EP4452996A1 - Epoxysteroide - Google Patents

Epoxysteroide

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EP4452996A1
EP4452996A1 EP22844092.1A EP22844092A EP4452996A1 EP 4452996 A1 EP4452996 A1 EP 4452996A1 EP 22844092 A EP22844092 A EP 22844092A EP 4452996 A1 EP4452996 A1 EP 4452996A1
Authority
EP
European Patent Office
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mmol
independently
alkyl
cells
nmr
Prior art date
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Pending
Application number
EP22844092.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Aram Prokop
Hans-Günther SCHMALZ
Ömer Taspinar
Jennifer WITT
Tobias Wilczek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helios Kliniken Schwerin GmbH
Original Assignee
Helios Kliniken Schwerin GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helios Kliniken Schwerin GmbH filed Critical Helios Kliniken Schwerin GmbH
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane

Definitions

  • the present invention relates to novel drugs based on steroids.
  • cytotoxic treatment methods such as e.g. B. chemotherapy, radiation therapy and hyperthermia
  • chemotherapeutic agents currently used in clinical practice exert their effects by inducing apoptosis (programmed cell death) (Hannun, 1997).
  • apoptosis programmeed cell death
  • some patients suffering from malignant tumors develop resistance to chemotherapy or radiation at an early stage or are primarily refractory to therapy (Hickman, 1996).
  • primary tumors and metastases often respond quite differently to cytotoxic therapies.
  • the therapies for relapses in childhood leukemia, lymphoma and solid tumors still do not show satisfactory survival rates.
  • ALL acute lymphatic leukemia
  • other tumor diseases some of which are difficult to treat, such as e.g. As brain tumors, lymphomas, sarcomas such as soft tissue sarcomas, Ewing's or osteosarcoma, germ cell tumors, kidney or liver tumors and carcinomas such.
  • B. the thyroid carcinoma or the colon carcinomas and breast carcinomas which are very common in adulthood.
  • difficult rare tumors such.
  • desmoblastic round cell tumors or malignant peripheral nerve sheath tumors in the event of metastasis appropriate chemotherapy is required, since these malignant cells are resistant to cytostatics.
  • psoriasis is one of the most common skin diseases (two to four percent of people suffer from it), and the therapy for it still needs improvement.
  • cytostatic agents which can penetrate into the central nervous system because they show a high volume of distribution. This is of great importance, especially for the treatment of various brain tumors (grade 1 - grade 4), since many conventional cytostatics cannot sufficiently cross the blood-brain barrier, so that the necessary concentration of active substances in the tumor tissue cannot be achieved during chemotherapy.
  • Conventional steroids can easily cross the blood-brain barrier, but they show no or insufficient cytostatic effect in brain tumors, other solid tumors or in steroid-resistant leukemias and lymphomas.
  • the object of the present invention is to provide medicaments which overcome these disadvantages of the prior art.
  • W 1 , W 2 are independently H, OH, CHR 2 OH, CHR 2 R X , CR 2 R X OH or W 1 and W 2 together are 0
  • R 2 saturated or unsaturated, optionally branched alkyl radicals having 4 to 9 carbon atoms, where these alkyl radicals can also have a cyclopropane or cyclobutane substructure;
  • R 3 _ methyl or ethyl
  • X 1 , X 2 independently of one another R x or OR 5 ), or together 0, NOR 4 ;
  • Y 1 , Y 2 independently of one another R x or OR 5 ), or together 0, NOR 4 ; or X 1 and Y 1 together form a double bond or an epoxy group;
  • Z 1 , Z 2 independently of one another R x or OR 5 , or together 0, NOR 4 , CH 2 ;
  • the object is achieved by medicaments based on 7,19-epoxy steroids, containing a compound of the general formula A or a physiologically tolerable salt thereof, in which in the formula:
  • R 2 saturated or unsaturated, optionally branched alkyl radicals having 4 to 9 carbon atoms, it also being possible for these alkyl radicals to have a cyclopropane or cyclobutane substructure;
  • R 3 methyl or ethyl
  • Y 1 , Y 2 (H/OR 5 ), or together 0, NOR 4 ;
  • the formula A therefore includes the basic frameworks A1 and A2:
  • the compounds according to the invention are based on the basic structure of steroids, which have been well researched both synthetically and medically/pharmacologically.
  • Rx in formula I or A has 1 to 10 carbon atoms.
  • Rx in formula I or A has as a substituted alkyl.
  • Preferred protecting groups are carbonate such as tBOC (tert-butyloxycarbonyl) and silyl ethers such as TBDMS (tert-butyldimethylsilyl), esters or acetals such as MOM (methoxymethyl). Additional protecting groups are known to those skilled in the art from Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, the contents of which are incorporated herein in their entirety.
  • the compounds according to the invention differ from other steroids in particular by the 7,19-epoxy linkage.
  • these substances initiate apoptotic cell death not only in leukemia and lymphoma cells but also in solid tumor cells and in steroid- or polychemotherapy-resistant leukemia or lymphoma cells. Because of their lipophilicity, these compounds of general formula I or A against tumor diseases of the bone marrow, but also against tumors of a different provenance, such as e.g. B. epithelial tumors, sarcomas or malignancies of the skin, etc., are used.
  • malignant brain tumors grade 1 - grade 4
  • malignant brain tumors grade 1 - grade 4
  • gliomas astrocytomas
  • medulloblastomas astrocytomas
  • medulloblastomas astrocytomas
  • apoptosis signaling cascade By investigating the apoptosis signaling cascade, it was possible according to the invention to develop novel steroids which, in contrast to the conventional glucocorticoids, mediate apoptosis in malignant cells via all three known pathways of the apoptosis signaling cascade (receptor-mediated, mitochondrial and via the endoplasmic reticulum). Induce cells and thus destroy glucocorticoid or polycytostatic-resistant leukemia, lymphoma and solid tumor cells. The effect is selective on malignant cells.
  • R x H
  • alkyl and R 2 is 4-methyl-pentyl.
  • Preferred substituents for R 1 are H or methyl.
  • Each R 4 , R 5 and R x independently of one another preferably has up to 10 carbon atoms.
  • R x is alkyl or substituted alkyl.
  • substituents preferably have 1-10 carbon atoms.
  • the invention also relates to a process for the production of
  • step a is carried out under basic conditions.
  • the preferred subject matter of the invention is a process for preparing compounds of the formula A, comprising step a and subsequent conversion of the functional groups: step a being carried out under basic conditions, preferably by heating the substrate in the presence of Li 2 CO 3 and LiBr in N,N-dimethylformamide at temperatures of 80 to 120°C.
  • step a being carried out under basic conditions, preferably by heating the substrate in the presence of Li 2 CO 3 and LiBr in N,N-dimethylformamide at temperatures of 80 to 120°C.
  • the invention also relates to the use of the medicaments according to the invention in the therapy of malignant diseases, benign or semi-malignant skin diseases.
  • Typical malignant diseases are diseases that affect the bone marrow or other blood-forming organs or are solid tumors or epithelial tumors, the solid tumors being in particular brain tumors such as glioblastoma and medulloblastoma.
  • Typical benign or semi-malignant diseases are skin diseases such as psoriasis vulgaris, keloids or basalioma.
  • the medicaments according to the invention are also suitable for use in the therapy of inflammatory and chronically inflammatory diseases, for use in immunosuppressive therapy, for antiviral, antibacterial, antimycotic, antiprotozoal or antihelminthic therapy.
  • the compounds are preferably administered intravenously in the concentration range between 0.1 to 100 pg/ml based on the patient's blood volume.
  • the compounds can also be taken orally.
  • the compounds according to the invention are distinguished by the following properties:
  • the new group of 7,19-epoxy steroids shows a cytostatic effect in solid tumor cells, in various brain tumor cells and in steroid-resistant leukemia and lymphoma cells, which are co-resistant to a wide variety of conventional cytostatics used in therapy .
  • An effect in cytostatic-resistant solid tumor cells is also detectable.
  • the compounds are also effective in pancreatic carcinoma cells.
  • the novel class of steroids specifically induces apoptosis in malignant cells while not damaging primary human leukocytes.
  • novel steroids show a synergistic effect in vitro with conventional cytostatics used in the therapy of malignant diseases.
  • the overcoming of cytostatic drug resistance in connection with the large volume of distribution of the active ingredients in the human body due to their steroid structure are the special new properties of this new class of active ingredients, which promise a good cytostatic effect in malignant diseases that are difficult or impossible to treat today.
  • Figure 1 shows the inhibition of proliferation in Nalm-6 cells.
  • FIG. 2 shows the overcoming of resistance to steroids and polycytostatics in NaKu cells.
  • FIG. 3 shows the overcoming of polycytostatic resistance in BiBo cells.
  • FIG. 4 shows the overcoming of polycytostatic resistance in 7-CCA cells.
  • FIG. 5 shows synergistic effects with cytarabine and vincristine on Nalm-6 cells.
  • FIG. 6 shows the exclusion of non-specific necrosis in Nalm-6 cells.
  • FIG. 7 shows the selectivity for leukemia cells (Nalm-6 cells) and in lymphoma cells (BJAB cells) compared to human leukocytes.
  • FIG. 8 shows the effect in cytostatic-resistant solid tumors.
  • Figure 9 shows the effect in brain tumor cells.
  • Figure 10 shows the effect in primary human glioblastoma cells.
  • Figure 11 shows the effect in primary human pancreatic carcinoma cells.
  • FIG. 12 shows the distribution of the substances according to the invention in the serum.
  • FIG. 13 shows the distribution of the substances according to the invention in the brain.
  • FIG. 14 shows the distribution of the substances according to the invention in the liver. examples
  • the synthesis sequence for the production of the novel steroids according to the invention is explained using the example of the substance WIL-071.
  • the C-19 methyl group of cholesteryl acetate (1) is first hydroxylated according to a method known in principle from the literature before the 19-hydroxycholesteryl acetate (4) in the B ring is oxidatively functionalized and the 7,19-epoxy bridge is closed.
  • Steps a - c Synthesis of 3 ⁇ -acetoxy-cholest- ⁇ 5 -en- -19 ⁇ ol (4) 200 g (0.23 mol, 1.0 eq.) cholesteryl acetate (1) in 1.6 L dioxane were treated with 96 g (0.67 mol, 1.5 eq.) N-bromoacetamide (NBA) and 320 mL HCIO 4 (0.5 N). After 1 hour at 0° C. with the exclusion of light and 1 hour at room temperature, the reaction was stopped by adding saturated NazSO 3 solution (until the reaction mixture became discolored) and water.
  • NBA N-bromoacetamide
  • FT-IR (ATR): v [m 1 ] 3507 (bw), 2944 (s), 2934 (s), 2870 (m), 1734 (m), 1713 (s), 1469 (m), 1444 ( m), 1381 (m), 1370 (m), 1254 (s), 1245 (vs), 1029 (vs), 977 (m), 961 (m), 911 (w), 886 (w), 824 ( f), 807(f), 742(f), 670(f), 610(f).
  • Step d Synthesis of 3 ⁇ -acetoxy-19-methoxymethyloxy-cholestane-A 5 -ene (5)
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3419 (br w), 2932 (m), 2868 (m), 1733 (m), 1498 (w), 1467 (w), 1444 (w), 1366(m), 1242(s), 1144(m), 1112(m), 1096(m), 1046(s), 1033(s), 986(m), 962(m), 943(m), 915 (m), 881 (f), 845 (f), 824 (f), 814 (f), 727 (f), 703 (f), 679 (f), 630 (f), 607 (m), 580 (w).
  • Step e Synthesis of 3ß-acetoxy-5a-hydroxy-19-methoxymethyloxy-cholestan-6-one (6)
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3384 (br w), 2939 (m), 2869 (m), 1730 (m), 1713 (s), 1467 (w), 1401 (w), 1382(m), 1365(m), 1236 (s), 1150 (m), 1106 (m), 1034 (s), 1012 (s), 967 (m), 940 (m), 920 (m), 904 (m), 871 (w), 834 (f), 734 (f), 664 (f), 941 (f), 609 (f), 553 (f).
  • Step f Synthesis of 3 ⁇ -acetoxy-7a-bromo-5a,6a-dihydroxy-6 ⁇ ,19-epoxy-cholestane (7)
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3418 (br w), 2933 (m), 2868 (m), 1726 (s), 1714 (s), 1498 (w), 1466 (w), 1382(m), 1366(m), 1244(s), 1154(m), 1131(m), 1096(m), 1042(s), 984(m), 965(s), 942(s), 906 (m), 846 (m), 814 (f), 727 (f), 703 (m), 680 (m), 666 (m), 629 (m), 609 (m), 583 (m).
  • Step g Synthesis of 3 ⁇ -acetoxy-5a-hydroxy-7 ⁇ ,19-epoxy-cholestan-6-one (8) (WIL-232)
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3507 (br w), 2944 (s), 2934 (s), 2870 (m), 1734 (m), 1713 (s), 1469 (m), 1444 (m), 1381 (m), 1370 (m), 1254 (s), 1245 (vs), 1029 (vs), 977 (m), 961 (m), 911 (w), 886 (w), 824(f), 807(f), 742(f), 670(f), 610(f).
  • Step h Synthesis of 3 ⁇ ,5a-dihydroxy-7 ⁇ ,19-epoxy-cholestan-6-one (9) (WIL-071)
  • the product 9 (WIL-071) was obtained as a white solid (11.3 g, 26.1 mmol, 98%) and subsequently recrystallized from ca. 400 mL (EtOH/H 2 O, 1:1) (9.7 g highly pure substance) . Melting point: 178°C - 180°C.
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3463 (br w), 2948 (s), 2868 (m), 1733 (vs), 1497 (w), 1466 (m), 1414 (w), 1382 (m), 1365 (f), 1340 (f), 1296 (f), 1248 (m), 1225 (f), 1153 (m), 1051 (vs), 968 (m), 958 (m), 887 (f), 818 (f), 779 (f), 756 (m), 713 (f), 637 (f), 558 (m), 539 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3459 (bw), 2952 (m), 2940 (m), 2918 (m), 2859 (m), 1742 (s), 1714 (s), 1466 (m), 1382 (m), 1345 (f), 1298 (f), 1252 (f), 1238 (m), 1195 (f), 1163 (m), 1145 (m), 1102 (f), 1079 (f), 1051 (s), 980 (f), 948 (m), 913 (f), 903 (f), 891 (f), 854 (f), 822 (f), 797 (f), 752 (m), 723 (m), 663 (f), 631 (m), 594 (f), 559 (m), 525 (m).
  • FT-IR (ATR): v[cm- 1 ] 2954(m), 2933(m), 2857(m), 1724(m), 1688(s), 1632(w), 1465(m), 1453 (m), 1383 (f), 1366 (f), 1328 (f), 1274 (f), 1245 (f), 1231 (m), 1185 (m), 1113 (f), 1074 (f), 1035 (s), 974 (f), 932 (f), 904 (s), 879 (f), 857 (f), 828 (m), 811 (f), 780 (m), 766 (f), 720 (f), 653 (f), 634 (f), 571 (f), 548 (m), 529 (m), 507 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3064 (w), 3031 (w), 2949 (s), 2867 (s), 1733 (s), 1496 (w), 1454 (m), 1382 (w), 1364 (w), 1307 (w), 1262 (w), 1228 (w), 1206 (w), 1179 (w), 1142 (w), 1090 (s), 1054 (m), 1001 (f), 953 (f), 873 (f), 842 (f), 803 (f), 734 (s), 693 (s), 557 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3444 (bw), 2947 (m), 2868 (m), 1737 (s), 1463 (m), 1381 (m), 1350 (m), 1275 (w), 1261 (w), 1181 (s), 1155 (m), 1082 (m), 1046 (m), 1022 (m), 975 (w), 952 (m), 889 (w), 869 (m), 824 (f), 808 (f), 757 (m), 711 (f), 663 (f), 637 (f), 559 (m).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3457 (bw), 2950 (m), 2867 (w), 1743 (s), 1443 (m), 1383 (w), 1320 (w), 1269 (s), 1258 (s), 1227 (m), 1171 (w), 1154 (w), 1046 (m), 1018 (m), 952 (m), 935 (m), 877 (w), 825 (f), 792 (m), 757 (f), 721 (f), 664 (f), 625 (f), 559 (f), 530 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3387 (bw), 2951 (m), 2869 (m), 1740 (s), 1720 (s), 1513 (m), 1467 (w), 1384 (m), 1366 (m), 1282 (w), 1251 (m), 1204 (m), 1169 (s), 1051 (m), 970 (w), 918 (w), 867(f), 825(f), 757(f), 734(f), 559(f).
  • the organic phase was washed once each with saturated aqueous NaHCO 3 solution, water and saturated aqueous NaCl solution. The organic phase was then dried over MgSO 4 and the solvent removed under reduced pressure. The residue was purified by column chromatography on silica (20:1, cHex/EtOAc) and the desired product 17 could be obtained as a colorless solid (165 mg, 0.273 mmol, 59%). In addition, the undesired side product 18 could also be obtained as a colorless solid (53 mg, 0.080 mmol, 17 %).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3494 (w), 2952 (m), 2931 (m), 2896 (w), 2858 (w), 1741 (m), 1495 (w), 1463 (f), 1441 (f), 1383 (f), 1361 (f), 1252 (m), 1221 (m), 1187 (f), 1147 (s), 1085 (f), 1048 (m), 1021 (m), 977 (f), 961 (f), 888 (f), 835 (s), 780 (s), 755 (m), 712 (m), 663 (f), 636 (f), 602 (f), 559 (f), 474 (f), 434 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3523 (w), 2950 (m), 2930 (m), 2885 (w), 2858 (w), 1771 (m), 1754 (m), 1739 (m), 1470 (f), 1444 (f), 1389 (f), 1367 (f), 1255 (f), 1223 (f), 1180 (m), 1141 (s), 1040 (m), 1018 (f), 975 (f), 956 (f), 891 (f), 880 (f), 836 (s), 782 (m), 760 (m), 729 (f), 693 (f), 663 (f), 635 (f), 561 (f), 545 (f), 454 (f), 408 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3454 (bw), 2949 (m), 1932 (m), 2867 (m), 1738 (s), 1465 (m), 1446 (m), 1383 (m), 1366 (w), 1223 (s), 1208 (s), 1155 (m), 1097 (s), 1087 (s), 1045 (s), 1020 (m), 973 (m), 961 (m), 920 (f), 888 (f), 824 (m), 780 (f), 757 (m), 716 (f), 663 (f), 637 (f), 559 (m), 522 (m), 477 (m), 431 (m).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3423 (bw), 2949 (m), 2867 (m), 1739 (m), 1717 (m), 1603 (w), 1585 (w), 1493 (f), 1451 (f), 1382 (f), 1316 (f), 1273 (s), 1227 (m), 1175 (f), 1152 (f), 1112 (m), 1069 (m), 1046 (m), 1027 (m), 954 (m), 887 (f), 856 (f), 822 (f), 757 (f), 710 (s), 686 (m), 663 (f), 637 (f), 600 (f), 559 (m), 524 (f).
  • the organic phase was washed once each with saturated aqueous NaHCO 3 solution, water and saturated aqueous NaCl solution. The organic phase was then dried over MgSO 4 and the solvent removed under reduced pressure. The residue was purified by column chromatography on silica (10:1 - 8:1; cHex/EtOAc) and the product 21 could be obtained as a colorless solid (65 mg, 0.116 mmol, 69%).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3422 (bw), 2951 (w), 2930 (w), 2866 (w), 1731 (s), 1644 (w), 1457 (w), 1434 (f), 1375 (f), 1333 (m), 1301 (f), 1201 (s), 1178 (s), 1146 (m), 1097 (f), 1040 (m), 1033 (m), 1023 (m), 975 (f), 956 (m), 936 (f), 920 (f), 884 (f), 826 (m), 813 (m), 783 (f), 754 (m), 712 (f), 644 (f), 584 (f), 562 (m), 545 (f), 459 (f).
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3511 (bw), 3290 (bw), 3197 (bw), 3111 (bw), 2954 (m), 2939 (m), 2921 (m), 2867 (m), 1493 (f), 1469
  • FT-IR (ATR): v [cm- 1 ] 3453 (bw), 2951 (m), 2868 (m), 1722 (s), 1645 (w), 1495 (w), 1437 (w), 1383 (f), 1302 (s), 1260 (m), 1227 (f), 1155 (s), 1100 (f), 1086 (f), 1033 (m), 1021 (m), 977 (m), 910 (f), 889 (f), 825 (f), 775 (f), 757 (f), 734 (f), 676 (f), 593 (f), 559 (f), 529 (f).
  • the aqueous phase was extracted with ethyl acetate and the combined organic phases were washed with saturated aqueous NaCl solution, dried over MgSO 4 and freed from solvent under reduced pressure.
  • the residue was purified by column chromatography on silica (1:1; cHex/EtOAc) and the alkene 27 could be obtained as a colorless solid (82 mg, 0.19 mmol, 83 %).
  • FT-IR v [cm- 1 ] 3484 (bw), 2948 (m), 2932 (m), 2866 (m), 1737 (s), (ATR): 1465 (w), 1441 (w), 1375 (m), 1248 (m), 1224 (m), 1157 (m),
  • reaction mixture was terminated by adding saturated NaHCO 3 solution and the aqueous phase was extracted with EtOAc.
  • the combined organic phases were washed with water and saturated NaCl solution.
  • the clear yellow solution was dried over MgSO 4 and the solvent removed under reduced pressure.
  • the desired product 35 was then obtained in the form of a colorless gel (1.51 g, 2.76 mmol, 61%) after purification by column chromatography on silica gel (c-Hex/EtOAc, 3:1).
  • Example 2 Inhibition of proliferation in leukemia cells (Nalm-6 cells).
  • Example 3 Overcoming resistance to steroids and polycytostatics in NaKu cells
  • Bisso cells are lymphoma cells (BJAB cells) that have been made resistant to vincristine and show Bcl-2 overexpression as a resistance mechanism. They show co-resistances for the following cytostatics:
  • Example 5 Overcoming polycytostatic resistance in 7-CCA cells
  • 7-CCA cells are lymphoma cells (BJAB cells) that have been rendered resistant to doxorubin and display caspase-3 underexpression as the mechanism of resistance. They show co-resistance to the following cytostatics:
  • LDH lactate dehydrogenase
  • WIL 071 Treatment with the steroid WIL 071 induces concentration-dependent apoptosis in leukemia cells (Nalm-6 cells) and in lymphoma cells (BJAB cells). WIL 071 acts selectively in malignant cells that are proliferating. In contrast, no apoptosis is induced in human primary leukocytes. The DNA fragmentation was measured by flow cytometry, see FIG. 7. The experiments were carried out three times independently of one another. The error bars show the standard deviations of the measurements from three independent experiments.
  • Example 9 Effect in cytostatic-resistant solid tumors
  • the steroid WIL 071 can also induce apoptosis in solid tumor cells. Resistance to cytostatics is also overcome in neuroblastoma cells (SKNAS cells) (LiOn cells - cisplatin-resistant SKNAS cells with underexpression of caspase-8.
  • SKNAS cells neuroblastoma cells
  • the DNA fragmentation was measured by flow cytometry, see FIG. 8.
  • the experiments were carried out three times independently of one another.
  • the error bars show the standard deviations of the measurements from three independent experiments.
  • the steroid WIL 071 can also induce apoptosis in brain tumor cells.
  • the steroid WIL 071 also significantly induces apoptosis in glioblastoma cells (DBTRG05MG cells).
  • Example 11 Effect in primary human glioblastoma cells
  • the steroid WIL 071 can also induce apoptosis in primary human brain tumor cells.
  • the steroid WIL 071 also significantly induces apoptosis in the primary glioblastoma cells of a patient with glioblastoma (grade 4).
  • the steroid WIL 071 can also induce apoptosis in pancreatic carcinoma cells. In a corresponding cell line (DAN-G), the steroid WIL 071 significantly induces apoptosis.
  • the DNA fragmentation was measured by flow cytometry, see FIG. 11.
  • the experiments were carried out three times independently of one another.
  • the error bars show the standard deviations of the measurements from three independent experiments.
  • Standard treatment for pancreatic cancer includes and 5-fluorouracil. In comparable experiments, these show significantly poorer apoptosis rates (oxaliplatin: 14% apoptosis at 50 pM, 5-fluoro-uracil 24.9% at 30 pM, 21.2% at 50 pM).
  • Example 13 Comparison of the biological effect of different steroid derivatives in leukemia cells (Nalm-6)
  • the cells were incubated in 6-well plates at 1.0-10 5 cells/mL in two milliliters of medium with the respective steroid derivative in various concentrations.
  • the solvent control (DMSO) that was carried along served as a control, which was subtracted from all other measured values in order not to take into account the spontaneous apoptosis of the cells, which takes place independently of the drug concentration.
  • DMSO solvent control
  • the steroid concentration at which apoptosis was triggered in 50% of the leukemia cells tested was read off with the aid of the curve of the dose-response relationship (steroid concentration apoptosis induction) arising from these measured values.
  • Prednisolone resistance overcoming is given.
  • apoptosis induction in prednisolone-resistant leukemia cells is as high as in normal leukemia cells.
  • a stepwise dose increase of the three substances Wil-071, Wil-232 and Wil-369 was carried out in 8-week-old female NOG-F (Taconic) mice. Different mice were given one of up to seven different doses of the test substances. It started on day 1 with the lowest dose of 10 mg/kg. If, after this injection into the animal's tail vein, there were no abnormal behavior or observable health symptoms over the next 24 hours, the next higher dose was continued the next day. In total, doses of 10, 20, 40, 80, 100, 150 and 200 mg/kg were tested as far as possible. The maximum tolerable dose (MTD) was then administered to three other animals and then observed for a week to detect any to observe developing symptoms. The animals were observed and weighed daily. The body weight is considered an indicator of the general condition of the animals.
  • Example 4 The samples obtained in Example 4 were examined for the content of the substances. Since WIL-369 can be hydrolyzed to WIL-071, both WIL-369 and WIL-071 were determined in the samples. To the extent that these substances were detectable in the samples, this is shown in the figures as The distribution is shown in FIGS. 12 to 14.
  • FIG 12 shows that when WIL-369 is administered, WIL-071 is formed but serum levels are rapidly eliminated; Thus, WIL-369 is a prodrug
  • Figure 13 shows relevant levels of WIL-071 after administration of WIL-369 or WIL-071 in the brain, which could be effective for more than 8 hours.
  • Rho-GDI 2 The GDP dissociation inhibitor, D4-GDI (Rho-GDI 2), but not the homologous Rho-GDI 1, is cleaved by caspase-3 during drug-induced apoptosis, Biochem. J. 346, 777-783.
  • Glucocorticoids for the therapy of malignant diseases :
  • Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant acute lymphoblastic leukemia. Blood, 94, 1209-1217.
  • Proteasome inhibitor-induced apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells involves cytochrome c release and caspase activation, accompanied by formation of an approximately 700 kDa Apaf-1 containing apoptosome complex.
  • Leukemia 15 , 1388-1397.

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Abstract

Arzneimittel auf Basis von 7,19-Epoxy-Steroiden, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder ein physiologisch verträgliches Salz hiervon, worin in der Formel bedeuten: R1 = H; Methyl, Aryl-CH2-, Rx-C(=O)- oder Rx-O-C(=O)-; oder R1O entfällt, wenn eine Doppelbindung zwischen 4-5 vorhanden ist; W1, W2 unabhängig voneinander H, OH, CHR2OH, CHR2RX, CR2RXOH oder W1 und W2 sind zusammen O R2 = gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigte Alkylreste mit 4 bis 9 C-Atomen, wobei diese Alkylreste können auch eine Cyclopropan- oder Cyclobutan-Substruktur aufweisen; R3= Methyl oder Ethyl, X1, X2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen O, NOR4; Y1, Y2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen O, NOR4; oder X1 und Y1 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxygruppe bilden; Z1, Z2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen O, NOR4, CH2; R4 unabhängig voneinander = H, Alkyl oder Aryl; und R5 unabhängig voneinander = H; Alkyl, Aryl-CH2-, Rx-C(=O)- oder Rx- O-C(=O)-, SO3H, SO3CH3, PO(OH)2 oder Glycosyl; wobei jedes Rx unabhängig voneinander = H, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes Alkyl, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl, PEG, SO3H, PO(OH)2 oder Glycosyl ist; und wobei bis zu 3 Wasserstoffe durch Fluor substituiert sein können.

Description

Epoxysteroide
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Arzneimittel auf Basis von Steroiden.
Die Entstehung von malignen Tumoren und Leukämien bzw. anderen gutartigen hyperproliferativen Erkrankungen, wie z. B. der Schuppenflechte oder des Keloids, ist auf eine gestörte Balance zwischen der Gewebsneubildung und dem regulierten Absterben von Zellen aus dem Gewebsverband zurückzuführen.
In der klinischen Praxis wird durch den Einsatz zytotoxischer Behandlungs- methoden, wie z. B. der Chemotherapie, der Strahlentherapie und der Hyper- thermie, versucht, diese gestörte Balance wieder zurechtzurücken und die überschüssigen Tumorzellen gleichzeitig abzutöten. Es ist allgemein anerkannt, dass die meisten derzeit in der klinischen Praxis eingesetzten Chemotherapeutika ihre Wirkung durch Einleitung der Apoptose (programmierter Zelltod) entfalten (Hannun, 1997). Allerdings entwickelt ein Teil der an malignen Tumoren erkrankten Patienten frühzeitig eine Chemo- therapie- bzw. Strahlenresistenz oder ist primär therapierefraktär (Hickman, 1996). Weiterhin ist bekannt, dass Primärtumor und Metastasen auf zytotoxische Therapien oft ganz different ansprechen.
Aufgrund neuerer Untersuchungen ist bekannt, dass die Ursachen für Resistenzen oft in unterschiedlichen Störungen der Apoptose-Signalkaskade liegen (Raisova et al., 2000).
Insbesondere die Therapien von Rezidiven bei Leukämien, Lymphomen und soliden Tumoren im Kindesalter zeigen noch immer keine befriedigenden Überlebensraten. So versterben z. B. trotz aggressiver Therapie ca. 45% der erkrankten Kinder im Rezidiv der akuten lymphatischen Leukämie (ALL). Ähnliches trifft auch auf andere teilweise schwer therapierbare Tumorerkrankungen, wie z. B. Hirntumore, Lymphome, Sarkome, wie Weichteilsarkome, Ewing- oder Osteosarkom, Keimzell-Tumore, Nieren- oder Lebertumore und Karzinome, wie z. B. das Schilddrüsenkarzinom oder die im Erwachsenenalter sehr häufigen Kolonkarzinome und Mammakarzinome, zu. Ferner fehlt bei schwierigen seltenen Tumoren wie z. B. beim desmoblastischen Rundzell-Tumor oder beim malignen peripheren Nervenscheiden-Tumor im Falle einer Metastasierung eine geeignete Chemotherapie, da diese malignen Zellen Zytostatika-Resistenzen aufweisen.
Weiterhin stellt die Psoriasis eine der häufigsten Erkrankungen der Haut (zwei bis vier Prozent der Menschen leiden an ihr) dar, deren Therapie noch immer verbesserungswürdig ist.
Obwohl eine Vielzahl von Arzneimitteln mit Wirkungen durch Apoptose bekannt ist, besteht weiterhin Bedarf nach neuen Arzneimitteln, welche die Resistenzen der malignen Zellen gegen herkömmliche Zytostatika überwinden können.
Ferner besteht ein großer Bedarf an neuen zytostatischen Wirkstoffen, die in das Zentralnervensystem eindringen können, da sie ein hohes Verteilungsvolumen zeigen. Gerade zur Behandlung von verschiedenen Hirntumoren (Grad 1 - Grad 4) ist dies von großer Bedeutung, da viele herkömmlichen Zytostatika nicht ausreichend die Blut-Hirn-Schranke überwinden können, so dass bei einer Chemotherapie nicht die notwendige Wirkstoffkonzentration im Tumorgewebe erreicht werden kann. Herkömmliche Steroide können die Blut-Hirnschranke gut überwinden, sie zeigen aber in Hirntumoren, anderen soliden Tumoren oder in Steroid-resistenten Leukämien und Lymphomen keine oder keine ausreichende zytostatische Wirkung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Arzneimittel bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes der Technik überwinden.
Gelöst wird die Aufgabe durch Arzneimittel auf Basis von 7,19-epoxy-Steroiden, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel I
oder ein physiologisch verträgliches Salz hiervon, worin in der Formel bedeuten :
R1 = H; Methyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O)- ; oder RXO entfällt, wenn eine Doppelbindung zwischen 4-5 vorhanden ist;
W1, W2 unabhängig voneinander H, OH, CHR2OH, CHR2RX, CR2RXOH oder W1 und W2 sind zusammen 0
R2 = gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigte Alkylreste mit 4 bis 9 C-Atomen, wobei diese Alkylreste können auch eine Cyclopropan- oder Cyclobutan-Substruktur aufweisen;
R3_ Methyl oder Ethyl,
X1, X2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen 0, NOR4;
Y1, Y2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen 0, NOR4; oder X1 und Y1 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxygruppe bilden;
Z1, Z2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5, oder zusammen 0, NOR4, CH2 ;
R4 unabhängig voneinander = H, Alkyl oder Aryl; und
R5 unabhängig voneinander = H; Alkyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder Rx- 0-C(=0)-, SO3H, SO3CH3, PO(OH)2 oder Glycosyl; wobei jedes Rx unabhängig voneinander = H, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes Alkyl, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl, PEG, SO3H, PO(OH)2 oder Glycosyl ist; und wobei bis zu 3 Wasserstoffe durch Fluor substituiert sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aufgabe gelöst durch Arzneimittel auf Basis von 7,19-epoxy-Steroiden, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel A oder ein physiologisch verträgliches Salz hiervon, worin in der Formel bedeuten:
R1 = H; Methyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O)-, wobei RXO entfällt, wenn eine Doppelbindung zwischen 4-5 vorhanden ist;
R2 = gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigte Alkylreste mit 4 bis 9 C-Atomen, wobei diese Alkylreste auch eine Cyclopropan- oder Cyclobutan-Substruktur aufweisen können;
R3= Methyl oder Ethyl;
Y1, Y2 = (H/OR5), oder zusammen 0, NOR4;
Z1, Z2 = (H/OR5), oder zusammen 0, NOR4;
R4 unabhängig voneinander = H, Alkyl oder Aryl; und
R5 unabhängig voneinander = H; Alkyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O); wobei jedes Rx unabhängig voneinander = H, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes Alkyl, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl, PEG, SO3H, PO(OH)2 oder Glycosyl ist; und wobei bis zu 3 Wasserstoffe durch Fluor substituiert sein können.
Die Formel A umfasst also die Grundgerüste A1 und A2:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bauen auf dem Grundgerüst von Steroiden auf, die sowohl synthetisch als auch medizinisch/pharmakologisch gut erforscht sind.
In bevorzugten Ausführungsformen weist Rx in Formel I oder A 1 bis 10 C- Atome auf.
In bevorzugten Ausführungsformen weist Rx in Formel I oder A als ein substituiertes Alkyl auf. Bevorzugte Substituenten sind -OR' oder C(=O)OR' aufweist und R' H oder Alkyl oder eine Schutzgruppe ist.
Bevorzugte Schutzgruppen sind Carbonat wie z.B. tBOC (tert- Butyloxycarbonyl) und Silylether wie TBDMS (tert-Butyldimethylsilyl), Ester oder Acetale wie z.B. MOM (Methoxymethyl). Weitere Schutzgruppen sind dem Fachmann aus Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition bekannt, dessen Inhalt hier vollständig einbezogen ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von anderen Steroiden insbesondere durch die 7,19-Epoxyverknüpfung.
Diese Substanzen leiten den apoptotischen Zelltod nicht nur in Leukämie- und Lymphomzellen sondern auch in soliden Tumorzellen und in Steroid- bzw. Polychemotherapie-resistenten Leukämie- bzw. Lymphomzellen ein. Wegen ihrer Lipophilie können diese Verbindungen der allgemeinen Formel I oder A gegen Tumorerkrankungen des Knochenmarks, aber auch gegen Tumore einer anderen Provenienz, wie z. B. epitheliale Tumore, Sarkome oder maligne Erkrankungen der Haut usw., eingesetzt werden.
Mit den entwickelten Substanzen scheint aufgrund ihrer Lipophilie eine Überschreitung der Blut- Hirnschranke möglich und diese Substanzen könnten daher auch für maligne Hirntumore (Grad 1 - Grad 4), wie z. B. Gliome, Astrozytome, Medulloblastome oder Glioblastome, eingesetzt werden.
Aufgrund des großen Verteilungsvolumens der Steroide können vermutlich mit diesen neuen Wirkstoffen auch Tumor-Metastasen in den im menschlichen Körper für Zytostatika schwerzugänglichen Bereichen wie Pleuraspalt, Peritoneum, Mediastinum, etc. in einer zytostatischen Therapie adressiert werden.
Durch Untersuchungen der Apoptose-Signalkaskade war erfindungsgemäß die Entwicklung neuartiger Steroide möglich, die im Gegensatz zu den herkömm- lichen Glukokortikoiden über alle drei bekannten Wege der Apoptose- Signalkaskade (Rezeptor-vermittelt, mitochondrial und über das endo- plasmatische Retikulum vermittelt) Apoptose in bösartigen Zellen induzieren und somit Glukokortikoid- bzw. Poly-Zytostatika-resistente Leukämie-, Lymphom- und solide Tumorzellen zerstören können. Dabei ist die Wirkung selektiv auf maligne Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R1 = H, Z1, Z2 = 0, R3 = Methyl.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y1, Y2 = (H/OH) oder Y1, Y2 = (H/OR5), wobei R5 = RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O)- und Rx = H, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl ist, wobei jeweils auch einzelne Positionen fluoriert sein können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Rx = H, Alkyl und R2 4-Methyl-pentyl. Bevorzugte Substituenten für R1 sind H oder Methyl.
Bevorzugt weist jedes R4, R5 und Rx unabhängig voneinander bis zu 10 C-Atome auf.
In bevorzugten Ausführungsformen ist Rx Alkyl oder substituiertes Alkyl.
Soweit Substituenten nicht anders definiert sind, weisen sie bevorzugt 1 - 10 C-Atome auf.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von
Verbindungen der Formel I umfassend den Schritt a und nachfolgende
Umwandlung der funktionellen Gruppen: wobei Schritt a unter basischen Bedingungen durchgeführt wird.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel A umfassend den Schritt a und nachfolgende Umwandlung der funktionellen Gruppen: wobei Schritt a unter basischen Bedingungen, bevorzugt durch Erhitzen des Substrates in Gegenwart von Li2CO3 und LiBr in N,N-Dimethylformamid auf Temperaturen von 80 bis 120 °C durchgeführt wird. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Arzneimittel in der Therapie maligner Erkrankungen, gutartigen bzw. semimalignen Hauterkrankungen.
Typische maligne Erkrankungen sind Erkrankungen, die das Knochenmark oder andere blutbildende Organe betreffen oder solide Tumore oder epitheliale Tumore sind, wobei die soliden Tumore insbesondere Hirntumore wie Glioblastom und Medulloblastom sind.
Typische gutartige bzw. semimaligne Erkrankungen sind Hauterkrankungen wie Psoriasis vulgaris, Keloide oder Basaliome.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel eignen sich auch zur Verwendung in der Therapie von entzündlichen und chronisch entzündlichen Erkrankungen, zur Anwendung zur immunsuppressiven Therapie, zur antiviralen, antibakteriellen, antimykotischen, anti-Protozoen- oder antihelminthischen Therapie.
Die Verbindungen werden bevorzugt intravenös im Konzentrationsbereich zwischen 0,1 bis 100 pg/ml, bezogen auf das Blutvolumen des Patienten, verabreicht.
Bei einer topischen Anwendung werden 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das fertige Präparat, in die erkrankte Haut eingerieben.
Auch orale Einnahme ist bei den Verbindungen möglich.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, zeichnen sich die erfindungs- gemäßen Verbindungen durch folgende Eigenschaften aus:
Wirkungsunterschiede zu herkömmlichen Glukokortikoiden
Die neuartige Gruppe der 7,19-epoxy-Steroide zeigt im Gegensatz zu herkömmlichen Steroiden eine zytostatische Wirkung in soliden Tumorzellen, in verschiedenen Hirntumorzellen und in Steroid-resistenten Leukämie- und Lymphomzellen, die Ko-Resistenzen zu verschiedensten herkömmlichen in der Therapie verwendeten Zytostatika tragen. Ebenfalls ist eine Wirkung in Zytostatika-resistenten soliden Tumorzellen nachweisbar.
Auch in Pankreas-Karzinomzellen sind die Verbindungen wirksam.
Die neuartige Steroid-Klasse induziert spezifisch Apoptose in malignen Zellen, während primäre humane Leukozyten nicht geschädigt werden.
Die neuartigen Steroide zeigen in vitro eine synergistische Wirkung mit herkömmlichen in der Therapie von malignen Erkrankungen verwendeten Zytostatika. Die Zytostatika-Resistenz-Überwindung in Verbindung mit dem großen Verteilungsvolumen der Wirkstoffe im menschlichen Körper begründet durch ihre Steroid-Struktur sind die besonderen neuen Eigenschaften dieser neuen Wirkstoffklasse, die eine gute zytostatische Wirkung bei heutzutage schwer oder nicht therapierbaren malignen Erkrankungen versprechen lassen.
Figuren
Figur 1 zeigt die Proliferationsinhibition in Nalm-6-Zellen.
Figur 2 zeigt die Steroid- und Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in NaKu- Zellen.
Figur 3 zeigt die Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in BiBo-Zellen.
Figur 4 zeigt die Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in 7-CCA-Zellen.
Figur 5 zeigt synergistische Effekte mit Cytarabin und Vincristin auf Nalm-6- Zellen.
Figur 6 zeigt den Ausschluss von unspezifischer Nekrose bei Nalm-6-Zellen.
Figur 7 zeigt die Selektivität für Leukämiezellen (Nalm-6-Zellen) und in Lymphomzellen (BJAB-Zellen) im Vergleich zu humanen Leukozyten.
Figur 8 zeigt die Wirkung in Zytostatika-resistenten soliden Tumoren.
Figur 9 zeigt die Wirkung in Hirntumor-Zellen.
Figur 10 zeigt die Wirkung in primären humanen Glioblastom-Zellen.
Figur 11 zeigt die Wirkung in primären humanen Pankreaskarzinom-Zellen.
Figur 12 zeigt die Verteilung der erfindungsgemäßen Substanzen im Serum.
Figur 13 zeigt die Verteilung der erfindungsgemäßen Substanzen im Gehirn.
Figur 14 zeigt die Verteilung der erfindungsgemäßen Substanzen in der Leber. Beispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Synthese von 3β,5a-Dihydroxy-7β ,19-epoxy-cholestan-6- on (9, WIL-071)
Die Synthesesequenz zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuartigen Steroide wird am Beispiel der Substanz WIL-071 erläutert. Dabei wird zunächst gemäß eines im Grundsatz literaturbekannten Verfahrens die C-19 Methylgruppe von Cholesterylacetat (1) hydroxyliert, bevor das 19- Hydroxycholesteryacatat (4) im B-Ring oxidativ funktionalisiert und die 7,19- Epoxybrücke geschlossen wird.
Schritte a - c: Synthese von 3β -Acetoxy-cholest-Δ5-en- -19β ol (4) 200 g (0.23 mol, 1.0 Äq.) Cholesterylacetat (1) in 1.6 L Dioxan wurden mit 96 g (0.67 mol, 1.5 Äq.) N- Bromacetamid (NBA) sowie 320 mL HCIO4 (0.5 N) versetzt. Nach 1 h bei 0 °C unter Lichtausschluss und 1 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von gesättigter NazSO3-Lösung (bis zur Verfärbung der Reaktionsmischung) und Wasser gestoppt. Nach Extraktion mit MTBE wurden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt (2, beiger Feststoff) - mit erheblichen Mengen (>40%) an regioisomerem Bromhydrin - wurde ohne weitere Aufreinigung im folgenden Schritt eingesetzt. Für eine detaillierte Analyse wurde eine kleine Menge des Bromhydrins 2 durch Säulenchromato- graphie aufgereinigt.
Zu einer Lösung von (ca. 25 g) Bromhydrin 2 (+ Regioisomer) in 1.5 L Cyclohexan wurden 27.6 g (85.8 mmol, 1.5 Äq.) Diacetoxyiodbenzol (DIB) sowie 8.76 g (68.6 mmol, 1.2 Äq.) lod gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 1 h unter Bestrahlung mittels einer 150 Watt Quecksilberdampflampe zum Rückfluss erhitzt. Die violette Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und durch Zugabe von gesättigter Na2SO3-Lösung und Wasser (bis zur Verfärbung) gequencht. Nach Extraktion mit EtOAc wurden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt (3, braunes viskoses Öl) konnte im nächsten Schritt ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden. Diese Prozedur wurde insgesamt siebenfach vorgenommen. Eine kleine Menge an 3 wurde für analytische Zwecke säulenchromatographisch aufgereinigt.
Zu einer Lösung von Verbindung 3 (ca. 50 g) in 1.6 L Z-PrOH wurden 37.8 g (0.58 mol, 5.0 Äq.) Zinkpulver sowie 94 mL (98 g, 1.64 mol, 14.0 Äq.) Essigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3 h zum Rückfluss erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur gekühlt und über Celite® filtriert. Die klare, gelbe Lösung wurde auf ein Volumen von 100 mL eingeengt und nach Zugabe von Wasser mit MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSÖ4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Diese Prozedur wurde insgesamt vierfach vorgenommen. Das Produkt 4 wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 10: 1) in Form eines beigen Feststoffs erhalten werden (74 g, 0.17 mol, 36% über drei Stufen).
Schmelzpunkt: 112 °C - 114 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 5.76 (d, J = 5.0 Hz, 1H),
4.66 - 4.60 (m, 1H), 3.82 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.61 (dd, J = 11.4, 9.1 Hz, 1H), 2.41 (ddd, J = 13.0, 4.9 Hz, 2.1 Hz, 1H), 2.28 - 2.23 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.95 (dt, J = 13.8, 3.4 Hz, 1H), 1.90 - 0.93 (m, 26H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 6.6, 2.2 Hz, 3H), 0.72 (s, 3H).
13C-NMR (125 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 170.6, 134.7, 128.4, 73.6,
62.9, 57.7, 56.2, 50.4, 42.7, 41.7, 40.1, 39.6, 38.4, 36.3,
35.9, 33.5, 33.2, 31.4, 28.4, 28.2, 28.2, 24.2, 24.0, 23.0, 22.7, 21.9, 21.5, 18.8, 12.4.
FT-IR (ATR): v [m 1] = 3507 (bw), 2944 (s), 2934 (s), 2870 (m), 1734 (m), 1713 (s), 1469 (m), 1444 (m), 1381 (m), 1370 (m), 1254 (s), 1245 (vs), 1029 (vs), 977 (m), 961 (m), 911 (w), 886 (w), 824 (w), 807 (w), 742 (w), 670 (w), 610 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C29H48O3Na+[M + Na] +
467.3496 u, gefunden: 467.3493 u.
Schritt d: Synthese von 3β-Acetoxy-19-methoxymethyloxy-cholestan- A5-en (5)
42 g (78.7 mmol, 1.0 Äq.) 19-Hydroxycholesterylacetat (4) in 315 mL CH2(OMe)2 wurden mit 1.64 g (18.9 mmol, 0.2 Äq.) Lithiumbromid sowie 1.8 g (9.44 mmol, 0.1 Äq.) p-Toluolsulfonsäure (als Monohydrat) versetzt und die Reaktionsmischung für 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem ein vollständiger Umsatz beobachtet wurde (DC-Kontrolle), wurde die Reaktion durch Zugabe von gesättigter NaCI-Lösung gestoppt und die wässrige Phase mit MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten NaHCO3-Lösung sowie einer NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Produkt 5 konnte nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 5: 1) in Form eines weißen Feststoffs erhalten werden (26.9 g, 55.0 mmol, 70%).
Schmelzpunkt: 84 °C - 85 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 5.60 (d, J = 5.4 Hz, 1H),
4.67 - 4.58 (m, 3H), 3.73 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.48 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 2.40 (ddd, J = 13.0, 5.2, 2.2 Hz, 1H), 2.33 (t, J = 12.2 Hz, 1H), 2.11 (dt, J = 13.8, 3.7 Hz, 1H), 2.03 (s, 3H), 2.02 - 0.96 (m, 25H), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.3 Hz, 6H), 0.70 (s, 3H).
13C-NMR (125 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 170.7, 135.8, 126.2, 97.0,
73.8, 69.1, 57.4, 56.2, 55.6, 50.5, 42.6, 40.5, 40.2, 39.7, 38.5, 36.3, 36.0, 33.4, 32.9, 31.7, 28.4, 28.2, 28.2, 24.3, 24.0, 23.0, 22.7, 22.0, 21.6, 18.8, 12.2. FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3419 (br w), 2932 (m), 2868 (m), 1733 (m), 1498 (w), 1467 (w), 1444 (w), 1366 (m), 1242 (s), 1144 (m), 1112 (m), 1096 (m), 1046 (s), 1033 (s), 986 (m), 962 (m), 943 (m), 915 (m), 881 (w), 845 (w), 824 (w), 814 (w), 727 (w), 703 (w), 679 (w), 630 (w), 607 (m), 580 (w).
Schritt e: Synthese von 3ß- Acetoxy- 5a- hydroxy- 19- methoxymethyloxy-cholestan-6-on (6)
32.4 g (66.3 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 5 wurden in 400 mL CH2CI2 gelöst und mit 25.3 g (113 mmol, 1.7 Äq.) mCPBA (70%) versetzt. Die Reaktions- mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt (mit Erreichen eines vollen Umsatzes wurde ein weißer Niederschlag beobachtet, ist jedoch nicht zwingend notwendig) und auf 0 °C gekühlt. Der entstandene weiße Niederschlag wurde durch Zugabe von 950 mL Aceton gelöst und die klare Lösung wurde mit einer Lösung aus 24 g (239 mmol, 3.6 Äq.) CrO3 in 80 mL Wasser versetzt. Nach 10 Minuten auf 0 °C wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht und für 1 h gerührt. Anschließend wurde die zuvor beschriebene Prozedur mit 7.82 g (78.2 mmol, 1.18 Äq.) CrO3 in 35 mL Wasser wiederholt. Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von gesättigter NaHCO3-Lösung beendet und die wässrige Phase mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCI- Lösung gewaschen. Die klare, gelbe Lösung wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Anschließend wurde das gewünschte Produkt 6 nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 8: 1) in Form eines weißen Schaums erhalten (22.3 g, 42.8 mmol, 65%).
Schmelzpunkt: 143 °C - 144 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 5.11 (m, 1H), 4.50 (s, 2H),
3.64 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 2.75 (s, 1H), 2.57 (dd, J = 14.6, 11.6 Hz, 1H), 2.20 - 2.13 (m, 2H), 2.09 - 2.03 (m, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.96 - 1.82 (m, 3H), 1.76 - 1.63 (m, 3H, H-l), 1.59 - 1.43 (m, 5H), 1.39 - 0.96 (m, 12H), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.1 Hz, 6H), 0.68 (s, 3H).
13C-NMR (125 MHz, CDCI3): δ [ ppm] = 209.6, 171.1, 97.1, 77.8,
70.4, 67.1, 57.0, 56.3, 56.1, 45.7, 44.1, 43.2, 41.5, 40.0, 39.6, 37.2, 36.3, 35.9, 32.5, 28.3, 28.1, 26.6, 26.1, 24.0, 22.9, 22.7, 21.9, 21.5, 18.8, 12.3.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3384 (br w), 2939 (m), 2869 (m), 1730 (m), 1713 (s), 1467 (w), 1401 (w), 1382 (m), 1365 (m), 1236 (s), 1150 (m), 1106 (m), 1034 (s), 1012 (s), 967 (m), 940 (m), 920 (m), 904 (m), 871 (w), 834 (w), 734 (w), 664 (w), 941 (w), 609 (w), 553 (w).
Schritt f: Synthese von 3β -Acetoxy-7a-bromo-5a,6a-dihydroxy-6β,19- epoxy-cholestan (7)
Zu einer Lösung von 22.3 g (42.8 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 6 in 400 mL Essigsäure wurden 6.6 mL (20.5 g, 128 mmol, 3.5 Äq.) Brom in Essigsäure (65 mL) sowie einige Tropfen HBr (48% wässr.) gegeben. Die Reaktions- mischung wurde für 5 h auf 60 °C erwärmt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigter NazSO3-Lösung gequencht. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser sowie gesättigter NaCI- Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt 7 wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung (c-Hex/EtOAc, 6: 1) in Form eines weißen Feststoffs erhalten (13.4 g, 24.2 mmol, 57%).
Schmelzpunkt: 124 °C - 125 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 5.05 - 5.00 (m, 1H), 4.12
(d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.73 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.09 (s, 1H), 2.89 (s, 1H), 2.19 (ddd, J = 12.9, 4.5, 2.2 Hz, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.05 - 1.99 (m, 1H), 1.97 - 1.83 (m, 5H), 1.74 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 1.62 (s, 2H), 1.59 - 0.98 (m, 19H), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.87 (dd, J = 6.6, 3.0 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR (125 MHz, CDCI3): δ [ ppm] = 170.7, 101.7, 79.4, 69.9,
66.8, 59.4, 55.7, 52.9, 45.4, 43.5, 39.6, 39.0, 38.7, 38.6, 36.2, 35.8, 35.0, 28.2, 28.1, 27.2, 24.0, 24.0, 23.3, 23.0, 22.7, 21.6, 21.5, 18.8, 13.1.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3418 (br w), 2933 (m), 2868 (m), 1726 (s), 1714 (s), 1498 (w), 1466 (w), 1382 (m), 1366 (m), 1244 (s), 1154 (m), 1131 (m), 1096 (m), 1042 (s), 984 (m), 965 (s), 942 (s), 906 (m), 846 (m), 814 (w), 727 (w), 703 (m), 680 (m), 666 (m), 629 (m), 609 (m), 583 (m).
Schritt g: Synthese von 3β-Acetoxy-5a-hydroxy-7β,19-epoxy- cholestan-6-on (8) (WIL-232)
22.6 g (40.7 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 7 wurden in 1.8 L Dimethyl- formamid gelöst und mit 38.3 g (0.52 mol, 12.7 Äq.) Li2CO3 sowie 16.3 g (0.19 mol, 4.6 Äq.) LiBr versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 100 °C gerührt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gekühlt und mit Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser sowie gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt 8 nach säulenchromatographischer Aufreinigung (c-Hex/EtOAc, 6: 1) in Form eines weißen Feststoffs erhalten (17.5 g, 37.0 mmol, 91%).
Schmelzpunkt: 146 °C - 147 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 5.25 - 5.18 (m, 1H), 4.14
(dd, J = 10.2, 1.7 Hz, 1H), 3.91 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.61 (s, 1H), 2.12 - 2.03 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.00 - 1.94 (m, 2H), 1.86 (dt, J = 13.0, 9.4, 5.8 Hz, 1H), 1.73 (td, J = 13.8, 4.7 Hz, 1H), 1.65 - 1.48 (m, 5H), 1.42 - 1.04 (m, 13H), 0.98 (dt, J = 10.2, 8.7 Hz, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR (125 MHz, CDCI3): δ [ ppm] = 212.9, 170.5, 78.7, 76.2,
69.2, 63.6, 55.7, 52.0, 45.5, 45.1, 43.2, 40.5, 40.2, 39.6,
36.2, 35.8, 35.2, 28.6, 28.1, 26.2, 23.9, 22.9, 22.9, 22.7, 21.7, 21.5, 21.3, 18.7, 13.1.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3507 (br w), 2944 (s), 2934 (s), 2870 (m), 1734 (m), 1713 (s), 1469 (m), 1444 (m), 1381 (m), 1370 (m), 1254 (s), 1245 (vs), 1029 (vs), 977 (m), 961 (m), 911 (w), 886 (w), 824 (w), 807 (w), 742 (w), 670 (w), 610 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C29H46O5Na+ [M + Na] +
497.32375 u, gefunden : 497.32341 u.
Schritt h: Synthese von 3β,5a-Dihydroxy-7β,19-epoxy-cholestan-6-on (9) (WIL-071)
Zu einer Lösung von 12.7 g (26.7 mmol, 1.0 Äq.) 8 in 890 mL Methanol wurden 5.5 g (40.1 mmol, 1.5 Äq.) K2CO3 gegeben und die Reaktionsmischung für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde die Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit NaCI-Lösung gewaschen und über MgSÜ4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand säulenchromato- graphisch (c-Hex/EtOAc, 1 : 1) aufgereinigt. Das Produkt 9 (WIL-071) wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten (11.3 g, 26.1 mmol, 98%) und anschließend aus ca. 400 mL (EtOH/H2O, 1 : 1) umkristallisiert (9.7 g hochreine Substanz). Schmelzpunkt: 178 °C - 180 °C.
1H-NMR (600 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 4.19 - 4.13 (m, 2H), 3.88
(d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.81 (s, 1H), 2.71 (s, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 3H), 1.96 - 1.82 (m, 3H), 1.75 (s, 1H), 1.65 - 0.94 (m, 20H), 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 6.6, 2.9 Hz, 6H), 0.73 (s, 3H).
13C-NMR (150 MHz, CDCI3): δ [ ppm] = 213.6, 79.2, 76.2, 66.2,
63.7, 55.7, 52.1, 45.5, 45.2, 43.3, 40.6, 40.3, 39.6, 38.8, 36.2, 35.8, 30.2, 28.6, 28.1, 23.9, 22.9, 22.9, 22.7, 21.8, 21.5, 18.7, 13.1.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3463 (br w), 2948 (s), 2868 (m), 1733 (vs), 1497 (w), 1466 (m), 1414 (w), 1382 (m), 1365 (w), 1340 (w), 1296 (w), 1248 (m), 1225 (w), 1153 (m), 1051 (vs), 968 (m), 958 (m), 887 (w), 818 (w), 779 (w), 756 (m), 713 (w), 637 (w), 558 (m), 539 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H44O4Na+ [M + Na] +
455.31318 u, gefunden : 455.31365 u.
Synthese von 5a-Hydroxy-7β,19-epoxy-cholestan-3,6-dion (10) (WIL-
Zu einer Lösung von 400 mg (0.93 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 9 in 11.5 mL Dichlormethan bei 0 °C wurden 588 mg (1.39 mmol, 1.5 Äq.) Dess-Martin- Periodinan gegeben und die Reaktionsmischung wurde für 1 h bei Raum- temperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde die Reaktionsmischung mit wässriger NaHCO3-Lösung und wässriger Na2S2O3- Lösung verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit CH2CI2 extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch (cHex/EtOAc, 5: 1) aufgereinigt und das Produkt 10 in Form eines weißen Feststoffs erhalten (148 mg, 0.34 mmol, 37%).
Schmelzpunkt: 204 °C - 205 °C. 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 4.12 (q, J = 10.5 Hz, 2H),
3.93 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 2.99 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 2.92 - 2.87 (m, 1H), 2.48 (m, J = 16.3, 8.0 Hz, 2H), 2.43 - 2.34 (m, 1H), 2.19 (t, J = 10.6 Hz, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 2H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.65 - 1.56 (m, 3H), 1.55 - 1.06 (m, 14H), 1.03 - 0.95 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.77 (s, 3H).
13C-NMR (126 MHz, CDCI3): δ [ ppm] = 211.5, 206.5, 80.0, 76.8,
63.6, 55.7, 51.9, 47.1, 45.4, 45.1, 43.4, 40.9, 40.2, 39.6, 36.9, 36.2, 35.8, 28.6, 28.1, 23.9, 22.9, 22.9, 22.7, 22.4, 21.8, 18.7, 13.1.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3459 (bw), 2952 (m), 2940 (m), 2918 (m), 2859 (m), 1742 (s), 1714 (s), 1466 (m), 1382 (m), 1345 (w), 1298 (w), 1252 (w), 1238 (m), 1195 (w), 1163 (m), 1145 (m), 1102 (w), 1079 (w), 1051 (s), 980 (w), 948 (m), 913 (w), 903 (w), 891 (w), 854 (w), 822 (w), 797 (w), 752 (m), 723 (m), 663 (w), 631 (m), 594 (w), 559 (m), 525 (m).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H43O4 + [M + H] +
431.31559 u, gefunden : 431.31544 u; m/z berechnet für: C27H42O4Na+ [M + Na]+ 453.29753 u, gefunden: 453.29761 u.
Synthese von 7β,19-Epoxy-cholest-4-en-3,6-dion (11) (WIL-270)
Zu einer Lösung von 50 mg (0.12 mmol, 1.0 Äq.) 10 in 1.2 mL Toluol wurden 1.8 mg (5.8 pmol, 0.05 Äq.) TsOH H2O bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 70 °C erwärmt und 7 h bei 70 °C gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde die Reaktionsmischung mit CH2CI2 und verdünnter wässriger NaHCO3-Lösung verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit CH2CI2 extrahiert, die vereinigten org. Phasen wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch (cHex/EtOAc, 6: 1) aufgereinigt. Das Produkt 11 wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten (44 mg, 0.11 mmol, 92%).
Schmelzpunkt: 127 °C - 128 °C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 6.42 (s, 1H), 4.03 (d, J = 8.9
Hz, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 2.50 - 2.43 (m, 2H), 2.23 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 2.13 (dt, J = 13.2, 3.1 Hz, 1H), 2.06 - 1.96 (m, 1H), 1.95 - 1.83 (m, 2H), 1.70 - 1.62 (m, 1H), 1.62 - 1.47 (m, 3H), 1.44 - 1.06 (m, 12H), 1.03 - 0.96 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.78 (s, 3H)
13C-NMR (126 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 198.6, 197.7, 156.4, 122.7,
77.0, 64.3, 55.7, 52.4, 49.3, 45.4, 43.5, 40.3, 39.6, 38.4, 36.2, 35.8, 34.7, 28.7, 28.1, 24.2, 23.9, 22.9, 22.9, 22.7, 21.9, 18.7, 13.1.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 2954 (m), 2933 (m), 2857 (m), 1724 (m), 1688 (s), 1632 (w), 1465 (m), 1453 (m), 1383 (w), 1366 (w), 1328 (w), 1274 (w), 1245 (w), 1231 (m), 1185 (m), 1113 (w), 1074 (w), 1035 (s), 974 (w), 932 (w), 904 (s), 879 (w), 857 (w), 828 (m), 811 (w), 780 (m), 766 (w), 720 (w), 653 (w), 634 (w), 571 (w), 548 (m), 529 (m), 507 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H41O3 + [M + H] +
413.30502 u, gefunden : 413.30513 u; m/z berechnet für: C27H40O3Na+ [M + Na]+ 435.28697 u, gefunden: 435.28720 u.
Synthese von 3β,5a-Dibenzyloxy-7β,19-epoxy-cholestan-6-on (12)
(WIL 242a) sowie von 5a-Benzyloxy-3β-hydroxy-7β,19-epoxy- cholestan-6-on (13) (WIL 242b) Zu einer Lösung von 39 mg (0.090 mmol, 1.0 Äq.) 9 in 0.92 mL Dimethylformamid wurden 35 mg (0.185 mmol, 2.0 Äq.) CsOH H2O, 16.2 mL (0.139 mmol, 1.5 Äq.) Bnßr und 4 mg (0.011 mmol, 0.1 Äq.) Tetrabutyl- ammoniumiodid bei Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde die Reaktionsmischung mit MTBE und verdünnter wässriger NH4CI- Lösung verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit MTBE extrahiert, die vereinigten org. Phasen wurden erst mit Wasser, dann mit gesättigter NaCI- Lösung gewaschen, anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch (cHex/EtOAc, 9: 1 auf 3: 1) aufgereinigt. Das Produkt 12 (doppelt Bn) wurde in Form eines farblosen Öls erhalten (22 mg, 0.036 mmol, 40%). Zudem wurde das Produkt 13 (einfach benzyliert) ebenfalls in Form eines farblosen Öls erhalten (7.9 mg, 0.015 mmol, 17%).
Analytik zu 12:
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 7.38 - 7.25 (m, 5H), 5.15 (d,
J = 11.9 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.13 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.88 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 3.67 (s, 1H), 2.65 (dd, J = 14.2, 3.5 Hz, 1H), 2.09 - 1.97 (m, 3H), 1.96 - 1.73 (m, 4H), 1.63 - 1.06 (m, 18H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR (126 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 208.4, 139.3, 128.4, 127.1, 80.7, 66.1, 65.5, 63.7, 55.7, 52.6, 45.6, 44.1, 43.0, 41.4, 40.6, 39.6, 36.3, 35.8, 33.2, 30.5, 28.7, 28.2, 23.9, 23.0, 22.9, 22.7, 22.0, 21.9, 18.7, 13.1.
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C34H5o04Na+ [M + Na]+
545.36013 u, gefunden : 545.36016 u.
Analytik zu 13:
1H-NMR (500 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 7.38 - 7.23 (m, 8H), 7.16 (d,
J = 6.9 Hz, 2H), 5.07 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.58 - 4.51 (m, 3H), 4.15 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.66 (s, 1H), 3.64 - 3.55 (m, 1H), 2.72 (dd, J = 14.2, 3.4 Hz, 1H), 2.08 - 1.93 (m, 4H), 1.91 - 1.83 (m, 1H), 1.79 (dd, J = 14.1, 11.4 Hz, 1H), 1.72 (td, J = 13.8, 4.7 Hz, 1H), 1.62 - 1.46 (m, 4H), 1.41 - 1.06 (m, 13H), 1.02 - 0.94 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.73 (s, 3H).
13C-NMR (126 MHz, CDCI3): δ [ppm] = 208.7, 139.2, 138.7, 128.6, 128.4, 127.8, 127.3, 127.3, 80.6, 72.3, 70.6, 65.5, 63.7, 55.8, 52.6, 45.6, 44.1, 43.1, 41.6, 40.6, 39.6, 36.3, 35.8, 30.2, 28.7, 28.2, 27.3, 23.9, 23.0, 23.0, 22.7, 21.9, 21.8, 18.7, 13.1, 0.2.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3064 (w), 3031 (w), 2949 (s), 2867 (s), 1733 (s), 1496 (w), 1454 (m), 1382 (w), 1364 (w), 1307 (w), 1262 (w), 1228 (w), 1206 (w), 1179 (w), 1142 (w), 1090 (s), 1054 (m), 1001 (w), 953 (w), 873 (w), 842 (w), 803 (w), 734 (s), 693 (s), 557 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C41H56O4Na+ [M + Na]+
635.40708 u, gefunden : 635.40751 u.
Synthese von Propionsäure-(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-keto- cholestan-3β-yl)-ester (14) [WIL-313]
Zu einer Lösung von 100 mg (0.232 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 9 in 0.58 ml Pyridin wurden 0.30 ml (2.32 mmol, 10 Äq.) Propionsäureanhydrid bei Raumtemperatur hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 25 h bei Raumtemperatur gerührt und nach Abschluss der Reaktion (DC) mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde zweimal mit IM Salzsäure, sowie einmal mit Wasser gewaschen und anschließend über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (cHex/EtOAc, 10: 1) aufgereinigt. Das Produkt 14 konnte in Form eines weißen Feststoffs erhalten werden (92 mg, 0.19 mmol, 81 %).
Analytik zu 14:
Smp: 50 °C - 55 °C.
Rf: 0.50 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.23 (tt, J = 11.1, 5.5 Hz, 1H),
4.19 - 4.11 (m, 1H), 3.91 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 2.61 (s, 1H), 2.29 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.13 - 2.03 (m, 3H), 2.00 - 1.93 (m, 2H), 1.91 - 1.82 (m, 1H), 1.73 (td, J = 13.9, 4.7 Hz, 1H), 1.65 - 1.47 (m, 4H), 1.44 - 1.07 (m, 17H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.7, 2.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.89, 173.96, 78.67, 76.18,
68.93, 63.57, 55.73, 52.03, 45.52, 45.09, 43.22, 40.53,
40.24, 39.59, 36.22, 35.77, 35.27, 28.64, 28.13, 28.00,
26.24, 23.88, 22.93, 22.89, 22.69, 21.71, 21.27, 18.74, 13.07, 9.30.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3444 (bw), 2947 (m), 2868 (m), 1737 (s), 1463 (m), 1381 (m), 1350 (m), 1275 (w), 1261 (w), 1181 (s), 1155 (m), 1082 (m), 1046 (m), 1022 (m), 975 (w), 952 (m), 889 (w), 869 (m), 824 (w), 808 (w), 757 (m), 711 (w), 663 (w), 637 (w), 559 (m).
HR-MS: (GC-EI-MS, 70 eV) = m/z berechnet für: C30H48O5 [M] +
488.34963 u, gefunden: 488.34896 u. c = 0.555 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 7β,19-Epoxy-5a-hydroxy-6-on-cholestan-3β-yl- methylcarbonat (15) [WIL-357]
Zu einer Lösung von 99 mg (0.231 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 9 in 0.49 ml Dichloromethan wurden bei 0 °C 0.07 ml (8.8 mmol, 3.8 Äq.) Pyridin, 3 mg (0.025 mmol, 0.1 Äq.) DMAP und 0.03 (0.38 mmol, 1.6 Äq.)
Methylchloroformat zugegeben. Nach 1.5 h bei 0 °C wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung und Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichloromethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden mit IM Salzsäure, sowie mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und anschließend über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (cHex/EtOAc, 10: 1) aufgereinigt. Das Produkt 15 konnte in Form eines weißen Feststoffs erhalten werden (93 mg, 0.19 mmol, 81 %).
Analytik zu 15:
Smp: 64 °C - 65 °C.
Rf: 0.67 (1 : 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.09 (tt, J = 11.1, 5.4 Hz, 1H),
4.12 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 2.63 (s, 1H), 2.17 (ddd, J = 13.0, 5.2, 1.6 Hz, 1H), 2.13 - 1.99 (m, 4H), 1.86 (dtd, J = 13.1, 9.5, 5.9 Hz, 1H), 1.73 (td, J = 13.7, 4.5 Hz, 1H), 1.66 - 1.55 (m, 3H), 1.51 (dt, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.43 - 1.07 (m, 14H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.72, 155.19, 78.65, 76.12,
73.29, 63.51, 55.73, 54.82, 52.02, 45.52, 45.09, 43.20,
40.51, 40.24, 39.59, 36.22, 35.76, 35.21, 28.64, 28.13,
26.18, 23.88, 22.93, 22.88, 22.69, 21.71, 21.22, 18.74,
13.08.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3457 (bw), 2950 (m), 2867 (w), 1743 (s), 1443 (m), 1383 (w), 1320 (w), 1269 (s), 1258 (s), 1227 (m), 1171 (w), 1154 (w), 1046 (m), 1018 (m), 952 (m), 935 (m), 877 (w), 825 (w), 792 (m), 757 (w), 721 (w), 664 (w), 625 (w), 559 (w), 530 (w).
HR-MS: (GC-EI-MS, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H46O6 [M] +
490.32889 u, gefunden: 490.32834 u. c = 0.58 g/100 mL, CHCI3: Synthese von N-Boc-glycin (7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on-cholestan-
3β-yl) ester (16) [WIL-360]
Zu einer Lösung von 199 mg (0.460 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 9 in 4.6 ml Dichloromethan wurden unter einer Argonatmosphäre 0.12 ml (1.5 mmol, 3.4 Äq.) Pyridin, 195 mg (1.02 mmol, 2.2 Äq.) EDC HCI, 18 mg (0.14 mmol, 0.3 Äq.) DMAP und 89 mg (0.51 mmol, 1.1 Äq.) N-Boc-Glycin hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit 20 ml Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde je einmal mit gesättigter wässriger NaHCO3 Lösung, Wasser und wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (10: 1, cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Produkt 16 in Form eines farblosen Feststoffs erhalten (262 mg, 0.444 mmol, 96 %).
Analytik zu 16:
Smp: 76 °C - 77 °C.
Rf: 0.42 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.29 (tt, J = 11.1, 5.5 Hz, 1H, H-3), 5.04 - 4.71 (m, 1H, NH), 4.12 (d, J = 10.8 Hz, 1H, H-19), 3.94 - 3.78 (m, 4H, H-29, H-19, H-7), 2.64 (s, 1H, OH), 2.12 - 1.95 (m, 5H), 1.91 - 1.81 (m, 1H), 1.73 (td, J = 13.7, 4.6 Hz, 1H), 1.63 - 1.54 (m, 4H), 1.50 (dt, J = 13.3, 6.6 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.41 - 1.05 (m, 13H), 0.98 (q, J = 9.1 Hz, 1H), 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.73, 169.86, 155.81, 80.13,
78.62, 76.15, 70.50, 63.50, 55.73, 52.01, 45.51, 45.08,
43.20, 42.75, 40.51, 40.23, 39.59, 36.21, 35.76, 35.19,
28.63, 28.46, 28.13, 26.15, 23.88, 22.93, 22.88, 22.69,
21.69, 21.21, 18.74, 13.07.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3387 (bw), 2951 (m), 2869 (m), 1740 (s), 1720 (s), 1513 (m), 1467 (w), 1384 (m), 1366 (m), 1282 (w), 1251 (m), 1204 (m), 1169 (s), 1051 (m), 970 (w), 918 (w), 867 (w), 825 (w), 757 (w), 734 (w), 559 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C34H55NO7Na [M + Na]+
612.38707 u, gefunden: 612.38748 u. c = 0.575 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von (tert-Butyldimethylsilanyloxy)essigsäure (7β, 19-epoxy- 5α-hydroxy-6-on-cholestan-3β-yl)- ester (17) [WIL-361]
Zu einer Lösung von 198 mg (0.458 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 1 in 4.6 ml Dichloromethan wurden unter einer Argonatmosphäre 0.12 ml (1.5 mmol, 3.4 Äq.) Pyridin, 197 mg (1.02 mmol, 2.2 Äq.) EDC HCI, 18 mg (0.14 mmol, 0.3 Äq.) DMAP und 98 mg (0.51 mmol, 1.1 Äq.) TBS-Glycolsäure hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit 20 ml Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde je einmal mit gesättigter wässriger NaHCO3 Lösung, Wasser und wässriger gesättigter NaCI- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (20: 1, cHex/EtOAc) aufgereinigt und das gewünschte Produkt 17 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (165 mg, 0.273 mmol, 59 %). Außerdem konnte das unerwünschte Nebenprodukt 18 ebenfalls als farbloser Feststoff erhalten werden (53 mg, 0.080 mmol, 17 %).
Analytik zu 17:
Smp: 139 °C - 140 °C.
Rf: 0.59 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.29 (dt, J = 11.3, 5.6 Hz, 1H),
4.20 (s, 2H), 4.12 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 2.60 (s, 1H), 2.13 - 1.94 (m, 5H), 1.91 - 1.81 (m, 1H), 1.73 (td, J = 13.9, 4.7 Hz, 1H), 1.64 - 1.46 (m, 4H), 1.43 - 1.06 (m, 14H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H), 0.09 (d, J = 1.3 Hz, 6H).
13C-NMR: (151 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.74, 171.29, 78.62, 76.15,
69.83, 63.54, 62.08, 55.73, 52.02, 45.52, 45.07, 43.20,
40.52, 40.23, 39.59, 36.21, 35.77, 35.20, 28.64, 28.13,
26.19, 25.88, 23.88, 22.93, 22.89, 22.69, 21.70, 21.24,
18.74, 18.54, 13.07, -5.25, -5.27.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3494 (w), 2952 (m), 2931 (m), 2896 (w), 2858 (w), 1741 (m), 1495 (w), 1463 (w), 1441 (w), 1383 (w), 1361 (w), 1252 (m), 1221 (m), 1187 (w), 1147 (s), 1085 (w), 1048 (m), 1021 (m), 977 (w), 961 (w), 888 (w), 835 (s), 780 (s), 755 (m), 712 (m), 663 (w), 636 (w), 602 (w), 559 (w), 474 (w), 434 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C35H60O6SiNa [M + Na] +
627.40514 u, gefunden: 627.40559 u. c = 0.53 g/100 mL, CHCI3:
Analytik zu 18:
Smp: 170 °C - 171 °C.
Rf: 0.48 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.33 (tt, J = 11.1, 5.5 Hz, 1H),
4.69 - 4.60 (m, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.14 (dd, J = 10.3, 1.8 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.63 (s, 1H), 2.15 - 1.98 (m, 5H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.75 (td, J = 13.8, 4.7 Hz, 1H), 1.65 - 1.49 (m, 4H), 1.44 - 1.08 (m, 14H), 1.04 - 0.97 (m, 1H), 0.94 (s, 9H), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.76 (s, 3H), 0.14 (s, 6H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.63, 171.31, 166.98, 78.59,
76.13, 70.83, 63.49, 61.59, 60.96, 55.73, 52.00, 45.51, 45.08, 43.19, 40.51, 40.22, 39.59, 36.21, 35.76, 35.14, 28.63, 28.13, 26.09, 25.88, 23.88, 22.93, 22.88, 22.69, 21.69, 21.20, 18.74, 18.54, 13.07, -5.31.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3523 (w), 2950 (m), 2930 (m), 2885 (w), 2858 (w), 1771 (m), 1754 (m), 1739 (m), 1470 (w), 1444 (w), 1389 (w), 1367 (w), 1255 (w), 1223 (w), 1180 (m), 1141 (s), 1040 (m), 1018 (w), 975 (w), 956 (w), 891 (w), 880 (w), 836 (s), 782 (m), 760 (m), 729 (w), 693 (w), 663 (w), 635 (w), 561 (w), 545 (w), 454 (w), 408 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C37H62O8SiNa [M + Na] +
685.41062 u, gefunden: 685.41025 u.
Synthese von Glycolsäure(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on-cholestan-
3β— l) ester (19) [WIL-364]
Eine Lösung von 104 mg (0.172 mmol, 1.0 Äq.) des TBS-Ethers 17 in 1.7 ml THF wurde auf 0°C gekühlt und anschließend mit 0.34 ml (0.34 mmol, 2.0 Äq.) TBAF versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde nach 1.5 h und Abschluss der Reaktion (DC) mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung versetzt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (3: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das gewünschte Produkt 19 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (76 mg, 0.15 mmol, 90 %).
Analytik zu 19:
Smp: 164 °C - 166 °C.
Rf: 0.17 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.35 (tt, J = 11.2, 5.5 Hz, 1H),
4.14 - 4.08 (m, 3H), 3.90 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.79 (s, 1H), 2.47 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 2.14 - 2.02 (m, 3H), 2.02 - 1.96 (m, 2H), 1.85 (dtd, J = 13.1, 9.4, 6.0 Hz, 1H), 1.74 (td, J = 13.9, 4.7 Hz, 1H), 1.63 - 1.54 (m, 3H), 1.52 - 1.46 (m, 1H), 1.41 - 1.03 (m, 14H), 1.01 - 0.93 (m, 1H), 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.84 (dd, J = 6.6, 2.9 Hz, 6H), 0.73 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.75, 172.97, 78.58, 76.17,
70.93, 63.48, 60.88, 55.73, 52.00, 45.52, 45.06, 43.20,
40.51, 40.22, 39.59, 36.22, 35.76, 35.17, 28.63, 28.14,
26.18, 23.88, 22.93, 22.89, 22.69, 21.70, 21.22, 18.74,
13.07.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3454 (bw), 2949 (m), 1932 (m), 2867 (m), 1738 (s), 1465 (m), 1446 (m), 1383 (m), 1366 (w), 1223 (s), 1208 (s), 1155 (m), 1097 (s), 1087 (s), 1045 (s), 1020 (m), 973 (m), 961 (m), 920 (w), 888 (w), 824 (m), 780 (w), 757 (m), 716 (w), 663 (w), 637 (w), 559 (m), 522 (m), 477 (m), 431 (m).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C29H46O6Na [M + Na]+
513.31866 u, gefunden: 513.31859 u. c = 0.56 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von Benzoesäure-(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on-cholestan-
3β-yl) ester (20) [WIL-362]
Zu einer Lösung von 150 mg (0.347 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 1, 6 mg (0.05 mmol, 0.1 Äq.) DMAP, 0.10 ml (0.69 mmol, 2.0 Äq.) Triethylamin in 2.3 ml DCM wurden bei 0°C unter einer Argonatmosphäre 0.06 ml (0.52 mmol, 1.5 Äq.) Benzoylchlorid zugegeben. Nach 15 min bei 0°C wurde das Reaktionsgemisch weitere 15 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit Dichloromethan und Wasser verdünnt und die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichloromethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (40: 1 - 15: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das gewünschte Produkt 20 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (158 mg, 0.294 mmol, 85 %).
Analytik zu 20:
Smp: 151 °C - 152 °C.
Rf: 0.55 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 8.07 - 8.01 (m, 2H), 7.61 - 7.54
(m, 1H), 7.45 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 5.51 (tt, J = 11.0, 5.5 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 10.3, 1.7 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.70 (s, 1H), 2.25 (ddd, J = 13.0, 5.3, 1.5 Hz, 1H), 2.19 - 2.07 (m, 4H), 1.95 - 1.78 (m, 2H), 1.78 - 1.59 (m, 3H), 1.53 (dt, J = 13.1, 6.6 Hz, 1H), 1.48 - 1.09 (m, 14H), 1.06 - 0.98 (m, 1H), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.77 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 212.86, 166.01, 133.04, 130.61,
129.71, 128.46, 78.74, 76.21, 69.83, 63.62, 55.74, 52.04, 45.54, 45.12, 43.26, 40.61, 40.26, 39.60, 36.23, 35.78, 35.39, 28.66, 28.14, 26.35, 23.89, 22.94, 22.91, 22.70, 21.74, 21.33, 18.75, 13.09.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3423 (bw), 2949 (m), 2867 (m), 1739 (m), 1717 (m), 1603 (w), 1585 (w), 1493 (w), 1451 (w), 1382 (w), 1316 (w), 1273 (s), 1227 (m), 1175 (w), 1152 (w), 1112 (m), 1069 (m), 1046 (m), 1027 (m), 954 (m), 887 (w), 856 (w), 822 (w), 757 (w), 710 (s), 686 (m), 663 (w), 637 (w), 600 (w), 559 (m), 524 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C34H49O5 [M + H] +
537.35745 u, C34H48O5Na [M + Na]+ 559.33940 u, gefunden : 537.35769 u, 559.33938. c = 0.56 g/100 mL, CHCI3: Synthese von Itakonsäure-4-(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on- cholestan-3β-yl)-l-methylester (21) [WIL-367]
Zu einer Lösung von 73 mg (0.169 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 1 in 1.7 ml Dichloromethan wurden unter einer Argonatmosphäre 0.042 ml (0.54 mmol, 3.2 Äq.) Pyridin, 74 mg (0.39 mmol, 2.3 Äq.) EDC HCI, 8 mg (0.07 mmol, 0.4 Äq.) DMAP und 28 mg (0.19 mmol, 1.1 Äq.) Itakonsäure Monomethylester hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 2.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit 10 ml Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde je einmal mit gesättigter wässriger NaHCO3 Lösung, Wasser und wässriger gesättigter NaCI- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (10: 1 - 8: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Produkt 21 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (65 mg, 0.116 mmol, 69 %).
Analytik zu 21 :
SMP: 132 °C - 134 °C.
Rf: 0.39 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 6.31 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 5.69 (d,
J = 1.1 Hz, 1H), 5.25 (tt, J = 11.1, 5.4 Hz, 1H), 4.13 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.30 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 2.57 (s, 1H), 2.12 - 2.02 (m, 3H), 2.00 - 1.94 (m, 2H), 1.91 - 1.82 (m, 1H), 1.72 (td, J = 13.8, 4.7 Hz, 1H), 1.63 - 1.47 (m, 4H), 1.42 - 1.06 (m, 14H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 212.83, 170.14, 166.77, 133.91,
128.55, 78.65, 76.16, 69.79, 63.54, 55.73, 52.27, 52.02, 45.52, 45.09, 43.22, 40.53, 40.24, 39.59, 38.19, 36.22, 35.77, 35.14, 28.64, 28.14, 26.10, 23.89, 22.94, 22.89, 22.69, 21.70, 21.24, 18.74, 13.07.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3422 (bw), 2951 (w), 2930 (w), 2866 (w), 1731 (s), 1644 (w), 1457 (w), 1434 (w), 1375 (w), 1333 (m), 1301 (w), 1201 (s), 1178 (s), 1146 (m), 1097 (w), 1040 (m), 1033 (m), 1023 (m), 975 (w), 956 (m), 936 (w), 920 (w), 884 (w), 826 (m), 813 (m), 783 (w), 754 (m), 712 (w), 644 (w), 584 (w), 562 (m), 545 (w), 459 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C34H50O7 [M + H] +
559.36293 u, C33H50O3Na [M + Na]+ 581.34488 u, gefunden : 559.36329 u, 581.34505 u. c = 0.52 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 7β,19-Epoxy-3β,5a-hydroxy-cholestan-6-on-oxime (22)
[WIL-368]
Zu einer Lösung von 101 mg (0.231 mmol, 1.0 Äq.) des Alkohols 1 in 2.3 ml Pyridin wurden 64 mg (0.93 mmol, 4.0 Äq.) Hydroxylamin Hydrochlorid und eine Lösung aus 78 mg (0.93 mmol, 4.0 Äq.) Natriumacetat in 0.5 ml Methanol bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 19 h bei Raumtemperatur gerührt und nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc und wässriger gesättigter NaCI-Lösung verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit einer verdünnten NaCI-Lösung, Wasser, wässriger gesättigter NaCI-Lösung und einer CuSO4-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde au seiner Mischung aus Methanol, Ethylacetat und Wasser umkristallisiert. Das Produkt 22 konnte als farbloser Feststoff erhalten werden (35 mg, 0.078 mmol, 34 %).
Analytik zu 22:
Smp: 266 °C - 267 °C (Decomposition).
Rf: 0.09 (1 : 1, cHex: EtOAc); 0.45 (5:5: 1, cHex: EtOAc: MeOH) 1H-NMR: (600 MHz, DMSO-d6) δ [ ppm] : 11.02 (s, 1H), 4.62 (s, 1H),
4.36 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 3.69 (s, 1H), 3.59 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 1.95 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.82 - 1.65 (m, 3H), 1.65 - 1.57 (m, 1H), 1.55 - 1.43 (m, 3H), 1.42 - 1.17 (m, 8H), 1.17 - 0.99 (m, 8H), 0.97 - 0.90 (m, 1H), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.81 (dd, J = 6.6, 2.9 Hz, 6H), 0.67 (s, 3H).
13C-NMR: (151 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 158.76, 74.65, 71.50, 63.77,
62.83, 55.16, 52.23, 44.83, 44.31, 42.47, 40.22, 38.92, 38.78, 37.95, 35.67, 35.11, 29.88, 28.23, 27.39, 23.15, 22.67, 22.44, 22.41, 21.13, 21.11, 18.47, 12.78.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3511 (bw), 3290 (bw), 3197 (bw), 3111 (bw), 2954 (m), 2939 (m), 2921 (m), 2867 (m), 1493 (w), 1469
(m), 1444 (w), 1418 (w), 1384 (w), 1375 (w), 1362 (w),
1337 (w), 1307 (w), 1251 (w), 1208 (w), 1181 (w), 1157
(m), 1131 (w), 1098 (w), 1069 (w), 1042 (m), 1018 (m),
986 (m), 944 (s), 906 (m), 894 (w), 873 (w), 838 (w), 811 (m), 789 (m), 733 (m), 712 (w), 666 (w), 605 (w), 593 (w), 578 (w), 562 (m), 488 (w), 462 (w), 443 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H46NO4 [M + H]+
448.34214 u, gefunden : 448.34203 u. c = 0.59 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von Fumarsäure-(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on-cholestan-
3β-yl) methylester (23) [WIL-369]
Zu einer Lösung von 100 mg (0.23 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 1 in 2.3 ml Dichloromethan wurden unter einer Argonatmosphäre 0.06 ml (0.69 mmol, 3.0 Äq.) Pyridin, 97 mg (0.0.51 mmol, 2.2 Äq.) EDC HCI, 8 mg (0.07 mmol, 0.3 Äq.) DMAP und 37 mg (0.25 mmol, 1.1 Äq.) Fumarsäure Monomethylester hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde das Reaktionsgemisch mit 20 ml Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde je einmal mit gesättigter wässriger NaHCO3 Lösung, Wasser und wässriger gesättigter NaCI- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (8: 1 - 6: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Produkt 23 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (106 mg, 0.195 mmol, 84 %).
Analytik zu 23:
Smp: 153 °C - 154 °C.
Rf: 0.20 (6: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) <5 [ppm] : 6.85 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 5.36 (tt,
J = 11.1, 5.5 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 10.3, 1.7 Hz, 1H), 3.94 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.85 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.67 (s, 1H), 2.18 - 2.01 (m, 5H), 1.94 - 1.84 (m, 1H), 1.77 (td, J = 13.8, 4.6 Hz, 1H), 1.69 - 1.57 (m, 3H), 1.53 (dt, J = 13.1, 6.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.08 (m, 14H), 1.04 - 0.97 (m, 1H), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.76 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 212.69, 165.54, 164.36, 134.09,
133.44, 78.61, 76.15, 70.51, 63.52, 55.73, 52.46, 52.01, 45.52, 45.08, 43.22, 40.54, 40.23, 39.59, 36.22, 35.76, 35.16, 28.64, 28.13, 26.12, 23.88, 22.93, 22.89, 22.69, 21.70, 21.23, 18.74, 13.07.
FT-IR (ATR): v [cm-1] = 3453 (bw), 2951 (m), 2868 (m), 1722 (s), 1645 (w), 1495 (w), 1437 (w), 1383 (w), 1302 (s), 1260 (m), 1227 (w), 1155 (s), 1100 (w), 1086 (w), 1033 (m), 1021 (m), 977 (m), 910 (w), 889 (w), 825 (w), 775 (w), 757 (w), 734 (w), 676 (w), 593 (w), 559 (w), 529 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C33H48O7 [M + H] +
545.34728 u, C32H48O3Na [M + Na]+ 567.32922 u, gefunden : 545.34756 u, 567.32935 u. c = 0.59 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von Methansulfonsäure-(7β,19-epoxy-5a-hydroxy-6-on- cholestan-3β-y/ -ester (24) [TAS-S389]
Zu einer Lösung von 150 mg (0.347 mmol, 1.0 Äq.) Alkohol 1 in 8 ml Pyridin wurden 138 /zl Mesylchlorid (1.75 mmol, 5.0 Äq.) gegeben und anschließend bei 10°C für 5 h gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von Wasser gequentscht und die wässrige Phase wurde mich Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden nacheinander mit Wasser, 1 N HCl und wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (2: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das mesitylierte Produkt 24 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (175 mg, 0.343 mmol, 99 %).
Analytik zu 24:
Smp: 173 °C - 176 °C.
Rf: 0.35 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (600 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.12 (dp, J = 11.0, 5.7 Hz, 1H), 4.14 - 4.08 (m, 1H), 3.92 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 1.7 Hz,
1H), 3.01 (s, 3H), 2.77 (s, 1H), 2.24 (ddd, J = 13.0, 5.4, 1.6 Hz,
1H), 2.21 - 2.07 (m, 3H), 2.09 - 2.03 (m, 1H), 1.91 - 1.82 (m,
1H), 1.81 - 1.70 (m, 2H), 1.62 - 1.47 (m, 3H), 1.42 - 1.05 (m,
14H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.9 Hz, 6H), 0.75 - 0.73 (m, 3H).
13C-NMR: (151 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.21, 78.67, 77.47, 76.06, 63.35, 55.71, 51.95, 45.49, 45.03, 43.13, 40.35, 40.18, 39.57, 38.70, 36.50, 36.19, 35.73, 28.61, 28.11, 27.56, 23.86, 22.92, 22.85, 22.67, 21.67, 21.36, 18.72, 13.05. FT-IR v [cm-1] = 3499 (w), 2947 (w), 2921 (w), 2865 (w), 1733 (m),
(ATR): 1496 (w), 1467 (w), 1455 (w), 1417 (w), 1363 (m), 1356 (m),
1334 (m), 1302 (m), 1262 (w), 1229 (w), 1181 (m), 1169 (s), 1151 (m), 1100 (w), 1087 (w), 1045 (m), 1019 (w), 981 (m), 945 (s), 885 (m), 861 (s), 821 (m), 764 (m), 748 (m), 720 (w),
662 (w), 638 (w), 592 (w), 559 (w), 531 (m), 507 (m), 497 (m),
434 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C28H46O6SNa [M + Na]+
533.290731 u, gefunden: 533.29086 u. c = 0.54 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 7β,19-Epoxy-5a-hydroxy-cholest-2-en-6-on (25) [TAS-
Zu einer Lösung von 143 mg (0.280 mmol, 1.0 Äq.) Mesylat 24 in 5.0 ml DMF wurden 92 mg Lißr (1.06 mmol, 3.8 Äq.) und 99 mg Li2CO3 (1.01 mmol, 3.6 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend für 1 h refluxiert. Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt war, würde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in Wasser und Dichloromethan aufgenommen und die wässrige Phase mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silicia (15: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Eliminierungsprodukt 25 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (75 mg, 0.18 mmol, 65 %).
Analytik zu 25: Smp: 78 °C - 80 °C.
Rf: 0.56 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (600 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.76 - 5.66 (m, 2H), 3.91 - 3.80 (m, 3H), 2.76 - 2.64 (m, 2H), 2.19 - 2.08 (m, 3H), 2.06 (dt, J = 13.1, 3.1 Hz, 1H), 1.87 (dtd, J = 13.1, 9.4, 5.9 Hz, 1H), 1.72 - 1.36 (m, 8H), 1.35 - 1.05 (m, 9H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 6.6, 3.0 Hz, 6H), 0.75 (s, 3H).
13C-NMR: (151 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : ö 214.86, 125.53, 123.65, 77.16, 77.08, 65.09, 55.74, 51.94, 45.48, 45.35, 43.58, 40.36, 40.26, 39.59, 36.21, 35.77, 33.46, 28.65, 28.12, 24.66, 23.88, 22.93, 22.86, 22.68, 21.54, 18.74, 13.09.
FT-IR v [cm-1] = 3568 (bw), 3464 (bw), 3399 (bw), 3023 (w), 2949 (s),
(ATR): 2933 (m), 1895 (m), 2865 (m), 1742 (s), 1646 (w), 1615 (w),
1490 (w), 1464 (m), 1425 (m), 1380 (m), 1366 (w), 1336 (w), 1314 (w), 1285 (w), 1257 (w), 1232 (w), 1207 (w), 1178 (m), 1128 (w), 1099 (w), 1077 (m), 1039 (s), 979 (w), 966 (w), 932 (w), 908 (m), 899 (m), 876 (w), 861 (w), 820 (w), 801 (w), 770 (w), 738 (m), 657 (s), 608 (m), 565 (m), 488 (w), 463 (w), 429 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H43O3 [M + H]+ 415.320671 u, C27H42O3Na [M + Na]+ 437.302616 u, gefunden: 415.32086 u, 437.30267 u. : c = 0.55 g/100 mL, CHCI3: Synthese von 7β,19-Epoxy-5a-hydroxy-cholestan-6-on (26) [TAS-
Zu einer Lösung aus 70 mg (0.17 mmol, 1.0 Äq.) des Aikens 25 in 4 ml Ethylacetat wurden 20 mg Pd/C gegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 16 h bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch über Celite filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (5: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Hydrierungsprodukt 26 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (60 mg, 0.14 mmol, 85 %).
Analytik zu 26:
Smp: 50 °C.
Rf: 0.58 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 4.15 (dd, J = 10.1, 1.6 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.43 - 2.36 (m, 1H), 2.07 (tdd, J = 11.0, 10.1, 9.5, 2.4 Hz, 2H), 1.94 (dd, J = 13.8, 4.5 Hz, 1H), 1.92 - 1.75 (m, 2H), 1.64 - 1.55 (m, 6H), 1.51 (ddt, J = 16.5, 6.6, 3.2 Hz, 2H), 1.44 - 1.06 (m, 14H), 1.03 - 0.95 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 215.48, 77.89, 76.46, 63.78, 55.75, 52.13, 45.57, 45.05, 44.07, 40.83, 40.33, 39.60, 36.23, 35.78, 30.11, 28.67, 28.13, 23.88, 22.94, 22.91, 22.69, 22.18, 21.43, 20.32, 19.14, 18.75, 13.08.
FT-IR v [cm-1] = 3474 (bw), 2932 (s), 2866 (s), 1734 (s), 1492 (w),
(ATR): 1465 (m), 1449 (m), 1382 (m), 1346 (w), 1261 (w), 1237 (w),
1205 (w), 1153 (m), 1132 (w), 1103 (w), 1085 (w), 1043 (s), 1006 (m), 988 (m), 962 (w), 946 (w), 906 (w), 879 (m), 825 (w), 804 (w), 749 (s), 689 (w), 660 (w), 632 (w), 558 (s), 538 (w), 473 (w), 463 (w), 453 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H45O3 [M + H]+ 417.336322 u, C27H44O3Na [M + Na]+ 439.318266 u, gefunden: 417.33657 u, 439.31838 u. c = 0.49 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 7β,19-Epoxy-6-methylen-cholest-3β,5a-diol (27) [TAS-
Zu einer Lösung aus 125 mg (0.35 mmol, 1.5 Äq.) Ph3PCH3Br in 2 ml trockenem THF wurden 39 mg (0.35 mmol, 1.5 Äq.) KOtBu bei 0°C hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt, für 30 min bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wieder auf 0 °C gekühlt. Anschließend wurde eine Lösung aus 100 mg (0.231 mmol, 1.0 Äq.) des Alkohols 1 in 3.0 ml THF zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und anschließend auf Raumtemperatur aufgewärmt. Die Reaktion wurde nach 1 h durch Zugabe von Wasser beendet. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (1 : 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Alken 27 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (82 mg, 0.19 mmol, 83 %).
Analytik zu 27:
Smp: 171 °C - 174 °C.
Rf : 0.20 ( 1 : 2, cHex : EtOAc) .
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.23 (s, 1H), 4.97 (s, 1H), 4.10 (tt, J = 11.0, 5.2 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 10.0, 1.7 Hz, 1H), 3.91 (s, 1H), 3.71 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 2.11 - 2.03 (m, 2H), 1.93 - 1.80 (m, 4H), 1.69 - 1.61 (m, 3H), 1.54 - 1.47 (m, 2H), 1.45 - 1.06 (m, 16H), 1.02 - 0.95 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.1 Hz, 6H), 0.75 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 155.41, 109.49, 75.66, 75.24, 66.82, 63.83, 55.86, 53.00, 45.44, 44.94, 43.90, 43.40, 40.82, 39.62, 39.12, 36.29, 35.76, 30.24, 28.79, 28.15, 23.86, 22.96, 22.94, 22.70, 21.88, 21.71, 18.77, 13.37.
FT-IR v [cm-1] = 3436 (bw), 1934 (s), 1906 (s), 2865 (s), 1657 (w),
(ATR): 1489 (w), 1462 (m), 1450 (m), 1437 (m), 1415 (w), 1382 (m),
1365 (m), 1310 (m), 1263 (m), 1222 (m), 1171 (w), 1151 (w), 1122 (w), 1073 (s), 1039 (s), 1029 (s), 1013 (s), 1001 (m), 956 (s), 926 (m), 892 (m), 875 (m), 852 (m), 818 (m), 767 (w), 749 (w), 710 (w), 693 (m), 660 (w), 531 (m), 491 (m), 454 (m). c = 0.57 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 3a,5a-Dihydroxy-7β ,19-epoxy-cholestan-6-on (28)
[TAS-S403]
1 . PPh3 (2.0 Äq.), DBAD (2.0 Äq.)
AcOH (2.0 Äq.)
THF, r.t., 16 h
2. K2CO3 (1.2 Äq.) MeOH, r.t., 16 h
28 (TAS-S403)
Zu einer Lösung aus 121 mg (0.46 mmol, 2.0 Äq.) PPh3 und 106 mg (0.46 mmol, 2.0 Äq.) DBAD in 2.0 ml trockenem THF wurde eine Lösung aus 100 mg (0.23 mmol, 1.0 Äq.) des Alkohols 1 in 3.0 ml trockenem THF gegeben. Bei Farbumschlag des Reaktionsgemischs von farblos zu gelb wurden 26 ml (0.46 mmol, 2.0 Äq.) Essigsäure hinzugegeben und anschließend für 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf Silica adsorbiert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (20: 1 - 6: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das erhaltene Acetat (97 mg, 0.20 mmol, 1.0 Äq.) wurde direkt in 5.0 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 34 mg (0.25 mmol, 1.2 Äq.) K2CO3 hinzugegeben, das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend durch die Zugabe von Wasser gequentscht. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (2: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und der freie Alkohol 28 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (80 mg, 0.18 mmol, 80 %).
Analytik zu 28:
Smp: 148 °C - 150 °C.
Rf: 0.11 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 4.18 (p, J = 2.9 Hz, 1H), 3.97 (dd, J = 10.3, 1.6 Hz, 1H), 3.92 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.62 (bs, 2H), 2.13 - 2.04 (m, 4H), 1.92 - 1.76 (m, 4H), 1.69 - 1.55 (m, 2H), 1.51 (dt, J = 13.1, 6.6 Hz, 1H), 1.47 - 1.07 (m, 14H), 1.03 - 0.94 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 212.36, 79.55, 76.56, 66.47, 63.64, 55.73, 51.99, 45.55, 45.08, 43.63, 41.35, 40.24, 39.58, 36.21, 35.77, 35.01, 28.71, 28.63, 28.12, 23.89, 22.93, 22.87, 22.68, 21.46, 18.74, 17.62, 13.06.
FT-IR v [cm-1] = 3428 (bw), 3287 (bw), 2946 (s), 2867 (m), 1735 (s),
(ATR): 1459 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1344 (w), 1327 (w), 1297 (w),
1244 (m), 1211 (m), 1119 (m), 1089 (m), 1079 (m), 1044 (s), 949 (m), 934 (m), 921 (m), 897 (m), 860 (m), 821 (w), 766 (w), 730 (w), 714 (w), 667 (m), 632 (m), 597 (m), 581 (m), 526 (w), 492 (w), 453 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H45O4 [M + H]+ 433.331236 u, C27H44O4Na [M + Na]+ 455.313181 u, gefunden: 433.33145 u, 455.31325 u. c = 0.53 g/100 mL, CHCI3: Synthese von 3a-Acetoxy-5a-hydroxy-7β ,19-epoxy-cholestan-6-on
Zu einer Lösung aus 50 mg (0.116 mmol, 1.0 Äq.) des Alkohols 28 in 2.0 ml Pyridin wurden 110 ml (1.16 mmol, 10 Äq.) AC2O hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 16 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurde mit 1 M HCl und wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, sowie über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (2: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt. Das Acetat 29 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (54 mg, 0.114 mmol, 98 %).
Analytik zu 29:
Smp: 122 °C - 114 °C.
Rf: 0.43 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.31 - 5.26 (m, 1H), 3.94 (s, 2H), 3.77 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.33 (s, 1H), 2.23 - 2.11 (m, 2H), 2.13 - 2.03 (m, 5H), 1.92 - 1.75 (m, 5H), 1.66 - 1.56 (m, 1H), 1.51 (dt, J = 13.1, 6.6 Hz, 1H), 1.46 - 1.23 (m, 9H), 1.22 - 1.05 (m, 5H), 1.03 - 0.95 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.75 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 210.28, 169.44, 77.16, 76.67, 68.81, 63.38, 55.74, 52.04, 45.57, 44.58, 43.32, 41.07, 40.25, 39.59, 36.22, 35.80, 33.15, 28.67, 28.13, 25.47, 23.92, 22.94, 22.89, 22.69, 21.58, 21.53, 18.75, 18.10, 13.05.
FT-IR v [cm-1] = 3484 (bw), 2948 (m), 2932 (m), 2866 (m), 1737 (s), (ATR): 1465 (w), 1441 (w), 1375 (m), 1248 (m), 1224 (m), 1157 (m),
1119 (w), 1094 (m), 1083 (m), 1043 (s), 969 (w), 914 (w), 893 (w), 852 (w), 832 (m), 769 (w), 749 (m), 713 (w), 657 (w), 631 (w), 606 (w), 563 (m), 524 (w), 494 (w), 427 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C29H47O5 [M + H]+ 475.241801 u, C29H46O5Na [M + Na]+ 497.323746 u, gefunden: 475.34182 u, 497.32366 u. c = 0.55 g/100 mL, CHCI3: [ ]s89 ( )
Synthese von 7β ,19-Epoxy-6a-methylcholestan-3β ,5a,6β -triol (30)
[TAS-S406]
Zu einer Lösung von 100 mg (0.23 mmol, 1.0 Äq.) des Ketons 1 in 5.0 ml trockenem Diethylether wurden 0.23 ml (0.69 mmol, 3.0 Äq., 3.0 M in Et2O) MeMgßr bei -78 °C hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur aufgewärmt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Der vollständige Umsatz des Startmaterials wurde mit Hilfe von DC-Kontrollen verfolgt und anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe einer gesättigten NH4CI Lösung beendet. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässriger gesättigter NaCI- Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (1 :5; cHex/EtOAc) aufgereinigt und der Alkohol 30 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (90 mg, 0.20 mmol, 87 %).
Analytik zu 30:
Smp: 218 °C - 221 °C.
Rf: 0.16 (1 :5, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 4.04 (tt, J = 10.9, 5.1 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 10.0, 1.6 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.34 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 2.49 (s, 3H), 2.07 - 1.98 (m, 2H), 1.90 - 1.75 (m, 3H), 1.69 - 1.46 (m, 6H), 1.43 - 1.23 (m, 11H), 1.21 - 1.07 (m, 6H), 1.03 - 0.96 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.3 Hz, 6H), 0.71 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 76.81, 74.91, 67.92, 64.05, 55.91, 54.37, 45.39, 42.98, 40.80, 40.68, 40.00, 39.64, 39.30, 36.32, 35.85, 30.20, 28.80, 28.15, 24.09, 23.91, 22.95, 22.91, 22.70, 22.63, 22.07, 18.77, 12.69.
FT-IR v [cm-1] = 3449 (bw), 2930 (m), 2847 (m), 1492 (w), 1463 (w),
(ATR): 1438 (w), 1378 (m), 1365 (w), 1325 (w), 1279 (w), 1226 (w),
1171 (w), 1125 (w), 1107 (m), 1067 (m), 1043 (s), 982 (w), 960 (w), 935 (m), 920 (w), 881 (w), 852 (w), 819 (w), 757 (w), 646 (m), 523 (m).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C28H48O4Na [M + Na] +
471.344481 u, gefunden: 471.34455 u. c = 0.54 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 5a-Hydroxy-2a,3a-7β ,19-diepoxy-cholestan-6-on (31)
[TAS-S407]
Zu einer Lösung von 117 mg (0.28 mmol, 1.0 Äq.) des Aikens 25 in 5.0 ml Dichloromethan wurden 58 mg (0.34 mmol, 1.2 Äq.) mCPBA bei 0 °C hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 16 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von Wasser beendet. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigten NazSO3, NaHCO3 und NaCI Lösungen gewaschen. Anschließend wurden die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Silica (3: 1; cHex/EtOAc) aufgereinigt und das Epoxid 31 konnte in Form eines farblosen Feststoffs erhalten werden (95 mg, 0.22 mmol, 79 %).
Analytik zu 31:
Smp: 189 °C - 191 °C.
Rf: 0.20 (2: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 3.96 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 10.1, 1.6 Hz, 1H), 3.52 (s, 1H), 3.46 (dt, J = 3.8, 1.9 Hz, 1H), 3.31 (dd, J = 5.6, 3.8 Hz, 1H), 2.52 - 2.40 (m, 2H), 2.10 - 2.03 (m, 3H), 1.86 (dtd, J = 13.2, 9.4, 6.2 Hz, 1H), 1.68 - 1.56 (m, 3H), 1.50 (dq, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.22 (m, 8H), 1.19 - 1.04 (m, 5H), 1.01 - 0.94 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 6.6, 2.5 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 209.29, 77.72, 77.56, 65.18, 55.67, 54.11, 51.71, 51.25, 45.36, 44.75, 43.72, 40.05, 39.95, 39.56, 36.18, 35.79, 29.57, 28.62, 28.11, 23.92, 23.61, 22.93, 22.81, 22.67, 21.27, 18.72, 13.01.
FT-IR v [cm-1] = 3460 (w), 2977 (m), 2943 (m), 2932 (m), 2922 (m),
(ATR): 2864 (m), 1746 (s), 1466 (m), 1435 (w), 1382 (w), 1374 (m),
1326 (w), 1304 (w), 1264 (w), 1245 (w), 1234 (w), 1142 (m),
1130 (m), 1096 (m), 1051 (s), 1034 (m), 978 (w), 937 (m), 903
(s), 870 (m), 803 (s), 792 (m), 776 (m), 750 (m), 723 (m), 681 (w), 651 (w), 610 (m), 590 (m), 566 (m), 487 (w), 470 (m), 450 (s), 414 (w).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C27H43O4 [M + H]+ 431.315586 u, C27H42O4Na [M + Na]+ 453.297531 u, gefunden: 431.31568 u, 453.29764 u. c = 0.602 g/100 mL, CHCI3: Synthese von 3β -Acetoxy-19-hydroxy-stigmast-A5-en (33) [WIL-
DK04]
7.49 g (16.4 mmol, 1.0 Äq.) Sitosterylacetat (32) in 200 ml Dioxan wurden mit 3.39 g (23.6 mmol, 1.5 Äq.) N- Bromacetamid (NBA) sowie 40 ml HCIO4 (0.5 N) versetzt. Nach 1 h bei 0 °C unter Lichtausschluss und 2.5 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von gesättigter Na2SO3- Lösung (bis zur Verfärbung der Reaktionsmischung) und Wasser gestoppt. Nach Extraktion mit MTBE wurden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt (beiger Feststoff, 9.06 g) - mit erheblichen Mengen (>40%) an regioisomerem Bromhydrin - wurde ohne weitere Aufreinigung im folgenden Schritt eingesetzt.
Zu einer Lösung des (ca. 9.06 g) Bromhydrins (+ Regioisomer) aus dem vorherigen Rohprodukt in 500 ml Cyclohexan wurden 7.92 g (24.5 mmol, 1.5 Äq.) Diacetoxyiodbenzol (DIB) sowie 4.99 g (19.6 mmol, 1.2 Äq.) lod gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3 h unter Bestrahlung mittels einer 150 Watt Quecksilberdampflampe zum Rückfluss erhitzt. Die violette Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und durch Zugabe von gesättigter NazSO3- Lösung und Wasser (bis zur Verfärbung) gequencht. Nach Extraktion mit MTBE wurden die vereinigten organischen Phasen mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt (braunes viskoses Öl, 13.6 g) konnte im nächsten Schritt ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden.
Zu einer Lösung des Rohprodukts aus der vorangegangenen Reaktion (13.6 g) in 400 ml /-PrOH wurden 5.35 g (8.19 mol, 5.0 Äq.) Zinkpulver sowie 13.8 g (22.9 mol, 14.0 Äq.) Essigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3 h zum Rückfluss erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur gekühlt und über Celite® filtriert. Die klare, gelbe Lösung wurde auf ein Volumen von 100 mL eingeengt und nach Zugabe von Wasser mit MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und anschließend über MgSÜ4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Diese Prozedur wurde insgesamt vierfach vorgenommen. Das Produkt 33 wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 4: 1) in Form eines beigen Feststoffs erhalten (2.67 g, 5.82 mmol, 35% über drei Stufen).
Analytik zu 33:
Smp: 115 - 118 °C.
Rf: 0.33 (4: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.78 (dd, J = 4.8, 2.4 Hz, 1H), 4.64 (tt, J = 11.4, 4.8 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 3.62 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 2.42 (ddd, J = 13.0, 4.9, 2.3 Hz, 1H), 2.31 - 2.23 (m, 1H), 2.07 - 1.99 (m, 5H), 1.96 (dt, J = 13.9, 3.7 Hz, 1H), 1.90 - 1.77 (m, 3H), 1.70 - 1.46 (m, 7H), 1.40 - 0.98 (m, 11H), 0.95 - 0.89 (m, 6H), 0.86 - 0.80 (m, 9H), 0.80 - 0.76 (m, 1H), 0.73 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) 8 [ppm] : 170.65, 134.66, 128.47, 73.55, 62.87, 57.71, 56.14, 50.45, 45.97, 42.67, 41.75, 40.13, 38.36, 36.28, 34.07, 33.52, 33.24, 31.39, 29.28, 28.39, 28.25, 26.21, 24.23, 23.20, 21.91, 21.54, 19.96, 19.17, 18.91, 12.36, 12.12.
FT-IR v [cm-1] = 3497(bs), 2956 (s), 2932 (s), 2866 (s), 1728 (m),
(ATR): 1464 (s), 1441 (S), 1377 (m), 1255 (m), 1133 (s), 1088 (s),
1033 (m), 960 (s), 916 (s), 883 (s), 841 (s), 810 (s), 798 (s), 623 (s), 585 (s).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C31H52O3Na [M + Na] +
481.365217 u, gefunden: 481.36525 u. c = 0.95 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 3ß-Acetoxy-19-(methoxymethyloxy)stigmastan-A5-en
(34) [WIL-DK05] 33 34 (WIL-DK05)
2.67 g (5.82 mmol, 1.0 Äq.) 19-Hydroxystigmastylacetat (33) in 34 ml CH2(OMe)2 wurden mit 300 mg (2.31 mmol, 0.6 Äq.) Lithiumbromid sowie 0.11 g (0.57 mmol, 0.1 Äq.) p-Toluolsulfonsäure Monohydrat versetzt und die Reaktionsmischung für 23 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem ein vollständiger Umsatz beobachtet wurde (DC-Kontrolle), wurde die Reaktion durch Zugabe von Wasser gestoppt und die wässrige Phase mit MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und einer gesättigten NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Produkt 34 konnte nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 10: 1) in Form eines braunen Feststoffs erhalten werden (2.37 g, 4.59 mmol, 79%).
Analytik zu 34:
Smp: 83 - 84 °C.
Rf: 0.39 (10: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.60 (dt, J = 4.4, 1.9 Hz, 1H), 4.69 - 4.57 (m, 3H), 3.73 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.48 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 2.40 (ddd, J = 13.1, 5.2, 2.2 Hz, 1H), 2.36 - 2.27 (m, 1H), 2.19 - 2.15 (m, 1H), 2.11 (dt, J = 13.5, 3.5 Hz, 1H), 2.07 - 1.96 (m, 5H), 1.84 (dtd, J = 15.5, 9.2, 6.0 Hz, 2H), 1.79 - 1.61 (m, 2H), 1.64 - 1.45 (m, 6H), 1.39 - 0.98 (m, 15H), 0.97 - 0.86 (m, 6H), 0.88 - 0.79 (m, 9H), 0.81 - 0.75 (m, 1H), 0.70 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) 8 [ppm] : 170.67, 135.81, 126.26, 97.05, 73.83, 69.07, 57.42, 56.14, 55.60, 50.47, 45.99, 42.59, 40.52,
40.18, 38.50, 36.31, 34.09, 33.45, 32.91, 31.73, 29.29, 28.40,
28.19, 26.21, 24.35, 23.21, 21.99, 21.57, 19.96, 19.18, 18.91,
12.19, 12.13.
FT-IR v [cm-1] = 2952 (bs), 2933 (s), 2869 (s), 1728 (m), 1463 (s),
(ATR): 1443 (s), 1379 (m), 1369 (s), 1243 (m), 1140 (s), 1112 (s),
1045 (m), 1027 (m), 917 (s), 916 (s), 881 (s), 839 (s), 802 (s), 736 (s), 611 (s), 578 (s).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C33H56O4Na [M + Na] +
539.407081 u, gefunden: 539.40665 u. c = 0.85 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 3β -Acetoxy-5a-hydroxy-19-(methoxymethyloxy)- sitgmastan-6-on (35) [WIL-DK06]
2.27 g (4.39 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 34 wurden in 33 ml CH2CI2 gelöst und mit 1.28 g (7.47 mmol, 1.7 Äq.) mCPBA (70%) versetzt. Die Reaktions- mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und auf 0 °C gekühlt. Der entstandene weiße Niederschlag wurde durch Zugabe von 81 ml Aceton gelöst und die klare Lösung wurde mit einer Lösung aus 2.37 g (23.4 mmol, 5.4 Äq.) CrO3 in 8.0 ml Wasser versetzt. Nach 10 Minuten auf 0 °C wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht und für 18 h gerührt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von gesättigter NaHCO3-Lösung beendet und die wässrige Phase mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und gesättigter NaCI- Lösung gewaschen. Die klare, gelbe Lösung wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Anschließend wurde das gewünschte Produkt 35 nach säulenchromatographischer Aufreinigung an Kieselgel (c-Hex/EtOAc, 3: 1) in Form eines farblosen Gels erhalten (1.51 g, 2.76 mmol, 61%).
Analytik zu 35:
Rf: 0.19 (3: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.11 (tt, J = 11.2, 5.3 Hz, 1H), 4.50 (s, 2H), 3.64 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 2.83 (s, 1H), 2.57 (dd, J = 14.6, 11.5 Hz, 1H), 2.21 - 2.12 (m, 2H), 2.08 - 1.99 (m, 5H), 1.96 - 1.82 (m, 3H), 1.77 - 1.63 (m, 3H), 1.59 - 1.43 (m, 4H), 1.39 - 0.98 (m, 12H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 0.88 - 0.76 (m, 10H), 0.68 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) <5 [ppm]: 209.63, 171.09, 97.12, 77.83, 70.46, 67.13, 57.05, 56.16, 56.05, 45.92, 45.70, 44.09, 43.22, 41.54, 39.99, 37.20, 36.26, 34.01, 32.48, 29.26, 28.31, 26.56, 26.28, 26.09, 24.05, 23.19, 21.93, 21.50, 19.95, 19.16, 18.84, 12.25, 12.11.
FT-IR v [cm-1] = 3417 (bs), 2936 (m), 2870 (s), 1713 (m), 1463 (s),
(ATR): 1443 (s), 1379 (m), 1365 (s), 1236 (m), 1150 (s), 1106 (s),
1034 (m), 1012 (s), 967 (s), 941 (s), 919 (s), 835 (s), 666 (s), 608 (s), 581 (s), 552 (s).
HR-MS: (ESI, 70 eV) = m/z berechnet für: C33H56O6Na [M + Na] +
571.396911 u, gefunden: 571.39677 u. c = 0.90 g/100 mL, CHCI3:
Synthese von 3β -Acetoxy-7a-bromo-5a,6a-dihydroxy-6β ,19-epoxy- stigmastan (36) [WIL-DK07]
Zu einer Lösung von 1.34 g (2.45 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 35 in 25 ml Essigsäure wurden 1.37 ml (8.57 mmol, 3.5 Äq.) Brom sowie 8 Tropfen HBr (48% wässr.) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 24 h auf 60 °C erwärmt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigter Na2SO3-Lösung gequencht. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser sowie gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt 36 wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung (c- Hex/EtOAc, 5: 1) in Form eines weißen Feststoffs erhalten (657 mg, 1.13 mmol, 61%).
Analytik zu 36:
Smp: 93 - 94 °C.
Rf: 0.21 (5: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 5.03 (tt, J = 11.0, 4.6 Hz, 1H), 4.13
(d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.06 - 4.01 (m, 1H), 3.73 (d, J = 8.9 Hz,
1H), 2.20 (ddd, J = 12.9, 4.4, 2.2 Hz, 1H), 2.10 (s, 1H), 2.07 - 2.00 (m, 4H), 1.97 - 1.83 (m, 5H), 1.75 (dd, J = 12.9, 11.9 Hz, 1H), 1.70 - 1.64 (m, 1H), 1.60 - 1.00 (m, 17H), 0.96 - 0.89 (m, 4H), 0.88 - 0.76 (m, 10H), 0.75 (s, 3H).
13C-NMR: (151 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 170.81, 101.79, 79.34, 69.92, 66.86, 59.35, 55.56, 52.87, 45.94, 45.37, 43.44, 38.98, 38.64, 38.53,
36.21, 35.01, 34.01, 29.29, 28.11, 27.18, 26.22, 24.01, 23.28,
23.21, 21.57, 21.54, 19.99, 19.15, 18.85, 13.12, 12.12.
FT-IR v [cm-1] = 3413 (bs), 2954 (m), 2936 (m), 2869 (s), 2050 (s),
(ATR): 1713 (m), 1497 (s), 1457 (s), 1377 (m), 1365 (s), 1243 (m),
1153 (s), 1129 (s), 1036 (m), 1095 (s), 985 (s), 945 (s), 906 (s), 844 (s), 702 (s), 677 (s), 628 (s), 608 (s), 528 (s).
HR-MS: (GC-EI/MS, 70 eV, 50-250°C) m/z (%) = 81.06980 (88),
109.06468 (100), 255.17394 (55), 396.33803 (30), 414.34872 (45), 474.36932 (10), 502.36426 (<5). c = 1.00 g/100 mL, CHCI3: Synthese von 3β -Acetoxy-5a-hydroxy-7β ,19-epoxy-stigmastan-6-on
533 mg (0.913 mmol, 1.0 Äq.) der Verbindung 36 wurden in 46 ml Dimethyl- formamid gelöst und mit 858 mg (11.6 mmol, 12.7 Äq.) Li2CO3 sowie 365 mg (4.20 mmol, 4.6 Äq.) Li Br versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 100 °C gerührt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gekühlt und mit Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser sowie gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt 37 nach säulenchromatographischer Aufreinigung (c-Hex/EtOAc, 2.5: 1) in Form eines weißen Feststoffs erhalten (321 mg, 0.639 mmol, 54%).
Analytik zu 37:
Smp: 142 - 143 °C.
Rf: 0.33 (2.5: 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 5.22 (tt, J = 11.2, 5.5 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 10.3, 1.7 Hz, 1H), 3.91 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.63 (s, 1H), 2.13 - 2.01 (m, 6H), 2.00 - 1.93 (m, 2H), 1.88 (dtd, J = 13.0, 9.4, 5.9 Hz, 1H), 1.77 - 1.49 (m, 5H), 1.42 - 1.11 (m, 14H), 1.05 - 0.97 (m, 1H), 0.95 - 0.87 (m, 4H), 0.87 - 0.75 (m, 9H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 212.88, 170.55, 78.65, 76.17, 69.18, 63.55, 55.60, 52.02, 45.94, 45.52, 45.09, 43.21, 40.53, 40.23, 36.13, 35.23, 33.98, 29.24, 28.66, 26.22, 26.11, 23.18, 22.90, 21.70, 21.46, 21.25, 19.93, 19.14, 18.80, 13.07, 12.11.
FT-IR v [cm-1] = 3533 (bs), 2953 (m), 2863 (s), 2112 (s), 1733 (m),
(ATR): 1499 (s), 1463 (s), 1375 (m), 1332 (s), 1253 (m), 1151 (s),
1097 (s), 1042 (m), 1024 (s), 963 (s), 945 (s), 910 (s), 892 (s), 870 (s), 753 (s), 710 (s), 655 (s), 635 (s), 606 (s), 574 (s).
HR-MS: (GC-EI/MS, 70 eV, 50-250°C) m/z (%) = 81.06982 (100),
109.06469 (100), 255.17406 (65), 396.33804 (35), 414.34868 (50), 474.36956 (10), 502.36451 (<1). c = 0.91 g/100 mL, CHCI3: [ ]5 9 ( )
Synthese von 3β ,5a-Dihydroxy-7β ,19-epoxy-stigmastan-6-on (38)
Zu einer Lösung von 222 mg (0.442 mmol, 1.0 Äq.) 37 in 30 ml Methanol wurden 91 mg (0.66 mmol, 1.5 Äq.) K2CO3 gegeben und die Reaktions- mischung für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion (DC) wurde die Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand säulenchromatographisch (c-Hex/EtOAc, 1 : 1) sowie mittels Umkristallisation aus EtOH/H2O aufgereinigt. Das Produkt 38 wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten (110 mg, 0.685 mmol, quant.).
Analytik zu 38:
Smp: 175 - 176 °C.
Rf: 0.17 (1 : 1, cHex: EtOAc).
1H-NMR: (500 MHz, CDCI3) δ [ ppm] : 4.22 - 4.12 (m, 2H), 3.89 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.14 - 2.01 (m, 3H),
I.97 - 1.84 (m, 3H), 1.71 - 1.54 (m, 4H), 1.48 (tdd, J = 13.4,
II.2, 4.9 Hz, 1H), 1.42 - 1.11 (m, 14H), 1.05 - 0.98 (m, 1H), 0.94 - 0.88 (m, 4H), 0.86 - 0.75 (m, 10H), 0.74 (s, 3H).
13C-NMR: (126 MHz, CDCI3) δ [ppm] : 213.65, 79.18, 76.18, 66.23, 63.66, 55.62, 52.06, 45.93, 45.53, 45.19, 43.31, 40.59, 40.28, 38.87, 36.12, 33.99, 30.19, 29.24, 28.67, 26.10, 23.18, 22.91, 21.76, 21.52, 19.93, 19.14, 18.80, 13.07, 12.11.
FT-IR v [cm-1] = 3353 (bs), 2955 (m), 2861 (s), 2050 (s), 1732 (m),
(ATR): 1495 (s), 1463 (s), 1376 (m), 1365 (s), 1250 (m), 1225 (s),
1154 (s), 1070 (s), 1049 (m), 969 (s), 914 (s), 88 (s), 872 (s), 853 (s), 818 (s), 754 (s), 710 (s), 6635 (s), 637 (s), 583 (s), 559 (s).
HR-MS: (GC-EI/MS, 70 eV, 50-300°C) m/z (%) = 81.06982 (100),
109.06472 (60), 133.10107 (55), 273.18460 (35), 414.34881 (25), 432. 35897 (15), 460.35410 (<1). c = 0.86 g/100 mL, CHCI3:
Beispiel 2: Proliferationsinhibition in Leukämiezellen (Nalm-6-Zellen
In Leukämiezellen (Nalm-6) wird die Zellproliferation gehemmt. 1 x 105 Zellen vermehren sich nach 24 h auf fast das Dreifache (2.97 x105 Zellen), während die Zell-Proliferation durch Behandlung mit dem Steroid WIL 071 konzentrationsabhängig bis zu 100% gehemmt wird, siehe Figur 1. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiel 3: Steroid- und Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in NaKu-Zellen
In Steroid- und Polyzytostatika-resistenten Leukämiezellen (NaKu (ALL)) wird durch Behandlung mit dem Steroid WIL 071 konzentrationsunabhängig eben so viel Apoptose induziert wie in den nicht resistenten Leukämiezellen (Nalm-6), siehe Figur 2. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten. Das Steroid WIL 071 überwindet die Steroidresistenz in Leukämiezellen (NaKu- Zellen). Ferner weisen die Steroid-resistenten Leukämiezellen (NaKu-Zellen) Ko- Resistenzen für folgende Zytostatika auf:
• Prednisolon, Methylprednisolon, Dexamethason,
• Doxorubicin, Daunorubicin, Idarubicin, Epirubicin
• Cytarabin, Cladribin
• Etoposid
• Cyclophosphamid, Ifosfamid
• Vindesin
• Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin
Beispiel 4: Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in BiBo-Zellen
Bißo-Zellen sind Lymphomzellen (BJAB-Zellen), die resistent gegen Vincristin gemacht worden sind und als Resistenzmechanismus eine Bcl-2 Überexpression aufweisen. Sie weisen Ko-Resistenzen für folgende Zytostatika auf:
• Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Vinorelbin, Taxol
• Cytarabin
• Daunorubicin
In Polyzytostatika-resistenten Lymphomzellen (BiBo-Zellen) wird durch Behandlung mit dem Steroid WIL 071 konzentrationsunabhängig eben so viel Apoptose induziert wie in den nicht resistenten Lymphomzellen (BJAB (Burkitt like lymphoma Zellen)), siehe Figur 3. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten. Das Steroid WIL 071 überwindet die Steroidresistenz in Lymphomzellen (BiBo- Zellen).
Beispiel 5: Polyzytostatika-Resistenzüberwindung in 7-CCA-Zellen
7-CCA-Zellen sind Lymphomzellen (BJAB-Zellen), die resistent gegen Doxorubin gemacht worden sind und als Resistenzmechanismus eine Caspase- 3-Unterexpression aufweisen. Sie weisen Ko- Resistenzen für folgende Zytostatika auf:
• Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Vinorelbin, Taxol
• Cytarabin, Fudarabin, Cladribin, Clofarabin, • Daunorubicin, Doxorubicin, Idarubicin, Epirubicin
• Cisplatin, Oxaliplatin
In Poly-Zytostatika-resistenten Lymphomzellen (7-CCA-Zellen) wird durch Behandlung mit dem Steroid WIL 071 konzentrationsunabhängig eben so viel Apoptose induziert wie in den nicht resistenten Lymphomzellen (BJAB (Burkitt like lymphoma Zellen)), siehe Figur 4. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten. Das Steroid WIL 071 überwindet die Steroidresistenz in Lymphomzellen (7- CCA-Zellen).
Beispiel 6: Synergistische Effekte mit Cytarabin und Vincristin
In Leukämiezellen (Nalm-6-Zellen) wird durch parallele Behandlung mit dem Steroid WIL 071 und Cytarabin bzw. Vincristin signifikant mehr Apoptose induziert als das 1.1 fache der Summe der Apoptose- Raten bei der Behandlung durch Monotherapie der entsprechenden Wirkstoffe, siehe Figur 5. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten. Das Steroid WIL 071 wirkt synergistisch mit Cytarabin bzw. Vincristin.
Beispiel 7: Ausschluss von unspezifischer Nekrose
Gemessen ist die Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung in Leukämiezellen (Nalm-6-Zellen) im Zellüberstand, welche ein Zeichen des unspezifischen Zelltodes (Nekrose) ist, da dieses große Protein LDH nur eine defekte Zell- membran in Richtung extrazellulären Raum überschreiten kann, siehe Figur 6. Unspezifische Nekrose kann ausgeschlossen werden.
Beispiel 8: Selektivität
In Leukämiezellen (Nalm-6-Zellen) und in Lymphomzellen (BJAB-Zellen) wird durch Behandlung mit dem Steroid WIL 071 konzentrationsabhängig Apoptose induziert. WIL 071 wirkt selektiv in malignen Zellen, die proliferieren. In humanen primären Leukozyten wird dagegen keine Apoptose induziert. Durchflusszytometrisch wurde die DNA-Fragmentierung gemessen, siehe Figur 7. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiel 9: Wirkung in Zytostatika-resistenten soliden Tumoren
Im Gegensatz zu herkömmlichen Glukokortikoiden kann das Steroid WIL 071 auch in soliden Tumorzellen Apoptose induzieren. Auch in Neuroblastomzellen (SKNAS-Zellen) werden Resistenzen gegenüber Zytostatika überwunden (LiOn- Zellen - Cisplatin-resistente SKNAS-Zellen mit einer Unterexpression von Caspase-8.
Durchflusszytometrisch wurde die DNA-Fragmentierung gemessen), siehe Figur 8. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiel 10: Wirkung in Hirntumor-Zellen
Im Gegensatz zu herkömmlichen Glukokortikoiden kann das Steroid WIL 071 auch in Hirntumorzellen Apoptose induzieren. Auch in Glioblastomzellen (DBTRG05MG-Zellen) induziert das Steroid WIL 071 signifikant Apoptose.
Durchflusszytometrisch wurde die DNA-Fragmentierung gemessen, siehe Figur
9. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiel 11: Wirkung in primären humanen Glioblastom-Zellen
Im Gegensatz zu herkömmlichen Glukokortikoiden kann das Steroid WIL 071 auch in primären humanen Hirntumorzellen Apoptose induzieren. Auch in primären Glioblastom-Zellen eines Patienten mit Glioblastom (Grad 4) induziert das Steroid WIL 071 signifikant Apoptose.
Durchflusszytometrisch wurde die DNA-Fragmentierung gemessen, siehe Figur
10. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiel 12: Wirkung auf Pankreas Karzinomzellen
Im Gegensatz zu herkömmlichen Glukokortikoiden kann das Steroid WIL 071 auch in Pankreas Karzinomzellen Apoptose induzieren. In einer entsprechenden Zelllinie (DAN-G) induziert das Steroid WIL 071 signifikant Apoptose.
Durchflusszytometrisch wurde die DNA-Fragmentierung gemessen, siehe Figur 11. Die Experimente sind dreimal unabhängig voneinander durchgeführt worden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Messwerte von drei unabhängigen Experimenten.
Die Standardbehandlung bei Pankreaskarzinom umfasst und 5-Fluor-Uracil. Diese zeigen in vergleichbaren Experimenten deutlich schlechtere Apoptoseraten (Oxaliplatin: 14 % Apoptose bei 50 pM, 5-Fluor-Uracil 24.9 % bei 30 pM, 21,2 % bei 50 pM).
Beispiel 13: Vergleich der biologischen Wirkung verschiedener Steroidderivate in Leukämie-Zellen (Nalm-6)
Apoptoseinduktion in Nalm-6-Zellen nach der Behandlung mit WIL-071 bzw. verseh ieden en S teroid- Deri vaten.
Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 1,0-105 Zellen/mL in zwei Millilitern Medium mit dem jeweiligen Steroid-Derivat in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Als Kontrolle diente die mitgeführte Lösungsmittelkontrolle (DMSO), die von allen weiteren gemessenen Werten subtrahiert wurde, um die unabhängig von der Wirkstoffkonzentration stattfindende Spontanapoptose der Zellen nicht zu berücksichtigen. Nach 72 h wurde eine modifizierte Zellzyklusanalyse durchgeführt, um den Anteil apoptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Es wurden für jede Konzentration des Steroids jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichungen, n = 3 (* : p < 0,05 vs. DMSO, T-Test) ermittelt. Mit Hilfe der aus diesen Messwerten entstehenden Kurve der Dosis-Wirkungsbeziehung (Steroid-Konzentration Apoptoseinduktion) wurde die Steroid-Konzentration abgelesen, bei welcher in 50% der getesteten Leukämie-Zellen Apoptose ausgelöst wurde.
Prednisolon-Resistenz-Überwindung ist gegeben. Wenn die Apoptoseinduktion in Prednisolon-resistenten Leukämie-Zellen so hoch ist wie in den normalen Leukämiezellen.
Beispiel 14: Verträglichkeitsuntersuchung im Tiermodell
Es wurde eine schrittweise Dosiserhöhung der drei Substanzen Wil-071, Wil- 232 und Wil-369 an 8 Wochen alten, weiblichen NOG-F (Taconic) Mäusen durchgeführt. Dabei wurde verschiedenen Mäusen eine von bis zu sieben unterschiedlichen Dosen der Testsubstanzen verabreicht. Begonnen wurde an Tag 1 mit der geringsten Dosis von 10 mg/kg. Zeigten sich nach dieser Injektion in die Schwanzvene des Tieres keine Verhaltensauffälligkeiten oder beobachtbare, gesundheitliche Symptome im Verlauf der nächsten 24 Stunden, wurde am nächsten Tag mit der nächsthöheren Dosis fortgefahren. Insgesamt wurden, soweit möglich, die Dosen 10, 20, 40, 80, 100, 150 und 200 mg/kg getestet. Im Anschluss wurde die maximal tolerable Dosis (MTD) drei weiteren Tieren verabreicht und anschließend eine Woche beobachtet, um etwaige sich entwickelnde Symptome beobachten zu können. Dazu wurden die Tiere täglich beobachtet und gewogen. Das Körpergewicht gilt als Indikator des Allgemeinzustands der Tiere.
Im Anschluss an die Ermittlung der MTD wurden acht Tiere erneut mit der MTD der Substanzen i.v. injiziert und jeweils 2 Tiere nach 1, 2, 8 und 24 Stunden euthanasiert. Für die Pharmakokinetik wurden die Leber, das Gehirn und Serum der Tiere im flüssigen Stickstoff schockgefroren und analysiert (siehe Beispiel 15).
Ergebnisse
Alle drei Substanzen sind für getestete Injektionslösungen schwer löslich, sodass die maximale Dosis 200 mg/kg nicht überschreiten konnte.
Wil-071 wurde für den MTD-Versuch in 100% DMSO gelöst und dann 1 :50 mit einer 20% (w/v) 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPßCD)-Lösung verdünnt. So ließen sich 200 pl Injektionslösung (pro Maus) einer 40 mg/kg Dosis erreichen. Für 80, 100 und 150 mg/kg wurde der DMSO-Anteil auf bis zu 4% (v/v) in der finalen Injektionslösung erhöht. Zudem musste Ultraschall eingesetzt und die Probe bis zu 45 min lang auf 60°C erhitzt werden. 200 mg/kg wurden nur als milchige Suspension erreicht. Die Tiere zeigten nach Injektion der einzelnen Dosen keine Auffälligkeiten, und auch die abschließende Sektion ergab makroskopisch keine Toxizität. Die Injektion der 200 mg/kg Suspension führte jedoch zum sofortigen Tod des Tieres. Die Sektion ergab Anzeichen einer Lungenembolie. Wil-071 kann daher als nicht toxisch bis zu 150 mg/kg angesehen werden. Die finale MTD konnte aufgrund der unzureichenden Löslichkeit nicht bestimmt werden.
Bei 100 mg/kg Wil-232 betrug die Endkonzentration des DMSO in der Injektionslösung 2%. Um Wil-232 zu lösen, musste die Probe ebenfalls mit Ultraschall behandelt und auf 60°C erhitzt werden. Die Dosis von 150 mg/kg wurde nur mit 4% DMSO und 200 mg/kg nur als Suspension erreicht. Die Injektion der 200 mg/kg Dosis führte zum sofortigen Tod des Tieres (Anzeichen Lungenembolie nach Sektion). Ansonsten gab es keine Anzeichen für Toxizität, sodass die Substanz als verträglich bis zu 150 mg/kg angesehen werden kann. Auch hier lässt sich aufgrund der Löslichkeit final keine MTD bestimmen. Wil-369 zeigte die geringste Löslichkeit. Mittels DMSO-Stock und 20%iger HPßCD -Lösung wurden nur maximal 5 mg/ml gelöst. Eine weitere Steigerung gelang auch mit mehr DMSO oder HPßCD nicht. So wurde oberhalb der Dosis von 40 mg/kg ein höheres Injektionsvolumen injiziert, um die entsprechende Dosis zu erreichen. Bei 100 mg/kg in doppelten Injektionsvolumen legten sich die Tiere für einige Augenblicke auf die Seite, erholten sich aber schnell wieder. Im weiteren Verlauf und bei der Sektion waren alle Tiere unauffällig, bis auf ein Tier der 100 mg/kg Dosisgruppe, das an Tag 3 nach der Injektion tot aufgefunden wurde. Die Verträglichkeit unter den jetzigen Lösungsvoraussetzungen ist auf 50 mg/kg anzusetzen. Diese Dosis wurde den 8 Tieren für die Pharmakokinetik injiziert. Auch hier lässt sich aufgrund der Löslichkeit final keine MTD bestimmen.
Erkenntnis
In dem Konzentrationsbereich, der eine vollständige Lösung der Substanzen erlaubt, sind alle Substanzen gut verträglich.
Beispiel 15: Verteilung
Die in Beispiel 4 erhaltenen Proben wurden auf die Gehalte an den Substanzen untersucht. Da WIL-369 zu WIL-071 hydrolysiert werden kann, wurden in den Proben sowohl WIL-369 als auch WIL-071 bestimmt. Soweit in den Proben diese Substanzen nachweisbar waren, sind dies in den Figuren dargestellt, als Die Verteilung ist in den Figuren 12 bis 14 gezeigt.
Figur 12 zeigt, dass bei Verabreichung von WIL-369 WIL-071 gebildet wird, die Serumspiegel aber schnell eliminiert werden; WIL-369 ist also eine Prodrug
Figur 13 zeigt relevante Spiegel von WIL-071 nach Verabreichung von WIL-369 oder WIL-071 im Hirn, die für mehr als 8 Stunden wirksam sein könnten.
Figur 14 zeigt, dass in der Leber ein schneller Abbau stattfindet; WIL-369 wird nur dort gefunden. Literatur
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Claims

Patentansprüche 1. Arzneimittel auf Basis von 7,19-Epoxy-Steroiden, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz hiervon, worin in der Formel bedeuten :
R1 = H; Methyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O)- ; oder RXO entfällt, wenn eine Doppelbindung zwischen 4-5 vorhanden ist;
W1, W2 unabhängig voneinander H, OH, CHR2OH, CHR2RX, CR2RXOH oder W1 und W2 sind zusammen 0
R2 = gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigte Alkylreste mit 4 bis 9 C-Atomen, wobei diese Alkylreste können auch eine Cyclopropan- oder Cyclobutan- Substruktur aufweisen;
R3= Methyl oder Ethyl,
X1, X2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen 0, NOR4;
Y1, Y2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen 0, NOR4; oder X1 und Y1 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxygruppe bilden;
Z1, Z2 = unabhängig voneinander Rx oder OR5), oder zusammen 0, NOR4, CH2 ;
R4 unabhängig voneinander = H, Alkyl oder Aryl; und - 64 -
R5 unabhängig voneinander = H; Alkyl, Aryl-CH2-, RX-C(=O)- oder RX-O-C(=O)-, SO3H, SO3CH3, PO(OH)2 oder Glycosyl; wobei jedes Rx unabhängig voneinander = H, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes Alkyl, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls verzweigtes substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl, PEG, SO3H, PO(OH)2 oder Glycosyl ist; und wobei bis zu 3 Wasserstoffe durch Fluor substituiert sein können. 2. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei Formel I die Formel A aufweist und die Substituenten wie im Anspruch 1 definiert sind. 3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei
(i) wobei Rx 1 bis 10 C-Atome aufweist und/oder
(ii) das substituierte Alkyl in Rx als Substituent -OR' oder C(=O)OR' aufweist und R' H oder Alkyl oder eine Schutzgruppe ist oder
(iii) R1 = H, Z1, Z2 = 0, R3 = Methyl ist. 4. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche wobei
Y1=H, Y2 = OH oder Y1 =H, Y2 = OR5), wobei R5 = RX-C(=O)- oder Rx-O- C(=O)- und Rx = H, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, Heteroaryl ist. 5. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei Rx = H, Alkyl und R2 4-Methyl-pentyl ist. 6. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei R1 = H; Methyl. 7. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei R4 bis zu 10 C- Atome aufweist und/oder wobei R5 bis zu 10 C-Atome aufweist. 8. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei Rx bis zu 10 C- Atome aufweist. 9. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei Rx Alkyl oder substituiertes Alkyl ist. 10. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I umfassend den Schritt a und nachfolgende Umwandlung der funktionellen Gruppen: wobei Schritt a unter basischen Bedingungen durchgeführt wird. 11. Verbindung der allgemeinen Formel I wie im Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Therapie maligner Erkrankungen, gutartigen bzw. semimalignen Hauterkrankungen. 12. Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 11, wobei die malignen Erkrankungen das Knochenmark oder andere blutbildender Organe betreffen oder solide Tumore oder epitheliale Tumore sind, insbesondere wobei die soliden Tumore Hirntumore (Grad 1 – Grad 4), insbesondere Glioblastom und Medulloblastom sind. 13. Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 11, wobei die gutartigen bzw. semimalignen Hauterkrankungen Psoriasis vulgaris, Keloide oder Basaliome sind. 14. Verbindung der allgemeinen Formel I wie im Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Therapie von entzündlichen und chronisch entzündlichen Erkrankungen, zur Anwendung zur immunsuppressiven Therapie, zur antiviralen, antibakteriellen, antimykotischen, anti- Protozoen- oder antihelminthischen Therapie. 15. Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Therapie mit einem Zytostatikum kombiniert wird, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytarabin und Vincristin.
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