EP4558604A1 - Assemblage et culture d'objets cellulaires sur une structure de contact sous l'action de forces de radiation acoustique axiale et transversale - Google Patents

Assemblage et culture d'objets cellulaires sur une structure de contact sous l'action de forces de radiation acoustique axiale et transversale

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EP4558604A1
EP4558604A1 EP23736145.6A EP23736145A EP4558604A1 EP 4558604 A1 EP4558604 A1 EP 4558604A1 EP 23736145 A EP23736145 A EP 23736145A EP 4558604 A1 EP4558604 A1 EP 4558604A1
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EP
European Patent Office
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objects
contact structure
acoustic
axial
cavity
Prior art date
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Pending
Application number
EP23736145.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Luc Aider
Nathan JEGER-MADIOT
Jean-Michel Peyrin
Mauricio Hoyos
Chloé DUPUIS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Sorbonne Universite
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Sorbonne Universite
Universite Paris Cite
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI, Sorbonne Universite, Universite Paris Cite filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
    • B01D21/28—Mechanical auxiliary equipment for acceleration of sedimentation, e.g. by vibrators or the like
    • B01D21/283—Settling tanks provided with vibrators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2221/00—Applications of separation devices
    • B01D2221/10—Separation devices for use in medical, pharmaceutical or laboratory applications, e.g. separating amalgam from dental treatment residues

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology and in particular to the assembly of cells or micrometric particles, for example with a view to reconstructing or modeling living tissues.
  • the invention is of particular but in no way limiting interest in the sectors of cell therapy, pharmacological modeling, agri-food, for example for the cultivation of meat, micro-algae or plants, or even aerospace, particularly for cell culture in microgravity conditions.
  • the techniques most used for this purpose include the manipulation of cells within microfluidic devices and the formation of tissues by additive manufacturing.
  • Another known technique consists of structuring cell sheets by acoustic levitation in hydrogels: Bouyer et al. A bio-Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered, 3D Brain-Like Constructs, Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro-Progenitors, Adv. Mater. 2016, 28, 161-167.
  • BAL bio-Acoustic Levitational
  • the assembly techniques known in this field are complex and expensive, and can require significant periods of time to assemble and cultivate cells and, to the extent that they are implemented in vitro, can lead to the death of a large number of cells.
  • the present invention aims to overcome the aforementioned drawbacks by providing a device intended to assemble objects, comprising: a cavity configured to receive a fluid and the objects, a generation system configured to generate in the cavity, along an axial direction , a stationary acoustic wave so as to produce an axial acoustic radiation force capable of positioning objects on nodes and/or pressure anti-nodes formed by the acoustic wave.
  • the device comprises a contact structure forming one or more surfaces extending along the axial direction and the generation system is configured to exert a transverse acoustic radiation force capable of moving the objects in the direction of the or surfaces of the contact structure.
  • the propagation of a stationary acoustic wave in the cavity makes it possible to form in the cavity, along the axial direction, one or more pressure nodes, that is to say places where the pressure of the fluid is zero. , and one or more anti-nodes or pressure antinodes, that is to say places where this pressure is maximum.
  • the axial acoustic radiation force moves the objects either towards a pressure node when their acoustic contrast is positive or towards a pressure anti-node when it is negative.
  • the force of axial acoustic radiation thus makes it possible to form in the cavity one or more aggregates of objects which follow one another along the axial direction, this extremely quickly - typically in a few seconds - and with the aid of equipment particularly simple to implement and inexpensive.
  • the transverse acoustic radiation force which is preferably generated after such axial positioning of the objects, makes it possible to bring each of the aggregates thus formed into contact with the contact structure.
  • the invention thus makes it possible to produce one or more assemblies of objects and to maintain these assemblies in acoustic levitation resting on the contact structure.
  • the invention thus makes it possible to carry out a cell culture in acoustic levitation, by controlling, for each of the assemblies, the development of the connections and interactions between the cells of this assembly and/or between these cells and other objects or elements which can be arranged on or in the contact structure (see further below).
  • an “object” designates a living or inert element preferably having a small size compared to the length of the stationary acoustic wave generated in the cavity.
  • the objects can have a micrometric size, for example between 1 pm and 100 pm, typically when the frequency of the standing wave has a value in the MHz range.
  • the objects can have a millimeter size, for example between 1 mm and 100 mm.
  • the invention can, however, be implemented with objects of different sizes.
  • the objects or some of them may have a size less than 1 pm, for example being formed by bacteria or viruses, and/or have a size of several hundred pm.
  • the objects, or some of them may be multi-cellular elements or artificially formed objects or even objects taken from an organ.
  • the fluid in which the objects are suspended is preferably a liquid which, depending on the application envisaged, may comprise water or form a culture medium or more generally an aqueous medium comprising for example a hydrogel pre-polymer or colloidal particles.
  • the invention also provides a particularly precise solution in terms of positioning objects in space and which, if necessary, makes it possible to control the development of intercellular interactions.
  • the device of the invention can thus form an acousto-fluidic chip used for various applications and have varied structural characteristics, in particular concerning its contact structure.
  • the contact structure comprises one or more membranes or walls.
  • a membrane also called a "wall” is a structure typically comprising two relatively large surfaces in relation to a thickness of this structure, that is to say in relation to the distance separating these two surfaces.
  • the cavity comprises several chambers delimited by one or more of said membranes.
  • the cavity may comprise two chambers and the contact structure may comprise a single membrane arranged so that a first surface of the membrane delimits one of these chambers and a second surface of the membrane delimits the other chamber.
  • each of the rooms includes a respective portion of the objects.
  • the objects can be divided into two series, the objects of the first series being able to be placed in one of the chambers and the objects of the second series in the other room.
  • the transverse acoustic radiation force can be configured so as to move the objects of the first series in the direction of the membrane in order to group these objects against the first surface of the membrane and so as to move the objects of the second series towards the membrane in order to group these objects against the second surface of the membrane.
  • the objects of the first series and the second series arranged at the same position along the axial direction can thus be grouped on either side of the membrane, allowing, for example, the development of interactions, particularly through the membrane when it is porous.
  • one or more of said membranes are porous.
  • one or more of said surfaces formed by the contact structure are surfaces each extending around a respective direction.
  • this direction is parallel or oblique to said axial direction.
  • one or more of said surfaces formed by the contact structure can each extend around a respective direction so as to form a surface of revolution around this direction, for example so as to present a cylindrical geometry.
  • Such a surface of revolution may have a relatively small cross section compared to the length of the stationary acoustic wave generated in the cavity and/or relative to the axial dimension of this surface of revolution, so as to allow one or more assemblies of objects around such a surface, for example in the form of spheroid or ovoid assemblies.
  • one or more of said surfaces formed by the contact structure can each form a hollow structure, allowing for example to perfuse and/or collect biological or chemical objects, elements or samples, or even to encapsulate objects such as as biological cells in the contact structure.
  • the device comprises elements, such as biological cells, connected to the contact structure so as to authorize interactions between these elements and one or more of said objects when these are moved in the direction of the surfaces of the contact structure.
  • these principles can be generalized so that one or more of said surfaces of the contact structure, whether the latter takes the form of one or more membranes and/or hollow structures and/or arranged around one or more several directions and/or one or more three-dimensional structures of any geometry, can be cellularized or, more generally, comprise or carry elements containing biological, physicochemical and/or physical information, for example using molecules promoting or inhibiting the multiplication of cells, nanoparticles or even micrometric or nanometric texturing elements.
  • the contact structure includes or forms one or more electrodes and/or has conductive properties.
  • the contact structure comprises a gas-permeable material, for example polydimethylsiloxane, for example so as to diffuse oxygen into the heart of the assembly(s) of objects.
  • a gas-permeable material for example polydimethylsiloxane
  • the contact structure comprises one or more wires forming one or more of said surfaces.
  • the generation system includes one or more piezoelectric and/or ultrasonic transducers that may include multiple matrix-organized elements and/or one or more acoustic holographic lenses.
  • said objects include objects having positive acoustic contrast relative to the fluid such that the axial acoustic radiation force moves these objects toward the pressure nodes and/or objects having negative acoustic contrast relative to the fluid. fluid so that the axial acoustic radiation force moves these objects towards the pressure anti-nodes.
  • the invention also relates to a method of assembling objects using a device as defined above.
  • This method comprises generating the axial acoustic radiation force so as to position the objects on the pressure nodes and/or anti-nodes and generating the transverse acoustic radiation force so as to move the objects in the direction of the or surfaces of the contact structure.
  • the transverse acoustic radiation force is preferably generated after positioning the objects on the pressure nodes and/or anti-nodes, for example with a generation system comprising a matrix of piezoelectric elements.
  • the axial and transverse acoustic radiation forces can be generated simultaneously, for example with a generation system comprising a single transducer or an acoustic holographic lens.
  • the method can implement any steps making it possible to obtain different combinations of the functional characteristics described above, depending in particular on the structural characteristics of the device and in particular on the contact structure.
  • the invention does not cover, at least in certain embodiments, applications in which said objects comprise human embryonic stem cells involving the destruction of a human embryo and applications in which the invention would be put implemented so as to constitute or develop a human body.
  • FIG. 1 is a schematic view, in axial section, of a device according to the invention, this device comprising a cavity, a porous membrane arranged in the cavity so as to delimit two chambers, an ultrasonic transducer comprising a matrix of piezoelectric elements and a reflector, each of the chambers containing cellular objects kept in acoustic levitation in the form of aggregates at a distance from the membrane;
  • FIG. 2 is a schematic view of the device of Figure 1, the aggregates of cellular objects being arranged against the membrane so as to form assemblies of aggregates capable of developing intercellular interactions between them through pores in the membrane;
  • FIG. 3 is a schematic view, in cross section, of a device according to the invention which is distinguished from that of Figure 1 in that it comprises two porous membranes arranged in the cavity so as to delimit four chambers which contain each of the cellular objects kept in acoustic levitation in the form of aggregates at a distance from the membrane;
  • FIG. 4 is a schematic view of the device of Figure 4, the aggregates of cellular objects being arranged against the membranes so as to form assemblies of aggregates capable of developing intercellular interactions between them through pores of the membranes;
  • FIG. 5 is a schematic view, in axial section, of a device according to the invention, this device comprising a cavity, elongated contact elements arranged in the cavity, an ultrasonic transducer comprising a matrix of piezoelectric elements and a reflector , the cavity containing cellular objects kept in acoustic levitation in the form of aggregates at a distance from the contact elements;
  • FIG. 6 is a schematic view of the device of Figure 5, the aggregates of cellular objects being arranged around the contact elements.
  • Figure 1 schematically illustrates an example of a device conforming to a first embodiment of the invention.
  • This device comprises a container which forms a cavity 1 capable of containing a fluid and/or different substances, in particular in liquid form.
  • the cavity 1 extends along an axial direction Al, which corresponds in this example to a vertical direction.
  • Cavity 1 has, along direction Al, a dimension B1 defining a height of cavity 1.
  • the cavity 1 has a generally cylindrical shape, the direction Al forming an axis of symmetry of the cavity 1.
  • the cavity 1 can have another geometry, for example a rectangular section.
  • the device of the invention also comprises a system for generating acoustic waves, in this case a transducer 2 provided with a matrix of piezoelectric elements 2A and 2B as well as an acoustic reflector 3.
  • a transducer 2 provided with a matrix of piezoelectric elements 2A and 2B as well as an acoustic reflector 3.
  • the transducer 2 is arranged at a first end of the cavity 1 in the direction Al, in this case vertically above the cavity 1.
  • the reflector delimits a second end of the cavity 1 in direction Al, in this case being arranged vertically below cavity 1.
  • the piezoelectric elements 2A and 2B are distributed transversely, that is to say over the width of the cavity 1, so that each of these elements is located at a respective position radially relative to the direction Al.
  • This system is configured to generate in the cavity 1 and propagate in the fluid it contains a stationary acoustic wave, in an axial propagation direction which corresponds to the direction Al.
  • the standing wave can be generated by one or more of the piezoelectric elements of transducer 2, with a frequency identical to the resonance frequency of cavity 1, which in this case forms a resonator.
  • the standing wave may have a frequency different from the resonance frequency of cavity 1.
  • the system is configured to be able to generate, in particular, a wave having a wavelength A less than or equal to twice the height B1 of the cavity 1, in order to form along the direction Al at least one pressure node and at least one pressure belly.
  • Transducer 2 is in this example a broadband transducer equipped with an ultrasonic source. Such a transducer 2 makes it possible to modify the position of the nodes of the standing wave along the direction Al and/or the distance between these nodes, by varying the frequency of the wave.
  • the device comprises a wall 4, also called a “membrane”, which extends into the cavity 1 so as to separate the cavity 1 into two chambers 5 and 6.
  • the membrane 4 comprises a first surface 7 which delimits the chamber 5 and a second surface 8 which delimits the chamber 6.
  • Membrane 4 as well as its surfaces? and 8 extend along the direction Al, in this case parallel to this direction.
  • the membrane 4 is made of nitrocellulose and includes pores 9 forming openings which pass through the membrane 4 right through, so as to open onto the surfaces 7 and 8.
  • the membrane 4 can have a thickness, defined as the distance between the surfaces 7 and 8, of 150 ⁇ m and pores having a diameter of 3 ⁇ m.
  • the size of such pores can range from the nanometric scale to the micrometric scale.
  • Chambers 5 and 6 are in this example filled with a fluid containing objects 11 and 12 each having a size between 1 pm and 100 pm.
  • the objects 11 are biological cells of a first type which are received in the chamber 5 while the objects 12 are biological cells of a second type received in the chamber 6.
  • the fluid forms a medium culture for cellular objects 11 and 12.
  • objects 11 and 12 can be neurons or glial, tumor, endothelial, epithelial, bone or even immune cells.
  • each of the objects 11 and 12 has a density p 0 greater than the density p of the fluid.
  • Objects 11 and 12 are further chosen to so that the speed c 0 of propagation of an acoustic wave in these objects 11 and 12 is greater than the speed c of propagation of this acoustic wave in the fluid.
  • the device of Figure 1 is in this example implemented so as to be able to structure the objects 11 and 12 in the manner described below.
  • the transducer 2 is implemented so as to generate a stationary acoustic wave in the cavity 1, along the direction Al, in this example with a wavelength forming four pressure nodes N1-N4.
  • the wave is generated via the piezoelectric elements 2A, identified by rectangles with a cross in Figure 1, the piezoelectric elements 2B, identified by rectangles without crosses in Figure 1, being inactivated.
  • This standing wave produces an axial acoustic radiation force which is exerted on objects 11 and 12.
  • This axial acoustic radiation force FRA A can in particular be described according to the following model, known per se, by K. Yosioka and Y. Kawasima:
  • FRA A —pf VQ kd 3 F y sin(fc z) where v 0 is the speed of the wave, k the wave number, F y the acoustic contrast factor, or density-compressibility, and z the position axial of the object 11 or 12 considered along the direction Al, that is to say along the direction of propagation of the wave.
  • the acoustic contrast factor, or density-compressibility, F y can be defined as follows: where p 0 is the density of the object 11 or 12 considered and c 0 the speed of propagation of the wave within the object 11 or 12 considered. Taking into account the density and the speed of propagation of the acoustic wave of the objects 11 and 12 relative to the fluid, the objects 11 and 12 have a positive density-compressibility factor, or acoustic contrast.
  • the axial acoustic radiation force causes a movement of objects 11 and 12 towards the nodes of the stationary acoustic wave, so as to reach a configuration as illustrated in Figure 1.
  • the axial acoustic radiation force thus results in positioning of the objects 11 and 12 in the form of groups, also called “aggregates”, in the manner illustrated in Figure 1, which are located radially at the level of the activated piezoelectric elements 2A.
  • a group 21 of objects 11 is formed axially at the level of the pressure node NI and radially at the level of the piezoelectric elements 2A located opposite the chamber 5.
  • Three other groups 22, 23 and 24 of objects 11 are formed axially at pressure nodes N2, N3 and N4, respectively, and radially at the same level as group 21.
  • a group 25 of objects 12 is formed axially at the level of the pressure node NI and radially at the level of the piezoelectric elements 2A located opposite the chamber 6.
  • Three other groups 26, 27 and 28 of objects 12 are formed axially at pressure nodes N2, N3 and N4, respectively, and radially at the same level as group 25.
  • the actuated piezoelectric elements 2A can maintain the objects 11 and 12 in acoustic levitation for the time necessary to obtain sufficient self-organization of the aggregates 21 to 28, which in this example constitute substantially ovoid three-dimensional structures.
  • the transducer 2 can then be controlled so as to produce a transverse acoustic radiation force in order to move the objects 11 and 12 towards the membrane 4, in particular so that the aggregates 21 to 24, located in the chamber 5, are plated on surface 7 of membrane 4 and that the aggregates 25 to 28, located in chamber 6, are placed on surface 8 of membrane 4.
  • such a transverse acoustic radiation force is produced by modifying the activation state of the piezoelectric elements 2A and 2B, that is to say by progressively activating the piezoelectric elements radially in the direction of the direction Al and in inactivating, as new piezoelectric elements are activated, the previously activated piezoelectric elements.
  • the transducer 2 thus makes it possible to spatially control the acoustic field in the cavity 1 so as to exert a transverse acoustic radiation force capable of translating the aggregates 21 to 28 towards the membrane 4, until reaching a configuration as illustrated in the Figure 2.
  • the transverse acoustic radiation force FRA T can be expressed as a function of the gradient of the acoustic energy density: where d corresponds to the diameter of objects 11 and 12 and E ac (x,y, z)) to the acoustic energy density gradient.
  • the piezoelectric elements 2A located radially at the level of the membrane 4 can remain activated so as to maintain the aggregates 21 to 28 in contact with the membrane 4, by acoustic levitation.
  • the invention thus makes it possible to assemble object structures, in this example aggregates 21-24 of objects 11 of a first type with aggregates 25-28 of objects 12 of a second type, without the different types of objects located in the same plane of acoustic levitation come into direct contact with each other and so that contact can in this example be established via the porous membrane 4.
  • Such a membrane 4 makes it possible in particular to control the interactions between the objects 11 and 12, through the pores 9 which can constitute passages for axon-type connections when the objects 11 and 12 are primary neurons.
  • Numerous variations can be made to the device which has just been described and to its implementation.
  • the height B1 of cavity 1 and/or the frequency of the stationary acoustic wave can be modified in order to increase the number of pressure nodes, for example so as to simultaneously assemble several dozen aggregates.
  • the size and shape of the objects 11 and 12 can also be modified, as well as the concentration of the objects in the cavity 1, the volume of the cavity 1 or even the frequency of the wave, in order for example to determine a number of objects by aggregate or assembly as well as the size of the assembly(s) thus obtained.
  • the choice of the amplitude and frequency of the acoustic wave, setting the magnitude of the acoustic radiation force, can also be controlled to modify the lateral and/or axial dimensions of the assembly(s).
  • the amplitude of the acoustic pressure applied to sets of objects can also be controlled, for example to force a given spatial organization or to stimulate the objects and thus force certain spatial organizations and/or functionalities.
  • the membrane 4 can be a glass wall or more generally a non-porous structure, making it possible in particular to use different fluids in each of the chambers 5 and 6 of the cavity 1.
  • a wall can of course be functionalized and /or cellularized and/or be gas permeable.
  • the contact structure 4 comprises not one membrane but two porous membranes 4A and 4B separating the cavity 1 into four chambers 5A, 5B, 6A and 6B.
  • Each of the rooms 5A, 5B, 6A and 6B includes objects 31, 32, 33 and 34, respectively, of a different nature.
  • Such a device makes it possible to form complex assemblies, in this case by doubling the types of objects compared to the device in Figure 1.
  • the contact structure 4 can therefore be configured to compartmentalize the acoustic levitation cavity into several independent chambers, with different culture media, according to need. This makes it possible in particular to maintain acoustic levitation and to cultivate in three dimensions one cell type per chamber, in a single acousto-fluidic chip.
  • levitating cellular objects can be brought into contact with a contact structure such as a membrane, either at the start of the culture or during the culture.
  • different symmetrical or asymmetrical shapes of reflectors can be implemented in order to promote a given spatial organization of the aggregates of acoustically levitating objects, for example an organization in sheets, in spheroid or ovoid structures, in rings, or even in independent lobes.
  • the membrane(s) of the contact structure may be of varied physicochemical nature, for example be formed of a hydrogel, an elastomer or even an inorganic material, and/or may comprise textures of micrometric or nanometric.
  • membranes of controlled porosity makes it possible to control on the one hand the self-assembly of different aggregates, in particular spheroids, and thus to reconstruct complex multicellular assemblies, and on the other hand the nature of the interactions between aggregates of varied. It is for example possible to control exchanges of solutes, in particular with membrane pores whose size is less than a micrometer, cellular extensions including neuronal axons, in particular with a porosity of between 1 pm and 5 pm, or even exchanges of cells or objects, particularly with a porosity greater than 5 pm.
  • the chamber(s) delimited by one or more membranes, or more generally by a contact structure which can be otherwise constituted can be used only for initial structuring stages, that is to say for assemblies of objects, these assemblies can then be cultivated in a conventional manner, for example in a liquid medium or in a hydrogel.
  • the device of the invention can be used to carry out long-term culture in acoustic levitation.
  • the transverse acoustic radiation force is generated by selective activation of piezoelectric elements of the transducer 2.
  • This force can of course be generated using another type of organ. acoustic field control, for example with an acoustic holographic lens.
  • an acoustic holographic lens can be coded on several frequencies.
  • a first frequency can be used to organize the objects in the form of aggregates in the manner illustrated in Figure 1 and a second frequency to bring and maintain these aggregates against the contact structure 4 and form assemblies as illustrated in Figure 2.
  • the wave generation system producing the axial and transverse acoustic radiation forces may comprise one or more transducers or combinations of transducers of different types and/or positioned axially and/or transversely.
  • the device comprises a contact structure comprising a network of contact elements 40 which each have an elongated geometry along the axial direction Al of the cavity 1.
  • each of the contact elements 40 has a cylindrical geometry so as to form an external surface 41 extending around a direction A2 parallel to the axial direction Al of the cavity 1.
  • the acoustic wave generation system of the device of Figure 5 also comprises an ultrasonic transducer 2 provided with piezoelectric elements 2C organized in a matrix and a reflector 3 each extending in a transverse plane of the cavity 1 so as to be able to move objects 42 present in the cavity 1.
  • the axial acoustic radiation force resulting from the standing wave generated by the transducer 2 results in positioning of the objects 42 in the form of aggregates as shown in Figure 5.
  • the aggregates of objects 42 are formed in this particular example on three pressure nodes formed by the standing wave, the objects 42 presenting a positive acoustic contrast with respect to the fluid, transversely facing activated piezoelectric elements 2C, in this configuration at a distance from the contact elements 40.
  • the activation of the piezoelectric elements 2C is then modified to produce a transverse acoustic radiation force causing a movement of the aggregates around the contact elements 40 as illustrated in Figure 6 , so as to form in this example spheroid assemblies which can thus be cultivated.
  • the contact elements 40 can be of different physicochemical and geometric natures. They can for example be solid or hollow, permeable or not, electroactive or not, which can make it possible in particular to perfuse, stimulate, monitor and/or sample the assemblies in a controlled manner.
  • the contact elements 40 can form electrodes intended to measure or impose electrical activity. Electroactive and/or conductive contact elements 40 make it possible in particular to model a vascularization phenomenon, with electrical stimulation and recording of the electrical activity of the assemblies of objects 42.
  • the contact elements 40 can be hollow and/or porous, for example in order to be able to inject and trap in the contact elements 40 and perfuse solutes such as compounds or agents into the assemblies of objects 42. biological and physical, cells or even viruses. The nature of the diffusion/migration of such solutes can be controlled through the porosity of the contact elements 40.
  • Such variants can be implemented or combined with other types of contact structures, for example one or more membranes 4 as described above with reference to Figures 1 to 4.
  • the contact structure of the device of the invention can be functionalized so as to modify the interaction between cellular objects assembled on the contact structure.
  • the functionalization of the contact structure may comprise a grafting of objects on one or more surfaces of the contact structure and/or inside the contact structure, for example inside elements of contact 40 as illustrated in Figures 5 and 6.
  • the grafted objects can be particles conferring new properties to the contact structure, for example in terms of electrical, magnetic or even acoustic conductivity, bioactive substances influencing the development of cellular objects, or even cells, for example endothelial or astrocytic, or other living organisms.
  • the contact elements 40 of the device of Figures 5 and 6 can be formed by a hardened hydrogel, for example by confocal photopolymerization. These contact elements 40 may include cellular or functionalization objects, such as those described above, trapped in the hydrogel forming these contact elements 40. Of course, such contact elements can have any three-dimensional geometry more or less complex, forming for example a lattice or other structure.
  • the invention makes it possible to carry out numerous applications including the reconstruction of complex tissue elements, the modeling of interactions of several organs in series, for example of interactions of different areas of the brain, of placing models in series or in parallel. organs, etc.
  • the invention makes it possible to carry out three-dimensional reconstruction of neuro-anatomical pathways or three-dimensional models of tissue barriers of the blood-brain type or placental.
  • the anisotropy of the porosity, for example conical holes, of membranes would make it possible to control the direction of growth of axons and/or nerves from one organoid towards the other.
  • complex biological interfaces can be modeled by cellularization of membranes, porous or not, in particular by prior seeding of the membranes with cells of interest.

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Abstract

Dispositif et procédé d'assemblage d'objets (11, 12) par génération d'une force de radiation acoustique axiale afin de positionner les objets (11, 12) sur des nœuds (N1-N4) et/ou des anti-nœuds de pression et génération d'une force de radiation acoustique transversale afin de déplacer les objets (11, 12) ainsi positionnés sur une structure de contact (4) du type membrane poreuse.

Description

DESCRIPTION
Titre : Assemblage et culture d'objets cellulaires sur une structure de contact sous l'action de forces de radiation acoustique axiale et transversale
Domaine technique
L'invention se rapporte au domaine de la biotechnologie et en particulier de l'assemblage de cellules ou particules micrométriques, par exemple en vue de reconstruire ou de modéliser des tissus vivants.
L'invention présente un intérêt particulier mais nullement limitatif dans les secteurs de la thérapie cellulaire, de la modélisation pharmacologique, de l'agro-alimentaire par exemple pour la culture de viande, de micro-algues ou de végétaux, ou encore de l'aérospatial, notamment pour la culture cellulaire en conditions de microgravité.
État de la technique antérieure
Dans le contexte de la recherche portant sur la reconstruction et la modélisation d'organes sur puces (« organ-on-a-chip » en anglais) et d'organoïdes, un nombre croissant d'approches expérimentales visent à permettre la structuration d'ensembles cellulaires.
Les techniques les plus utilisées dans cet objectif incluent la manipulation de cellules au sein de dispositifs microfluidiques et la formation de tissus par fabrication additive.
Une autre technique connue, décrite dans le document suivant, consiste à structurer des feuillets cellulaires par lévitation acoustique dans des hydrogels : Bouyer et al. A bio- Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered, 3D Brain-Like Constructs, Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro-Progenitors, Adv. Mater. 2016, 28, 161-167. Cette technique permet d'assembler dans un hydrogel des cellules sous forme de couches ou feuillets dans l'objectif d'établir des connexions entre cellules de différentes couches. Cependant, cette technique ne permet pas de contrôler le développement de telles connexions de manière satisfaisante.
Plus généralement, les techniques d'assemblage connues dans ce domaine sont complexes et coûteuses, peuvent nécessiter des durées importantes pour assembler et cultiver des cellules et, dans la mesure où elles sont mises en œuvre in vitro, peuvent entraîner la mort d'un grand nombre de cellules.
Exposé de l'invention
La présente invention vise à surmonter les inconvénients précités en procurant un dispositif destiné à assembler des objets, comprenant : une cavité configurée pour recevoir un fluide et les objets, un système de génération configuré pour générer dans la cavité, le long d'une direction axiale, une onde acoustique stationnaire de manière à produire une force de radiation acoustique axiale apte à positionner les objets sur des nœuds et/ou des anti-nœuds de pression formés par l'onde acoustique.
Selon l'invention, le dispositif comprend une structure de contact formant une ou plusieurs surfaces s'étendant le long de la direction axiale et le système de génération est configuré pour exercer une force de radiation acoustique transversale apte à déplacer les objets en direction de la ou des surfaces de la structure de contact.
La propagation d'une onde acoustique stationnaire dans la cavité permet en effet de former dans la cavité, le long de la direction axiale, un ou plusieurs nœuds de pression, c'est-à-dire des endroits où la pression du fluide est nulle, et un ou plusieurs anti-nœuds ou ventres de pression, c'est-à-dire des endroits où cette pression est maximale.
De manière connue en soi, en fonction des propriétés des objets et en particulier de leur facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique par rapport au fluide contenu dans la cavité, la force de radiation acoustique axiale déplace les objets soit vers un nœud de pression lorsque leur contraste acoustique est positif soit vers un anti-nœud de pression lorsqu'il est négatif.
La force de radiation acoustique axiale permet ainsi de former dans la cavité un ou plusieurs agrégats d'objets qui se succèdent le long de la direction axiale, cela de manière extrêmement rapide - typiquement en quelques secondes - et à l'aide d'un matériel particulièrement simple à mettre en œuvre et peu coûteux. La force de radiation acoustique transversale, qui est de préférence générée après un tel positionnement axial des objets, permet de mettre chacun des agrégats ainsi formés en contact avec la structure de contact.
L'invention permet ainsi de réaliser un ou plusieurs assemblages d'objets et de maintenir ces assemblages en lévitation acoustique en appui sur la structure de contact.
En maintenant de tels assemblages en lévitation acoustique pendant la durée requise, par exemple plusieurs heures ou jours, il est possible de favoriser des interactions entre objets lorsque ceux-ci sont vivants, en particulier lorsque ces objets sont des cellules biologiques.
L'invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique, en contrôlant, pour chacun des assemblages, le développement des connexions et interactions entre les cellules de cet assemblage et/ou entre ces cellules et d'autres objets ou éléments qui peuvent être disposés sur ou dans la structure de contact (voir plus loin ci- dessous).
Dans la présente description, un « objet » désigne un élément vivant ou inerte ayant de préférence une taille petite par rapport à la longueur de l'onde acoustique stationnaire générée dans la cavité.
A titre d'exemple non limitatif, les objets peuvent avoir une taille micrométrique, par exemple comprise entre 1 pm et 100 pm, typiquement lorsque la fréquence de l'onde stationnaire a une valeur dans la gamme des MHz.
Pour autre exemple, notamment lorsque la fréquence de génération est dans la gamme des kHz, les objets peuvent avoir une taille millimétrique, par exemple comprise entre 1 mm et 100 mm.
L'invention peut toutefois être mise en œuvre avec des objets de taille différente. Par exemple, les objets ou certains d'entre eux peuvent avoir une taille inférieure à 1 pm, en étant par exemple formés par des bactéries ou des virus, et/ou avoir une taille de plusieurs centaines de pm. De plus, les objets, ou certains d'entre eux, peuvent être des éléments muli-cellulaires ou des objets formés artificiellement ou encore des objets prélevés sur un organe. Le fluide dans lequel les objets sont en suspension est de préférence un liquide qui, selon l'application envisagée, peut comprendre de l'eau ou former un milieu de culture ou plus généralement un milieu aqueux comprenant par exemple un pré-polymère d'hydrogel ou des particules colloïdales.
L'invention fournit par ailleurs une solution particulièrement précise en termes de positionnement des objets dans l'espace et qui permet le cas échéant de contrôler le développement d'interactions intercellulaires.
Le dispositif de l'invention peut ainsi former une puce acousto-fluidique mise en œuvre pour des applications diverses et présenter des caractéristiques structurelles variées, en particulier concernant sa structure de contact.
Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend une ou plusieurs membranes ou parois.
Dans la présente description, une membrane, aussi appelée « paroi », est une structure comprenant typiquement deux surfaces relativement grandes par rapport à une épaisseur de cette structure, c'est-à-dire par rapport à la distance séparant ces deux surfaces.
Dans un mode de réalisation, la cavité comprend plusieurs chambres délimitées par une ou plusieurs desdites membranes.
A titre d'exemple non limitatif, la cavité peut comprendre deux chambres et la structure de contact peut comprendre une unique membrane agencée de sorte qu'une première surface de la membrane délimite l'une de ces chambres et qu'une deuxième surface de la membrane délimite l'autre chambre.
Dans un mode de réalisation, chacune des chambres comprend une partie respective des objets.
Ainsi, dans le cadre de l'exemple précité de compartimentation de la cavité en deux chambres, les objets peuvent être répartis en deux séries, les objets de la première série pouvant être placés dans l'une des chambres et les objets de la deuxième série dans l'autre chambre. Dans cet exemple non limitatif, la force de radiation acoustique transversale peut être configurée de sorte à déplacer les objets de la première série en direction de la membrane afin de regrouper ces objets contre la première surface de la membrane et de sorte à déplacer les objets de la deuxième série en direction de la membrane afin de regrouper ces objets contre la deuxième surface de la membrane.
Les objets de la première série et de la deuxième série disposés au niveau d'une même position le long de la direction axiale peuvent ainsi être regroupés de part et d'autre de la membrane, permettant, par exemple, le développement d'interactions, notamment à travers la membrane lorsque celle-ci est poreuse.
Ainsi, dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites membranes sont poreuses.
Dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact sont des surfaces s'étendant chacune autour d'une direction respective.
De préférence, cette direction est parallèle ou oblique par rapport à ladite direction axiale.
Par exemple, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact peuvent chacune s'étendre autour d'une direction respective de manière à former une surface de révolution autour de cette direction, par exemple de manière à présenter une géométrie cylindrique.
Une telle surface de révolution peut présenter une section transversale relativement petite par rapport à la longueur de l'onde acoustique stationnaire générée dans la cavité et/ou par rapport à la dimension axiale de cette surface de révolution, de manière à permettre un ou plusieurs assemblages d'objets autour d'une telle surface, par exemple sous forme d'assemblages sphéroïdes ou ovoïdes.
Dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact peuvent chacune former une structure creuse, permettant par exemple de perfuser et/ou prélever des objets, éléments ou échantillons biologiques ou chimiques, ou encore pour encapsuler des objets tels que des cellules biologiques dans la structure de contact. Ainsi, dans un mode de réalisation, le dispositif comprend des éléments, tels que des cellules biologiques, reliés à la structure de contact de manière à autoriser des interactions entre ces éléments et un ou plusieurs desdits objets lorsque ceux-ci sont déplacés en direction des surfaces de la structure de contact.
Bien entendu, ces principes peuvent être généralisés de sorte qu'une ou plusieurs desdites surfaces de la structure de contact, que cette dernière prenne la forme d'une ou plusieurs membranes et/ou de structures creuses et/ou agencées autour d'une ou plusieurs directions et/ou d'une ou plusieurs structures tridimensionnelles de toute géométrie, peuvent être cellularisées ou, plus généralement, comprendre ou porter des éléments contenant des informations biologiques, physico-chimiques et/ou physiques, par exemple à l'aide de molécules favorisant ou inhibant la multiplication de cellules, de nanoparticules ou encore d'éléments de texturation micrométriques ou nanométriques.
Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend ou forme une ou plusieurs électrodes et/ou présente des propriétés conductrices.
Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend un matériau perméable au gaz, par exemple le polydiméthylsiloxane, par exemple de manière à diffuser de l'oxygène au cœur du ou des assemblages d'objets.
Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend un ou plusieurs fils formant une ou plusieurs desdites surfaces.
Dans un mode de réalisation, le système de génération comprend un ou plusieurs transducteurs piézoélectriques et/ou ultrasonores qui peuvent comprendre plusieurs éléments organisés de manière matricielle et/ou une ou plusieurs lentilles holographiques acoustiques.
Dans un mode de réalisation, lesdits objets comprennent des objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les nœuds de pression et/ou des objets présentant un contraste acoustique négatif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les anti-nœuds de pression. L'invention a aussi pour objet un procédé d'assemblage d'objets à l'aide d'un dispositif tel que défini ci-dessus.
Ce procédé comprend une génération de la force de radiation acoustique axiale de manière à positionner les objets sur les nœuds et/ou les anti-nœuds de pression et une génération de la force de radiation acoustique transversale de manière à déplacer les objets en direction de la ou des surfaces de la structure de contact.
La force de radiation acoustique transversale est de préférence générée après positionnement des objets sur les nœuds et/ou les anti-nœuds de pression, par exemple avec un système de génération comprenant une matrice d'éléments piézoélectriques.
En variante, les forces de radiation acoustique axiale et transversale peuvent être générée simultanément, par exemple avec un système de génération comprenant un unique transducteur ou une lentille holographique acoustique.
Le procédé peut mettre en œuvre toutes étapes permettant d'obtenir différentes combinaisons des caractéristiques fonctionnelles décrites ci-dessus, en fonction notamment des caractéristiques structurelles du dispositif et notamment de la structure de contact.
De manière non limitative, l'invention ne couvre pas, au moins dans certains modes de réalisation, des applications dans lesquelles lesdits objets comprennent des cellules souches embryonnaires humaines impliquant la destruction d'un embryon humain et des applications dans lesquelles l'invention serait mise en œuvre de sorte à constituer ou développer un corps humain.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée, non limitative, qui suit.
Brève description des dessins
La description détaillée qui suit fait référence aux dessins annexés sur lesquels :
[Fig. 1] est une vue schématique, en coupe axiale, d'un dispositif conforme à l'invention, ce dispositif comprenant une cavité, une membrane poreuse disposée dans la cavité de manière à délimiter deux chambres, un transducteur ultrasonore comportant une matrice d'éléments piézoélectriques et un réflecteur, chacune des chambres contenant des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance de la membrane ;
[Fig. 2] est une vue schématique du dispositif de la figure 1, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés contre la membrane de manière à former des assemblages d'agrégats pouvant développer entre eux des interactions intercellulaires à travers des pores de la membrane ;
[Fig. 3] est une vue schématique, en coupe transversale, d'un dispositif conforme à l'invention qui se distingue de celui de la figure 1 en ce qu'il comprend deux membranes poreuses disposées dans la cavité de manière à délimiter quatre chambres qui contiennent chacune des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance de la membrane ;
[Fig. 4] est une vue schématique du dispositif de la figure 4, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés contre les membranes de manière à former des assemblages d'agrégats pouvant développer entre eux des interactions intercellulaires à travers des pores des membranes ;
[Fig. 5] est une vue schématique, en coupe axiale, d'un dispositif conforme à l'invention, ce dispositif comprenant une cavité, des éléments de contact allongés disposés dans la cavité, un transducteur ultrasonore comportant une matrice d'éléments piézoélectriques et un réflecteur, la cavité contenant des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance des éléments de contact ;
[Fig. 6] est une vue schématique du dispositif de la figure 5, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés autour des éléments de contact.
Description détaillée de modes de réalisation
La figure 1 illustre schématiquement un exemple de dispositif conforme à un premier mode de réalisation de l'invention.
Ce dispositif comprend un récipient qui forme une cavité 1 apte à contenir un fluide et/ou différentes substances, notamment sous forme liquide. De manière générale, la cavité 1 s'étend le long d'une direction axiale Al, qui correspond dans cet exemple à une direction verticale. La cavité 1 présente le long de la direction Al une dimension B1 définissant une hauteur de la cavité 1.
Dans cet exemple, la cavité 1 a une forme globalement cylindrique, la direction Al formant un axe de symétrie de la cavité 1. Dans des variantes non représentées, la cavité 1 peut avoir une autre géométrie, par exemple une section rectangulaire.
Le dispositif de l'invention comprend par ailleurs un système de génération d'ondes acoustiques, en l'occurrence un transducteur 2 doté d'une matrice d'éléments piézoélectriques 2A et 2B ainsi qu'un réflecteur acoustique 3.
En référence à la figure 1, le transducteur 2 est disposé au niveau d'une première extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en l'occurrence verticalement au-dessus de la cavité 1. Le réflecteur s délimite une deuxième extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en étant en l'occurrence disposé verticalement en-dessous de la cavité 1.
Les éléments piézoélectriques 2A et 2B sont répartis transversalement, c'est-à-dire sur la largeur de la cavité 1, de sorte que chacun de ces éléments est situé à une position respective radialement par rapport à la direction Al.
Ce système est configuré pour générer dans la cavité 1 et propager dans le fluide qu'elle contient une onde acoustique stationnaire, selon une direction de propagation axiale qui correspond à la direction Al.
L'onde stationnaire peut être générée par un ou plusieurs des éléments piézoélectriques du transducteur 2, avec une fréquence identique à la fréquence de résonance de la cavité 1, laquelle forme dans ce cas un résonateur. Alternativement, l'onde stationnaire peut avoir une fréquence différente de la fréquence de résonance de la cavité 1.
Dans tous les cas, le système est configuré pour pouvoir générer, notamment, une onde ayant une longueur d'onde A inférieure ou égale au double de la hauteur B1 de la cavité 1, afin de former le long de la direction Al au moins un nœud de pression et au moins un ventre de pression. Le transducteur 2 est dans cet exemple un transducteur à large bande équipé d'une source ultrasonore. Un tel transducteur 2 permet de modifier la position des nœuds de l'onde stationnaire le long de la direction Al et/ou la distance entre ces nœuds, en jouant sur la fréquence de l'onde.
Dans le mode de réalisation de la figure 1, le dispositif comprend une paroi 4, aussi appelée « membrane », qui s'étend dans la cavité 1 de manière à séparer la cavité 1 en deux chambres 5 et 6.
La membrane 4 comprend une première surface 7 qui délimite la chambre 5 et une deuxième surface 8 qui délimite la chambre 6.
La membrane 4 ainsi que ses surfaces ? et 8 s'étendent le long de la direction Al, en l'occurrence parallèlement à cette direction.
Dans cet exemple, la membrane 4 est en nitrocellulose et comprend des pores 9 formant des ouvertures qui traversent la membrane 4 de part en part, de manière à déboucher sur les surfaces 7 et 8.
A titre indicatif, la membrane 4 peut avoir une épaisseur, définie comme la distance entre les surfaces 7 et 8, de 150 pm et des pores ayant un diamètre de 3 pm. De manière non limitative, la dimension de tels pores peut aller de l'échelle nanométrique à l'échelle micrométrique.
Les chambres 5 et 6 sont dans cet exemple remplies d'un fluide contenant des objets 11 et 12 ayant chacun une taille comprise entre 1 pm et 100 pm.
Dans cet exemple non limitatif, les objets 11 sont des cellules biologiques d'un premier type qui sont reçues dans la chambre 5 tandis que les objets 12 sont des cellules biologiques d'un deuxième type reçues dans la chambre 6. Le fluide forme un milieu de culture pour les objets cellulaires 11 et 12.
De manière non limitative, les objets 11 et 12 peuvent être des neurones ou des cellules gliales, tumorales, endothéliales, épithéliales, osseuses ou encore immunitaires.
Dans cet exemple spécifique, chacun des objets 11 et 12 a une masse volumique p0 supérieure à la masse volumique p du fluide. Les objets 11 et 12 sont en outre choisis de sorte que la vitesse c0 de propagation d'une onde acoustique dans ces objets 11 et 12 soit supérieure à la vitesse c de propagation de cette onde acoustique dans le fluide.
Le dispositif de la figure 1 est dans cet exemple mis en œuvre de manière à pouvoir structurer les objets 11 et 12 de la manière décrite ci-dessous.
Dans un état initial, non représenté, les objets 11 et 12 sont en suspension dans le fluide, respectivement dans les chambres 5 et 6.
Le transducteur 2 est mis en œuvre de manière à générer une onde acoustique stationnaire dans la cavité 1, le long de la direction Al, dans cet exemple avec une longueur d'onde formant quatre nœuds de pression N1-N4. En l'occurrence, l'onde est générée par l'intermédiaire des éléments piézoélectriques 2A, identifiés par des rectangles avec une croix sur la figure 1, les éléments piézoélectriques 2B, identifiés par des rectangles sans croix sur la figure 1, étant inactivés.
Cette onde stationnaire produit une force de radiation acoustique axiale qui s'exerce sur les objets 11 et 12.
Cette force de radiation acoustique axiale FRAA peut notamment être décrite selon le modèle suivant, connu en soi, de K. Yosioka et Y. Kawasima :
TT
FRAA = —pf VQ k d3 Fy sin(fc z) où v0 est la vitesse de l'onde, k le nombre d'onde, Fy le facteur de contraste acoustique, ou densité-compressibilité, et z la position axiale de l'objet 11 ou 12 considérée le long de la direction Al, c'est-à-dire le long de la direction de propagation de l'onde.
Le facteur de contraste acoustique, ou densité-compressibilité, Fy peut être défini de la manière suivante : où p0 est la masse volumique de l'objet 11 ou 12 considéré et c0 la vitesse de propagation de l'onde au sein de l'objet 11 ou 12 considéré. Compte tenu de la masse volumique et de la vitesse de propagation de l'onde acoustique des objets 11 et 12 par rapport au fluide, les objets 11 et 12 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, positif.
Compte tenu des propriétés respectives précitées du fluide et des objets 11 et 12, à partir dudit état initial dans lequel les objets 11 et 12 sont distribués de manière relativement homogène dans l'ensemble de la cavité 1, la force de radiation acoustique axiale entraîne un déplacement des objets 11 et 12 vers les nœuds de l'onde acoustique stationnaire, de manière à atteindre une configuration telle qu'illustrée sur la figure 1.
La force de radiation acoustique axiale entraîne ainsi un positionnement des objets 11 et 12 sous forme de groupes, aussi appelés « agrégats », de la manière illustrée sur la figure 1, qui sont situés radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A activés.
Ainsi, un groupe 21 d'objets 11 se forme axialement au niveau du nœud de pression NI et radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A situés en regard de la chambre 5. Trois autres groupes 22, 23 et 24 d'objets 11 se forment axialement au niveau des nœuds de pression N2, N3 et N4, respectivement, et radialement au même niveau que le groupe 21.
Symétriquement, un groupe 25 d'objets 12 se forme axialement au niveau du nœud de pression NI et radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A situés en regard de la chambre 6. Trois autres groupes 26, 27 et 28 d'objets 12 se forment axialement au niveau des nœuds de pression N2, N3 et N4, respectivement, et radialement au même niveau que le groupe 25.
Les éléments piézoélectriques 2A actionnés peuvent maintenir les objets 11 et 12 en lévitation acoustique le temps nécessaire pour obtenir une auto-organisation suffisante des agrégats 21 à 28, qui constituent dans cet exemple des structures tridimensionnelles sensiblement ovoïdes.
Le transducteur 2 peut ensuite être commandé de manière produire une force de radiation acoustique transversale afin de déplacer les objets 11 et 12 en direction de la membrane 4, en particulier de sorte que les agrégats 21 à 24, situés dans la chambre 5, soient plaqués sur la surface 7 de la membrane 4 et que les agrégats 25 à 28, situés dans la chambre 6, soient plaqués sur la surface 8 de la membrane 4.
Dans cet exemple, une telle force de radiation acoustique transversale est réalisée en modifiant l'état d'activation des éléments piézoélectriques 2A et 2B, c'est-à-dire en activant progressivement les éléments piézoélectriques radialement en direction de la direction Al et en inactivant, au fur et à mesure de l'activation de nouveaux éléments piézoélectriques, les éléments piézoélectriques préalablement activés.
Le transducteur 2 permet ainsi de contrôler spatialement le champ acoustique dans la cavité 1 de manière à exercer une force de radiation acoustique transversale apte à translater les agrégats 21 à 28 vers la membrane 4, jusqu'à atteindre une configuration telle qu'illustrée sur la figure 2.
De manière connue en soi, la force de radiation acoustique transversale FRAT peut s'exprimer en fonction du gradient de la densité d'énergie acoustique : où d correspond au diamètre des objets 11 et 12 et Eac(x,y, z)) au gradient de densité d'énergie acoustique.
Dans la configuration de la figure 2, les éléments piézoélectriques 2A situés radialement au niveau de la membrane 4 peuvent rester activés de manière à maintenir les agrégats 21 à 28 en contact avec la membrane 4, par lévitation acoustique.
L'invention permet ainsi d'assembler des structures d'objets, dans cet exemple des agrégats 21-24 d'objets 11 d'un premier type avec des agrégats 25-28 d'objets 12 d'un deuxième type, sans que les différents types d'objets situés dans un même plan de lévitation acoustique n'entrent en contact direct les uns avec les autres et de sorte qu'un contact puisse dans cet exemple être établi via la membrane poreuse 4.
Une telle membrane 4 permet notamment de contrôler les interactions entre les objets 11 et 12, à travers les pores 9 qui peuvent constituer des passages pour des connexions du type axones lorsque les objets 11 et 12 sont des neurones primaires. De nombreuses variantes peuvent être apportées au dispositif qui vient d'être décrit et à sa mise en œuvre. Par exemple, la hauteur B1 de la cavité 1 et/ou la fréquence de l'onde acoustique stationnaire peuvent être modifiées afin d'augmenter le nombre de nœuds de pression, par exemple de manière à assembler simultanément plusieurs dizaines d'agrégats.
La taille et la forme des objets 11 et 12 peuvent aussi être modifiées, ainsi que la concentration des objets dans la cavité 1, le volume de la cavité 1 ou encore la fréquence de l'onde, afin par exemple de déterminer un nombre d'objets par agrégat ou assemblage ainsi que la taille du ou des assemblages ainsi obtenus. Le choix de l'amplitude et de la fréquence de l'onde acoustique, fixant la magnitude de la force de radiation acoustique peut également être contrôlé pour modifier des dimensions latérale et/ou axiale du ou des assemblages. L'amplitude de la pression acoustique appliquée aux ensembles d'objets peut aussi être contrôlée, par exemple pour forcer une organisation spatiale donnée ou encore pour stimuler les objets et forcer ainsi certaines organisations spatiales et/ou fonctionnalités.
Pour autre exemple, la membrane 4 peut être une paroi en verre ou plus généralement une structure non poreuse, permettant notamment d'utiliser des fluides différents dans chacun des chambres 5 et 6 de la cavité 1. Une telle paroi peut bien entendu être fonctionnalisée et/ou cellularisée et/ou être perméable aux gaz.
D'autres modes de réalisation de l'invention, non limitatifs, sont décrits ci-dessous, étant entendu que la description qui précède s'applique par analogie à ces différents modes de réalisations et à leurs variantes. Dans la description qui suit, ces modes de réalisation sont donc essentiellement décrits selon leurs différences par rapport au mode de réalisation des figures 1 et 2.
Dans le mode de réalisation des figures 3 et 4, la structure de contact 4 comprend non pas une membrane mais deux membranes poreuses 4A et 4B séparant la cavité 1 en quatre chambres 5A, 5B, 6A et 6B. Chacune des chambres 5A, 5B, 6A et 6B comprend des objets 31, 32, 33 et 34, respectivement, de nature différente. Un tel dispositif permet de former des assemblages complexes, en l'occurrence en doublant les types d'objets par rapport au dispositif de la figure 1.
Plus généralement, la structure de contact 4 peut donc être configurée pour compartimenter la cavité de lévitation acoustique en plusieurs chambres indépendantes, avec des milieux de culture différents, selon le besoin. Cela permet notamment de maintenir en lévitation acoustique et de cultiver en trois dimensions un type cellulaire par chambre, cela dans une unique puce acousto-fluidique.
En contrôlant la fréquence des ondes acoustiques émises et/ou la forme du réflecteur, et par conséquent le motif spatial du champ acoustique généré dans la cavité, des objets cellulaires en lévitation peuvent être amenés au contact d'une structure de contact telle qu'une membrane, soit au début de la culture soit au cours de la culture.
Dans ces différents exemples, différentes formes symétriques ou asymétriques de réflecteur s peuvent être mises en œuvre afin de favoriser une organisation spatiale donnée des agrégats d'objets en lévitation acoustique, par exemple une organisation en feuillets, en structures sphéroïdes ou ovoïdes, en anneaux, ou encore en lobes indépendants.
La ou les membranes de la structure de contact peuvent être de nature physico-chimique variée, par exemple être formées d'un hydrogel, d'un élastomère ou encore d'un matériau inorganique, et/ou peuvent comprendre des textures de taille micrométrique ou nanométrique.
L'utilisation de membranes de porosité contrôlée permet de contrôler d'une part l'auto- assemblage de différents agrégats, notamment sphéroïdes, et ainsi de reconstruire des ensembles multicellulaires complexes, et d'autre part la nature des interactions entre des agrégats de nature variée. Il est par exemple possible de contrôler des échanges de solutés, notamment avec des pores de membrane dont la taille est inférieure au micromètre, des extensions cellulaires incluant des axones de neurones, notamment avec une porosité comprise entre 1 pm et 5 pm, ou encore des échanges de cellules ou objets, notamment avec une porosité supérieure à 5 pm. Par ailleurs, la ou les chambres délimitées par une ou plusieurs membranes, ou plus généralement par une structure de contact pouvant être autrement constituée, peuvent être utilisées uniquement pour des étapes initiales de structuration, c'est-à-dire d'assemblages d'objets, ces assemblages pouvant ensuite être cultivés de manière conventionnelle, par exemple en milieu liquide ou dans un hydrogel. Alternativement, le dispositif de l'invention peut être utilisé pour réaliser une culture au long terme en lévitation acoustique.
Dans le mode de réalisation des figures 1 et 2, la force de radiation acoustique transversale est générée par activation sélective d'éléments piézoélectriques du transducteur 2. Cette force peut bien entendu être générée à l'aide d'un autre type d'organe de contrôle de champ acoustique, par exemple avec une lentille holographique acoustique. De manière connue en soi, une lentille holographique acoustique peut être codée sur plusieurs fréquences. Ainsi, une première fréquence peut être utilisée pour organiser les objets sous forme d'agrégats de la manière illustrée sur la figure 1 et une deuxième fréquence pour ramener et maintenir ces agrégats contre la structure de contact 4 et former des assemblages tels qu'illustrés sur la figure 2. Plus généralement, le système de génération d'ondes produisant les forces de radiation acoustique axiale et transversale peut comprendre un ou plusieurs transducteurs ou combinaisons de transducteurs de différents types et/ou positionnés de manière axiale et/ou transversale.
Un autre type de structure de contact est illustré sur les figures 5 et 6.
En référence à la figure 5, le dispositif comprend une structure de contact comportant un réseau d'éléments de contact 40 qui présentent chacun une géométrie allongée le long de la direction axiale Al de la cavité 1.
Dans cet exemple non limitatif, chacun des éléments de contact 40 a une géométrie cylindrique de manière à former une surface externe 41 s'étendant autour d'une direction A2 parallèle à la direction axiale Al de la cavité 1.
De manière analogue au mode de réalisation des figures 1 et 2, le système de génération d'ondes acoustiques du dispositif de la figure 5 comprend lui aussi un transducteur ultrasonore 2 pourvu d'éléments piézoélectriques 2C organisés en matrice et un réflecteur 3 s'étendant chacun dans un plan transversal de la cavité 1 de manière à pouvoir déplacer des objets 42 présents dans la cavité 1.
A partir d'un état initial, non représenté, dans lequel les objets 42 sont en suspension dans le fluide, la force de radiation acoustique axiale résultant de l'onde stationnaire générée par le transducteur 2 entraîne un positionnement des objets 42 sous forme d'agrégats tel qu'illustré sur la figure 5.
Les agrégats d'objets 42 se forment dans cet exemple particulier sur trois nœuds de pression formés par l'onde stationnaire, les objets 42 présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide, transversalement en regard d'éléments piézoélectriques 2C activés, dans cette configuration à distance des éléments de contact 40.
De manière analogue au mode de réalisation des figures 1 et 2, l'activation des éléments piézoélectriques 2C est ensuite modifié pour produire une force de radiation acoustique transversale entraînant un déplacement des agrégats autour des éléments de contact 40 tel qu'illustré sur la figure 6, de manière à former dans cet exemple des assemblages sphéroïdes pouvant ainsi être cultivés.
Les éléments de contact 40 peuvent êtres de différentes natures physico-chimiques et géométriques. Ils peuvent par exemple être pleins ou creux, perméables ou non, électroactifs ou non, ce qui peut permettre notamment de perfuser, stimuler, monitorer et/ou échantillonner les assemblages de façon contrôlée.
Ainsi, dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 peuvent former des électrodes prévues pour mesurer ou imposer une activité électrique. Des éléments de contact 40 électro-actifs et/ou conducteurs permet notamment de modéliser un phénomène de vascularisation, avec stimulation électrique et enregistrement de l'activité électrique des assemblages d'objets 42.
Dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 peuvent être creux et/ou poreux, par exemple afin de pouvoir injecter et piéger dans les éléments de contact 40 et perfuser dans les assemblages d'objets 42 des solutés tels que des composés ou agents biologiques et physiques, des cellules ou encore des virus. La nature de la diffusion/migration de tels solutés peut être contrôlée à travers la porosité des éléments de contact 40.
De telles variantes peuvent être mises en œuvre ou combinées avec d'autres types de structures de contact, par exemple une ou plusieurs membranes 4 telles que décrites ci- dessus en référence aux figures 1 à 4.
Plus généralement, la structure de contact du dispositif de l'invention peut fonctionnalisée de façon à modifier l'interaction entre des objets cellulaires assemblés sur la structure de contact.
De plus, la fonctionnalisation de la structure de contact peut comprendre un greffage d'objets sur une ou plusieurs surfaces de la structure de contact et/ou à l'intérieur de la structure de contact, par exemple à l'intérieur d'éléments de contact 40 tels qu'illustrés sur les figures 5 et 6. Les objets greffés peuvent être des particules conférant de nouvelles propriétés à la structure de contact, par exemple en termes de conductivité électrique, magnétique ou encore acoustique, des substances bioactives influençant le développement des objets cellulaires, ou encore des cellules, par exemple endothéliales ou astrocytaires, ou autres organismes vivants.
Dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 du dispositif des figures 5 et 6 peuvent être formés par un hydrogel durci, par exemple par photopolymérisation confocale. Ces éléments de contact 40 peuvent comprendre des objets cellulaires ou de fonctionnalisation, tels que ceux décrits ci-dessus, piégés dans l'hydrogel formant ces éléments de contact 40. Bien entendu, de tels éléments de contact peuvent avoir toute géométrie tridimensionnelle plus ou moins complexe, formant par exemple une structure en treillis ou autre.
L'invention permet de réaliser de nombreuses applications incluant la reconstruction d'éléments tissulaires complexes, la modélisation d'interactions de plusieurs organes en série, par exemple d'interactions de différentes zones du cerveau, de mise en série ou en parallèle de modèles d'organes, etc. Entre autres exemples d'applications, l'invention permet de faire de la reconstruction tridimensionnelle de voies neuro-anatomiques ou de modèles tridimensionnels de barrières tissulaires du type hémato-encéphalique ou placentaire. Dans le contexte des neurosciences, l'anisotropie de la porosité, par exemple des trous coniques, de membranes permettrait de contrôler la direction de croissance d'axones et/ou nerfs d'un organoïde vers l'autre. Pour autre exemple, des interfaces biologiques complexes peuvent être modélisées par cellularisation de membranes, poreuses ou non, notamment par ensemencement préalable des membranes avec des cellules d'intérêt.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif destiné à assembler des objets (11, 12, 31-34, 42), comprenant : une cavité (1) configurée pour recevoir un fluide et les objets (11, 12, 31-34, 42), un système de génération (2) configuré pour générer dans la cavité (1), le long d'une direction axiale (Al), une onde acoustique stationnaire de manière à produire une force de radiation acoustique axiale apte à positionner les objets (11, 12, 31- 34, 42) sur des nœuds (N1-N4) et/ou des anti-nœuds de pression formés par l'onde acoustique, caractérisé en ce qu'il comprend une structure de contact (4, 40) formant une ou plusieurs surfaces (7, 8, 41) s'étendant le long de la direction axiale (Al) et en ce que le système de génération (2) est configuré pour exercer une force de radiation acoustique transversale apte à déplacer les objets (11, 12, 31-34, 42) en direction de la ou des surfaces (7, 8, 41) de la structure de contact (4, 40).
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la structure de contact comprend une ou plusieurs membranes (4, 4A, 4B).
3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la cavité (1) comprend plusieurs chambres (5, 6, 5A, 5B, 6A, 6B) délimitées par une ou plusieurs desdites membranes (4, 4A, 4B), chacune des chambres (5, 6, 5A, 5B, 6A, 6B) comprenant de préférence une partie respective des objets (11, 12, 31-34).
4. Dispositif selon la revendication 2 ou 3, dans lequel une ou plusieurs desdites membranes (4, 4A, 4B) sont poreuses.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel une ou plusieurs desdites surfaces (41) formées par la structure de contact (40) sont des surfaces s'étendant chacune autour d'une direction (A2) respective, cette direction (A2) étant de préférence parallèle ou oblique par rapport à ladite direction axiale (Al).
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la structure de contact (4, 40) comprend ou forme une ou plusieurs électrodes.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant des éléments, tels que des cellules biologiques, reliés à la structure de contact (4, 40) de manière à autoriser des interactions entre ces éléments et un ou plusieurs desdits objets (11, 12, 31- 34, 42) lorsque ceux-ci sont déplacés en direction des surfaces (7, 8, 41) de la structure de contact (4, 40).
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le système de génération (2) comprend un ou plusieurs transducteurs piézoélectriques et/ou ultrasonores qui peuvent comprendre plusieurs éléments (2A, 2B, 2C) organisés de manière matricielle et/ou une ou plusieurs lentilles holographiques acoustiques.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel lesdits objets (11, 12, 31-34, 42) comprennent des objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les nœuds de pression (N1-N4) et/ou des objets présentant un contraste acoustique négatif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les anti-nœuds de pression.
10. Procédé d'assemblage d'objets (11, 12, 31-34, 42) à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant une génération de la force de radiation acoustique axiale de manière à positionner les objets (11, 12, 31-34, 42) sur les nœuds (N 1- N4) et/ou les anti-nœuds de pression et une génération de la force de radiation acoustique transversale de manière à déplacer les objets (11, 12, 31-34, 42) en direction de la ou des surfaces (7, 8, 41) de la structure de contact (4, 40).
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