mélange.
[0071] L'homme du métier saura choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée, plus préférentiellement par nasale ou voie inhalée à l'aide d'un appareil de nébulisation.
[0072] La composition peut comprendre 0,05 mg à 4 mg par jour, préférentiellement de 0,25 mg à 4 mg par jour. Lorsque le patient est un adulte, la composition peut comprendre de 0,1 mg à 4 mg par jour, préférentiellement de 0,5 mg à 4 mg par jour. Lorsque le patient est un enfant, la composition peut comprendre de 0,05 mg à 2 mg par jour, préférentiellement de 0,25 mg à 2 mg par jour.
[0073] De façon particulièrement préférée, la composition comprend au moins 103 unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer, préférentiellement de 104 à 109 CFU, plus préférentiellement de 105 à 107 CFU.
[0074] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Ainsi et de façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. La composition utile comprend alors au moins 103, préférentiellement de 104 à 109 CFU de bactéries par dose quotidienne à administrer, encore plus préférentiellement de 105 à 107 CFU.
[0075] Lesdites bactéries sont un mélange de bactéries correspondant ou issues d'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.
[0076] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition.
[0077] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.
[0078] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactéries vivantes ou non, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement, au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement, au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre).
[0079] Les bactéries vivantes sont un mélange de bactéries correspondant à l'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées, préférentiellement appartenant au Complexe Clonal CC40 ou CC21, plus préférentiellement une souche ayant une séquence d'ARN 16S de SEQ ID NO :l.
[0080] Dans le cas de la mise en oeuvre d'un surnageant de l'une quelconque des souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
[0081] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0082] Lorsque la composition est destinée à un usage thérapeutique, la composition comprend au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, la composition selon l'invention est alors une composition pharmaceutique.
[0083] Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend ici un excipient dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier.
[0084] Ainsi, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le ou les ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment. Ladite composition pharmaceutique est un médicament.
[0085] Selon une variante, l'invention porte sur un kit pharmaceutique comprenant au moins une souche E. faecalis, préférentiellement la souche CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699 ou leur mélange et un co rti co stéroïde préférentiellement le budésonide, pour une administration simultanée ou étalée dans le temps.
[0086] Dans le kit pharmaceutique selon l'invention, la souche E. faecalis et le co rti co stéroïde tel que le budésonide peuvent être présents sous la forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs 1) E. faecalis et 2) le corticostéroïde, ou bien de deux formulations distinctes comprenant chacune l'un des principes actifs (permettant alors une administration simultanée ou séquentielle).
[0087] Utilisation
[0088] La composition ou le kit selon l'invention est utile comme médicament pour un usage dans la santé humaine ou vétérinaire.
[0089] Préférentiellement, la composition selon l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter l'inflammation et ainsi être utilisée dans le traitement et/ou la prévention des maladies inflammatoires, plus préférentiellement des maladies respiratoires et/ou des maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou des maladies inflammatoires associées à une infection virale, parasitaire ou bactérienne.
[0090] On peut ainsi citer à titre d'exemple l'asthme (léger, modéré ou sévère), par exemple, bronchique, allergique, intrinsèque, extrinsèque, induit par l'exercice, induit par des allergènes, tels la poussière, l'asthme résistant aux stéroïdes ; la bronchite, y compris la bronchite infectieuse et à éosinophiles, d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), comme la BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), la fibrose cystique, la fibrose pulmonaire, y compris cryptogénique alvéolite fibrosante, la fibrose pulmonaire idiopathique, pneumopathies interstitielles idiopathiques, la fibrose compliquant une thérapie antinéoplasique et une infection chronique, y compris la tuberculose et l'aspergillose et d'autres infections fongiques; vascularite et troubles thrombotiques du système vasculaire pulmonaire et hypertension artérielle pulmonaire; activité antitussive comprenant le traitement de la toux chronique associée à des affections inflammatoires et sécrétoires des voies respiratoires et la toux iatrogène; rhinite aiguë et chronique, y compris la rhinite médicamenteuse, et la rhinite vasomotrice; per annuelle et saisonnière rhinite allergique y compris la rhinite nerveuse (rhume des foins); polypose nasale; infection aiguë virale, y compris le rhume, et l'infection due au virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe, les bronchopathies pulmonaires, les infections aux coronavirus (SRAS notamment) et l'adénovirus, un œdème pulmonaire, embolie pulmonaire, pneumonie, sarcoïdose pulmonaire, la silicose, poumon de fermier et les maladies apparentées; pneumopathie d'hypersensibilité, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë, l'emphysème, la bronchite chronique, la tuberculose et le cancer du poumon.
[0091] La composition selon l'invention vise également les pathologies respiratoires ayant des « dérégulations immunitaires » communes avec celles observées dans l'asthme comme l'induction de certaines cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) et des dérégulations mucosales (hyper production de mucus) et des modifications de l'épithélium bronchique.
[0092] En particulier, les utilisations de la composition selon la présente invention englobent la prévention et le traitement des maladies respiratoires chroniques, par exemple l'asthme, la BPCO et la rhinite. Encore plus particulièrement, les utilisations de la composition selon la présente invention portent sur la prévention et le traitement de l'asthme. L'utilisation de la souche de l'invention et la composition la comprenant pourront donc être notamment utilisées efficacement pour prévenir l'apparition de l'asthme chez des patients connus pour leur prédisposition pour cette pathologie (par exemple, des patients ayant une prédisposition familiale au développement de l'asthme).
[0093] Etant donné les voies inflammatoires communes, par exemple la production d'interleukine comme IL-8, la composition selon l'invention est également utile dans une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro- hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, la gastrite, la pancréatite, l'ulcère gastro- duodénal et le syndrome du côlon irritable.
[0094] Enfin, la composition selon l'invention est particulièrement d'intérêt lorsque l'Homme ou l'animal est résistant et/ou réfractaire aux corticostéroïdes.
[0095 ] Procédé de préparation d'une composition selon l'invention
[0096] La combinaison ou la composition selon l'invention peut être produite par tout moyen bien connu de l'homme du métier.
[0097] A titre d'exemple, la souche selon l'invention est produite par culture, par exemple, dans un milieu de croissance connu de l'homme du métier (par exemple, un milieu BHI : « Brain-Heart Infusion ») de 8 heures à 3 jours, à une température de 30-37°C, avec ou sans ajustement du pH. Le bouillon de fermentation contenant les cellules bactériennes est recueilli. Le bouillon peut être utilisé tel quel, concentré ou lyophilisé. Avantageusement, les bactéries seront recueillies, par exemple par centrifugation puis remises en suspension dans un tampon approprié, par exemple du PBS (« phosphate buffered saline »). La concentration bactérienne peut être établie en utilisant un cytomètre de flux ou un autre procédé équivalent. [0098] Les bactéries pourront ensuite être nébulisée partir de la forme liquide ou de la forme lyophilisée. Un solvant pourra être ajouté afin de faciliter la nébulisation.
[0099] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de composition selon l'invention et par des résultats.
[0100] Exemples
[0101] Exemple 1 - Dose minimale du budésonide seul sur les cellules BEAS-2B.
[0102] Le budésonide est un corticostéroïde aux propriétés anti-inflammatoires in vitro et in vivo et utilisé chez l'Homme, notamment dans le traitement de l'asthme.
[0103] Des cellules bronchiques humaines (BEAS-2B) sont mises en culture et une situation pro-inflammatoire est induite via l'ajout dans le milieu de TNF-a. Les cellules BEAS-2B répondent alors par la libération d'IL-8 dans le milieu. Le dosage de l'IL-8 après 6h permet d'estimer l'état d'activation des cellules, qui peut être réduit par l'ajout d'un agent antiinflammatoire.
[0104] Les inventeurs ont ainsi identifié une dose de budésonide qui induit peu ou pas d'effet anti-inflammatoire dans le modèle BEAS-2B, soit 0,1 nM.
[0105] Exemple 2 - Effets anti-inflammatoires in vitro de la combinaison selon l'invention.
[0106] Les inventeurs ont ensuite cherché à tester les effets de la combinaison selon l'invention soit E. faecalis et budésonide sur le modèle BEAS-2B.
[0107] Pour cela, ils ont utilisé 3 souches distinctes : CNCM 1-4969 ; CNCM 1-5701 et CNCM I- 5699. D'après les analyses de génomes, ces trois souches sont phylogénétiquement très proches puisque l'homologie de séquence du gène de l'ARN 16S desdites trois souches est de 100%. Malgré une homologie de séquence de l'ARN 16S, les trois souches présentent notamment des propriétés anti-inflammatoires différentes, en particulier un profil cytokinique différent. Il en résulte une efficacité différente pour chaque souche.
[0108] Les souches sont, dans un premier temps, ajoutées seules. Les 3 souches CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 à une MOI 10 :1, ne présentent pas d'effet sur la libération d'IL- 8 induite par le TNF-a (Figure 2), à l'instar de la dose O.lnM de budésonide.
[0109] Dans un second temps, lors de la co-incubation des cellules BEAS-2B stimulées au TNF- a avec 0,lnM de budésonide et l'une des souches d'E. faecalis (CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699), les inventeurs ont observé un effet synergique de la combinaison selon l'invention qui induit une inhibition de 32%, 31% et 12% respectivement avec les souches CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 de libération d'IL-8.
[0110] La souche d'E. faecalis CNCM 1-5699, associée au budésonide 0,lnM tend à réduire l'IL- 8 induite par le TNF-a de 12%.
[0111] L'effet de la combinaison budésonide 0,lnM et CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 provoque une inhibition de 30%, alors que le budésonide seul et CNCM 1-4969 ou CNCM I- 5701 seules n'ont pas d'effet démontrant ainsi une synergie d'action de la combinaison selon l'invention par rapport au budésonide ou E.faecalis administré seul (Figure 2). L'inhibition avec une dose 5 fois supérieure de budésonide seul, est de 50%.
[0112] Exemple 3 - Essai des effets anti-inflammatoires ex vivo de la combinaison selon l'invention.
[0113] Les inventeurs ont poursuivi leurs travaux sur l'effet potentialisateur d'f. faecalis sur un modèle plus complexe d'explants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo. Ces expiants ont une production basale de différentes cytokines, laquelle peut être modifiée par la présence d'éléments immunomodulateurs.
[0114] Les inventeurs ont alors observé que 0,1 nM de budésonide et 50 CFU de CNCM 1-4969 seuls n'avaient pas d'effets, ou des effets modestes sur les cytokines mesurées dans le surnageant des expiants (Figure 3).
[0115] En revanche, lors de la co-incubation avec une combinaison de 0,lnM de budésonide et 50 CFU d’E. faecalis CNCM 1-4969, Les inventeurs ont observé un effet synergique induisant une forte inhibition de la libération des cytokines pro-inflammatoires IL-2, IL-18, IL-13, IFN-y et IL-6.
[0116] La combinaison selon l'invention (budésonide 0,lnM - CNCM 1-4969) permet d'obtenir un effet anti-inflammatoire supérieur à celui obtenu avec une dose 50 fois supérieure de budésonide seul, démontrant là encore l'effet synergique de la combinaison selon l'invention (Figure 3).
[0117] En conclusion, les inventeurs ont pu démontrer que la combinaison associant les souches d’E. faecalis et le budésonide permet d'obtenir un effet synergique anti-inflammatoire. Ainsi, une dose du corticostéroïde qui seul n'a pas d'effet anti-inflammatoire, montre une efficacité significative in vitro et ex vivo lorsqu'elle est associée à une souche d’E. faecalis.

Claims

Revendication
[Revendication 1] Combinaison d'au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis (i) et d'un agent anti-inflammatoire (ii) pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.
[Revendication 2] Combinaison selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'agent anti-inflammatoire est un co rti co stéroïde.
[Revendication 3] Combinaison selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la souche comprend une séquence du gène de l'ARNr 16S ayant au moins 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO :1.
[Revendication 4] Combinaison selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la souche est choisie parmi la souche déposée sous le numéro CNCM I- 4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 et/ou le corticostéroïde est le budésonide.
[Revendication 5] Combinaison selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la souche est vivante, morte, atténuée ou inactivée.
[Revendication 6] Composition pharmaceutique comprenant la combinaison selon l'une des revendications précédentes et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[Revendication 7] Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les bactéries vivantes représentent au moins 103 CFU.
[Revendication 8] Composition selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[Revendication 9] Composition selon l'une des revendications 6 à 8, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires et/ou les maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou les maladies inflammatoires associées à une infection virale, parasitaire ou bactérienne.
[Revendication 10] Composition selon la revendication précédente, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie choisie parmi l'asthme, la bronchite, la bronchiolite, la BPCO, la fibrose pulmonaire, la rhinite.
[Revendication 11] Composition selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que l'Homme ou l'animal est résistant aux corticostéroïdes.
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