EP4722446A1

EP4722446A1 - Verfahren zur herstellung von zellstoff

Info

Publication number: EP4722446A1
Application number: EP24204035.0A
Authority: EP
Inventors: Nicole STAUNIG; Zoltan Szabo; Kurt Messner
Original assignee: Annikki GmbH
Current assignee: Annikki GmbH
Priority date: 2024-10-01
Filing date: 2024-10-01
Publication date: 2026-04-08
Also published as: WO2026073990A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Zellstoff, dadurch gekennzeichnet, dass Stroh, welches Lignin, Xylan und Cellulose enthält und in einer wässerigen Phase suspendiert vorliegt, einer Behandlung zur Herabsetzung des Lignin-Gehalts und einer Behandlung mit einer Xylanase zur Herabsetzung des Xylan-Gehalts unterzogen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellstoff.

Hintergrund der Erfindung

Bioraffinerien erfüllen die Aufgabe, Werkstoffe, Chemikalien sowie Bioenergie unter möglichst vollständiger Verwertung aller Rohstoffkomponenten aus Biomasse nachhaltig zu erzeugen. Ein Beispiel für bestehende Bioraffinerien stellt die Zellstoffindustrie dar. Die auf dem mengenmäßig häufigsten Rohstoff Holz basierenden traditionellen Kochverfahren sind primär auf die Herstellung von Zellstoff ausgerichtet. Sie erfordern harsche Reaktionsbedingungen, die nur eine beschränkte Nutzung von Nebenprodukten, welche vorwiegend thermisch verwertet werden, erlauben (Singh et al., 2022; Chandel et al., 2018; Steffen et al., 2024).
Neuere Konzepte von Lignocellulose-Bioraffinerien zielen darauf ab, die lignocellulosischen Komponenten wie Lignin, Glucose (als Hauptbestandteil der Cellulose) und Xylose (als Hauptbestand des Xylans, eines Typs der Hemicellulose) bei geringem Energieaufwand möglichst rein zu gewinnen, um daraus chemische Wertstoffe erzeugen zu können. Als Rohstoff dient dabei vorwiegend nicht Holz, sondern die Lignocellulose von Einjahrespflanzen. Dabei wird in erster Linie der Vorteil genutzt, dass das Lignin weniger kondensiert als in Holz ist und daher die immer im ersten Schritt erforderliche Extraktion von Lignin bei wesentlich milderen Bedingungen als bei klassischen Zellstoff-Kochungen erfolgen kann (Singh et al., 2022; Chandel et al., 2018; Steffen et al., 2024).
Veränderungen am Zellstoffmarkt, bedingt durch verstärkte Nachfrage nach "grünen" Verpackungsmaterialien sowie durch den generell stark steigenden Bedarf an Verpackungspapier, führten zu einem Engpass an Recyclingpapier, der sich negativ auf die Entwicklung von Qualität und Preis auswirkt. Dies veranlasst die Zellstoffindustrie, nach neuen Quellen für frische Fasern zu suchen. Eine Alternative zu Fasern aus Recyclingmaterial sowie aus Holz-Zellstoffen stellt Zellstoff aus Getreide-Stroh dar, die billiger und in hohem Maße verfügbar sind. In einigen asiatischen Märkten, wo Holz als Rohstoff schlechter verfügbar ist, stellen Bagasse und Reisstroh bereits 70% der Rohstoffe für die Zellstoffindustrie dar (Steffen et al., 2024; Worku et al., 2023).
Speziell im boomenden Verpackungspapier-Sektor wird erwartet, dass sich durch den Einsatz von Fasern aus Stroh die reduzierte Qualität der Recycling-Primärfasern kompensieren lässt. Dadurch kann in weiterer Folge auch der Einsatz chemischer Zusatzstoffe (wie Trocken- oder Nassfestigkeitsadditive) reduziert werden.
Zur Herstellung von Zellstoff aus Stroh werden verschiedene Verfahren eingesetzt, die sich von den klassischen Holz-Aufschlüssen (Kraft-Aufschluss/Sulfatverfahren, Sulfitverfahren) in erster Linie durch den Einsatz milderer Bedingungen unterscheiden.
Für die Erzeugung von Zellstoffen aus Stroh und anderen lignocellulosischen Abfällen aus der Nahrungsmittelindustrie wird im Organosolv-Aufschluss das größte Potenzial vermutet. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem das lignocellulosische Rohmaterial durch Behandlung in einer wässrigen organischen Phase in Gegenwart eines Katalysators oder ohne Katalysator fraktioniert wird (Thoresen et al., 2020).
Im Folgenden werden Beispiele für Organosolv-Verfahren angeführt, welche auch auf Weizenstroh angewendet werden können.
Im Alcell-Prozess wird eine wässrige Lösung von Ethanol (ca. 50 wt%) zur Delignifizierung verwendet. Der Kochprozess findet bei 190 °C und 28 bar statt. Da weder Säuren noch Laugen zugesetzt werden, stellt sich der pH-Wert auf 4 bedingt durch die Deacetylierung des Rohmaterials ein. Lignin, Furfural, Essigsäure und Hemicellulose-Zucker (wie Xylose) sind die Hauptnebenprodukte des Alcell-Prozesses mit Weizenstroh (Azadi et al., 2013).
Weitere Organosolv-Verfahren basieren auf der Verwendung organischer Säuren wie Essigsäure (Acetosolv, Acetocell, Formacell, CIMV) oder Ameisensäure (Formacell, Milox, Formico, CIMV) als Lösungsmittel (Tofani et al., 2024).
Der etablierteste Prozess für Stroh und andere Nichtholz-Materialien ist der Aufschluss mit Natronlauge (NaOH) als aktive Chemikalie. So wurde bereits 1982 ein Organosolv-Verfahren zur Herstellung von Holz-Zellstoff mit Ethanol und NaOH bei 170 °C in WO 1982/001568 A1 beschreiben.
Der hohe Silikat-Anteil in z.B. Weizenstroh führt aufgrund der guten Löslichkeit von Silikat im basischen Milieu zu Problemen bei der Behandlung der Schwarzlauge und Rückgewinnung der NaOH. Um diese Problematik zu vermeiden, kann beispielsweise Natriumcarbonat statt Natriumhydroxid verwendet werden. Damit hergestellte Zellstoffe haben höhere Ligningehalte und sind daher weniger für gebleichte Papiere, sondern eher für Verpackungsmaterial oder in Misch-Zellstoffen mit Recyclingpaper geeignet, um die mechanischen Eigenschaften zu erhöhen (Steffen et al., 2024).
Im sogenannten NACO-Prozess wird ebenfalls Natriumcarbonat verwendet, jedoch werden zur Delignifizierung zusätzlich Sauerstoff und etwas Natriumhydroxid zur Aktivierung eingesetzt. Dies führt zu Pulpen mit einem niedrigen Lignin-Gehalt (niedrige Kappa-Zahl). Dieser Prozess wird in zwei Spezialreaktoren (sogenannte Turbo-Pulper), die in Serie mit 6 - 7 bar Druck und bei einer Temperatur 130 - 145 °C (je nach Rohmaterial) betrieben werden (Fiala et al., 1983).
Der IDE-Prozess ist ebenfalls ein schwefelfreies alkalisches Aufschlussverfahren. Der Prozess besteht aus drei Schritten: Imprägnierung, Depolymerisation und Extraktion. Im ersten Schritt wird das Rohmaterial mit einer konzentrierten Natriumcarbonat-Lösung behandelt. Der zweite Schritt umfasst das Kochen in einer wässrigen Ethanol-Lösung zur Delignifizierung. Im letzten Schritt wird das abgebaute Lignin mit einer frischen wässrigen Ethanol-Lösung extrahiert. In Versuchen mit Weizenstroh werden Ausbeuten über 50% erreicht, wobei der Restlignin-Gehalt unter 2 % liegt (Hultom et al., 1997).
Der ASAM-Prozess (Alkali-Sulfit-Anthrachinon-Methanol) oder ASAE-Prozess (Alkali-Sulfit-Anthrachinon-Ethanol) wird bei pH-Werten über 13 und bei 170 - 180 °C durchgeführt, wobei das Anthrachinon als Katalysator dient und Sulfit als Delignifizierungsmittel fungiert (Black, 1991; EP 0538576 A1 ; Kirçi et al., 1994). Im Vergleich zu den klassischen Sulfat-Pulpen zeigten die ASAE-Pulpen der Brutia-Kiefer (Pinus brutia Ten.) in einer Studie von Kirçi et al. (1994) höhere Ausbeuten, Viskosität, Helligkeit sowie bessere Festigkeitseigenschaften.
In EP 2611820 B1 wird ein Verfahren zur Abtrennung von Lignin aus lignocellulosischem Material durch Aufschluss mit Alkohol (Ethanol oder Isopropanol), Wasser und einer Base (NaOH oder KOH) bei einer Temperatur von unter 100 °C beschrieben. Die milden und selektiven Bedingungen des Verfahrens ermöglichen eine Entkoppelung des Ligninabbaus vom sonst bei klassischen Kochverfahren erfolgenden gleichzeitigen Hemicellulose-Abbau. Dabei konnten je nach Bedingung bis zu 93% des Lignins aus dem Weizenstroh abgetrennt werden, wobei nur ein geringer Anteil des Xylans unter diesen Bedingungen abgebaut und aus dem Stroh entfernt wird. Die dadurch erreichten geringen Restlignin-Gehalte bilden die Voraussetzung für eine effiziente enzymatische Gewinnung von Xylose aus Xylan und Glucose aus Cellulose und für eine eventuelle Produktion von Bioalkohol.
In US 9970038 B2 wird die Gewinnung von Kohlenhydrat-Spaltprodukten wie Xylose oder Glucose aus Weizenstroh beschrieben. Dazu wurde zuerst gemahlenes Weizenstroh in einer alkalischen (NaOH) wässrigen Isopropanol-Lösung oder in Gegenwart von Wasserstoffperoxid in einer alkalischen wässrigen Ethanol-Lösung delignifiziert. Das vorbehandelte Weizenstroh wurde danach mittels einer kommerziellen Enzym-Mischung bestehend aus Cellulasen und Hemicellulasen (Accellerase 1000 von Genencor) behandelt. Die in Lösung vorliegende Xylose wurde enzymatisch mit einer Xylose-Reduktase aus Candida tenuis zu Xylitol, einem Zuckeraustauschstoff, reduziert. Durch den Einsatz einer Enzym-Mischung, die auch Cellulasen enthält, ist die Gewinnung von Zellstoff mit diesem Verfahren unmöglich.
In US 9187571 B2 und US 8617851 B2 wird ein Verfahren vorgeschlagen, um Cellulose zugänglicher für enzymatische oder chemische Modifizierung zu machen. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Verfahren wird von Cellulose und nicht von lignocellulosischem Material ausgegangen, welche mit einer Mischung bestehend aus NaOH, Wasser und Ethanol behandelt wird. Die auf diese Weise vorbehandelte Cellulose kann im Vergleich zu einer unbehandelten Cellulose leichter mittels Cellulase zu Glucose depolymerisiert werden.
Als optimale Lösung für eine Zellstoff-Bioraffinerie ist ein Verfahren zu betrachten, das die Herstellung von Zellstoff bei zusätzlicher Gewinnung nativen, schwefelfreien Lignins und weiters zusätzlicher Gewinnung von Xylan/Xylose als Chemierohstoff ermöglicht. Die gleichzeitige Gewinnung der drei Fraktionen (Zellstoff, Lignin, Xylan/Xylose) werden in den oben genannten Beispielen nicht erwähnt.
Lignin wird, teilweise auch beruhend auf dem Ausmaß seines Vorkommens in der Natur - es ist nach der Cellulose der zweithäufigste biogene Rohstoff - als der Chemierohstoff der Zukunft betrachtet. Bisherige Anwendungen sind - neben der thermischen Nutzung - der Einsatz als Binde- und Stabilisierungsmittel in Beton und Zement und als Düngemittel. An der Verwendung von Lignin als Chemierohstoff wird jedoch intensiv gearbeitet und Anwendungen als Klebstoff, Bioplastik sowie als Basis für Energiespeicher in Batteriezellen werden entwickelt (Norgren & Edlund, 2014; Gaspar & Fardim, 2023).
Die Gewinnung von reinem Xylan oder reiner Xylose im Rahmen der industriell angewandten Aufschlussverfahren von Holz-Zellstoffen ist aufgrund der notwendigen hohen Temperaturen sehr eingeschränkt. So können zum Beispiel größere Mengen von Xylose aus dem Pre-Hydrolysis Liquor im Kraft-basierten Dissolving Pulp Prozess praktisch nur nach aufwändigen Reinigungsverfahren gewonnen werden (Chen et al., 2018).
In der beim Sulfit-Verfahren erhaltenen Lauge finden sich neben Xylose auch Arabinose, Glucose, Galactose und Mannose, aber auch Abbauprodukte wie Essigsäure, Furfural und 5-Hydroxymethylfurfural, welche als Fermentationsinhibitoren wirken. Um die Zucker in einer nachfolgenden Fermentation mittels Enterococcus mundtii zu L-Milchsäure umsetzen zu können, müssen die Fermentationsinhibitoren aufwendig mittels Simulated Moving Bed Chromatography abgetrennt werden (Hoheneder et al., 2021).
Oftmals wird das bei der Zellstoffgewinnung entfernte und abgebaute Xylan als "Abfall" verbrannt (Puls & Saake, 2010) und steht daher nicht als Chemierohstoff zur Verfügung.
Die hydrolytische Spaltung von Xylan aus Weizenstroh ist ebenfalls beschrieben. Walker et al. (2018) nutzten Steam Explosion (Druck 12 bar(g), Verweilzeit 6 min) mit Phosphorsäure als Katalysator zur Freisetzung von 90% der Xylose aus Weizenstroh im Hydrolysat, welche in weiterer Folge mikrobiell zu Xylitol reduziert wurde. Nachteilig ist die Bildung der Fermentationsinhibitoren Furfural und 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) bedingt durch die Dehydratisierung der Pentosen bzw. Hexosen.
Agrawal et al. (2015) nutzen einen kontinuierlichen Reaktor zur Vorbehandlung von Weizenstroh mit verdünnter Schwefelsäure bei 160 °C, wobei ein Großteil der Hemicellulose hydrolysiert wurde. Glucose wurde aus dem vorbehandelten Stroh mittels kommerzieller Cellulasen freigesetzt, welche fermentativ mit Saccharomyces cerevisiae zu Ethanol umgesetzt wurde. Die Autoren zeigten, dass Lignin, Essigsäure, Furfural, HMF und Vanillin, die während der Vorbehandlung mit verdünnter Säure freigesetzt werden oder entstehen, inhibierend auf die eingesetzten Cellulasen wirken.
Die zusätzliche Gewinnung von Xylan/Xylose in Verbindung mit der Herstellung von Zellstoff wird auf Basis des bisherigen Verständnisses seiner Rolle im Zellstoff-Verbund ausgeschlossen. Xylan wird als ein die Festigkeit von Papier förderndes Bindeglied zwischen den Fasern im Zellstoff betrachtet. Die gängige Lehrmeinung besagt, dass die von ihm vermittelten Wasserstoffbrücken-Bindungen positive Auswirkungen auf die Stärke und Elastizität von Zellwänden in Pflanzen haben und damit zu einer erhöhten Beständigkeit gegen enzymatischen Abbau führen (Busse-Wicher et al., 2014).
Die nativ im Zellstoff vorkommenden Hemicellulosen (z. B. Xylane) verbessern zum einen die Reißfestigkeit und tragen zum anderen zu einer Ausbildung stärkerer Faserbindungen bei. Allerdings führen die zur Zellstoff-Herstellung verwendeten Aufschlussbedingungen dazu, dass die Hemicellulosen entweder entfernt oder verändert werden (Puls & Saake, 2010; Schaubeder et al., 2024).
Beim Weizenstroh-Xylan handelt es sich wie beim Weichholz-Xylan um Arabinoxylan, wobei die beiden Pentosen Xylose und Arabinose ca. 30% bzw. 7% der gesamten Trockenmasse im Weizenstroh ausmachen (Walker et al., 2018).
In den Koch- und Bleichprozessen treten neben der Depolymerisation von Cellulosen und Hemicellulosen auch chemische Veränderungen auf. So wird beispielsweise im Kraft-Prozess aus der 4-O-Methylglucuronsäure durch Elimination von Methanol eine Hexenuronsäure gebildet, die dann in weiterer Folge auch mit Bleichmitteln reagieren kann (Henriksson et al., 2024; Schaubeder et al., 2024).
Malik et al. (2020) behandelten Weizenstroh mittels verschiedener Methoden vor - sauer (0,1 N H₂SO₄, 125 °C für 120 min), alkalisch (6 w% NaOH, 150 °C für 120 min) und mit heißem Wasser (150 °C für 120 min), wodurch Glucose, Xylose und Arabinose extrahiert wurden. Vorbehandeltes und nicht vorbehandeltes Weizenstroh wurde mit verschiedenen Konzentrationen an NaOH (12%, 14% und 16%) bei 166 °C für 180 min gepulpt. Aus den verschiedenen Pulpen wurden in weiterer Folge Papierblätter hergestellt, welche auf ihre Festigkeitseigenschaften (Tear Index, Tensile Index und Burst Index) analysiert wurden. Im Vergleich zum nicht vorbehandelten Weizenstroh nahmen der Tensile und Burst Index durchwegs ab, wobei die Abnahme bei dem mit Säure vorbehandelten Weizenstroh, bei dem fast die komplette Hemicellulose-Fraktion abgetrennt wurde, am größten ausfiel. Im Fall des Tear Index konnte bei einer NaOH-Konzentration von 16% eine leichte Zunahme (bis zu +4,3%) für das vorbehandelte Weizenstroh (für alle drei Varianten) festgestellt werden.
Aus einer Studie von Sjöberg et al. (2004) geht hervor, dass die Festigkeitseigenschaften von Papier durch das Vorhandensein von Hemicellulosen an der Oberfläche der Fasern positiv beeinflusst werden, daher werden Hemicellulosen wie Xylane als Additiv in der Papierherstellung zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften eingesetzt.
Naterova et al. (1986) setzten Mais-Xylane zu Packpapier zu, wodurch bei einem Zusatz von 2% Xylan die Biegefestigkeit um 172% gesteigert werden konnte.
US 5810972 A beschreibt den Zusatz von stark gemahlenen xylanreichen Birken-Zellstoff, Xylan oder Galactomannan zu Cellulose für Papiertücher, wodurch die Bruchfestigkeit sowohl in Maschinen- (bis zu 84%) als auch quer zu Laufrichtung (bis zu 90%) gesteigert werden konnte.
Aus einer Studie von Puls & Saake (2010) geht hervor, dass die Wirkung von Arabinoxylan auf die Papierfestigkeit vom Mahlgrad und vom Zellstofftyp abhängt. Je höher der Mahlgrad, desto geringer ist die positive Wirkung des Arabinoxylans. Bei Sulfit-Zellstoffen ist die Wirkung größer als bei Sulfat-Zellstoffen und bei Nadelholz-Zellstoffen größer als bei Laubholz-Zellstoffen. Bei Verwendung unmodifizierter Xylane kann auch in Wechselwirkung mit Epichlorhydrinharz, einem Papierhilfsmittel, bei Produkten mit niedrigem Mahlgrad der Tensile Index um 50 - 55% und der Tear Index um 20 - 25% erhöht werden.
In EP 1688534 A1 wurde der Zusatz von Arabinoxylanen zu einer Pulpe während der Papierherstellung beschrieben. Dadurch konnten Papiereigenschaften wie die Reißlänge, Durchreißfestigkeit und das Volumen der Papiere (Bulk) sowie die Optik verbessert werden. Dabei zeigte sich, dass der Zusatz eines Arabinoxylans aus Haferspelzen zu größeren Reißlängen im Vergleich zum Zusatz eines 4-O-Methylglucuronxylans aus Birkenholz oder eines Lenzing-Xylans aus Buchenholz-Zellstoff führt. Das Arabinoxylan aus Haferspelzen weist dabei nicht die in Laubholz- und Nadelholz-Xylanen auftretenden 4-O-Methylglucuronsäuren als Substituenten auf und zeichnet sich durch eine höhere Kettenlänge als das Lenzing-Xylan auf.
Die in den oben genannten Patenten und Publikationen zur Erhöhung der Festigkeit durch Zusatz von Xylan angeführten Zellstoffe sind durchwegs gebleichte Holz-Zellstoffe, die nach üblichen klassischen harschen Kochverfahren wie dem Kraft-Prozess (170 °C) hergestellt wurden. Ihnen liegt ein intensiver Abbau und eine wesentliche chemische Veränderung des Xylans zugrunde.
Die selektive Gewinnung von Xylan aus Stroh bei gleichzeitiger Nutzung der Rest-Biomasse für Zellstoffe wurde noch nie berichtet, weil dadurch - auf Grund der gängigen Lehrmeinung - ein Verlust an Festigkeit des Papiers impliziert wird.
Versuche, Zellstoff mit für industrielle Anwendungen ausreichender Festigkeit oder erhöhten Festigkeitswerten durch enzymatische Extraktion von Xylan zu erzeugen, sind nicht bekannt.
Xylanase-hältige Enzymmischungen wurden jedoch zum Erreichen verschiedener Ziele eigesetzt: zur Modifikation von Holz-Zellstoffen, um die Entwässerbarkeit zu verbessern (Blomstedt et al., 2010), zur Extraktion von Chromophoren ( US 5498534 A ), um die Mahlung zu verbessern (Noé et al., 2008) oder zum Zwecke der Enzym-unterstützten Bleiche (Viikari et al., 1994).
Die meisten in der Literatur bekannten Xylanasen wirken auch als Cellulase, was bei der Zellstoff-Herstellung unerwünscht ist. Es sind aber auch Xylanasen wie z.B. jene aus Bacillus SSP-34 (Subramaniyan & Prema, 2000) oder Thermomyces lanuginosus (Gomes et al., 1993) beschrieben, die keine oder nur eine minimale Cellulase-Aktivität aufweisen.
Der Effekt der verbesserten Bleichbarkeit wird auf den Abbau des bei der Kochung von Kraft-Zellstoffen an der Faseroberfläche präzipitierten, und die Entfernung von Lignin blockierenden, Xylans zurückgeführt (Viikari et al., 1993). Einflüsse auf Faserfestigkeiten werden nicht berichtet.
Weiters wird von Viikari et al. (1993) der allgemeine Schluss gezogen, dass hohe Hemicellulose-Gehalte in Bezug auf die Faser-Faser-Bindungseigenschaften von Vorteil für die Papierherstellung sind und eine Entfernung der Hemicellulosen zu keiner Verbesserung der Bindungseigenschaften führt. Eine Reduktion des Xylan-Gehaltes mittels Enzymen wird daher a priori ausgeschlossen, sondern vielmehr der Zusatz von Xylan zur Erhöhung von Festigkeitswerten empfohlen (siehe oben).
Die enzymatische Entfernung von Xylan aus Zellstoffen und dessen Auswirkung auf die Bindefestigkeit wurde nur in wenigen Arbeiten und hier zu rein wissenschaftlichen Zwecken verfolgt. Die untersuchten Zellstoffe sind gebleichte Weichholz-Kraft-Zellstoffe und die Xylanase-Behandlung erfolgte nach der Mahlung.
Schaubeder et al. (2024) untersuchten die Rolle von intrinsischem und extrinsischem Xylan in einer mit Chlordioxid gebleichten (ECF) Weichholz-Kraft-Pulpe (85% Fichte, 10% Pinie und 5% Lärche). Ein Teil der Pulpe wurde einer enzymatischen Degradation mittels endo-Xylanase aus Neocallimastix patriciarium unterzogen, wobei ca. 1% des Xylans abgebaut wurde, und ein zweiter Teil der Pulpe wurde mit Buchenholz-Xylan versetzt, was zu einem ca. 3% erhöhten Xylan-Gehalt führte. Beim Tensile Index des erzeugten Papiers wurde eine Reduktion von 8% für die Enzym-behandelte Pulpe festgestellt, während hingegen eine Zunahme von 8,5% für die mit Xylan-angereicherte Pulpe beobachtet wurde. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von Sjöberg et al. (2004).
Schönberg et al. (2001) untersuchten ebenfalls die Rolle von Xylan am Beispiel einer Fichtenholz-Kraft-Pulpe. Durch Behandlung mit einer Xylanase wurden 0,9% Xylan abgebaut, was zu einer Abnahme der internen Bindungsstärke (Scott Bond Value) von 23% führte. Durch die Adsorption von 1,5% Xylan konnte ein Zuwachs von des Scott Bond Values von 22% beobachtet werden. Schaubeder et al. (2024) fanden für den Xylanase-behandelten Zellstoff eine Abnahme des Scott Bond Values von 12% und für den Xylan-angereicherten Zellstoff eine Zunahme von 16%.
Die Verwendung von Stroh zur Herstellung von Zellstoffen gewinnt immer mehr an Bedeutung, allerdings ist für gewisse Zellstoffprodukte eine erhöhte Festigkeit notwendig. Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, einen Zellstoff hergestellt aus Stroh mit erhöhter Festigkeit zu Verfügung zu stellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Aufgabe zur Herstellung von Zellstoff wird erfindungsgemäß gelöst, indem Stroh, welches Lignin, Xylan und Cellulose enthält und in einer wässerigen Phase suspendiert vorliegt, einer Behandlung zur Herabsetzung des Lignin-Gehalts und einer Behandlung mit einer Xylanase zur Herabsetzung des Xylan-Gehalts unterzogen wird.
Durch die Herabsetzung des Xylan-Gehalts wird entgegen der Lehrmeinung überraschenderweise ein Zellstoff hergestellt, welcher eine erhöhte Festigkeit aufweist. Bisher ging der Fachmann davon aus, dass bei Herabsetzung des Xylan-Gehalts die Festigkeit des Zellstoffs abnimmt (siehe z.B. Schaubeder et al. (2024)).
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Behandlung zur Herabsetzung des Lignin-Gehalts mittels einer alkalischen wässerigen Lösung enthaltend Ethanol vorgenommen.
Die Aufgabe zur Herstellung von Zellstoff, Lignin und Xylan-Spaltprodukten aus Stroh, welches Lignin, Xylan und Cellulose enthält, ist gekennzeichnet durch die Kombination der Maßnahmen, dass

a) zerkleinertes Stroh mit einer wässerigen Lösung behandelt wird, welche einen C1-C4-Alkohol enthält und einen pH-Wert zwischen 11 und 14 aufweist, wodurch ein Teil des im Stroh enthaltenen Lignins in Lösung geht und eine Lignin-hältige Lösung und ein in dieser Lösung suspendierter erster Zellstoff erhalten wird,
b) der erste Zellstoff aus der Lignin-hältigen Lösung abgetrennt wird,
c) aus der erhaltenen Lignin-hältigen Lösung das Lignin gewonnen wird,
d) der abgetrennte erste Zellstoff mit einer wässerigen Lösung behandelt wird, welche eine Xylanase enthält, um selektiv den Gehalt an Xylan im ersten Zellstoff herabzusetzen und Xylan-Spaltprodukte in Lösung zu bringen, wodurch ein zweiter Zellstoff erhalten wird, der in der Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung suspendiert ist,
e) der zweite Zellstoff aus der Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung abgetrennt wird, und
f) aus der erhaltenen Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung die Xylan-Spaltprodukte zumindest teilweise gewonnen werden.

Bei dem ersten Zellstoff handelt es sich um einen Lignin-reduzierten Zellstoff, der in weiterer Folge auch als "Zellstoff 1" bezeichnet wird und bei dem zweiten Zellstoff handelt es sich um einen Lignin- und Xylan-reduzierten Zellstoff, der in weiterer Folge auch als "Zellstoff 2" bezeichnet wird.
Unter Zellstoff ist im Sinne der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung eine aus Pflanzenfasern hergestellte faserige Masse, welche vorwiegend aus Cellulose besteht, zu verstehen.
Unter Stroh sind im Sinne der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung getrocknete Faserpflanzen oder deren Anteile wie beispielsweise Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Hirse, Buchweizen, Emmer, Einkorn, Sorghum, Reis, Mais oder Gras-ähnliche Rohstoffe wie Miscanthus zu verstehen, wobei Weizenstroh besonders bevorzugt ist.
Unter Xylan-Spaltprodukte sind im Sinne der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung D-Xylose, L-Arabinose, Xylooligosaccharide, substituierte Xylooligosaccharide (z.B. mit Arabinofuranosyl-Resten), Uronsäuren/Uronate wie 4-O-Methyl-D-glucuronsäure/4-O-Methyl-D-glucuronat und/oder Essigsäure/Acetat zu verstehen.
Im Sinne der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung wird unter Festigkeit der sogenannte Tear Index verstanden, der die Durchreißfestigkeit pro Flächenmasse (Einheit mN·m²·g^-1) beschreibt (Puls & Saake, 2010).
Das hier beschriebene alkalische Organosolv-Verfahren in Kombination mit der enzymatischen Dexylanisierung bietet die einzigartige Möglichkeit einer Stroh-Bioraffinerie, die alle drei Optionen der selektiven Produktgewinnung in sich vereint: 1) die Gewinnung eines schwefelfreien und auf Grund der milden Kochbedingungen wenig kondensierten, nativen Lignins als Chemierohstoff (siehe EP 2611820 B1 ), 2) selektive enzymatische Gewinnung von Xylan/Xylose als Chemierohstoff und 3) der Herstellung eines Zellstoffs mit verbesserten Festigkeitseigenschaften.
Der Xylan-reduzierte Zellstoff ist des Weiteren dadurch gekennzeichnet, dass er durch Behandlung mit einer Xylanase hergestellt wurde, die entweder nur aus dem Rückgrat-spaltenden Enzym endo-1,4-β-Xylanase besteht oder zusätzlich β-Xylosidase und Seitenketten-spaltende (akzessorische) Enzyme wie α-L-Arabinofuranosidase oder individuelle Mischungen derselben enthält. Die Xylanasen sind wesentlich dadurch charakterisiert, dass sie keine oder eine minimale Cellulase-Aktivität besitzen, sodass dies keinen Einfluss auf die Festigkeitswerte des Zellstoffs ausübt (siehe Tabelle 2).
Eine Xylanase kann in folgenden Varianten zur Herstellung von Xylan-Spaltprodukten angewendet werden, wovon die letzte Variante besonders bevorzugt ist: 1. Einsatz von nur endo-1,4-β-Xylanase zur Abtrennung von Xylan (z.B. in Form von Xylooligosacchariden), 2. Einsatz von nur endo-1,4-β-Xylanase zur Abtrennung von Xylan und nachträgliche enzymatische Spaltung der Xylan-Spaltprodukte zu Monomeren (Xylose und Arabinose) und 3. Einsatz von endo-1,4-β-Xylanase in Kombination mit weiteren Xylanasen zur unmittelbaren Gewinnung von Monomeren.
Der durch die Einwirkung der Xylanase entstandene Xylan-reduzierte Zellstoff (Zellstoff 2) befindet sich nach Xylan-Extraktion in einer Suspension/Lösung, die aus Monomeren (Xylose und Arabinose) besteht und nach Abtrennung des Xylan-reduzierte Zellstoffs als Chemierohstoff verwendet werden kann.
Im Vergleich zum in US 9970038 B2 beschriebenen Verfahren, bei dem Xylose und auch Glucose aus delignifiziertem Weizenstroh mittels einer kommerziellen Cellulase/Hemicellulase-Mischung freigesetzt wurden, wird in der vorliegenden Erfindung eine Cellulase-freie Xylanase zur selektiven Dexylanisierung verwendet. Dadurch enthält die erfindungsgemäße Xylan-Spaltprodukte-hältige Lösung Glucose (und Galactose) nur in Konzentrationen unter der Bestimmungsgrenze (siehe Beispiel 3).
Die Xylanase liegt entweder in Form in einer Suspension, im Homogenat und/oder im Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vor, oder in isolierter Form vor, wobei Homogenate besonders bevorzugt sind.
Suspension bedeutet in diesem Kontext eine Suspension von resting cells. Diese werden nach der Kultivierung geerntet (vom Nährmedium abgetrennt) und in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Im Gegensatz zu fermentativen Verfahren, bei denen auch mit ganzen Zellen gearbeitet wird, können die resting cells aufgrund der Entfernung von Kohlenstoff-Quellen und Nährstoffen nicht mehr wachsen, sondern dienen nur der Umsetzung von Substraten (Lin & Tao, 2017). Homogenat steht in diesem Kontext für eine physikalisch und/oder chemisch behandelte Suspension (z.B. mittels Druckes, Lysozym oder Ultraschall behandelt), wobei die Zellbestandteile aus den Zellen freigesetzt werden. Ein Lysat wird erhalten, wenn die unlöslichen Zellbestandteile des Homogenats beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden.
In einer weiteren Variante können die Enzyme auch mit einem wasserlöslichen Polymer wie Polyethylenglycol am N-Terminus modifiziert, in oder auf einer festen Matrix immobilisiert oder Teil eines Fusionsproteins sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren einen Zellstoff, der nach einem der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Zellstoff-Blatt, welches aus dem erfindungsgemäßen Zellstoff durch Blattbildung hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Zellstoff-Blatt mit einem Tear Index von mindestens 4,00 mN·m²·g^-1, besonders bevorzugt von mindestens 4,50 mN·m²·g^-1, und insbesondere bevorzugt in Kombination mit einem Xylan-Gehalt unter 25,0 Gewichtsprozent.
Ferner ist bevorzugt ein Zellstoff-Blatt mit einem Tear Index von mindestens 4,00 mN·m²·g^-1, besonders bevorzugt von mindestens 4,50 mN·m²·g^-1, sowie einem Strain at Break von mindestens 3,5%.
Im Sinne der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung wird unter Strain at Break das Verhältnis zwischen der Längenzunahme eines Werkstoffs und seiner originalen Länge beim Anlegen einer Zugkraft (Einheit %) verstanden.
Der erfindungsgemäße Zellstoff kann als solcher zur Herstellung von Faserverbundwerkstoffen, insbesondere Papier, Pappe oder Karton, verwendet werden oder als Zusatz zu Misch-Zellstoffen Verwendung finden.
In Bezug auf den Tear Index ist zu erwähnen, dass dieser allgemein mit zunehmendem Mahlgrad sinkt, was auf eine Faserschädigung durch die Mahlung schließen lässt. Um den für die jeweilige Papierqualität optimalen Mahlgrad zu finden, wird eine Beziehung zwischen Tear und Tensile Index hergestellt. Die für die gegenständliche Erfindung relevante Beziehung ist jedoch der Zusammenhang zwischen dem Xylan-Gehalt des Zellstoffs und dem daraus resultierenden Tear Index nach Mahlung.
Der ungemahlene und Lignin-reduzierte Zellstoff (Tabelle 7: Zellstoff 1) weist einen Tear Index von 4,61 mN·m²·g^-1 auf und verliert durch FPI-Mahlung bei 1500 rpm 26% und bei 2500 rpm 44% an Festigkeit. Die Zellstoffe nach ca. 50% Entfernung von Xylan (Tabelle 7: Zellstoff 2) erreichen mit Werten von 4,82 mN·m²·g^-1 (PFI-Mahlung bei 1500 rpm) bzw. 4,10 mN·m²·g^-1 wieder den Festigkeitsbereich von ungemahlenem Zellstoff 1.
Der gemahlene Lignin- und Xylan-reduzierte Zellstoff (Zellstoff 2) gewinnt gegenüber dem nicht Xylan-reduzierten Zellstoff (Zellstoff 1) bei 1500 rpm 41% und bei 2500 rpm 60% an Reißfestigkeit (Tear Index).
Auch der Wert für Strain at Break (Bruchdehnung) steigt nach Xylanase-Behandlung und Mahlung bei 2500 rpm um ca. 42% im Vergleich zum nicht mit Xylanase behandelten Zellstoff, während der Burst Index nach Mahlung etwa gleichbleibt. Nur der Tensile Index der gemahlenen Zellstoffe sinkt um 13% (PFI 1500 rpm) bzw. 10% (PFI 2500 rpm) nach Dexylanisierung.
Daraus geht deutlich hervor, dass Stroh-Zellstoff durch Xylanase-Behandlung und Mahlung im Vergleich zu nicht mit Xylanase behandeltem Zellstoff eine deutliche Zunahme an Festigkeit, gemessen als Tear Index erfährt, die zu Lasten eines geringen Abfalls des Tensile Index geht.
Dieser in der gegenständlichen Erfindung auf Stroh-Zellstoff erzielte positive Festigkeitseffekt wurde in keinem bisher berichteten, auf Holz-Zellstoff beruhenden Verfahren und deren Messungen erkannt. Er ist auch in Folge der hohen Komplexität der die Festigkeit begründenden Faktoren nicht abschätzbar oder erwartbar.
Dieser Effekt eröffnet die Erkenntnis, dass auch nach Abtrennung und Gewinnung von Xylan aus Stroh ein Zellstoff gewonnen werden kann, der den Anforderungen des Marktes entspricht. Die Möglichkeit derartigen Zellstoff herzustellen und gleichzeitig mittels spezifischer Xylanasen Xylan zu gewinnen, wurde bisher ausgeschlossen, da negative Effekte auf die Festigkeitseigenschaften des Zellstoffs sowie des daraus gewonnen Papiers erwartet wurden (Schönberg et al., 2001; Sjöberg et al., 2004; Schaubeder et al., 2004).
Die Verbesserung von Festigkeitswerten von Zellstoff durch Extraktion von Xylan widerspricht gänzlich der gängigen Lehrmeinung von der Funktion des Xylans in Lignocellulose-Faserverbänden. In keiner der oben angeführten Arbeiten wurde jedenfalls der Einfluss der enzymatischen Xylan-Extraktion auf den Tear Index gemessen und dessen deutliche Erhöhung erwähnt oder erkannt (siehe Hintergrund der Erfindung).
Die gegenständliche Erfindung zeigt, dass nach mildem Organosolv-Aufschluss mindestens 50% des Xylans aus Zellstoff gewonnen werden kann und trotzdem ein Zellstoff mit Festigkeitswerten entsteht, der nach Mahlung im Vergleich zu nicht mit Xylanase behandeltem Zellstoff deutlich erhöhte Festigkeitswerte aufweist.
Ein direkter Vergleich der Festigkeitswerte des erfindungsgemäßen Zellstoffs ist nicht ohne weiteres möglich, da es sich bei den im Stand der Technik beschriebenen Zellstoffen meist um (gebleichte) Holz-Kraft-Zellstoffe handelt, die sich deutlich von dem nach dem vergleichsweise milden Organosolv-Aufschluss gewonnenen Stroh-Zellstoff unterscheiden.
So setzt sich der Kohlenhydrat-Anteil in gebleichtem Weichholz-Kraft-Zellstoff (BKSP), auf den sich die meisten Untersuchungen zur Funktion von Xylan (siehe Hintergrund der Erfindung) beziehen, zu ca. 82% aus Glucose, aber nur zu ca. 7% aus Xylose und darüber hinaus zu ca. 7% aus Mannose zusammen (für z.B. Douglasie; siehe Mansfield et al., 2002). Ähnliche Werte werden von Oliver-Ortega et al. (2020) für eine gebleichte Kraft-Weichholz-Pulpe aus der Pinie angegeben -15% Hemicellulose und 84% Cellulose.
Im Gegensatz dazu setzt sich der Kohlenhydrat-Anteil des ungebleichten, Lignin-reduzierten Zellstoffes (Zellstoff 1) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus ca. 63% Glucose und 32% Xylose zusammen (siehe Tabelle 6), was einem wesentlich höheren Xylan/Hemicellulose-Gehalt im Vergleich zu den Weichholz-Kraft-Zellstoffen entspricht.
Außerdem zeigt die Tatsache, dass ein hoher Anteil des im Zellstoff vorhandenen Xylans (> 50%) enzymatisch gewonnen werden kann, weiterhin, dass durch den milden Organosolv-Aufschluss der gegenständlichen Erfindung die Stroh-Lignocellulose in Form des anfallenden Zellstoffs in einen Aggregatszustand versetzt wird, der eine ausreichende Porosität der Ultrastruktur aufweist, um die Diffusion von Kohlenhydrat-spaltenden Enzymen zu gewährleisten. Dies lässt auch die Option offen, den gewonnenen Zellstoff als Ausgangsmaterial für die enzymatische Gewinnung von Glucose zu nutzen.

Materialien

Weizenstroh wurde von Derler Agrar GmbH, Birkfeld, Österreich im Oktober 2023 bezogen. Die chemische Zusammensetzung (siehe Methoden zur Beschreibung der Analysenmethoden) ist in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt.
Salzsäure, Schwefelsäure, Natriumhydroxid, Natriumacetat, Natriumdodecylsulfat (SDS), Zinkacetat und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), L-Arabinose und D-Xylose wurden von Carl Roth, Aceton und D-Galactose wurden von AppliChem, Ethanol wurde von Honeywell, Glycin, D-Glucose, Natriumthiosulfat, Kaliumpermanganat und Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat wurden von Sigma-Aldrich und AZO-Wheat-Arabinoxylan, 4-Nitrophenyl-ß-o-xylopyranosid, 4-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid und AZO-CM-Cellulose wurden von Megazyme bezogen. Tabelle 1. Chemische Zusammensetzung des verwendeten Strohs.

Komponenten Gehalt [%]

Lignin 22,4

Glucose 40,3

Xylose 22,8

Arabinose 2,5

Galactose 0,8

Extraktstoffe 2,9

Asche 5,4

Silikat 2,3

Andere 2,8

Enzyme - Methoden und Analytik

Allgemeines zur Expression von rekombinanten Enzymen in E. coli

Für die rekombinante Enzymproduktion in einem Escherichia coli-Stamm wurde zunächst das zu exprimierende Gen in einer PCR unter der Verwendung der genomischen DNA oder deren synthetisch an die Codon-Verwendung von E. coli angepasstes Äquivalent als Matrize zusammen mit spezifischen Oligonukleotiden, die zusätzlich Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen tragen, amplifiziert und aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Nach dem Nukleinsäure-Verdau mit den Restriktionsenzymen Sphl und HindIII wurde das für das Target-Enzym kodierende Genfragment in das mit Sphl und Hindlll geschnittene Rückgrat des Expressionsvektors pQE70-Kan ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in chemisch kompetente E. coli-Zellen Top10F' transformiert und die entstandenen Kolonien wurden für die Plasmid-Isolierung und Restriktionsanalyse benutzt.
Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung überprüft. Das resultierende Konstrukt trägt das Target-Gen unter dem IPTG-induzierbaren T5-Promotor.
Für die Überexpression des Enzymes in E. coli wurde das resultierende Expressionsplasmid in die kompetenten Expressionszellen RB791 transformiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden entstandene Kolonien für die Expressionstests in LB-Medium angeimpft.
Am nächsten Tag wurden damit Expressionskulturen mit einer optischen Dichte OD₅₅₀ von 0,02 angeimpft und bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD₅₅₀ von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 °C gesenkt und die Kulturen wurden beim Erreichen einer OD₅₅₀ von 0,5 mit 0,1 mM IPTG induziert. Nach 22 h wurden die Kulturen geerntet (vom Medium mittels Zentrifugation in Form eines Zellpellets abgetrennt) und auf die Expression des rekombinanten Enzymes mit Hilfe von SDS-Gelelektrophorese und einer Aktivitätsbestimmung (Verwendung in Use-Test oder optischenzymatischer Assay) analysiert.

Herstellung von Zell-Homogenaten mittels Sonifier-Aufschlusses

Zur Herstellung einer Zell-Suspension wurde das nach obigen Verfahren hergestellte Zellpellet in einem geeigneten Gefäß eingewogen und mit Puffer versetzt (z.B. Natriumacetat-Puffer) und unter Rührung gelöst. Der Massenanteil an Biomasse beträgt üblicherweise 20%, der Rest entfällt auf den Puffer.
Zum Zell-Aufschluss wurde ein Branson Sonifier 450 verwendet. Die Suspension wurde dreimal mit je 15 Ultraschall-Stößen (Einstellungen am Gerät: Timer = 15; Duty Cycle = 50; Output Control = 3 - 5) behandelt.
Das erhaltene Homogenat wurde direkt für die Ansätze verwendet.

Messung der endo-1,4-β-Xvlanase-Aktivität

Die endo-1,4-β-Xylanase-Aktivität wurde mit dem AZO-Wheat-Assay von Megazyme ermittelt. Für den Assay wurde das Enzym (E. coli-Zell-Homogenat) mit 100 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) verdünnt und 200 µL der Enzym-Lösung mit 200 µL Substrat-Lösung (Weizen-Arabinoxylan mit Remazol Brilliant Blue R Farbstoff) vermischt und für 10 min bei 40 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 mL 95% Ethanol gestoppt und für 10 min bei Raumtemperatur equilibriert. Danach wurden die Reaktionsmischungen noch einmal durchmischt und in einer Tischzentrifuge bei 1500 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in Küvetten überführt und die Absorption bei 590 nm gemessen. Die Aktivität wurde anhand einer Kalibrationskurve ermittelt.

Messung der β-Xvlosidase-Aktivität

Die Messung der β-Xylosidase-Aktivität erfolgte mit dem Modelsubstrat 4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid (O-PNPX). 890 µL 20 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) wurden in einem 2 mL Reaktionsgefäß vorgelegt und in einem Eppendorf-Thermomixer auf 30 °C temperiert. 10 µL des entsprechend verdünnten Enzym-Lösung (E. coli-Zell-Homogenat) und 100 µL Substratlösung (4 mM) wurden zum vorgelegten Puffer pipettiert, gemischt und für 5 min bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µL 500 mM Glycin-NaOH Puffer gestoppt, die Mischung in eine Küvette überführt und die UV-Absorption bei 405 nm gemessen.

Messung der α-L-Arabinofuranosidase-Aktivität

Die α-L-Arabinofuranosidase-Aktivität wurde mit dem Modelsubstrat 4-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid (O-PNPAF) gemessen. Für den Assay wurden 890 µL 20 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) mit 10 µl der entsprechend verdünnten Enzym-Lösung (E. coli-Zell-Homogenat) und 100 µL Substratlösung (4 mM) in einem 2 mL Eppendorf-Vial vermischt und für 5 min bei 30 °C inkubiert. Danach wurde die Aktivität durch Zugabe von 100 µL 500 mM Glycin-NaOH Puffer gestoppt, in eine Küvette überführt und die UV-Absorption bei 405 nm gemessen.

Messung der Cellulase-Aktivität

Die Cellulase-Aktivität wurde mit dem Assay für endo-1,4-beta-Glucanase (Cellulase) mit AZO-CM-Cellulose von Megazyme bestimmt. Zur Herstellung der Substratlösung wurden 2 g mit Remazol Brilliant
Blue R gefärbte CM-Cellulose 4M in 80 mL kochendem Wasser unter heftigem Rühren gelöst, der pH-Wert mit 2 M Natriumacetat-Puffer auf 4,5 eingestellt, die Lösung abgekühlt und mit Wasser auf 100 mL aufgefüllt. 200 µL der Enzym-Lösung wurden mit 200 µL Substratlösung für 10 min bei 40 °C inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von 1 mL 96% Ethanol gestoppt, gut durchmischt, 10 min bei Raumtemperatur equilibriert und anschließend bei 1000 x g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde in eine Küvette überführt und die Absorption bei 590 nm gemessen. Die Auswertung erfolgte über eine Kalibrationskurve.

Übersicht verwendete Enzyme zur Xylan-Depolymerisierung

Tabelle 2. Enzymtypen, Spenderorganismen, NCBI Accession Numbers, Aktivitäten und Cellulase-Aktivitäten des zur Xylan-Depolymerisierung verwendeten Xylanasen.

Enzym	Spenderorganismus	NCBI Accession Nr.	Aktivität [U/g]	Cellulase-Aktivität^d[U/g]
endo-1,4-β-Xylanase I	Bacillus subtilis	WP_003231377	9500^a	0,33
endo-1,4-β-Xylanase II	Paenibacillus timonensis	WP_240267768	180^a	0,44
β-Xylosidase	Geobacillus zalihae	WP_060787919	37^b	0,23
α-L-Arabinofuranosidase	Bifidobacterium adolescentis	WP_011742888	6,5^c	0,24

Assay: ^a AZO-Wheat-Arabinoxylan, ^b4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid, ^c4-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid, ^dAZO-CM-Cellulose (siehe oben)

Um sicher zu gehen, dass die hier eingesetzten Xylanasen keine Cellulase-Aktivität aufweist, wurden die Enzyme in einem Stamm von Escherichia coli exprimiert. E. coli ist ein Bakterium, von dem kein Naturstamm bekannt ist, der die Fähigkeit besitzt, Cellulose enzymatisch zu spalten. Zur Expression der Enzyme wurde für das jeweilige spezifisch wirkende Target-Enzym kodierende Genfragment ausgewählt. Im Enzymassay weisen die exprimierten Enzyme des Xylanase-Komplexes trotzdem Spuren von Cellulase-Aktivitäten auf (siehe Tabelle 2).
Um zu zeigen, dass diese keinen Einfluss auf die Festigkeit der Cellulose und damit des xylan-reduzierten Zellstoffes ausüben, wurde nach Zusatz der Xylanase die Menge der freigesetzten Glucose im Filtrat des Xylan-reduzierten Zellstoffs nach Xylanextraktion gemessen (siehe Beispiel 3), welche in allen Bestimmungen unter Bestimmungsgrenze der HPAEC-Methode (siehe unten) lag. Die eingesetzten Xylanasen können daher als "Cellulase-frei" im Sinne von effektlos auf Spaltung von Cellulose im Zellstoff bezeichnet werden.

Analytische Methoden

Bestimmung des Gesamtzuckers in Feststoffen/Lösungen mittels vollständiger Hydrolyse

Es wurden Mehrfach-Bestimmungen durchgeführt. Der Feststoff (z.B. Weizenstroh, Zellstoff 1 oder Zellstoff 2) wurde gemahlen (Retsch Ultra Zentrifugal Mühle ZM 200), um eine homogene Probe zu erhalten. 5 mg (± 0,1 mg) des gemahlenen Feststoffes wurden in ein Druckreagenzröhrchen eingewogen. Für die Gesamtzuckerbestimmung aus den Lösungen wurden 100 - 200 µL in ein Druckreagenzglas pipettiert und im Vakuumtrockenschrank bei 50 °C eingedampft. Die Proben (Feststoffe oder eingedampfte Lösungen) wurden mit 80 µL 12 M Schwefelsäure für 2 h mit einem Magnetrührstäbchen auf einer Magnetrührplatte bei 300 rpm gerührt. Danach wurden die Proben mit 2,75 mL Wasser verdünnt und im Trockenschrank für 1 h auf 120 °C erhitzt. Anschließend wurden die Röhrchen auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Calciumcarbonat neutralisiert. Die Proben wurden in einer Tischzentrifuge für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, ein weiteres Mal für 5 min zentrifugiert und bei Bedarf weiter verdünnt. Die Lösung wurde in ein IC-Vial überführt und mittels HPAEC (siehe unten) analysiert.

Bestimmung des Ligningehalts nach Klason

Für die Bestimmung von Klason-Lignin wurden 500 mg Lignin in einem Becherglas mit 7,5 mL 12 M H₂SO₄ versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Mischung in einen Erlenmeyer-Kolben überführt, das Becherglas mit heißem deionisiertem Wasser nachgewaschen und auf eine Gesamtmasse von 285 g aufgefüllt. Nach Inkubieren in einem Ultraschallbad für 10 min wurde die Mischung auf einer Heizplatte für 4 h gekocht, wobei die Verdampfungsverluste alle 30 min mit deionisiertem Wasser ausgeglichen wurden. Im Anschluss wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Feststoff mittels tarierter Glasfritte abfiltriert und mit heißem deionisiertem Wasser nachgewaschen, bis die Waschlösung neutral war. Die Masse des Feststoffs (unlösliche Lignin-Fraktion) wurde nach Trocknung der Glasfritte im Vakuumtrockenschrank über Nacht bestimmt. Die lösliche Lignin-Fraktion im Filtrat wurde mittels Photometrie (Messung bei 205 nm) quantifiziert.

Bestimmung des Asche- und Silikat-Gehalts in Feststoffen

Für die Bestimmung des Aschegehalts wurde 1 g Probe (Weizenstroh, Zellstoff oder Lignin) in einem zuvor ausgeglühten und tarierten Keramiktiegel eingewogen und mit einem Bunsenbrenner so lange verascht, bis kein Rauch mehr sichtbar war. Danach wurde der Tiegel über Nacht im Muffelofen (575 °C) erhitzt. Die Masse der Asche wurde durch Auswiegen bestimmt.
Zur Bestimmung des Silikat-Gehalts wurde die gesamte Menge der Asche in einem Becherglas mit 5 mL 6 M HCl versetzt und auf der Heizplatte (200 - 220 °C) erhitzt. Nach Abdampfen der HCl wurden 5 mL 6 M HCl zugesetzt und wieder abgedampft. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt (gesamte Zugabe: 15 mL 6 M HCl). Danach wurden 20 mL deionisiertes Wasser zugesetzt und der Feststoff über einen aschefreien Filter abfiltriert und mit heißem deionisiertem Wasser so lange nachgewaschen, bis das Filtrat pH-neutral war. Nach Veraschung des Filters wurde der Silikat-Gehalt durch Auswiegen bestimmt.

Bestimmung des Anteils der Extraktstoffe mittels Soxhlet-Extraktion

4 g zerkleinertes Weizenstroh wurden in einer vorgetrockneten und abgewogenen Cellulose-Extraktionshülse eingewogen. Die Extraktion erfolgte in einer Soxhlet-Apparatur für 2 h mit 500 mL Aceton. Danach wurde die Extraktionshülse über Nacht im Vakuumtrockenschrank getrocknet und der Anteil der Extraktstoffe als Massendifferenz bestimmt.

Bestimmung der Kappa-Zahl

30 mg eines Feststoffs (z.B. Zellstoff) wurden in einem 50 mL Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 14 mL Wasser versetzt und bis zur Bildung einer homogenen Suspension verrührt. Danach wurden 2 mL einer 0,1N Kaliumpermanganat-Lösung zugegeben. Nach 10 min wurden 400 µl einer 10% Kl-Lösung zugesetzt, wodurch eine orange-braune Suspension erhalten wurde. Diese wurde mit einer 0,1N Natriumthiosulfat-Lösung so lange titriert, bis eine hellgelbe Lösung erhalten wurde. Zur besseren Sichtbarkeit des Umschlagspunktes wurden 200 µl Stärke-Lösung zugesetzt und die Titration bis zur kompletten Entfärbung fortgeführt. Aus dem Verbrauch der Natriumthiosulfat-Lösung wurde die Kappa-Zahl berechnet.

Bestimmung des Mahlgrads nach Schopper-Riegler

2 g Probe sowie 1 L destilliertes Wasser wurden in den Behälter des Aufschlaggeräts (Frank-PTI) gegeben und bis zur Erreichung der Umdrehungsanzahl (30 000 Umdrehungen) aufgeschlagen.
Danach wurde die Suspension in das Schopper Riegler-Mahlgradprüfgerät (Frank-PTI) gefüllt, wo die Trennung der Suspension mittels eines Siebes erfolgte. Der Schopper-Riegler-Wert (°SR) wurde auf der Skala des Messbechers abgelesen.

Aufarbeitung für die HPAEC-Analyse mittels Carrez-Fällung

Für die Carrez-Lösung I wurden 21,9 g Zinkacetat in 100 mL Wasser gelöst. Die Carrez-Lösung II wurde durch Lösen von 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II) in 100 mL Wasser hergestellt.
Zu 1 mL Probe (Filtrat oder Waschlösung nach Enzymbehandlung) wurden 70 µL Carrez-Lösung I pipettiert und bei 25 °C und 1000 rpm für 5 min inkubiert. Danach wurden 70 µL Carrez-Lösung II hinzugefügt und für weitere 5 min bei 25 °C und 1000 rpm inkubiert. Anschließend wurde der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren in einer Tischzentrifuge für 10 min bei 1000 rpm abgetrennt. Vor der HPAEC-Messung erfolgte bei Bedarf eine weitere Verdünnung.

High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC)

Zur Quantifizierung von Arabinose, Glucose, Galactose und Xylose mittels HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) wurde ein Dionex ICS6000 System mit AS-AP Autosampler verwendet. Zur Trennung der Analyten wurde eine Dionex CarboPac PA20-fast-4µm Säule mit entsprechender Vorsäule sowie einem NaOH-Gradienten verwendet. Die Analyten wurden mittels gepulsten amperometrischen Detektors (PAD, Gold-Elektrode) und der Wellenform "Carbo, Quad" detektiert.
Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens noch näher beschrieben.

Beispiel 1

Delignifizierung von Stroh

2,4 kg gehäckseltes, gesiebtes Weizenstroh (Partikelgröße 1 - 5 cm) wurden in einem horizontalen Paddel-Reaktor (Gesamtvolumen: 80 L) in 7,2 L einer Reaktionslösung bestehend aus 2,72 kg Wasser, 4,03 kg Ethanol und 0,27 kg NaOH suspendiert. Die Suspension wurde im Reaktor auf 120 °C erhitzt (die Aufheizzeit zum Erreichen von 120 °C betrug ca. 15 - 20 min) und für 15 min bei 11 U/min gerührt. Danach wurde das Reaktionsgefäß auf ca. 40 °C abgekühlt, die Suspension entleert und auf 4% Stoffdichte mit Wasser verdünnt.
Anschließend wurde die Suspension im Refiner (Sprout-Bauer 12" (7208-110); 0,3 mm Platten-Abstand) zerfasert, wobei die Fasern mechanisch bearbeitet wurden.
Der Feststoffanteil wurde mittels Waschpresse (Fischer Edelstahl Hydropresse; Arbeitsvolumen 90 L) von der Lignin-Lösung abgetrennt und der resultierende Zellstoff unter Verwendung der Waschpresse dreimal mit 20 L Wasser gewaschen. Der Lignin-reduzierte Zellstoff wurde danach über Siebe (80 µm Maschenweite) mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der Waschlösung < 9 betrug und mit einer Wäscheschleuder (Thomas Centri 776 SEK) behandelt, um den Trockenmasseanteil auf ca. 30% zu erhöhen. Zum Schluss wurde der Lignin-reduzierte Zellstoff mittels einer Knetmaschine (GGM Gastro PRMH20; 20 L Arbeitsvolumen) gemischt. Der auf diese Weise gewonnene Zellstoff mit reduziertem Ligningehalt wird im Folgenden als "Zellstoff 1" bezeichnet.
Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt die Trockenmasse, Ausbeute, Kappa-Zahl und den Schopper-Riegler-Wert von Zellstoff 1. In der nachfolgenden Tabelle 4 sind die Zuckergehalte sowie der Lignin-Gehalt nach Klason von Zellstoff 1 angegeben. Tabelle 3. Charakterisierung von Zellstoff 1.

Feuchtmasse der Pulpe [kg] Trockenmasse [%] Ausbeute [%] Kappa-Zahl Schopper-Riegler-Wert [°SR]

4,6 31,6 60 41,5 23

Tabelle 4. Zuckergehalt und Lignin-Gehalt (Klason) von Zellstoff 1.

Glucose [%] Xylose [%] Arabinose [%] Galactose [%] Klason-Lignin [%]

63,3 32,4 3,7 0,6 7,7
Aus einem Teil der Lignin-Lösung wurde Lignin gefällt.

Beispiel 2

Fällung von Lignin

500 mL der erhaltenen Lignin-Lösung wurden in einen Rundkolben überführt. Das in der Lösung enthaltene Ethanol wurde am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbad-Temperatur von < 40 °C abgedampft. Nach Bestimmung der Lignin-Konzentration (21,4 g/L) mittels Photometrie (Messung bei 280 nm in 10 mM NaOH) wurde die Lösung auf eine Lignin-Konzentration von 10 g/L mit deionisiertem Wasser verdünnt.
Es wurde eine Doppelbestimmung mit je 200 mL der verdünnten Lignin-Lösung (10 g/L) durchgeführt. Der pH-Wert der Lösungen wurde zuerst mit 66 v% H₂SO₄ unter Rühren auf pH < 4 gestellt. Danach wurden die Lösungen ohne Rührung in einem Wasserbad bei 65 °C für 60 min inkubiert, wobei sich ein Feststoff bildete. Unmittelbar nach Ende der Inkubation wurde der Feststoff mittels eines A113-Filterpapiers im Büchner-Trichter abfiltriert und mit etwas deionisiertem Wasser nachgewaschen.
Auf diese Weise konnten je 1,4 g Feststoff (70% Ausbeute) erhalten werden. Der Zuckergehalt und der Lignin-Gehalt (Klason) des gewonnenen Lignins sind in Tabelle 4 (Durchschnitt aus der Doppelbestimmung) dargestellt. Tabelle 5. Zuckergehalt und Lignin-Gehalt (Klason) des gefällten Lignin-Feststoffs.

Glucose [%] Xylose [%] Arabinose [%] Galactose [%] Klason-Lignin [%]

<LOQ 1,6 0,7 <LOQ 91

Beispiel 3

Enzymatische Depolymerisierung und Extraktion von Xylan

Das Xylan in Zellstoff 1 wurde enzymatisch depolymerisiert und die Xylan-Spaltprodukte enthaltende Lösung vom Feststoff (Zellstoff 2) abgetrennt.
Die Durchführung erfolgte in einem kugelförmigen 1 L-Glasreaktionsgefäß mit Deckel, beheizbar mittels Magnet-Rührer und Heat-on-Aufsatz und ausgestattet mit einem KPG-Rührer und Rührwelle mit Halbmond-Rührblatt. Das Reaktionsvolumen betrug 400 mL. 40 g (Trockenmasse) vorbehandeltes Substrat (Zellstoff 1) wurden in Wasser suspendiert und der pH-Wert mit 1 M Schwefelsäure auf 6 (±0,2) eingestellt. Nach Stabilisierung des pH-Wertes wurden die Xylanasen in Form von E. coli-Zell-Homogenaten (10,7 mL endo-1,4-β-Xylanase I, 10 mL endo-1,4-β-Xylanase II, 5 mL β-Xylosidase, 10 mL α-L-Arabinofuranosidase) hinzugefügt.
Die Suspension wurde gut durchmischt und für 6 h bei 50 °C und 50 rpm inkubiert. Zur Deaktivierung der Enzyme wurde die Suspension für 15 - 30 min auf 95 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf ca. 40 °C wurde die Lösung mittels Filtration über einen Büchner-Trichter vom Feststoff abgetrennt und der enzymbehandelte Zellstoff zweimal mit je 200 mL Wasser gewaschen.
Der Zuckergehalt des Substrat-Zellstoffs (Zellstoff 1), des enzymbehandelten Zellstoffs (Zellstoff 2) sowie die Gesamt-Zuckerkonzentration und Zucker-Monomeren-Konzentration des Filtrates und der Waschlösungen wurden mittels HPAEC analysiert.
Die nach Enzymbehandlung im Filtrat von Zellstoff 2 erhaltenen Konzentrationen an monomeren Pentosen lagen durchschnittlich bei 2,7 g/L Arabinose und 22,8 g/L Xylose. Die Konzentrationen an monomeren Hexosen Galactose und Glucose lagen in allen Bestimmungen unter der Bestimmungsgrenze, was für eine kaum vorhandene Cellulase-Aktivität der eingesetzten Enzyme spricht (vgl. dazu die Cellulase-Aktivitäten der Xylanasen in Tabelle 2).
Die nachfolgende Tabelle 6 zeigt die Zuckergehalte im Lignin-reduzierten Zellstoff (Zellstoff 1) sowie im Lignin- und Xylan-reduzierten Zellstoff (Zellstoff 2). Die dargestellten Werte sind das Ergebnis von

Mehrfachbestimmungen - Zellstoff 1: Mittelwert aus 16 Proben (4 Vierfachbestimmungen) und Zellstoff 2: Mittelwert aus 10 Proben (5 Doppelbestimmungen).

Tabelle 6. Zuckergehalte von Zellstoff 1 (Lignin-reduziert) sowie Zellstoff 2 (Lignin- und Xylan-reduziert).

	Arabinose [%]	Galactose [%]	Glucose [%]	Xylose [%]
Zellstoff 1 (Lignin-reduziert)	3,70	0,63	63,29	32,43
Zellstoff 2 (Lignin- und Xylan-reduziert)	1,84	0,78	84,50	18,09
	prozentuelle Veränderung [%] *
	Arabinose	Galactose	Glucose	Xylose
	-59,2	+0,5	+9,5	-54,3

* Zur Berechnung der angegebenen prozentuellen Veränderungen wurde die durchschnittliche Ausbeute an Zellstoff 2 (82%) miteinbezogen.

Man sieht eine deutliche Abreicherung der Pentosen Arabinose und Xylose im Zellstoff 2 (-59,2% und -54,3% im Vergleich zu Zellstoff 1), während hingegen die Hexosen Glucose und Galactose (+0,5% und +9,5% im Vergleich zu Zellstoff 1) angereichert werden. Der Xylan-Gehalt (Summe aus Arabinose- und Xylose-Gehalt) sinkt von 36 (Zellstoff 1) auf 20% (Zellstoff 2).

Beispiel 4

Festigkeitswerte des Zellstoffs

30 g von Zellstoff 1 (Lignin-reduziert) oder Zellstoff 2 (Lignin- und Xylan-reduziert) wurden in einer Feststoffkonzentration von 1,5% in Wasser in einer PFI-Mühle nach Standard ISO 5264-2:2011 bei 1500 rpm und 2500 rpm (PFI 1500 oder PFI 2500) gemahlen und Papierblätter zur Bestimmung der Festigkeitswerte hergestellt. Die Blattbildung erfolgte dabei nach Standard ISO 5269-2:2004 auf einem Blattbilder der Firma Frank-PTI.

Die Bestimmung der Festigkeitswerte erfolgte nach den folgenden Standards: Tear Index (ISO 1974:2012), Strain at Break (ISO 1924-2:2009), Tensile Index (ISO 1924-2:2009) Burst Index (ISO 2758:2014). Die Messergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 7 sowie in den Figuren 1 (Tear Index) und 2 (Strain at Break) dargestellt, wobei ø für die ungemahlen, PFI 1500 für Mahlung mit 1500 rpm und PFI 2500 für die Mahlung mit 2500 rpm steht.

Tabelle 7. Festigkeitsparameter der aus Zellstoff 1 (Lignin-reduziert) und Zellstoff 2 (Lignin- und Xylan-reduziert) hergestellten Blätter. PFI 1500 steht für Mahlung mit einer PFI-Mühle bei 1500 rpm und PFI 2500 für Mahlung bei 2500 rpm. Die in den Klammern angegebenen Prozentwerte beschreiben die prozentuelle Änderung der Festigkeitswerte nach Xylanase-Behandlung.

	Zellstoff 1			Zellstoff 2
	ungemahlen	PFI 1500	PFI 2500	ungemahlen	PFI 1500	PFI 2500
Tear Index [mN·m²·g^-1]	4,61	3,42	2,57	5,34 (+16%)	4,82 (+41%)	4,10 (+60%)
Strain at Break [%]	1,4	3,0	3,1	1,2 (-16%)	4,1 (+37%)	4,4 (+42%)
Tensile Index [N·m·g^-1]	33,3	74,0	81,4	22,3 (-33%)	64,6 (-13%)	73,4 (-10%)
Burst Index [kPa·m²·g^-1]	1,67	4,35	4,83	1,18 (-29%)	4,50 (+3%)	4,96 (+3%)

Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung von Zellstoff, dadurch gekennzeichnet, dass Stroh, welches Lignin, Xylan und Cellulose enthält und in einer wässerigen Phase suspendiert vorliegt, einer Behandlung zur Herabsetzung des Lignin-Gehalts und einer Behandlung mit einer Xylanase zur Herabsetzung des Xylan-Gehalts unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung zur Herabsetzung des Lignin-Gehalts mittels einer alkalischen wässerigen Lösung enthaltend Ethanol vorgenommen wird.
Verfahren zur Gewinnung von Zellstoff, Lignin und Xylan-Spaltprodukten aus Stroh, welches Lignin, Xylan und Cellulose enthält, gekennzeichnet durch die Kombination der Maßnahmen, dass
a) zerkleinertes Stroh mit einer wässerigen Lösung behandelt wird, welche einen C1-C4-Alkohol enthält und einen pH-Wert zwischen 11 und 14 aufweist, wodurch ein Teil des im Stroh enthaltenen Lignins in Lösung geht und eine Lignin-hältige Lösung und ein in dieser Lösung suspendierter erster Zellstoff erhalten wird,

b) der erste Zellstoff aus der Lignin-hältigen Lösung abgetrennt wird,

c) aus der erhaltenen Lignin-hältigen Lösung das Lignin gewonnen wird,

d) der abgetrennte erste Zellstoff mit einer wässerigen Lösung behandelt wird, welche eine Xylanase enthält, um selektiv den Gehalt an Xylan im ersten Zellstoff herabzusetzen und Xylan-Spaltprodukte in Lösung zu bringen, wodurch ein zweiter Zellstoff erhalten wird, der in der Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung suspendiert ist,

e) der zweite Zellstoff aus der Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung abgetrennt wird, und

f) aus der erhaltenen Xylan-Spaltprodukte-hältigen Lösung die Xylan-Spaltprodukte zumindest teilweise gewonnen werden.
Zellstoff, erhältlich nach einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3.
Zellstoff-Blatt, welches aus Zellstoff nach Anspruch 4 durch Blattbildung hergestellt wird.
Zellstoff-Blatt nach Anspruch 5 mit einem Xylan-Gehalt unter 25,0% und einem Tear Index von mindestens 4,00 mN·m²·g^-1.
Zellstoff-Blatt nach Anspruch 6 mit einem Tear Index von mindestens 4,50 mN·m²·g^-1.
Zellstoff-Blatt nach Anspruch 6 oder 7 mit einem Strain at Break mindestens 3,5%.
Verwendung eines Zellstoffs nach Anspruch 4 zur Herstellung von Faserverbundwerkstoffen, insbesondere Papier, Pappe oder Karton, oder als Zusatz in Misch-Zellstoffen.