ES2083387T5

ES2083387T5 - Peptidos sinteticos y sus mezclas para la deteccion de anticuerpos hiv.

Info

Publication number: ES2083387T5
Application number: ES89400221T
Authority: ES
Inventors: Francesco Bellini; Gervais Dionne; Martial Lacroix
Original assignee: Adaltis Inc
Current assignee: Adaltis Inc
Priority date: 1988-01-27
Filing date: 1989-01-26
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2009-01-26
Also published as: JP3851761B2; DE68925043D1; JP2001055400A; JPH08245693A; IL88963A; DE68925043T3; IL88963A0; AU629528B2; JPH01224397A; EP0326490A3; ES2083387T3; EP0326490B1; AU2851389A; EP0326490B2; DE68925043T2; ATE131492T1; EP0326490A2

Abstract

SE PROPORCIONAN PEPTIDOS CICLCOS DE FORMULA(I), EN LA QUE X ES EL EXTREMO AMINO, UN AMINOACIDO O SECUENCIA DE AMINOACIDO QUE EMPIEZA CON EL AMONOACIDO 604 Y LLEGA HASTA EL AMINOACIDO 586 (GP 41 - HIV - 1); E Y ES EL EXTREMO CARBOXILICO, UN AMINOACIDO O SECUENCIA AMINOACIDO QUE EMPIEZA CON EL AMINOACIDO 612 Y LLEGA HASTA EL AMINOACIDO 629 (GP 41 HIV - 1). TAMBIEN SE PROPORCIONAN PEPTIDOS DE FORMULA(II) EN LA QUE X1 ES EL EXTREMO AMINO, UN AMINOACIDO O SECUENCIA AMINOACIDO QUE EMPIEZA CON EL AMINOACIDO 596 Y LLEGA AL AMINOACIDO 578 (GP 42 - HIV - 2); E Y1 ES EL EXTREMO CARBOXILICO, UN AMINOACIDO O SECUENCIA AMINOACIDO QUE EMPIEZA CON EL AMINOACIDO 604 Y LLEGA HASTA EL 613 (GP 42 - HIV - 2). ESTOS PEPTIDOS CICLICOS SOLOS O EN MEZCLA CON DETERMINADOS PEPTIDOS LINEALES SON PARTICULARMENTE UTILES PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS.

Description

Péptidos sintéticos y sus mezclas para la detección de anticuerpos HIV.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos sintéticos cíclicos y sus combinaciones con péptidos sintéticos lineales para la detección de anticuerpos del HIV.

Antecedentes de la invención

Se ha postulado que el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), el complejo relacionado con el SIDA (ARC) y el pre-SIDA son causados por un retrovirus, el virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV-1; también conocido como HTLV-III, LAV-1 y ARV). Recientemente otro retrovirus humano patogénico denominado HIV-2 (anteriormente LAV-2) se aisló de pacientes del oeste africano con SIDA (Montagnier et al, en PCT/FR 87/00025, publicada el 30 de julio de 1987 bajo el nº de Publicación Internacional WO 87/04459). Se ha mostrado recientemente (Guyader et al, Nature 326, 662-669, 1987) que el HIV-2 comparte un número de secuencias conservadas con el HIV-1 y con los virus de la Inmunodeficiencia Simia (SIV).

Aún cuando en la técnica anterior referida en este documento se utilizan otros sistemas de enumeración, el sistema de enumeración para los aminoácidos que se utiliza en el presente documento es el de Ratner et al., Nature, 313, 277-284, 1985, para las proteínas del HIV-1 y el de Guyader et al, Nature, 326, 662-669 (1987) para las proteínas del HIV-2. Los aminoácidos que aquí se utilizan en los péptidos se expresan con el código de letra única de la manera siguiente: ala=A, arg=R, asn=N, asp=D, cys=C, gln=Q, glu=E, gly=G, his=H, ile=l, leu=L, lys=K, met=M, phe=F, pro=P, ser=S, thr=T, trp=W, tyr=Y y val=V.

Los ensayos de inmunodiagnóstico inicial para la detección de los anticuerpos en el suero de los pacientes infectados con HIV-1, utilizaban el virus completo como antígeno. Los ensayos de segunda generación utilizaron secuencias polipéptidas obtenidas mediante la metodología del ADN recombinante. Cabradilla et al. Bio/Technology 4 128-133 (1985) y Chang et al. Bio/Technology 3, 905-909 (1985) tuvieron éxito en la obtención de fragmentos proteicos víricos sintetizados bacterialmente de, respectivamente, 82 y 102 residuos de aminoácidos. E.P. 86202314 y 86114243 describen regiones que abarcan polipéptidos recombinantes de la gp41 y gp120 que solas o mezcladas, son inmunorreactivas. Shoeman et al, Anal. Biochem 161, 370-379 (1987) describen también varios polipéptidos de la gp41 que poseen propiedades inmunorreactivas con anticuerpos presentes en el suero de los pacientes infectados con el HIV-1. Ninguno de los procedimientos de ensayo anteriores es aceptable. Su falta de sensibilidad es importante, pues puede dejar que el virus que contiene la sangre escape a la detección y de este modo conduzca potencialmente a la reinfección de los receptores de los productos sanguíneos. Las impurezas presentes en estas preparaciones antigénicas son también responsables de los inaceptablemente altos niveles de resultados positivos falsos que provocan que los individuos sanos se angustien.

Se ha hecho evidente que una tendencia de la técnica anterior fue la identificación de epítopos más cortos. Esto es debido a la facilidad y menor costo con los que podrían prepararse y, de forma más importante, a causa de la reducción en el riesgo de obtener resultados falsamente positivos de los ensayos debido a la presencia de epítopos compartidos con las proteínas víricas no relacionadas con el SIDA. A este respecto, Gallaher (Cell 50,327-328,1987) ha encontrado que una región de la gp41 del HIV-1 comparte una secuencia de cinco residuos aminoácidos adyacentes con el virus sincitial respiratorio y de cuatro aminoácidos distribuidos igualmente de la glicoproteína F1 del virus del sarampión. De este modo, incluso los polipéptidos recombinantes muy purificados que esta región contiene o cualesquiera otras regiones comunes todavía por descubrir, serían potencialmente responsables de los resultados falsamente positivos.

Aparte de su especificidad superior, la identificación de secuencias peptídicas más cortas que corresponden a epítopos únicos y muy conservados de los virus HIV, hace que su producción mediante síntesis química, sea más fácil y más barata. Se han descrito métodos empíricos. Estos métodos son capaces de ayudar en la selección de secuencias aminoácidas más cortas que van a quedar expuestas probablemente en la superficie de la proteína original (para una revisión, véase Hopp y Woods, J. Immunol.Met. 88: 1-18, 1986). Aunque algo útiles, estos métodos no son más que indicativos. Sin embargo, se han aplicado por muchos para la identificación de epítopos presentes en las proteínas de los virus responsables del SIDA. Por ejemplo: la Patente US nº 4.629.783, la Solic. de Patente Internacional nº PCT/US86/00831 y la Solic. EP nº 86303224 dan a conocer varios péptidos sintéticos de las proteínas p18, p25, gp41 y gp120 del HIV-1 que se reivindican como útiles en kits diagnósticos del SIDA.

Esta tendencia hacia antígenos más pequeños se acompaña sin embargo del riesgo de que el epítopo sintetizado no sea capaz de asumir una conformación rígida que sea reconocida por el anticuerpo. Aunque el número de muestras séricas ensayadas en cada uno de estos casos es muy limitado, se encontró que la especificidad era muy alta (95%-100%) con péptidos sintéticos pequeños, variando la sensibilidad total entre el 80 y el 100%. En el único ejemplo en el que se alcanzó una sensibilidad del 100%, sólo se habían ensayado diez muestras.

Smith et al, (J. Clin. Microbiol. 25, 1498-1504, 1987) describió dos péptidos solapados, E32 y E34, que son muy inmunorreactivos. No se obtuvieron resultados positivos falsos, entre 240 especímenes seronegativos, pero el ensayo no detectó tres muestras seropositivas entre 322 (sensibilidad del 99,1%). Wang et al (Proc. Natl. Acad. Sci 83, 6159-6163, 1986) describió una serie de péptidos que se solapaban (que incluían residuos aminoácidos de los péptidos E32 y E34 descubiertos por Smith et al.), entre los que un péptido de 21 unidades poliméricas mostró un 100% de especificidad y un 98% de sensibilidad (en 228 muestras seropositivas obtenidas de pacientes con SIDA, 224 se encontraron positivas con este péptido).

En la solicitud de Patente US nº 120.027, presentada el 13 de noviembre de 1987, se da a conocer un péptido sintético corto que abarca los residuos 606 a 620 (SGKLICTTAVPWNAS)) de la gp41 (HIV-1) que se afirma que es inmunorreactivo con los anticuerpos de pacientes infectados con los virus del SIDA. En este ejemplo, la especificidad fue también excelente (63/63), pero 6 especímenes seropositivos por 57 confirmados como positivos no se pudieron detectar (sensibilidad del 89%).

Gnann et al. (J. Virol. 61, 2639-2641, 1987 y J. Infec. Dis. 156, 261-267, 1987) también informó de una serie de péptidos que se solapaban en una región inmunodominante de la gp41 (HIV-1). De interés particular fue su hallazgo de que un péptido que presentaba la secuencia SGKLIC (606-611) no fue inmunorreactivo con ninguno de los 22 sueros HIV-1 positivos ensayados. La adición de un residuo de cisteína al extremo N-terminal restauró alguna inmunorreactividad, y 21 de los 44 sueros reaccionaron con el péptido de 7 unidades poliméricas (48% de sensibilidad). Gnann et al. llegaron a la conclusión de que la cys-605 fue esencial para la inmunorreactividad de este segmento de la proteína gp41 del (HIV-1).

Gnann et al han especulado también que los residuos de cisteína en las posiciones 605 y 611 (sistema de enumeración de Ratner) de la gp41 (HIV-1) podrían jugar un papel crítico en la conformación antigénica de esta región de la proteína, posiblemente mediante la formación de un bucle a través de la unión disulfuro. Sin embargo, los intentos por parte de los autores para identificar y probar la formación de la unión disulfuro no han tenido éxito. Debido a que Gnann et al nunca demostraron que tenían un péptido sintético que contenía la secuencia aminoácida parcial 605-611 en la que los dos grupos cisteína terminales estaban unidos mediante uniones disulfuro, las propiedades de un péptido que poseía tal unión disulfuro eran desconocidas e impredicibles.

La secuencia parcial de 7 aminoácidos que contiene dos residuos de cisteína en posición 605-611 también se ha dado a conocer en otros documentos, tales como PCT/US 86/00831 publicado el 6 de noviembre de 1986, bajo el nº de Publicación Internacional WO 86/06414, en donde el péptido X(39), que está codificado por la región existente desde alrededor de los 7516 pares de bases a los 7593 pares de bases, y el péptido XIII (79), que es codificado por la región que abarca desde alrededor de los 7543 pares de bases a los 7593 pares de bases, ambos contienen la secuencia de 7 aminoácidos (aminoácidos 605-611) considerada por Gnann et al. en la publicación referida anteriormente. Se habla de los péptidos como si fueran lineales y los autores no han mencionado ninguna formación de estructuras cíclicas.

Rosen et al., en el documento PCT/US 87/00577 publicado el 8 de octubre de 1987 bajo el nº de Publicación Internacional WO 87/06005, han informado que una serie de péptidos sintéticos que abarcan los residuos Cys(605)-Cys(611) de la glicoproteína de envuelta del HIV-1 (gp41) experimentan una serie de transformaciones oxidativas espontáneas tras solubilización en un tampón acuoso básico o neutral. Los autores han especulado que bajo estas condiciones, los péptidos utilizados en ELISAs son una mezcla al azar de monómeros lineales, monómeros cíclicos, dímeros lineales o cíclicos y polímeros lineales de varias longitudes. Sin embargo, los inventores no probaron la presencia de componentes cíclicos y no han caracterizado los otros varios dímeros y polímeros presentes, especulando que las formas poliméricas son los componentes más importantes para la reactividad en el ensayo ELISA.

Gnann et al (Science 237, 1346-1349, 1987), informaron de un péptido sintético lineal corto que abarcaba los residuos 592 a 603 de la gp42 (HIV-2), que contiene dos cisteínas en una región homóloga a la una en gp41 (HIV-1), que incluye Cys (605) y Cys (611). Este péptido reaccionó con 5 entre 5 de los sueros que se obtuvieron de los pacientes infectados con el HIV-2.

Aunque las referencias consideradas anteriormente proporcionan péptidos que son útiles para identificar anticuerpos HIV-1, también presentan ciertos inconvenientes tales como incapacidad para la detección plena (100%) de muestras positivas de suero. Por ejemplo, Gnann et al (J. Virol 61, 2639-2641, (1987)), en sus ensayos con su secuencia aminoácida 600-611 detectaron 22 entre 22 sueros positivos. Sin embargo, también indicaron que ensayos similares llevados a cabo por otro autor en el Centers for Disease Control (Centro para el control de las enfermedades) Atlanta, Ga., con la misma secuencia de 12 aminoácidos (600-611) detectó 78 entre 79 sueros positivos. Gnann et al en J. Infect. Dis, 156, 261-267, 1987, mostró que la misma secuencia de 12 aminoácidos de gp41 (HIV-1) se mostró reactiva con 131 entre 132 de los pacientes HIV-1 infectados de los Estados Unidos.

En el mismo artículo, se muestra claramente también que cuando los sueros HIV-1 positivos se diluyen por un factor que excede de 500, algunos de estos sueros diluídos muestran ser negativos, lo cual indica una baja sensibilidad.

Otro inconveniente potencial de estos ensayos de la técnica anterior es la utilización de una mezcla peptídica escasamente definida e imprevisible como sonda. Esta mezcla comprende péptidos que poseen muchas formas oxidativas de cisteína producidas espontáneamente durante la preparación, procesamiento y utilización del péptido.

Sería muy deseable proporcionar péptidos o mezclas peptídicas que sean resistentes a la oxidación espontánea. Tales péptidos deberían tener, por lo tanto, una estructura bien definida. Por otra parte, tales péptidos deberían, bajo condiciones normales de ensayo, detectar todas las muestras que contuvieran anticuerpos HIV-1 y/o HIV-2 como positivas, aún cuando estuvieran presentes niveles muy bajos de anticuerpos.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se proporcionan ahora nuevos péptidos que están particularmente adaptados para la detección del 100% de los anticuerpos del HIV- 1 e HIV-2 y que son capaces todavía de detectar por completo todos los anticuerpos HIV-1 o HIV-2, aún cuando el suero esté muy diluido.

Más específicamente, los nuevos péptidos de la presente invención se definen en la reivindicación 1 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes siguientes: AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE.

También se halla dentro del alcance de la presente invención una combinación o mezcla de péptidos sintéticos tal como se define en la reivindicación 1 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes siguientes: AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE, en asociación con

- un péptido de gp120 caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 497 a 518 (gp120-HIV-1), o

- un péptido de gp120 caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 497 a 518 (gp120-HIV-1), un péptido de p24 caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 241 a 263 (p24-HIV-1) o

- un péptido de gp120 caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 497 a 518 (gp120-HIV-1), y un péptido de gp41 que abarca desde 586 a 620 (gp41-HIV-1).

Según la presente invención, se proporcionan también nuevos péptidos que son útiles para identificar el 100% de los sueros obtenidos de un reducido número de pacientes infectados con el HIV-2. Es por tanto posible utilizar algunos de los péptidos o mezclas de péptidos que se describen en esta invención para la detección de ambos HIV-1 y/o HIV-2.

Más específicamente, los nuevos péptidos de este aspecto de la presente invención están definidos en la reivindicación 3 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes siguientes: AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE; y en la reivindicación 1 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes GR y ES.

También se encuentra del alcance de esta invención una combinación o mezcla de péptidos sintéticos que comprende por lo menos un péptido cíclico tal como se define en la reivindicación 3 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes siguientes: AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE; y en la reivindicación 1 del juego de reivindicaciones previsto para los Estados contratantes GR y ES.

En asociación con un péptido denominado péptido 203, de la glicoproteína de la envuelta externa (EGP) y caracterizado por una secuencia aminoácida que se extiende desde 486 a 508, o un péptido denominado péptido 204, de la EGP, caracterizado por una secuencia aminoácida que se extiende desde 486 a 501.

Además, se halla dentro del alcance de la presente invención la utilización de combinaciones de péptidos sintéticos de la presente invención, en ausencia o en asociación con uno o más péptidos lineales de la gp120 y/o p24 y/o las secuencias aminoácidas de EGP previamente definidas.

Una ventaja no esperada de las nuevas mezclas de la presente invención es que son capaces de proporcionar la completa detección de los anticuerpos HIV procedentes de un amplio conjunto de sueros compuesto por 1378 individuos positivos al HIV-1 y de 5 individuos positivos al HIV-2. Otra ventaja consiste en el alto nivel de especificidad conservada por las mezclas de la presente invención que da lugar a un número mínimo de positivos falsos.

Descripción detallada de la invención Selección de péptidos para síntesis

Los péptidos se seleccionaron para la síntesis sobre la base de las secuencias aminoácidas conocidas de los aislamientos del HIV-1, así como del conocimiento de qué regiones se conservan. Más recientemente, se ha mostrado que el HIV-2, un nuevo virus que ha surgido recientemente, comparte una homología considerable con el HIV-1. Es pues así posible utilizar alguno de los péptidos o mezclas de péptidos descritas en esta invención para detectar ambos HIV-1 y/o HIV-2.

Además de las secuencias de aminoácidos conocidas, se escogieron epítopos potenciales, utilizando diversos principios fisicoquímicos que ayudan en la predicción de qué porciones del polipéptido están más probablemente orientadas a la superficie y por lo tanto son inmunogénicas. Estas incluyen los gráficos de hidrofilicidad de Hopp y Woods (Proc. Nat. Acad. Sci 78, 3824-3828, 1981) y un enfoque similar por parte de Kyte y Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132, 1982). Asimismo, la predicción empírica de la conformación proteica (Chou y Fasman, Ann. Rev. Biochem, 47, 251-276, 1978) constituye una guía útil en la predicción de qué partes del polipéptido es probable que sean inmunogénicas. Aunque estos enfoques teóricos son guías útiles, existen muchas excepciones que incluyen algunas que se descubrieron durante el transcurso de los presentes estudios.

En muchos casos, es deseable modificar las secuencias que se encuentran de modo natural, con el objeto de hacer que el péptido sea más útil como reactivo de inmunodiagnóstico, sin que cambien sus propiedades antigénicas. Tales cambios incluyen:

- adición de un residuo de cisteína en el extremo carboxílico o amino con el objeto de facilitar la conjugación del péptido a una proteína transportadora con reactivos de entrecruzamiento heterobifuncional, tal como el sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil) butirato, un reactivo preferido para llevar a cabo tales uniones;

- adición de ciertos aminoácidos en el extremo carboxílico o amino de un oligopéptido, para facilitar la unión de los péptidos entre ellos, para la conjugación a un soporte o péptido mayor o para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido. Tales cambios se realizan mediante adiciones de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico que pueden utilizarse como engarces mediante una reacción de esterificación, y lisina que puede conectarse mediante formación de una base de Schiff o de una amida;

- formación de derivados mediante acilación del NH_{2} terminal, amidación del ácido tioglicólico, amidación del COOH terminal, por ejemplo, amoníaco, metilamina. Estas modificaciones conducen a cambios en la carga neta del péptido y pueden también facilitar la unión covalente del péptido a un soporte sólido, un transportador u otro péptido. Estas modificaciones no conducen probablemente a cambios en la inmunorreactividad del péptido;

- la metionina, un aminoácido que es propenso a la oxidación espontánea, puede habitualmente ser reemplazado por la norleucina sin cambiar la antigenicidad.

Las secuencias peptídicas pueden ser sometidas a sustituciones conservadoras.

Puede ser conveniente añadir una "cola" que consiste en un reducido número (1-10) de aminoácidos hidrofóbicos para facilitar la adsorción pasiva de un péptido a un soporte sólido. Esta modificación puede realizarse en el extremo COOH o en el NH_{2}. La adición que se prefiere es phe-ala-phe-ala-phe.

Según la presente invención, los péptidos cíclicos útiles preferidos para la detección de los anticuerpos del HIV-1 son aquellos en los que:

a-x es NH_{2}-RILAVERYLKDQQLLGIWG- e y-b es -TTAVPWNAS-COOH (87c).

Asimismo según la presente invención, los péptidos cíclicos útiles preferidos para la detección de los anticuerpos HIV-2 son aquellos en los que:

a-x^{1} es NH_{2}-RVTAIEKYLQDQARLNSWG- e y^{1} es HTTVPWVNDS-COOH (péptido 202).

Los péptidos cíclidos más preferidos son los péptidos 87c y 202.

La Tabla 1 proporciona los números posicionales de los aminoácidos para HIV-1 basados en la secuencia publicada por Ratner et al., Nature 313, p. 277-284 (1985) y aquéllos para HIV-2 basados en la secuencia publicada por Gudayer et al, Nature 326, 662-669 (1987), para los péptidos cíclicos preferidos de la presente invención.

TABLA I

1

Preparación de péptidos lineales y cíclicos

El soporte de resina es cualquier resina apropiada que se utilizan convencionalmente en la técnica para la preparación de polipéptidos en fase sólida, preferentemente resina de p-benciloxialcohol polistireno y de p-metilbencidrilamina. Tras la conjugación del primer aminoácido protegido al soporte resínico, el grupo protector amino es eliminado mediante métodos estándares utilizados convencionalmente en la técnica de la síntesis peptídica en fase sólida. Tras la eliminación del grupo protector amino, los \alpha-amino protegidos restantes y, si es necesario, los aminoácidos protegidos de la cadena lateral se conjugan secuencialmente en el orden deseado para obtener el producto. Alternativamente, pueden conjugarse múltiples grupos de aminoácidos utilizando una metodología en fase líquida previa a la conjugación con la secuencia aminoácida con soporte resinoso.

La selección de un agente de conjugación apropiado sigue la técnica establecida. Por ejemplo, son reactivos apropiados de conjugación la N,N'-diisopropilcarbodiimida o la N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), bien solos o preferentemente en presencia de 1-hidroxibenzotriazol. Otro procedimiento útil de conjugación utiliza anhídridos simétricos preformados de aminoácidos protegidos.

El grupo protector \alpha-amino necesario utilizado para cada aminoácido introducido en la cadena polipeptídica en crecimiento es preferentemente 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), aunque puede utilizarse cualquier otro grupo protector apropiado mientras no sufra degradación bajo las condiciones de conjugación y mientras sea fácil y selectivamente eliminable en presencia de cualesquiera otros grupos protectores ya presentes en la molécula creciente.

Los criterios para la selección de grupos para los aminoácidos de la cadena lateral son: (a) estabilidad del grupo protector respecto a los distintos reactivos bajo condiciones de reacción selectivas para la eliminación del grupo protector \alpha-amino en cada fase de la síntesis: (b) el grupo protector debe conservar sus propiedades estratégicas (esto es, no dividirse bajo las condiciones de conjugación) y (c) el grupo protector debe ser fácilmente eliminable después de la terminación de la síntesis del polipéptido y bajo condiciones que no afecten de otro modo a la estructura polipeptídica.

Los péptidos soportados por la resina totalmente protegidos son fragmentados a partir de la resina de p-benciloxi alcohol con una solución del 50 al 60% de ácido trifluoroacético en cloruro de metileno durante 1 a 6 horas, a temperatura ambiente, en presencia de "coleccionistas de desechos" apropiados, tales como anisol, tioanisol, etil metil sulfuro, 1,2-etaneditiol y reactivos relacionados. Simultáneamente, se eliminan la mayoría de los grupos protectores ácido lábiles de cadena lateral. Mediante tratamiento por HF, se eliminan la mayoría de los grupos protectores ácido resistentes.

Los péptidos cíclicos de la presente invención se preparan mediante la conversión oxidativa directa de grupos SH protegidos o desprotegidos a un puente disulfuro mediante las técnicas siguientes, que se conocen generalmente en la técnica de la síntesis peptídica. El método preferido implica la oxidación directa de grupos SH libres con ferricianuro de potasio. Tales péptidos cíclicos adoptan una conformación más rígida, que puede favorecer la unión al anticuerpo. No se sabe si existen uniones disulfuro cisteína a cisteína en las proteínas víricas originales.

Mezclas peptídicas

También se hallan dentro del alcance de la presente invención las mezclas de péptidos cíclicos y lineales que, sorprendentemente, se ha encontrado que proporcionan una completa detección de los anticuerpos HIV-1 e HIV-2 derivados de un conjunto amplio de sueros de 1378 individuos HIV-1 positivos y de 5 individuos HIV-2 positivos. También se ha encontrado que las nuevas mezclas de esta invención proporcionan un alto nivel de especificidad, que da lugar a un número mínimo de positivos falsos.

Además, las mezclas de la presente invención comprenden por lo menos un péptido cíclico de fórmula general

2

en la que x, y, a y b son tal como se definieron previamente, en combinación con

-: un péptido lineal de gp120 (HIV-1), o

-: un péptido lineal de gp120 (HIV-1), un péptido lineal de p24 (HIV-1) y un péptido lineal de gp41 (HIV-1), o

-: un péptido lineal de gp120 (HIV-1) y un péptido lineal de gp41 (HIV-1).

Otras mezclas de la presente invención comprenden por lo menos un péptido cíclico de fórmula general:

3

en la que x^{1} e y^{1} son tal como se definieron previamente, en combinación con uno de los péptidos lineales de la EGP de HIV-2.

Aún cuando los péptidos cíclicos derivados de la gp41-(HIV-1) y de la gp42-(HIV-2) imitan una región inmunodominante y muy conservada, se encontró más seguro incluir secuencias peptídicas de gp41(HIV-1) y algunas de otras dos proteínas inmunogénicas de (HIV-1). En el caso de que una mutación modificara este epítopo hasta el punto de que los anticuepros contenidos en el suero de tal persona infectada no fueran ya capaces de unirse a los péptidos cíclicos, este suero podría todavía encontrarse positivo, a causa de los otros anticuerpos dirigidos contra los otros epítopos contenidos en el sistema de ensayo. Existe por lo tanto un límite para el número de péptidos que pueden utilizarse en una mezcla. Primero de todo, demasiados péptidos diferentes podrían incrementar la cantidad de resultados positivos falsos. Particularmente, muchos péptidos de la proteína p24 (HIV-1) fueron a menudo encontrados responsables de una especificidad inaceptablemente baja. En segundo lugar, la adición de demasiados péptidos en una mezcla diluiría al o a los inmunodominantes y disminuiría la sensibilidad del ensayo.

Más específicamente, el péptido lineal de gp120 (HIV-1) posee la secuencia de aminoácidos que se extiende desde 497 a 518 y corresponde a la fórmula

(71)NH_{2}-CGKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR-COOH

El péptido lineal de p24 (HIV-1) posee la secuencia de aminoácidos que se extiende desde 241 a 263 y que corresponde a la fórmula

(61)NH_{2}-CGSTLQEQIGWNTNNPPIPVGEIYK-COOH

Los péptidos lineales de EGP (HIV-2) poseen secuencias de aminoácidos que se extienden desde 486 a 501 (péptido 204) o de 486 a 508 (péptido 203).

(203)NH_{2}LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR-COOH

(204)NH_{2}LVEITPIGFAPTKEKR-COOH

Detección de anticuerpos de HIV

Los péptidos y las mezclas peptídicas de la presente invención se utilizan como reactivos diagnósticos para la detección de anticuerpos asociados con el SIDA, según los métodos bien conocidos en la técnica. La principal ventaja de estos péptidos en la determinación de los anticuerpos contra el SIDA reside en su especificidad, cuando se compara con los antígenos conocidos utilizados hasta la fecha.

Según un método para la determinación de anticuerpos contra el virus del SIDA, se utiliza el denominado análisis de "Transferencia Western" (Towbin, H., Staehelin, Th. y Gordon, J. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)). Según esta técnica, un péptido o péptidos de la presente invención se aplica o se aplican a un papel de nitrocelulosa. Este papel de nitrocelulosa está saturado, tratándose entonces con el suero que debe ensayarse. Después de lavado, el papel de nitrocelulosa se trata con una IgG antihumana marcada con un enzima. La actividad enzimática se determina entonces mediante un sustrato adecuado. Por supuesto que pueden utilizarse otros marcadores, tales como sustancias radioactivas o fluorescentes.

Una técnica clásica y conveniente, preferida para la determinación de anticuerpos contra el virus del SIDA que utiliza un péptido o una mezcla de péptidos de la presente invención es el ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA). Según este ensayo, un péptido o una mezcla peptídica de la invención se adsorbe en los pocillos de un placa de microtitulación. Los pocillos se tratan entonces con sueros que deben ensayarse. Después de lavado, se añade a los pocillos IgG anti humana marcada con peroxidasa. La determinación de la peroxidasa se lleva a cabo con un sustrato correspondiente, por ejemplo, con o-fenilen diamina. También en este procedimiento la peroxidasa puede cambiarse por otra sustancia marcadora, por ejemplo, por un marcador radioactivo o fluorescente.

En el ensayo de ELISA, es posible utilizar péptidos individuales o combinación de los mismos. Esta última es preferible, ya que le permite a uno combinar los péptidos más efectivos para detectar anticuerpos, mientras que al mismo tiempo se excluyen los que contribuyen a respuestas falsas. Se descubrió durante estos estudios que algunas muestras séricas dieron resultados positivos correctos con mezclas de péptidos, mientras que daban respuestas dudosas con péptidos individuales como antígeno. Así, un ensayo completamente fiable para los anticuerpos HIV-1 e HIV-2 puede sólo alcanzarse con una combinación apropiada de antígenos peptídicos.

Otro método para la determinación de anticuerpos contra el virus del SIDA con los péptidos o con la mezcla de los péptidos de la invención es un ensayo inmunológico enzimático según el denominado "Método del sandwich del antígeno doble". Este método se basa en el trabajo de Maiolini, R.I., tal como se describe en Immunological Methods 20, 25-34 (1978). Según este método, el suero que va a ensayarse se hace contactar con una fase sólida que se recubre con un péptido o mezcla de péptidos de la invención (capa de captura) y con un péptido o una mezcla peptídica de esta invención que está marcada con peroxidasa (capa sonda). La reacción inmunológica puede llevarse a cabo en una o dos fases. Si la reacción inmunológica se lleva a cabo en dos etapas, se realiza entonces una fase de lavado entre las dos incubaciones. Después de la o las reacciones inmunológicas, se hace un lavado. Entonces la peroxidasa se determina con un sustrato, por ejemplo, con o-fenilén diamina.

Fases sólidas apropiadas son polímeros orgánicos e inorgánicos [amilasas, dextranos, celulosas naturales o modificadas, polietileno, poliestireno, poliacrilamidas, agarosas, magnetita, polvo de vidrio poroso, fluoruro de polivinildieno (kynar) y latex], la pared interna de los recipientes analíticos (tubo de ensayo, placas de titulación o recipientes de vidrio o material artificial) así como la superficie de cuerpos sólidos (varillas de vidrio y material artificial, varillas con engrosamiento terminal, varillas con lóbulos terminales o láminas). Esferas de vidrio y material artificial son transportadores de fase sólida particularmente apropiados.

Los péptidos y mezclas de péptidos de la presente invención no sólo son útiles en la determinación de anticuerpos contra el virus del SIDA, sino también para la determinación del virus del SIDA en sí mismo, ya que estos péptidos bien libremente, polimerizados o conjugados a un transportador apropiado, son útiles para generar anticuerpos, en particular, anticuerpos monoclonales, contra el virus del SIDA. Tales anticuerpos pueden provocarse inyectando una cantidad suficiente de un péptido o de una mezcla de péptidos de la invención en un mamífero o un ave y recuperando tales anticuerpos a partir del suero de los mencionados animales.

Entre los animales huéspedes apropiados para provocar anticuerpos, se incluyen mamíferos tales como conejos, caballos, cobayas, cabras, ratas, ratones, ovejas, vacas, etc.

En la determinación del virus del SIDA o de una porción suya, pueden utilizarse varios métodos generalmente conocidos.

En uno de tales procedimientos, cantidades conocidas de una muestra sérica que debe ensayarse, péptidos cíclicos radiomarcados o mezclas de péptidos de la presente invención se mezclan juntos y se dejan en reposo. El complejo anticuerpo/antígeno se separa de los reactivos no unidos mediante procedimientos conocidos en la técnica, es decir, mediante tratamiento con sulfato amónico, polietilenglicol, un segundo anticuerpo bien en exceso o unido a un soporte insoluble, carbón vegetal tapizado de dextrano y análogos. La concentración del péptido marcado o mezcla de péptidos de la presente invención se determina en la fase unida o no unida, y el contenido SIDA de la muestra puede ser entonces determinado mediante comparación del nivel del componente marcado observado con una curva estándar de una forma de por sí conocida.

Otro método apropiado es el "Ensayo sandwich del anticuerpo doble". Según este ensayo, la muestra que debe ensayarse se trata con dos anticuerpos distintos. Uno de estos anticuerpos está marcado y el otro está revistido en una fase sólida. Las fases sólidas apropiadas son las que se han mencionado anteriormente en esta solicitud. Marcajes apropiados son enzimas, por ejemplo peroxidasa, marcadores radioactivos o fluorescentes. La fase sólida preferida es una perla de plástico y el marcaje preferido es peroxidasa de rábano. Pueden producirse distintos anticuerpos mediante inmunización de distintos animales, por ejemplo ovejas y conejos.

Otro método consiste en utilizar la técnica bien conocida de Koehler y Milstein para producir anticuerpos monoclonales. Con el objeto de distinguir los anticuerpos monoclonales que están dirigidos contra el mismo antígeno, pero contra distintos epítopos, puede utilizarse el método de Stähli et al [J. of Immunological Methods 32, 297-304 (1980)].

Por supuesto, también es posible utilizar un antisuero (anticuerpo policlonal) y un anticuerpo monoclonal.

Según el "Método sandwich del anticuerpo doble" se incuba la muestra con el anticuerpo de fase sólida y el anticuerpo marcado. Es posible tratar la muestra primero con el anticuerpo de fase sólida y después de lavado tratar la muestra con el anticuerpo marcado.

Sin embargo, es también posible tratar la muestra primero con el anticuerpo de fase sólida y, al cabo de cierto tiempo, con el anticuerpo marcado. Además y preferentemente es posible tratar la muestra junto con la fase sólida y el anticuerpo marcado.

Después de la reacción o las reacciones inmunológicas, se lleva a cabo una fase de lavado. Tras el lavado, se determina el marcador según los procedimientos conocidos en la técnica. En el caso de que se utilice peroxidasa como marcador, la determinación se lleva a cabo con el sustrato, por ejemplo con o-fenilen diamina o con tetrametilbencidina. La cantidad del componente marcado es proporcional a la cantidad del antígeno (s) presentes en la muestra.

Los métodos para la determinación del virus del SIDA o de los anticuerpos contra el virus del SIDA tal como se describieron anteriormente, pueden ser llevados a cabo en kits de ensayo apropiados que comprenden, en un recipiente, un péptido cíclico de la invención o anticuerpos contra el virus del SIDA provocados por un péptico cíclico o una mezcla de péptidos cíclicos y lineales de la invención.

Conjunto de sueros ensayados

El conjunto de sueros que se ensayaron con los productos de la presente invención se han obtenido a partir de una amplia variedad de individuos e incluye 845 muestras que se supo eran seronegativas y 1378 muestras que se confirmaron seropositivas para el HIV-1 y 5 muestras que se confirmaron seropositivas para el HIV-2.

La Tabla 2 muestra una descripción de los individuos de los cuales se tomaron las muestras séricas así como su status serológico en cuanto al HIV.

TABLA 2

4

Resultados

Los péptidos cíclicos de la invención y sus mezclas con uno o más péptidos lineales se ensayaron según la prueba de ELISA descrita previamente contra una variedad de sueros, alguno de los cuales se confirmaron positivos y otros negativos.

La Tabla 3 proporciona resultados de péptidos únicos que se evaluaron individualmente para identificar sueros HIV-1 positivos conocidos.

La Tabla 4 proporciona los resultados de péptidos únicos que se evaluaron individualmente para identificar sueros HIV-2 positivos conocidos.

La Tabla 5 se proporciona para ilustrar la sensibilidad de los péptidos cíclicos respecto a los no cíclicos en el ensayo ELISA, comparando los resultados de algunos sueros a varias diluciones. Se tendrá en cuenta que dentro de cada par, el análogo cíclico es más activo que su réplica lineal. Estos datos muestran claramente la importancia de una estructura cíclica de ciertos péptidos para reaccionar con el anticuerpo.

Más recientemente, se encontró que en algunas condiciones utilizadas para el revestimiento (tampón carbonato, pH 9,6), los péptidos lineales que poseían dos cisteínas en su secuencia podrían sufrir una ciclización interna y una polimerización. Aunque estos resultados que se presentan en la Tabla 5 muestran claramente la superioridad de los péptidos cíclicos sobre sus opuestos lineales para detectar los anticuerpos HIV-1, esta sensibilidad aumentada podría haber sido infravalorada a causa de la ciclización y polimerización del péptido lineal tras solubilización en un tampón carbonato (pH 9,6). Este experimento se repitió con el péptido lineal 87 y el cíclico 87c disueltos en un tampón carbonato (pH 9,6) como antes y también en ácido acético al 10% (pH 2,7). El análisis HPLC de los péptidos confirmó que en tampón carbonato, el péptido lineal 87 utilizado sufrió ciclización y polimerización cuando se mantuvo en solución a la temperatura ambiente. Se cree que la ciclización y polimerización también tuvieron lugar en los pocillos de las placas de microtitulación, aunque la proporción exacta del péptido cíclico que se une a las placas respecto al lineal, todavía no se ha determinado.

Contrariamente a lo que se aprecia en el tampón carbonato, el péptido lineal 87, disuelto en ácido acético al 10%, permaneció lineal tal como se indicó mediante HPLC y mediante el ensayo de Ellman.

El péptido cíclico 87c disuelto en ácido acético al 10% se mantuvo cíclico (a partir del análisis HPLC y del ensayo negativo de Ellman).

Las placas utilizadas en este experimento se recubrieron con soluciones de péptidos a 10 \mug/ml. (Los resultados experimentales de las Tabla 5 se obtuvieron con placas revestidas con péptidos a 0,5 \mug/ml). Cuatro muestras de sueros HIV-1 positivos distintos se diluyeron en serie, determinándose sus títulos. El título se definió como la dilución sérica que daba una lectura de la absorbancia de 1,0 en las condiciones del procedimiento ELISA ya descrito.

Como ya se demostró en la Tabla 5, está claro todavía en la Tabla 6 que el péptido cíclico 87c es capaz de detectar, con una sensibilidad mayor que su réplica lineal 87, los anticuerpos específicos para el HIV-1. Las relaciones de sensibilidades medidas con el péptido cíclico respecto del péptido 87 lineal varían entre 1,3 y 2,2, con una media de 1,8. Estas relaciones son aún más grandes, variando desde 3,0 a 4,5, cuando la sensibilidad del ensayo ELISA utilizando el péptido cíclico 87c se compara utilizando condiciones (pH ácido) en las que el péptido lineal 87 se conserva lineal y no se le deja ciclizar o polimerizarse.

Experimentos similares que comparan la sensibilidad de placas revestidas con el péptido cíclico bien definido 87c con otras revestidas con un conjunto de fracciones cromatográficas que contienen sólo varios polímeros del péptido 87, demostraron también la superioridad del péptido cíclico 87c en la detección de anticuerpos HIV-1 con la máxima sensibilidad. Durante estos experimentos, se encontró también inesperadamente que las lecturas precedentes son significativamente más altas en las placas revestidas con el péptido lineal 87 (0,144 \pm 0,010 versus 0,006 \pm 0,002), e ilustra una ventaja adicional de utilizar el péptido 87c cíclico completamente oxidado en los ensayos del
SIDA.

En la Tabla 7, se evalúan mezclas de péptidos cíclicos y lineales para identificar sueros HIV-1 o HIV-2 positivos conocidos y la Tabla 8 muestra los resultados de las mismas mezclas contra los sueros HIV-1 o HIV-2 negativos.

Las mezclas utilizadas en la Tabla 7 y 8 son como sigue:

Mezcla n^{o}	Péptidos de la mezcla

1	Péptidos lineales 41, 42, 56 y 71
2	Péptidos lineales 23, 29, 42, 56 y 71
3	Péptido cíclico 80 y péptidos lineales 61,71 y 87
4	Péptido cíclico 80 y péptidos lineales 71 y 87
5	Péptidos cíclicos 80 y 87c y péptido lineal 71
6	Péptidos cíclicos 200, 201, 202 y péptidos lineales 203 y 204.
7	Péptidos cíclicos 80, 87c, 202 y péptidos lineales 71, 203 y 204.

En estas mezclas, los péptidos 23, 29, 203 y 204 tienen la siguiente secuencia:

La Tabla 9 muestra una comparación de un ensayo entre la mezcla 4 de la invención y la prueba de la Transferencia Western en el ensayo de 167 sueros HIV-1 positivos y de 51 sueros negativos HIV-1 e HIV-2. Los resultados muestran que la mezcla 4 de la invención en el ensayo ELISA proporciona una sensibilidad y especificidad más acusada que la prueba de Transferencia Western.

La Tabla 10 muestra un ensayo de inmunofluorescencia en el ensayo de 822 sueros HIV-positivos y 114 sueros negativos HIV-1 e HIV-2. Los resultados muestran que la mezcla 4 en el ensayo ELISA proporciona una sensibilidad y especificidad más acusada que el ensayo de inmunofluorescencia.

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TABLA 3

5

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6

TABLA 4

7

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TABLA 5

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TABLA 6

9

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TABLA 7

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TABLA 8

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TABLA 9

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TABLA 10

13

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Los resultados muestran claramente la superioridad de ciertas mezclas peptídicas, particularmente la preferida, número 5, que identifica correctamente los sueros conocidos HIV-1 positivos y de la mezcla 6 que identifica correctamente los sueros conocidos HIV-2 positivos y, finalmente, la mezcla 7 que identifica correctamente ambas muestras séricas HIV-1 e HIV-2 positivas. La utilización de una mezcla en lugar de un péptido único minimiza las posibilidades de fracaso en la identificación de un bajo título sérico atípico en el cual los anticuerpos puedan estar dirigidos contra un número muy limitado de epítopos. Todas las muestras seropositivas se ensayaron mediante ELISA y se confirmaron mediante Transferencia Western o ensayo de inmunofluorescencia. En caso de discrepancia, la muestra se ensayó mediante un ensayo de precipitación radioinmune, el cual se tomó como el estándar de referencia final.

Los siguientes ejemplos ilustran el procedimiento general para la síntesis y utilización de péptidos de la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de resinas que transportan el residuo aminoácido protegido por N\alpha-Fmoc

El residuo aminoácido protegido por N\alpha-Fmoc en una mezcla de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y dimetilformamida (DMF) (4:1) se añadió a una suspensión de la resina p-benziloxi alcohólica en CH_{2}Cl_{2} :DMF (4:1) a 0ºC. La mezcla se agitó manualmente durante algunos segundos y se trató entonces con N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), seguido de una cantidad catalítica de 4-(dimetilamino) piridina. La mezcla se agitó a 0ºC durante otros 30 minutos y durante la noche a temperatura ambiente. La resina filtrada se lavó sucesivamente con CH_{2}Cl_{2}, DMF e isopropanol (3 lavados cada uno) y finalmente con CH_{2}Cl_{2}. La resina se suspendió en CH_{2}Cl_{2}, se enfrió en un baño de hielo y a la suspensión agitada se le añadió piridina redestilada seguida de cloruro de benzoilo. Se continuó la agitación a 0ºC durante 30 minutos y durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración, la resina se lavó sucesivamente con CH_{2}Cl_{2}, DMF e isopropanol (3 lavados cada uno) y finalmente con éter de petróleo (dos veces), antes de secarse bajo alto vacío a un peso constante. La determinación espectrofotométrica de sustitución según Meienhofer et al (Int. J. Peptide Protein Res., 13, 35, 1979) indicó el grado de sustitución en la resina.

Ejemplo 2 Conjugación de los aminoácidos consecutivos

La resina que transporta el primer residuo de aminoácido protegido por N\alpha-Fmoc se dispuso en un recipiente de reacción de un Sintetizador de Péptidos Labortec SP640 y se trató de la manera siguiente:

1): Lavado con DMF (dos veces durante un minuto, cada una).

2): Prelavado con una solución de piperidina al 20% en DMF (10 minutos).

3): Desprotección con una solución de piperidina al 20% (10 minutos).

4): Lavado con DMF (4 veces, 30 segundos cada una).

5): Lavado con isopropanol (dos veces, 30 segundos cada una)

6): Lavado con DMF (dos veces, 45 segundos cada una).

7): Comprobación de los grupos amino libres mediante el ensayo de Kaiser (debe ser positivo).

8): La resina peptídica se agita entonces suavemente durante 2 minutos, con 3 equivalentes molares del aminoácido deseado protegido por F-moc y con 3,6 equivalentes molares de 1-hidroxibenzotriazol disuelto por completo en DMF redestilado seco.

9): Se añaden entonces al recipiente de reacción DCC sólido (3,3 equivalentes molares).

10): Se agita la mezcla reactiva durante 2 horas.

11): Se lava con DMF (dos veces durante 45 segundos cada una).

12): Lavado con isopropanol (dos veces durante 45 segundos cada una).

Después de la etapa 12, se toma una parte alícuota para llevar a cabo un ensayo de ninhidrina. Si el ensayo es negativo, se vuelve a la etapa 1 para la conjugación del siguiente aminoácido. Si el ensayo es positivo o ligeramente positivo, se repiten las etapas 6-12.

El esquema anterior se utiliza para la conjugación de cada uno de los aminoácidos de los péptidos que se describen en la invención. La protección N-\alpha con Fmoc se utiliza con cada uno de los restantes aminoácidos hasta el final de la síntesis.

Se obtienen péptidos marcados radioactivamente mediante la incorporación de ^{3}H-glicina, utilizando el protocolo de conjugación mencionado.

Después de la adición del último aminoácido, el N\alpha-Fmoc del residuo N-terminal se elimina volviendo a las etapas 1-7 del esquema anterior. La resina peptídica se lava con CH_{2}Cl_{2} y se seca al vacío para dar el péptido en bruto protegido.

Ejemplo 3 Desprotección y fragmentación de los péptidos a partir de la resina

La resina peptídica protegida se suspende en una solución de ácido trifluoroacético (TFA) al 55% en CH_{2}Cl_{2} que contenía etaneditiol al 2,5% y anisol al 2,5%. La mezcla se inunda con N_{2} y se agita durante 1,5 h a temperatura ambiente. La mezcla se filtra y la resina se lava con CH_{2}Cl_{2}. Se trata la resina otra vez con TFA al 20% en CH_{2}Cl_{2} durante 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se filtra y la resina se lava con TFA al 20% en CH_{2}Cl_{2},lavándose entonces con CH_{2}Cl_{2}. Los filtrados combinados se evaporaron al vacío por debajo de 35ºC y el residuo se trituró varias veces con éter dietílico seco. El sólido se disolvió en ácido acético acuoso al 10% y se liofilizó para proporcionar el producto en bruto.

Los péptidos que contienen residuos arg y cys son desprotegidos posteriormente mediante tratamiento con HF a 0ºC durante 1 hora en presencia de anisol y dimetilsulfuro. Los péptidos se extraen con ácido acético acuoso al 10%, se lavan con éter dietílico y se liofilizan para proporcionar los péptidos en bruto.

Ejemplo 4 Purificación de péptidos

Los péptidos en bruto se purifican mediante HPLC preparatoria en una columna Vydac (2,5 x 25 mm) de fase inversa C_{18} o C_{4}, con un gradiente de la fase móvil. El chorro se monitoriza a 220 nm y posteriormente mediante HPLC analítica.

Las fracciones importantes se asocian, se evaporan y liofilizan. La identidad de los péptidos sintéticos se comprueba mediante cromatografía de fase inversa y mediante análisis de aminoácidos.

Ejemplo 5 Ciclización de los péptidos

Se añade lentamente una solución de ferricianuro potásico (0,1 M, pH 7,0) a una solución acuosa diluída (0,5 mM) del péptido lineal a pH 7,0. Después de 2 horas a temperatura ambiente, el pH se hace disminuir hasta 5,0 y la solución se trata con resina de intercambio inónico (Bio-Rad Ag-3-X4a, forma Cl) durante 30 minutos. La suspensión se filtra y el filtrado se liofiliza para dar el péptido cíclico en bruto. El péptido se purifica mediante HPLC preparatoria de fase inversa y se caracteriza mediante análisis de aminoácidos. La prueba de una estructura cíclica se obtiene mediante comparación de la movilidad cromatográfica (de HPLC) del péptido cíclico con el péptido lineal de partida, reduciendo una parte alícuota del péptido cíclico al péptido lineal y también observando la desaparición de grupos sulfhidrilos libres (prueba de Ellman) después de la ciclización.

Con el objeto de ilustrar la diferencia fisicoquímica entre los péptidos cíclicos y sus correspondientes péptidos lineales, puede hacerse referencia a la Tabla 11, que muestra la diferencia en el tiempo de retención en la HPLC.

TABLA 11

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Ejemplo 6 Conjugación de péptidos con la albúmina sérica bovina o con la hemocianina de las lapas

Los péptidos se conjugan con la BSA o con la KLH previamente tratadas con sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (Sulfo-SMPB).

Una solución acuosa de sulfo-SMPB (Pierce Chemicals) se añade a una solución de BSA o KLH en tampón fosfato sódico 0,02 M pH 7,0. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 45 minutos y el transportador activado se aplica inmediatamente a una columna de Sephadex G-25 equilibrada con tampón de fosfato sódico 0,1 M; pH 6,0, a 4ºC.

Las fracciones del primer pico de absorbancia (280 nm) que corresponden al transportador activado se combinan en un matraz de fondo redondo al que se añade una solución del péptido en tampón de fosfato sódico 0,05 M; pH 6,2. La mezcla se inunda a fondo con N_{2} y se incuba durante la noche a temperatura ambiente. La eficacia de la conjugación se monitoriza utilizando un péptido marcado con ^{3}H- y mediante análisis de los aminoácidos del conjugado.

Ejemplo 7 Detección de anticuerpos para el HIV mediante un ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA)

Cada pocillo de la placa de microtitulación se satura con 100 \mul de una solución que contiene un péptido o una mezcla de péptidos (5 \mug/ml) y se deja durante la noche. Los pocillos se vacían y se lavan dos veces con un tampón de lavado (Tris, 0,043M; NaCl, 0,5M; timerosal, 0,01% peso/vol; Tween 20, 0,05% v/v; pH 7,4). Los pocillos se saturan entonces con 0,35 ml de tampón de lavado durante 1 hora a 37ºC y se lavan una vez con el mismo tampón. Las muestras séricas a analizar se diluyen con tampón de muestra) (tampón de lavado + caseína, 0,05% peso/vol). Los pocillos se enjuagan con tampón de lavado antes de la adición de la muestra del suero diluído (0,1 ml). Se dejan incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se vacían entonces, se lavan dos veces rápidamente y una vez durante dos minutos con tampón de lavado. La solución del conjugado (anticuerpo de cabra purificado por afinidad para IgG humana marcada con peroxidasa, 0,5 mg en 5 ml de glicerol al 50%) diluida con albúmina sérica bovina al 1% peso/vol en tampón de lavado, se añade a cada pocillo (0,1 ml) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se vacían entonces y se lavan dos veces rápidamente con tampón de lavado y cinco veces en las cuales el tampón estuvo en contacto con el pocillo durante 2 minutos por lavado. La solución del sustrato (3,3', 5,5'-tetrametilbencidina, 8 mg por ml de DMSO) se diluye con 100 volúmenes de tampón de citrato-acetato 0,1 M; pH 5,6 que contiene 0,1% v/v de H_{2}O_{2} al 30% y se añade a cada pocillo (0,1 ml por pocillo). Después de 10 minutos, el contenido de cada pocillo se trata con 0,1 ml de H_{2}SO_{4} 2N y la densidad óptica se lee a 450 nm. Todas las determinaciones se realizan por duplicado.

Claims

1. Péptido sustancialmente puro de fórmula:

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en la que x^{1}, si está presente, se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:

RVTAIEKYLQDQARLNSWG y péptidos correspondientes derivados de las regiones homólogas N-terminales de otros aislamientos de HIV-2 y péptidos que difieren de los anteriores como resultado de sustituciones de aminoácidos conservadores;

y^{1}, si está presente, se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:

HTTVPWVNDS y péptidos C-terminales correspondientes, derivados de las regiones homólogas de otros aislamientos de HIV-2 y péptidos que difieren de los anteriores como resultado de sustituciones de aminoácidos conservadores;

a representa un amino terminal o se selecciona de entre el un grupo constituido por un residuo de cisteína, una tirosina, un ácido glutámico, un ácido aspártico y una lisina, que hace al péptido más útil como reactivo de inmunodiagnóstico, sin cambiar sus propiedades antigénicas;

b representa un carboxi terminal o se selecciona de entre el grupo constituido por un residuo de cisteína, una tirosina, un ácido glutámico, un ácido aspártico y una lisina, que hace al péptido más útil como reactivo de inmunodiagnóstico, sin cambiar sus propiedades antigénicas.

2. Péptido según la reivindicación 1, en el que a-x^{1} es NH_{2}-RVTAIEKYLQDQARLNSWG- e y^{1}-b es -HTTVPWV
NDS-COOH.

3. Mezcla inmunorreactiva que comprende por lo menos un péptido según la reivindicación 1, mezclado con:

- un péptido de EGP (HIV-2) caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 486 a 501, o

- un péptido de EGP (HIV-2) caracterizado por una secuencia de aminoácidos que abarca desde 486 a 508.

4. Método para la detección de anticuerpos para HIV-2, que comprende la utilización de un péptido o de una mezcla de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el método de inmunoensayo es un procedimiento de ensayo ELISA, de hemoaglutinación, o sobre tira en uno o varios puntos.

6. Kit de prueba para la detección de anticuerpos para HIV-2 y diagnóstico del SIDA, de las condiciones ARC y pre-SIDA, caracterizado porque el reactivo inmunoquímico es un péptido o una mezcla peptídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales para HIV-2 en los mamíferos, que utiliza un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el péptido está conjugado con cualquier transportador apropiado.

8. Método para la detección del HIV-2 que utiliza anticuerpos derivados del inmunógeno según la reivindicación 7 y que detecta la presencia de dichos virus.