ES2084689T5 - Metodo para la averiguacion del sindrome de down. - Google Patents
Metodo para la averiguacion del sindrome de down.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN METODO Y APARATO PARA DETERMINAR SI UNA MUJER GESTANTE TIENE UN RIESGO SIGNIFICANTE DE PORTAR UN FETO CON UN EL SINDROME DE DOWN. EL METODO COMPRENDE LA MEDIDA DE LOS NIVELES EN LA SANGRE DE LA MADRE QUE LA SUBUNIDAD BETA LIBRE DE GANADOTROPINA CORIONICA HUMANA. EL NIVEL DE LA SUBUNIDAD BETA LIBRE DE GANADOTROPINA CORIONICA HUMANA INDIVIDUALMENTE O CON OTROS MARCADORES PUEDE COMPARARSE CON DATOS DE REFERENCIA. TAMBIEN SE PRESENTA UN APARATO COMPUTERIZADO PARA EFECTUAR LA DETERMINACION, USANDO PREFERIBLEMENTE UNA FUNCION DE DENSIDAD DE PROBABILIDAD GENERADA A PARTIR DE UN CONJUNTO DE DATOS DE REFERENCIA MEDIANTE UN PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DISCRIMINANTE LINEAL.
Description
Método para la averiguación del síndrome de
Down.
La presente invención se refiere a un método para
detectar el síndrome de Down fetal (Trisomía 21) durante la
averiguación prenatal. Este método se refiere también a otras
trisomías cromosómicas más raras pero detectables tales como
Trisomía 13 y Trisomía 18. Más particularmente, la presente
invención se refiere a un método para mejorar la eficiencia de la
detección en la averiguación del síndrome de Down por medición de
la cantidad de la subunidad beta libre de la gonadotropina
coriónica humana (hCG) en la sangre de las mujeres embarazadas.
El síndrome de Down, al que se hace referencia
también como Trisomía 21, es la causa congénita más común de retraso
mental grave. Generalmente, el síndrome de Down fetal se puede
determinar por un procedimiento de diagnóstico que incluye
amniocentesis y cariotipado. Sin embargo, este procedimiento de
diagnóstico es invasivo e implica riesgo para la mujer y para el
feto. La amniocentesis y el cariotipado no se realizan
rutinariamente durante todos los embarazos. En lugar de ello, se
pueden utilizar uno o más métodos de averiguación para determinar
cuándo el riesgo para el embarazo garantiza el riesgo de someterse
a un procedimiento de diagnóstico invasivo.
La incidencia del síndrome de Down aumenta
significativamente con la edad materna creciente. Históricamente, la
investigación prenatal para el síndrome de Down se ha enfocado
sobre mujeres embarazadas de 35 años y edades superiores, a cuyas
edades los riesgos de síndrome de Down se aproximan o superan los
riesgos de los procedimientos de diagnóstico utilizados para
detectar el síndrome de Down fetal. Por consiguiente, el método
estándar de averiguación prenatal ha implicado seleccionar mujeres
para amniocentesis diagnóstica sobre la base de la edad materna. La
edad, sin embargo, es un criterio de averiguación inadecuado en el
sentido de que sólo aproximadamente el 20% de todos los embarazos
con síndrome de Down pueden detectarse por realización de
amniocentesis y cariotipado en el 5% de las mujeres embarazadas que
presentan mayor riesgo, es decir, aquéllas de una edad de 35 años o
superior. Y, dado que en la práctica clínica actual sólo
aproximadamente la mitad de las mujeres de edad 35 años o superior
se someten a amniocentesis y cariotipado, menos del 10% de los
embarazos con síndrome de Down se detectan antes del nacimiento.
En 1984 se descubrió una asociación entre niveles
reducidos de \alpha-fetoproteína (AFP) en la
sangre materna y síndrome de Down fetal Por ejemplo, véase "An
association between low maternal serum
\alpha-fetoprotein and fetal chromosomal
abnormalities"; Merkatz, Macri, et al.; Am. J. Obstet.
Gynecol. 148:886, 1984; cuya descripción se incorpora en esta
memoria como anterioridad. En esta publicación, se indicó que otras
trisomías cromosómicas, en particular la Trisomía 13 y la Trisomía
18, estaban asociadas también con niveles reducidos de AFP en la
sangre materna. La incidencia de estas trisomías cromosómicas
adicionales (1 en 5000 embarazos y 1 en 6600 embarazos,
respectivamente) es significativamente menor que el riesgo general
asociado a priori con la Trisomía 21 (síndrome de Down). Sin
embargo, debido a la asociación de estas otras trisomías
cromosómicas con los niveles reducidos de MSAFP, tales
anormalidades se detectarán también en un protocolo de averiguación
que utilice AFP de sangre materna y la subunidad \beta libre de
hCG y posiblemente marcadores adicionales descritos en esta
memoria. Es evidente para los expertos en la técnica que en la
utilización del protocolo descrito en esta memoria para la Trisomía
21, se puede conseguir también la detección de las Trisomías 13 y
18. La asociación entre niveles de AFP reducidos en sangre materna
y síndrome de Down fetal ofreció la oportunidad de utilizar un
ensayo de averiguación en sangre no invasivo en la detección de
casos de síndrome de Down en familias jóvenes, aparentemente no
afectadas en las que se presentan aproximadamente el 80% de los
casos de síndrome de Down. Se estima que el uso de un ensayo de
averiguación basado en AFP bajo en sangre materna (como marcador de
averiguación) conduciría a la detección prenatal de aproximadamente
el 20% de todos los casos de síndrome de Down fetal.
Otro método para averiguación implica medir el
nivel de estriol no conjugado (UE) en sangre materna. Por ejemplo,
véase "Maternal blood screening for Down syndrome in early
pregnancy"; Wald, et al., British Journal of Obstetrics
and Gynecology (BMJ), volumen 95, abril de 1988, cuya descripción se
incorpora en esta memoria como anterioridad. La medición de UE
proporciona, sin embargo, una base pobre para la averiguación. Más
recientemente se ha descubierto una asociación entre niveles
elevados de hCG en sangre materna, niveles elevados de la subunidad
alfa de hCG (hCG se compone de dos subunidades, denominadas de aquí
en adelante \alpha-hCG y
\beta-hCG respectivamente), y el síndrome de Down
fetal. Por ejemplo, véase "Abnormal Maternal Serum Chorionic
Gonadotropin Levels in Pregnancies with Fetal Chromosome
Abnormalities"; Bogart, Pandian y Jones; Prenatal Diagnosis,
Vol. 7, 623-630 (1987) cuya descripción se incorpora
en este documento como anterioridad. En el artículo de Bogart, se
estima que el uso de niveles elevados de hCG en sangre materna y
niveles elevados de la subunidad alfa de hCG en sangre materna,
detectaría aproximadamente el 68% de los fetos cromosómicamente
anormales. Sin embargo, estos resultados se obtuvieron a partir de
un estudio sobre embarazos a las 18-25 semanas de
gestación y los casos afectados parecen ser de mujeres
identificadas previamente como mujeres con riesgo de síndrome de
Down.
Generalmente, como se ha sugerido arriba, la
averiguación por evaluación de hCG en sangre materna ha implicado
solamente la medición de hCG en general y adicionalmente la medición
de \alpha-hCG. Aunque estos métodos de
averiguación detectan realmente el síndrome de Down fetal, existe
necesidad y deseo de un método que detecte un mayor porcentaje de
casos de síndrome de Down fetal.
El documento
JP-A-54-126.723
describe la preparación de anticuerpos específicos de hCG y
anticuerpos específicos anti-subunidad \beta
hCG.
Se ha descubierto ahora una asociación
previamente desconocida entre niveles elevados de
\beta-hCG libre en sangre materna y síndrome de
Down fetal. Se ha descubierto también una asociación previamente
desconocida entre el nivel en sangre materna de
\beta-hCG libre y el nivel en sangre materna de
AFP y el síndrome de Down fetal. Adicionalmente se ha descubierto
una asociación previamente desconocida entre la relación del nivel
en sangre materna de \beta-hCG libre al nivel en
sangre materna de la molécula de hCG intacta y el síndrome de Down
fetal. Todavía adicionalmente, se ha descubierto que la utilización
de una técnica de análisis de discriminante y multivariante aumenta
la eficiencia de detección de un método de averiguación que utiliza
el nivel en sangre materna de \beta-hCG libre, o
el nivel en sangre materna de \beta-hCG libre y el
nivel en sangre materna de AFP, o el logaritmo de cualquiera de
ellos, o el logaritmo de ambos, especialmente cuando la edad de
gestación se incorpora también como variable en la técnica de
análisis de discriminante, para un nivel de corte de riesgo
seleccionado. La edad de gestación se refiere a la edad del feto de
la mujer embarazada. La eficiencia de detección se refiere al
porcentaje de casos de síndrome de Down fetal que se detectan
correctamente para un nivel de corte de riesgo seleccionado. El
nivel de corte de riesgo se explicará más completamente en una
sección posterior. El análisis de discriminante es un enfoque
generalmente conocido para análisis multivariante que implica la
separación de una población en dos o más grupos por una
averiguación de riesgo univariante. El análisis de discriminante se
describe también algunas veces como una vía de construcción de una
combinación lineal de variables independientes, reduciendo así el
problema de medición de diferencias de grupo a un problema
univariante. El análisis de discriminante puede realizarse también
cuando existe solamente una variable implicada en un problema. Una
exposición general del análisis de discriminante puede encontrarse
en Marketing Research; Churchill, G.A.; Dryden, 1976; capítulo 15,
páginas 530-543, cuya descripción se incorpora en
este documento como anterioridad. Se ha descubierto que, sometiendo
los niveles en sangre materna de \beta-hCG libre,
los niveles en sangre materna de hCG intacta, la relación del nivel
en sangre materna de \beta-hCG libre al nivel en
sangre materna de la molécula de hCG intacta, el nivel en sangre
materna de AFP, el nivel en sangre materna de UE, y la edad de
gestación a análisis de discriminante multivariante se detecta un
mayor porcentaje, con una tasa de resultados positivos falsos más
baja, de casos de síndrome de Down fetal que por cualquier otro
método de averiguación conocido para la detección prenatal del
síndrome de Down. Se ha descubierto, adicionalmente, que un número
todavía mayor de los casos de síndrome de Down fetal puede
detectarse empleando solamente las mediciones de los niveles en
sangre materna de \beta-hCG libre y los niveles
en sangre materna de AFP y sometiendo el logaritmo de cada medición
y la edad de gestación a un análisis de discriminante
multivariante. Estos y otros descubrimientos se explicarán más
completamente en la sección Sumario de la Invención y la sección
Descripción Detallada de la Invención.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método y procedimiento para evaluar el síndrome de
Down fetal que detecta un mayor porcentaje de casos de síndrome de
Down fetal con una tasa de resultados positivos falsos dada que
otros métodos de averiguación prenatal conocidos.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método y procedimiento para averiguación del
síndrome de Down fetal que tiene una tasa menor de resultados
positivos falsos para un porcentaje de detección dado que otros
métodos conocidos.
Un objeto todavía adicional de la presente
invención es aplicar análisis de discriminante multivariante a
métodos para averiguación del síndrome de Down con objeto de
detectar un porcentaje mayor de casos de síndrome de Down fetal con
una tasa menor de resultados positivos falsos.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un método y procedimiento para averiguación del
síndrome de Down fetal por medición del nivel de
\beta-hCG libre en sangre materna.
Un objeto todavía adicional de la presente
invención es proporcionar un método y procedimiento para
averiguación del síndrome de Down fetal por medición del nivel en
sangre materna de AFP y el nivel en sangre materna de
\beta-hCG libre.
Otros objetos y ventajas de la presente invención
resultarán evidentes en la descripción siguiente de la
invención.
Para conseguir estos y otros objetos, de acuerdo
con la presente invención, se miden los niveles en el suero materno
de una mujer embarazada (en lo sucesivo la paciente) de
\beta-hCG libre por métodos inmunológicos
convencionales que pueden incluir técnicas de
inmuno-ensayo tales como aquéllas a las que se ha
hecho referencia en los documentos anteriores, y otros métodos
conocidos en la técnica. El nivel de \beta-hCG
libre se compara luego con un conjunto de datos de referencia para
determinar el riesgo de la paciente de ser portadora de un feto con
síndrome de Down. Para mejorar la eficiencia de detección, el nivel
de \beta-hCG libre y la edad de gestación pueden
compararse con una serie de datos de referencia. Para mejorar
adicionalmente la eficiencia de la detección, se miden los niveles
en sangre materna de una paciente de \beta-hCG
libre y AFP (a los que se hace referencia como "marcadores")
por métodos inmunológicos convencionales, que incluyen métodos de
ensayo conocidos en la técnica tales como aquéllos a los que se ha
hecho referencia en los documentos citados anteriormente. Los
niveles de cada marcador se comparan luego con una serie de datos
de referencia para determinar el riesgo de la paciente de ser
portadora de un feto con síndrome de Down. Se utiliza un método de
análisis de discriminante multivariante para comparar los niveles
de los marcadores con una serie de datos de referencia. Más
particularmente, se calcula luego un riesgo específico para la
paciente utilizando la regla de Bayes, el riesgo a priori de
la paciente, y las frecuencias relativas para embarazos no
afectados y afectados que se determinan por incorporación del
logaritmo de los niveles cuantitativos en la paciente de cada
marcador en las funciones de densidad de probabilidad para los
datos de referencia desarrollados utilizando análisis de
discriminante multivariante. Si el riesgo de la paciente de ser
portadora de un feto con síndrome de Down es mayor que un nivel de
corte de riesgo dado, la paciente debe ser aconsejada acerca de
ensayos de diagnóstico adicionales para confirmar la presencia del
síndrome de Down. La incorporación de la edad de gestación como un
marcador junto con el nivel de \beta-hCG libre y
el nivel en sangre materna de AFP aumentará adicionalmente la
eficiencia de la detección. Dado que los niveles en sangre materna
de \beta-hCG libre y el nivel en sangre materna de
AFP para cierto número de muestras tienden a distribuirse de
acuerdo con una curva de distribución
logarítmico-gaussiana, la eficiencia de detección
máxima puede alcanzarse incorporando el logaritmo de los niveles
cuantitativos en la paciente de cada marcador y la edad de
gestación en las funciones de densidad de probabilidad para los
datos de referencia desarrollados utilizando análisis de
discriminante multivariante.
Una ventaja del método y procedimiento de la
presente invención es que el mismo predice correctamente un
porcentaje mayor de casos de síndrome de Down fetal, con una tasa
de resultados positivos falsos menor que otros métodos y
procedimientos conocidos.
Otras ventajas de la presente invención
resultarán claras a partir de la descripción más detallada
siguiente y de los Ejemplos que siguen.
La Fig. 1 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra el nivel de significación de
marcadores inhibidores para la Trisomía 21.
La Fig. 2 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down de marcadores individuales.
La Fig. 3 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down de marcadores compuestos.
La Fig. 4 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la proporción de casos de
síndrome de Down por encima de percentiles dados de la distribución
de la subunidad \beta libre de hCG en embarazos no afectados.
La Fig. 5 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down de marcadores individuales.
La Fig. 6 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down del logaritmo de AFP y el
logaritmo de la subunidad \beta libre de hCG como un marcador
compuesto para intervalos de edad de gestación diferentes.
La Fig. 7 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 2, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down proyectada de AFP,
\beta-hCG libre y edad materna a través de los
Estados Unidos.
La Fig. 8, a la que se hace referencia en el
Ejemplo 2, muestra los niveles de subunidad \beta libre de hCG en
casos de Trisomía 21 en relación a diversos percentiles de los
embarazos no afectados.
La Fig. 9, a la que se hace referencia en el
Ejemplo 2, muestra las distribuciones de los niveles de la
subunidad \beta libre de hCG.
La Fig. 10 es una tabla, a la que se hace
referencia en el Ejemplo 3, que muestra la eficiencia de
averiguación del síndrome de Down para una diversidad de
combinaciones de marcadores.
La Fig. 11 muestra el aparato de la presente
invención utilizado en la realización del método para detección del
síndrome de Down.
Las Figs. 12 y 13 muestran un diagrama de flujo
para un programa de ordenador utilizado para el cálculo de
parámetros de referencia para uso en asociación con la
determinación del riesgo específico de una paciente de ser portadora
de un feto afectado.
La Fig. 14 muestra un diagrama de flujo para un
programa de ordenador que utiliza los parámetros de referencia
calculados en el programa mostrado en las Figs. 12 y 13 para
determinar el riesgo específico de una paciente de ser portadora de
un feto afectado.
En una realización de la presente invención, se
toma una muestra de sangre materna de una paciente. El nivel en
sangre materna de \beta-hCG libre se mide luego
por métodos analíticos convencionales, tales como métodos
inmunológicos conocidos en la técnica. El nivel en sangre materna
de \beta-hCG libre se compara luego con una serie
de datos de referencia para determinar si la paciente corre un
riesgo incrementado de ser portadora de un feto con síndrome de
Down. Para aumentar la eficiencia de la detección, se pueden
comparar la edad de gestación y el nivel en sangre materna de
\beta-hCG libre con una serie de datos de
referencia para determinar si la paciente corre un riesgo aumentado
de ser portadora de un feto con síndrome de Down.
Aunque cualquiera de los métodos analíticos
conocidos para medir el nivel en sangre materna de
\beta-hCG libre funcionará en la presente
invención, como es evidente para los expertos en la técnica, el
método analítico utilizado para \beta-hCG libre
tiene que ser el mismo método utilizado para generar los datos de
referencia para \beta-hCG libre. Si se utiliza un
método analítico nuevo para \beta-hCG libre,
tiene que generarse una nueva serie de datos de referencia, basada
en datos desarrollados con el método.
Se entiende también generalmente que en la
generación de anticuerpos monoclonales específicos para la cadena
\beta de hCG, algunos anticuerpos serán específicos para la
proteína y algunos serán específicos para sitios antigénicos
asociados con carbohidratos. La medición del nivel de
\beta-hCG libre al que se hace referencia a lo
largo de la descripción de la invención incluye la utilización de
anticuerpos específicos para la proteína o los sitios antigénicos
asociados con carbohidratos o cualquier otro sitio de
\beta-hCG libre.
Se entenderá adicionalmente por quienes posean
una experiencia ordinaria en la técnica, que mientras que la
subunidad \alpha libre de hCG es codificada por un solo gen, la
subunidad \beta libre es codificada por una familia compleja de
al menos siete genes o pseudogenes muy similares. Por ejemplo, véase
"Human chorionic gonadotropin \beta-subunit is
encoded by at least eight genes arranged in tandem and inverted
pairs", Boorstein, Vamvakopoules, & Fiddes; Nature, Vol 300,
2 de Diciembre de 1982; cuya doctrina se incorpora aquí como
anterioridad. Es sabido que solamente tres de los siete genes de
\beta-hCG libre se expresan en la producción
placentaria normal de \beta-hCG libre. Por
ejemplo, véase "Fragmentation of the
\beta-Subunit of Human Chorionic Gonadotropin
Produced by Choriocarcinoma"; Nishimura, Ide, Ubsunomiya,
Kitajima, Yuki, y Mochizuki; Endocrinology, vol. 123, No. 1, 1988;
cuyas doctrinas se incorporan aquí como anterioridad. No se ha
determinado si estos tres mismos genes se expresan en estados de
enfermedad, tales como durante la presencia del síndrome de Down
fetal. Es, por consiguiente, posible que puedan sintetizarse formas
múltiples de \beta-hCG libre con pequeñas
diferencias en secuencias de aminoácidos, u otras diferencias
pequeñas. Asimismo, es posible que en el síndrome de Down se
expresen uno o más de los genes de \beta-hCG
libre, produciendo de este modo una sola o varias variantes de
\beta-hCG libre. De acuerdo con la presente
invención, estas variantes, si existen, se miden por técnicas
inmunológicas convencionales para medir \beta-hCG
libre. Un ensayo puesto a punto para medir la variante, o
variantes, de \beta-hCG libre
específica(s), asociadas con el síndrome de Down, si existen,
puede dar como resultado un aumento aún mayor de la eficiencia de
detección.
Se han utilizado eficazmente técnicas de ensayo
con anticuerpos monoclonales para medir la subunidad \beta libre
de hCG con objeto de distinguir entre embarazos afectados y no
afectados por la Trisomía 21. Se ha alcanzado una eficiencia de
detección para la Trisomía 21 tan alta como 83%. Como es bien
sabido por los expertos en la técnica, el uso de anticuerpos para
cuantificar analitos específicos puede dar como resultado grados de
reactividad cruzada con una sustancia distinta pero similar. Por
consiguiente, la distinción entre casos afectados y no afectados
puede ser debida a la presencia de una forma distinta de la
subunidad \beta libre de hCG que esté siendo detectada debido a
cierto grado de reactividad cruzada con los anticuerpos que se
utilizan. Si se identifica una forma aberrante de este tipo de la
subunidad \beta libre de hCG, la misma puede designarse como una
nueva sustancia bioquímica. De hecho, la información procedente de
la bibliografía científica indica que se han reconocido formas
aberrantes de \beta-hCG (por ejemplo, véase
Nishimura et al. citado más adelante).
Los casos afectados por la Trisomía 21 pueden
caracterizarse también por una forma aberrante de la subunidad
\beta libre de hCG. Si la Trisomía 21 se caracteriza por la
producción de una forma aberrante de la subunidad \beta libre de
hCG, los expertos en la técnica podrán desarrollar anticuerpos
específicos para tales formas aberrantes que pueden dar como
resultado un aumento adicional de la eficiencia de detección para
este síndrome.
Los datos de referencia reflejan el nivel en
sangre materna de \beta-hCG libre para mujeres
embarazadas que son portadoras de fetos con síndrome de Down (a las
que se hace referencia también como "afectadas") y/o el nivel
en sangre materna de \beta-hCG libre para mujeres
embarazadas que son portadoras de fetos normales (a las que se hace
referencia también como "no afectadas"). Como será comprendido
generalmente por quienes posean experiencia en la técnica, los
métodos para averiguación del síndrome de Down fetal son
procedimientos de toma de decisión por comparación. Para cualquier
procedimiento de toma de decisión, son necesarios valores de
referencia basados en pacientes que tengan la enfermedad o
condición de interés y/o pacientes que no tengan la enfermedad o
condición de interés. En la presente invención, los valores de
referencia son el nivel en sangre materna del marcador o marcadores
medidos, por ejemplo, \beta-hCG libre, tanto en
mujeres embarazadas que son portadoras de fetos con síndrome de
Down como en mujeres embarazadas que son portadoras de fetos
normales. Se establece una serie de datos de referencia recogiendo
los valores de referencia para varias muestras. Como será evidente
para quienes posean experiencia en la técnica, la serie de datos de
referencia mejorará incluyendo números crecientes de valores de
referencia.
Para determinar si la paciente corre un riesgo
incrementado de ser portadora de un feto con síndrome de Down, tiene
que establecerse un punto de corte. Es evidente para los expertos
en la técnica que un punto de corte establecido para determinar si
una paciente corre un riesgo incrementado de ser portadora de un
feto con Trisomía 13 o Trisomía 18 puede ser eficaz también para
identificar casos de Trisomía 21. Este punto de corte puede ser
establecido por el laboratorio, el médico o en una base de casos
individuales por cada paciente. El nivel del punto de corte puede
basarse en varios criterios que incluyen el número de mujeres que
se someterían a ensayos de diagnóstico invasivo ulteriores, el
riesgo medio de ser portadora de un feto con síndrome de Down de
todas las mujeres que se someten a ensayos de diagnóstico invasivo
ulteriores, una decisión que cualquier mujer cuyo riesgo específico
como paciente es mayor que un cierto nivel de riesgo tal como 1 en
400 debería tener en cuenta para ensayos de diagnóstico invasivo
adicionales u otros criterios conocidos por los expertos en la
técnica. El nivel de punto de corte podría establecerse utilizando
varios métodos, con inclusión de: percentiles, valores medios más o
menos la desviación o desviaciones estándar; múltiplos del valor
medio; riesgo específico de la paciente u otros métodos conocidos
por quienes posean experiencia en la técnica.
En otra realización de la presente invención, que
da como resultado una detección de un mayor número de los casos de
síndrome de Down fetal, se toma una muestra de sangre materna de
una paciente. Los niveles en la sangre materna de la molécula de
hCG intacta, \beta-hCG libre, UE y AFP
(denominados en lo sucesivo "marcadores") se miden luego por
métodos analíticos convencionales, tales como métodos inmunológicos
conocidos en la técnica. Aunque cualquiera de los métodos
analíticos conocidos para medir los niveles en sangre materna de
estos marcadores funcionará en la presente invención, como es
evidente para los expertos en la técnica, el método analítico
utilizado para cada marcador tiene que ser el mismo método empleado
para generar los datos de referencia para el marcador particular.
Si se utiliza un método analítico nuevo para un marcador
particular, tendrá que generarse una nueva serie de datos de
referencia, basada en datos desarrollados con el método.
Un riesgo específico de que una paciente albergue
un feto con el síndrome de Down se calcula luego utilizado la regla
de Bayes, el riesgo a priori de la paciente, y las
frecuencias relativas para embarazos no afectados y afectados que
se determinan por incorporación de los niveles cuantitativos de cada
marcador (la molécula de hCG intacta, \beta-hCG
libre, UE y AFP) en la paciente y la relación de
\beta-hCG libre al nivel de la molécula de hCG
intacta, junto con la edad de gestación de la paciente, en las
funciones de densidad de probabilidad desarrolladas para los datos
de referencia utilizando análisis de discriminante multivariante.
El análisis de discriminante multivariante se puede llevar a cabo
con arreglo al paquete estadístico del programa de ordenador
comercialmente asequible Statistical Analysis System (fabricado y
vendido por SAS Institute Inc.) o por otros métodos de análisis
estadístico multivariante u otros paquetes de equipo lógico
estadístico conocidos por los expertos en la técnica.
La función de densidad de probabilidad
proporciona un método para comparar el nivel de cada marcador en la
paciente con una serie de datos de referencia. Un tipo de función
de densidad de probabilidad se indica a continuación, aunque, como
será evidente para los expertos en la técnica, otras funciones de
densidad de probabilidad se comportarán análogamente, y por
consiguiente se comportarán adecuadamente en la presente
invención.
Fórmula para Riesgo de Síndrome de Down:
El subíndice "a" se refiere a los casos
afectados.
El subíndice "u" se refiere a los casos no
afectados.
(X-M) es un vector en el que cada
elemento es el nivel de cada variable menos el valor medio de la
variable.
cov^{-1} es la inversa de la matriz de
covarianza agrupada de los valores afectados y no afectados de la
totalidad de las variables en el modelo; (X-M) es la
transpuesta del vector (X-M).
EXP se refiere a la función exponencial.
|COV| se refiere al determinante de la matriz de
covarianza de todas las variables en el modelo para los datos de
referencia.
Como es evidente para los expertos en la técnica,
pueden emplearse matrices de covarianza individuales para embarazos
no afectados y afectados en sustitución de la matriz de covarianza
agrupada. La fórmula para el Riesgo del Síndrome de Down pasaría a
ser entonces:
|COV| se refiere al determinante de la matriz de
covarianza de todas las variables en el modelo para los datos de
referencia.
Para los fines del análisis de discriminante, se
hace una suposición en cuanto a la probabilidad previa del síndrome
de Down en la población no seleccionada general.
Generalmente, la probabilidad previa es
aproximadamente 1 en 800. Para el análisis de discriminante
multivariante se toma la decisión en cuanto a qué nivel de punto de
corte de riesgo constituye un resultado de ensayo positivo. Por
ejemplo, si es deseable realizar ensayos de diagnóstico ulteriores
en una mujer embarazada que tiene una posibilidad de 1 en 400 o
mayor de ser portadora de un feto con síndrome de Down, entonces,
cuando los resultados del análisis de discriminante indican que una
mujer embarazada tiene una posibilidad de 1 en 400 o mayor de ser
portadora de un feto con síndrome de Down, se considera que la
mujer embarazada tiene un resultado de ensayo positivo. Si se indica
un resultado de ensayo positivo, la paciente debe ser aconsejada en
cuanto a ensayos de diagnóstico adicionales para confirmar la
presencia del síndrome de Down.
Con referencia a las Figs. 11-14,
se muestran el aparato y un esquema de flujo para un programa de
ordenador con objeto de calcular los parámetros de referencia y el
riesgo específico.
Como se muestra en la Fig. 11, la edad de
gestación GA, el nivel de AFP y el nivel de
\beta-hCG libre se determinan por técnicas
convencionales a partir de embarazos afectados y no afectados con
objeto de desarrollar datos de referencia. Se elige un número
grande de muestras para aumentar la fiabilidad. Las mediciones para
el desarrollo de parámetros de referencia se indican
esquemáticamente en 10.
Una vez que se han calculado los parámetros de
referencia 22 por la unidad de proceso 20 después de su acceso por
la vía de un dispositivo de entrada adecuado 15, se puede calcular
el riesgo específico 25 para una paciente particular sobre la base
de los valores de los marcadores medidos específicos de la persona,
indicados en 30.
El programa para determinar los parámetros de
referencia se muestra en las Figs. 12 y 13, y el programa para
calcular el riesgo específico se muestra en la Fig. 14.
Haciendo ahora referencia a las Figs. 12 y 13, en
una primera vuelta 100, el programa lee en los datos de
identificación ID, la edad de gestación GA, cantidades de AFP y
\beta-hCG libre y un CODIGO que indica si el
embarazo está afectado o no afectado por la Trisomía 21 a partir de
un grupo de referencia con objeto de desarrollar datos de
referencia. Esto se muestra en la etapa 102. En el esquema de
flujo, la edad de gestación GA se designa por la variable X_{1},
el logaritmo de AFP está dado por la variable X_{2} y el
logaritmo de \beta libre está dado por X_{3}, como se muestra
en la etapa 104. Las matrices de suma y
suma-producto se determinan luego o se calculan como
se muestra en la etapa 106 basándose en las cantidades X_{1},
X_{2} y X_{3}. Se incrementa luego la variable N_{CÓDIGO}
que cuenta el número de casos afectados y no afectados en el grupo
de referencia. Una vez que ha terminado la vuelta, como se muestra
por la línea de flujo 110, se calculan entonces los valores medios
a partir de una serie de vueltas definidas por las cantidades I, J
y K como se indica por el número de referencia 112. En estas
vueltas, se calcula de matriz de covarianza utilizando la matriz de
suma definida en la vuelta 100 y la matriz de
suma-producto calculada en la vuelta 100. Después
de estas vueltas, se hace una elección en cuanto a si se agrupan o
no se agrupan las matrices de covarianza para los casos afectados y
no afectados. Esta elección se introduce en las etapas 114, 116 y
118. Si la elección es agrupar, las covarianzas se agrupan para
formar una matriz de covarianza agrupada como viene dado por la
etapa 120, se invierte la matriz de covarianza agrupada dando como
resultado la matriz de covarianza agrupada invertida IPCM que se
muestra en 122, y los valores medios y la matriz de covarianza
agrupada invertida se salvan en un fichero y se imprimen en las
etapas 124 y 126. Si la elección es no agrupar las matrices de
covarianza, entonces cada una de las dos matrices de covarianza se
invierte en las etapas 123 y 125 y los valores medios y las
matrices de covarianza invertidas se salvan en un fichero y se
imprimen en las etapas 125 y 127. Estas cantidades comprenden los
parámetros de referencia para el cálculo del riesgo de una persona
específica de ser portadora de un feto afectado.
Con referencia a la Fig. 14, los parámetros de
referencia determinados durante la ejecución del programa mostrado
en las Figs. 12 y 13, los parámetros de referencia que comprenden
los valores medios y la matriz de covarianza agrupada invertida, se
leen como se muestra en 130. El registro de la paciente específica,
con inclusión de la identificación de la paciente, la edad de
gestación GA, AFP y \beta-hCG libre se leen luego
como se muestra en 132. La edad de gestación se calcula después más
específicamente en 134, y se hace un cálculo de la edad materna en
136. En 138, se determina el riesgo previo sobre la base de la edad
materna y los datos de incidencia. En los ejemplos que se exponen
más adelante, el resultado de este cálculo es el factor 1/800, un
número típico.
En 140, se determina el riesgo previo
multiplicado por la frecuencia relativa de ser portadora de un feto
afectado (ABT), que es el numerador de las ecuaciones (1) o (2)
expuestas anteriormente. En 142, se determina la frecuencia relativa
de ser portadora de un feto no afectado multiplicada por (1 -
riesgo previo), (NT), que es el segundo factor en el denominador de
las ecuaciones (1) o (2) arriba expuestas. En 144, se determina el
riesgo específico utilizando la regla de Bayes, es decir, ABN =
ABT/(ABT + NT). (Ecuaciones (1) y (2)). En 146, se imprimen los
resultados, es decir, el riesgo específico de la paciente ABN y el
número de identificación de la paciente.
Como será evidente para una persona con
experiencia en la técnica, se pueden utilizar también para calcular
los parámetros de referencia otras técnicas estadísticas y
matemáticas, distintas de un procedimiento de análisis de
discriminante lineal.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, se toma una muestra de sangre materna de una
paciente. Los niveles en sangre materna de
\beta-hCG libre y AFP (denominados en lo sucesivo
"marcadores") se miden luego por métodos analíticos
convencionales, con inclusión de métodos inmunológicos conocidos en
la técnica. Aunque cualquiera de los métodos analíticos conocidos
para medir los niveles en sangre materna de estos marcadores
funcionará adecuadamente en la presente invención, como es evidente
para un experto en la técnica, el método analítico utilizado para
cada marcador tiene que ser el mismo método empleado para generar
los datos de referencia para el marcador particular. Si se utiliza
un método analítico nuevo para un marcador particular, tendrá que
generarse una nueva serie de datos de referencia, basada en datos
desarrollados con el método.
El riesgo específico de una paciente de ser
portadora de un feto con síndrome de Down se calcula luego
utilizando la regla de Bayes, el riesgo a priori de la
paciente, y las frecuencias relativas para embarazos no afectados y
afectados que se determinan por incorporación de los niveles
cuantitativos en la paciente de cada marcador junto con la edad de
gestación de la paciente, en las funciones de densidad de
probabilidad desarrolladas para los datos de referencia empleando
análisis de discriminante multivariante. Para aumentar
adicionalmente la eficiencia de la detección, el logaritmo de los
niveles cuantitativos en la paciente de \beta-hCG
libre y AFP, junto con la edad de gestación de la paciente, se
incorporan en las funciones de densidad de probabilidad
desarrolladas para los datos de referencia utilizando análisis de
discriminante multivariante. El análisis de discriminante
multivariante se puede llevar a cabo con el paquete estadístico del
programa de ordenador comercialmente asequible
Sta-tistical Analysis System (fabricado y vendido
por SAS Institute Inc.) o por otros métodos de análisis estadístico
multivariante u otros paquetes de equipo lógico estadístico
conocidos por los expertos en la técnica.
Para los fines del análisis de discriminante, se
hace una suposición en cuanto a la probabilidad previa de síndrome
de Down en la población general no seleccionada. Generalmente, la
probabilidad previa es aproximadamente 1 en 800. Para el análisis
de discriminante multivariante se toma la decisión en cuanto a qué
nivel de punto de corte de riesgo constituye un resultado de ensayo
positivo. Por ejemplo, si es deseable realizar ensayos de
diagnóstico ulteriores en una mujer embarazada que tiene una
posibilidad de 1 en 400 o mayor de ser portadora de un feto con
síndrome de Down, entonces, cuando los resultados del análisis de
discriminante indican que una mujer embarazada tiene una posibilidad
de 1 en 400 o mayor de ser portadora de un feto con síndrome de
Down, se considera que la mujer embarazada tiene un resultado de
ensayo positivo. Si se indica un resultado de ensayo positivo, la
paciente debe ser aconsejada en cuanto a ensayos de diagnóstico
adicionales para confirmar la presencia del síndrome de Down.
Como es evidente para los expertos en la técnica,
en cualquiera de las realizaciones arriba expuestas, el cambio del
nivel de punto de corte de riesgo de un valor positivo o la
utilización de riesgos diferentes a priori que puedan
aplicarse a subgrupos diferentes de la población, podrían cambiar
los resultados del análisis de discriminante para cada
paciente.
La presente invención no se limita a las
realizaciones arriba expuestas, sino que más bien incluye la
totalidad de las realizaciones posibles y combinaciones de
marcadores descritos en los Ejemplos siguientes.
Se utilizaron más de 400 muestras de pacientes
para estudiar la relación del síndrome de Down fetal con los niveles
en sangre materna de \beta-hCG libre en asociación
con AFP en suero materno (MSAFP), UE, y hCG intacta. Estas muestras
incluían 25 muestras de sangre materna de mujeres embarazadas que se
sabía eran portadoras de fetos con síndrome de Down y muestras
testigo adaptadas a los casos afectados.
Para cada muestra de sangre, se determinaron los
niveles cuantitativos de AFP, la molécula de hCG intacta,
\beta-hCG libre, y UE (cada uno de los cuales se
denomina en lo sucesivo "marcador"), por las técnicas de ensayo
siguientes:
| Marcador | Técnica de ensayo |
| MSAFP | Ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) |
| UE | Radioinmunoensayo |
| hCG intacta | ELISA tipo perla |
| \beta-hCG libre | ELISA |
El nivel de cada marcador se convirtió en una
variable en el procedimiento de discriminante escalonado y el
procedimiento de discriminante lineal en el paquete estadístico de
equipo lógico de ordenador asequible comercialmente Statistical
Analysis System (SAS Institute Inc.) para generar una serie de datos
de referencia. La relación de \beta-hCG libre a
la molécula de hCG intacta y la edad de gestación de la paciente se
incorporaron también como variables. El procedimiento de
discriminante escalonado determinó que la totalidad de las
variables podían incorporarse en el procedimiento de discriminante
lineal. Se llevó a cabo luego el procedimiento de discriminante
lineal sobre cada variable por separado y sobre combinaciones
diferentes de variables. Los resultados de estos análisis de
discriminante se resumen en el cuadro siguiente. La sensibilidad es
el porcentaje de casos de síndrome de Down fetal que muestran un
resultado de ensayo positivo. Los resultados positivos falsos son el
porcentaje de fetos normales que dan un resultado de ensayo
positivo.
| Variable | Sensibilidad | Positivos falsos |
| MSAFP | 15,4% | 4,2% |
| UE | 15,4% | 2,8% |
| hCG intacta | 37% | 8,6% |
| MSAFP, UE, hCG intacta | 50,0% | 7,2% |
| \beta-hCG libre + hCG intacta | 60,0% | 8,5% |
| Proporción de composición % peso | 76% | 5,3% |
| UE de la composición % peso | 76% | 5,3% |
| Composición | 80% | 4,3% |
| \beta-hCG libre de la composición % peso | 60,0% | 5,3% |
| * log hCG intacta + (log \beta-hCG libre + hCG intacta) | 68% | 7,6% |
| * log hCG intacta, log MSAFP + (log \beta-hCG libre + hCG intacta) | 88% | 7,4% |
| Composición = MSAFP + \beta-hCG libre + hCG intacta + UE + relación. Edad de gestación se incorpora junto | ||
| con cada variable. El nivel de punto de corte de riesgo variable = 1 en 400 excepto (*) que es 1 en 365. |
Como es evidente para un experto en la técnica,
el cambio del nivel de punto de corte de riesgo de un resultado
positivo, o el uso de riesgos diferentes a priori que pueden
aplicarse a subgrupos diferentes de la población, cambiará los
resultados del procedimientos discriminante para la paciente.
Se utilizaron más de 550 muestras de pacientes
para estudiar la relación del síndrome de Down fetal con los niveles
en sangre materna de \beta-hCG libre.
Inicialmente se analizaron 29 muestras de mujeres embarazadas que se
sabía eran portadoras de fetos con síndrome de Down y 520 mujeres
no afectadas se emparejaron en cuanto a edad de gestación (la misma
semana), la edad materna (dentro de un intervalo de 3 años) y el
tiempo de almacenamiento en el frigorífico (dentro de un mes).
Todas las muestras eran de mujeres aisladas embarazadas, de raza
blanca y no diabéticas.
Con objeto de evitar el sesgo de la serie de
aprendizaje en las estimaciones de la eficiencia de averiguación, se
utilizó el concepto de una serie de validación. Una serie de
validación es una serie de datos independiente de la serie de datos
de referencia. Los resultados de pacientes en la serie de
validación no se utilizan en el establecimiento de datos de
referencia. En lugar de ello, los resultados de pacientes en la
serie de validación se comparan con la serie de datos de referencia
para determinar la eficiencia de averiguación. Esta segunda serie
de validación estaba constituida por 26 casos adicionales
confirmados de Trisomía 21 (55 casos totales) y un grupo
seleccionado aleatoriamente de 159 muestras testigo. Las muestras
testigo se extrajeron análogamente de mujeres aisladas de raza
blanca, embarazadas y no diabéticas.
El estudio total consistió en 4388
determinaciones sobre 7 ensayos diferentes de los niveles en sangre
materna de los marcadores que se indican a continuación:
| Marcador | Ensayo |
| MSAFP | ELISA |
| hCG intacta | ELISA |
| hCG intacta + \beta-hCG libre | ELISA |
| \beta-hCG libre | RIA (radio-inmunoensayo) |
| \alpha-hCG libre | RIA |
| UE | 2 métodos, inmunoensayo enzimático y RIA |
| ELISA = ensayo de inmunosorbente unido a enzima |
El nivel de cada marcador se convirtió en una
variable en el procedimiento de discriminante escalonado y el
procedimiento de discriminante lineal en el paquete estadístico de
equipo lógico de ordenador asequible comercialmente Statistical
Analysis System (SAS Institute Inc.), para generar una serie de
datos de referencia. La edad de gestación se incorporó también como
variable. El procedimiento de discriminante lineal se llevó a cabo
luego sobre cada variable por separado y sobre combinaciones
diferentes de variables. Las pacientes se clasificaron como
afectadas o no afectadas sobre la base de un punto de corte de
riesgo de síndrome de Down de 1 en 365. Los casos no afectados que
se clasificaron como afectados se consideraron positivos falsos. El
riesgo de síndrome de Down de cada paciente se calculó utilizando
la regla de Bayes, las funciones de densidad de probabilidad
normales multivariante para los casos afectados y no afectados, y
un riesgo general a priori de 1 en 800. Se utilizó una
matriz de covarianza agrupada para cada función de densidad de
probabilidad.
Los resultados encontrados en las Tablas 1 a 3,
que se muestran en las Figs. 1-3, se refieren a la
serie de estudios inicial. Los resultados de las Tablas
5-7, Figs. 5-7, están basados en la
clasificación de pacientes en el ensayo de validación. La Tabla 4,
representada en la Fig. 4, y las Figs. 8 y 9 están basadas en la
serie de estudio inicial y en todos los casos afectados.
Los resultados procedentes de los procedimientos
de ensayo se analizaron para determinar si existían diferencias
significativas en los niveles de cada marcador entre los casos
afectados y no afectados. La Tabla 1 (Fig. 1) indica que los casos
afectados eran significativamente diferentes de los no afectados en
todos los aspectos excepto en U.E. Adicionalmente, la tasa de
resultados positivos falsos y la eficiencia de detección de cada
marcador se determinaron como se muestra en la Tabla 2 (Fig. 2). La
eficiencia de detección máxima se consiguió con un ensayo de hCG
que medía no sólo la molécula intacta sino también la subunidad
\beta libre. Una mejora adicional en la eficiencia de detección
se observó por combinación de marcadores individuales en marcadores
compuestos. El marcador compuesto que contenía el ensayo de hCG, que
medía no sólo la molécula hCG intacta sino también la subunidad
\beta libre de hCG, produjo la eficiencia de detección máxima
entre los marcadores compuestos como se muestra en la Tabla 3 (Fig.
3).
La averiguación de las subunidades \beta y
\alpha de hCG individualmente demostró que no existían en
absoluto diferencias significativas entre los casos afectados y no
afectados para la subunidad \alpha (p = 0,23), mientras que se
observó un aumento significativo en la subunidad \beta en los
casos afectados (p = 0,001). Como se sabe generalmente en la
técnica, p mide el grado de evidencia en estudios científicos por
indicación de la probabilidad de que un resultado al menos tan
extremo como el observado pudiera producirse por casualidad. Cuanto
menor es el valor p, tanto mayor es el grado de evidencia de que la
observación no es resultado de la casualidad.
La Fig. 8 muestra los percentiles 10º, 50º y 90º
de \beta-hCG libre por edad de gestación. Se
observa una tendencia descendente continuada por edad de gestación
en los embarazos no afectados. El análisis de los niveles de
\beta-hCG libre en casos de síndrome de Down
fetal, como se muestra en la Tabla 4 (Fig. 4), revela que el 86%
caen por encima de la mediana de los casos no afectados.
Los niveles de \beta-hCG libre
tanto en los casos afectados como no afectados se ajustan a una
distribución logarítmica gaussiana (p = 0,78 y 0,86). La Fig. 9
ilustra estas distribuciones. La Tabla 5 (Fig. 5) proporciona datos
de eficiencia de detección en la subunidad
\beta-hCG libre y la subunidad
\alpha-hCG libre individualmente. La elevada
eficiencia de detección de \beta-hCG libre se
muestra en la Tabla 5.
Una eficiencia de detección aún mayor se alcanzó
con un marcador compuesto de AFP y \beta-hCG
libre. Por incorporación del logaritmo del nivel de
\beta-hCG libre y el logaritmo del nivel de MSAFP
en el procedimiento de discriminante lineal sobre el paquete
estadístico de equipo lógico de ordenador comercialmente asequible
Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.), como se ha
descrito arriba, se alcanzó una eficiencia de detección superior
como se muestra en la tabla 6 (Fig. 6).
Podría alcanzarse también una eficiencia de
detección alta empleando el nivel de \beta-hCG
libre y el nivel de AFP, en oposición al logaritmo de cada uno de
ellos.
Un análisis ulterior de los datos indicó que
tanto AFP como \beta-hCG libre son independientes
de la edad materna (p = .8394 y .5214 utilizando ensayos
Kruskal-Wallis a través de cuatro grupos de edad
materna diferentes para AFP y \beta-hCG libre
respectivamente, (edades = 30, 31-35,
36-40, y 40). Adicionalmente, la correlación (r) de
los niveles de subunidad \beta libre de hCG y AFP no era
significativamente diferente de cero (r = 0,04, p = 0,39 y r =
-0,06, p = 0,81 para los casos no afectados y afectados
respectivamente).
La observación fundamental encontrada en los
datos del autor confirma el hecho de que la subunidad
\beta-hCG libre contribuye a la eficiencia de
detección máxima para el síndrome de Down. De hecho, el uso de un
ensayo que mida únicamente \beta-hCG libre
producía una eficiencia de detección y una tasa de resultados
positivos falsos de 65,4% y 5,2% respectivamente. Estos valores son
comparables a los consignados por otros autores que utilizaron una
combinación de tres ensayos. Así pues, como se ha indicado
anteriormente, la reducción del número de ensayos es una ventaja de
la presente invención.
Los descubrimientos del autor en cuanto a la
contribución de \beta-hCG libre están basados en
lo siguiente: (a) el contribuidor óptimo simple para la eficiencia
de detección del síndrome de Down fue un ensayo para
\beta-hCG libre, (b) un ensayo para la molécula
de hCG intacta produce tasas de detección sustancialmente
inferiores, (c) un ensayo que mide una combinación de la molécula
de hCG intacta y \beta-hCG libre produce una
eficiencia de detección mayor que un ensayo que mide la molécula de
hCG intacta sola.
Está establecido que el riesgo de síndrome de
Down fetal aumenta con la edad materna. Por esta razón, como se ha
descrito arriba, para producir riesgos específicos de paciente para
uso clínico de la presente invención se incorpora un riesgo a
priori específico de la edad materna en el procedimiento de
análisis de discriminante multivariante. Dado que tanto el nivel de
AFP como el de \beta-hCG libre son independientes
de la edad materna, el autor ha determinado sus propios datos para
ver cuántas mujeres no afectadas y afectadas arrojarían resultados
positivos dado un riesgo a priori para cada edad individual.
La información que antecede se utilizó para proyectar, sobre la
base de la distribución por edad materna de nacimientos vivos en
los Estados Unidos, los resultados positivos falsos y la tasa de
sensibilidad para averiguación de alcance nacional dentro de los
Estados Unidos. Como se muestra en la tabla 7 (Fig. 7) las
proyecciones indican que es posible alcanzar una tasa de detección
del 80%, con 5% de resultados positivos falsos.
Las muestras descritas en el Ejemplo 2 se
analizaron ulteriormente para descubrir la eficiencia de detección
de otras combinaciones de los marcadores. Más particularmente, el
procedimiento de discriminante lineal del Ejemplo 2, con el mismo
punto de corte de riesgo y un nivel de riesgo a priori, se
llevó a cabo sobre combinaciones diferentes de los marcadores,
múltiplos de la mediana (MOM) para el marcador y logaritmos de los
marcadores, y sin la incorporación de la edad de gestación. El
procedimiento de discriminante lineal se llevó a cabo utilizando
los datos de referencia y los datos de variación. Los resultados se
resumen en la Tabla 8 en la Fig. 10.
El Ejemplo siguiente ilustra la preparación de un
ensayo de \beta-hCG libre en una sola etapa y un
ensayo de \beta-hCG libre en dos etapas y su uso
en el método de la presente invención.
- 1.
- Una placa de microvaloración de 96 pocillos se reviste con un anticuerpo "de atrapamiento" que es específico para la subunidad \beta libre de la molécula de gonadroponina coriónica humana (hCG). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La concentración de anticuerpo utilizada para revestir la placa es 0,8 microgramos por pocillo, pero podría ser diferente en caso deseado. La placa se incuba a 4ºC durante al menos 16 horas.
- 2.
- La placa se lava con una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2 que contiene 0,05% de Tween 20. Pueden emplearse otros tampones de lavado adecuados. La placa se "bloquea" luego con una solución que contiene proteína animal hidrolizada al 3% y 0,05% de Tween 20 en una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2. Pueden utilizarse otras soluciones, familiares para los expertos en la técnica, tales como solución de sero-albúmina de bovino al 1%. Se añaden 300 microlitros de la solución de bloqueo a cada pocillo y la placa se deja incubar durante 1 hora a la temperatura ambiente. Son también viables otros procedimientos de bloqueo, p.ej. "vidriado".
- 3.
- Se lava a continuación la placa, como se ha descrito anteriormente, y se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene un anticuerpo biotinilado específico para la subunidad \beta libre de hCG. El tampón de ensayo utilizado es proteína animal hidrolizada al 3% y 0,05% de Tween 20 en una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2, pero puede ser cualquiera de varias soluciones adecuadas conocidas por los expertos en la técnica. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y, dependiendo de la preferencia del operador, puede estar conjugado a una sustancia distinta de la biotina, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. La concentración de anticuerpo en el tampón de ensayo puede ajustarse para obtener valores de absorbancia óptimos.
- 4.
- Se añaden luego 20 microlitros de muestra a cada pocillo. La muestra puede ser: tampón de ensayo, ejecutado como muestra en blanco para comprobar la eficiencia del ensayo; una solución de \beta-hCG libre utilizada para estandarizar los valores de muestras desconocidas; o una muestra de suero procedente de una mujer embarazada que se encuentra en el segundo trimestre. La placa se agita turbulentemente durante 30 segundos y se pone luego sobre un rotor a 200 rpm donde se incuba durante 30 minutos a la temperatura ambiente.
- 5.
- Se lava luego la placa como se ha descrito anteriormente. Se añaden después a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Esta etapa no es necesaria si el segundo anticuerpo utilizado está conjugado a una sustancia distinta de la biotina. La concentración de estreptavidina-peroxidasa en tampón de ensayo es 2,0 microgramos por mililitro. La placa se deja sobre un rotor a 200 rpm durante 5 minutos a la temperatura ambiente.
- 6.
- Se lava luego la placa como se ha descrito anteriormente. Se añaden a cada pocillo 100 microlitros de una solución de sustrato de o-fenilenodiamina. Esta solución de sustrato puede ser alternativamente uno cualquiera de varios tintes apropiados conocidos por los expertos en la técnica y depende de la sustancia que se conjugue con el segundo anticuerpo. La placa se pone sobre un rotor a 200 rpm y se incuba a la temperatura ambiente en la oscuridad durante 8 minutos.
- 7.
- Se añaden luego 100 microlitros de ácido sulfúrico diluido (1,0 N) a cada pocillo para parar la reacción del sustrato.
- 8.
- Se determina espectrofotométricamente la absorbancia de cada pocillo a 492 nm.
- 1.
- Se reviste una placa de microvaloración de 96 pocillos con un anticuerpo "de atrapamiento" que es específico para la subunidad \beta libre de la molécula de gonadotropina coriónica humana (hCG). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La concentración de anticuerpos utilizada para revestir la placa es 0,8 microgramos por pocillo, pero puede ser diferente, si se desea. La placa se incuba a 4ºC durante al menos 16 horas.
- 2.
- La placa se lava con una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2 que contiene 0,05% de Tween 20. Se pueden emplear otros tampones de lavado adecuados. La placa se "bloquea" luego con una solución que contiene proteína animal hidrolizada al 3% y 0,05% de Tween 20 en una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2. Pueden utilizarse otras soluciones, familiares para los expertos en la técnica, tales como una solución de sero-albúmina de bovino al 1%. Se añaden 300 microlitros de la solución de bloqueo a cada pocillo y se deja incubar la placa durante una hora a la temperatura ambiente. Se pueden emplear otros procedimientos de bloqueo, tales como "vidriado".
- 3.
- Se lava luego la placa, como se ha descrito anteriormente, y se añaden a cada pocillo 100 microlitros de un tampón de ensayo. El tampón de ensayo utilizado es proteína animal hidrolizada al 3% y 0,05% de Tween 20 en una solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2, pero puede ser cualquiera de varias soluciones adecuadas conocidas por lo expertos en la técnica.
- 4.
- Se añaden luego 20 microlitros de muestra a cada pocillo. La muestra puede ser: tampón de ensayo, ejecutado como la muestra en blanco para comprobar la eficiencia del ensayo; una solución de \beta-hCG libre utilizada para estandarizar los valores de muestras desconocidas; o una muestra de suero de una mujer embarazada que se encuentra en el segundo trimestre. La placa se agita de modo turbulento durante 30 segundos y se pone luego sobre un rotor a 200 rpm, en el cual se incuba durante 30 minutos a la temperatura ambiente.
- 5.
- Se lava luego la placa como se ha descrito anteriormente, y se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene un anticuerpo biotinilado específico para la subunidad \beta de hCG. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y, dependiendo de la preferencia del operador, puede conjugarse con una sustancia distinta de biotina, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. La concentración del anticuerpo se puede ajustar para obtener valores de absorbancia óptimos. La placa se agita de modo turbulento durante 30 segundos y se pone luego sobre un rotor a 200 rpm, en el cual se incuba durante 30 minutos a la temperatura ambiente.
- 6.
- La placa se lava luego como se ha descrito anteriormente. Se añaden luego a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Esta etapa no es necesaria si el segundo anticuerpo utilizado está conjugado a una sustancia distinta de la biotina. La concentración de estreptavidina-peroxidasa en tampón de ensayo es 2,0 microgramos por mililitro. La placa se pone sobre un rotor a 200 rpm durante 5 minutos a la temperatura ambiente.
- 7.
- Se lava luego la placa como se ha descrito anteriormente. Se añaden a cada pocillo 100 microlitros de una solución de o-fenilenodiamina. Esta solución de sustrato puede ser alternativamente uno cualquiera de varios tintes apropiados conocidos por los expertos en la técnica y depende de la sustancia que se conjugue con el segundo anticuerpo. La placa se pone sobre un rotor a 200 rpm y se incuba a la temperatura ambiente en la oscuridad durante 8 minutos.
- 8.
- Se añaden luego 100 microlitros de ácido sulfúrico diluido (1,0 N) a cada pocillo para parar la reacción del sustrato.
- 9.
- Se determina espectrofotométricamente la absorbancia de cada pocillo a 492 nm.
Se utilizaron estos dos ensayos en la realización
del método de la presente invención. Se utilizaron ciento setenta y
ocho (178) muestras de pacientes para estudiar la relación del
síndrome de Down fetal con los niveles en sangre materna de
\beta-hCG libre. Se analizaron veintiséis (26)
muestras de mujeres embarazadas que se sabía eran portadoras de
fetos con síndrome de Down y 152 muestras desconocidas no
afectadas. Todas las muestras eran de mujeres aisladas embarazadas
de raza blanca, no diabéticas.
Las muestras de pacientes se analizaron luego con
respecto a niveles cuantitativos de MSAFP, por un ensayo ELISA, y
niveles de \beta-hCG libre por el ensayo en una
sola etapa y el ensayo de dos etapas independientemente. El nivel
de MSAFP y el nivel de \beta-hCG libre por cada
ensayo se convirtieron luego en una variable en el procedimiento de
discriminante lineal con el paquete estadístico de equipo lógico de
ordenador comercialmente asequible Statistical Analysis System para
generar una serie de datos de referencia. Se incorporó también la
edad de gestación de la paciente como una variable en el
procedimiento de discriminante. Los resultados de estos análisis de
discriminante, para todas las edades de gestación, y para edades de
gestación comprendidas entre 14 y 16 semanas, se resumen a
continuación.
Todas las
semanas
| Positivo falso | Eficiencia de detección | Testigos | Afectados | |
| Log (\beta-1) | 6,6% | 69,2% | 152 | 26 |
| Log (\beta-1) + log (AFP) | 5,9% | 72,0% | 152 | 25 |
| Log (\beta-2) | 8,2% | 33,3% | 138 | 18 |
| Log (\beta-2) + log (AFP) | 10,1% | 64,7% | 138 | 17 |
| Log (\beta-2)* | 9,6% | 33,3% | 136 | 18 |
| Log (\beta-2) + log (AFP)* | 10,3% | 52,9% | 136 | 17 |
Semanas
14-16
| Positivo falso | Eficiencia de detección | Testigos | Afectados | |
| Log (\beta-1) | 5,8% | 68,4% | 104 | 19 |
| Log (\beta-1) + log (AFP) | 4,8% | 73,7% | 104 | 19 |
| Log (\beta-2) | 7,1% | 45,4% | 98 | 11 |
| Log (\beta-2) + log (AFP) | 9,2% | 63,6% | 98 | 11 |
| Log (\beta-2)* | 10,4% | 54,6% | 96 | 11 |
| Log (\beta-2) + log (AFP)* | 8,3% | 63,6% | 96 | 11 |
| Nota: todos los análisis incluían la edad de gestación | ||||
| * En los análisis con un * a continuación de ellos, se apartaron dos resultados aberrantes con valores de 260 | ||||
| y 316. |
Claims (17)
1. Un método de averiguación in vitro para
determinar si una mujer embarazada es portadora de un feto con
síndrome de Down que comprende:
ensayar la sangre de una mujer embarazada
respecto a gonadotropina coriónica humana \beta (hCG) libre,
siendo los resultados del ensayo indicativos de riesgo incrementado
de síndrome de Down fetal.
2. El método de averiguación in vitro de
la reivindicación 1, en el cual la indicación de riesgo incrementado
de síndrome de Down fetal es el resultado de comparar el nivel de
\beta-(hCG) libre medido en dicha mujer embarazada y la edad de
gestación de dicha mujer embarazada con una serie de datos de
referencia.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2 que
comprende adicionalmente:
ensayar la sangre de una mujer embarazada para
\alpha-fetoproteína, siendo los resultados del
ensayo para la \beta-(hCG) libre y el ensayo para
\alpha-fetoproteína indicativos de riesgo
incrementado de síndrome de Down fetal.
4. Un método de averiguación in vitro para
determinar el riesgo de una mujer embarazada de ser portadora de un
feto con síndrome de Down, que comprende: medir la sangre materna
de dicha mujer embarazada con respecto al nivel de \beta-(hCG)
libre durante un período de tiempo seleccionado del grupo
constituido por: el primer trimestre de embarazo, el segundo
trimestre de embarazo y el tercer trimestre de embarazo, y comparar
dicho nivel de \beta-(hCG) libre con valores de referencia del
nivel para \beta-(hCG) libre durante el período de tiempo en: (1)
mujeres embarazadas que son portadoras de fetos con síndrome de
Down y (2) mujeres embarazadas portadoras de fetos normales, siendo
dicha comparación indicativa del riesgo de dicha mujer embarazada
de ser portadora de un feto con síndrome de Down, en el cual un
nivel más alto de \beta-(hCG) libre es indicativo de una
probabilidad mayor de ser portadora de un feto con síndrome de
Down.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, para determinar si una mujer embarazada corre un riesgo
significativo de ser portadora de un feto con síndrome de Down, que
comprende: medir el nivel en la sangre materna de la mujer
embarazada de \beta-(hCG) libre y comparar los datos de la
medición del analito con una serie de datos de referencia para
determinar el riesgo de la mujer embarazada de ser portadora de un
feto con síndrome de Down.
6. El método de las reivindicaciones 4 ó 5, que
comprende adicionalmente:
medir el nivel en la sangre materna de la mujer
embarazada de \alpha-fetoproteína y comparar el
nivel medido de \beta-(hCG) libre, el nivel medido de
\alpha-fetoproteína y la edad de gestación de la
mujer embarazada con una serie de datos de referencia.
7. El método de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en
el cual la etapa de comparación comprende incorporar los datos de la
o las mediciones en una función de densidad de probabilidad
generada a partir de la serie de datos de referencia por un
procedimiento de análisis de discriminante lineal.
8. El método de las reivindicaciones 4, 5, 6, o
7, en el cual la etapa de comparación comprende comparar el
logaritmo de los datos de la o las mediciones con la serie de datos
de referencia.
9. Un método para determinar in vitro si
una mujer embarazada corre un riesgo significativo de ser portadora
de un feto con síndrome de Down, que comprende:
medir el nivel en la sangre materna de la mujer
embarazada de un analito seleccionado del grupo constituido por
\beta-(hCG) libre, una variante (o variantes) de \beta-(hCG)
libre, o una forma aberrante (formas aberrantes) de la
\beta-(hCG) libre y comparar los datos de la medición del analito
con una serie de datos de referencia para determinar el riesgo de
la mujer embarazada de ser portadora de un feto con síndrome de
Down.
10. Uso de un estuche (kit) de ensayo para llevar
a cabo el método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5
para determinar si una mujer embarazada corre un riesgo
significativo de ser portadora de un feto con síndrome de Down, que
comprende:
medios para ensayar la sangre de una mujer
embarazada en cuanto a \beta-(hCG) libre.
11. El uso de un aparato para el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho
aparato:
medios adaptados para recibir los datos de
medición de un nivel en sangre materna de mujer embarazada de
\beta-(hCG) libre y medios de ordenador para comparar los datos
de medición del nivel de \beta-(hCG) libre con una serie de datos
de referencia para determinar las trisomías cromosómicas
fetales.
12. El uso de la reivindicación 11 en el cual la
trisomía cromosómica fetal es el síndrome de Down.
13. El uso de un aparato para el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho
aparato:
medios adaptados para recibir los datos de
medición del nivel en la sangre materna de la mujer embarazada de
\beta-(hCG) libre,
medios adaptados para recibir los datos de
medición del nivel en la sangre materna de la mujer embarazada de
\alpha-fetoproteína, y
medios de ordenador para calcular una serie de
datos normativos a partir de una serie de datos de referencia que
contienen valores de referencia del nivel de \beta-(hCG) libre y
el nivel de \alpha-fetoproteína para diversas
edades de gestación en: (1) mujeres embarazadas que son portadoras
de fetos con síndrome de Down y (2) mujeres embarazadas que son
portadoras de fetos normales, y para incorporación de dichos datos
de mediciones de dichos niveles de dichas \beta-(hCG) libre y
\alpha-fetoproteína, y dicha edad de gestación de
la mujer embarazada en una función de densidad de probabilidad,
comparando de este modo dichos niveles y dicha edad de gestación de
la mujer embarazada con la serie de datos normativos para
determinar el riesgo de que dicha mujer embarazada sea portadora de
un feto con síndrome de Down.
14. El uso de un aparato para el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho
aparato:
medios adaptados para recibir los datos de
medición de un nivel en sangre materna de mujer embarazada de
\beta-(hCG) libre, y
medios de ordenador para calcular una serie de
datos de referencia y para incorporar dichos datos de medición de
dicho nivel de \beta-(hCG) libre y dicha edad de gestación de la
mujer embarazada en una función de densidad de probabilidad,
comparando de este modo dicho nivel de \beta(hCG) libre en
la mujer embarazada y dicha edad de gestación de la mujer
embarazada con la serie de datos normativos para determinar el
riesgo de que dicha mujer embarazada sea portadora de un feto con
síndrome de Down.
15. El uso de la reivindicación 13 ó 14, en el
cual dicho aparato comprende adicionalmente:
medios adaptados para recibir los datos de
medición de un nivel en sangre materna de mujer embarazada de
\alpha-fetoproteína, y en el cual los medios de
ordenador incorporan también los datos de medición de
\alpha-fetoproteína en la función de densidad de
probabilidad y comparan de este modo también el nivel en la mujer
embarazada de \alpha-fetoproteína con la serie de
datos de referencia.
16. El uso de las reivindicaciones 13, 14 ó 15,
en el cual la serie de datos de referencia se calcula a partir del o
de los logaritmos de los datos de mediciones del nivel o niveles,
y
el o los logaritmos de los datos de medición se
utilizan para comparar el o los niveles en la mujer embarazada del
conjunto de datos normativos.
17. El uso de un aparato para el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho
aparato:
medios adaptados para recibir los datos de
medición de un nivel en sangre materna de mujer embarazada de un
analito seleccionado del grupo constituido por \beta-(hCG) libre,
una variante (o variantes) de \beta-(hCG) libre, o una forma
aberrante (formas aberrantes) de la \beta-(hCG) libre y
medios de ordenador para calcular una serie de
datos de referencia y para incorporar dichos datos de medición de
dicho nivel del analito y dicha edad de gestación de la mujer
embarazada en una función de densidad de probabilidad, comparando
de este modo dicho nivel en la mujer embarazada de dicho analito y
dicha edad de gestación de la mujer embarazada con la serie de datos
normativos para determinar el riesgo de que dicha mujer embarazada
sea portadora de un feto con síndrome de Down.
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