EP4649491A1 - Procédé de détection de la présence de polymères dans un spectre obtenu par spectrométrie de masse - Google Patents

Procédé de détection de la présence de polymères dans un spectre obtenu par spectrométrie de masse

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Publication number
EP4649491A1
EP4649491A1 EP24704519.8A EP24704519A EP4649491A1 EP 4649491 A1 EP4649491 A1 EP 4649491A1 EP 24704519 A EP24704519 A EP 24704519A EP 4649491 A1 EP4649491 A1 EP 4649491A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
period
descriptor
spectrum
signal
Prior art date
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Pending
Application number
EP24704519.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Priscillia GADEYNE
Guillaume Perrin
Remi THIEBAUT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP4649491A1 publication Critical patent/EP4649491A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/20—Identification of molecular entities, parts thereof or of chemical compositions

Definitions

  • the application relates to a method for detecting the presence of at least one polymer in a spectrum obtained by mass spectrometry.
  • the present disclosure falls within the field of in vitro diagnostics.
  • bacteria In order to properly identify the bacteria in a sample to be analyzed, it is generally required to culture the sample in a nutrient environment. In such a rich environment, bacteria build polymers to store energy and/or get rid of waste. There are other sources of polymers, such as solvents used to clean the sample.
  • polymers have a significant impact on the spectra obtained by mass spectrometry to the extent that they generate spurious signals, which can prevent the detection of peaks of interest for the identification of bacteria, and can lead to false identifications.
  • the present disclosure improves the situation by at least partially remedying the aforementioned drawbacks.
  • a method for detecting the presence of a signal from at least one polymer in at least one spectrum obtained by mass spectrometry of a biological sample comprising: a step of determining a set of at least one parameter, called a descriptor, for the presence of the polymer, a step of assigning a score to each value of each descriptor, and a step of classifying the spectrum on the basis of each descriptor and each score, so as to detect or not the presence of said at least one polymer.
  • the practitioner is quickly informed if the sample is contaminated by one or more polymers, and, therefore, can act accordingly: either exclude the analysis of said sample, or stop the process identification when it is determined that it is impossible to identify the bacteria contained in the sample, or to work on the signal.
  • the step of determining a set of at least one descriptor comprises a step of calculating a period of spectrum obtained by Lomb-Scargle calculation, called Lomb-Scargle period (Ti(LSP)) and/or a period of spectrum obtained by calculation, for at least part of the peaks, of the differences, in an m/z scale, between a peak and all the other peaks, called period difference (Ti(HD)) and/or a comparison parameter of said Lomb-Scargle periods (Ti(LSP)) and difference (Ti(HD)).
  • LSP Lomb-Scargle period
  • the score associated with the Lomb-Scargle period depends on a ratio of a maximum value of a spectral spectral density and an average value of said spectral density, in an interval m/z given.
  • the score associated with the period of the differences depends on a prominence of a difference in peak height.
  • the method comprises a step of refining an analysis window in an m/z scale.
  • one of the limits of said window is evaluated using a period obtained by Lomb-Scargle calculation.
  • the method comprises a step of identifying at least one bacterium in said at least one spectrum obtained by mass spectrometry if, at the end of the classification step, no polymer has been detected .
  • the method comprises a detection alert step of said at least one polymer if, at the end of the classification step, said at least one polymer has been detected.
  • the method comprises a step of modeling the signal coming from a polymer.
  • the method comprises a step of removing the signal obtained by said modeling step.
  • the invention also relates to a computer program comprising instructions for implementing the method according to as already described when this program is executed by a processor.
  • the invention also relates to a non-transitory recording medium readable by a computer on which a program is recorded for implementing the method as already when this program is executed by a processor.
  • the invention also relates to a device for detecting bacteria in a biological sample, comprising said recording medium.
  • Figure 1 shows a spectrum of a sample of a strain of Dermacoccus nishinomiyaensis, without polymer, obtained by mass spectrometry.
  • Figure 2 shows a spectrum of a sample of a strain of Dermacoccus nishinomiyaensis, including polymers, obtained by mass spectrometry.
  • Figure 3 shows a flowchart of a method for detecting the presence of polymers in a biological sample, according to the present invention.
  • Figure 4 shows a periodogram of a spectral density of the signal of a sample obtained by mass spectrometry as a function of a period for the implementation of the method of Figure 3, according to a first variant (abscissa: dalton (Da ) - ordinate: power spectral density (Da 2 /Hz)).
  • Figure 5 shows the periodogram of Figure 4 in the implementation of a score calculation step.
  • Figure 6 shows a histogram of the peak differences for the implementation of another alternative embodiment.
  • Figure 7 shows the histogram of Figure 6 in the implementation of a prominence calculation step.
  • Figure 8 shows a spectrum after a centering step of the analysis window.
  • Figure 9 shows a classification making it possible to distinguish spectra with polymers on the one hand and spectra without polymer on the other hand.
  • Figure 10 shows a selection of a window for polymer signal modeling.
  • a signal from a biological sample likely to include bacteria is acquired using mass spectrometry.
  • a device such as a mass spectrometer comprising a laser ionizing the biological sample.
  • Ion time of flight provides a graph of ion intensity versus m/z ratio, where m is the molecular mass of each ion and z is the charge of each ion.
  • we speak of signal or spectrum to designate the overall intensity profile as a function of the m/z ratio.
  • a calibration step precedes the acquisition step.
  • reference strains are used, such as strains of the bacterium Escherichia coli for example, which produce proteins of a known mass. These reference values make it possible to move from a time-of-flight reference to the m/z reference using a regression.
  • polymers may be present in the analyzed sample. Their signal noises the signal emitted by the bacteria that we are trying to identify. The present invention applies particularly to homopolymers.
  • the overall profile includes a signal from bacteria and a signal from polymers.
  • Figure 1 illustrates a spectrum of a sample of a strain of Dermacoccus nishinomiyaensis, without polymer, obtained by mass spectrometry.
  • Figure 2 illustrates a spectrum from a sample of the same species and contaminated with polymers. As shown in Figure 2, the polymers generate a succession of identical patterns (peaks), whose intensity follows a Gaussian, and which makes detection of the signal of interest more difficult.
  • the repetition of the pattern is in particular linked to the degree of polymerization.
  • a polymer with degree of polymerization n and a polymer with degree of polymerization n+1 emit peaks with a difference on the m/z scale equal to mass_monomer/charge, if they have the same charge.
  • the chains exist with n degrees of polymerization they are found on the spectrum in the form of n peaks spaced by the constant mass_monomer/charge distance. If they have the same charge, this distance is constant.
  • the distribution follows a Gaussian distribution of the intensity of the polymer peaks.
  • one degree of polymerization is more probable than another; this relative abundance explains the Gaussian shape formed by the polymer patterns.
  • bacteria tend to accumulate more amino acids and therefore form longer chains, which shifts the maximum of the Gaussian towards higher m/z.
  • peaks of the two polymers are spaced by a distance equal to mass_adduct/charge. For this reason, a degree of polymerization is characterized by a pattern of peaks rather than an isolated peak.
  • the Holder has shown empirically that the majority of the polymer signal on the m/z portion between 3000 and 17000 Da is composed of monocharged peaks.
  • the DET-Ti step is based on a Lomb-Scargle (LSP) method, known to those skilled in the art in that it makes it possible to detect and characterize periodic signals in data sampled in a manner irregular.
  • LSP Lomb-Scargle
  • a periodogram P of the spectral density of the signal S as a function of the period T.
  • the period of interest Ti corresponds to a maximum of the periodogram, denoted Max, as illustrated in the figure 4.
  • a so-called scipy LSP process is used on a regular frequency grid extending between 40 Da and 400 Da, preferably.
  • the method 100 also includes a step 103 (SCORE) of defining a criterion of a score, Sc(LSP) of the period of interest Ti.
  • the score makes it possible to quantify to what extent the spectral density of the period of interest Ti differs from those calculated for other periods.
  • the method can advantageously include a step of removing peaks of intensity higher than a threshold in order to prevent them from noisy the signal underlying periodic. It should be noted that this noise is in fact the signal of interest (the bacterial proteins) and that the periodic signal of interest is that of the polymers. We are here within the framework of the search for polymers in the signal, the roles are therefore reversed;
  • the method can advantageously include a step of normalizing the intensity of each of the peaks.
  • the DET-Ti step is based on the use of inter-peak differences.
  • the period of interest Ti is the class of the histogram which has the largest number.
  • each class is replaced by a linear combination of the numbers of nearby classes.
  • En be the number associated with class n and a1, a2, a3 e R such that 0 ⁇ a1 ⁇ a2 ⁇ a3 ⁇ 1.
  • En a1 En-2 + a2En-1 + a3En + a2En+1 + a1 En+2.
  • a peak search isolates the peak in the histogram that has the highest prominence, the prominence of a peak being defined as the distance between the top of the peak and the minimum surrounding it, as shown in Figure 7.
  • the method according to the present invention also comprises the determination of a descriptor for comparing the periods of interest Ti(LSP) and Ti(HD).
  • the threshold noted a makes it possible to eliminate cases where the result of one of the variants is not physically correct, which is more likely when the spectrum does not include a polymer. More generally, we carry out a test to determine which natural number the descriptor Ra approximates, using the fact that the period Ti(HD) is a multiple of the true period, while Ti(LSP) is a submultiple of the real period.
  • period comparison descriptor is not the only possible descriptor according to the present invention.
  • the maximum intensity of the periodogram for the LSP method or the prominence for the HD method are other possible descriptors.
  • the method comprises a preliminary step 104, called centering, denoted CENT, to center the analyzed spectrum.
  • centering denoted CENT
  • a given m/z interval is selected at the start of the signal, for example between 2000 Da and 7000 Da.
  • one of the limits of the interval is optimized with respect to the score Sc(LSP) of the period of interest found by the LSP variant. By varying this limit, we recalculate the period and its score so as to obtain the highest possible score, advantageously via a method known as “golden search”.
  • This method is a variation of the dichotomy with an intermediate point chosen so as to respect the proportions of the golden ratio rather than chosen in the middle. To use it, it is necessary to have three points x1, x2, x3 which verify x1 ⁇ x2 ⁇ x3 and f(x1) > x2 ⁇ f(x3) (if we are looking for a minimum).
  • Figure 8 illustrates a spectrum after centering.
  • the selected m/z interval is between 2,000 and 12,000 Da.
  • the signal that corresponds to the polymers is indeed within the selected interval.
  • the CENT centering step makes it possible to efficiently center the area studied on the polymer peaks and significantly improve the results and calculation time. In particular, this step makes it possible to avoid carrying out calculations on all of the peaks but only on a fraction of them.
  • the method comprises a step 105 of classifying the spectra, denoted CLASS, into at least one class or group of positive spectra, that is to say which contain peaks generated by polymers and into a class or group of negative spectra, that is, considered not to contain polymer-generated peaks.
  • an unsupervised method is used, preferably “K-means clustering”.
  • K-means clustering is to optimize groups so that each member of the group is as close as possible to all the others, in the descriptor space.
  • One of the groups thus obtained brings together most of the positive spectra, while the negative spectra are distributed in at least one other group. Classifying the negative spectra into more than two groups makes it possible to account for the diversity of the group's spectra.
  • This first unsupervised classification has the significant advantage of not having any a priori on the data: it creates groups blindly, without knowing the classes of the different spectra.
  • a supervised method is used, advantageously called support vector machine (SVM), or “support vector machine” in English.
  • SVM support vector machine
  • a linear SVM method This method consists of making a decision based on a linear combination of descriptors.
  • the data that is classified can be considered to be the spectrum summarized by the descriptor, and its score.
  • the method 100 comprises a step of identifying the bacteria(s) present in the sample, there are some. This step includes in particular a comparison of the spectrum with spectra belonging to a bank of referenced spectra, each referenced spectrum being that of a given bacterium.
  • the method 100 optionally includes an indication step, for example by visual and/audible alert, that the signal includes at least a polymer.
  • This contamination indication step can lead to a shutdown of the process 100, and no identification of bacteria is carried out.
  • the method 100 according to the present invention optionally comprises a step 106, denoted SUPP, of removing the signal emitted by the polymers.
  • the method 100 makes it possible to eliminate the peaks of the polymers so as to isolate the signal emitted by the proteins of the bacteria.
  • the deletion step is preceded by a step 107 of MODEL modeling of the signal emitted by the polymers.
  • the period Ti(HD) is used, because, on the one hand, it is generally more precise, and, on the other hand, it also makes it possible to obtain a multiple of the period, and therefore to isolate one or more polymer units.
  • the period Ti(LSP) is a submultiple of the period, and its use could lead to isolating only part of the pattern per window.
  • the method 100 according to the present invention ensures reliable and rapid classification of spectra, making it possible to distinguish spectra contaminated by polymers and spectra without polymers.
  • the invention has numerous advantages, among which: a/ the method is purely digital, it is therefore very inexpensive in terms of time and money compared to a biological or chemical method, b/ depending on the use: the detection method can be used for quality control, or serve as a preliminary step before the step of removing polymer peaks, c/ the invention can be directly used to determine which polymer is present in a mass spectrometry sample, it can therefore be applied to other themes than the identification of bacteria.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de détection de la présence d'un signal issu d'un polymère dans des spectres obtenus par spectrométrie de masse d'échantillons biologiques, comprenant une étape (101) de détermination d'un ensemble d'au moins un paramètre, dit descripteur, de présence du polymère, une étape (103) d'attribution d'un score à chaque valeur de chaque descripteur, et une étape (105) de classification des scores en une classe de spectres positifs ne contenant pas de polymère et une classe de spectres négatifs contenant ledit polymère.

Description

Titre : Procédé de détection de la présence de polymères dans un spectre obtenu par spectrométrie de masse
La demande a pour objet un procédé de détection de la présence d’au moins un polymère dans un spectre obtenu par spectrométrie de masse.
Domaine technique
La présente divulgation relève du domaine du diagnostic in vitro.
Technique antérieure
En microbiologie, pour une prise en charge optimale d’un patient, il est essentiel de procéder à une identification rapide de microorganismes dans un échantillon donné. Depuis une décennie, une technique connue sous le nom de spectrométrie de masse MALDI-TOF a grandement accéléré cette identification, permettant aux praticiens de prescrire, de façon fiable et efficace, une antibiothérapie ciblée.
Afin de bien identifier les bactéries dans un échantillon à analyser, il est généralement requis de recourir à une culture de l’échantillon dans un environnement nutritif. Dans un tel milieu riche, les bactéries construisent des polymères pour stocker de l’énergie et/ou se débarrasser de déchets. Il existe d’autres sources de polymères, comme par exemple des solvants utilisés pour nettoyer l’échantillon.
Or, les polymères ont un impact non négligeable sur les spectres obtenus par spectrométrie de masse dans la mesure où ils génèrent des signaux parasites, ce qui peut empêcher la détection des pics d’intérêt pour l’identification des bactéries, et peut entraîner de fausses identifications.
Résumé
La présente divulgation vient améliorer la situation en remédiant au moins partiellement aux inconvénients précités.
A cet effet, il est proposé un procédé de détection de la présence d’un signal issu d’au moins un polymère dans au moins un spectre obtenu par spectrométrie de masse d’un échantillon biologique, comprenant : une étape de détermination d’un ensemble d’au moins un paramètre, dit descripteur, de présence du polymère, une étape d’attribution d’un score à chaque valeur de chaque descripteur, et une étape de classification du spectre sur la base de chaque descripteur et de chaque score, de sorte à détecter ou non la présence dudit au moins un polymère.
Ainsi, grâce au procédé selon la présente invention, le praticien est averti rapidement si l’échantillon est contaminé par un ou des polymères, et, de ce fait, peut agir en conséquence : soit écarter l’analyse dudit échantillon, soit arrêter le processus d’identification quand il est déterminé qu’il est impossible d’identifier les bactéries contenues dans l’échantillon, soit de travailler sur le signal.
Selon un autre aspect, l’étape de détermination d’un ensemble d’au moins un descripteur comprend une étape de calcul d’une période de spectre obtenu par calcul Lomb-Scargle, dite période Lomb-Scargle (Ti(LSP)) et/ou une période de spectre obtenu par calcul, pour au moins une partie des pics, des écarts, dans une échelle m/z, entre un pic et tous les autre pics, dite période différence (Ti(HD)) et/ou un paramètre de comparaison desdites périodes Lomb-Scargle (Ti(LSP)) et différence (Ti(HD)).
Selon un autre aspect, le score associé à la période Lomb-Scargle (Ti(LSP)) dépend d’un rapport d’une valeur maximale d’une densité spectrale spectre et d’une valeur moyenne de ladite densité spectrale, dans un intervalle m/z donné.
Selon un autre aspect, le score associé à la période des différences dépend d’une proéminence d’une différence de hauteur de pics.
Selon un autre aspect, le procédé comprend une étape d’affinage d’une fenêtre d’analyse dans une échelle m/z.
Selon un autre aspect, au cours de l’étape d’affinage, on évalue l’une des bornes de ladite fenêtre à l’aide d’une période obtenue par calcul Lomb-Scargle.
Selon un autre aspect, le procédé comprend une étape d’identification d’au moins une bactérie dans ledit au moins un spectre obtenu par spectrométrie de masse si, à l’issue de l’étape de classification, aucun polymère n’a été détecté.
Selon un autre aspect, le procédé comprend une étape d’alerte de détection dudit au moins un polymère si, à l’issue de l’étape de classification, ledit au moins un polymère a été détecté.
Selon un autre aspect, le procédé comprend une étape de modélisation du signal issu d’un polymère.
Selon un autre aspect, le procédé comprend une étape de suppression du signal obtenu par ladite étape de modélisation.
L’invention a également pour objet un programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre du procédé selon tel que déjà décrit lorsque ce programme est exécuté par un processeur.
L’invention a également pour objet un support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme pour la mise en œuvre du procédé tel que déjà lorsque ce programme est exécuté par un processeur.
L’invention a également pour objet un dispositif de détection de bactéries dans un échantillon biologique, comprenant ledit support d’enregistrement.
Brève description des dessins
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
La figure 1 montre un spectre d’un échantillon d’une souche de Dermacoccus nishinomiyaensis, sans polymère, obtenu par spectrométrie de masse. La figure 2 montre un spectre d’un échantillon d’une souche de Dermacoccus nishinomiyaensis, comprenant des polymères, obtenu par spectrométrie de masse.
La figure 3 montre un ordinogramme d’un procédé de détection de présence de polymères dans un échantillon biologique, selon la présente invention.
La figure 4 montre un périodogramme d’une densité spectrale du signal d’un échantillon obtenu par spectrométrie de masse en fonction d’une période pour la mise en œuvre du procédé de la figure 3, selon une première variante (abscisse : dalton (Da) - ordonnée : densité spectrale de puissance (Da2/Hz)).
La figure 5 montre le périodogramme de la figure 4 dans la mise en œuvre d’une étape de calcul de score.
La figure 6 montre un histogramme des différences de pics pour la mise en œuvre d’une autre variante de réalisation.
La figure 7 montre l’histogramme de la figure 6 dans la mise en œuvre d’une étape de calcul de proéminence.
La figure 8 montre un spectre après une étape de centrage de la fenêtre d’analyse.
La figure 9 montre une classification permettant de distinguer les spectres avec polymères d’une part et les spectres sans polymère d’autre part.
La figure 10 montre une sélection d’une fenêtre pour la modélisation du signal des polymères.
La figure 11 montre une répétition de la fenêtre de la figure 10.
La figure 12 montre un spectre théorique obtenu après application d’une gaussienne au spectre de la figure 11 .
Description détaillée
Le procédé selon la présente invention, référencé 1 sur les figures, s’applique à des spectres obtenus par spectrométrie de masse.
Au cours d’une étape préalable, on acquiert par une spectrométrie de masse un signal d’un échantillon biologique susceptible de comprendre des bactéries. Pour ce faire, de façon connue, on utilise un dispositif tel qu’un spectromètre de masse comprenant un laser ionisant l’échantillon biologique. Le temps de vol des ions permet d’obtenir un graphique représentant l’intensité des ions en fonction de leur rapport m/z, où m est la masse moléculaire de chaque ion et z la charge de chaque ion. Par la suite, on parle de signal ou de spectre pour désigner le profil global de l’intensité en fonction du rapport m/z.
De préférence, une étape de calibration précède l’étape d’acquisition. Au cours de l’étape de calibration, on utilise des souches de référence, comme des souches de la bactérie escherichia coli par exemple, qui produisent des protéines d’une masse connue. Ces valeurs de référence permettent de passer d’un référentiel temps de vol vers le référentiel m/z à l’aide d’une régression. Comme déjà expliqué, des polymères peuvent être présents dans l’échantillon analysé. Leur signal bruite le signal émis par les bactéries que l’on cherche à identifier. La présente invention s’applique tout particulièrement aux homopolymères. Ainsi, le profil global comprend-il un signal issu des bactéries et un signal dû aux polymères.
La figure 1 illustre un spectre d’un échantillon d’une souche de Dermacoccus nishinomiyaensis, sans polymère, obtenu par spectrométrie de masse. La figure 2 illustre un spectre issu d’un échantillon de la même espèce et contaminé par des polymères. Comme il ressort de la figure 2, les polymères génèrent une succession de motifs (pics) identiques, dont l’intensité suit une gaussienne, et qui rend plus difficile la détection du signal d’intérêt.
La répétition du motif est en particulier liée au degré de polymérisation. Un polymère de degré de polymérisation n et un polymère de degré de polymérisation n+1 émettent des pics avec un écart sur l’échelle m/z égal à masse_monomère/charge, s’ils présentent la même charge. Comme les chaînes existent avec n degrés de polymérisation, on les retrouve sur le spectre sous forme de n pics espacés de la distance constante masse_monomère/charge. S’ils présentent la même charge, cette distance est constante.
Comme déjà indiqué, la distribution suit une répartition gaussienne de l’intensité des pics de polymères. En fonction du milieu de culture, un degré de polymérisation est plus probable qu’un autre, cette abondance relative explique la forme gaussienne formée par les motifs de polymères. On note que, dans un environnement riche, les bactéries ont tendance à accumuler plus d’acides aminés et donc à former des chaînes plus longues, ce qui déplace le maximum de la gaussienne vers des m/z plus élevés.
Par ailleurs, pour deux chaînes de polymères identiques à l’exception d’un adduit, par exemple de sodium, les pics des deux polymères sont espacés d’un écart égal à masse_adduit/charge. C’est pour cette raison qu’un degré de polymérisation est caractérisé par un motif de pics plutôt que par un pic isolé.
La Titulaire a montré empiriquement que la majeure partie du signal des polymères sur la portion m/z comprise entre 3000 et 17000 Da est composée de pics monochargés.
On note que le procédé selon la présente invention utilise ce schéma régulier du aux monomères répétés et de la périodicité du signal (pics) des polymères, au contraire des spectres non contaminés par des polymères, qui ne sont pas périodiques.
L’un des objectifs de la présente invention est de distinguer les spectres d’échantillons contaminés par au moins un polymère. Le procédé selon la présente invention, référencé 100, comprend une étape (notée DESCR) 101 d’élaboration d’au moins un descripteur. Chaque descripteur est un paramètre dont le comportement permet de déterminer la présence de polymères dans cet échantillon. Un bon descripteur différencie fortement les échantillons contenant au moins un polymère dans une classe, dite positive, de ceux qui n’en contiennent pas, dans une autre classe, dite négative. Ainsi, l’étape 101 comprend avantageusement une étape 102 de détermination de la période du signal émis par le polymère, notée DET-Ti. On note période d’intérêt Ti dans le signal S du polymère la période déterminée par l’étape DET-Ti.
Selon une première variante, l’étape DET-Ti est basée sur une méthode de Lomb-Scargle (LSP), connue de l’homme du métier en ce qu’elle permet de détecter et caractériser des signaux périodiques dans des données échantillonnées de manière irrégulière.
Pour cela, on établit au cours d’une étape PER un périodogramme P de la densité spectrale du signal S en fonction de la période T. La période d’intérêt Ti correspond à un maximum du périodogramme, noté Max, comme illustré sur la figure 4.
Au cours de l’étape PER, on recourt à un procédé dit scipy LSP sur une grille régulière en fréquences et s’étendant entre 40 Da et 400 Da, de préférence.
Le procédé 100 comprend également une étape 103 (SCORE) de définition d’un critère d’un score, Sc(LSP) de la période d’intérêt Ti. Le score permet de quantifier dans quelle mesure la densité spectrale de la période d’intérêt Ti se distingue de celles calculées pour d’autres périodes.
De préférence, on calcule le score Sc(LSP) selon l’équation suivante : Sc(LSP)=Max/Moy, où Moy est la moyenne de la densité spectrale sur toutes les périodes, comme il ressort de la figure 5.
On note que cette première variante peut également être optimisée en gardant en tête que les données ne sont pas strictement sinusoïdales du fait notamment que :
- Le signal n’est pas parfaitement périodique à cause de pics qui ne correspondent pas aux polymères : le procédé peut avantageusement comprendre une étape de suppression des pics d’intensité plus élevée qu’un seuil afin d’éviter qu’ils bruitent le signal périodique sous-jacent. Il est à noter que ce bruit est en fait le signal d’intérêt (les protéines de la bactéries) et que le signal périodique d’intérêt est celui des polymères. On se situe ici dans le cadre de la recherche de polymères dans le signal, les rôles sont donc inversés ;
- L’intensité des motifs de polymères suit une gaussienne, et le signal n’est donc périodique qu’à un facteur de correction près : le procédé peut avantageusement comprendre une étape de normalisation l’intensité de chacun des pics.
Selon une deuxième variante, dite variante HD, l’étape DET-Ti est basée sur une utilisation de différences inter-pics.
Pour ce faire, on calcule un écart E en m/z entre un pic et tous les pics suivants. Puis, comme illustré sur la figure 6, on trace un histogramme des différences. Ensuite, on sélectionne comme période d’intérêt Ti selon les effectifs des classes.
Par exemple, la période d’intérêt Ti est la classe de l’histogramme qui a l’effectif le plus important.
Préférentiellement, on remplace l’effectif de chaque classe par une combinaison linéaire des effectifs des classes proches. Plus la classe est proche, plus le coefficient associé est élevé. En d’autres termes, on peut écrire : soit En l’effectif associé à la classe n et a1 , a2, a3 e R tels que 0 < a1 < a2 < a3 < 1 .
On réévalue En de la façon suivante, afin de tenir compte des effectifs des classes proches : En = a1 En-2 + a2En-1 + a3En + a2En+1 + a1 En+2.
Ces étapes permettent de déterminer la période d’intérêt Ti même lorsque celle-ci se situe entre deux classes.
Puis, une recherche de pics permet d’isoler le pic de l’histogramme qui a une proéminence la plus élevée, la proéminence d’un pic étant définie comme la distance entre le sommet du pic et le minimum qui l’entoure, comme illustré sur la figure 7.
Alternativement, on pourrait utiliser une taille absolue des pics mais la proéminence permet de faire abstraction du fait que les différences inter-pics plus longues sont moins courantes.
La période d’intérêt, notée Ti(HD), se calcule comme Ti(HD)=(Cinf+Csup)/2, où Cinf et Csup sont des bornes, respectivement inférieure et supérieure, de la classe qui a l’effectif le plus proéminent du signal.
Selon cette variante, le score Sc(HD) s’écrit Sc(HD)=proeminence(C1). De préférence, il s’agit de la proéminence régularisée, comme il sera détaillé ultérieurement.
Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend également la détermination d’un descripteur de comparaison des périodes d’intérêts Ti(LSP) et Ti(HD).
Ce descripteur est le rapport Ra= Ti(HD)/Ti(LSP) auquel on associe un score de 1 si la différence Ti(LSP)-Ti(HD)>a, avec a> 0 fixé de manière empirique. Le score de 1 est le pire envisagé. Le seuil noté a permet d’éliminer les cas où le résultat de l’une des variantes n’est pas physiquement correct, ce qui est plus probable lorsque le spectre ne comprend pas de polymère. Plus généralement, on procède à un test pour déterminer de quel entier naturel le descripteur Ra se rapproche, en utilisant le fait que la période Ti(HD) est un multiple de la vraie période, tandis que Ti(LSP) est un sous multiple de la vraie période.
On note que le descripteur de comparaison des périodes n’est pas l’unique descripteur possible selon la présente invention. Notamment, l’intensité maximale du périodogramme pour la méthode LSP ou la proéminence pour la méthode HD sont d’autres descripteurs possibles.
On note également que les notions de descripteur et de score peuvent être confondues ou distinctes, le descripteur correspondant à la valeur brute et le score à la valeur normalisée.
Avantageusement, le procédé comprend une étape 104 préliminaire, dite de centrage, notée CENT, pour centrer le spectre analysé. En d’autres termes, il s’agit de bien sélectionner l’intervalle m/z du spectre pour analyse, du fait que les signaux correspondant aux polymères n’étant pas présents sur l’ensemble de l’axe m/z.
Selon une première variante, on sélectionne un intervalle m/z donné en début de signal, par exemple compris entre 2000 Da et 7000 Da. Selon une autre variante, on optimise l’une des bornes de l’intervalle par rapport au score Sc(LSP) de la période d’intérêt trouvée par la variante LSP. En faisant varier cette borne, on recalcule la période et son score de sorte à d’obtenir le score le plus élevé possible, avantageusement via une méthode connue sous le terme « golden search ».
Cette méthode est une variante de la dichotomie avec un point intermédiaire choisi de manière à respecter les proportions du nombre d’or plutôt que choisi au milieu. Pour l’utiliser, il est nécessaire d’avoir trois points x1 , x2, x3 qui vérifient x1 < x2 < x3 et f(x1) > x2 < f(x3) (si on cherche un minimum).
On implémente une méthode « bracket » basée sur la « golden search » qui réduit l’intervalle jusqu’à obtenir trois points qui vérifient la propriété précédente. Une fois la borne supérieure trouvée, on résout un deuxième problème d’optimisation pour la borne inférieure, en veillant à garder un intervalle minimal entre la borne inférieure et supérieure afin de s’assurer d’avoir un intervalle m/z suffisant pour être exploitable.
La figure 8 illustre un spectre après centrage. Ainsi, l’intervalle m/z sélectionné est compris entre 2 000 et 12 000 Da. Et, le signal qui correspond aux polymères se trouve effectivement dans l’intervalle sélectionné.
L’étape de centrage CENT permet de centrer efficacement la zone étudiée sur les pics de polymères et d’améliorer significativement les résultats et le temps de calcul. En particulier, cette étape permet d’éviter d’opérer les calculs sur l’ensemble des pics mais seulement sur une fraction d’entre eux.
Le procédé comprend une étape 105 de classification des spectres, notée CLASS, en au moins une classe ou groupe de spectres positifs, c’est-à-dire qui contiennent des pics générés par des polymères et en une classe ou groupe de spectres négatifs, c’est-à-dire considérés comme ne contenant pas de pics générés par des polymères.
Selon une première variante, on utilise une méthode non supervisée, de préférence « clustering K-means ».
Le principe du clustering K-means est d’optimiser des groupes pour que chaque membre du groupe soit le plus proche possible de tous les autres, dans l’espace des descripteurs.
Un des groupes ainsi obtenus réunit la plupart des spectres positifs, tandis que les spectres négatifs se répartissent dans au moins un autre groupe. Classer dans plus de deux groupes les spectres négatifs permet de rendre compte de la diversité des spectres du groupe.
Cette première classification non-supervisée présente l’avantage non négligeable de ne pas avoir d’a priori sur les données : elle fait des groupes en aveugle, sans connaître les classes des différents spectres.
Selon une deuxième variante, on utilise une méthode supervisée, avantageusement dite support vecteur machine (SVM), ou « support vector machine » en anglais. Préférentiellement, on utilise une méthode SVM linéaire. Cette méthode consiste à rendre une décision à partir d’une combinaison linéaire des descripteurs.
Sur la figure 9, qui représente les données dans l’espace des descripteurs, on trouve un hyperplan (en trait plein sur la figure) qui maximise une marge entre la classe de spectres positifs (trait discontinu) et la classe de spectres négatifs (trait discontinu mixte), c’est-à-dire l’écart entre le trait plein et ceux en trait discontinu.
On note que, pour la classification, les données qui sont classées peuvent être considérées comme étant le spectre résumé par le descripteur, et son score.
De préférence, préalablement à l’étape de classification, on régularise chaque descripteur, selon l’équation suivante, pour un descripteur X, donné : régularisé = [X - min(Xentrainement)]/ [max(Xentrainement) - min(Xentrainement)].
En soustrayant la valeur minimale prise par ce descripteur dans un jeu de données d’entraînement et en divisant par la différence entre cette valeur minimale et la leur maximale, on permet à chaque descripteur de prendre des valeurs comparables. On peut ainsi classifier les données sans privilégier un descripteur sur la seule base de son ordre de grandeurs.
Comme déjà indiqué, si le spectre est considéré, à l’issue de l’étape de classification, comme ne contenant pas de polymère, le procédé 100 comprend une étape d’identification de la ou des bactéries présentes dans l’échantillon, s’il y en a. Cette étape comprend notamment une comparaison du spectre à des spectres appartenant à une banque de spectres référencés, chaque spectre référencé étant celui d’une bactérie donnée.
Si le spectre est considéré, à l’issue de l’étape de classification, comme contenant un ou des polymères, le procédé 100 comprend éventuellement une étape d’indication, par exemple par alerte visuelle et/ sonore, que le signal comprend au moins un polymère. Cette étape d’indication de contamination peut induire un arrêt du procédé 100, et on n’effectue pas d’identification de bactéries.
Selon une autre variante, le procédé 100 selon la présente invention comprend éventuellement une étape 106, notée SUPP, de suppression du signal émis par les polymères.
Ainsi, pour un spectre donné, lorsque l’étape de classification a considéré que des polymères sont présents, le procédé 100 permet d’éliminer les pics des polymères de façon à isoler le signal émis par des protéines des bactéries.
L’étape de suppression est précédée d’une étape 107 de modélisation MODEL du signal émis par les polymères.
Au cours de cette étape, on isole un motif de pics de polymères.
On commence par découper le signal en fenêtres successives de la taille d’une période, pour isoler un motif de polymère par fenêtre (avec un décalage potentiel). De préférence, on utilise la période Ti(HD), du fait, d’une part, qu’elle est généralement plus précise, et, d’autre part, elle permet également d’obtenir un multiple de la période, et donc d’isoler un ou plusieurs motifs de polymères.
Au contraire la période Ti(LSP) est un sous multiple de la période, et son utilisation pourrait amener à n’isoler qu’une partie de motif par fenêtre.
On note que la précision de la période est très importante pour ne pas induire un décalage le long de l’axe m/z ; les fenêtres ne seraient alors plus centrées sur un motif de polymère.
Une fois déterminée la meilleure fenêtre (figure 10), on la recopie sur l’ensemble du spectre (figure 11) et on applique une gaussienne au spectre recopié (figure 12).
On obtient alors un signal théorique des polymères, qu’il faut alors soustraire au signal global pour l’éliminer.
Ainsi, le procédé 100 selon la présente invention assure une classification fiable et rapides de spectres, permettant de distinguer les spectres contaminés par des polymères et les spectres sans polymères.
Il est également possible grâce au procédé 100 d’isoler le signal émis par les bactéries, en éliminant celui des polymères.
Comme il ressort déjà de la description qui précède, l’invention présente de nombreux avantages, parmi lesquels : a/ la méthode est purement numérique, elle est donc très peu coûteuse en temps et en argent comparativement à une méthode biologique ou chimique, b/ en fonction de l’usage : la méthode de détection peut servir en contrôle qualité, ou servir d’étape préliminaire avant l’étape de suppression des pics de polymères, c/ l’invention peut être directement utilisée pour déterminer quel polymère est présent dans un échantillon de spectrométrie de masse, elle peut donc être appliquée à d’autres thématiques que l’identification de bactéries.

Claims

Revendications
1. Procédé de détection de la présence d’un signal issu d’au moins un polymère dans au moins un spectre obtenu par spectrométrie de masse d’un échantillon biologique, comprenant : une étape (101) de détermination d’un ensemble d’au moins un paramètre, dit descripteur, de présence du polymère, une étape (103) d’attribution d’un score à chaque valeur de chaque descripteur, et une étape (105) de classification du spectre sur la base de chaque descripteur et de chaque score, de sorte à détecter ou non la présence dudit au moins un polymère.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’étape (101) de détermination d’un ensemble d’au moins un descripteur comprend une étape de calcul d’une période de spectre obtenu par calcul Lomb-Scargle, dite période Lomb-Scargle (Ti(LSP)) et/ou une période de spectre obtenu par calcul, pour au moins une partie des pics, des écarts, dans une échelle m/z, entre un pic et tous les autre pics, dite période différence (Ti(HD)) et/ou un paramètre de comparaison desdites périodes Lomb-Scargle (Ti(LSP)) et différence (Ti(HD)).
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le score associé à la période Lomb- Scargle (Ti(LSP)) dépend d’un rapport d’une valeur maximale d’une densité spectrale et d’une valeur moyenne de ladite densité spectrale, dans un intervalle m/z donné.
4. Procédé selon l’une des revendications 2 ou 3, dans lequel le score associé à la période des différences dépend d’une proéminence d’une différence de hauteur de pics.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape (104) d’affinage d’une fenêtre d’analyse dans une échelle m/z.
6. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel, au cours de l’étape d’affinage, on évalue l’une des bornes de ladite fenêtre à l’aide d’une période obtenue par calcul Lomb-Scargle.
7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape d’identification d’au moins une bactérie dans ledit au moins un spectre obtenu par spectrométrie de masse si, à l’issue de l’étape de classification, aucun polymère n’a été détecté.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape d’alerte de détection dudit au moins un polymère si, à l’issue de l’étape de classification, ledit au moins un polymère a été détecté.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant une étape (107) de modélisation du signal issu d’un polymère.
10. Procédé selon la revendication précédente, comprenant une étape (108) de suppression du signal obtenu par ladite étape de modélisation.
11 . Programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications précédentes lorsque ce programme est exécuté par un processeur.
12. Support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 10 lorsque ce programme est exécuté par un processeur.
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