EP4593625A2 - Natives funktionales kartoffelprotein und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Natives funktionales kartoffelprotein und verfahren zu seiner herstellung

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Publication number
EP4593625A2
EP4593625A2 EP23817013.8A EP23817013A EP4593625A2 EP 4593625 A2 EP4593625 A2 EP 4593625A2 EP 23817013 A EP23817013 A EP 23817013A EP 4593625 A2 EP4593625 A2 EP 4593625A2
Authority
EP
European Patent Office
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protein
potato
kda
proteins
potato protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP23817013.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nico REINS
Fabian GRUBER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Emsland Staerke GmbH
Original Assignee
Emsland Staerke GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Emsland Staerke GmbH filed Critical Emsland Staerke GmbH
Publication of EP4593625A2 publication Critical patent/EP4593625A2/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof

Definitions

  • the invention relates to a potato protein with a molecular weight of 10 - 120 kDa (according to SDS-Page primary structure), as well as a process for its production and its use in food.
  • the potato fruit water that accrues when cleaned potatoes are chopped, such as in potato starch production, represents a challenge for the industry, as it cannot be disposed of in sewage treatment plants or discharged into water bodies without further treatment. Separation of the proteins contained (approx. 2%) is essential. Precipitation often takes place by means of a strong increase in temperature to > 90 °C and/or pH shift and subsequent isolation of the coagulated proteins by mechanical separation. The proteins obtained in this way no longer have any functional properties (no functionality, no solubility, no gelling or foaming), as the tertiary structure of the proteins is irreversibly destroyed during thermal coagulation.
  • protein fractions isolated in this way have a strong aftertaste and often contain a high proportion of anti-nutritional substances, in particular a high proportion of glycoalkaloids. All of this makes their use in the food industry unattractive and, due to the high proportion of glycoalkaloids, also prohibited by law.
  • plant proteins in human nutrition is becoming increasingly important, which can be attributed to various reasons. Vegetarian and vegan diets are becoming increasingly popular, and the use of animal proteins is sometimes undesirable for religious, ethical or health reasons (e.g. allergies to milk proteins, etc.). In addition, animal proteins have a shorter shelf life when moist. However, plant proteins often have the disadvantage that they are not complete in terms of their amino acid spectrum and therefore have a lower biological value. Potato protein has one of the best values among plant proteins, a high nutrient content, high digestibility and a balanced amino acid spectrum that is comparable to milk and egg protein. The high proportion of lysine in potato protein makes it a good substitute for low-lysine proteins such as those from grains.
  • potato protein - which here refers to the proteins found in potato tubers - consists of three main groups: patatin (MW: 40-45 kDa - as well as a dimer of approx. 88 kDa, represents approx. 40 wt.% of the soluble tuber protein), protease inhibitors (MW: 7-21 kDa, approx. 50 wt.% of the soluble tuber protein) and higher molecular weight proteins (MW > 40 kDa, approx. 10 wt.% of the soluble tuber protein).
  • Patatin also known as tuberin, is a group of glycoproteins and has lipid acyl hydroxygenase activity. It has an isoelectric point of around 4.9. It is temperature-sensitive and irreversibly loses its tertiary structure at 45 °C and the alpha-helical part of patatin denatures at 55 °C (see p. 76, 2.2. “Patatin”). Precipitation in acidic conditions has a similar effect. It has a biological value like egg albumin or lysozyme, has antioxidant properties and better emulsifying properties than soy protein. In contrast to most plant proteins, patatin has a high proportion of the essential amino acid lysine and sulfur-containing amino acids.
  • protease inhibitors also called tuberinin
  • tuberinin storage proteins.
  • the higher molecular proteins of this very diverse group contain lectins, phenoloxidases and lipoxygenases and some have peptidase or carboxypeptidase inhibitor properties.
  • Low to undenatured potato protein has good functional properties such as solubility in aqueous and alcoholic solutions (globulins dissolve in alcoholic solutions), gel and foam formation, as well as good emulsifying properties, which, in addition to its nutritional properties, makes it attractive for use in food.
  • the functional properties are strongly influenced by the production conditions of the protein (heat, pH value, salts, shear forces, stress), as these can lead to denaturation and thus loss of functionality.
  • heat, pH value, salts, shear forces, stress As on page 87 of “Advances in Potato Chemistry and Technology” under 2.3.3. Foaming Properties explains, ultrafiltration can be used to improve the foaming ability of potato protein (v. Koenigsveld 2002). “Potato Chemisty” also explains that high mechanical stress leads to denaturation of potato protein.
  • proteins can also be denatured chemically.
  • a common means is to adjust the pH value.
  • the isoelectric point of a protein is the pH value at which the total charge of the protein is zero. This minimizes the repulsive forces of the charges, which is why the proteins can aggregate and coagulate so that their solubility is at the isoelectric point at the is lowest. At pH values below and above this value, the solubility of the protein increases again. Extreme pH conditions that lead to a high positive or negative charge of the protein can also lead to strong intramolecular repulsion and thus denaturation (see S. Damoong, "Amino Acids, peptides and proteins” in Fennema's Food Chemistry, 2008, 5th Edition, CRC Books; J. Culbertson, "Proteins functional properties” in Food Chemistry: Principles and Applications, 2012, 3rd Edition, Science Technology).
  • electrostatic interactions can also be exploited to precipitate proteins using organic solvents that are less polar than water. This effect can be used for the precipitation of proteins in extractions or for purification (Z. Ustunol, 4.2.2.2 Organic-solvent-induced denaturation in “Applied Food Protein Chemistry” 2015, 1st Edition, Wiley Blackwell).
  • salts also has a strong influence on protein properties.
  • Ustunol describes that protein solubility is increased in dilute salt solutions with low ionic strength ( ⁇ 0.2 M) regardless of the type of salt. At high salt concentrations (> 1 M), however, the opposite effect occurs.
  • the salt interacts with the water so that protein-protein interactions are strengthened, which leads to precipitation of the proteins.
  • the salt concentration at which precipitation occurs depends on the type of protein.
  • Osborne was able to demonstrate these effects as early as 1905 (see T. B. Osborne, G. F. Campbell, J. Am. Chem. Soc. 1896, 18, 575-582; T. B. Osborne, I. F. Harris, Am. J. Phys. 1905, 13, 35-44 and T. B. Osborne, “The Plant Proteins” in Results of Physiology 1910, 10, 47-215) to obtain the so-called Osborne fractions from grain protein, which could be obtained according to their different solubilities: While the albumins can be extracted with water, Globulins can be extracted with saline solutions. Prolamins can be extracted with ethanol (70%). The glutelins, on the other hand, remain behind. The name of these so-called Osborne fractions has become established throughout the entire range of plant proteins.
  • the starting material (with shell), the protein manufacturing process and the conditions of further processing into a food product have an immense influence on the condition, functionality and composition of the protein obtained. All processing steps therefore have an impact on the properties of the final protein product. All methods involving heating, such as pasteurization, drying, sterilization, blanching, cooking and others, ensure complete or partial denaturation of the protein, which begins at temperatures as low as 40 °C. Due to the attractive properties of potato protein and the increased demand for proteins mentioned at the beginning, a large number of different processes for producing potato protein are now known. The first patents for the production of potato protein were registered as early as 1997.
  • the proteins contained in potato juice are often isolated by coagulation by adjusting the temperature to > 60 °C and/or setting the pH to ⁇ 6 and then mechanically separating the coagulated protein, which, as stated in "Advances in Potato Chemistry and Technology", is extremely detrimental to the properties of solubility, water-binding capacity, emulsifying capacity, foaming capacity and stability.
  • the proteins obtained in this way are therefore not very suitable for use in foods for human consumption because, as already explained, they have hardly any functionalities (solubility, foaming, gelling, etc.) and also have a strong off-taste. They have a large particle size, which gives an unpleasant, sandy mouthfeel, a coarse, grainy structure of the proteins and limits the ability to form a film.
  • WO 2017/142406 describes an improvement in protein properties (lower hardness, smaller particles, lower density, less off-taste) when the coagulated potato protein is washed to a conductivity of the washing water of ⁇ 1 mS/cm before drying.
  • an improvement in protein properties such as solubility and water-binding capacity can be achieved by physically reducing the particle size of the protein, as described in WO 2016/133448, or by extraction steps with low molecular weight alcohols such as ethanol or propanol-water mixtures, as set out in WO 2020/171708.
  • the precipitation of proteins using organic solvents described above is used.
  • the so-called Despite the so-called Despite the achievable sensory improvements of coagulated potato proteins and the resulting application in food, the strong loss of functionality of the proteins caused by denaturation remains irreversible.
  • WO 2014/011042 describes the fractionation of proteins from potato fruit fluid into a high molecular weight and a low molecular weight fraction using a functionalized carrier material by means of adsorption and desorption steps of the individual fractions.
  • WO 2008/069650 describes the isolation of proteins and the protease inhibitor from potato amniotic fluid using expanded bed chromatography, with a separation into two protein fractions.
  • pure native potato proteins with high functionality can be obtained, but not a total fraction.
  • Chromatographic processes are associated with high process costs, difficult up-scaling and high technical and energy expenditure, which is why processes without these steps are of great interest.
  • WO 2018/183770 describes the isolation of a dispersible potato protein powder for use in food, feed and beverages with a protein content of 30 - 91%, a proportion of a-glycoalkaloids ⁇ 300 ppm, an ash content of 1 - 20% and a Particle size of 10 - 100 pm. It includes the following steps:
  • WO2020/242299A1 describes the production of a potato protein from peeled potatoes, whereby the protein isolation, in addition to isoelectric precipitation, coagulation, microfiltration and ultrafiltration, can also include the step of diafiltration against a salt solution with a conductivity of 5 - 20 mS/cm.
  • Peeling is said to produce a cleaner protein with reduced microbial load and glycoalkaloid content, meaning fewer purification steps are required.
  • the protein obtained in this way has a different protein composition than that of peeled tubers.
  • the potato patatin which is contained in a large proportion of potato protein, can split fatty acids from triglycerides.
  • the selectivity of this reaction depends heavily on the chain length and the structure of the fatty acids, in particular from P. Pinsirodom, K. L. Parkin, J. Am. Oil Chem. Soc. 1999, 76, 1119-1125 and C. Anderson, P. Pinsirodom, K. L. Parkin, J. Food. Biochem. 2002, 26, 63-74.
  • lipases The basic interaction of lipases with triglycerides and the dependence of their selectivity on the chain length of the fatty acids is a principle that has been known for a long time (see textbooks such as “Advances in Potato Chemistry and Technology”, p.78, 2nd paragraph). , as can also be seen from EP 232933A1 or Römpp, keyword “lipases” 11th edition.
  • patatin is only used in the literature with longer-chain fats (e.g. US 2017/0196243), which it cannot split.
  • the splitting of triglycerides can also be used to deliberately create a flavor note by specifically using fats with shorter chain lengths, as shown in US 2009/053191 and by Spelbrink et al. (REJ Spelbrink, H. Lensing, MR Egmond, MLF Giuseppin, Appl. Biochem. Biotechnol. 2015, 176, 231- 243).
  • patatin does not break down triglycerides and thus does not cause any taste changes
  • Preferred oils in which patatin does not break down triglycerides and thus does not cause any taste changes are listed in the publication: “Fatty Acids Composition of Vegetable Oils and Its Contribution to Dietary Energy Intake and Dependance of Cardiovascular Mortality on Dietary Intake of Fatty Acids” (J. Orsavova, et al., Int. J. Mol. Sei. 2015, 16, 12871-12890), to which reference is made in full.
  • patatin has this lipase activity was first described in 1971 by Galliard (T. Galliard, Biochem. J. 1971 , 121, 379-390).
  • the object of the invention is to obtain a native, functional potato protein of natural structure from potato fruit fluid in a simple manner on an industrial scale.
  • a typical potato protein according to the invention with a molecular weight of 10 - 120 kDa (according to SDS-Page primary structure) is available through:
  • the liquid potato protein ultrafiltration retentate can be converted into dried potato protein by gentle drying. Spray drying, lyophilization, vacuum drying, etc. are suitable for this. It can also be added to other substances in liquid form.
  • the highly functional potato protein product obtained in this way on an economical scale is of high quality and has advantageous functional properties for food applications (e.g. gelling, emulsion formation and foam formation). However, it can also be used as an adhesive for special applications - for pharmaceutical carrier materials, such as cellulose and its derivatives.
  • the potato protein according to the invention also offers the ability to hot gel with high viscosity. The water-binding ability of the gel creates a better mouthfeel and a softer texture.
  • the taste of the protein was also greatly improved by this treatment.
  • the invention relates to a dried native, functional potato protein with a molecular weight of 10 - 120 kDa (according to SDS-Page primary structure), which can be produced from potato fruit water, which is obtained by the mechanical solid/liquid separation of chopped, cleaned potato parts, characterized by: a) protein content of at least 84% by weight atro b) moisture content of max. 10% by weight c) foam volume 1400 - 2000 mL d) foam stability of at least 90% e) product solubility/protein solubility in tap water of 75 - 100% f) maximum gel strength of at least 1000 g) ash content of max.
  • the protein according to the invention has a molecular weight of 10 - 120 kDa (according to SDS-PAGE primary structure). It has three main fractions, the first main fraction having a molecular weight of 10 to 20 kDa, the second main fraction having a molecular weight between 25 and 40 kDa and the third main fraction having a molecular weight of about 66 kDa according to SDS-PAGE primary structure. According to HPLC chromatography, at least 70% of the proteins have a molecular weight of 3 - 182 kDa. The different molecular size ranges detected are due to the different analytical methods. While with SDS-PAGE the mass of the protein is determined in its primary structure, with HPLC chromatography the volume of the proteins is determined in their quaternary structure.
  • the protein according to the invention is obtainable by: a) introducing chopped, cleaned potato parts; b) mechanically separating the solids from the chopped potatoes to produce potato fruit water and solids; c) adjusting the pH of the potato fruit water to a pH between 6 and 9; d) separating insoluble components and suspended matter by means of centrifugal separation; e) ultrafiltration of the pH-adjusted potato fruit water; f) diafiltration of the ultrafiltration retentate to reduce the electrical conductivity of the retentate solution by 50 - 90%, preferably 65 - 90%, particularly preferably 75 - 85%.
  • the dried protein according to the invention is obtainable by adjusting the pH after the mechanical solid/liquid separation to a pH of 6 - 9, preferably 6.5 - 8.2, particularly preferably 6.9 - 7.5.
  • the dried protein according to the invention is obtained by drying by at least one of the process steps of spray drying, lyophilization, vacuum drying, freeze drying.
  • the protein according to the invention is obtainable in that the ultrafiltration membrane is a plastic or ceramic membrane with a cut-off of 3 - 150 kDa, preferably 5 - 120 kDa, particularly preferably 10 - 100 kDa.
  • the protein according to the invention is characterized in that the ultrafiltration retentate is adsorbed with adsorbents selected from activated carbon, bentonites, polymeric adsorbents or derivatives of the adsorbents treated.
  • adsorbents selected from activated carbon, bentonites, polymeric adsorbents or derivatives of the adsorbents treated.
  • Typical polymeric adsorbents are polystyrene/divinylbenzene resins, phenol-formaldehyde resins, derivatives of the adsorbents and combinations thereof which decolorize and remove off-flavors.
  • the polymeric adsorbent used is a polystyrene/divinylbenzene resin.
  • the resins Amberlite XAD 761, Amberlite FPX 68, Diaion HP 20, Sepabeads SP 70, Purosorb PAD 550 Polymeric adsorbent, activated carbon, cellulose-based adsorbents, gelatin, cellulose-based adsorbents, tannins, are also preferred for reducing off-flavors - polystyrene/divinylbenzene resins, polyphenol-formaldehyde resins and combinations thereof can also be used.
  • a protein according to the invention can be produced by gently sterilizing the ultrafiltration retentate, for example by pasteurization with microwaves or HTST pasteurization (High Temperature Short Time), PEF sterilization (Pulsed Electric Fields), HPP pasteurization (High Pressure Pasteurization).
  • microwaves or HTST pasteurization High Temperature Short Time
  • PEF sterilization Pulsed Electric Fields
  • HPP pasteurization High Pressure Pasteurization
  • the protein according to the invention is obtainable by:
  • Adjustment of the pH value to 6 - 9, preferably 6.5 - 8.2, particularly preferably 6.9 - 7.5.
  • the protein according to the invention is a component of a food or additive, a dietary food or food additive for human or animal consumption.
  • the protein according to the invention is a component of foods or food additives, of dietetic foods or food additives for human or animal consumption, both as a solution and as a solid.
  • the protein according to the invention is part of an adhesive. In one embodiment of the invention, the protein according to the invention is part of a mixture with other vegetable proteins, preferably legume proteins, such as pea protein, bean protein, field bean protein, lentil protein or soy protein, lupine protein or mung bean protein or mixtures of these.
  • legume proteins such as pea protein, bean protein, field bean protein, lentil protein or soy protein, lupine protein or mung bean protein or mixtures of these.
  • the potato fruit water from washed potatoes with peel is obtained after solid/liquid separation of crushed, cleaned potato parts, for example as a side stream from potato starch production.
  • the raw material potato is cleaned of sand, stones and plant residues and crushed, for example using a grater, usually with the addition of a reducing or antioxidant, such as sodium hydrogen sulfite, or under an inert gas atmosphere.
  • a reducing or antioxidant such as sodium hydrogen sulfite
  • Centrifugation separates the starch into a solid phase consisting of starch and fibers, and potato fruit water as a liquid phase with water-soluble components such as proteins, sugars, amino acids, organic acids and salts, etc. These steps are common in this or a similar manner for the extraction of starch from potatoes (see, for example: J. BeMiller, R. Whistler, Starch: Chemistry and Technology, 3rd edition, Academic Press, pp. 522-555).
  • the native functional potato protein For a possible production process of the native functional potato protein from potato fruit water, its pH value is first adjusted to 6 - 9, preferably 6.5 - 8.2, particularly preferably 6, using an aqueous lye that is safe for foodstuffs, for example caustic soda, potassium hydroxide or calcium hydroxide .9 - 7.5 set. Insoluble components and suspended matter are then separated using centrifugal separation. Through these first process steps, the potato fruit fluid loses its cloudiness and becomes a clear protein solution. By ultrafiltration of the separated clear protein solution, a concentration of the proteins in the liquid ultrafiltration retentate, the protein solution, is achieved. In one embodiment, the concentration factor is approximately 10, although a higher or lower protein concentration is also possible, depending on conditions such as energy costs.
  • Ceramic and plastic membranes are preferred.
  • a plastic membrane with a cut-off of 3 - 150 kDa, preferably 5 - 120 kDa, particularly preferably 10 - 100 kDa is suitable.
  • Membrane filtration is carried out at low pressures of 1 - 3 bar. Too high a pressure is avoided, as this mechanical stress negatively affects the functionality of the proteins.
  • undesirable flavors and anti-nutritional substances including glycoalkaloids, can be removed from the protein solution using adsorption techniques.
  • Activated carbon or bentonite adsorptions are particularly suitable, but other adsorbents as mentioned above can also be used.
  • the ultrafiltration retentate is diafiltered until the electrical conductivity is reduced by 50-90%, preferably 65-90%, particularly preferably 75-85%.
  • the diafiltration can be carried out with fully deionized water, distilled water, process water or tap or process water, the water used having a conductivity of 5 pS/cm - 5000 pS/cm, preferably 10 - 50 pS/cm or even 5 - 50 pS /cm can have.
  • the resulting protein solution can optionally be sterilized using gentle procedures.
  • gentle procedures For example, pasteurization with microwaves, HTST pasteurization (High Temperature Short Time), PEF sterilization (Pulsed Electric Fields) or HPP pasteurization (High Pressure Pasteurization) are suitable here.
  • the protein solution can be dried by spray drying or other gentle drying processes, e.g. lyophilization or vacuum drying. But further use of the protein solution is also conceivable.
  • the potato protein according to the invention with a molecular weight of 10 to 120 kDa is characterized by its good emulsifying and foaming properties. Additionally, it is hot-swelling, allowing for better processing and easier protein enrichment. The low viscosity when cold also leads to good processability, while many other commercially available proteins already have a significantly higher viscosity. The superior gelation properties when heated are similar to animal proteins and make the invention Potato protein is very interesting for use in meat substitute products, among other things.
  • Fig. 1 Process diagram of production example 1.
  • Fig. 2 HPLC chromatogram of the potato protein according to the invention and a protein standard.
  • Fig. 3 HPLC chromatogram of the potato protein according to the invention and Solanic 300®.
  • Fig. 4 HPLC chromatogram of the potato protein according to the invention and Solanic 200®.
  • Fig. 6 DSC diagrams for thermally treated and thermally untreated potato proteins.
  • Fig. 7 Viscosity measurement according to Anton Paar of the potato protein according to the invention in comparison with a sample treated with calcium chloride.
  • Fig. 8 Gel strength measurements of the potato protein according to the invention in comparison with a sample treated with calcium chloride.
  • Fig. 9 Process diagram according to claim 1.
  • Example 1 Production of highly water-soluble, functional potato protein:
  • potatoes were cleaned and finely chopped.
  • the suspension was subjected to gravity separation (centrifugation) and the supernatant was further used as protein-rich amniotic fluid for protein recovery.
  • the protein-containing, cloudy solution was adjusted to a pH of 7.0 to 8.0 using aqueous sodium hydroxide solution and centrifuged again, removing fine suspended particles from the solution.
  • the purified proteinaceous clear solution was ultrafiltered using a 100 kDa polyvinylidene fluoride membrane at a transmembrane pressure of 2.0 bar and a differential pressure of 1.0 bar.
  • the protein according to the invention remained in the ultrafiltration retentate, while salts, sugars and amino acids remained in the ultrafiltration permeate.
  • Example 1 represents an embodiment of the invention, but is in no way limited to this.
  • potatoes were cleaned and finely chopped.
  • the suspension was subjected to gravity separation (centrifugation) and the supernatant was further used as protein-rich amniotic fluid for protein recovery.
  • the protein-containing, cloudy solution was adjusted to a pH of 7.0 to 8.0 using aqueous sodium hydroxide solution and centrifuged again, removing fine suspended particles from the solution.
  • the purified protein-containing, clear solution was ultrafiltered using a 100 kDa polyvinylidene fluoride membrane at a transmembrane pressure of 2.0 bar and a differential pressure of 1.0 bar.
  • the protein according to the invention remained in the ultrafiltration retentate, while salts, sugars and amino acids remained in the ultrafiltration permeate.
  • Example 2 represents an embodiment of the invention, but is in no way limited to this.
  • the potato protein according to the invention according to Example 1 was examined using an HPLC from Knauer.
  • An HPLC Xbridge BEH SEC 200A, 3.5 from Waters was used as the column and eluted with an aqueous solution of 0.02 M Na2HPO4/NaH2PO4 with pH 7.
  • the following standards were used by Sigma-Aldrich: 670 kDa - thyroglobulin 150 kDa - gamma globulin
  • UV absorption at 214 nm was used for detection.
  • the measured HPLC chromatogram is shown in FIG. 2, where the time in minutes is plotted against the absorption in absorbance units.
  • the protein standard (broken lines) is with relatively sharp peaks at 10.84 min for thyroglobulin; 14.12 min for gamma globulin;
  • volume corresponds to the peak area of the signals.
  • An evaluation of the volume distribution showed that the relative peak ratios for both the protein standard and the potato protein according to the invention do not change even at different detector wavelengths. Therefore, an approximately semi-quantitative statement about the quantity distribution and a conclusion from the volume distribution to their molecular weights is possible.
  • the volume of the proteins in the potato protein according to the invention can therefore be semi-quantitatively assigned to the molecular weights: Molar masses and retention times of the potato protein according to the invention:
  • the first characteristic signal at retention times of 8.9 to 11.7 min can be assigned to a molecular weight of 697 kDa at its maximum at 10.7 min.
  • the main fraction (30% of the total fraction, retention time: 13.41 - 16.32 min) can be assigned to molecular weights of 43.5 kDa to 182.0 kDa.
  • the potato protein according to the invention is made up of a mixture of smaller proteins (retention time: 16.3 - 30.0 min). The largest proportion within this low molecular weight range is made up of proteins with molecular weights of 5.2 to 13 kDa.
  • FIG. 3 shows an HPLC chromatogram of the potato protein according to the invention (solid line) and of the potato protein Solanic 300® from AVEBE (broken line) available on the market, the time in minutes being plotted against the absorption in absorbance units.
  • Solanic 300® is a single fraction (99%, retention time: 15.5 - 27.4 min) of a specific molecular weight range.
  • Fig. 4 shows an HPLC chromatogram of the potato protein according to the invention (solid line) and the commercially available product Solanic 200® from AVEBE (broken line), with the time in minutes plotted against the absorption in absorbance units. While the protease inhibitor fraction (PI fraction) is missing in Solanic 200®, it is still present in the potato protein according to the invention, which represents a water-soluble total fraction of the potato protein.
  • PI fraction protease inhibitor fraction
  • the potato protein according to the invention represents a water-soluble total fraction of the potato protein. This makes it the only commercially and economically producible highly functional total potato protein fraction. To date, only functional individual fractions or coagulated total protein fractions with significantly limited functionality are available.
  • Total potato protein here is understood to mean a total fraction of water-soluble proteins.
  • Other commercial potato proteins such as KMC's Protafy 130®, could not be examined using HPLC due to their low solubility.
  • the potato protein according to the invention was also examined using SDS-Page gel chromatography - see Fig. 5. The selectivity of the method can clearly be seen, as a result of which proteins with a molecular weight > 120 kDa are not present in the product.
  • the HPLC chromatogram three most intense areas can be seen and, according to the SDS page, can be assigned molecular weights of 10 - 20 kDa, 25 - 40 kDa and around 66 kDa.
  • both analysis methods are not comparable in terms of the molecular weights determined, since the proteins are denatured differently in the measurement methods. Nevertheless, both methods show that three protein mixtures are main components of the potato protein according to the invention. According to SDS-Page this corresponds to ranges of 10 - 20 kDa, 25 - 40 kDa and a mixture of around 66 kDa, while according to HPLC chromatography the potato protein according to the invention consists of a protein mixture of 428 - 1627 kDa, the main fraction of 43 - 182 kDa and a mixture of smaller proteins with a majority of 5 - 13 kDa.
  • the discrepancy in the detected molecular sizes is due to the different analytical methods: While the SDS-PAGE determines the mass of the proteins in their primary structure, the HPLC chromatography determines the volume of the proteins. Here, the proteins are still in their quaternary structure.
  • the primary structure of the protein corresponds to its amino acid sequence in an extended form, while in the quaternary structure the protein is present in a spatial structure as a protein complex - thus there is a difference in the existing bonding relationships. For this reason, the stated molecular sizes initially appear very different.
  • Denaturing a protein means that the protein's folding state is changed to a lower-order protein structure.
  • the unfolding of a protein is an energetic balance of various interactions between protein groups and the surrounding medium, so that the matrix in which the protein is dissolved influences the amount of energy absorbed during denaturation.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • Solanic 300® is a mixture of various low molecular weight proteins, which can be summarized as a protease inhibitor fraction (PI fraction).
  • Solanic 200® is a refined patatin in which the protease inhibitors (PI fraction) are almost completely missing. This is reflected in the DSC measurement.
  • Solanic 300® similar to the potato protein according to the invention, absorbs heat from approx. 64 °C, which, however, ends at approx. 83 °C.
  • the temperature profiles generally show that all proteins are significantly different products. In general, larger proteins are denatured more easily, i.e. at lower temperatures, than smaller proteins, which can no longer be denatured after a certain size. Therefore, Solanic 300® has a longer heat absorption because, in contrast to Solanic 200®, it contains the Pl fraction. Based on the significantly longer heat absorption of the potato protein according to the invention, it is clear that it has a different protein fraction in which small proteins are still contained.
  • the solubilities of the dried potato protein according to the invention are strongly dependent on the salt content of the water used for the analysis.
  • Fig. 7 shows tests on the viscosity of the dried potato protein according to the invention (solid line) in comparison to a sample treated with calcium chloride (dotted line), with the time in minutes being plotted against the viscosity in cP.
  • the viscosity profiles were recorded as follows: A 15% solution of the product in demineralized water was prepared.
  • the viscosity even increases to around 350 cP when the maximum temperature of 90 °C is reached, but the gel formed is not stable. During cooling, the gel strength decreases continuously, so that at the end of the measurement it is only about 225 cP and thus significantly lower than that of the potato protein according to the invention.
  • the measurement method involves slowly pressing a plunger into the prepared sample solution, which corresponds to the first peak.
  • force When moving the stamp into the gel, force must be applied until the stamp has completely penetrated the gel.
  • the negative force then corresponds to the retraction of the stamp and the elastic tightening of the gel.
  • the process is then repeated and the stamp penetrates the gel a second time.
  • the maximum force is usually lower in the second process because the gel strength is still affected by the first process. The more similar the peaks are, the greater the elasticity of the gel.
  • the mousse made with the potato protein according to the invention showed a better structure that was airier compared to a mousse made with egg white.
  • the mousse made with the protein according to the invention showed greater storage stability, since the airy structure was still unchanged after 4 days, while the mousse made with egg white hardens.
  • the mousse made with the potato protein according to the invention had a better mouthfeel and melted on the tongue.
  • Another big advantage was that the mousse produced in this way is salmonella-free, whereas the use of fresh eggs can always be associated with the risk of salmonella poisoning.
  • potato protein achieves a smoother structure with a more beautiful chocolate color.
  • the potato protein according to the invention is therefore very suitable as a vegan chicken protein substitute.
  • the potato protein according to the invention is very suitable as a vegan chicken protein substitute.
  • the meringue can also be made by directly using the prepared protein solution without prior drying.
  • Example 10 Food Burgers: 1. Allow TVP to rehydrate for 15 min
  • the potato protein according to the invention formed a very solid gel immediately upon heating. This process could be observed at relatively low temperatures, i.e. when frying the patties, whereas with many other proteins this is only observed upon cooling and even at higher temperatures. As a result, the use of the protein according to the invention made it possible to achieve a significant improvement in product binding, firmness and the meat-like mouthfeel.
  • the gel formation of the potato protein according to the invention is irreversible.
  • the protein solution produced from the potato protein according to the invention can be used to produce an emulsion in vegan burgers.
  • the advantage is that the potato protein according to the invention acts as an emulsifier.
  • the above-mentioned advantages of the dried potato protein according to the invention also apply to the protein in solution.
  • the lipase activity of patatin described above must be taken into account.
  • Vegetable fats and oils have proven to be particularly suitable for this application.
  • Example 11 Textured Vegetable Protein (TVP)
  • the potato protein according to the invention ensured improved stability of the TVPs (textured vegetable proteins) after rehydration, so that they did not become mushy.
  • an improvement in the texture of the TVPs could be achieved, which becomes firmer, more fibrous, more water-containing and therefore more meat-like, which can be attributed to the excellent gel-forming properties of the potato protein according to the invention.
  • the solution of the potato protein according to the invention can be used in combination with a dry mixture of dried protein according to the invention and, if necessary, other ingredients (e.g. flours, starches or fibers).
  • other ingredients e.g. flours, starches or fibers.
  • the benefits are similar to using dried protein.
  • the potato protein according to the invention By using the potato protein according to the invention, a stable foam and a stable solution were formed.
  • the potato protein had good solubility, resulting in a creamy mouthfeel.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kartoffelprotein sowie ein natives funktionales Kartoffelprotein mit einem Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur), herstellbar aus Kartoffelfruchtwasser, das durch die mechanische fest- /flüssig-Trennung von zerkleinerten, gereinigten Kartoffelteilen erhalten wird, mit: a) Proteingehalt von mind. 84 Gew.%atro; b) einem Feuchtegehalt als getrocknetes Protein aufweist: max. 10 Gew.%; c) Produktlöslichkeit/Proteinlöslichkeit in Wasser von 75 -100 %; d) Aschegehalt von max. 3 Gew.%, das herstellbar ist durch a) Zerkleinerung des Pflanzenrohstoffs Kartoffel,; b) mechanische Äuftrennung der Kartoffelmaische in Festphase und Flüssigphase (Kartoffelfruchtwasser); c) pH-Wert-Einstellung auf 6 - 9; d) Ultrafiltration der Flüssigphase; d) Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats; e) optional vor oder nach Schritt d) Entfernung von unerwünschten Geschmacksstoffen mittels Adsorptionstechniken; f) Entkeimung der erhaltenen Protein-Lösung; g) optional Trocknung der Protein-Lösung.

Description

NATIVES FUNKTIONALES KARTOFFELPROTEIN UND VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Kartoffelprotein mit einem Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur), sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung und seinen Einsatz in Lebensmitteln.
1. Technisches Gebiet:
Das bei der Zerkleinerung von gereinigten Kartoffeln anfallende Kartoffelfruchtwasser, wie beispielsweise bei der Kartoffelstärke-Produktion anfallend, stellt eine Herausforderung für die Industrie dar, da eine Entsorgung in Kläranlagen oder die Einleitung in Gewässer ohne eine weitere Behandlung nicht möglich ist. Eine Separation der enthaltenen Proteine (ca. 2%) ist zwingend notwendig. Häufig findet eine Ausfällung mittels starker Temperaturerhöhung auf > 90 °C und/oder pH-Verschiebung statt und anschließender Isolierung der koagulierten Proteine durch mechanische Separation. Die so erhaltenen Proteine weisen keine funktionellen Eigenschaften mehr auf (keine Funktionalität, keine Löslichkeit, keine Gelierung oder Schaumbildung), da die Tertiär-Struktur der Proteine bei der thermischen Koagulation irreversibel zerstört wird. Zusätzlich weisen so isolierte Proteinfraktionen einen starken Nebengeschmack und häufig einen hohen Anteil an antinutritiven Stoffen, insbesondere einen hohen Glykoalkaloidanteil, auf. All das macht ihre Verwendung in der Lebensmittelindustrie unattraktiv und durch den hohen Glykoalkaloid- Anteil auch gesetzlich verboten.
2. Stand der Technik:
Die Nutzung pflanzlicher Proteine in der menschlichen Ernährung gewinnt immer mehr an Bedeutung, was auf verschiedene Ursachen zurückzuführen ist. So verbreitet sich zunehmend die vegetarische und vegane Ernährungsweise und der Einsatz tierischer Proteine ist teilweise aus religiösen, ethischen oder gesundheitlichen Gründen (z.B. Allergien gegen Milcheiweiße etc.) unerwünscht. Zudem besitzen tierische Proteine in feuchtem Zustand eine geringere Haltbarkeit. Pflanzliche Proteine haben jedoch häufig den Nachteil, dass sie nicht vollwertig hinsichtlich ihres Aminosäurespektrums sind und folglich eine geringere biologische Wertigkeit aufweisen. Das Kartoffelprotein besitzt eine der besten Wertigkeiten unter den pflanzlichen Proteinen, einen hohen Nährstoffgehalt, eine hohe Verdaulichkeit sowie ein ausgeglichenes Aminosäurespektrum, das mit Milch- und Ei-Eiweiß vergleichbar ist. Durch den hohen Anteil an Lysin in Kartoffelprotein stellt es so einen guten Ersatz für Lysin-arme Proteine wie denen aus Getreide dar. Das Lehrbuch „Advances in Potato Chemistry and Technology”, Elsevier Inc. 2016, das in der 2. Auflage vorliegt und offensichtlich wegen hoher Nachfrage 2024 bereits in der dritten Auflage erscheinen wird, ist als allgemein bekannter Stand der Technik über Kartoffelproteine anzusehen. Aus Kapitel 4, S. 75 - 104, Potato Proteins, „Functional food Ingredients“ dieses Standardwerkes ergibt sich, dass das Kartoffelprotein - worunter hier die in den Karoffelknollen auffindbaren Proteine verstanden werden, aus den drei Hauptgruppen: Patatin (MG: 40-45 kDa - sowie ein Dimer von ca 88 kDa, stellt ca. 40 Gew.% des löslichen Knollenproteins), den Protease-Inhibitoren (MG: 7-21 kDa, ca. 50 Gew.% des löslichen Knollenproteins) und höher-molekularen Proteinen (MG > 40 kDa, ca. 10 Gew.% des löslichen Knollenproteins) besteht.
Patatin, das auch als Tuberin bezeichnet wird, ist demnach eine Gruppe von Glykoproteinen und weist Lipidacylhydroxygenase-Aktivität auf. Es hat einen isoelektrischen Punkt von ca 4,9. Es ist temperaturempfindlich und verliert ab 45 °C irreversibel die Tertiärstruktur und ab 55 °C denaturiert der alpha-helikale Teil des Patatins (siehe S. 76, 2.2. „Patatin“). Ähnlich wirkt eine Ausfällung im Sauren. Es hat eine biologische Wertigkeit wie Ei-Albumin bzw. Lysozym, besitzt antioxidative Eigenschaften und bessere emulgierende Eigenschaften als Sojaprotein. Im Gegensatz zu den meisten pflanzlichen Proteinen hat Patatin einen hohen Anteil der essentiellen Aminosäure Lysin und schwefelhaltiger Aminosäuren. Dabei ist zu beachten, dass die verschiedenen Proteingruppen ungleichmäßig in der Knolle verteilt sind - viele wertvolle Bestandteile treten nur im äußeren Bereich unter den Schalen auf (siehe G. Barel, I. Ginzberg, J. Exp. Bot. 2008, 59,3347-3357). Zusätzlich sind viele Elemente wie Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Mangan-, und Kupferkationen stärker in der Kartoffelschale konzentriert (siehe S. 116, Kapitel 5: „Potato Proteins, Lipids, and Minerals“ von S. O. Kärenlampi, P. J. White, aus „Advances in Potato Chemistry and Technology“).
Die Protease-Inhibitoren, auch Tuberinin genannt, gehören zu den Speicherproteinen. Die höher-molekularen Proteine dieser sehr diversen Gruppe weisen Lectine, Phenoloxidasen und Lipoxygenasen auf und besitzen teilweise Peptidase- oder Carboxypeptidase-Inhibitor- Eigenschaften.
Es ist festzustellen, dass alle angegebenen Werte sowie die analytischen Werte einer Schwankungsbreite unterliegen, wie es bei Naturprodukten unumgänglich ist und auch Aggregate und Verbindungen mit höherem Molekulargewicht in geringen Mengen beinhaltet sein können, die im SDS-Gel nicht zu sehen sind. Das SDS-Gel-Chromatogramm zeigt nur größere Mengen - kleine Mengen liefern keine Banden. Zudem können lediglich qualitative Rückschlüsse auf die Probenzusammensetzung gezogen werden, nicht jedoch quantitative.
Wenig- bis nicht-denaturiertes Kartoffelprotein weist gute funktionelle Eigenschaften wie Löslichkeit in wässrigen und auch alkoholischen Lösungen (Globuline lösen sich in alkoholischen Lösungen), Gel- und Schaumbildung, sowie gute Emulgierfähigkeiten auf, was es neben seinen nutritiven Eigenschaften für die Anwendung in Lebensmitteln attraktiv macht. Die funktionellen Eigenschaften werden dabei stark von den Herstellungsbedingungen des Proteins (Hitze, pH-Wert, Salze, Scherkräfte, Stress) beeinflusst, da diese zur Denaturierung und damit dem Verlust der Funktionalität führen können. Wie auf S. 87 der „Advances in Potato Chemistry and Technology“ unter 2.3.3. Foaming Properties“ erklärt, kann Ultrafiltration eingesetzt werden, um die Schaumfähigkeit von Kartoffelprotein zu verbessern (v. Koenigsveld 2002). „Potato Chemisty“ erläutert auch, dass eine hohe mechanische Belastung zu Denaturierungen von Kartoffel protein führt.
In „Applied Food Protein Chemistry“ (editiert von Z. Ustunol, Kapitel 4: „Physical, Chemical and Processing-induced Changes in Proteins“, 2015, 1. Edition, Wiley Blackwell) werden sehr genau die grundlegenden Auswirkungen von physikalischen und chemischen Einflüssen auf das Protein und seine Funktionalitäten beschrieben. Z. Ustunol ist Professorin an der University of Michigan, d.h. diese Informationen werden an Studenten der Nahrungsmitteltechnologie weitergegeben und sind Wissen des Fachmanns. Denaturierung bedeutet Änderungen in der Tertiär- und Sekundärstruktur eines Proteins, die zur reversiblen oder auch irreversiblen Entfaltung des Proteins führen. Hierbei werden die inter- und intramolekularen Wechselwirkungen durch äußere Faktoren gebrochen. Durch Hitze wird die Stabilität der nicht-kovalenten Wechselwirkungen verringert und Bindungen, wie Wasserstoff-Brückenbindungen, gebrochen. Hierbei beeinflusst die Feuchtigkeit des Proteins auch dessen Stabilität gegenüber Hitze. Ein hydratisiertes Protein ist mobiler und kann sich leichter entfalten, weshalb es auch weniger stabil gegenüber Hitze-Denaturierung ist.
Damodaran beschrieb schon 2008 (siehe „Amino Acids, peptides and proteins“ in Fennema’s Food Chemistry, 2008, 5. Edition, CRC Books), dass es sich bei der Hitze-Koagulation bei den meisten Proteinen um eine irreversible Denaturierung handelt. Ebenfalls führen hohe Drücke zur Entfaltung von Proteinen, da native Proteine Aushöhlungen aufweisen, die im denaturierten (entfalteten) Zustand nicht vorhanden sind. Ergänzend dazu beschrieb Bianco 2012 (V. Bianco, S. Iskrov, G. Franzese, J. Biol. Phys. 2012, 38, 27-48), dass durch hohe Drücke Wasser in die Hohlräume der Proteine gedrückt werden kann, was zum Aufquellen und zur Denaturierung des Proteins führt. Gleichermaßen können auch mechanische Scherkräfte (beispielsweise durch Zentrifugieren, Schütteln, Mixen, Aufschlagen,..) zu einer Denaturierung führen.
Neben den genannten physikalischen Mitteln können Proteine auch chemisch denaturiert werden. Ein gängiges Mittel ist die Anpassung des pH-Werts. Der isoelektrische Punkt eines Proteins bezeichnet den pH-Wert, bei dem die Gesamt-Ladung des Proteins null beträgt. Dadurch werden die abstoßenden Kräfte der Ladungen minimiert, weshalb die Proteine aggregieren und koagulieren können, sodass ihre Löslichkeit beim isoelektrischen Punkt am geringsten ist. Bei pH-Werten unterhalb und oberhalb dieses Wertes nimmt die Löslichkeit des Proteins wieder zu. Auch extreme pH-Bedingungen, die zu hoher positiver oder negativer Ladung des Proteins führen, können zu starker intramolekularer Abstoßung und damit Denaturierung führen (siehe dazu S. Damodaran, „Amino Acids, peptides and proteins“ in Fennema’s Food Chemistry, 2008, 5. Edition, CRC Books; J. Culbertson, „Proteins functional properties“ in Food Chemistry: Principles and Applications, 2012, 3. Edition, Science Technology).
Die elektrostatischen Wechselwirkungen können ebenfalls ausgenutzt werden, um Proteine mittels organischer Lösungsmittel zu fällen, welche unpolarer als Wasser sind. Dieser Effekt kann für die Fällung von Proteinen in Extraktionen oder zur Aufreinigung ausgenutzt werden (Z. Ustunol, 4.2.2.2 Organic-solvent-induced denaturation in „Applied Food Protein Chemistry“ 2015, 1. Edition, Wiley Blackwell).
Die Zugabe von Salzen beeinflusst ebenso stark die Proteineigenschaften. Ustunol beschreibt, dass die Protein-Löslichkeit in verdünnten Salzlösungen niedriger lonenstärke (< 0.2 M) unabhängig von der Art des Salzes erhöht wird. Bei hohen Salz-Konzentrationen hingegen (> 1 M) tritt der gegenteilige Effekt auf. Das Salz interagiert mit dem Wasser, sodass Protein-Protein-Wechselwirkungen verstärkt werden, was zu einer Fällung der Proteine führt. Dabei ist die Salz-Konzentration bei der die Fällung auftritt abhängig von der Art des Proteins.
Diese Effekte konnte Osborne bereits 1905 (siehe T. B. Osborne, G. F. Campbell, J. Am. Chem. Soc. 1896, 18, 575-582; T. B. Osborne, I. F. Harris, Am. J. Phys. 1905, 13, 35-44 und T. B. Osborne, „Die Pflanzenproteine“ in Ergebnisse der Physiologie 1910, 10, 47-215) ausnutzen, um die sogenannten Osborne-Fraktionen aus Getreideprotein zu gewinnen, die nach ihren unterschiedlichen Löslichkeiten gewonnen werden konnten: Während die Albumine mit Wasser extrahiert werden können, sind Globuline mit Kochsalzlösungen extrahierbar. Prolamine können mit Ethanol (70%) extrahiert werden. Die Gluteline hingegen verbleiben im Rückstand. Die Bezeichnung dieser sogenannten Osborne-Fraktionen hat sich im gesamten Bereich der pflanzlichen Proteine durchgesetzt.
Aus diesen Gründen haben sowohl das Ausgangsmaterial (mit Schale), das Herstellungsverfahren des Proteins und die Bedingungen der Weiterverarbeitung zum Lebensmittelprodukt immensen Einfluss auf den Zustand, die Funktionalität und auch die Zusammensetzung des gewonnenen Proteins. Alle Verarbeitungsschritte haben somit Auswirkungen auf die Eigenschaften des finalen Proteinprodukts. Alle mit Erwärmung verbundenen Methoden, wie beispielsweise das Pasteurisieren, Trocknen, Sterilisieren, Blanchieren, Kochen und weitere, sorgen für eine komplette oder teilweise Denaturierung des Proteins, welche bereits bei Temperaturen von 40 °C einsetzt. Aufgrund der attraktiven Eigenschaften des Kartoffelproteins und des zu Beginn bereits erwähnten gesteigerten Bedarfs an Proteinen sind mittlerweile eine Vielzahl verschiedener Verfahren zur Herstellung von Kartoffelprotein bekannt. Die ersten Patente zur Gewinnung von Kartoffelprotein wurden bereits 1997 angemeldet. Zu diesem Thema wurden ebenso einige wissenschaftliche Publikationen in Form von Übersichtsartikeln publiziert, die die gängigsten Herstellungsmethoden beschreiben und Vor- und Nachteile nennen (siehe beispielsweise: Y. Fu, W.-N. Liu, O. P. Soladoye, Int. J. Food Sei. Technol. 2020, 55, 2314- 2322 oder S. L0kra, K. O. Straetkvern, Food 2009, Special Issue 1, 88-95). Grundsätzlich lassen sich die Verfahren auf drei Hauptmethoden zurückführen: 1) Fällung/ Koagulation - mittels Temperaturanpassung und/ oder pH-Wert-Anpassung, Zugabe eines Fällungsmittels oder Komplexierung; 2) Membranseparation; 3) Chromatographie. Als Ausgangsmaterial dient überwiegend das in der Stärkeindustrie als Nebenprodukt anfallende Kartoffelfruchtwasser, in dem ca. 1 - 2 % Kartoffelprotein enthalten sind.
Häufig findet die Isolierung der im Kartoffelfruchtwasser enthaltenen Proteine in der Industrie mittels Koagulation durch Anpassung der Temperatur auf > 60 °C und/oder Einstellung des pH-Wertes auf < 6 und anschließender mechanischer Abtrennung des koagulierten Proteins statt, was, wie in „Advances in Potato Chemistry and Technology“ angegeben, äußerst nachteilig für die Eigenschaften Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgierfähigkeit, Schaumbildungsfähigkeit und -Stabilität ist. Die so erhaltenen Proteine sind daher für die Anwendung in Lebensmitteln für die menschliche Ernährung wenig geeignet, da sie, wie bereits erläutert, kaum Funktionalitäten (Löslichkeit, Schaumbildung, Gelierung etc.) und zusätzlich einen starken Nebengeschmack aufweisen. Sie haben eine große Partikelgröße, die für ein unangenehmes, sandartiges Mundgefühl, eine grobe körnige Struktur der Proteine und Einschränkung der Filmbildungsfähigkeit sorgt.
Um die oben genannten Nachteile der Gewinnung von Kartoffelproteinen mittels Koagulation zu vermindern, wurden weitere Verfahren zur Verbesserung der Produktqualität der koagulierten Kartoffelproteine entwickelt.
WO 2017/142406 beschreibt eine Verbesserung der Proteineigenschaften (geringere Härte, kleinere Partikel, niedrigere Dichte, geringerer Nebengeschmack), wenn das koagulierte Kartoffelprotein vor seiner Trocknung bis zu einer Leitfähigkeit des Waschwassers von <1 mS/cm gewaschen wird. Ebenso kann eine Verbesserung der Proteineigenschaften Löslichkeit und Wasserbindevermögen durch physische Verringerung der Partikelgröße des Proteins, wie in WO 2016/133448 beschrieben, oder durch Extraktionsschritte mit niedermolekularen Alkoholen wie Ethanol- oder Propanol-Wasser-Gemischen, wie in WO 2020/171708 dargelegt, erzielt werden. Im letzten Beispiel wird die oben beschriebene Fällung von Proteinen mittels organischer Lösungsmittel angewendet. Trotz der so erreichbaren sensorischen Verbesserungen der koagulierten Kartoffelproteine und einer dadurch ermöglichten Anwendung in Lebensmitteln, bleibt der durch die Denaturierung hervorgerufene starke Funktionalitätsverlust der Proteine irreversibel.
Deshalb ist die Entwicklung von Verfahren zur großtechnischen Isolation der Kartoffelproteine, die ohne eine Denaturierung ablaufen, von großem Interesse. WO 2014/011042 beschreibt die Fraktionierung von Proteinen aus Kartoffelfruchtwasser in eine hoch-molekulargewichtige und eine nieder-molekulargewichtige Fraktion unter Verwendung eines funktionalisierten Trägermaterials mittels Adsorptions- und Desorptionsschritten der einzelnen Fraktionen. WO 2008/069650 legt die Isolierung von Proteinen und dem Protease- Inhibitor aus Kartoffelfruchtwasser mittels expanded-bed-Chromatographie dar, wobei eine Trennung in zwei Protein-Fraktionen erfolgt. Hierbei können reine native Kartoffelproteine mit hoher Funktionalität erhalten werden, jedoch keine Gesamtfraktion. Chromatographische Verfahren sind mit hohen Prozesskosten, schwierigem Up-Scaling und mit einem hohen technischen und energetischem Aufwand verbunden, weshalb Verfahren ohne diese Schritte von großem Interesse sind. WO 2018/183770 beschreibt die Isolierung eines dispergierbaren Kartoffelprotein-Pulvers für die Anwendung in Lebens- und Futtermitteln und Getränken mit einem Proteingehalt von 30 - 91%, einem Anteil von a-Glykoalkaloiden < 300 ppm, einem Aschegehalt von 1 - 20% und einer Partikelgröße von 10 - 100 pm. Es umfasst folgende Schritte:
• Mikrofiltration des Kartoffelfruchtwassers
• Ultrafiltration
• Ggf. Mikropartikulation
• Sprühtrocknung
• Glykoalkaloid-Entfernung vor oder nach der Ultrafiltration und optional Umkehrosmose
Darüber hinaus beschreibt die WO2020/242299A1 die Herstellung eines Kartoffelproteins aus geschälten Kartoffeln, wobei die Proteinisolierung neben der isoelektrischen Fällung, Koagulation, Mikrofiltration und Ultrafiltration auch den Schritt der Diafiltration gegen eine Salzlösung mit einer Leitfähigkeit von 5 - 20 mS/cm beinhalten kann. Explizit wird in dieser Schrift auf die unvermeidbare Schälung der Knollen vor der Verarbeitung hingewiesen und diese beansprucht. Durch die Schälung soll ein saubereres Protein mit einer verringerten mikrobiellen Belastung und verringertem Glykoalkaloidgehalt hergestellt werden können, wodurch weniger Reinigungsschritte benötigt werden sollen. Zudem weist das so erhaltene Protein eine andere Protein-Zusammensetzung auf, als das von geschälten Knollen. Während das aus geschälten Knollen erhaltene Protein höhere Gehalte an Tyrosin, Prolin, Arginin, Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat aufweist, sind viele essentielle Aminosäuren vermehrt in der Schale der Knolle enthalten, welche durch die Schälung verloren gehen. Das betrifft vor allem Threonin, Leucin, Isoleucin, Methionin und Phenylalanin. Zudem sind, wie oben bereits erwähnt, viele Mineralien in der Schale angereichert.
Dass die Gewinnung von Kartoffelproteinen aus Kartoffelfruchtwasser grundsätzlich durch Ultrafiltration und Diafiltration möglich ist, ist dem Fachmann schon aus dem o.g. Lehrbuch „Advances in Potato Chemistry und Technology“, s.o. bekannt (siehe auch z.B. WO 97/42834; H. J. Zwingenberg, A. J. N. Kemperman, M. E. Boerrigter, M. Lotz, J. F.
Dijksterhuis, P. E. Poulsen, G.-H. Koops, Desalination 2002, 144, 331-334; B. J. Oosten, Die Stärke 1976, 4, 135-137; G. Eriksson, B. Sivik, Potato Res. 1976, 19, 279-287; I.
Wojnowska, S. Poznanski, W. Bednarski, J. Food. Sei. 1981 , 47, 167-172).
Auch das Prinzip der Entfernung von Geschmacks- und Schadstoffen aus proteinhaltigen Lebensmittelprodukten mittels Adsorptionstechniken ist grundsätzlich bekannt. So beschreibt WO 2008/069651 die Adsorption von Glykoalkaloiden an Aktivkohle selbst oder an mit einem gelartigen Mittel beschichteter Aktivkohle. Schon DE 29 47207 A1 von 1979 beschreibt die Entfernung von unerwünschten Geschmacksstoffen mittels Aktivkohle-Behandlung aus einer Kartoffel-Albumin-Fraktion aus Kartoffelfruchtwasser.
Das im Kartoffelprotein zu einem großen Anteil enthaltene Kartoffel patatin kann Fettsäuren von Triglyceriden abspalten. Dabei hängt die Selektivität dieser Reaktion stark von der Kettenlänge und dem Aufbau der Fettsäuren ab, insbesondere beispielsweise aus P. Pinsirodom, K. L. Parkin, J. Am. Oil Chem. Soc. 1999, 76, 1119-1125 und C. Anderson, P. Pinsirodom, K. L. Parkin, J. Food. Biochem. 2002, 26, 63-74 ersichtlich. Die grundsätzliche Wechselwirkung von Lipasen mit Triglyceriden und die Abhängigkeit ihrer Selektivität von der Kettenlänge der Fettsäuren, ist dabei ein Prinzip, das schon lange bekannt ist (s. Lehrbücher wie „Advances in Potato Chemistry and Technology“, S.78, 2. Absatz), wie auch aus der EP 232933A1 oder Römpp, Stichwort „Lipasen“ 11. Auflage ersichtlich.
Um die Bildung von off-flavor-Noten durch diese Lipaseaktivität und der damit einhergehenden Abspaltung von Fettsäuren zu vermeiden, wird Patatin in der Literatur nur mit längerkettigen Fetten verwendet (z.B. US 2017/0196243), die es nicht spalten kann. Die Spaltung der Triglyceride kann demgegenüber aber auch für die bewusste Erzeugung einer Geschmacksnote genutzt werden, indem gezielt Fette mit kürzeren Kettenlängen eingesetzt werden, wie in US 2009/053191 und von Spelbrink et al. gezeigt (R. E. J. Spelbrink, H. Lensing, M. R. Egmond, M. L. F. Giuseppin, Appl. Biochem. Biotechnol. 2015, 176, 231- 243). Bevorzugte Öle, bei denen Patatin keine Triglyceride spaltet und somit keine Geschmacksveränderungen auftreten, gehen aus der Publikation: „Fatty Acids Composition of Vegetable Oils and Its Contribution to Dietary Energy Intake and Dependance of Cardiovascular Mortality on Dietary Intake of Fatty Acids“ (J. Orsavova, et al., Int. J. Mol. Sei. 2015, 16, 12871-12890) hervor, auf diese Veröffentlichung wird vollinhaltlich Bezug genommen. Dass Patatin diese Lipaseaktivität aufweist, wurde erstmals bereits 1971 von Galliard (T. Galliard, Biochem. J. 1971 , 121, 379-390) beschrieben. Auch der Wikipedia- Artikel von 2008 zu Patatin
(https://en.wi kipedia.org/w/index.php?title=Patatin&oldid=193784497) beschreibt bereits die Enzymaktivität des Patatins als Lipase mit der Fähigkeit Fettsäuren abzuspalten und verweist auf den 2003 von P. R. Shewry veröffentlichten Übersichtsartikel „Tuber Storage Proteins“ (P. R. Shewry, Ann. Bot. 2003, 91, 755-769), der einen umfassenden Überblick über die Lipaseaktivität, die Eigenschaften und das Verhalten von Patatin gibt. Bei Verwendung von Gesamtkartoffelproteinfraktionen in Lebensmitteln ist daher die Lipaseaktivität besonders zu berücksichtigen, indem Vorsicht beim Arbeiten mit Fetten geboten ist und sich, wie oben erwähnt, einige Fette besser eignen, wenn die Bildung von Off-Noten durch freie Fettsäuren unerwünscht ist. Eine Inaktivierung der Enzymaktivität, bspw. durch Erhitzung auf die Denaturierungstemperatur der hitzeempfindlichen Lipase, kann ebenfalls hilfreich sein.
Die bekannten Verfahren zur Herstellung eines hochfunktionellen Kartoffelproteins waren somit in verschiedener Hinsicht verbesserungsfähig.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein natives, funktionales Kartoffelprotein natürlicher Struktur aus Kartoffelfruchtwasser in einfacher Weise in großtechnischem Maßstab zu gewinnen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie ein Kartoffelprotein nach Anspruch 8 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen oder Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Dieses ist erfindungsgemäß mit hoher Ausbeute durch das Verfahren mittels der Schlüsseltechnologien Membranfiltration und Adsorptionsmittelbehandlung erhältlich. Dadurch, dass ungeschälte Kartoffeln verarbeitet werden, wird im Produkt ein vollständigeres Aminosäurespektrum gewonnen, sowie beim Verfahren ein aufwändiger Verfahrensschritt (Schälen) vermieden und weniger Abfall erzeugt.
Ein typisches erfindungsgemäßes Kartoffelprotein mit einem Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur) ist erhältlich durch:
Vorlegen ggf. unter Oxidationsschutz zerkleinerter, gereinigter, Kartoffeln;
Mechanisches Abtrennen der Feststoffe aus den zerkleinerten Kartoffeln unter Herstellung von Kartoffelfruchtwasser und Feststoffen;
Einstellung des pH-Wertes des Kartoffelfruchtwassers auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9; Separation unlöslicher Bestandteile und Schwebstoffe mittels Zentrifugalseparation;
Ultrafiltration des pH-Wert eingestellten Kartoffelfruchtwassers;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats zur Herabsetzung der elektrischen Leitfähigkeit der Retentatlösung um 50 - 90%, bevorzugt 65 - 90%, besonders bevorzugt 75 - 85% unter Erhalt der Kartoffelproteinlösung; ggf. Trocknen der Kartoffelproteinlösung und ggf. Entkeimung.
Das flüssige Kartoffelprotein-Ultrafiltrationsretentat kann durch schonende Trocknung in getrocknetes Kartoffelprotein überführt werden. Dafür eignen sich bspw. Sprühtrocknung, Lyophilisierung, Vakuumtrocknen u. dgl .. Es kann aber auch flüssig weiteren Substanzen zugesetzt werden.
Das so in ökonomischer weise großtechnisch gewonnene hochfunktionale Kartoffelproteinprodukt ist hochwertig und weist vorteilhafte funktionelle Eigenschaften für Lebensmittelanwendungen auf (z.B. Gelierung, Emulsionsbildung und Schaumbildung). Es kann aber auch als Kleber für Spezialanwendungen eingesetzt werden - bei pharmazeutischen Trägermaterialien, bspw. Cellulose und ihre Derivate. Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein bietet darüber hinaus im Unterschied zu anderen pflanzlichen Proteinen die Fähigkeit zur Heiß-Gelierung mit hoher Viskositätsausbildung. Durch das Wasserbindevermögen des Gels wird ein besseres Mundgefühl und eine weichere Textur erreicht.
Auch der Geschmack des Proteins wurde durch diese Behandlung stark verbessert.
In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein getrocknetes natives, funktionales Kartoffelprotein mit einem Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur), herstellbar aus Kartoffelfruchtwasser, das durch die mechanische fest- /flüssig-Trennung von zerkleinerten, gereinigten Kartoffelteilen erhalten wird, gekennzeichnet durch: a) Proteingehalt von mind. 84 Gew.%atro b) Feuchtegehalt von max. 10 Gew.% c) Schaumvolumen 1400 - 2000 mL d) Schaumstabilität von mind. 90 % e) Produktlöslichkeit/Proteinlöslichkeit in Leitungswasser von 75 - 100%. f) maximale Gelfestigkeit von mindestens 1000 g g) Aschegehalt von max. 3 Gew.% In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Protein ein Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur) auf. Es hat drei Hauptfraktionen, wobei die erste Hauptfraktion ein Molekulargewicht von 10 bis 20 kDa aufweist, die zweite Hauptfraktion ein Molekulargewicht zwischen 25 und 40 kDa sowie die dritte Hauptfraktion ein Molekulargewicht von etwa 66 kDa nach SDS-Page Primärstruktur besitzt. Nach HPLC Chromatographie weisen mindestens 70% der Proteine ein Molekulargewicht von 3 - 182 kDa auf. Die unterschiedlichen nachgewiesenen Molekülgrößenbereiche sind auf die unterschiedlichen analytischen Methoden zurückzuführen. Während bei der SDS-Page die Masse des Proteins in seiner Primärstruktur ermittelt wird, wird bei der HPLC- Chromatographie das Volumen der Proteine vorliegend in ihrer Quartärstruktur bestimmt.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein erhältlich durch: a) Vorlegen zerkleinerter, gereinigter Kartoffelteile; b) Mechanisches Abtrennen der Feststoffe aus den zerkleinerten Kartoffeln unter Herstellung von Kartoffelfruchtwasser und Feststoffen; c) Einstellung des pH-Wertes des Kartoffelfruchtwassers auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9; d) Separation unlöslicher Bestandteile und Schwebstoffe mittels Zentrifugalseparation; e) Ultrafiltration des pH-Wert eingestellten Kartoffelfruchtwassers; f) Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats zur Herabsetzung der elektrischen Leitfähigkeit der Retentatlösung, um 50 - 90%, bevorzugt 65 - 90%, besonders bevorzugt 75 - 85%.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße getrocknete Protein dadurch erhältlich, dass eine pH-Wert-Einstellung nach der mechanischen fest-/flüssig- Trennung auf einen pH-Wert von 6 - 9, bevorzugt 6,5 - 8,2, besonders bevorzugt 6,9 - 7,5 erfolgt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße getrocknete Protein erhalten, indem das Trocknen durch mindestens einen der Verfahrensschritte Sprühtrocknen, Lyophilisieren, Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen erfolgt.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein dadurch erhältlich dass die Ultrafiltrationsmembran eine Kunststoff- oder Keramikmembran mit einem cut-off von 3 - 150 kDa, bevorzugt 5 - 120 kDa, besonders bevorzugt 10 - 100 kDa, ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein dadurch ausgezeichnet, dass das Ultrafiltrationsretentat mit Adsorptionsmitteln, ausgewählt aus Aktivkohle, Bentoniten, polymeren Adsorptionsmitteln oder Derivaten der Adsorptionsmittel behandelt ist. Typische polymere Adsorptionsmittel sind Polystyrol/Divinylbenzol Harze, Phenolformaldehydharze, Derivate der Adsorptionsmittel und Kombinationen davon, die entfärben und von off-flavors befreien. In einer bevorzugten Verkörperung ist das verwendete polymere Adsorptionsmittel ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz. Bevorzugt werden auch die Harze Amberlite XAD 761 , Amberlite FPX 68, Diaion HP 20, Sepabeads SP 70, Purosorb PAD 550 Polymeres Adsorbens, Aktivkohle, zellulosebasierte Adsobentien, Gelatine, Cellulose-basierte Adsorbentien, Tannine, zur Reduktion von off-flavors eingesetzt - auch Polystyren/Divinylbenzen Harze, Polyphenol-Formaldehyd Harze und Kombinationen derselben können verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Protein dadurch herstellbar, dass das Ultrafiltrationsretentat schonend entkeimt ist, beispielsweise durch Pasteurisierung mit Mikrowellen oder HTST-Pasteurisierung (High Temperature Short Time), PEF-Steriliserung (Pulsed Electric Fields), HPP-Pasteurisierung (High Pressure Pasteurization).
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein erhältlich durch:
Vorlegen zerkleinerter, gereinigter Kartoffelteile in Form von Kartoffelmaische, mechanische Auftrennung der Kartoffelmaische in Fest- und Flüssigphase (Kartoffelfruchtwasser) ;
Einstellung des pH-Wertes auf 6 - 9, bevorzugt 6,5 - 8,2, besonders bevorzugt 6,9 - 7,5.
Ultrafiltration der Flüssigphase mit Membranen eines cut-off von 3 - 150 kDa, bevorzugt 5 - 120 kDa, besonders bevorzugt 10 - 100 kDa;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats bis zu einer Reduktion der Leitfähigkeit um 50 - 90 %, bevorzugt, 65 - 90 % und besonders bevorzugt um 75 - 85 %.
Entfernung von antinutritiven Stoffen mittels Adsorptionstechniken; ggf. Entkeimung und ggf. Trocknung der Protein-Lösung.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein Bestandteil eines Lebensmittels oder -Zusatzes, ein diätisches Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz für menschlichen oder tierischen Genuss.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein sowohl als Lösung als auch als Feststoff Bestandteil von Lebensmitteln oder -Zusätzen, von diätischen Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelzusätzen für den menschlichen oder tierischen Genuss.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein Bestandteil eines Klebstoffes. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein Bestandteil einer Mischung mit anderen pflanzlichen Proteinen, bevorzugt Leguminosenproteinen, wie Erbsenprotein, Bohnenprotein, Ackerbohnenprotein, Linsenprotein oder Sojaprotein, Lupinenprotein oder Mungbohnenprotein oder Mischungen dieser.
3. Herstellung des nativen funktionalen Kartoffelproteins:
Das Kartoffelfruchtwasser von gewaschenen Kartoffeln mit Schale wird nach fest-/flüssig- Trennung von zerkleinerten, gereinigten Kartoffelteilen erhalten, beispielsweise als Nebenstrom der Kartoffelstärke-Herstellung. Dabei wird als erster Schritt der Rohstoff Kartoffel von Sand, Steinen und Pflanzenresten gereinigt und, z.B. mittels Reibe, meist unter Zugabe eines Reduktions- bzw. Antioxidationsmittels, wie beispielsweise Natriumhydrogensulfit, oder unter Schutzgasatmosphäre zerkleinert. Eine vorangehende Schälung der Kartoffel ist für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unerwünscht, wodurch es im Gegensatz zu Verfahren des Standes der Technik, bei dem explizit eine Schälung der Kartoffeln beschrieben wird, eine vorteilhafte Weiterentwicklung darstellt. Durch den Verzicht auf die Schälung wird die Ökonomie des Verfahrens verbessert und ein ernährungsphysiologisch günstigeres Aminosäurespektrum erhalten, wie zuvor bereits erläutert. Bei einer herkömmlichen Schälung kann von einem Schälverlust von 10 Gew.% ausgegangen werden, wodurch bei einer Ausgangsmenge von 1000 to Kartoffeln durch die Schälung ein Verlust von 100 to Rohstoff generiert wird. Hinzu kommen eingesparte Energie- und Stromkosten, sowie Materialkosten, die durch Messerwechsel oder Erneuerung der Walzenschäler bei einer mechanischen Schälung entstehen würden. Bei einer Dampfschälung sind ebenfalls die Energiekosten zu beachten, sowie die Kosten durch Strom, Wasser, Erwärmung. Zudem ist die Kartoffel bei einer Dampfschälung erhöhten Temperaturen ausgesetzt, die zu einer Denaturierung des Proteins und durch Verkleisterung der Stärke zu einer erschwerten oder verhinderten Isolierung des Proteins führen können.
Durch Zentrifugation erfolgt eine Auftrennung in eine Festphase aus Stärke und Fasern, und Kartoffelfruchtwasser als Flüssigphase mit wasserlöslichen Komponenten wie Proteinen, Zuckern, Aminosäuren, organischen Säuren und Salzen etc.. Diese Schritte sind in dieser oder ähnlicher Art und Weise üblich für die Gewinnung von Stärke aus Kartoffeln (siehe beispielsweise: J. BeMiller, R. Whistler, Starch: Chemistry and Technology, 3. Auflage, Academic Press, S. 522-555).
Für einen möglichen Herstellungsprozess des nativen funktionalen Kartoffelproteins aus Kartoffelfruchtwasser, wird zunächst dessen pH-Wert mit Hilfe von einer nahrungsmitteltechnisch unbedenklichen wässrigen Lauge, beispielswiese Natronlauge, Kalilauge oder Calciumhydroxid, auf 6 - 9, bevorzugt 6,5 - 8,2, besonders bevorzugt 6,9 - 7,5 eingestellt. Daraufhin erfolgt eine Separation unlöslicher Bestandteile und Schwebstoffe mittels Zentrifugalseparation. Durch diese ersten Prozessschritte verliert das Kartoffelfruchtwasser seine Trübung und wird zu einer klaren Protein-Lösung. Durch Ultrafiltration der separierten klaren Protein-Lösung wird eine Konzentration der Proteine im flüssigen Ultrafiltrationsretentat, der Protein-Lösung, erreicht. Der Konzentrations-Faktor beträgt in einer Ausführungsform etwa 10, wobei auch eine höhere oder tiefere Protein- Konzentration möglich ist, abhängig von Bedingungen wie Energiekosten.
Bevorzugt werden Keramik- und Kunststoffmembranen eingesetzt. Hierfür eignet sich beispielsweise eine Kunststoff-Membran mit einem cut-off von 3 - 150 kDa, bevorzugt 5 - 120 kDa, besonders bevorzugt 10 - 100 kDa. Die Membranfiltration wird bei geringen Drücken von 1 - 3 bar durchgeführt. Ein zu hoher Druck wird vermieden, da durch diesen mechanischen Stress die Funktionalitäten der Proteine negativ beeinflusst werden.
Vor oder nach der Ultrafiltration kann eine Entfernung von unerwünschten Geschmacksstoffen und antinutritiven Substanzen aus der Protein-Lösung, unter anderem von Glyko- alkaloiden, mittels Adsorptionstechniken erfolgen. Als besonders geeignet erweisen sich Aktivkohle- oder Bentonit-Adsorptionen, aber auch andere Adsorbentien wie oben erwähnt können eingesetzt werden.
Das Ultrafiltrationsretentat wird bis zu einer Reduktion der elektrischen Leitfähigkeit um 50 - 90%, bevorzugt 65 - 90%, besonders bevorzugt 75 - 85% diafiltriert. Die Diafiltration kann mit vollentionisiertem Wasser, destilliertem Wasser, Prozesswasser oder Leitungs- bzw. Betriebswasser durchgeführt werden, wobei das verwendete Wasser eine Leitfähigkeit von 5 pS/cm - 5000 pS/cm, bevorzugt 10 - 50 pS/cm oder auch 5 - 50 pS/cm besitzen kann.
Die erhaltene Protein-Lösung kann optional im Anschluss durch schonende Verfahren entkeimt werden. Hier eignet sich beispielsweise die Pasteurisierung mit Mikrowellen, HTST- Pasteurisierung (High Temperature Short Time), PEF-Steriliserung (Pulsed Electric Fields) oder HPP-Pasteurisierung (High Pressure Pasteurization). Zuletzt kann die Trocknung der Protein-Lösung durch Sprühtrocknung oder andere schonende Trocknungsverfahren, z.B. Lyophilisieren oder Vakuumtrocknung erfolgen. Aber auch die weitere Verwendung der Protein-Lösung ist denkbar.
Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein mit einem Molekulargewicht von 10 bis 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur) zeichnet sich durch seine gute Emulgier- und Schaumfähigkeit aus. Darüber hinaus ist es heiß-quellend, wodurch eine bessere Verarbeitung und leichtere Proteinanreicherung ermöglicht wird. Auch die geringe Viskosität im kalten Zustand führt zu einer guten Verarbeitbarkeit, während viele handelsübliche andere Proteine hier bereits eine deutlich höhere Viskosität aufweisen. Die überlegenen Gelbildungseigenschaften bei Erhitzen ähneln tierischen Proteinen und machen das erfindungsgemäße Kartoffelprotein unter anderem für die Verwendung in Fleischersatzprodukten hochinteressant.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen sowie den Zeichnungsfiguren, auf die sie keineswegs eingeschränkt ist, erläutert. Darin zeigt:
Fig. 1 : Verfahrensschema des Herstellungsbeispiels 1.
Fig. 2: HPLC Chromatogramm des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins und eines Protein- Standards.
Fig. 3: HPLC Chromatogramm des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins und Solanic 300®.
Fig. 4: HPLC Chromatogramm des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins und Solanic 200®.
Fig. 5: SDS-Page Gel vom erfindungsgemäßen Kartoffelprotein (Spur 1 = Marker; 2 und 3: Chargen des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins)
Fig. 6: DSC-Diagramme für thermisch behandelte und thermisch unbehandelte Kartoffelproteine.
Fig. 7: Viskositätsmessung nach Anton Paar des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins im Vergleich mit einer mit Calciumchlorid behandelten Probe.
Fig. 8: Gelfestigkeitsmessungen vom erfindungsgemäßen Kartoffelprotein im Vergleich mit einer mit Calciumchlorid behandelten Probe.
Fig. 9: Verfahrensschema nach Anspruch 1.
Beispiele für Herstellungsverfahren
Beispiel 1 - Herstellung von hochwasserlöslichem, funktionalen Kartoffelprotein:
Zur Herstellung einer Ausführungsform von hochwasserlöslichem Kartoffelprotein wurden Kartoffeln gereinigt und fein zerkleinert. Die Suspension wurde einer Schwerkrafttrennung (Zentrifugation) unterworfen und der Überstand als proteinreiches Fruchtwasser für die Proteingewinnung weiterverwendet. Die proteinhaltige, trübe Lösung wurde mit Hilfe von wässriger Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 bis 8,0 eingestellt und abermals zentrifugiert, wobei feine Schwebstoffe aus der Lösung entfernt wurden. Die gereinigte proteinhaltige, klare Lösung wurde unter Verwendung einer 100 kDa Polyvinylidenfluorid- Membran bei einem Transmembrandruck von 2,0 bar und einem Differenzdruck von 1,0 bar ultrafiltriert. Das erfindungsgemäße Protein verblieb im Ultrafiltrationsretentat, während Salze, Zucker und Aminosäuren im Ultrafiltrationspermeat verblieben. Folgend wurde das Ultrafi Itrationsretentat mit demineralisiertem Wasser bis zu einer Reduktion der elektrischen Leitfähigkeit um 81 % diafiltriert. Anschließend erfolgte eine Entfernung von antinutritiven Bestandteilen und Entfärbung mittels Aktivkohle-Adsorption. Das nach Sprühtrocknung erhaltene erfindungsgemäße Kartoffel protein wies auf:
Die Verfahrensschritte des Beispiels 1 sind in Fig. 1 verdeutlicht. Beispiel 1 stellt ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dar, ist aber keinesfalls auf dieses eingeschränkt.
Beispiel 2 - Herstellung einer funktionalen Kartoffelprotein-Lösung:
Zur Herstellung einer Ausführungsform von hochwasserlöslichem Kartoffelprotein wurden Kartoffeln gereinigt und fein zerkleinert. Die Suspension wurde einer Schwerkrafttrennung (Zentrifugation) unterworfen und der Überstand als proteinreiches Fruchtwasser für die Proteingewinnung weiterverwendet. Die proteinhaltige, trübe Lösung wurde mit Hilfe von wässriger Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 bis 8,0 eingestellt und abermals zentrifugiert, wobei feine Schwebstoffe aus der Lösung entfernt wurden. Die gereinigte proteinhaltige, klare Lösung wurde unter Verwendung einer 100 kDa Polyvinylidenfluorid-Membran bei einem Transmembrandruck von 2,0 bar und einem Differenzdruck von 1 ,0 bar ultrafiltriert. Das erfindungsgemäße Protein verblieb im Ultrafiltrationsretentat, während Salze, Zucker und Aminosäuren im Ultrafiltrationspermeat verblieben. Folgend wurde das Ultrafiltrationsretentat mit demineralisiertem Wasser bis zu einer Reduktion der elektrischen Leitfähigkeit um 81 % diafiltriert. Anschließend erfolgte eine Entfernung von antinutritiven Bestandteilen und Entfärbung mittels Aktivkohle-Adsorption. Die gewonnene Kartoffelprotein-Lösung wies auf: Die Verfahrensschritte des Beispiels 2 sind in Fig. 9 verdeutlicht. Beispiel 2 stellt ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dar, ist aber keinesfalls auf dieses eingeschränkt.
Nachfolgend sind weitere Anwendungsbeispiele angegeben, die Einsatzmöglichkeiten des erfindungsgemäßen wasserlöslichen Proteins zeigen - weitere Anwendungen sind dem Fachmann offensichtlich.
Beispiel 3: HPLC
Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein nach Beispiel 1 wurde mittels einer HPLC der Fa. Knauer untersucht. Als Säule wurde eine HPLC Xbridge BEH SEC 200A, 3,5 der Fa. Waters verwendet und mit einer wässrigen Lösung von 0,02 M Na2HPO4/NaH2PO4 mit pH 7 eluiert. Als Standards wurden von Sigma-Aldrich verwendet: 670 kDa - Thyreoglobulin 150 kDa - Gamma-Globulin
44,3 kDa - Ovalbumin
13.74 kDa - Ribonuclease A
Zur Detektion wurde die UV-Absorption bei 214 nm verwendet. Das gemessene HPLC Chromatogramm ist in Fig. 2 gezeigt, wobei die Zeit in Minuten gegen die Absorbtion in absorbance units aufgetragen ist. In Fig. 2 ist der Proteinstandard (unterbrochene Linien) mit relativ scharfen Peaks bei 10,84 min für Thyreoglobulin; 14,12 min für Gamma-Globulin;
15.74 min für Ovalbumin und 18,93 min für Ribonuclease gezeigt. Das Chromatogramm des erfindungsgemäßen Proteins (durchgezogene Linie) wurde mit demjenigen der Standards überlagert. Deutlich erkennt man verschiedene Proteinfraktionen, wobei zwei Hauptkomponenten bei Retentionszeiten von etwa 10 und 15 Minuten auftreten, sowie ein Gemisch verschiedener Proteine im Bereich von 17-20 Minuten.
Bei der Auswertung der HPLC Chromatogramme wird davon ausgegangen, dass das Volumen der Peakfläche der Signale entspricht. Eine Auswertung der Volumenverteilung ergab, dass sich sowohl für den Protein-Standard als auch für das erfindungsgemäße Kartoffelprotein deren relative Peak-Verhältnisse auch bei unterschiedlichen Detektorwellenlängen nicht verändern. Deshalb ist näherungsweise eine halbquantitative Aussage über die Mengenverteilung und ein Rückschluss von der Volumenverteilung auf deren Molmassen möglich. Das Volumen der Proteine im erfindungsgemäßen Kartoffelprotein kann daher halbquantitativ den Molmassen zugeordnet werden: Molmassen und Retentionszeiten des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins:
Das erste charakteristische Signal bei Retentionszeiten von 8,9 bis 11,7 min kann in seinem Maximum bei 10.7 min einer Molmasse von 697 kDa zugeordnet werden. Die Hauptfraktion (30% der Gesamtfraktion, Retentionszeit: 13,41 - 16,32 min) kann Molmassen von 43,5 kDa bis 182,0 kDa zugeordnet werden. Zusätzlich setzt sich das erfindungsgemäße Kartoffelprotein aus einem Gemisch von kleineren Proteinen (Retentionszeit: 16,3 - 30,0 min) zusammen. Den größten Anteil bilden innerhalb dieses niedermolekularen Bereichs Proteine mit Molmassen von 5,2 bis 13 kDa.
In Fig. 3 ist ein HPLC Chromatogramm des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins (durchgezogene Linie) und des auf dem Markt verfügbaren Kartoffelproteins Solanic 300® der AVEBE (unterbrochene Linie) dargestellt, wobei die Zeit in Minuten gegen die Absorbtion in absorbance units aufgetragen ist. Im Vergleich der beiden Chromatogramme ist deutlich erkennbar, dass es sich bei Solanic 300® um eine Einzelfraktion (99%, Retentionszeit: 15,5 - 27,4 min) eines bestimmten Molekulargewichtbereichs handelt.
In Fig. 4 ist ein HPLC Chromatogramm des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins (durchgezogene Linie) und des auf dem Markt verfügbaren Produkts Solanic 200® der AVEBE (unterbrochene Linie) erkennbar, wobei die Zeit in Minuten gegen die Absorbtion in absorbance units aufgetragen ist. Während im Solanic 200® die Protease-Inhibitoren- Fraktion (Pl-Fraktion) fehlt, ist diese im erfindungsgemäßen Kartoffel protein, welche eine wasserlösliche Gesamtfraktion des Kartoffelproteins darstellt, weiterhin vorhanden.
Im Vergleich zu den So/an/c®-Produkten stellt das erfindungsgemäße Kartoffelprotein eine wasserlösliche Gesamtfraktion des Kartoffelproteins dar. Damit ist es die einzige kommerziell und ökonomisch herstellbare hochfunktionelle Gesamtkartoffelproteinfraktion. Bislang sind nur funktionelle Einzelfraktionen oder koagulierte und damit in ihrer Funktionalität deutlich eingeschränkte Gesamtproteinfraktionen verfügbar. Unter Gesamtkartoffelprotein wird hier eine Gesamtfraktion der wasserlöslichen Proteine verstanden. Andere kommerzielle Kartoffelproteine, wie das Protafy 130® von KMC, konnten wegen zu geringer Löslichkeit gar nicht mittels HPLC untersucht werden. Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein wurde auch mittels SDS-Page Gelchromatographie untersucht - s. Fig. 5. Es ist deutlich eine Trennschärfe des Verfahrens zu erkennen, wodurch Proteine mit einem Molekulargewicht > 120 kDa nicht im Produkt vorhanden sind. Hier sind wie auch im HPLC Chromatogramm drei intensivste Bereiche erkennbar und können nach der SDS-Page Molekulargewichten von 10 - 20 kDa, 25 - 40 kDa und etwa 66 kDa zugeordnet werden.
Beide Analyse-Verfahren sind jedoch bezüglich der ermittelten Molekulargewichte nicht vergleichbar, da die Proteine in den Messmethoden unterschiedlich denaturiert vorliegen. Dennoch zeigen beide Verfahren, dass drei Proteingemische Hauptkomponenten des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins sind. Nach SDS-Page entspricht das Bereichen von 10 - 20 kDa, 25 - 40 kDa und einem Gemisch um 66 kDa, während sich das erfindungsgemäße Kartoffelprotein nach HPLC-Chromatographie aus einem Proteingemisch von 428 - 1627 kDa, der Hauptfraktion von 43 - 182 kDa und einem Gemisch kleinerer Proteine mit einem Hauptanteil bei 5 - 13 kDa zusammensetzt.
Die Diskrepanz in den nachgewiesenen Molekülgrößen ist auf die unterschiedlichen analytischen Methoden zurückzuführen: Während bei der SDS-Page die Masse der Proteine in ihrer Primärstruktur bestimmt wird, wird bei der HPLC-Chromatographie das Volumen der Proteine bestimmt. Hier befinden sich die Proteine nach wie vor in ihrer Quartärstruktur. Die Primärstruktur des Proteins entspricht dabei ihrer Aminosäuresequenz in gestreckter Form, während bei der Quartärstruktur das Protein in räumlicher Struktur als Proteinkomplex vorliegt - somit besteht ein Unterschied in den vorliegenden Bindungsverhältnissen. Aus diesem Grund wirken die angegebenen Molekülgrößen zunächst sehr unterschiedlich.
Beispiel 4: Differential-Scanning-Calorimetie-Analyse (DSC):
Denaturierung eines Proteins bedeutet, dass das Protein in seinem Faltungszustand hin zu einer Proteinstruktur geringerer Ordnung verändert wird. Die Entfaltung eines Proteins ist ein energetisches Gleichgewicht von verschiedenen Interaktionen zwischen Protein-Gruppen und dem umgebenden Medium, sodass die Matrix, in welcher das Protein gelöst ist, die Menge der aufgenommenen Energie beim Denaturieren beeinflusst.
Diese Faltungs- und Entfaltungsreaktionen sind mit Wärmeeffekten verbunden, die mittels Differential-Scanning-Calorimetry-Analyse (DSC) untersucht werden können. Bei der DSC- Analyse wird die Wärmekapazität eines Proteins in wässriger Lösung als Funktion der Temperatur gemessen, wobei die Fläche unter der Wärmekapazitätskurve der Enthalpie der Denaturierung entspricht. Eine größere Enthalpie, d.h. mehr Wärme, die zur Zerstörung der geordneten Proteinstruktur benötigt wird, deutet auf eine höheren Faltungsgrad des Proteins hin. Die Peak-Temperatur des Wärmekapazitäts-Profils (TdPeak) entspricht der Übergangstemperatur (transition temperature).
Für die Messungen wurden etwa 60 mg einer 50%igen handelsüblichen Lösung des zu untersuchenden Proteins in demineralisiertem Wasser in einen 100 pL Aluminiumtiegel eingewogen. Die Messung erfolgte an einem DSC3+ Star System von Mettler Toledo® unter Stickstoff-Atmosphäre, wobei ein Temperaturbereich von 25 - 95 °C mit einer Heizrate von 10 °C/min untersucht wurde. In Fig. 6 ist erkennbar, dass das Tierfutter Kartoffelprotein (punktgestrichelte Linie, erste Kurve), bei dem es sich um ein mittels Temperaturerhöhung und pH-Wert-Anpassung koaguliertes Protein handelt, keine Wärme aufnimmt. Das ist auf die vollständige Denaturierung des Proteins zurückzuführen. Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein (gepunktete Linie, zweite Kurve) zeigt hingegen ab einer Temperatur von ca. 64 °C eine Wärmeaufnahme, was dem Beginn der Denaturierung (TonSet) entspricht. Die Wärmaufnahme endet bei ca. 87 °C, sodass sich eine Denaturierungs-Peak-Temperatur (TdPeak) von etwa 77 °C ergibt. Im Anschluss wurden zum Vergleich die kommerziell erhältlichen Kartoffelproteine Solanic 300® (kurz-gestrichelte Linie, dritte Kurve) und Solanic 200® (lang-gestrichelte Linie, vierte Kurve) untersucht. Bei Solanic 300® handelt es sich wie oben beschrieben um eine Mischung verschiedener Proteine geringen Molekulargewichts, die als Protease-Inhibitoren Fraktion (Pl-Fraktion) zusammengefasst werden kann. Bei Solanic 200® handelt es sich hingegen um ein raffiniertes Patatin, bei dem die Protease- Inhibitoren (Pl-Fraktion) nahezu vollständig fehlen. Das spiegelt sich in der DSC-Messung wieder.
Solanic 200® beginnt bereits ab einer Temperatur von 62 °C Wärme aufzunehmen, wobei die Wärmeaufnahme schon bei 79 °C endet (TdPeak = 72 °C). Solanic 300® hingegen nimmt ähnlich wie das erfindungsgemäße Kartoffel protein ab ca. 64 °C Wärme auf, welche jedoch bei ca. 83 °C endet.
Anhand der Temperaturprofile zeigt sich allgemein, dass es sich bei allen Proteinen, um deutlich verschiedene Produkte handelt. Generell werden größere Proteine leichter denaturiert, also bei kleineren Temperaturen, als kleinere Proteine, welche ab einer gewissen Größe gar nicht mehr denaturiert werden können. Deshalb weist Solanic 300® dementsprechend eine längere Wärmeaufnahme auf, da es im Gegensatz zu Solanic 200® die Pl-Fraktion enthält. Anhand der deutlich längeren Wärmeaufnahme des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins wird deutlich, dass dieses eine andere Proteinfraktion aufweist, in der kleine Proteine noch enthalten sind.
Beispiel 5: Analytische Charakterisierung
Es wurde erfindungsgemäßes getrocknetes Kartoffel protein, herstellbar nach Beispiel 1, untersucht. Analytische Methoden:
Feuchtiqkeitsbestimmunq:
• Gerät: Oberflächentrockner (Trocknungstemperatur 105°C Stufe 2)
Proteinqehalt:
• Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl (Nx6,25), DIN EN ISO 3188
Produktlöslichkeit:
• Einwaage: 40 g Leitungswasser + 0,5 g Produkt
• Rührzeit: 1 h
• auf 50 mL im Messkolben auffüllen
• 30 min. bei 2770 x g zentrifugieren
• über Whatmann-Filter (Nr. 1) filtrieren (Papierfilter mit 11 micrometer Porengröße)
• 20 - 25 g Filtrat in eine Glasschale einwiegen
• 24 Stunden im Trockenschrank bei 100°C trocknen
_ Trockensubstanz Filtrat r%l
Berechnung ö: 0,5 - 0,5 g ■ Feuchtigkeit [%] ■ 10000
Proteinlöslichkeit:
• Siehe Produktlöslichkeit
• Vom Filtrat wurde eine Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl (Nx6,25), DIN EN ISO
• 3188 durchgeführt
• Einwaage: ca. 6 g Filtrat
Die Löslichkeiten des erfindungsgemäßen getrockneten Kartoffelproteins sind dabei stark abhängig von dem Salzgehalt des für die Analyse verwendeten Wassers.
Asche:
• Einwaage: ca. 1 g Produkt
• Mikrowellen-Ofen: MAS 7000
• Veraschungstemperatur: 550°C
• Veraschungszeit: 60 Minuten
Schaumaktivität und -Stabilität:
• 5 g Produkt in 95 g demineralisiertem H2O lösen
• 15 Minuten bei Stufe 3 aufschlagen (Hobart 50-N)
• Schaumvolumen bestimmen = Schaumaktivität in mL
• Bestimmung des Schaumvolumens nach 60 min. Standzeit = Schaumstabilität in % Emulsionskapazität:
• Einwaage: 80 g demin. H2O + 10 g Produkt
• 250 mL Sonnenblumenöl in einen Tropftrichter geben
• Rühren mit Ultra Turrax bei 20000 UpM, Temperatur von 20 °C halten
• Sonnenblumenöl kontinuierlich bis zur Phaseninversion (bis Emulsion
• schlagartig dünner wird) hinzufügen
• Das Volumen des nicht verbrauchten Sonnenblumenöls bestimmen
• 250 mL - Restvolumen = Verbrauch (Sonnenblumenöl)
• Ergebnis: 10 g Produkt : 80 g demin. H2O : Verbrauch / 10
• Viskositätsmessung mittels Brookfield HAT, Spindel 4, 20 UpM
Viskosität:
In Fig. 7 sind Versuche zur Viskosität des erfindungsgemäßen getrockneten Kartoffelproteins (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer mit Calciumchlorid-behandelten Probe (gepunktete Linie) gezeigt, wobei die Zeit in Minuten gegen die Viskosität in cP aufgetragen ist. Für die Herstellung der mit Calciumchlorid-behandelten Probe wurden 0.5 Gew.% Calciumchlorid bezogen auf die Masse des Kartoffelfruchtwassers als wässrige Lösung (CaCh : Wasser = 1 : 3) nach der mechanischen Abtrennung der Feststoffe und vor der Einstellung des pH-Werts und vor der Zentrifugalseparation zugegeben, woraufhin alle weiteren Prozessschritte wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden (siehe Fig. 1). Die Viskositätsprofile wurden dabei wie folgt aufgenommen: Es wurde eine 15%ige Lösung des Produkts in demineralisiertem Wasser hergestellt. Im Anton Paar Physica MCR 301 (Standard-Einsatz, Rührer ST24-2D, 60 U/min) wurden 35 mL der Lösung nach dem Temperaturprofil (Start: 25 °C, Heizen 6.5 °C/min, 12 min bei 90 °C halten, 25 Kühlen mit 4.3 °C/min, 10 min halten bei 25 °C) gemessen. In Fig. 7 ist deutlich erkennbar, dass die CaCh-Behandlung des Proteins einen deutlichen Einfluss auf die Viskosität des Proteins hat. Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein besitzt bei Erreichen der Temperatur von 90 °C eine Viskosität von etwa 230 cP, welche am Ende der Abkühlungsperiode auf ca. 335 cP ansteigt und damit ein festes Gel bildet. Durch die Zugabe von CaCh steigert sich die Viskosität bei Erreichen der Höchsttemperatur von 90 °C sogar auf etwa 350 cP, jedoch ist das ausgebildete Gel nicht stabil. Beim Abkühlen nimmt die Gelfestigkeit kontinuierlich ab, sodass sie am Ende der Messung nur noch bei etwa 225 cP liegt und damit deutlich geringer als die des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins.
Gelfestigkeit:
In Fig. 8 sind Versuche zum Gelbildungsverhalten der Proteine gezeigt, wobei die Zeit in Sekunden gegen die Kraft in Gramm aufgetragen ist. Dabei wurde das erfindungsgemäße Kartoffel protein (durchgezogene Kurve) mit einer mit CaCh-behandelten Probe des Kartoffelproteins (gepunktete Linie) verglichen, um den Einfluss des Salzes auf das Protein zu veranschaulichen. Für die Herstellung der mit Calciumchlorid-behandelten Probe wurden erneut 0.5 Gew.% Calciumchlorid bezogen auf die Masse des Kartoffelfruchtwassers als wässrige Lösung (CaCh : Wasser = 1 : 3) nach dem mechanischen Abtrennen der Feststoffe und vor der Einstellung des pH-Werts und vor der Zentrifugalseparation zugegeben, woraufhin alle weiteren Prozessschritte wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden (siehe Fig. 1). Die Gelfestigkeit wurde mittels Texturanalyse mit dem TA XT plus Texture Analyzer unter Verwendung des Stempels (SMS P 05) (Weg: 20 mm, Vor-, Test-, und Rückgeschwindigkeit: 1,0 mm/sec; Auslösekraft: 20 g) bei Raumtemperatur untersucht.
• Vorbereitung von 2 Proben: Protein (6 g bzw. 12 g Produkt) vorlegen und demin. H2O (34 g bzw. 68 g) zugeben, Rühren bis zur Lösung des Proteins
• 30 mL der Probenlösung in ein Anton Paar Rheometer mit Metallzylinder mit Loch (H- CC27-D) geben
• Aufkochen der Probenlösung: Starttemperatur von 25 °C, Heizphase: Erhitzen auf 90 °C mit einer Heizrate von 6,5 °C/min, Haltezeit bei 90 °C für 15 min, Kühlphase: Abkühlen auf 25 °C mit einer Kühlrate von 4,0 °C, Haltezeit bei 25 °C für 10 min
• aufgekochte Probenlösung für 24 h bei Raumtemperatur lagern
• Texturanalyse mit dem TA XT plus Texture Analyzer
Bei der Messmethode wird ein Stempel langsam in die vorbereitete Probenlösung gedrückt, was dem ersten Peak entspricht. Beim Hineinfahren des Stempels in das Gel muss solange eine Kraft aufgebracht werden, bis der Stempel vollständig in das Gel eingedrungen ist. Die negative Kraft entspricht anschließend dem Zurückfahren des Stempels und dem elastischen Nachziehen des Gels. Danach wird der Vorgang wiederholt und der Stempel dringt ein zweites Mal in das Gel ein. Die Maximalkraft ist bei dem zweiten Vorgang meist geringer, da die Gelfestigkeit durch den ersten Vorgang noch beeinträchtigt ist. Je ähnlicher die Peaks sich dabei sind, desto größer ist die Elastizität des Gels.
Deutlich erkennt man, dass unterschiedliche Kräfte zum Durchstoßen des Gels benötigt werden. Während beim erfindungsgemäßen Kartoffelprotein beim ersten Peak eine maximale Kraft von 1265 g aufgebracht werden muss, verringert diese sich beim zweiten Durchstoßen des Stempels um -34 % auf 836 g. Die Behandlung mit Calciumchlorid hat starken Einfluss auf die Gelfestigkeit des Proteins. Die Messung verdeutlicht dabei die bereits im Stand der Technik erläuterte starke Abhängigkeit des Proteins von äußeren Faktoren. Die behandelte Probe weist beim ersten Peak eine Maximalkraft von 1815 g auf, welche beim zweiten Peak lediglich um 24 % verringert (1468 g). Das heißt, dass die CaCh- Behandlung die Gelfestigkeit des Kartoffelproteins deutlich erhöht und dessen Elastizität geringfügig verbessert wird. Chemische Untersuchungsergebnisse:
Probennr.: 209-2022-00035006
Probenbezeichnung: Empro K
Die o.g. Proteinanalyse einer einzigen erhaltenen Proteincharge gilt nur beispielhaft für das erfindungsgemäße Protein, das je nach Kartoffelwachstumsbedingung und Lagerung Schwankungen unterliegt.
Nachfolgend werden Anwendungsbeispiele angegeben, die Einsatzmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins zeigen. Dessen Einsetzbarkeit beschränkt sich jedoch nicht auf diese - weitere Anwendungen sind dem Fachmann offensichtlich.
Beispiel 6 - Mousse au Chocolat:
1 . Zugabe des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins zu Wasser unter Rühren auf einer Rührplatte (3 Minuten, ca. 1000 U/rnin) zur Herstellung einer 3 %igen Lösung
2. Schmelzen der Kuvertüre im Thermomix® durch Erhitzen auf 65 °C bei einer Geschwindigkeit von 4-5
3. Zugabe der zuvor hergestellten 3 %igen Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins in die Schale des Hobart® und steif schlagen (Level 3 für 5 Minuten)
4. Leichtes Abkühlen der geschmolzenen Schokolade und Einrühren in die steife Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins
5. Mousse im Kühlschrank für mindestens 2 Stunden lagern
Die mit dem erfindungsgemäßen Kartoffelprotein hergestellte Mousse zeigte im Vergleich zu einer mit Eiklar hergestellten Mousse eine bessere Struktur, die luftiger war. Zudem zeigte die mit dem erfindungsgemäßen Protein hergestellte Mousse eine größere Lagerstabilität, da die luftige Struktur auch nach 4 Tagen noch unverändert war, während die mit Eiklar hergestellte Mousse verhärtet. Darüber hinaus wies die mit dem erfindungsgemäßen Kartoffelprotein hergestellte Mousse ein besseres Mundgefühl auf und schmilzt auf der Zunge. Als großer Vorteil erwies sich zudem, dass die so hergestellte Mousse Salmonellenfrei ist, während die Verwendung von Frischei immer mit der Gefahr einer Salmonellen- Vergiftung einhergehen kann. Zuletzt konnte durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins gegenüber Eiklar eine glattere Struktur mit schönerer Schokoladenfärbung erreicht werden.
Beispiel 7 - Yellow Cake:
1. Die 3 %ige Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins steif schlagen
2. Zucker und Butter mischen
3. Mehl, Milch und Backpulver zu der Butter-Zucker-Mischung zugeben
4. Steif geschlagene Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins mit einem Löffel unterheben
5. Teig in eine Kastenform geben
6. Backen für 50 - 60 min bei 170 °C Umluft
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins wurde ein lockerer Teig erzielt. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Kartoffelprotein sehr gut als veganer Hühnereiweiß-Ersatz.
Beispiel 8 - Französische Meringue
1. Die Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins (optional unter Zugabe des Xanthans) in der KitchenAid® für 5 min steif schlagen
2. Zucker unter Rühren langsam hinzugeben
3. 3 min weiterschlagen
4. Masse mit einem Spritzbeutel auf ein Backblech geben
5. Für eine Stunde bei 100 °C Umluft trocknen Durch seine sehr gute Aufschlagfähigkeit eignet sich das erfindungsgemäße Kartoffelprotein sehr gut als veganer Hühnereiweiß-Ersatz.
Gleichermaßen kann die Meringue auch durch direkten Einsatz der hergestellten Protein- Lösung ohne vorherige Trocknung hergestellt werden.
Beispiel 9 - Protein-angereicherte Pasta
1. Alle trockenen Zutaten gut vermischen
2. Etwa 450 - 530 g kaltes Leitungswasser pro 1000 g trockene Zutaten zugeben
3. Mischen/Kneten mit der Haussier Nudelmaschine PN 300 VXS für etwa 15 min
4. Mit einem single screw Extruder komprimieren und formen
5. Trocknung bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt < 13 Gew.%
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins wurde die Darstellung einer proteinangereicherten und zugleich Gluten-freien Pasta ermöglicht.
Beispiel 10 - Vegane Burger: 1. TVP für 15 min rehydratisieren lassen
2. die Mixtur bis zur gewünschten Partikelgröße schreddern
3. alle trockenen Inhaltsstoffe zugeben und mit dem Öl emulgieren
4. Burger Patties formen
Das erfindungsgemäße Kartoffelprotein bildete direkt beim Erhitzen ein sehr festes Gel aus. Dieser Vorgang konnte bereits bei relativ geringen Temperaturen, also bereits beim Braten der Patties beobachtet werden, während dies bei vielen anderen Proteinen erst beim Abkühlen und auch bei höheren Temperaturen zu beobachten ist. Dadurch konnte durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins eine deutliche Verbesserung von Produktbindung, Festigkeit und des fleischähnlichen Mundgefühls erreicht werden. Die Gelbildung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins ist irreversibel.
Die hergestellte Protein-Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins, ohne Trocknungsschritt, kann bei veganen Burger zur Herstellung einer Emulsion verwendet werden. Vorteilhaft ist, dass das erfindungsgemäße Kartoffel protein so als Emulgator wirkt. Die oben genannten Vorteile des erfindungsgemäßen, getrockneten Kartoffelproteins gelten genauso für das Protein in Lösung.
Bei der Verwendung des Fettes/ Öls ist an dieser Stelle die oben beschriebene Lipaseaktivität des Patatins zu berücksichtigen. Es zeigten sich pflanzliche Fette und Öle als besonders geeignet für diese Anwendung.
Es besteht zudem die Möglichkeit, die geformten Burger vor der Zubereitung im Konvektomaten zu blanchieren (50% Luftfeuchtigkeit, 100 °C, 15 min), was zu einer optimalen Texturierung und Ausbildung des Geschmackprofils führt.
Beispiel 11 : Textured-Vegetable-Protein (TVP)
1. Mischen der Zutaten
2. Extrusion der Mischung mittels Laborextruder von Theysohn (TSK 30) mit einem Verhältnis Trockenmischung: Wasser von 98.5 : 1.5. 3. Zweimalige Trocknung der TVPs mit Hilfe des Fließbetttrockners von Pavan (Mod. Tabatto Da Laboratorio) bei 110 °C
Das erfindungsgemäße Kartoffel protein sorgte für eine verbesserte Stabilität der TVPs (texturierte vegetabile Proteine) nach dem Rehydrieren, sodass diese nicht matschig wurden. Zudem konnte durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins eine Verbesserung der Textur der TVPs erreicht werden, welche fester, faseriger, wasserhaltiger und damit fleischähnlicher wird, was auf die hervorragenden Gelbildungseigenschaften des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins zurückgeführt werden kann.
Im Bereich der texturierten vegetarischen Proteine (TVP) kann die Lösung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins in Kombination mit einer Trockenstoffmischung aus getrocknetem, erfindungsgemäßen Protein und gegebenenfalls anderen Zutaten (z.B. Mehlen, Stärken oder Fasern) verwendet werden. Die Vorteile sind ähnlich zum Einsatz des getrockneten Proteins.
Beispiel 12: Ready-to-shake Drink (RTS-Drink)
1. Alle trockenen Zutaten miteinander vermischen.
2. etwa 300 mL Wasser oder vegane Milch in einen Protein-Shaker geben und 30 g der Protein-Mischung zugeben.
3. Alle Zutaten durch Schütteln für etwa 20 Sekunden vermischen.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kartoffelproteins bildeten sich ein stabiler Schaum und eine stabile Lösung. Das Kartoffelprotein wies eine gute Löslichkeit auf, wodurch ein cremiges Mundgefühl erreicht wurde. Obwohl kein Fett, das aus ernährungsphysiologischer Sicht vermieden werden sollte, zugegeben wurde, entstand durch das erfindungsgemäße Kartoffelprotein ein sahniges Mundgefühl. Obwohl die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert wurde, ist dem Fachmann offensichtlich, dass verschiedenste weitere Ausführungen möglich sind, wobei der Schutzumfang alleine durch die Ansprüche bestimmt wird.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines nativen, funktionalen Kartoffelproteins mit einem Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur), mit den Schritten:
Vorlegen optional unter Oxidationsschutz zerkleinerter, gereinigter Kartoffelteilchen;
Mechanisches Abtrennen der Feststoffe aus den zerkleinerten gereinigten Kartoffelteilchen unter Herstellung von Kartoffelfruchtwasser und Feststoffen;
Einstellung des pH-Wertes des Kartoffelfruchtwassers auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9;
Separation unlöslicher Bestandteile und Schwebstoffe mittels Zentrifugalseparation,
Ultrafiltration des pH-Wert eingestellten Kartoffelfruchtwassers;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats zur Herabsetzung der elektrischen Leitfähigkeit der Retentatlösung um 50 - 90%, bevorzugt 65 - 90%, besonders bevorzugt 75 - 85% unter Erhalt der Kartoffelproteinlösung; ggf. Trocknen der Kartoffelproteinlösung und ggf. Entkeimung.
2. Verfahren, nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Wert-Einstellung nach der mechanischen fest-/flüssig-Trennung auf einen pH-Wert von 6 - 9, bevorzugt 6,5 - 8,2, besonders bevorzugt 6,9 - 7,5 erfolgt.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trocknen ausgewählt ist aus Sprühtrocknen, Lyophilisieren, Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltrationsmembran eine Kunststoff- oder Keramikmembran mit einem cut-off von 3 - 150 kDa, bevorzugt 5 - 120 kDa, besonders bevorzugt 10 - 100 kDa ist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Behandlung der Proteinlösung optional vor oder nach der Ultrafiltration mit Adsorptionsmitteln, ausgewählt aus Aktivkohle, Bentoniten, polymeren Adsorptionsmitteln, sowie Derivaten derselben.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultrafiltrationsretentat schonend entkeimt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Entkeimung ausgewählt ist aus Pasteurisierung mit Mikrowellen oder HTST-Pasteurisierung (High Temperature Short Time), PEF-Steriliserung (Pulsed Electric Fields), HPP-Pasteurisierung (High Pressure Pasteurization).
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Diafiltration verwendete Wasser eine Leitfähigkeit von 5 pS/cm - 5000 pS/cm bevorzugt 10 - 50 pS/cm oder auch 5 - 50 pS/cm besitzt.
9. Kartoffelprotein, herstellbar durch:
Vorlegen optional unter Oxidationsschutz zerkleinerter, gereinigter Kartoffelteile in Form von Kartoffelmaische, mechanische Auftrennung der Kartoffelmaische in Fest- und Flüssigphase (Kartoffelfruchtwasser);
Einstellung des pH-Wertes auf 6 - 9, bevorzugt 6,5 - 8,2, besonders bevorzugt 6,9 - 7,5. Separation unlöslicher Bestandteile und Schwebstoffe mittels Zentrifugalseparation;
Ultrafiltration der Flüssigphase mit Membranen eines cut-off von 3 - 150 kDa, bevorzugt 5 - 120 kDa, besonders bevorzugt 10 - 100 kDa;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats bis zu einer Reduktion der Leitfähigkeit um 50 - 90 %, bevorzugt, 65 - 90 % und besonders bevorzugt um 75 - 85 %;
Entfernung von antinutritiven Stoffen mittels Adsorptionstechniken; ggf. Entkeimung und ggf. Trocknung der Protein-Lösung.
10. Kartoffel-Protein nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch a) Proteingehalt von mind. 84 %atro nach Kjeldahl, b) Produktlöslichkeit/Proteinlöslichkeit des auf 10 Gew.% Feuchte getrockneten Proteins in Leitungswasser von 75 - 100% und c) Aschegehalt von max. 3 Gew.%
11. Kartoffelprotein nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es nach Trocknen einen Feuchtegehalt von max. 10 Gew.% aufweist.
12. Kartoffel-Protein nach Anspruch 9 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekulargewicht von 10 - 120 kDa (nach SDS-Page Primärstruktur) aufweist.
13. Kartoffel-Protein, nach einem der Ansprüche 9 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass es drei Hauptfraktionen aufweist, wobei die erste Hauptfraktion ein Molekulargewicht von 10 bis 20 kDa aufweist, die zweite Hauptfraktion ein Molekulargewicht zwischen 25 und 40 kDa sowie die dritte Hauptfraktion ein Molekulargewicht von etwa 66 kDa nach SDS-Page Primärstruktur besitzt.
14. Kartoffel-Protein nach einem der vorangehenden Ansprüche 9 - 13 dadurch gekennzeichnet, dass es Bestandteil eines Lebensmittels oder -Zusatzes, ein diätisches Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz für menschlichen oder tierischen Genuss ist.
15. Kartoffel-Protein nach einem der vorangehenden Ansprüche 9 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass es Bestandteil eines Klebstoffes ist.
16. Kartoffel-Protein nach einem der Ansprüche 9 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass es Bestandteil einer Mischung mit anderen pflanzlichen Proteinen ist, bevorzugt Leguminosenproteine, wie Erbsenprotein, Bohnenprotein, Ackerbohnenprotein, Linsenprotein, Sojaprotein, Lupinenprotein, Mungbohnenprotein, oder Mischungen dieser.
17. Kartoffel-Protein nach einem der Ansprüche 9 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass es Bestandteil einer Mischung mit tierischen Proteinen ist.
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