ES2092976T3 - Metodos para modificar el comportamiento alimentario, compuestos utiles en tales metodos, y adn que codifica un receptor (y5) del neuropeptido y/peptido yy atipico hipotalamico. - Google Patents

Metodos para modificar el comportamiento alimentario, compuestos utiles en tales metodos, y adn que codifica un receptor (y5) del neuropeptido y/peptido yy atipico hipotalamico.

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ES2092976T3 ES95943642T ES95943642T ES2092976T3 ES 2092976 T3 ES2092976 T3 ES 2092976T3 ES 95943642 T ES95943642 T ES 95943642T ES 95943642 T ES95943642 T ES 95943642T ES 2092976 T3 ES2092976 T3 ES 2092976T3
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Abstract

ESTA INVENCION PROPORCIONA METODOS PARA MODIFICAR EL COMPORTAMIENTO DE ALIMENTACION, QUE INCLUYE UN AUMENTO O REDUCCION DEL CONSUMO DE ALIMENTOS, P. EJ., CON RESPECTO AL TRATAMIENTO DE OBESIDAD, BULIMIA O ANOREXIA. ESTOS METODOS INCLUYEN LA ADMINISTRACION DE AGONISTAS O ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR Y5. DICHO ANTAGONISTA TIENE LA ESTRUCTURA (I). ADEMAS, ESTA INVENCION PROPORCIONA UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA UN RECEPTOR Y5, UNA PROTEINA RECEPTORA Y5, VECTORES QUE CONSTAN DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA UN RECEPTOR Y5, CELULAS QUE COMPRENDEN DICHOS VECTORES, ANTICUERPOS DIRIGIDOS AL RECEPTOR Y5, SONDAS DE ACIDO NUCLEICO UTILES PARA DETECTAR RECEPTORES Y5 DE CODIFICACION DE ACIDO NUCLEICO, OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENSIBLES COMPLEMENTARIOS A CUALQUIER SECUENCIA UNICA DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN RECEPTOR Y5, UN ANIMAL TRANSGENETICO NO HUMANO QUE EXPRESA ADN, UN RECEPTOR Y5 NORMAL O UNO MUTANTE.

Description

Métodos para modificar el comportamiento alimentario, compuestos útiles en tales métodos, y ADN que codifica un receptor (Y5) del neuropéptido Y/péptido YY atípico hipotalámico.
Antecedentes de la invención
A lo largo de esta solicitud, las diversas referencias se presentan entre paréntesis. En esta solicitud se incorporan las descripciones de estas publicaciones en su totalidad como referencia para describir más detalladamente el estado de la técnica al que pertenece está invención. Pueden encontrarse las citas bibliográficas completas de estas referencias al final de esta solicitud, antes de la lista de secuencias y de las reivindicaciones.
El neuropéptido Y (NPY) es un miembro de la familia de polipéptidos pancreáticos con una amplia distribución a lo largo del sistema nervioso de mamíferos. NPY y sus péptidos relacionados (el péptido YY o PYY, y el polipéptido pancreático o PP) inducen una amplia serie de efectos fisiológicos por medio de la activación de al menos cinco subtipos de receptores acoplados a la proteína G conocidos como Y1, Y2, Y3, Y4 (o PP), y el "Y1 atípico". Se cree que el papel de NPY como el estimulante más potente del comportamiento alimentario descrito hasta ahora tiene lugar principalmente por medio de la activación del receptor "Y1 atípico" hipotalámico. Este receptor es único ya que su clasificación se basó únicamente en los datos del comportamiento alimentario, en lugar de en los datos de unión a radioligandos, a diferencia de los receptores Y1, Y2, Y3 e Y4 (o PP), de los que cada uno se describió previamente tanto en ensayos de unión a radioligandos como en ensayos funcionales. Los solicitantes ahora informan sobre el uso de una técnica de clonación de expresión basada en ^{125}I-PYY para aislar un ADNc hipotalámico de rata que codifica un receptor "Y1 atípico" denominado en este documento subtipo Y5. Los solicitantes también informan sobre el aislamiento y la caracterización de un homólogo de Y5 procedente del hipocampo humano. El análisis de la secuencia proteica revela que el receptor Y5 pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G. Tanto el homólogo humano como el homólogo de rata presentan una identidad del 42% en dominios transmembrana con los receptores de "tipo Y" clonados previamente. Los estudios de localización en cerebro de rata realizados usando técnicas de hibridación in situ verificaron la existencia del ARNm del receptor Y5 en el hipotálamo de rata. La evaluación farmacológica reveló las siguientes similitudes entre el receptor Y5 y el receptor "Y1 atípico". 1) Los péptidos se unían al receptor Y5 con un orden jerárquico de potencia idéntico al descrito para la respuesta alimentaria: NPY \geq NPY_{2-36} = PYY = [Leu^{31}, Pro^{34}] NPY >> NPY_{13-36}. 2) El receptor Y5 estaba acoplado negativamente a la acumulación de AMPc, como se había propuesto para el receptor "Y1 atípico". 3) Los péptidos activaban el receptor Y5 con un orden jerárquico de potencia idéntico al descrito para la respuesta alimentaria. 4) El "modulador" de la alimentación presentado [D-Trp^{32}]NPY se unía selectivamente al receptor Y5 y posteriormente activaba el receptor. 5) Tanto el receptor Y5 como el receptor "Y1 atípico" eran sensibles a deleciones o modificaciones en la región media de NPY y de ligandos peptídicos relacionados. Estos datos confirman la identidad del receptor Y5 como el "Y1 atípico" descrito previamente y, además, indican un papel para el receptor Y5 como una diana potencial en el tratamiento de la obesidad, de trastornos metabólicos y de trastornos del apetito.
El neuropéptido neurotransmisor I (NPY) es un miembro de 36 aminoácidos de la familia de polipéptidos pancreáticos con una amplia distribución a lo largo de todo el sistema nervioso de mamíferos. Se considera que NPY es el estimulante más potente del comportamiento alimentario descrito hasta ahora (Clark et al., 1984; Levine y Morley, 1984; Stanley y Leibowitz, 1984). La inyección directa en el hipotálamo de ratas saciadas, por ejemplo, puede aumentar la ingesta de alimentos hasta 10 veces durante un período de cuatro horas (Stanley et al., 1992). El papel de NPY en el comportamiento alimentario normal y anormal, y la capacidad para interferir con las rutas dependientes de NPY como medio para controlar el apetito y el peso, son áreas de gran interés en la investigación farmacológica y farmacéutica (Sahu y Kalra, 1993; Dryden et al., 1994). Sin embargo, cualquier medio creíble para el estudio o el control del comportamiento alimentario dependiente de NPY necesariamente debe ser muy específico, ya que el NPY puede actuar a través de al menos cinco subtipos de receptores farmacológicamente definidos para inducir una amplia diversidad de funciones fisiológicas (Dumont et al., 1992). Por lo tanto, es vital que el conocimiento de la biología molecular y de la diversidad estructural de los subtipos de receptores individuales se entienda como parte de una estrategia de diseño de fármacos racional para el desarrollo de compuestos con selectividad por ciertos subtipos. A continuación y también la tabla 1, se resume una breve revisión de la farmacología de los receptores de NPY.
Tabla 1
Receptores farmacológicamente definidos para NPY y polipéptidos pancreáticos relacionados
Los órdenes jerárquicos de afinidad para péptidos clave (NPY, PYY, PP, [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY, NPY_{2-36}, y NPY_{13-36}) se basan en datos funcionales y de unión presentados previamente (Schwartz et al., 1990; Wahlestedt et al., 1991; Dumont et al., 1992; Wahlestedt y Reis, 1993). Los datos para el receptor Y2 se describieron en la solicitud de patente de Estados Unidos 08/192.288 presentada con fecha 3/2/94, actualmente en trámite, cuyo contenido anterior se incorpora en el presente documento como referencia. Los datos para el receptor Y4 se describieron en la solicitud de patente de Estados Unidos 08/176.412 presentada el 28/12/93, actualmente en trámite, cuyo contenido anterior se incorpora en este documento como referencia. Los péptidos que faltan en las series reflejan la ausencia de información publicada.
TABLA 1
39
Farmacología de receptores de NPY
Históricamente, la farmacología de los receptores de NPY se ha basado en relaciones de estructura/actividad dentro de la familia de polipéptidos pancreáticos. La familia entera incluye el homónimo polipéptido pancreático (PP), sintetizado principalmente por células endocrinas en el páncreas; el péptido YY (PYY), sintetizado principalmente por células endocrinas en el intestino; y el NPY, sintetizado principalmente en neuronas (Michel, 1991; Dumont et al., 1992; Wahlestedt y Reis, 1993). Todos los miembros de la familia de polipéptidos pancreáticos comparten una estructura compacta que implica un "plegamiento PP" y un hexapéptido C-terminal conservado que termina en Tyr^{36} (o Y^{36} en el código de una sola letra). La sorprendente conservación de Y^{36} ha promovido que los receptores de polipéptidos pancreáticos se denominen receptores de "tipo Y" (Wahlestedt et al., 1987), de los que se propone que funcionan como receptores con siete dominios transmembrana acoplados a la proteína G (Dumont, et al., 1992).
El receptor Y1 reconoce NPY \geq PYY >> PP (Grundemar et al., 1992). El receptor requiere tanto las regiones N terminales como las regiones C terminales de los péptidos para un reconocimiento óptimo. Sin embargo, el intercambio de Gln^{34} en NPY o PYY por el resto análogo de PP (Pro^{34}) se tolera bien. El receptor Y1 se ha clonado a partir de una diversidad de especies incluyendo el ser humano, rata y ratón (Larhammar et al., 1992; Herzog et al., 1992; Eva et al., 1990; Eva et al., 1992). El receptor Y2 reconoce PYY \sim MPY >> PP y es relativamente tolerante a una deleción N-terminal (Grundemar et al., 1992). El receptor tiene un requisito estricto en relación con la estructura del extremo C (Arg^{33}-Gln^{34}-Arg^{35}-Tyr^{36}-NH_{2}); el intercambio de Gln^{34} por Pro^{34}, como en PP, no se tolera bien. Recientemente se ha clonado el receptor Y2 (descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 08/192.288, presentada el 3 de febrero de 1994). El receptor Y3 se caracteriza por una fuerte preferencia por NPY con respecto a PYY y PP (Wahlestedt et al., 1991). [Pro^{34}]NPY se tolera razonablemente bien aunque PP, que también contiene Pro^{34}, no se una bien al receptor Y3. Este receptor (Y3) todavía no se ha clonado. El receptor Y4 (descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 08/176.412, presentada el 28 de diciembre de 1993) se une a PP > PYY > NPY. Al igual que Y1, Y4 requiere tanto regiones N- terminales como regiones C-terminales de los péptidos para un reconocimiento óptimo (patente de Y4 sináptico). El receptor "Y1 atípico" o "alimentario" se definió exclusivamente por inyección de varios análogos de polipéptidos pancreáticos en el núcleo paraventricular del hipotálamo de rata, que estimuló el comportamiento alimentario con el siguiente orden jerárquico: NPY_{2-36} \geq NPY \sim PYY \sim [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY > NPY_{13-36} (Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992). El perfil es similar al de un receptor de tipo Y1 excepto por la capacidad anómala de NPY_{2-36} para estimular la ingesta de alimentos con una potencia equivalente o mejor que la de NPY. Un informe posterior en J. Med. Chem. de Balasubramaniam y colaboradores (1994) demostró que la alimentación puede regularse por [D-Trp^{32}]NPY. Aunque este péptido se presentó como un antagonista de NPY, los datos publicados confirman, al menos en parte, un efecto estimulador de [D-Trp^{32}]NPY sobre la alimentación. Por lo tanto, [D-Trp^{32}]NPY representa otra herramienta de diagnóstico para la identificación del receptor. A diferencia de lo que ocurre con otros subtipos de receptores de NPY, el receptor "alimentario" nunca se ha caracterizado con respecto a la afinidad de unión a péptidos en ensayos de unión a radioligandos, y no ha sido posible validar el hecho de que un solo receptor pueda ser responsable de la respuesta alimentaria en ausencia de una proteína receptora aislada; existe la posibilidad, por ejemplo, de que la respuesta alimentaria pueda ser un perfil compuesto de subtipos Y1 y Y2.
Los solicitantes ahora informan sobre el aislamiento por clonación de la expresión de un nuevo receptor de tipo Y a partir de una biblioteca de ADNc hipotalámico de rata, junto con su caracterización farmacológica, localización in situ y homólogos humanos. Los datos proporcionados asocian este subtipo de receptor recién clonado, denominado a partir de ahora subtipo Y5, con la respuesta alimentaria del "Y1 atípico". Por lo tanto, este descubrimiento proporciona una nueva estrategia, por medio del uso de sistemas de expresión heterólogos, para desarrollar un antagonista con selectividad de subtipo para la obesidad y otras indicaciones.
Los solicitantes además informan sobre el aislamiento de un receptor Y5 canino. Además, los solicitantes informan sobre el descubrimiento de compuestos químicos que se unen selectivamente al receptor Y5 de la presente invención y que actúan como antagonistas del receptor Y5. También se demostró que varios de los compuestos inhibían la ingesta de alimentos en ratas.
El tratamiento de trastornos o enfermedades asociadas con la inhibición del subtipo de receptores Y5, especialmente enfermedades causadas por trastornos de la alimentación tales como obesidad, bulimia nerviosa, diabetes y dislipidemia, puede realizarse por medio de la administración de compuestos que se unen selectivamente al receptor Y5 y que inhiben la activación del receptor Y5. Además, también puede tratarse cualquier estado de enfermedad en el que esté implicado el subtipo de receptores Y5, por ejemplo, pérdida de memoria, ataques epilépticos, migrañas, alteraciones del sueño y dolor, usando compuestos que se unan selectivamente al receptor Y5.
Esta invención proporciona un ácido nucleico que codifica un receptor Y5 de mamífero. Esta invención también proporciona una proteína del receptor Y5 purificada. Esta invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente.
Esta invención proporciona un vector que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN en una célula de mamífero unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 humano para permitir su expresión, denominado pcEXV-hY5 (Nº de acceso de la ATCC 75943).
Esta invención proporciona un plásmido que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN en una célula de mamífero unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 de rata para permitir su expresión, denominado pcEXV-rY5 (Nº de acceso de la ATCC 75944).
Esta invención proporciona una célula de mamífero que comprende el plásmido o el vector descrito anteriormente.
Esta invención proporciona una sonda de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos, capaz de hibridar específicamente con una única secuencia incluida dentro de la secuencia de un ácido nucleico que codifica un receptor Y5.
Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con un ARNm que codifica un receptor Y5 para prevenir la traducción del ARNm.
Esta invención proporciona un anticuerpo dirigido a un receptor Y5.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un antagonista eficaz para reducir la actividad de un receptor Y5 humano y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un agonista eficaz para aumentar la actividad de un receptor Y5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona la composición farmacéutica descrita anteriormente que comprende una cantidad del anticuerpo eficaz para bloquear la unión de un ligando al receptor Y5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona un mamífero no humano transgénico que expresa ADN que codifica un receptor Y5 humano.
Esta invención también proporciona un método para determinar si un compuesto químico se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la unión, y detectar la unión específica del compuesto químico al receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico es un agonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar un aumento en la actividad del receptor Y5, para determinar de esta manera si el compuesto químico es un agonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 con el ligando en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación de receptor Y5, detectar un aumento en la actividad del receptor Y5, y determinar de esta forma si el ligando es un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso que implica una unión competitiva para identificar un compuesto químico que se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana tanto con un compuesto químico que se sabe que se une específicamente al receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen específicamente al receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5 en condiciones adecuadas para la unión de compuestos, detectar la unión específica de la pluralidad de compuestos químicos, indicando una disminución en la unión del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5 en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une al receptor Y5, y detectar por separado la unión de cada compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos al receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para seleccionar una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen al receptor Y5 para identificar un compuesto que se una específicamente al receptor Y5, que comprende (a) preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con un compuesto que se sabe que se une específicamente al receptor Y5; (b) poner en contacto la preparación de la etapa (a) con la pluralidad de compuestos que no se sabe si se unen específicamente al receptor Y5, en condiciones que permitan la unión de los compuestos que se sabe que se unen al receptor Y5; (c) determinar si la unión del compuesto que se sabe que se une al receptor Y5 se reduce en presencia de los compuestos, con respecto a la unión del compuesto en ausencia de la pluralidad de compuestos; y si es así (d) determinar por separado la unión al receptor Y5 de cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos, para identificar de esta forma el compuesto que se une específicamente al receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente y activa un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen y activan el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia y en ausencia de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio en la respuesta del segundo mensajero en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico de la pluralidad de compuestos químicos activa el receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos se une a y activa el receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido en condiciones que permitan la activación del receptor Y5 y detectar una disminución en la actividad del receptor Y5, para determinar de esta manera si el compuesto químico es un antagonista de receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana tanto con el compuesto químico como con un segundo compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, y sólo en el caso del segundo compuesto químico, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de únicamente el segundo compuesto químico y en presencia tanto del segundo compuesto químico como del compuesto químico, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico que el compuesto químico inhibe la activación del receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana, tanto con un compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos que no se sabe si inhiben la activación del receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos con respecto a la presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos inhibe la activación del receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une específicamente e inhibe la activación del receptor Y5.
En una realización separada del proceso descrito anteriormente, la respuesta del segundo mensajero comprende la actividad adenilato ciclasa y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una disminución en el nivel de actividad adenilato ciclasa en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y de la pluralidad de compuestos químicos, menor que en presencia de únicamente el segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúen como agonistas de un receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 con una pluralidad de fármacos en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5, determinar los fármacos que activan tal receptor en la célula, e identificar de esta forma fármacos que actúan como agonistas del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúen como antagonistas del receptor Y5, que comprende poner en contacto células transfectadas con y que expresan ADN que codifica un receptor Y5 con una pluralidad de fármacos en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5, determinar los fármacos que inhiben la activación del receptor en la célula de mamífero, e identificar de esta forma fármacos que actúan como antagonistas del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para diagnosticar una predisposición a un trastorno asociado con la actividad de un alelo del receptor Y5 humano específico, que comprende:
a. obtener ADN de sujetos que padecen el trastorno; realizar una digestión de restricción del ADN con un panel de enzimas de restricción; c. separar electroforéticamente los fragmentos de ADN resultantes en un gel de clasificación por tamaños; d. poner en contacto el gel resultante con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con un ADN que codifica un receptor Y5 humano y marcado con un marcador detectable;
e. detectar las bandas marcadas que se han hibridado con el ADN que codifica un receptor Y5 humano marcado con un marcador detectable para crear un modelo de banda único específico para el ADN de sujetos que padecen el trastorno; f. preparar el ADN obtenido para diagnóstico por medio de las etapas a-e; y g. comparar el modelo de banda única específico para el ADN de sujetos que padecen el trastorno de la etapa e y el ADN obtenido para diagnóstico de la etapa f para determinar si los modelos son iguales o diferentes y para diagnosticar de esta forma la predisposición al trastorno si los modelos son iguales.
Esta invención proporciona un método para preparar el receptor Y5 humano, de rata o canino purificado que comprende: a) construir un vector adaptado para la expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula unidos operativamente al ácido nucleico que codifica el receptor Y5 humano, de rata o canino de forma que se permita su expresión, donde la célula se selecciona entre el grupo compuesto por células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero; b) insertar el vector de la etapa a) en una célula hospedadora adecuada; c) incubar las células de la etapa b) en condiciones que permitan la expresión de los receptores Y5 humanos, de rata o caninos; d) recuperar el receptor producido de esta forma; y e) purificar el receptor recuperado de esta forma, preparando de esta manera un receptor Y5 humano, de rata o canino.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY en membranas de hipotálamo de rata. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY y con concentraciones crecientes de competidores peptídicos. Los valores de IC_{50} correspondientes a un desplazamiento del 50% se determinaron mediante un análisis de regresión no lineal. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. Los valores de IC_{50} para estos compuestos se presentan por separado en la tabla 2.
Figura 2 Desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY_{3-36} en membranas de hipotálamo de rata. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY_{3-36} y con concentraciones crecientes de competidores peptídicos. Los valores de IC_{50} correspondientes a un desplazamiento del 50% se determinaron mediante un análisis de regresión no lineal. Los datos son representativos de al menos experimentos independientes. Los valores de IC_{50} para estos compuestos se presentan por separado en la tabla 2.
Figura 3 Secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de Y5 de hipotálamo de rata (Sec I.D. Nº 1). Los codones de inicio y stop están subrayados. Sólo se muestran secuencias parciales 5' y 3' no traducidas.
Figura 4 Secuencia de aminoácidos correspondiente del clon de ADNc de Y5 de hipotálamo de rata (Sec. I.D. Nº 2).
Figura 5 Secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de Y5 de hipocampo humano (Sec. I.D. Nº 3). Los codones de inicio y stop están subrayados. Sólo se muestran secuencias parciales 5' y 3' no traducidas.
Figura 6 Secuencia de aminoácidos correspondiente del clon de ADNc de Y5 de hipocampo humano (Sec. I.D. Nº 4).
Figura 7 A-E. Comparación de secuencias de nucleótidos codificantes entre los clones de ADNc de Y5 de hipotálamo de rata (fila superior) y de Y5 de hipocampo humano (fila inferior) (con una identidad de nucleótidos del 84,1%). F-G. Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida entre los clones de ADN de Y5 de hipotálamo de rata (fila superior) y de Y5 de hipocampo humano (fila inferior) (con una identidad global del 87,2% y una identidad de los dominios transmembrana del 98,8%).
Figura 8 Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del receptor Y5 humano con las de las secuencias de Y1, Y2 e Y4 humanos. Barras negras, los siete supuestos dominios transmembrana (TMI-VII). Sombreado, identidades entre las secuencias de receptores.
Figura 9 Unión de equilibrio de ^{125}I-PYY a membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores Y5 de rata. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY durante los tiempos indicados, en presencia o en ausencia de NPY humano 300 nM. La unión específica, B, se representó frente al tiempo, t, para obtener el máximo número de sitios de unión en equilibrio, B_{max}, y la velocidad de asociación observada, K_{obs}, de acuerdo con la ecuación, B =
B_{max} * (1 -e^{-(kobs * t)}). La unión se muestra como el porcentaje de la unión en equilibrio total, B_{max}, determinada mediante un análisis de regresión no lineal. Cada punto representa una determinación por triplicado.
Figura 10 Unión en equilibrio saturable de ^{125}I-PYY a membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores Y5 de rata. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY a concentraciones que variaban de 0,4 pM a 2,7 nM, en presencia o ausencia de NPY humano 300 nM. La unión específica, B, se representó frente a la concentración de ^{125}I-PYY libre, [L], para obtener el máximo número de sitios de unión saturables, B_{max}, y la constante de disociación en equilibrio de ^{125}I-PYY, K_{d}, de acuerdo con la isoterma de unión, B = B_{max}[L]/([L] + K_{d}). Se muestra la unión específica. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, con cada punto medido por triplicado.
Figura 11 Desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores Y5 de rata. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY y concentraciones crecientes de competidores peptídicos. Los valores de IC_{50} que corresponden a un desplazamiento del 50% se determinaron mediante un análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores de K_{i} de acuerdo con la ecuación K_{i} = IC_{50}/(1 + [L]/K_{d}), donde [L] es la concentración de ^{125}I-PYY y K_{d} es la constante de disociación de equilibrio de ^{125}I-PYY. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. En la tabla 4 se indican por separado los órdenes de jerarquía de afinidad para estos y otros compuestos.
Figura 12 Inhibición de la acumulación de AMPc estimulada por forskolina en células 293 intactas que expresan de forma estable receptores Y5 de rata. Los datos funcionales se obtuvieron a partir de un radioinmunoensayo de AMPc en células 293 estimuladas con forskolina 10 \cdot M durante un período de 5 minutos. Se ensayó la actividad agonista del NPY de rata/humano a concentraciones que variaban de 0,03 pM a 0,3 \muM durante el mismo período de tiempo. El valor de EC_{50} correspondiente a un 50% de la actividad máxima se determinó mediante un análisis de regresión no lineal. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Figura 13 Diagramas esquemáticos de secciones de corona a través del cerebro de rata, que ilustran la distribución del ARNm del receptor Y5 de NPY, visualizadas por medio de un microscopio en secciones sumergidas en emulsión líquida. Las secciones se disponen desde rostral (A) a caudal (H). Las diferencias en la densidad de granos de plata sobre las neuronas individuales en un área dada se indican por el gradiente de rayado. Las definiciones detalladas de las abreviaturas son como se muestran a continuación:
Aco = núcleo amigdaloide cortical anterior;
AD = núcleo talámico anterodorsal;
APT = núcleo pretectal anterior;
Arc = núcleo hipotalámico arqueado;
BLA = núcleo amigdalino basolateral anterior;
CA3 = región CA3 del asta de Ammon, hipocampo;
CeA = núcleo amigdalino central;
Cg = corteza cingular;
CL = núcleo talámico centrolateral;
CM = núcleo talámico centromedial;
DG = circunvolución dentada, hipocampo;
DMH = núcleo hipotalámico dorsomedial;
DR = rafe dorsal;
GiA = núcleo reticular gigantocelular, alfa;
HDB = banda diagonal del segmento horizontal del núcleo
InG = colículo superior de la capa gris intermedia;
LC = locus coeruleus;
LH = área hipotalámica lateral;
MePV = núcleo amigdalino medial, posteroventral;
MVe = núcleo vestibular medial;
MHb = núcleo habenular medial;
MPN = núcleo preóptico medial;
PAG = substancia gris periacueductal;
PaS = parasubículo;
PC = núcleo talámico paracentral;
PCRtA = núcleo reticular parvocelular, alfa;
Pe = núcleo hipotalámico periventricular;
PrS = presubiculum;
PN = núcleos pontinos;
PVH = núcleo hipotalámico paraventricular;
PVHmp = núcleo hipotalámico paraventricular, parte parvicelular medial
PVT = núcleo talámico paraventricular;
Re = núcleo talámico reuniens;
RLi = rafe del núcleo lineal rostral;
RSG = corteza restrosplenial;
SCN = núcleo supraquiasmático;
SNc = substancia negra, porción compacta; y
SON = núcleo supraóptico.
Figura 14 Secuencia de nucleótidos parcial del clon de ADNc de Y5 canino que comienza inmediatamente cadena arriba de TM III y llega hasta el codón stop (subrayado) (Sec. I.D. Nº 5). Sólo se muestra la secuencia 3' parcial no traducida.
Figura 15 Secuencia de aminoácidos correspondiente del clon de ADNc de Y5 canino (Sec. I.D. Nº 6).
Figura 16 A. Análisis de transferencia de Northern de diversos tejidos de rata. B. Análisis de transferencia de Northern de diversas áreas del cerebro humano: amígdala, núcleo caudado, cuerpo calloso, hipocampo, cerebro entero, substancia negra, núcleo subtalámico, y tálamo. C. Análisis de transferencia de Northern de diversas áreas del cerebro humano adicionales: cerebelo, corteza cerebral, médula, médula espinal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen. La hibridación se realizó en condiciones de alta rigurosidad, como se describe en la sección de Detalles Experimentales.
Figura 17 Análisis de transferencia de Southern de ADN genómico de rata o humano que codifica el subtipo de receptores Y5. La hibridación se realizó en condiciones de alta rigurosidad, como se describe en la sección de Detalles Experimentales.
Figura 18 Transcurso de tiempo para la unión en equilibrio de ^{125}I-Leu^{31}, Pro^{34}-PYY al receptor Y5 de rata. Las membranas se incubaron con radioligando 0,08 nM a temperatura ambiente durante todo el período de tiempo indicado en tampón de unión que contenía Na^{+} 10 mM o Na^{+} 138 mM.
Figura 19 Modulación por Nucleótido de Guanina de la Unión de Péptidos a Y5. Se incubaron receptores Y5 humanos o de rata expresados transitoriamente en membranas de células COS-7, o receptores Y5 humanos expresados de forma estable en membranas de células LM(tk-), con ^{125}I-PYY 0,08 nM y concentraciones crecientes de Gpp(NH)p, como se indica en las condiciones de ensayo de unión convencionales. La unión del radioligando se presenta como cpm, eficacia = 0,8. Para el Y5 humano en LM(tk-) (0,007 mg de proteína de membrana/muestra), el calor de \cdot cpm máximo = -2343. Dada una actividad específica de 2200 Ci/mmol, se calcula un cambio en la unión al radioligando de -0,6 fmol/0,007 mg de proteína = -85 fmol/mg de proteína de membrana.
Figura 20 Inhibición Dependiente de NPY de la Acumulación de AMPc Estimulada con Forskolina por Receptores Y5 Clonados. Se incubaron células intactas transfectadas de forma estable con receptores Y5 humanos o de rata con forskolina más el intervalo de concentraciones de NPY humano que se indica. Se muestra un experimento representativo para cada sistema receptor s (n \geq 2).
Figura 21 Movilización de Calcio: Ensayo Fura-2. Se seleccionaron receptores de tipo Y humanos clonados en las células hospedadoras indicadas con respecto a la movilización del calcio intracelular en respuesta a NPY y a péptidos relacionados. Se muestran transiciones de calcio representativas para cada sistema receptor.
Figura 22 Ilustra la estructura de un compuesto que se une selectivamente a los receptores Y5 humanos y de rata.
Descripción detallada de la invención
A lo largo de esta solicitud, se usan las siguientes abreviaturas convencionales para indicar bases de nucleótidos específicas:
C = citosina A = adenina
T = timina G = guanina
Además, el término "agonista" se usa a lo largo de esta solicitud para indicar cualquier compuesto peptídico o no peptidílico que aumenta la actividad de cualquiera de los receptores de la presente invención. El término "antagonista" se usa a lo largo de esta solicitud para indicar cualquier compuesto peptídico o no peptidílico que reduce la actividad de cualquiera de los receptores de la presente invención.
La actividad de un receptor acoplado a la proteína G, tal como un receptor Y5, puede medirse usando cualquiera de una diversidad de ensayos funcionales apropiados en los que la activación del receptor en cuestión ocasiona un cambio observable en el nivel de algunos sistemas de segundo mensajero, incluyendo pero sin limitación adenilato ciclasa, movilización de calcio, hidrólisis del fosfolípido inositol o guanilil ciclasa.
Esta invención proporciona un ácido nucleico que codifica un receptor Y5. En una realización, el receptor Y5 es un receptor Y5 de vertebrado o de mamífero. En una realización, el ácido nucleico codifica un receptor Y5 de mamífero donde el ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 4, 6 y 15. En otra realización, el receptor Y5 tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la descrita en la figura 4. En otra realización, el receptor Y5 tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la descrita en la figura 6.
Esta invención proporciona un ácido nucleico, donde el ácido nucleico codifica un receptor Y5 caracterizado por una secuencia de aminoácidos en cada una de las regiones transmembrana I-VII que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región transmembrana correspondiente del receptor Y5 humano mostrado en la figura 8.
Esta invención proporciona el ácido nucleico aislado descrito anteriormente, donde el ácido nucleico es ADN. En una realización, el ADN es ADNc. En otra realización, el ADN es ADN genómico. En otra realización, el ácido nucleico es ARN, donde el ARN es preferiblemente ARNm. En una realización separada, el ácido nucleico codifica un receptor Y5 humano. En una realización, el receptor Y5 humano tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6.
Esta invención proporciona además un ADN que es degenerado con respecto a cualquiera de los ADN mostrados en las figuras 3, 5 y 14, codificando dicho ADN receptores Y5 que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las figuras 4, 6 y 15, respectivamente.
Esta invención también incluye moléculas de ADN y ADNc que codifican secuencias de aminoácidos que difieren de las del receptor Y5, pero que no deberían producir cambios fenotípicos. Como alternativa, esta invención también incluye moléculas de ADN y ADNc que hibridan con el ADN y ADNc de la presente invención. Los métodos de hibridación son bien conocidos para los especialistas en la técnica.
Las moléculas de ADN de la presente invención también incluyen ADN que codifica para análogos polipeptídicos, fragmentos o derivados de polipéptidos antigénicos que difieren de las formas naturales en términos de la identidad o la localización de uno o más restos aminoacídicos (análogos de deleción que contienen menos restos que los especificados para la proteína, análogos de substitución donde uno o más restos especificados se han reemplazado por otros restos, y análogos de adición donde se han añadido uno o más restos aminoacídicos a la porción terminal o media de los polipéptidos) y que comparten algunas o todas las propiedades de las formas naturales. Estos ácidos nucleicos incluyen: la incorporación de codones "preferidos" para la expresión por hospedadores no mamíferos seleccionados; la disposición de sitios para la escisión por enzimas endonucleasas de restricción; y la disposición de secuencias de ADN adicionales iniciales, terminales o intermedias que facilitan la construcción de vectores que se expresan rápidamente.
Los ácidos nucleicos descritos y reivindicados en este documento son útiles por la información que proporcionan en relación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido y como productos para la síntesis a gran escala del polipéptido por medio de una diversidad de técnicas recombinantes. El ácido nucleico es útil para generar nuevos vectores de clonación y de expresión, células hospedadoras procariotas y eucariotas transformadas y transfectadas, y métodos nuevos y útiles para el cultivo de tales células hospedadoras capaces de expresar el polipéptido y productos relacionados.
En una realización separada, el ácido nucleico codifica un receptor Y5 de rata. En otra realización, el receptor Y5 de rata tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 4. En otra realización, el ácido nucleico codifica un receptor Y5 canino. En otra realización, el receptor Y5 canino tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 15.
Esta invención también proporciona una proteína del receptor Y5 purificada. En realizaciones separadas, la proteína del receptor Y5 puede ser una proteína humana, de rata o canina.
Esta invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente.
También se proporcionan vectores que comprenden el ácido nucleico aislado descrito anteriormente en este documento. Los vectores adecuados comprenden, pero sin limitación, un plásmido o un virus. Estos vectores pueden utilizarse para transformar una célula hospedadora adecuada para formar un sistema de vector de célula hospedadora para la producción de un polipéptido con la actividad biológica de un receptor Y5.
Esta invención proporciona el vector descrito anteriormente adaptado para la expresión en una célula hospedadora que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula hospedadora, unidos operativamente al ácido nucleico que codifica un receptor Y5 para permitir su expresión.
Esta invención proporciona el vector descrito anteriormente adaptado para la expresión en una célula hospedadora, donde la célula hospedadora es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero. En una realización, la célula hospedadora no es de origen neuronal. En otra realización, la célula es una célula COS-7, una célula 293 de riñón embrionario humano, una célula NIH-3T3 o una célula LM(tk-). En otra realización, la célula de insecto es una célula Sf9 o una célula Sf21.
Esta invención proporciona el vector descrito anteriormente que es un baculovirus o un plásmido.
Esta invención proporciona una preparación de membrana aislada a partir de las células hospedadoras descritas anteriormente, donde la célula hospedadora no expresa de forma natural un receptor Y5.
En una realización, el vector está adaptado para la expresión en una célula de mamífero que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 de mamífero para permitir su expresión.
En otra realización, el vector está adaptado para la expresión en una célula de mamífero que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 humano para permitir su expresión.
En otra realización, el plásmido está adaptado para la expresión en una célula de mamífero que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 de rata para permitir su expresión.
Esta invención proporciona el plásmido descrito anteriormente adaptado para la expresión en una célula de mamífero que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 de mamífero para permitir su expresión.
Esta invención proporciona un plásmido que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 humano para permitir su expresión, denominado pcEXV-hY5 (Nº de Acceso de la ATCC 75943).
Este plásmido (pcEXV-hY5) se depositó el 4 de noviembre de 1994 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibió el Nº de Acceso de la ATCC 75943.
Esta invención proporciona un plásmido que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula de mamífero, unidos operativamente al ADN que codifica el receptor Y5 de rata para permitir su expresión, denominado pcEXV-rY5 (Nº de Acceso de la ATCC 75944).
Este plásmido (pcEXV-rY5) se depositó el 4 de noviembre de 1994 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 75944. Esta invención proporciona un plásmido denominado Y5-bd-5 (Nº de Acceso de la ATCC _____________). Esta invención también proporciona un plásmido denominado Y5-bd-8 (Nº de Acceso de la ATCC _______________). Estos plásmidos se depositaron el 1 de diciembre de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibieron los Nº de Acceso de la ATCC ______________ y _______________, respectivamente.
Esta invención proporciona un baculovirus denominado hY5-BB3 (Nº de Acceso de la ATCC ______________). Este baculovirus se depositó el 15 de noviembre de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibió el Nº de Acceso de la ATCC ______________).
Esta invención proporciona una célula de mamífero que comprende el plásmido o el vector descrito anteriormente. En una realización, la célula de mamífero es una célula COS-7.
En otra realización, la célula de mamífero es una célula 293 de riñón embrionario humano denominada 293-rY5-14 (Nº de Acceso de la ATCC CRL 11757).
Esta célula (293-rY5-14) se depositó el 4 de noviembre de 1994, en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 11757.
En otra realización, la célula de mamífero es un fibroblasto de ratón (tk-), que contiene el plásmido pcEXV-hY5 y se denomina L-hY5-7 (Nº de Acceso de la ATCC CRL-11995). En otra realización, la célula de mamífero es una célula NIH-3T3 embrionaria de ratón que contiene el plásmido pcEXV-hY5 y se denomina N-hY5-8 (Nº de Acceso de la ATCC CRL-11994). Estas células se depositaron el 15 de noviembre de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, según las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patentes y recibieron el Nº de Acceso de la ATCC CRL-11995 y CRL-11994, respectivamente.
Esta invención proporciona una sonda de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos, capaz de hibridar específicamente con una única secuencia incluida dentro de la secuencia de un ácido nucleico que codifica un receptor Y5. En una realización, el ácido nucleico es ADN.
Este ácido nucleico producido puede ser ADN o ARN. Como se usa en este documento, la expresión "hibridar específicamente" significa la capacidad de un ácido nucleico para reconocer una secuencia de ácido nucleico complementaria a la suya propia y para formar segmentos de doble hélice mediante enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarios.
Este ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos capaz hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica los receptores Y5 humanos puede usarse como una sonda. La tecnología de la sonda de ácido nucleico es bien conocida para los especialistas en la técnica que apreciarán fácilmente que tales sondas pueden variar en gran medida en longitud y que pueden marcarse con un marcador detectable, tal como un radioisótopo o un colorante fluorescente, para facilitar la detección de la sonda. Las sondas de ADN pueden producirse por inserción de un ADN que codifica el receptor Y5 en vectores adecuados, tales como plásmidos o bacteriófagos, seguido de la transformación de células hospedadoras bacterianas adecuadas con dicho ADN, la replicación en las células hospedadoras bacterianas transformadas y la recogida de las sondas de ADN, usando métodos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, las sondas pueden generarse químicamente en sintetizadores de ADN.
Las sondas de ARN pueden generarse insertando el ADN que codifica el receptor Y5 cadena abajo de un promotor de bacteriófago tal como T3, T7 o SP6. Pueden producirse grandes cantidades de sonda de ARN incubando los nucleótidos marcados con el fragmento linealizado que contiene un promotor cadena arriba en presencia de la ARN polimerasa apropiada.
Esta invención también proporciona un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos capaz de hibridar específicamente con una secuencia de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico de mamífero que codifica un receptor Y5. Este ácido nucleico puede ser ADN o ARN.
Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con un ARNm que codifica un receptor Y5 para prevenir la traducción del ARNm.
Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con el ADN genómico de un receptor Y5.
Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido del receptor Y5 que comprende análogos químicos de nucleótidos.
Esta invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un receptor Y5. Esta invención también proporciona un anticuerpo capaz de inhibir competitivamente la unión a un receptor Y5 del anticuerpo descrito anteriormente. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se dirige a un epítopo de un receptor Y5 humano presente en la superficie de una célula de expresión del receptor Y5.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona la composición farmacéutica descrita anteriormente que comprende una cantidad del anticuerpo eficaz para bloquear la unión de un ligando al receptor Y5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en este documento, "vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, solución salina tamponada con fosfato, solución salina fisiológica, agua y emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua.
Se producen sistemas de modelos animales que esclarecen el papel fisiológico y conductual del receptor Y5 creando animales transgénicos en los que la actividad del receptor Y5 está aumentada o disminuida, o la secuencia de aminoácidos del receptor Y5 expresado está alterada, por una diversidad de técnicas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen, pero sin limitación: 1) inserción de versiones normales o mutantes de ADN que codifica un receptor Y5, por microinyección, electroporación, transfección retroviral u otros medios bien conocidos para los especialistas en la técnica, en embriones fertilizados apropiados para producir un animal transgénico, o 2) recombinación homóloga de versiones mutantes o normales, humanas o animales, de estos genes con el locus del gen nativo en animales transgénicos para alterar la regulación de la expresión o la estructura de estas secuencias del receptor Y5. La técnica de recombinación homóloga es bien conocida en la técnica. Reemplaza el gen nativo por el gen insertado y de esta forma es útil para producir un animal que no puede expresar receptores Y5 nativos pero que expresa, por ejemplo, un receptor Y5 mutante insertado, que ha reemplazado al receptor Y5 nativo en el genoma del animal por recombinación, obteniéndose una infraexpresión del transportador. La microinyección añade genes al genoma, pero no los retira, y de esta forma es útil para producir un animal que exprese sus propios receptores Y5 y receptores Y5 añadidos, obteniéndose una sobreexpresión de los receptores Y5.
Un medio disponible para producir un animal transgénico, siendo un ejemplo un ratón, es el siguiente: se aparean ratones hembra y los óvulos fertilizados resultantes se extraen de sus oviductos por disección. Los óvulos se almacenan en un medio apropiado tal como medio M2. Se purifica ADN o ADNc que codifica un receptor Y5 a partir de un vector por métodos bien conocidos en la técnica. Pueden fusionarse promotores inducibles con la región codificante del ADN para proporcionar un medio experimental para regular la expresión del transgen. Como alternativa o además, pueden fusionarse elementos reguladores con especificidad de tejido con la región codificante para permitir la expresión del transgen en un tejido específico. El ADN, en una solución tamponada de forma apropiada, se pone en una aguja de microinyección (que puede fabricarse a partir de un tubo capilar usando un extractor de pipeta) y el óvulo a inyectar se pone en un portaobjetos con una depresión. La aguja se inserta en el pronúcleo del óvulo, y se inyecta la solución de ADN. Después, el óvulo inyectado se transfiere al oviducto de un ratón con seudoembarazo (un ratón estimulado con las hormonas apropiadas para mantener un embarazo pero que en realidad no está embarazado), donde avanza hasta el útero, se implanta y se desarrolla completamente. Como se ha indicado anteriormente, la microinyección no es el único método para insertar ADN en la célula huevo, y en este documento se usa únicamente con fines ilustrativos.
Esta invención también proporciona un método para determinar si un compuesto químico se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o la preparación de membrana con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la unión, y detectar la unión específica del compuesto químico al receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso que implica una unión competitiva para identificar un compuesto químico que se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana tanto con el compuesto químico como con un segundo compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5, y sólo en el caso del segundo compuesto químico, en condiciones adecuadas para la unión de compuestos, y detectar la unión específica del compuesto químico al receptor Y5, indicando una disminución en la unión del segundo compuesto químico al receptor Y5 en presencia del compuesto químico que el compuesto químico se une al receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica el receptor Y5 con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos a tal receptor, detectar la presencia de cualquiera de estos ligandos unidos específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando se une específicamente al receptor Y5 humano, teniendo tal receptor Y5 substancialmente la misma secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 6.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica el receptor Y5 con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos a tal receptor, detectar la presencia de cualquiera de tales ligandos unidos específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando se une específicamente al receptor Y5, caracterizándose tal receptor Y5 por una secuencia de aminoácidos en la región transmembrana que tiene una homología del 60% o superior con la secuencia de aminoácidos en la región transmembrana del receptor Y5 mostrada en la figura 6.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos a tal receptor, detectar la presencia del ligando unido específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando se une específicamente al receptor Y5.
En realizaciones separadas de los métodos descritos anteriormente, el receptor Y5 puede ser un receptor Y5 humano, un receptor Y5 de rata o un receptor Y5 canino.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos al receptor Y5 humano, detectar la presencia del ligando unido específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando puede unirse específicamente al receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos al receptor Y5, detectar la presencia del ligando unido específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando puede unirse específicamente al receptor Y5, teniendo tal receptor Y5 substancialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 6.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede unirse específicamente a un receptor Y5, que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos al receptor Y5, detectar la presencia del ligando unido específicamente al receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando puede unirse específicamente al receptor Y5, caracterizándose tal receptor Y5 por una secuencia de aminoácidos en la región transmembrana que tiene una homología del 60% o superior con la secuencia de aminoácidos en la región transmembrana del receptor Y5 mostrada en la figura 6.
En realizaciones separadas de los métodos descritos anteriormente, el receptor Y5 puede ser un receptor Y5 humano, un receptor Y5 de rata, o un receptor Y5 canino. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el ligando no se conoce previamente.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico es un agonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar un aumento en la actividad del receptor Y5, determinando de esta manera si el compuesto químico es un agonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente y activa un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia y en ausencia del compuesto químico, indicando un cambio en la respuesta del segundo mensajero en presencia del compuesto químico que el compuesto químico activa el receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un agonista del receptor Y5 que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar un aumento en la actividad del receptor Y5, determinando de esta manera si el ligando es un agonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 con el ligando en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5, detectar una disminución en la actividad del receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando es un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto un célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 con el ligando en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, detectar una disminución en la actividad del receptor Y5 y determinar de esta manera si el ligando es un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un antagonista del receptor Y5, que comprende preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con y que expresan ADN que codifica el receptor Y5, aislar una fracción de membrana a partir del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY, en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar una disminución en la actividad del receptor Y5, determinando de esta manera si el ligando es un antagonista del receptor Y5.
En realizaciones separadas de los métodos descritos anteriormente, el receptor Y5 es un receptor Y5 humano, un receptor Y5 de rata o un receptor Y5 canino.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, la célula no es de origen neuronal. En otra realización, la célula no neuronal es un célula COS-7, una célula 293 de riñón embrionario humano, una célula NIH-3T3 o una célula LM(tk-).
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el ligando no se conoce previamente.
Esta invención proporciona un agonista del receptor Y5 detectado por el método descrito anteriormente. Esta invención proporciona un antagonista del receptor Y5 detectado por el método descrito anteriormente.
Esta invención proporciona un método para seleccionar una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen a un receptor Y5 para identificar un compuesto que se una específicamente al receptor Y5, que comprende (a) poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica el receptor Y5 con un compuesto que se sabe que se une específicamente al receptor Y5; (b) poner en contacto la preparación de la etapa (a) con la pluralidad de compuestos que no se sabe si se unen específicamente al receptor Y5 en condiciones que permitan la unión de los compuestos que se sabe que se unen al receptor Y5; (c) determinar si la unión del compuesto que se sabe que se une al receptor Y5 se reduce en presencia de los compuestos, con respecto a la unión del compuesto en ausencia de la pluralidad de compuestos; y, si es así, (d) determinar por separado la unión al receptor Y5 de cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos, para identificar de esta manera el compuesto que se une específicamente al receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso que implica una unión competitiva para identificar un compuesto químico que se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana tanto con un compuesto químico que se sabe que se une específicamente al receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen específicamente al receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5, en condiciones adecuadas para la unión de compuestos, detectar la unión específica de la pluralidad de compuestos químicos, indicando una disminución en la unión del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5 en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une al receptor Y5, y detectar por separado la unión de cada compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos al receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se una específicamente y activa un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con un pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen y activan el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia y en ausencia de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio en la respuesta del segundo mensajero en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico de la pluralidad de compuestos químicos activa el receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido la pluralidad de compuestos se une y activa el receptor Y5.
En una realización, la respuesta del segundo mensajero comprende la actividad adenilato ciclasa, y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es un disminución de la actividad adenilato ciclasa. En otra realización, la respuesta del segundo mensajero comprende la concentración de calcio intracelular, y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es un aumento de la concentración de calcio intracelular.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras o preparaciones de membrana con el compuesto químico en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar una disminución en la actividad del receptor Y5, para determinar de esta manera si el compuesto químico es un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana tanto con el compuesto químico como con el segundo compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, y sólo en el caso del segundo compuesto químico, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de únicamente el segundo compuesto químico y en presencia tanto del segundo compuesto químico como del compuesto químico, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico que el compuesto químico inhibe la activación del receptor Y5.
Esta invención proporciona un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras o preparaciones de membrana, tanto con un compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos que no se sabe si inhiben la activación del receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos con respecto a la presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos inhibe la activación del receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une específicamente e inhibe la activación del receptor Y5.
En realizaciones separadas del proceso descrito anteriormente, el receptor Y5 es un receptor Y5 humano, un receptor Y5 de rata o un receptor Y5 canino. En una realización, la célula es una célula de mamífero. En otra realización, la célula no es de origen neuronal. En otra realización, la célula es una célula COS-7, una célula 293 de riñón embrionario humano, una célula LM (tk-) o una célula MIH-3T3.
En realizaciones separadas del proceso descrito anteriormente, la respuesta del segundo mensajero comprende la actividad adenilato ciclasa, y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una reducción más pequeña del nivel de la actividad adenilato ciclasa en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y de la pluralidad de compuestos químicos con respecto a la presencia de únicamente el segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5.
En otra realización, la respuesta del segundo mensajero comprende la concentración de calcio intracelular y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una disminución más pequeña de la concentración de calcio intracelular en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y la pluralidad de compuestos químicos, con respecto a la presencia de únicamente el segundo compuesto químico o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que se unan específicamente a un receptor Y5 humano en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 humano con una pluralidad de fármacos en condiciones que permitan la unión de fármacos al receptor Y5 humano, determinar los fármacos que se unen específicamente a la célula transfectada, e identificar de esta forma los fármacos que se unen específicamente al receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúan como agonistas de un receptor Y5, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 con una pluralidad de fármacos en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5, determinar los fármacos que activan tal receptor en la célula e identificar de esta forma los fármacos que actúan como agonistas del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúan como agonistas de un receptor Y5 humano, que comprende poner en contacto una célula transfectada con y que expresa ADN que codifica un receptor Y5 humano con un pluralidad de fármacos en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5 humano, determinar los fármacos que activan tal receptor en la célula, e identificar de esta manera los fármacos que actúan como agonistas del receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúan como antagonistas del receptor Y5, que comprende poner en contacto células transfectadas con y que expresan ADN que codifica un receptor Y5 con una pluralidad de fármacos en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5, determinar los fármacos que inhiben la activación del receptor en la célula de mamífero e identificar de esta manera los fármacos que actúan como antagonistas del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método de selección de fármacos para identificar fármacos que actúan como antagonistas del receptor Y5 humano, que comprende poner en contacto células transfectadas con y que expresan ADN que codifica un receptor Y5 humano con un pluralidad de fármacos en presencia de un agonista del receptor Y5 humano conocido, tal como PYY o NPY, en condiciones que permitan la activación de una respuesta funcional del receptor Y5 humano, determinar los fármacos que inhiben la activación del receptor en la célula de mamífero e identificar de esta manera los fármacos que actúan como antagonistas del receptor Y5 humano. En una realización, la célula no es de origen neuronal. En otra realización, la célula es una célula COS-7, una célula 293 de riñón embrionario humano, una célula LM(tk-) o una célula NIH-3T3.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un fármaco identificado por el método descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta invención proporciona un método para detectar la expresión del receptor Y5 detectando la presencia de ARNm que codifica el receptor Y5, que comprende obtener ARNm total a partir de la célula y poner en contacto el ARNm obtenido de esta forma con la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente en condiciones de hibridación, detectar la presencia del ARNm hibridado con la sonda y detectar de esta manera la expresión del receptor Y5 por la célula.
Esta invención proporciona un método para tratar una anormalidad en un sujeto, donde la anormalidad se alivia por la inhibición de un receptor Y5, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente eficaz para inhibir el receptor Y5 en el sujeto.
Esta invención proporciona un método para tratar una anormalidad en un sujeto, donde la anormalidad se alivia por la activación de un receptor Y5, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente eficaz para activar el receptor Y5 en el sujeto.
Esta invención proporciona un método para tratar una anormalidad en un sujeto, donde la anormalidad se alivia por la inhibición de un receptor Y5, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para tratar una anormalidad en un sujeto, donde la anormalidad se alivia por la activación de un receptor Y5, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agonista del receptor Y5. En otra realización, la situación anormal es anorexia. En una realización separada, la situación anormal es un trastorno sexual/reproductor. En otra realización, la situación anormal es depresión. En otra realización, la situación anormal es ansiedad.
En una realización, la situación anormal es úlcera gástrica. En otra realización, la situación anormal es pérdida de memoria. En otra realización, la situación anormal es migraña. En otra realización, la situación anormal es dolor. En otra realización, la situación anormal es un ataque epiléptico. En otra realización, la situación anormal es hipertensión. En otra realización, la situación anormal es una hemorragia cerebral. En otra realización, la situación anormal es un choque. En otra realización, la situación anormal es una insuficiencia cardíaca congestiva. En otra realización, la situación anormal es un trastorno del sueño. En otra realización, la situación anormal es congestión nasal. En otra realización, la situación anormal es una diarrea.
Esta invención proporciona un método para tratar la obesidad en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para tratar la anorexia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para tratar la bulimia nerviosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista del receptor Y5.
Esta invención proporciona un método para inducir el apetito en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agonista del receptor Y5. En una realización, el sujeto es un vertebrado. En otra realización, el sujeto es un ser humano.
Esta invención proporciona un método para aumentar el consumo de un producto alimentario por parte de un sujeto, que comprende una composición del producto alimentario y una cantidad eficaz de un agonista del receptor Y5. En una realización, el sujeto es un vertebrado. En otra realización, el sujeto es un ser humano.
Esta invención proporciona un método para tratar anormalidades que se alivian por medio de la reducción de la actividad de un receptor Y5 humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición farmacéutica descrita anteriormente eficaz para reducir la actividad del receptor Y5 humano y aliviar de esta manera las anormalidades debidas a un exceso de actividad de un receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para detectar la presencia de un receptor Y5 humano en la superficie de una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo capaz de unirse al receptor Y5 humano en condiciones que permitan la unión del anticuerpo al receptor, detectar la presencia del anticuerpo unido a la célula, y detectar de esta manera la presencia de un receptor Y5 humano en la superficie de la célula.
Esta invención proporciona un método para determinar los efectos fisiológicos de niveles variables de actividad de un receptor Y5 humano, que comprende producir un mamífero no humano transgénico cuyos niveles de actividad del receptor Y5 humano varíen por medio del uso de un promotor inducible que regula la expresión del receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para determinar los efectos fisiológicos de niveles variables de actividad de un receptor Y5 humano, que comprende producir un panel de mamíferos no humanos transgénicos de los que cada uno exprese una cantidad diferente del receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para identificar una substancia capaz de aliviar las anormalidades debidas a un exceso de actividad de un receptor Y5 humano, que comprende administrar una substancia a los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente, y determinar si la substancia alivia las anormalidades físicas y de comportamiento presentadas por el mamífero no humano transgénico como resultado de un exceso de actividad de un receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para identificar una substancia capaz de aliviar las anormalidades debidas a una actividad insuficiente de un receptor Y5 humano, que comprende administrar la substancia a los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente y determinar si la substancia alivia las anormalidades físicas y de comportamiento presentadas por el mamífero no humano transgénico como resultado de la actividad insuficiente de un receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para tratar las anormalidades debidas a una actividad insuficiente de un receptor Y5 humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición farmacéutica descrita anteriormente eficaz para aliviar las anormalidades debidas a una actividad insuficiente de un receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para diagnosticar una predisposición a un trastorno asociado con la actividad de un alelo específico del receptor Y5 humano, que comprende:
a. obtener ADN de sujetos que padecen el trastorno; realizar una digestión de restricción del ADN con un panel de enzimas de restricción; c. separar electroforéticamente los fragmentos de ADN resultantes en un gel de clasificación por tamaños; d. poner en contacto el gel resultante con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con un ADN que codifica un receptor Y5 humano y marcado con un marcador detectable;
e. detectar las bandas marcadas que se han hibridado con el ADN que codifica un receptor Y5 humano marcado con un marcador detectable para crear un modelo de banda único específico para el ADN de sujetos que padecen el trastorno; f. preparar el ADN obtenido para diagnóstico por medio de las etapas a-e; y g. comparar el modelo de banda única específico para el ADN de sujetos que padecen el trastorno de la etapa e y el ADN obtenido para diagnóstico de la etapa f para determinar si los modelos son iguales o diferentes y para diagnosticar de esta forma la predisposición al trastorno si los modelos son iguales. En una realización, se diagnostica un trastorno asociado con la actividad de un alelo específico del receptor Y5 humano.
Esta invención proporciona un método para preparar un receptor Y5 purificado que comprende: a. poner la célula hospedadora en condiciones adecuadas que permitan la producción del receptor Y5; b. recuperar el receptor producido de esta forma por las células hospedadoras; y c. purificar el receptor recuperado de esta forma.
Esta invención proporciona un método para preparar el receptor Y5 humano, de rata o canino purificado que comprende: a. construir un vector adaptado para la expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula unidos operativamente al ácido nucleico que codifica el receptor Y5 humano, de rata o canino para permitir su expresión, donde la célula se selecciona entre el grupo compuesto por células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero; b. insertar el vector de la etapa a en una célula hospedadora adecuada; c. incubar las células de la etapa b en condiciones que permitan la expresión del receptor Y5 humano, de rata o canino; d. recuperar el receptor producido de esta forma; y e. purificar el receptor recuperado de esta forma, preparando de esta manera un receptor Y5 humano, de rata o canino.
Esta invención se entenderá mejor tras la lectura de la sección de Detalles Experimentales que se expone a continuación. Sin embargo, un especialista en la técnica apreciará fácilmente que los métodos específicos y los resultados discutidos son simplemente ilustrativos de la invención como se describe con más detalle en las reivindicaciones que se presentan más adelante.
Detalles experimentales Materiales y métodos Clonación de ADNc
Se preparó ARN total por una modificación del método de tiocianato de guanidina (Kingston, 1987), a partir de 5 gramos de hipotálamo de rata (Rockland, Gilbertsville, PA). Se purificó ARN poli A^{+} con un kit FastTrack (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Se sintetizó ADN bicatenario (ds) a partir de 7 \mug de ARN poli A^{+} de acuerdo con Gubler y Hoffman (Gubler y Hoffman, 1983), con la excepción de que en la síntesis de la segunda cadena de ADNc se omitió la ligasa. El ADNc DS resultante se unió a adaptadores BstxI/EcoRI (Invitrogen Corp.), el exceso de adaptadores se retiró por cromatografía en Sephacryl 500 HR (Pharmacia-LKB) y el tamaño del ADNc ds se seleccionó en una columna de HPLC Gen-Pak Fax (Millipore Corp. Milford, MA). Se unieron fracciones de alto peso molecular a pEXJ.BS (un vector de expresión de clonación de ADNc derivado de pcEXV-3; Okayama y Berg, 1983; Miller y Germain, 1986) cortado con BstxI como se describe por Aruffo y Seed (Aruffo y Seed, 1987). El ADN ligado se introdujo por electroporación en E. Coli MC 1061 F^{+} (Gene Pulser, Biorad). Pudo generarse un total de 3,4 x 10^{6} clones independientes con un tamaño medio del inserto de 2,7 kb. La biblioteca se cultivó en placas Petri (selección con ampicilina) en grupos de 6,9 a 8,2 x 10^{3} clones independientes. Después de 18 horas de amplificación, se rasparon las bacterias de cada grupo, se resuspendieron en 4 ml de medio LB y se procesaron 1,5 ml para la purificación del plásmido con un kit de plásmido QIAprep-8 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Se almacenaron alícuotas de 1 ml de cada grupo bacteriano a -85ºC en glicerol al 20%.
Aislamiento de un clon de ADNc que codifica un receptor de NPY5 hipotalámico de rata atípico
Se utilizó ADN de grupos de \approx7500 clones independientes para transfectar células COS-7 por una modificación del procedimiento de DEAE-dextrano (Warden y Thorne, 1968). Las células COS-7 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternero fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM (DMEM-C) a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las células se sembraron un día antes de la transfección a una densidad de 30.000 células/cm^{2} en portaobjetos de cámara Lab-Tek (1 cámara, portaobjetos Permanox de Nunc. Inc. Naperville, IL). Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con PBS, se añadieron 735 \mul de cóctel de transfección que contenía 1/10 del ADN de cada grupo y DEAE-dextrano (500 \mul/ml) en medio sin suero Opti-MEM I (Gibco®BRL Life Technologies Inc. Grand Island, NY). Después de una incubación durante 30 minutos a 37ºC, se añadieron 3 ml de cloroquina (80 \muM en DMEM-C) y las células se incubaron durante 2,5 horas más a 37ºC. Se aspiró el medio de cada cámara y se añadieron 2 ml de DMSO al 10% en DMEM-C. Después de 2,5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se aspiró el medio, cada cámara se lavó una vez con 2 ml de PBS, las células se incubaron durante 48 horas en DMEM-C y se realizó el ensayo de unión en los portaobjetos. Después de lavar una vez con PBS, los grupos positivos se identificaron incubando las células con una concentración 1 nM (3 x 10^{6} cpm por portaobjetos) de [^{125}I]-PYY porcino (NEN; SA = 2200Ci/mmol) en Hepes-NaOH 20 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1,26 mM, MgSO_{4} 0,81 mM, KH_{2}PO_{4} 0,44 mM, KCl 5,4, NaCl 10 mM, BSA al 1% y bacitracina al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Después de 6 lavados (de tres segundos cada uno) en tampón de unión sin ligando, las monocapas se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en PBS durante 5 minutos, se lavaron dos veces durante 2 minutos en PBS, se deshidrataron en baños de etanol durante dos minutos cada uno (70, 80, 95, 100%) y se secaron al aire. Después, los portaobjetos se sumergieron en fotoemulsión al 100% (tipo Kodak NTB2) a 42ºC y se expusieron a la obscuridad durante 48 horas a 4ºC en cajas a prueba de luz que contenían drierita. Los portaobjetos se revelaron durante 3 minutos en un revelador Kodak D19 (32 g/l de agua), se aclararon en agua, se fijaron en un fijador Kodak durante 5 minutos, se aclararon en agua, se secaron al aire y se montaron con Aqua-Mount (Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA). Los portaobjetos se seleccionaron a una amplificación total de 25 aumentos. Se aisló un solo clon, CG-18, por selección de SIB como se describe (Mc Cormick, 1987). El ADN-DS se secuenció con un kit Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) de acuerdo con el fabricante. El análisis de la secuencia de nucleótidos y de péptidos se realizó con programas del GCG (Genetics Computer group, Madison, WI).
Aislamiento del homólogo de Y5 humano
Usando cebadores oligonucleotídicos de rata en TM3 (cebador con sentido; posición 484-509 en la fig. 1A) y en TM 6 (cebador anti-sentido; posición 1219-1243 en la fig. 3A), los solicitantes seleccionaron una biblioteca de ADNc de hipocampo humano usando la reacción en cadena de la polimerasa. 1 \mul (4 x 10^{6} bacterias) de cada uno de los 450 grupos amplificados que contenían cada uno \approx 5000 clones independientes y que representaban un total de 2,2 x 10^{6}, se sometió directamente a 40 ciclos de PCR y los productos resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Uno de los tres grupos positivos se analizó adicionalmente y mediante selección sib se aisló y se caracterizó un solo clon de ADNc. Este ADNc se convirtió en un ADN de longitud completa y estaba en la orientación correcta para la expresión. El ADN-DS se secuenció con un kit Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) de acuerdo con el fabricante.
Aislamiento del homólogo de Y5 canino
Se usó una alineación de las secuencias de nucleótidos codificantes de los receptores Y5 humano y de rata para sintetizar un par de cebadores de PCR. Se eligió una región cadena arriba de TM III conservada en un 100% entre el ser humano y la rata para sintetizar el cebador de avance CH 156:
1
Se eligió una región del extremo carboxi del bucle 5-6, inmediatamente cadena arriba de TM6, que también se conserva en un 100% entre las secuencias de rata y humana, para sintetizar el cebador inverso CH153:
2
Los cebadores HC156-CH153 se usaron para amplificar 10 ng de ARN poli (A^{+}) procedente de cerebro de rata que se transcribió de forma inversa usando la transcriptasa inversa SSII (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Se realizó una PCR sobre ADNc monocatenario con la Taq polimerasa (Perkin-Elmer Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) en las siguientes condiciones: 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto durante 40 ciclos. El fragmento de ADN de 798 pb resultante de la PCR se subclonó en pCR Script (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció usando un kit Sequenase (USB, Cleveland, OH) y se denomina YS-bd-5.
3' y 5' RACE (amplificación aleatoria de extremos de ADNc)
Los extremos 3' y 5' que faltaban de las secuencias del receptor Y5 de perro de raza beagle se aislaron mediante 3' y 5' RACE usando un kit de amplificación de ADN Marathon (Clontech, Palo Alto, CA). A partir de la secuencia del fragmento de ADN de perro de raza beagle, obtenido por PCR, descrito anteriormente, se sintetizaron los siguientes cebadores de PCR:
3
4
Las reacciones de 3' y 5' RACE se realizaron en ADNc talámico de perro de raza beagle de acuerdo con las especificaciones del kit, con los cebadores descritos anteriormente. Los productos de ADN obtenidos por PCR resultantes (mancha de 0,7 a 10 kb) se purificaron en un gel de agarosa y se reamplificaron usando los cebadores anidados descritos anteriormente. Las bandas de ADN resultantes se volvieron a purificar en un gel de agarosa y se subclonaron en pCR Script (Stratagene, La Jolla, CA).
Se determinó la secuencia de nucleótidos que corresponde al extremo 3' del ADNc y el plásmido se denominó Y5-bd-8. La secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' se determinará en un futuro próximo. Estas secuencias de nucleótidos después se usarán para sintetizar cebadores exactos contra las regiones de los codones de iniciación y stop, y esos cebadores exactos después se usaran para amplificar ADNc talámico canino para generar un producto de PCR correspondiente a la región codificante de longitud completa del receptor Y5 canino, usando la polimerasa Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN). El producto de ADN obtenido por PCR resultante se subclonará en el vector de expresión pEXJ y se determinará toda la región codificante de la secuencia de nucleótidos de Y5 canino usando un kit Sequenase (USB, Cleveland, OH).
Transferencias de Northern
Se hibridaron en condiciones muy rigurosas transferencias de northern de múltiples tejidos de cerebro humano (transferencias MTN II y III, Clontech, Palo Alto, CA) que llevaban ARNm purificado a partir de diversas áreas del cerebro humano, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
La sonda fue un fragmento de ADN obtenido por PCR de 0,8 kb que correspondía al extremo TM III-carboxi del bucle 5-6 en la región codificante del subtipo del receptor Y5 humano.
Una transferencia de northern de tejido múltiple de rata (transferencia MTN de rata, Clontech, Palo Alto, CA) que llevaba ARNm purificado a partir de diversos tejidos de rata se hibridó en condiciones de alta rigurosidad de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La sonda fue un fragmento de ADN obtenido por PCR de 0,8 kb correspondiente al extremo TM III-carboxi del bucle 5-6 en la región codificante del subtipo de receptor Y5 de rata.
Transferencia de Southern
Se hibridaron en condiciones muy rigurosas transferencias de southern (Geno-Blot, Clontech, Palo Alto, CA) que contenían ADN genómico humano o de rata cortado con cinco enzimas diferentes (8 \mug de ADN por calle), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La sonda era un fragmento de ADN obtenido por PCR de 0,8 kb correspondiente al extremo TM III-carboxi del bucle 5-6 en la región codificante de los subtipos del receptor Y5 humano y de rata.
Producción de Baculovirus Recombinante
Se creó por ingeniería genética un sitio Bam HI directamente 5' con respecto a la metionina de partida del receptor Y5 humano reemplazando los \approx100 pares de bases iniciales de hY5 (es decir, desde la metionina inicial a un sitio EcoRI interno) por dos oligonucleótidos sintéticos solapantes (de \approx 100 bases cada uno), que contenían un sitio 5' Bam HI y un sitio 3' EcoRI. Esto permitió el aislamiento de un fragmento Bam HI/Hind III de \approx 1,5 kb que contenía la región codificante de hY5. Este fragmentó se subclonó en pBlueBacIII^{TM} en los sitios Bam HI/Hind III encontrados en el poliengarce (construcción denominada pBB/hY5). Para generar baculovirus, se utilizaron 0,5 \mug de ADN viral (BaculoGold^{TM}) y 3 \mug de pBB/hY5 para co-transfectar 2 x 10^{6} células Sf9 del insecto Spodoptera frugiperda por el método de co-precipitación con fosfato cálcico, como se indica en Pharmingen (en "Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual"). Las células se incubaron durante 5 días a 27ºC. El sobrenadante de la placa de co-transfección se recogió por centrifugación y el virus recombinante (hY5BB3) se purificó en placas. Los procedimientos para infectar las células con virus, para preparar soluciones madre de virus y para valorar las soluciones madre de virus fueron como se describe en el manual de Pharmingen.
Cultivo celular
Se cultivaron células COS-7 en placas de 150 mm en D-MEM con suplementos (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con suero de ternero al 10%, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con CO_{2} al 5%. Las placas madre de células COS-7 se tripsinizaron y se dividieron 1:6 cada 3-4 días. Se cultivaron células 293 de riñón embrionario humano en placas de 150 mm en D-MEM con suplementos (medio esencial mínimo) con sales y suplementos de Hank (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con suero de ternero al 10%, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con CO_{2} al 5%. Las placas madre de las células 293 se tripsinizaron y se dividieron 1:6 cada 3-4 días. Se cultivaron células LM(tk-) de fibroblastos de ratón en placas de 150 mm en D-MEM con suplementos (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con suero de ternero al 10%, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con CO_{2} al 5%. Las placas madre de las células LM(tk-) se tripsinizaron y se dividieron 1:10 cada 3-4 días.
Las células LM(tk-) transfectadas de forma estable con el receptor Y5 humano pasaron rutinariamente desde una monocapa adherente a una suspensión viable. Las células adherentes se recogieron con tripsina en el punto de confluencia, se resuspendieron en un volumen mínimo de DMEM completo para el recuento celular, y se diluyeron adicionalmente a una concentración de 10^{6} células/ml en medio de suspensión (suero de ternero al 10%, 10X Medio 199 (Gibco) al 10%, NaHCO_{3} 9 mM, glucosa 25 mM, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina y metil celulosa al 0,05%). La suspensión celular se mantuvo en un incubador en agitación a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 24 horas. Las membranas recogidas a partir de células cultivadas de esta manera pueden almacenarse como lotes uniformes y grandes en nitrógeno líquido. Como alternativa, las células pueden devolverse a un cultivo de células adherentes en DMEM completo por distribución en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (0,01 mg/ml) seguido de incubación a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 24 horas. Las células preparadas de esta forma produjeron una respuesta dependiente de NPY sólida y fiable en radioinmunoensayos de AMPc como se describe con más detalle posteriormente en este documento.
Se cultivaron células NIH-3T3 de fibroblastos embrionarios de ratón en placas de 150 mm en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con suplementos (suero de ternero al 10%, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con CO_{2} al 5%. Las placas madre de células NIH-3T3 se tripsinizaron y se dividieron 1:15 cada 3-4 días.
Se cultivaron células Sf9 y Sf21 en monocapas en placas de cultivo de tejidos de 150 mm en medio TMN-FH suplementado con suero de ternero fetal al 10%, a 27ºC, sin CO_{2}. Se cultivaron células de insectos High Five en placas de cultivo de tejidos de 150 ml en medio Ex-cell 400^{TM} suplementado con L-Glutamina, también a 27ºC, sin CO_{2}.
Transfección transitoria
Todos los subtipos de receptores estudiados (Y1 humano y de rata, Y2 humano y de rata, Y4 humano y de rata, Y5 humano y de rata) se utilizaron para transfectar transitoriamente células COS-7 por el método de DEAE-dextrano, usando 1 \mug de ADN/10^{6} células (Cullen, 1987). El receptor Y1 humano se preparó usando métodos conocidos (Larhammar, et al., 1992).
Transfección estable
Los receptores Y1 humano, Y2 humano e Y5 de rata se utilizaron para cotransfectar con un gen resistente a G-418 la línea celular 293 de riñón embrionario humano mediante un método de transfección de fosfato cálcico (Cullen, 1987). Las células transfectadas de forma estable se seleccionaron con G-418. De forma similar, se utilizaron receptores Y4 humano e Y5 humano para transfectar células LM(tk-) de fibroblastos de ratón y células NIH-3T3.
Expresión de otros receptores acoplados a la proteína G Receptores adrenérgicos humanos \alpha_{1}
Para determinar la unión de compuestos a los receptores \alpha_{1} humanos, se usaron líneas celulares LM(tk-) transfectadas de forma estable con los genes que codifican los receptores \alpha_{1a}, \alpha_{1b} y \alpha_{1d}. La nomenclatura que describe los receptores \alpha_{1} se ha cambiado recientemente, de forma que el receptor denominado antiguamente \alpha_{1a} ahora se denomina \alpha_{1d} y el receptor denominado antiguamente \alpha_{1c} ahora se denomina \alpha_{1a} (ref.). Las líneas celulares que expresan estos receptores se depositaron en la ATCC antes del cambio de nomenclatura y reflejan las denominaciones de subtipos asignadas antiguamente a estos receptores. De esta forma, la línea celular que expresa el receptor descrito en este documento como el receptor \alpha_{1a} se depositó en la ATCC el 25 de septiembre de 1992, con el Nº de Acceso de la ATCC CRL 11140, con la designación L-\alpha_{1c}. La línea celular que expresa el receptor descrito en este documento como el receptor \alpha_{1d} se depositó en la ATCC el 25 de septiembre de 1992, con el Nº de Acceso de la ATCC CRL 11138, con la designación L-\alpha_{1A}. La línea celular que expresa el receptor \alpha_{1b} se denomina L-\alpha_{1B}, y se depositó el 25 de septiembre de 1992 con el número de Acceso de la ATCC CRL 11139.
Receptores adrenérgicos humanos \alpha_{2}
Para determinar la unión de compuestos a receptores \alpha_{2} humanos, se usaron líneas de células LM(tk-) transfectadas de forma estable con los genes que codifican los receptores \alpha_{2A}, \alpha_{2B} y \alpha_{2C}. La línea celular que expresa el receptor \alpha_{2A} se denomina L-\alpha_{2A}, y se depositó el 6 de noviembre de 1992, con el Nº de Acceso de la ATCC CRL 11180. La línea celular que expresa el receptor \alpha_{2B} se denomina L-NGC-\alpha_{2B}, y se depositó el 25 de octubre de 1989 con el Nº de Acceso de la ATCC CRL 10275. La línea celular que expresa el receptor \alpha_{2C} se denomina L-\alpha_{2C} y se depositó el 6 de noviembre de 1992 con el Nº de Acceso de la ATCC CRL-11181. Se prepararon lisados celulares como se describe más adelante (véase la Unión de Radioligandos a Suspensiones de Membrana) y se suspendieron en tampón de glicilglicina 25 mM (pH 7,6 a temperatura ambiente). Se realizó un ensayo de unión competitiva en equilibrio usando [^{3}H]rauwolscina (0,5 nM), y la unión no específica se determinó por incubación con fentolamina 10 \muM. El radioligando unido se separó por filtración a través de filtros GF/B usando un recolector de células.
Receptor H_{1} de histamina humano
La secuencia codificante del receptor H_{1} de histamina humano, homólogo al receptor H_{1} bovino, se obtuvo a partir de una biblioteca de ADNc de hipocampo humano, y se clonó en el vector de expresión eucariótico pCEXV-3. El ADN plasmídico para el receptor H_{1} se denomina pcEXV-H1, y se depositó el 6 de noviembre de 1992, con el número de Acceso de la ATCC 75346. Esta construcción se utilizó para transfectar células COS-7 por el método de DEAE-dextrano. Las células se recogieron después de 72 horas y se lisaron por sonicación en Tris-HCl 5 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5. Los lisados celulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC y el sobrenadante se centrifugó a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se suspendió en NaHPO_{4} 37,8 mM, KH_{2}PO_{4} 12,2 mM, pH 7,5. La unión del antagonista de histamina H1 [^{3}H]mepiramina (1 nM, actividad específica: 24,8 Ci/mM) se realizó en un volumen final de 0,25 ml y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. La unión no específica se determinó en presencia de mepiramina 10 \muM. El radioligando unido se separó por filtración a través de filtros GF/B usando un recolector de células.
Receptor H_{2} de histamina humano
La secuencia codificante del receptor H_{2} humano se obtuvo a partir de una biblioteca genómica de placenta humana, y se clonó en el sitio de clonación del vector de expresión eucariótico PCEXV-3. El ADN plasmídico para el receptor H_{2} se denomina pcEXV-H2 y se depositó el 6 de noviembre de 1992 con el Nº de Acceso de la ATCC 75345. Esta construcción se utilizó para transfectar células COS-7 por el método de DEAE-dextrano. Las células se recogieron después de 72 horas y se lisaron por sonicación en Tris-HCl 5 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5. Los lisados celulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC, y el sobrenadante se centrifugó a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se suspendió en NaHPO_{4} 37,8 mM, K_{2}PO_{4} 12,2 mM, pH 7,5. La unión del antagonista de histamina H_{2} [^{3}H]tiotidina (5 nM, actividad específica: 70 Ci/mM) se realizó en un volumen final de 0,25 ml y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. La unión no específica se determinó en presencia de histamina 10 \muM. El radioligando unido se separó por filtración a través de filtros GF/B usando un recolector de células.
Receptores de serotonina humana
Receptores 5HT_{1D\alpha}, 5HT_{1D\beta}, 5HT_{1E}, 5HT_{1F},: se prepararon líneas celulares clonales LM(tk-) transfectadas de forma estable con los genes que codifican cada uno de estos subtipos de receptores 5HT como se ha descrito anteriormente. La línea celular para el receptor 5HT_{1D\alpha}, denominada Ltk-8-30-84 se depositó el 17 de abril de 1990, y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 10421. La célula para el receptor 5HT_{1D\beta}, denominada Ltk-11 se depositó el 17 de abril de 1990 y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 10422. La línea celular para el receptor 5HT_{1E}, denominada 5HT_{1E}-7 se depositó el 6 de noviembre de 1991, y se registró con el Nº de Acceso de la ATCC CRL 10913. La línea celular para el receptor 5HT_{1F}, denominada L-5-HT_{1F}, se depositó el 27 de diciembre de 1991 y recibió el Nº de Acceso de la ATCC 10957. Se prepararon preparaciones de membrana que comprendían estos receptores como se describe más adelante, y se suspendieron en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4 a 37ºC) que contenía MgCl_{2} 10 mM, EDTA 0,2 mM, pargilina 10 \muM y ascorbato al 0,1%. La unión de los compuestos se determinó en ensayos de unión competitiva por incubación durante 30 minutos a 37ºC en presencia de [^{3}H]serotonina 5 nM. La unión no específica se determinó en presencia de serotonina 10 \muM. El radioligando unido se separó por filtración a través de filtros GF/B usando un recolector de células.
Receptor 5HT_{2} humano
La secuencia codificante del receptor 5HT_{2} humano se obtuvo a partir de una biblioteca de ADNc de corteza cerebral humana y se clonó en el sitio de clonación del vector de expresión eucariótico pCEXV-3. Esta construcción se utilizó para transfectar células COS-7 por el método de DEAE-dextrano. Las células se recogieron después de 72 horas y se lisaron por sonicación en Tris-HCl 5 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5. Esta línea celular se depositó en la ATCC el 31 de octubre de 1989, denominada L-NGC-5HT_{2} y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 10287. Los lisados celulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC y el sobrenadante se centrifugo a 30.000 x g durante 20 minutos a 40ºC. El sedimento se suspendió en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,7 a temperatura ambiente) que contenía MgSO_{4} 10 mM, EDTA 0,5 mM y ascorbato al 0,1%. La potencia de los antagonista alfa-1 en los receptores 5HT_{2} se determinó en ensayos de unión competitiva en equilibrio usando [^{3}H]quetanserina (1 nM). La unión no específica se definió por la adición de mianserina 10 \muM. El radioligando unido se separó por filtración a través de filtros GF/B usando un recolector de células.
Receptor 5-HT_{7} humano
Se preparó una línea de células clonales LM(tk-) transfectada de forma estable con el gen que codifica el subtipo de receptor 5HT como se ha descrito anteriormente. La línea celular para el receptor 5HT_{7}, denominada L-5HT_{4B}, se depositó el 20 de octubre de 1992 y recibió el Nº de Acceso de la ATCC CRL 11166.
Receptor D_{3} de dopamina humano
La unión de compuestos al receptor D3 humano se determinó usando preparaciones de membrana procedentes de células COS-7 transfectadas con el gen que codifica el receptor D_{3} humano. El receptor D_{3} de dopamina humano se preparó de acuerdo con métodos conocidos (Sokoloff, P. et al, Nature, 347, 146, 1990, depositado en el EMBL Genbank como X53944). Las células se recogieron después de 72 horas y se lisaron por sonicación en Tris-HCl 5 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5. Los lisados celulares se centrifugaron a 100 rpm durante 5 minutos a 4ºC y el sobrenadante se centrifugó a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se suspendió en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía EDTA 1 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1,5 mM, MgCl_{2} 4 mM y ácido ascórbico al 0,1%. Los lisados celulares se incubaron con [^{3}H]espiperona (2 nM), usando (+)Butaclamol 10 \muM para determinar la unión no específica.
Recolección de membranas
Se recogieron membranas a partir de células COS-7 48 horas después de una transfección transitoria. Las células adherentes se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (NaCl 138 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KCl 2,5 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2} 0,9 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, pH 7,4) y se lisaron por sonicación en tampón de sonicación enfriado con hielo (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,7). Las partículas grandes y los desechos se eliminaron por centrifugación a baja velocidad (200 x g, 5 minutos, 4ºC). Las membranas se recogieron a partir de la fracción del sobrenadante por centrifugación (32.000 x g, 18 minutos, 4ºC). Se lavaron con tampón hipotónico enfriado con hielo, y se recogieron de nuevo por centrifugación (32.000 x g, 18 minutos, 4ºC). El sedimento de membrana final se resuspendió por sonicación en un volumen pequeño de tampón de unión enfriado con hielo ( \sim 1 ml para cada una de las 5 placas: NaCl 10 mM, HEPES 20 mM, KH_{2}PO_{4} 0,22 mM, CaCl_{2} 1,26 mM, MgSO_{4} 0,81 mM, pH 7,4). La concentración de proteínas se midió por el método de Bradford (Bradford, 1976) usando el reactivo de Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como patrón. Las membranas se mantuvieron en hielo durante un período de hasta una hora y se usaron frescas o congeladas inmediatamente y almacenadas en nitrógeno liquido.
De forma similar, se prepararon membranas a partir de células 293, LM(tk-) y NIH-3T3. Para preparar membranas a partir de células infectadas con baculovirus, se cultivaron 2 x 10^{7} células Sf21 en placas de cultivo de tejidos de 150 mm y se infectaron con una solución madre de alta titulación de hY5BB3. Las células se incubaron durante 2-4 días a 27ºC sin CO_{2} antes de la recolección y de la preparación de membranas como se ha descrito anteriormente.
De forma similar, se prepararon membranas a partir de hipotálamo de rata diseccionado. Los hipotálamos congelados se homogeneizaron durante 20 segundos en tampón de sonicación enfriado con hielo con la sonda estrecha de un homogeneizador Virtishear a 1000 rpm (Virtis, Gardiner, NY). Las partículas grandes y los desechos se retiraron por centrifugación (200 x g, 5 minutos, 4ºC) y la fracción de sobrenadante se reservó en hielo. Se extrajeron más membranas del sedimento repitiendo los procedimientos de homogeneización y de centrifugación dos veces más. Las fracciones del sobrenadante se agruparon y se sometieron a centrifugación de alta velocidad (100.000 x g, 20 minutos, 4ºC). El sedimento de membrana final se resuspendió por homogeneización suave en un pequeño volumen de tampón de unión enfriado con hielo (1 ml/gramo de peso húmedo de tejido) y se mantuvo en hielo durante un período de hasta una hora, o se congeló rápidamente y se almacenó en nitrógeno líquido.
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Unión de radioligandos a suspensiones de membrana
Se diluyeron suspensiones de membrana en tampón de unión suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1% para producir una concentración óptima de proteínas de membrana de forma que el ^{125}I-PYY(o un radioligando alternativo tal como ^{125}I-NPY, ^{125}I-PYY_{3-36} o ^{125}I-[Leu^{31}Pro^{31}Pro^{34}]PYY) unido a las membranas en el ensayo fuera menos del 10% del ^{125}I-PYY (o el radioligando alternativo) suministrado en la muestra (100.000 dpm/muestra = 0,08 nM para los ensayos de unión competitiva). También se diluyeron ^{125}I-PYY (o el radioligando alternativo) y competidores peptídicos hasta las concentraciones deseadas en tampón de unión suplementado. Después se prepararon muestras individuales en placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos mezclando ^{125}I-PYY (25 \mul) (o el radioligando alternativo), péptidos de competición o tampón de unión suplementado (25 \mul) y, finalmente, suspensiones de membrana (200 \mul). Las muestras se incubaron en un baño de agua a 30ºC con agitación constante durante 120 minutos. Las incubaciones se terminaron por filtración en filtros Whatman GF/C (pre- recubiertos con polietilenimina al 1% y secados al aire antes del uso), seguido de lavado con 5 ml de tampón de unión enfriado con hielo. Las membranas atrapadas en el filtro se impregnaron con centelleante sólido MultiLex (Wallac, Turku, Finlandia) y se realizó un recuento del ^{125}I en un lector de Beta-Plate de Wallac. La unión no específica se definió por NPY humano 300 nM para todos los receptores excepto los subtipos Y4; se usó PP humano 100 nM para el receptor Y4 humano y PP de rata 100 nM para el receptor Y4 de rata. La unión específica en estudios de transcurso de tiempo y de competición típicamente fue del 80%; la mayor parte de la unión no específica se asoció con el filtro. Los datos de unión se analizaron usando técnicas estadísticas y regresión no lineal disponibles en el paquete GraphPAD Prism (San Diego, CA)
Ensayo funcional: Radioinmunoensayo de AMPc
Se sembraron células transfectadas de forma estable en placas de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia. Para reducir el potencial de desensibilización del receptor, el componente sérico del medio se redujo a un 1,5% durante 4 a 16 horas antes del ensayo. Las células se lavaron en solución salina tamponada de Hank, o HBS, (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, CaCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM y glucosa 10 mM) suplementada con albúmina de suero bovino al 0,1% más teofilina 5 mM y se pre-equilibraron en la misma solución durante 20 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5%. Después, las células se incubaron durante 5 minutos con forskolina 10 \muM y diversas concentraciones de ligandos selectivos para el receptor. El ensayo se terminó por medio de la retirada de HBS y la acidificación de las células con HCl 100 mM. Se extrajo el AMPc intracelular y se cuantificó con una versión modificada de un radioinmunoensayo basado en perlas magnéticas (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). El complejo de antígeno/anticuerpo final se separó del ^{125}I-AMPc libre por filtración al vacío a través de un filtro de PVDF en una placa de microtitulación (Millipore, Bedford, MA). Los filtros se perforaron y se contó el ^{125}I en un contador gamma Packard. Los datos de unión se analizaron usando técnicas estadísticas y de regresión no lineal disponibles en el paquete GraphPAD Prism (San Diego, CA).
Ensayo funcional: Movilización del calcio intracelular
La concentración de calcio libre intracelular se midió por microespectrofluorometría usando el colorante indicador fluorescente Fura-2/AM (ref.). Se sembraron células transfectadas de forma estable en una placa de cultivo de 35 mm que contenía un inserto de cubreobjetos de vidrio. Las células se lavaron con HBS y se cargaron con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante un período de 20 a 40 minutos. Después de lavar con HBS para retirar la solución de Fura-2/AM, las células se equilibraron en HBS durante un período de 10 a 20 minutos. Después, las células se visualizaron con el objetivo de 40 aumentos de un microscopio Leitz Fluovert FS y la emisión de fluorescencia se determinó a 510 nm con longitudes de onda de excitación que alternaban entre 340 nm y 380 nm. Los datos de fluorescencia de partida se convirtieron en concentraciones de calcio usando curvas patrón de concentración de calcio y técnicas de análisis de software.
Preparación de tejidos para estudios neuroanatómicos
Se decapitaron ratas Sprague-Dawley (Charles Rivers) macho y los cerebros se retiraron rápidamente y se congelaron en isopentano. Se cortaron secciones en corona de 11 \mum en un criostato, se montaron descongeladas en portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Antes de la hibridación, los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4%, se trataron con ditiotreitol 5 mM, se acetilaron en trietanolamina 0,1 M que contenía anhídrido acético al 0,25%, se deslipidaron con cloroformo y se deshidrataron en etanoles graduados.
Sondas
Las sondas oligonucleotídicas empleadas para caracterizar la distribución del ARNm del receptor Y5 de NPY de rata fueron complementarias a los nucleótidos 1121 a 1165 en el bucle 5,6 del ARNm del receptor Y5 de rata (fig. 3A). Se sintetizaron sondas oligonucleotídicas de 45 nucleótidos con sentido y anti-sentido en un Sistema de síntesis de ácido nucleico Millipore Expedite 8909. Después, las sondas se liofilizaron, se reconstituyeron en agua estéril y se purificaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12%. Las sondas purificadas se volvieron a reconstituir a una concentración de 100 ng/\mul, y se almacenaron a -20ºC.
Hibridación in situ
Las sondas se marcaron en el extremo 3' con ^{35}S-dATP (1200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) hasta una actividad específica de 10^{9} dpm/\mug usando desoxinucleotidil transferasa terminal (Pharmacia). Las sondas radiomarcadas se purificaron en columnas de cromatografía Biospin 6 (Bio-Rad; Richmond, CA) y se diluyeron en tampón de hibridación a una concentración de 1,5 x 10^{4} cpm/\mul. El tampón de hibridación constaba de formamida al 50%, 4X tampón citrato sódico (1X SSC = NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M), 1X solución de Denhardt (polivinilpirrolidina al 0,2%, Ficoll al 0,2%, albúmina de suero bovino al 0,2%), ditiotreitol 50 mM, 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 0,5 mg/ml de ARNt de levadura y sulfato de dextrano al 10%. Se aplicaron a cada sección cien \mul de la sonda radiomarcada diluida, que después se cubrió con un cubreobjetos de Parafilm. La hibridación se realizó durante una noche en cámaras húmedas a una temperatura de 40 a 55ºC. Al día siguiente, las secciones se lavaron en dos cambios de 2X SSC durante una hora a temperatura ambiente, en 2X SCC durante 30 minutos a 50-60ºC y finalmente en 0,1X SSC durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tejidos se deshidrataron en etanoles graduados y se aplicaron en una película Kodak XAR-5 durante 3 días a 3 semanas a -20ºC, y después se sumergieron en emulsión de autorradiografía Kodak NTB3 diluida 1:1 con glicerol acuoso al 0,2%. Después de la exposición a 4ºC durante 2-8 semanas, los portaobjetos se revelaron en un revelador Kodak D-19, se fijaron y se tiñeron con violeta de cresilo como tinte de contraste.
Controles de hibridación
Los controles para la sonda/hibridación incluían específicamente la hibridación con la sonda con sentido radiomarcada, y el uso de líneas de células transfectadas. En resumen, se transfectaron células COS-7 (véase anteriormente) con ADNc de receptores para los receptores Y1, Y2 (descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/192.288, presentada el 3 de febrero de 1994), Y4 (descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/176.412, presentada el 28 de diciembre de 1993) o Y5, de rata. Como se ha descrito anteriormente, las células transfectadas se trataron e hibridaron con las sondas oligonucleotídicas antisentido y con sentido del receptor Y5 radiomarcadas, se lavaron y se aplicaron a la película durante 1-7 días.
Análisis de señales de hibridación
Las señales de hibridación en las secciones de cerebro de rata se analizaron de la siguiente forma. "Señal de hibridación", como se usa en el presente contexto, indica el número relativo de granos de plata observados sobre las neuronas en un área seleccionada del cerebro de rata. Dos observadores independientes clasificaron la intensidad de la señal de hibridación en un área de cerebro dada como inexistente, baja, moderada o alta. Después, estas evaluaciones se convirtieron en una escala numérica subjetiva como 0, +1, +2 o +3 (véase la tabla 10) y se localizaron en diagramas esquemáticos de secciones de corona del cerebro de rata (véase la fig. 11).
Métodos de síntesis química Compuesto 28 2-(Naftalen-1-ilamino)-3-fenilpropionitrilo
A una solución de 1-naftalenmetilamina (2,9 g, 20 mmol) y bencilaldehído (2,0 g, 17 mmol) en 30 ml de CHCl_{3} y 10 ml de MeOH, se le añadió TMSCN (6,6 ml, 51 mmol) y la solución resultante se agitó durante 12 horas a 25ºC. La mezcla de reacción se concentró al vacío, produciendo un aceite que se sometió a cromatografía en columna (EtOAc, puro) para proporcionar 3,5 g (74%) del producto deseado en forma de un aceite incoloro. El producto se identificó por RMN.
2-(Naftalen-1-il)-3-fenilpropano-1-2-diamina
A una solución del nitrilo (0,5 g, 1,8 mmol) en THF se le añadieron 6,9 ml de LiAlH4 1 N en THF gota a gota y la solución resultante se agitó durante 2 horas. La reacción se interrumpió mediante la adición de algunas piezas de hielo en la solución. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se filtró a través de una capa de Celite. El filtrado orgánico se concentró al vacío para proporcionar un residuo oleoso que se sometió a cromatografía en columna (EtOAc, puro) para proporcionar 0,28 g (57%) del producto deseado en forma de un aceite incoloro. El producto se identificó por RMN.
Estudios en ratas in vivo Ingesta de alimentos en ratas saciadas
Para estas determinaciones, la ingesta de alimentos puede medirse en ratas saciadas normales después de aplicación intracerebroventricular (i.c.v.) de NPY en presencia o ausencia del compuesto de ensayo. Para todos los experimentos se usan ratas Sprague Dawley (Ciba-Geigy AG, Sisseln, Suiza) macho con pesos comprendidos entre 180 g y 220 g. Las ratas se encierran de forma individual en jaulas de acero inoxidable y se mantienen en un ciclo de luz:obscuridad de 11:13 h (la luz se apaga a las 18:00 horas) a una temperatura controlada de 21-23ºC durante todo el tiempo. Se proporcionan agua y alimento (pienso de laboratorio granulado NAFAG, NAFAG, Gossau, Suiza) ad libitum.
A ratas anestesiadas con pentobarbital se les implanta estereotáxicamente una cánula guía de acero inoxidable dirigida al ventrículo lateral derecho. Las coordenadas estereotáxicas, con la barra de incisión fijada a -2,0 mm por debajo de la línea interaural, son: -0,8 mm anterior y +1,3 mm lateral al bregma. La cánula de guía se pone sobre la duramadre. Unas cánulas de inyección extienden las cánulas de guía -3,8 mm ventralmente con respecto la superficie del cráneo. Se deja que los animales se recuperen durante al menos los 4 días posteriores a la operación antes de usarse en los experimentos. La colocación de la cánula se controla después de la operación ensayando en todas las ratas la respuesta de bebida a una inyección intracerebroventricular (i.c.v.) de 50 ng de angiotensina II. En los estudios de alimentación sólo se usan ratas que beben al menos 2,5 ml de agua en los 30 minutos posteriores a la inyección de angiotensina II.
Todas las inyecciones se realizan por la mañana dos horas después de encender la luz. Los péptidos se inyectan en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en un volumen de 5 \mul. ACSF contiene: NaCl 124 mM, KCl 3,75 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, MgSO_{4} 2,0 mM, KH_{2}PO_{4} 0,22 mM, NaHCO_{3} 26 mM y glucosa 10 mM. Se disuelve NPY porcino en líquido cefalorraquídeo artificial (ACS). Para la inyección i.c.v., los compuestos de ensayo se disuelven preferiblemente en DMSO/agua (10%, v/v). El vehículo usado para la administración intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.) u oral (p.o.) de los compuestos es preferiblemente agua, solución fisiológica salina o DMSO/agua (10% v/v), o cremofor/agua (20% v/v), respectivamente.
Los animales que se tratan tanto con compuestos de ensayo como con p-NPY se tratan primero con el compuesto de ensayo. Posteriormente, 10 minutos después de la aplicación i.c.v. del compuesto de ensayo o del vehículo (control), o 30-60 minutos después de la aplicación i.p., s.c. y p.o del compuesto de ensayo o del vehículo, se administran 300 pmol de NPY mediante aplicación intracerebroventricular (i.c.v.).
La ingesta de alimentos puede medirse poniendo gránulos pesados previamente en las jaulas en el momento de la inyección de NPY. Posteriormente se retiran los gránulos de las jaulas en cada punto de tiempo seleccionado y se reemplazan por una nueva serie de gránulos pesados previamente. La ingesta de alimentos de los animales tratados con el compuesto de ensayo puede calcularse como un porcentaje de la ingesta de alimentos de los animales de control, es decir, los animales tratados con vehículo. Como alternativa, la ingesta de alimentos para un grupo de animales sometidos a las mismas condiciones experimentales puede expresarse como la media \pm S.E.M. El análisis estadístico se realiza mediante un análisis de varianza usando el ensayo de Student-Newman-Keuls.
Ingesta de alimento en ratas privadas de alimento
Los experimentos de privación de alimentos se realizan con ratas Sprague- Dawley macho que pesan entre 220 y 250 g. Después de la llegada, los animales se encierran de forma individual durante el período de estudio y se les permite el acceso libre al alimento normal junto con agua corriente. Los animales se mantienen en una sala con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (de 8:00 a.m. a 8:00 p.m de luz) a 24ºC y con la humedad controlada. Después de ponerse en jaulas individuales, las ratas se someten a un período de equilibrio de cuatro días, durante el cual se habitúan a su nuevo ambiente así como a comer una dieta en polvo o granulada (NAFAG, Gossau, Suiza).
Después del período de equilibrio, se retira la comida de los animales durante 24 horas empezando a las 8:00 a.m.. Después del período de ayuno, puede administrarse el compuesto o el vehículo a los animales por vía oral o por inyección intraperitoneal o intravenosa. Después de 10-60 minutos, se devuelve el alimento a los animales y su ingesta de alimentos se controla a diversos períodos de tiempo durante las siguientes 24 horas. La ingesta de alimentos de los animales tratados con el compuesto de ensayo puede calcularse como un porcentaje de la ingesta de alimentos de los animales de control (es decir, los animales tratados con vehículo). Como alternativa, la ingesta de alimentos para un grupo de animales sometidos a las mismas condiciones experimentales puede expresarse como la media \pm S.E.M.
Ingesta de alimentos en ratas Zucker obesas
La eficacia contra la obesidad de los compuestos de acuerdo con la presente invención también podría manifestarse en ratas Zucker obesas, que se conocen en la técnica como un modelo animal de obesidad. Estos estudios se realizan con ratas Zucker obesas macho (fa/fa Harlan CPB, Austerlitz NL) que pesan entre 480 g y 500 g. Los animales se encierran de forma individual en jaulas metabólicas durante el período de estudio y se les permite el acceso libre a un alimento normal en polvo y al agua. Los animales se mantienen en una sala con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luz de 8:00 A.M. a 8:00 P.M.) a 24ºC y con la humedad controlada. Después de ponerse en las jaulas metabólicas, las ratas se someten a un período de equilibrio de 6 días, durante el cual se habitúan a su nuevo medio y a comer una dieta en polvo. Después del período de equilibrio, se determina la ingesta de alimento durante las fases de luz y de oscuridad. Después de un período de control de tres días, los animales se tratan con compuestos de ensayo o con vehículo (preferiblemente agua o solución salina fisiológica o DMSO/agua (10%, v/v) o cremofor/agua (20 v/v). Después se controla la ingesta de alimentos durante los 3 días siguientes para determinar el efecto de la administración del compuesto de ensayo o del vehículo solo. Como en los estudios descritos anteriormente en este documento, la ingesta de alimento en presencia del fármaco puede expresarse como un porcentaje de la ingesta de alimento de los animales tratados con vehículo.
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Materiales
Los medios de cultivo de células y los suplementos procedían de Specialty Media (Lavallette, NJ). Las placas de cultivo de células (placas de microtitulación de 150 mm y de 96 pocillos) procedían de Corning (Corning, NY). Las células de insecto Sf9, Sf21 y High Five, así como el plásmido de transferencia de baculovirus pBlueBacIII^{TM}, se adquirieron en Invitrogen (San Diego, CA). El medio de insectos TMN-FH complementado con suero de ternero fetal al 10%, y el DNA de baculovirus, BaculoGold^{TM}, se obtuvieron en Pharmingen (San Diego, CA). El medio Ex-Cell 400^{TM} con L-Glutamina se adquirió en JRH Scientific. Las placas de microtitulación de 96 pocillos de polipropileno procedían de Co-star (Cambridge, MA). Todos los radioligandos procedían de New England Nuclear (Boston, MA). El NPY disponible en el mercado y los análogos peptídicos relacionados procedían de Bachem California (Torrance, CA) o Peninsula (Belmont, CA); los fragmentos C-terminales de [D-Trp^{32}]NPY y PP se sintetizaron por orden encargo en Chiron Mimotopes Peptide Systems (San Diego, CA). El reactivo Bio-Rad procedía de Bio- Rad (Hercules, CA). La albúmina de suero bovino (sin nada de grasa, A-7511) procedía de Sigma (St. Louis, MO). Todos los demás materiales eran de calidad reactiva.
Resultados experimentales Clonación de ADNc
Para clonar un subtipo del receptor de NPY "atípico" de hipotálamo de rata, los solicitantes usaron una estrategia de clonación de expresión en células COS-7 (Gearing et al., 1989; Kluxen et al., 1992; Kiefer et al., 1992). Se eligió esta estrategia por su sensibilidad extrema, ya que permite la detección de una sola célula "positiva en cuanto al receptor" mediante autorradiografía microscópica directa. Como el receptor "atípico" sólo se ha descrito en estudios sobre el comportamiento alimentario que implican la inyección de NPY y de ligandos relacionados con NPY en el hipotálamo de rata (véase la introducción), los solicitantes primero examinaron su perfil de unión mediante estudios de desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY y ^{125}I-PYY_{3-36} en membranas preparadas a partir de hipotálamo de rata. Los datos de desplazamiento competitivo indican: 1) el PP humano es capaz de desplazar un 20% del ^{125}I-PYY unido con una IC_{50} de 11 nM (fig. 1 y tabla 2). Como puede observarse en la tabla 5, este valor no se ajusta a los clones de Y1, Y2 e Y4 de rata aislados y, por lo tanto, podría corresponder a otro subtipo de receptor de NPY/PYY. 2) [Leu_{31}, Pro_{32}]NPY (un ligando específico de Y1) es capaz de desplazar con alta afinidad (IC_{50} de 0,38) un 27% del ligando ^{125}I-PYY_{3-36} unido (un ligando específico de Y2) (fig. 2 y tabla 2). Estos datos proporcionan los primeros indicios basados en un ensayo de unión de que las membranas hipotalámicas de rata podrían llevar un subtipo de receptor de NPY con una farmacología Y1/Y2 mixta (denominado subtipo "atípico") que se ajusta a la farmacología definida en los estudios sobre el comportamiento alimentario.
Tabla 2
Perfil farmacológico del hipotálamo de rata
Los datos de unión reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY y ^{125}I-PYY_{3-36} en membranas hipotalámicas de rata. Los péptidos se ensayaron a concentraciones que variaban de 0,001 nM a 100 nM a menos que se indique otra cosa. El valor de IC_{50} que corresponde a un desplazamiento del 50%, y el porcentaje de desplazamiento con respecto al producido por NPY humano 300 nM, se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal. Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
TABLA 2
40
Basándose en los datos anteriores, una biblioteca de ADNc hipotalámico de rata de 3 x 10^{6} recombinantes independientes con un tamaño medio de inserto de 2,7 kb se fraccionó en 450 grupos de \approx7500 clones independientes. Todos los grupos se ensayaron en un ensayo de unión con ^{125}I-PYY como se ha descrito previamente (documento de Estados Unidos con Nº de Serie 08/192/288). Siete grupos produjeron células positivas en el ensayo de selección (nº 81, 92, 147, 246, 254, 290, 312). Como los subtipos de receptor Y1, Y2, Y4 e Y5 (por PCR o por análisis de unión) se expresan en el hipotálamo de rata, los solicitantes analizaron el ADN de los grupos positivos por PCR con cebadores específicos de Y1, Y2 e Y4 de rata. Los grupos nº 147, 246, 254 y 312 contenían ADNc que codificaba un receptor Y1, el grupo nº 290 contenía ADNc que codificaba un subtipo de receptor Y2, pero los grupos nº 81 y 92 fueron negativos mediante el análisis de PCR para los receptores Y1, Y2 e Y4 y, por lo tanto, probablemente contenían un ADNc que codificaba un nuevo receptor de NPY hipotalámico de rata (Y5). Los grupos nº 81 y 92 posteriormente contenían un ADNc de receptor de NPY idéntico. El grupo 92 se sometió a selección sib como se describe en el documento de Estados Unidos con Nº de Serie 08/192.288 hasta que se aisló un solo clon (denominado CG-18).
El clon aislado lleva un ADNc de 2,8 kb. Este ADNc contiene una fase de lectura abierta entre los nucleótidos 779 y 2146 que codifica una proteína de 456 aminoácidos. La región 5' no traducida larga podría estar implicada en la regulación de la eficacia de la traducción o en la estabilidad del ARNm. La secuencia flanqueante alrededor del supuesto codón de iniciación no se ajusta a la secuencia consenso de Kozak para una iniciación de la traducción óptima (Kozak, 1989, 1991). El gráfico de hidrofobia presentó siete supuestas regiones transmembrana hidrófobas que hacen que el receptor Y5 hipotalámico de rata sea un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas se muestran en las figuras 3 y 4, respectivamente. Al igual que la mayoría de los receptores acoplados a la proteína G, el receptor Y5 contiene secuencias consenso para la N-glicosilación en el extremo amino (posiciones 21 y 28) implicadas en la expresión adecuada de proteínas de membrana (Kornfeld y Kornfeld, 1985). El receptor Y5 lleva dos restos de cisteína muy conservados en los dos primeros bucles extracelulares que, según se cree, forman un enlace disulfuro que estabiliza la estructura de la proteína funcional (Probst et al, 1992). El receptor Y5 muestra 9 sitios de fosforilación potenciales para la proteína quinasa C en las posiciones 204, 217, 254, 273, 285, 301, 328, 336 y 409; y 2 sitios de fosforilación por proteína quinasa dependientes de AMPc y GMPc en las posiciones 298 y 370. Debe tenerse en cuenta que 8 de estos 11 sitios de fosforilación potenciales se localizan en el tercer bucle intracelular, dos en el segundo bucle intracelular y uno en el extremo carboxi de receptor y, por lo tanto, podrían desempeñar un papel en la regulación de las características funcionales del receptor Y5 (Probst et al, 1992). Además, el receptor Y5 de rata lleva un motivo de cierre de leucina (leucine zipper) en su primer supuesto dominio transmembrana (Landschulz et al, 1988). En el medio del cierre de leucina se encuentra un sitio de fosforilación de tirosina quinasa.
Los estudios de localización (véase más adelante) demuestran que el ARNm de Y5 está presente en varias áreas del hipocampo de la rata. Asumiendo una localización comparable en el cerebro humano, los solicitantes seleccionaron una biblioteca de ADNc de hipocampo humano como se describe en el documento de Estados Unidos con Nº de serie 08/192.288 con cebadores oligonucleotídicos de rata que, como se demostró, producían una banda de ADN del tamaño esperado en una reacción de PCR realizada en ADNc de hipocampo humano (C. Gerald, resultados no publicados). Usando esta estrategia de selección por PCR (Gerald et al, 1994, presentada para publicación), se identificaron tres grupos positivos. Uno de estos grupos se analizó adicionalmente, y se purificó un clon aislado por selección sib. El clon aislado (CG-19) contenía un ADNc de longitud completa clonado en la orientación correcta para la expresión funcional (véase más adelante). En las figuras 5 y 6 se muestran respectivamente la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del receptor Y5 humano. Cuando se compara con el receptor Y5 de rata, la secuencia humana muestra una identidad de nucleótidos del 84,1% (fig. 7A a 7E) y una identidad de aminoácidos del 87,2% (fig. 7F y 7G). La secuencia de la proteína de rata tiene un aminoácido más en el extremo tanto de la cola amino como de la cola carboxi del receptor cuando se compara con la rata. El bucle 5-6 humano tiene un aminoácido más que la rata y muestra múltiples substituciones no conservativas. Aunque los bucles 5-6 muestran cambios significativos entre los homólogos de rata y humano, todos los motivos de la proteína encontrados en el receptor de rata están presentes en el homólogo humano. Todos los supuestos dominios transmembrana y las regiones de bucle extracelulares están muy conservados (fig. 7F y 7G). Por lo tanto, es de esperar que se parezcan mucho tanto los perfiles farmacológicos como las características funcionales de los homólogos del subtipo de receptor Y5 humano y de rata.
Cuando las secuencias del receptor Y5 humano y de rata se compararon con otros subtipos de receptor de NPY o con otros subtipos de receptores acoplados a la proteína G humanos, las identidades globales y de los dominios transmembrana fueron muy bajas, demostrando que los genes del receptor Y5 no están muy relacionados con otros ADNc caracterizados previamente. Incluso entre la familia de receptores de NPY humanos, los miembros Y1, Y2, Y4 e Y5 muestran niveles inusualmente bajos de identidad de aminoácidos (fig. 8A a 8G).
TABLA 3
41
Análisis de transferencia de northern
Usando la sonda de Y5 de rata, las hibridaciones de northern revelan una señal fuerte a 2,7 kb y una banda débil a 8 kb en el cerebro de rata entero. Se observa una señal débil a 2,7 kb en los testículos. No se observó ninguna señal en el corazón, bazo, pulmón, hígado, músculo esquelético y riñón después de tres días de exposición (figura 16A). Esto coincide con el ADNc de 2,7 kb que aislamos mediante clonación de expresión a partir del hipotálamo de rata e indica que nuestro clon de ADNc tiene la longitud completa. La banda de 8 kb observada en el cerebro entero probablemente corresponde a un pre- ARNm no dividido.
Con la sonda de Y5 humano, las hibridaciones de northern (figuras 16B y 16C) mostraron una señal fuerte a 3,5 kb con una banda mucho más débil a 2, 2 y 1,1 kb en el núcleo caudado, putamen y corteza cerebral, una señal media en el lóbulo frontal y la amígdala y una señal débil en el hipocampo, lóbulos occipital y temporal, médula espinal, médula, tálamo, núcleo subtalámico y substancia negra. No pudo detectarse ninguna señal a 3,5 kb en el cerebelo o en el cuerpo calloso después de 48 horas de exposición. Debe tenerse en cuenta que las transferencias MTN II y III de Clontech no llevan ningún ARNm procedente del hipotálamo, substancia gris periaqueductal, colículo superior y rafe.
El análisis de transferencia de southern en ADN genómico humano revela un modelo de bandas único en 4 de los 5 productos de digestión de restricción (figura 17A). Las dos bandas observadas en el producto de digestión de PstI pueden explicarse por la presencia de un sitio PstI en la región codificante del gen de Y5 humano. El análisis de transferencia de southern de rata mostró un modelo de bandas único en los cinco productos de digestión de restricción ensayados (figura 17B). Esos análisis son coherentes con los genomas humano y de rata que contienen una sola copia del gen del receptor Y5.
Homólogo de Y5 canino
La secuencia de nucleótidos canina obtenida hasta ahora (productos de PCR y de 3' RACE) incluyen el receptor Y5 canino desde el primer bucle extracelular inmediatamente cadena arriba de TM III hasta la región 3' no traducida (figura 14). En la región codificante, esta secuencia de nucleótidos presenta una alta identidad tanto con la secuencia humana como con la secuencia de rata (91% y 83,8% respectivamente). La secuencia de aminoácidos deducida de Y5 canino se muestra en la figura 15. Esta secuencia de aminoácidos de nuevo presenta una alta identidad con las secuencias de Y5 tanto humana como de rata (94,6% y 89,5% respectivamente), estando localizados la mayoría de los cambios de aminoácidos en el bucle 5-6. Por lo tanto, es de esperar que el perfil farmacológico del subtipo de receptor Y5 canino sea muy parecido a los perfiles del Y5 humano y de rata.
Estudios de unión
El ADNc para el receptor Y5 hipotalámico de rata se expresó de forma transitoria en células COS-7 para una evaluación farmacológica completa. ^{125}I-PYY se unía específicamente a las membranas de células COS-7 transfectadas de forma transitoria con la construcción del receptor Y5 de rata. El transcurso de tiempo de la unión específica se midió en presencia de ^{125}I-PYY 0,08 nM a 30ºC (fig. 9). La curva de asociación fue monofásica, con una velocidad de asociación observada (K_{obs}) de 0,06 min^{-1} y un t_{1/2} de 11 minutos; la unión en equilibrio se completó en un 99% en 71 minutos y fue estable durante al menos 180 minutos. Todos los ensayos de unión posteriores se realizaron durante 120 minutos a 30ºC. La unión de ^{125}I-PYY a receptores Y5 de rata expresados de forma transitoria fue saturable en un intervalo de concentraciones de radioligando de 0,4 pM a 2,7 nM. Los datos de unión se ajustaron a un modelo de unión de un solo sitio con una K_{d} aparente de 0,29 nM (pK_{d} = 9,54 \pm 0,13, n = 4). Se midió una densidad de receptores entre 5 y 10 pmol/mg de proteína de membrana en membranas que se habían congelado y almacenado en nitrógeno líquido (fig. 10). Las membranas de células transfectadas de forma simulada, cuando se prepararon y se analizaron de la misma forma que las de las células transfectadas con CG-18, presentaron una unión no específica de ^{125}I-PYY (datos no mostrados). Los solicitantes concluyen que los sitios de unión de ^{125}I-PYY observados en las condiciones descritas procedían de la construcción del receptor Y5 de rata.
Un análogo peptídico muy relacionado, ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34}]PYY porcino, también se unía específicamente a membranas de células COS-7 transfectadas de forma transitoria con el ADNc del receptor Y5 de rata. El transcurso de tiempo de la unión específica se midió a temperatura ambiente tanto en tampón de unión convencional ([Na^{+}] = 10 mM) como en tampón de unión isotónico ([Na^{+}] = 138 mM) usando ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34}]PYY 0,08 nM (figura 18). La curva de asociación en [Na^{+}] 10 mM fue monofásica, con una velocidad de asociación observada (K_{obs}) de 0,042 min^{-1} y un t_{1/2} de 17 minutos; la unión de equilibrio se completó en un 99% en 110 minutos y fue estable durante al menos 210 minutos (la unión específica fue máxima a 480 fmol/mg de proteína de membrana). La curva de asociación en [Na^{+}] 138 mM también fue monofásica con un transcurso de tiempo ligeramente menor: (K_{obs}) de 0,029 min^{-1} y un t_{1/2} de 24 min; la unión de equilibrio se completó en un 99% en 160 minutos y fue estable durante al menos 210 minutos (la unión específica fue máxima a 330 fmol/mg de proteína de membrana). Debe tenerse en cuenta que la unión específica se redujo según aumentaba [Na^{+}]; se ha observado un fenómeno similar para otros receptores acoplados a la proteína G y puede reflejar una propiedad general de esta familia de receptores que pueden estar modulados por Na^{+} (Horstman et al., 1990). Se realizaron estudios de unión de saturación con ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34}]PYY en tampón isotónico a temperatura ambiente durante un período de 120 minutos. La unión específica a receptores Y5 de rata expresados de forma transitoria fue saturable en un intervalo de concentraciones de radioligando de 0,6 pM a 1,9 nM. Los datos de unión se ajustaron a un modelo de unión de un solo sitio con una K_{d} aparente de 0,072 nM (pKd = 10,14 + 0,07, n = 2). Se midió una densidad de receptores de 560 \pm 150 pmol/mg en membranas que se habían congelado y almacenado en nitrógeno líquido. El hecho de que ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34}]PYY pueda unirse al receptor Y5 de rata con alta afinidad a temperatura ambiente en tampón isotónico, hace que sea un ligando potencialmente útil para caracterizar el receptor Y5 nativo en tejidos de rata usando técnicas autorradiográficas. Sin embargo, debe tenerse mucho cuidado de usar agentes de enmascaramiento apropiados para bloquear el radiomarcaje potencial de otros receptores tales como receptores Y1 e Y4 (obsérvese en la tabla 5 que Y1 e Y4 de rata se unen al homólogo estructural [Pro^{34}]PYY). Deben reevaluarse los informes publicados previamente de ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34}]PYY como radioligando selectivo para Y1 a la luz de los nuevos datos obtenidos con el receptor Y5 de rata (Dumont, et al., 1995).
El perfil farmacológico del receptor Y5 de rata se estudió primero usando análogos polipeptídicos pancreáticos en ensayos de unión a membrana. El orden jerárquico de afinidad para los compuestos seleccionados se obtuvo a partir del desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY (fig. 11). El receptor Y5 de rata se comparó con receptores Y1, Y2 e Y4 clonados procedentes de ser humano (tabla 4) y de rata (tabla 5), todos expresados de forma transitoria en células COS-7. Un subtipo de receptores ausente de nuestro panel fue el Y3, humano o de rata, ya que aún no se ha identificado ningún modelo adecuado para la selección de radioligandos.
Tabla 4
Perfil farmacológico del receptor Y5 de rata frente a receptores de tipo Y clonados procedentes de humanos
Los datos de unión reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY de membranas de células COS-7 que expresan de forma transitoria el receptor Y5 de rata y clones de subtipo humano. Los péptidos se ensayaron a concentraciones que variaban de 0,001 nM a 1000 nM a menos que se indique otra cosa. Los valores de CI_{50} correspondientes a un desplazamiento del 50% se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores de K_{i} de acuerdo con la ecuación de Cheng-Prusoff. Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
TABLA 4
5
Tabla 5
Perfil farmacológico del receptor Y5 de rata frente a receptores de tipo Y clonados a partir de rata
Los datos de unión reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY en membranas de células COS-7 que expresan de forma transitoria Y5 de rata y clones de subtipos de rata. Los péptidos se ensayaron a concentraciones que variaban de 0,001 nM a 1000 nM. Se determinaron valores de CI_{50} que correspondían a un desplazamiento del 50% por medio de un análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores de K_{i} de acuerdo con la ecuación de Cheng-Prusoff. Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes. Excepción: se ensayaron nuevos péptidos (marcados con un doble asterisco) en uno o más experimentos independientes.
TABLA 5
6
El receptor Y5 de rata poseía un perfil farmacológico único en comparación con los receptores de tipo Y humano y de rata. Presentó una preferencia por análogos estructurales de NPY de rata/humano (K_{i} = 0,68 nM) y PYY de rata/porcino (K_{i} = 0,64 nM) con respecto a la mayoría de los derivados de PP. La alta afinidad por el PP de salmón (K_{i} = 0,31 nM) refleja la analogía entre el PP de salmón y el NPY de rata, que comparten el 81% de su secuencia de aminoácidos y mantienen una identidad en posiciones clave: Tyr^{1}, Gln^{34}, y Tyr^{36}. Los dominios peptídicos N- y C-terminales son aparentemente importantes para el reconocimiento del receptor. La tirosina N-terminal de NPY o PYY podría delecionarse sin una pérdida apreciable en la afinidad de unión (K_{i} = 0,86 nM para NPY_{2-36} de rata/humano), pero una deleción N-terminal adicional anuló esta afinidad (K_{i} = 73 nM para NPY_{13-36} porcino). Este modelo pone el perfil de unión del receptor Y5 en algún sitio entre el del receptor Y2 (receptor que puede soportar una deleción N-terminal extrema) y el del receptor Y1 (receptor que es sensible incluso a una deleción N-terminal de un solo resto). Debe tenerse en cuenta que el receptor Y4 humano puede describirse de forma similar (K_{i} = 0,06 nM para PP humano, 0,06 nM para PP_{2-36} humano y 39 nM para Pp_{13-36} humano). El receptor Y5 se parecía tanto a los receptores Y1 como a los receptores Y4 en su tolerancia a ligandos que contenían Pro^{34} (como en [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY humano, [Pro^{34}]-PYY humano y PP humano). De forma interesante, el receptor Y5 de rata presentó una preferencia por el PP humano (K_{i} = 5,0 nM) con respecto al PP de rata (K_{i} = 180 nM). Este modelo distingue el Y5 de rata del receptor Y4 de rata, que se une tanto al PP humano como al PP de rata con valores de K_{i} < 0,2 nM. La hidrólisis de la amida carboxi terminal para dar el ácido carboxílico libre, como en el ácido libre de NPY, anuló la afinidad de unión por el receptor Y5 de rata (K_{i} = 480 nM). La amida terminal parece ser un requisito estructural común para las interacciones de la familia de polipéptidos pancreáticos/receptor.
Se ha demostrado previamente que varios péptidos estimulan el comportamiento alimentario en ratas, cuando se unen al receptor Y5 de rata con K_{i} \leq 5,0 nM. Éstos incluyen NPY de rata/humano (K_{i} = 0,68 nM), PYY de rata/porcino (K_{i} = 0,64 nM), NPY_{2-36} de rata/humano (K_{1} = 0,86 nM), [Leu^{31}, Pro^{34.}]NPY de rata/humano (K_{i} = 1,0 nM] y PP humano (K_{i} = 5,0 nM). Inversamente, los péptidos que eran relativamente menos eficaces como agentes orexigénicos se unían débilmente a CG-18. Éstos incluyen NPY_{13-36} porcino (K_{i} = 73 nM), C2-NPY porcino (K_{i} = 470 nM) y ácido libre de NPY humano (K_{i} = 480 nM). El orden jerárquico de los valores de K_{i} está de acuerdo con los órdenes jerárquicos de potencia y actividad para la estimulación del comportamiento alimentario cuando los péptidos se inyectan i.c.v o directamente en el hipotálamo de rata (Clark et al., 1984; Stanley et al., 1985; Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992). El receptor Y5 de rata también presentó una afinidad de unión moderada por [D-Trp^{32}]NPY (K_{i} = 53 nM), el péptido modificado que, según se ha informado por Balasubramaniam y colaboradores (1994), regula la alimentación inducida por NPY. Debe destacarse que [D-Trp^{32}]NPY tenía una selectividad \geq 10 veces mayor por CG-18 que por los otros receptores clonados estudiados, tanto si eran humanos como si eran de rata. Estos datos asocian clara y definitivamente el receptor Y5 clonado a la respuesta de alimentación.
El ADNc correspondiente al homólogo Y5 humano aislado a partir de hipocampo humano se expresó de forma transitoria en células COS-7 para realizar estudios de unión a membrana. La unión de ^{125}I-PYY al receptor Y5 humano (CG-19) fue saturable en un intervalo de concentraciones de radioligando de 8 pM a 1,8 nM. Los datos de unión se ajustaron a un modelo de unión de un solo sitio con una K_{d} aparente de 0,10 nM en el primer experimento. Los ensayos repetidos produjeron una K_{d} aparente de 0,18 nM (pK_{d} = 9,76 \pm 0,11, n = 4). Se midió una densidad de receptores máxima de 500 fmol/mg de proteína de membrana en membranas recién preparadas. Como se determina usando análogos peptídicos dentro de la familia de polipéptidos pancreáticos, el perfil farmacológico de Y5 humano tiene un parecido sorprendente con el receptor Y5 de rata (tablas 6 y 7).
Tabla 6
Perfil farmacológico del receptor Y5 de rata frente al receptor Y5 humano, expresado tanto de forma transitoria en células COS-7 como de forma estable en células LM(tk-)
Los datos de unión reflejan el desplazamiento competitivo del radioligando (^{125}I-PYY o ^{125}I-PYY_{3-36} según se indique) en membranas de células COS-7 que expresan de forma transitoria el receptor Y5 de rata y su homólogo humano o de células LM(tk-) que expresan de forma estable el receptor Y5 humano. Los péptidos se ensayaron a concentraciones que variaban de 0,001 nM a 1000 nM. Los valores de CI_{50} correspondientes a un desplazamiento del 50% se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores de K_{i} de acuerdo con la ecuación de Cheng-Prusoff. Los nuevos péptidos están marcados con un doble asterisco.
TABLA 6
7
Tabla 7
Perfil farmacológico del receptor Y5 humano frente a receptores de tipo Y clonados procedentes de ser humano
Los datos de unión reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY en membranas de células COS-7 que expresan de forma transitoria Y5 humano y otros clones de subtipos. Los péptidos se ensayaron a concentraciones que variaban de 0,001 nM a 1000 nM a menos que se indique otra cosa. Los valores de CI_{50} que corresponden a un desplazamiento del 50% se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores de K_{i} de acuerdo con la ecuación de Cheng-Prusoff. Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
TABLA 7
8
Estudios de unión de hY5 expresado en células de insecto
Inicialmente se realizaron ensayos para optimizar la expresión del receptor hY5. Al infectar células Sf9, Sf21 y High Five con virus hY5BB3 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 y al preparar membranas para análisis de unión a las 45 horas después de la infección, observamos intervalos de B_{max} de 417 a 820 fmoles/mg de proteína, estando la máxima expresión de hY5BB3 en las células Sf21. Por lo tanto, nuestra siguiente serie de experimentos usó células Sf21. Después examinamos la multiplicidad óptima de la infección (MOI, la relación entre partículas virales y células) ensayando la MOI de 1, 2, 5 y 10. Los valores de B_{max} fueron \approx1,1-1,2 pmoles/mg de proteína para cualquiera de los MOI, lo que sugiere que el aumento del número de partículas virales por célula ni es perjudicial ni es ventajoso. Como los cálculos de titulación viral son aproximados, usamos MOI = 5 para los experimentos futuros. El último parámetro que ensayamos fueron las horas transcurridas desde la infección para la expresión de la proteína, que variaban de 45 a 96 horas. Descubrimos que la expresión óptima se producía a las 45-73 horas después de la infección. En resumen, hemos creado un baculovirus recombinante hY5 que se une a ^{125}I-PYY con un valor de B_{max} de \approx1,2 pmoles/mg de proteína.
Homólogo de Y5 humano: Expresión transitoria en células de ovario de insecto Sf21 infectadas con baculovirus
Se recogieron células Sf21 infectadas con una construcción de baculovirus Y5 humano como homogeneizados de membrana y se seleccionaron con respecto a la unión específica de ^{125}I-PYY usando un radioligando a una concentración 0,08 nM. La unión específica fue la máxima (500 fmol/mg de proteína de membrana) para la muestra D-2/[4], derivada de células Sf-21. No se observó ninguna unión específica después de la infección con el plásmido de baculovirus solo (datos no mostrados). Si asumimos que la afinidad de unión del ^{125}I-PYY porcino por el receptor Y5 humano es la misma tanto si el sistema de expresión es COS-7 como si es baculovirus/Sf-21 (0,18 nM), la unión específica en la muestra D-2/[4] predice un valor de B_{max} aparente de 1600 fmol/mg de proteína de membrana. Por lo tanto, el receptor Y5 producido en el sistema de expresión baculovirus/Sf21 es tan bueno o mejor que el producido en células COS-7. Concluimos que el baculovirus ofrece una técnica de transfección alternativa susceptible de una gran producción en lotes del receptor Y5 humano.
Sistemas de expresión estables para receptores Y5: Caracterización en ensayos de unión
El ADNc para el receptor Y5 de rata se utilizó para transfectar de forma estable células 293 que se habían preseleccionado con respecto a la ausencia de unión específica a ^{125}I-PYY (datos no mostrados). Después de la cotransfección con el ADNc de Y5 de rata más un gen de resistencia a G-418 y la selección con G-418, se seleccionaron las colonias supervivientes como homogeneizados de membrana con respecto a la unión específica de ^{125}I-PYY usando radioligando a una concentración 0,08 nM. Un clon seleccionado (clon 293 Nº 12) se unió a 65 fmol de ^{125}I-PYY/mg de proteína de membrana y se aisló para estudiarse adicionalmente en ensayos funcionales.
El ADNc para el receptor Y5 humano se utilizó para transfectar de forma estable tanto células NIH-3T3 como LM(tk-), habiéndose preseleccionado cada una de ellas con respecto a la ausencia de unión específica de ^{125}I-PYY (datos no mostrados). Después de la cotransfección con el ADNc de Y5 humano más un gen de resistencia a G-418 y de la selección con G-418, las colonias supervivientes se seleccionaron como homogeneizados de membrana con respecto a la unión específica de ^{125}I-PYY usando un radioligando a una concentración 0,08 nM. El clon de NIH-3T3 nº 8 se unió a 46 fmol de ^{125}I-PYY/mg de proteína de membrana y el clon de LM(tk-) nº 7 se unió a 32 fmol de ^{125}I-PYY/mg de proteína de membrana. Estos dos clones se aislaron para una caracterización adicional en ensayos de unión y en ensayos funcionales de AMPc. Un tercer clon que se unió a 25 fmol/mg de proteína de membrana, LM(tk-) nº 3 se evaluó en ensayos de movilización de calcio.
El Y5 humano expresado de forma estable en células NIH-3T3 (clon nº 8) se caracterizó adicionalmente en ensayos de unión de saturación usando ^{125}I-PYY. La unión fue saturable en un intervalo de concentraciones de 0,4 pM a 1,9 nM. Los datos de unión se ajustaron a un modelo de unión de un solo sitio con una K_{d} aparente de 0,30 nM (pK_{d} = 9,53, n = 1) y un valor de B_{max} aparente de 2100 fmol/mg de proteína de membrana usando membranas recién preparadas.
El Y5 humano expresado de forma estable en células LM(tk-) (clon nº 7) se caracterizó adicionalmente en ensayos de unión de saturación usando ^{125}I-PYY, ^{125}I-PYY_{3-36}, y ^{125}I-NPY. La unión de ^{125}I-PYY fue saturable de acuerdo con un modelo de un sitio en un intervalo de concentraciones de 0,4 pM a 1,9 nM, con una K_{d} aparente de 0,47 nM (pK_{d} = 9,32 \pm 0,07, n = 5) y un valor de B_{max} aparente de hasta 8 pmol/mg de proteína de membrana cuando las membranas se habían congelado y almacenado en nitrógeno líquido. Los valores de K_{i} del péptido derivados de la unión de ^{125}I-PYY a receptores Y5 humanos procedentes de LM(tk-) fueron comparables a los obtenidos a partir de los sistemas de expresión de Y5 humano y de rata descritos previamente (tabla 6). La unión de ^{125}I-PYY_{3-36} al Y5 humano en células LM(tk-) también fue saturable de acuerdo con un modelo de un sitio en un intervalo de concentraciones de 0,5 pM al 2,09 nM, con una K_{d} aparente de 0,40 nM (pK_{d} = 9,40, n = 1) y un valor de B_{max} aparente de 490 fmol/mg de proteína de membrana cuando las membranas se habían congelado y almacenado en nitrógeno líquido. Los ligandos peptídicos parecían unirse con una afinidad comparable a los receptores Y5 humanos en células LM(tk-) tanto si el radioligando usado era ^{125}I-PYY como si era ^{125}I-PYY_{3-36} (tabla 6). Finalmente, la unión de ^{125}I-NPY al Y5 humano en células LM(tk-) fue saturable de acuerdo con un modelo de un sitio en un intervalo de concentraciones de 0,4 pM a 1,19 nM, con una Kd aparente de 0,28 y un valor de B_{max} aparente de 360 fmol/mg de proteína de membrana cuando las membranas se habían congelado y almacenado en nitrógeno líquido.
Considerando los estudios de unión de saturación para los homólogos del receptor Y5 humano y de rata en su conjunto, los datos proporcionan indicios de que el receptor Y5 es una diana para múltiples análogos peptídicos radioyodados de la familia de polipéptidos pancreáticos, incluyendo ^{125}I-PYY, ^{125}I-NPY, ^{125}I-PYY_{3-36}, y ^{125}I-[Leu^{31}, Pro^{34.}]PYY. Los denominados radioligandos selectivos de Y1 e Y2, tales como ^{125}I- [Leu^{31}, Pro^{34.}]PYY y ^{125}I-PYY_{3-36}, respectivamente (Dumont, et al., 1995) deben usarse con precaución cuando se sondean tejidos nativos con respecto a la expresión del receptor de tipo Y.
Interacciones de receptor/proteína G: Efectos de nucleótidos de guanina
Para un receptor acoplado a la proteína G dado, una porción de la población de receptores puede caracterizarse típicamente en el sitio de unión al ligando de alta afinidad usando agonistas de discriminación. La unión de GTP o un análogo no hidrolizable a la proteína G produce un cambio conformacional en el receptor que favorece un estado de unión al ligando de baja afinidad. Investigamos si el análogo de GTP no hidrolizable, Gpp(NH)p, alteraría la unión de ^{125}I-PYY a Y5 en células COS- 7 y LM(tk-) (fig. 19). La unión de ^{125}I-PYY a receptores Y5 tanto humanos como de rata en células COS-7 fue relativamente insensible a concentraciones crecientes de Gpp(NH)p que variaban de 1 nM a 100 \muM. El receptor Y5 humano en células LM(tk-), sin embargo, presentaba una reducción dependiente de la concentración en la unión del radioligando (-85 fmol/mg de proteína de membrana en todo el intervalo de concentraciones). Las diferencias entre las preparaciones de receptores podrían explicarse por varios factores, incluyendo 1) los tipos de proteínas G disponibles en la célula hospedadora para soportar un complejo de receptor de alta afinidad-agonista, 2) el nivel de reservas del receptor en la célula hospedadora, 3) la eficacia de acoplamiento de receptor/proteína G, y 4) la capacidad intrínseca del agonista (en este caso, ^{125}PYY) para distinguir entre múltiples conformaciones del receptor.
Ensayo funcional
Se cree que la activación de todos los receptores de tipo Y descritos hasta ahora implica el acoplamiento a proteínas G sensibles a la toxina pertussis que son inhibidoras de la actividad adenilato ciclasa (G_{i} o G_{o}) (Wahlestedt y Reis, 1993). El hecho de que el receptor Y1 atípico se asocie a la inhibición de la ciclasa se sugirió por la observación de que la toxina pertussis inhibía la alimentación inducida por NPY in vivo (Chance et al., 1989); fue imposible realizar un análisis más definitivo en ausencia del receptor aislado. Basándose en estas observaciones previas, los solicitantes investigaron la capacidad de NPY de inhibir la acumulación de AMPc estimulada por forskolina en células 293 de riñón embrionario humano transfectadas de forma estable con receptores Y5 de rata. La incubación de células intactas con forskolina 10 \muM produjo un aumento de 10 veces en la acumulación de AMPc durante un período de 5 minutos, como se determina por radioinmunoensayo. La incubación simultánea con NPY de rata/humano redujo la acumulación de AMPc estimulada por forskolina en un 67% en células transfectadas de forma estable (fig. 12), pero no en células no transfectadas (datos no mostrados). Los solicitantes concluyen que la activación del receptor Y5 de rata reduce la acumulación de AMPc, muy probablemente por medio de la inhibición de la actividad adenilato ciclasa. Este resultado es coherente con la ruta de señalización propuesta para todos los receptores de tipo Y y para el receptor Y1 atípico en particular.
Los péptidos seleccionados por su capacidad de estimular el comportamiento alimentario en ratas pudieron activar el receptor Y5 de rata con una EC_{50} < 10 nM (Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992; Balasubramaniam et al., 1994). Éstos incluyen NPY de rata/humano (EC_{50} = 1,8 nM), NPY_{2-36} de rata/humano (EC_{50} = 2,0 nM), [Leu^{31}, Pro^{34.}]NPY de rata/humano (EC_{50} = 0,6 nM), PYY de rata/porcino (EC_{50} = 4,0 nM) y [D-Trp^{32}]NPY de rata/humano (EC_{50} = 7,5nM) (tabla 8). Los valores de K_{i} obtenidos a partir de la unión de ^{125}I-PYY y de ligandos peptídicos dependiente de Y5 de rata (tabla 5) estaban en un intervalo próximo de valores de EC_{50} derivados de la regulación de la acumulación de AMPc dependiente de Y5 de rata (tabla 8). La supresión máxima de AMPc producida por todos los péptidos de la tabla 6 estuvo comprendida entre un 84% y un 120% de la producida por el NPY humano, excepto en el caso de la FLRF amida (42%). Es de un interés particular el péptido selectivo para Y5 [d-Trp^{32}]NPY. Éste es un péptido que se demostró que estimulaba la ingesta de alimentos cuando se inyectó en hipotálamo de rata, y que también atenuaba la alimentación inducida por NPY en el mismo paradigma (Balasubramaniam, 1994). Los solicitantes observaron que [D-Trp^{32}]NPY se unía débilmente a otros clones de tipo Y con una K_{i} > 500 nM (tablas 4 y 5) y no presentaba ninguna actividad en ensayos funcionales (tabla 10). En un marcado contraste, [D-Trp^{32}]NPY se unía al receptor Y5 de rata con una K_{i} = 53 nM y podía imitar completamente el efecto inhibidor de NPY sobre la acumulación de AMPc estimulada por forskolina con un valor de EC_{50} de 25 nM y un valor de E_{max} = 72%. El hecho de que [D-Trp^{32}]NPY pudiera activar selectivamente el receptor Y5 mientras que no tenía ninguna actividad detectable en otros clones de subtipos sugiere firmemente que la activación del receptor Y5 es responsable del efecto estimulador de [D-Trp^{32}]NPY sobre el comportamiento alimentario in vivo.
Tabla 8
Activación funcional del receptor Y5 de rata
Se obtuvieron datos funcionales a partir del radioinmunoensayo de la acumulación de AMPc en células 293 transfectadas de forma estable estimuladas con forskolina 10 \muM. Los péptidos se ensayaron con respecto a la actividad agonista concentraciones que variaban de 0,03 pM a 0,3 \muM. La inhibición máxima de la acumulación de AMPc (E_{max}) y la concentración que producía un efecto semimáximo (EC_{50}) se determinaron por un análisis de regresión no lineal de acuerdo con una ecuación logística de 4 parámetros. Los nuevos péptidos están marcados con un doble asterisco.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 8
9
La capacidad del receptor Y5 humano de inhibir la acumulación de AMPc se evaluó en células NIH-3T3 y LM(tk-), sin que ninguna de ellas presentara una regulación de [AMPc] dependiente de NPY sin la construcción de Y5. Se analizaron células intactas transfectadas de forma estable con el receptor Y5 humano como se ha descrito anteriormente para el ensayo de AMPc con Y5 de rata. La incubación de células NIH-3T3 transfectadas de forma estable con forskolina 10 \muM generó un aumento medio de 21 veces en [AMPc] (n = 2). La incubación simultánea con NPY humano redujo la [AMPc] estimulada por forskolina con un valor de E_{max} del 42% y una EC_{50} de 8,5 nM (fig. 20). La técnica de suspensión y el posterior cultivo repetido de las células LM(tk-) transfectadas con Y5 se correlacionó con una respuesta celular sólida y fiable a péptidos de tipo NPY y, por lo tanto, se incorporó en la metodología convencional para la evaluación funcional del Y5 humano en LM(tk-). La incubación de células LM(tk-) transfectadas de forma estable preparadas de esta manera produjo un aumento medio de 7,4 veces en [AMPc] (n = 87). La incubación simultánea con NPY humano redujo la [AMPc] estimulada por forskolina con un valor de E_{max} del 72% y con una EC_{50} de 2,4 nM (fig 21). El receptor Y5 humano confirmó una respuesta celular a péptidos de tipo NPY en un orden jerárquico similar al descrito para el receptor Y5 de rata (tabla 8, 9). Como el receptor Y5 de rata está asociado claramente por D-Trp^{32}-NPY y otras herramientas farmacológicas a la regulación del comportamiento alimentario dependiente de NPY, es previsible que el receptor Y5 humano funcione de una forma similar. Tanto el homólogo humano como el homólogo del receptor representan modelos útiles para la selección de compuestos destinados a modular el comportamiento alimentario interfiriendo con las rutas dependientes de NPY.
Tabla 9
Activación funcional del receptor Y5 humano en un radioinmunoensayo de AMPc
Se obtuvieron datos funcionales a partir de un radioinmunoensayo de la acumulación de AMPc en células LM(tk-) transfectadas de forma estable estimuladas con forskolina 10 \muM. Se ensayó la actividad agonista de los péptidos a concentraciones que variaban de 0,03 pM a 0,3 \muM. La inhibición máxima de la acumulación de AMPc (E_{max}) y la concentración que producía un efecto semimáximo (EC_{50}) se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal de acuerdo con una ecuación logística de 4 parámetros.
TABLA 9
11
Tabla 10
Unión y caracterización funcional de [D-Trp^{32}]NPY
Se generaron datos de unión como se describe en las tablas 4 y 5. Los datos funcionales se obtuvieron a partir de un radioinmunoensayo de la acumulación de AMPc en células transfectadas de forma estable estimuladas con forskolina 10 \muM. Se ensayó la actividad agonista de [D-Trp^{32}]NPY a concentraciones que variaban de 0,03 pM a 0,3 \muM. Como alternativa, [D-Trp^{32}]NPY se incluyó como una sola adición conocida (0,3 \muM) en la curva de concentración de PYY humano para los receptores Y1 humano e Y2 humano, o en la curva de concentración de PP humano para receptores Y4 humanos, y la actividad antagonista se detectó por la presencia de un desplazamiento hacia la derecha (de EC_{50} a EC_{50'}). Los valores de K_{b} se calcularon de acuerdo con la ecuación: K_{b} = [[D-Trp^{32}]NPY/((EC_{50}/EC_{50'})-1). Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 10
38
Ensayo funcional: Movilización de calcio intracelular
La concentración de calcio libre intracelular aumentó en células LM(tk-) transfectadas de forma estable con el receptor Y5 humano en un período de 30 segundos de incubación con NPY humano 100 nM (\rho Ca^{2+} = 34, fig 21D). Las células LM(tk-) no transfectadas no respondieron al NPY humano (datos no mostrados). La movilización de calcio proporciona una segunda ruta a través de la cual puede medirse la activación del receptor Y5. Estos datos también sirven para asociar el receptor Y5 con otros receptores de tipo Y humanos clonados, de los cuales se ha demostrado que todos movilizan el calcio intracelular en diversos sistemas de expresión (fig 21).
Estudios de localización
El ARNm para el receptor Y5 de NPY estaba ampliamente distribuido en el cerebro de rata, y parecía ser moderadamente abundante (tabla 11 y fig. 13). El tálamo en la línea media contenía muchas neuronas con granos de plata sobre ellas, particularmente el núcleo talámico paraventricular, el núcleo romboide y el núcleo reuniens. Además, se observaron señales de hibridación moderadamente intensas en neuronas tanto del núcleo talámico centromedial como del núcleo talámico anterodorsal. En el hipotálamo, se observó un nivel moderado de señales de hibridación en neuronas dispersas en el hipotálamo lateral, y en los núcleos paraventricular, supraóptico, arcuato y dorsomedial. Tanto en el núcleo preóptico medial como en el núcleo supraquiasmático, estaban presentes acumulaciones débiles o moderadas de granos de plata. En el núcleo supraquiasmático, la señal de hibridación estaba restringida principalmente a la subdivisión ventrolateral. En el hipotálamo paraventricular, se observaron neuronas positivas principalmente en la subdivisión parvicelular medial.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 11
12
Se encontraron señales de hibridación moderadas en la mayoría de las neuronas de la región polimórfica de la circunvolución dentada en el hipocampo, aunque se observaron niveles inferiores en neuronas dispersas en la región CA3. En la amígdala, el núcleo central y el núcleo cortical anterior contenían neuronas con niveles moderados de señales de hibridación. En el mesencéfalo, se observaron señales de hibridación en varias áreas. Las señales más intensas se encontraron en neuronas de los núcleos pretectales anterior y olivar, en la substancia gris periacueductal y sobre el rafe lineal rostral. Se observaron señales de hibridación moderadas en neuronas de la capa gris interna del colículo superior, la substancia negra, pars compacta, el rafe dorsal y los núcleos del puente. La mayoría de las neuronas del colículo inferior mostró un bajo nivel de señal. En la médula y en el puente del cerebelo, pocas áreas mostraron señales de hibridación substanciales. El núcleo vestibular medial estaba marcado moderadamente, así como el núcleo reticular parvicelular, pars alfa, y el núcleo reticular gigantocelular.
Se observaron pocas o ninguna señal de hibridación en secciones hibridadas con la sonda oligonucleotídica con sentido radiomarcada. Lo que es más importante, en las células COS-7 transfectadas, la sonda antisentido hibridó sólo con las células transfectadas con el ADNc de Y5 (tabla 12). Estos resultados indican que la sonda usada para caracterizar la distribución del ARNm de Y5 en cerebro de rata es específica para este ARNm, y no presenta hibridación cruzada con ninguno de los otros ARNm de receptores de NPY conocidos.
TABLA 12
13
Estudios in vivo con compuestos selectivos por Y5
Los resultados presentados anteriormente confirman fuertemente un papel para el receptor Y5 en la regulación del comportamiento alimentario. Por consiguiente, los solicitantes han sintetizado y evaluado la unión y las propiedades funcionales de varios compuestos en los receptores Y1 humano, Y2 humano, Y3 humano, Y4 humano e Y5 humano clonados. Como se muestra más adelante en la tabla 13, los solicitantes han descubierto varios compuestos que no sólo se unen selectivamente al receptor Y5 humano, sino que también actúan como antagonistas del receptor Y5, como se mide por su capacidad de bloquear la inhibición inducida por NPY de la acumulación de AMPc en células LM(tk-) estimuladas con forskolina transfectadas de forma estable con el receptor Y5 humano clonado. En la figura 22 se muestra un ejemplo de tal compuesto. Los experimentos preliminares indican que el compuesto 28 es un antagonista del receptor Y5.
Tabla 13
Evaluación de antagonistas del receptor Y5 humano
La capacidad de los compuestos para antagonizar los receptores de tipo Y se presenta como la K_{b}. La K_{b} se obtiene a partir de la EC_{50}, o concentración del efecto semimáximo, en presencia (EC_{50}) o ausencia (EC_{50}') de compuesto, de acuerdo con la ecuación: K_{b} = [NPY]/((EC_{50}/EC_{50}')-1). Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
N.D. = No determinado
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 13
14
Estos compuestos se ensayaron adicionalmente usando modelos animales in vivo del comportamiento alimentario. Como NPY es el estimulante más fuerte conocido del comportamiento alimentario, se realizaron experimentos con varios compuestos para evaluar el efecto de los compuestos descritos anteriormente sobre el comportamiento alimentario inducido por NPY en ratas saciadas.
En primer lugar, se administraron 300 pmoles de NPY porcino en vehículo (A.C.S.F.) por inyección intracerebroventricular (i.c.v.), junto con la administración i.p. del vehículo del compuesto (DMSO al 10%/agua), y la ingesta de alimentos de los animales estimulados con NPY se comparó con la ingesta de alimentos en animales tratados con los vehículos. Se descubrió que la inyección de 300 pmoles de NPY inducía significativamente la ingesta de alimentos (p < 0,05; Student-Newman- Keuls).
Usando la dosis de 300 pmoles de NPY que se considera eficaz para estimular la alimentación, otros animales se trataron con los compuestos por administración intraperitoneal (i.p.), seguido 30-60 minutos después por la administración de NPY i.c.v., y por la medición de la ingesta de alimentos posterior. Como se muestra en la tabla 14, la ingesta de alimentos inducida por NPY se redujo significativamente en los animales tratados primero con los compuestos (p < 0,05; Student-Newman-Keuls). Estos experimentos demuestran que la ingesta de alimentos inducida por NPY se reduce significativamente por medio de la administración a los animales de un compuesto que es un antagonista selectivo de Y5.
Tabla 14
Ingesta de alimentos acumulativa inducida por NPY en ratas tratadas con los vehículos i.c.v. e i.p. (control), o con 300 pmoles de NPY solo (NPY), o en ratas tratadas primero con compuesto y después con NPY (NPY + compuesto). La ingesta de alimentos se midió 4 horas después de la estimulación con NPY. La ingesta de alimentos se presenta como la media \pm S.E.M. de la ingesta para un grupo de animales.
TABLA 14
16
Como la privación de alimentos induce un aumento de los niveles de NPY hipotalámicos, se ha postulado que la ingesta de alimentos después de un período de privación de alimentos está medida por NPY. Por lo tanto, los antagonistas de Y5 de la tabla 13 se administraron a ratas conscientes después de un periodo de privación de alimentos de 24 horas. Cada uno de los antagonistas del receptor Y5 humano mostrados en la tabla 13 pudo reducir significativamente la ingesta de alimentos inducida por NPY en los animales, como se muestra más adelante en la tabla 15. La ingesta de alimentos de los animales tratados con compuesto de ensayo se presenta como un porcentaje de la ingesta de alimentos medida para los animales de control (tratados con vehículo), es decir, 25% significa que los animales tratados con el compuesto consumían sólo un 25% de los alimentos consumidos por los animales de control. Las mediciones se realizaron dos horas después de la administración del compuesto de ensayo.
TABLA 15
18
Estos experimentos indican que los compuestos de la presente invención inhiben la ingesta de alimentos en rata, especialmente cuando se administran en un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de rata, por administración oral, intraperitoneal o intravenosa. Los animales parecían normales durante estos experimentos, y no se observaron efectos de enfermedad sobre los animales después de finalizar los experimentos de alimentación.
También se evaluaron las propiedades de unión de los compuestos con respecto a otros receptores acoplados a la proteína G humanos clonados. Como se muestra más adelante en la tabla 16, los compuestos selectivos por Y5 descritos anteriormente en este documento presentaron menor afinidad por receptores distintos de los receptores de tipo Y.
19
20
Discusión experimental
Para aislar nuevos subtipos de receptores de NPY, los solicitantes eligen una estrategia de clonación de expresión donde realmente se detecta un receptor funcional con una sensibilidad exquisita en la superficie de células transfectadas, usando un ligando yodado muy específico. Usando esta estrategia, los solicitantes han identificado un ADNc hipotalámico de rata que codifica un nuevo receptor de tipo Y (Y5). El hecho de que los solicitantes tengan que seleccionar 3,5 x10^{6} clones independientes con un inserto de un tamaño medio de 2,7 kb para encontrar dos clones, revela una predisposición muy fuerte contra la clonación de ADNc de Y5 en la el procedimiento de construcción de la biblioteca de ADNc o que el ARNm de Y5 se expresa a niveles muy bajos en tejido hipotalámico de rata. La fase de lectura más larga en el ADNc de Y5 de rata (CG-18) codifica una proteína de 456 aminoácidos con un peso molecular estimado de 50,1 kD. Como existen dos sitios de N-glicosilación en el extremo amino, el peso molecular aparente podría ser ligeramente mayor. Los solicitantes han aislado el homólogo de Y5 humano a partir de una biblioteca de ADNc de hipocampo humano. La fase de lectura más larga en el ADNc de Y5 humano (CG-19) codifica una proteína de 455 aminoácidos con un peso molecular estimado de 50 kD. El receptor Y5 humano tiene un aminoácido menos que el Y5 de rata y muestra diferencias de aminoácidos significativas tanto en el extremo N terminal como en la región intermedia de las porciones del tercer bucle intracelular de la proteína. Los siete dominios transmembrana y los núcleos extracelulares, sin embargo, son prácticamente idénticos y los motivos de la proteína encontrados en los dos homólogos de especie son idénticos. Tanto el receptor Y5 humano como el de rata llevan un gran número de sitios de fosforilación potenciales en su segundo y tercer bucles intracelulares que podrían estar implicados en la regulación de sus características funcionales.
Tanto el receptor Y5 de rata como el receptor Y5 humano llevan un cierre de leucina (leucine zipper) en el primer supuesto dominio transmembrana. En tal estructura, se ha propuesto que los segmentos que contienen series periódicas de restos de leucina existen en un conformación de alfa hélice. Las cadenas laterales de leucina que se extienden desde una alfa hélice interaccionan con las de una alfa hélice similar de un segundo polipéptido, facilitando la dimerización por medio de la formación de un arrollamiento (O'Shea et al., 1989). Normalmente, tales modelos están asociados con proteínas de unión al ADN nuclear tales como c-myc, c-fos y c-jun, pero es posible que en algunas proteínas la repetición de leucina simplemente facilite la dimerización y tenga poco que ver con la colocación de una región de unión al ADN. Otros indicios que respaldan la idea de que puede producirse la dimerización de receptores específicos con siete dominios transmembrana, proceden de estudios de coexpresión con receptores muscarínicos/adrenérgicos donde se han descrito "entrecruzamientos" intermoleculares entre receptores acoplados a la proteína G quiméricos (Maggio et al., 1993). El sitio de fosforilación de tirosina encontrado en la región media de este cierre de leucina en el dominio transmembrana 1 (TM I) podría estar implicado en la regulación de la dimerización del receptor Y5. El significado fisiológico de la dimerización de receptores acoplados a la proteína G aún no se ha esclarecido, pero por analogía con la oligomerización de receptores de hormonas peptídicas, podría estar implicada en la activación de receptores y en la transducción de señales (Wells, 1994).
El análisis de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de Y5 (de rata y humano) revela bajos niveles de identidad con todos los receptores 7 TM, incluyendo los receptores Y1, Y2 e Y4, incluso en los dominios transmembrana que normalmente están muy conservados dentro de las subfamilias de receptores. Los solicitantes los han denominados receptores "Y5" CG-18 y CG-19 debido a su secuencia de aminoácidos única (con una identidad del 87,2% entre sí y una identidad \leq 42% con las regiones TM de subtipos de receptores "Y" clonados previamente) y a su perfil farmacológico. El nombre no se inclina hacia ningún miembro de la familia de polipéptidos pancreáticos. La "Y" tiene sus raíces en la clasificación original de los subtipos de receptores Y1 e Y2 (Wahlestedt et al., 1987). La letra refleja la conservación en miembros de la familia de polipéptidos pancreáticos de la tirosina C-terminal, descrita como "Y" en el código de aminoácidos de una sola letra. El número es el siguiente disponible en la serie de tipo Y, habiéndose reservado la posición del número 3 para el receptor Y3 definido farmacológicamente. Los solicitantes indican que el receptor Y1 humano clonado se introdujo por Larhammar y colaboradores como un "receptor del neuropéptido Y/péptido YY humano del tipo Y1" (Larhammar et al., 1992). De forma similar, los nuevos clones descritos en este documento pueden describirse como receptores del neuropéptido Y/péptido YY de rata y humanos del tipo Y5.
El receptor Y5 hipotalámico de rata presenta un perfil farmacológico muy similar al del receptor Y1 "atípico" descrito farmacológicamente que se considera que media la ingesta de alimentos inducida por NPY en el hipotálamo de rata. Tanto el receptor Y5 como "el receptor alimentario" presentan una preferencia por NPY y por análogos de tipo PYY, una sensibilidad a la deleción de péptidos N-terminales y tolerancia a Pro^{34.}. Ambos se considerarían de tipo Y1 excepto por la capacidad anómala de unirse y activarse por NPY_{2-36} así como por NPY. Ambos parecen ser sensibles a cambios en la región media del ligando peptídico. Por ejemplo, un estudio realizado por Kalra y colaboradores (1991) indicó que el reemplazo de la región media de NPY por una cadena de amino-octanoico para producir NPY_{1-4}-Aca-_{25-36} reducía notablemente la actividad en un ensayo de comportamiento alimentario. De forma similar, los solicitantes indican que la sólida diferencia en la unión de PP humano (K_{i} = 5,0 nM) y la unión de PP de rata (K_{i} = 230) al receptor Y5 de rata puede atribuirse a una serie de ocho cambios de aminoácidos entre los restos 6-30 en los ligandos peptídicos, llevando el PP humano el mayor parecido al NPY humano. También debe tenerse en cuenta que la FLRFamida, un análogo estructural del péptido FMRFamida que, según se ha informado, estimula la alimentación en las ratas, pudo unirse y activar el receptor Y5 de rata aunque a concentraciones relativamente altas (Orosco, et al., 1989). Estos perfiles de correspondencia, junto con una activación selectiva del receptor Y5 de rata por el "modulador" de la alimentación presentado [D-Trp^{32}]NPY, confirman la identidad del receptor Y5 de rata como el "receptor alimentario" propuesto primero para explicar la alimentación inducida por NPY en el hipotálamo de rata. El hecho de que el receptor Y5 humano tenga un perfil farmacológico parecido al del Y5 de rata tanto en ensayos de unión como en ensayos funcionales sugiere que los dos receptores pueden tener funciones similares in vivo.
La distribución del ARNm de Y5 en el cerebro de rata extiende adicionalmente el argumento para un papel de los receptores Y5 en el comportamiento alimentario. Por ejemplo, se ha sugerido que el locus anatómico de la respuesta de alimentación reside, al menos en parte, en el núcleo hipotalámico paraventricular (PVN) y también en el hipotálamo lateral, dos sitios donde se detectó ARNm de Y5 en abundancia. La localización post-sináptica del receptor Y5 en estas dos regiones puede regular la respuesta al NPY liberado endógenamente in vivo. El núcleo paraventricular recibe proyecciones de neuronas que contiene NPY en el núcleo arcuato otra región en la que se detectó ARNm de Y5. Esto indica un papel pre-sináptico para el receptor Y5 en el control de la liberación de NPY a través de la proyección arcuatoparaventricular, y por consiguiente en el control del comportamiento alimentario. La localización del ARNm de Y5 en los núcleos talámicos de la línea media también es importante. El complejo de núcleo talámico paraventricular/núcleo centromedial se proyecta fuertemente hacia el hipotálamo paraventricular y la amígdala. Como tal, el receptor Y5 es un substrato para el aspecto emocional de comportamientos relacionados con el apetito.
Los receptores Y5 son dianas muy atractivas para el control de apetito y del peso basándose en varias líneas de investigación (Sahu y Kalra, 1993). NPY es el estimulante más potente del comportamiento alimentario descrito hasta ahora (Clark et al., 1984; Levine y Morley, 1984; Stanley y Leibowitz, 1984). La inyección directa de NPY en el hipotálamo de ratas puede aumentar la ingesta de alimentos \sim10 veces durante un período de 4 horas (Stanley et al., 1992). Las ratas estimuladas con NPY presentan una preferencia por carbohidratos con respecto a las proteínas y las grasas (Stanley et al., 1985). De manera interesante, el NPY y el ARNm de NPY están aumentados en ratas privadas de alimento (Brady et al., 1990; O'Shea y Gundlach, 1991) y también en ratas que son genéticamente obesas (Sanacora et al., 1990) o que se han convertido en ratas diabéticas por tratamiento con estreptozotocina (White et al., 1990). Una explicación posible es que el NPY, un potente estimulante del comportamiento alimentario en ratas normales, está mal regulado en el animal con sobrepeso o diabético de forma que se aumenta la ingesta de alimentos, lo cual va acompañado por la obesidad. El estrés fisiológico de la obesidad aumenta el riesgo de problemas sanitarios tales como un mal funcionamiento cardiovascular, osteoartritis e hiperinsulinemia, junto con un pronóstico peor para la diabetes de inicio en adultos. Por lo tanto, un antagonista no peptídico dirigido al receptor Y5 podría ser eficaz como una forma para controlar no sólo el apetito y el peso corporal, sino una serie entera de trastornos relacionados con la obesidad y con la diabetes (Dryden et al., 1994). También existen indicios neuroquímicos que sugieren que las funciones mediadas por NPY están mal reguladas en trastornos de la alimentación tales como la bulimia y la anorexia nerviosa, de forma que estos trastornos también podrían responder al tratamiento con un fármaco selectivo por Y5. Por ejemplo, se ha propuesto que la ingesta de alimentos en ratas estimuladas con NPY imita el consumo de alimentos masivo asociado con el ansia de comer de la bulimia (Stanley, 1993). Los niveles en el CSF de PYY pero no de NPY estaban elevados en pacientes bulímicos que se abstenían de comer en exceso y después disminuyeron cuando se les permitió comer libremente (Berrettini et al., 1988). De forma inversa, los niveles de NPY estaban elevados en pacientes anoréxicos con bajo peso y después disminuyeron según se normalizaba el peso corporal (Kaye et al., 1990).
Como se ha descrito anteriormente, los modelos de expresión in vitro humanos y de rata se usaron en combinación para seleccionar compuestos destinados a modular el comportamiento alimentario dependiente de NPY. Usando esta estrategia, los solicitantes han descubierto varios compuestos que inhiben el comportamiento alimentario en modelos animales, lo cual debería conducir a descubrimientos de fármacos adicionales. Los compuestos de acuerdo con la presente invención inhiben la ingesta de alimentos en ratas obesas Zucker en un intervalo especialmente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg después de la administración oral, intraperitoneal o intravenosa.
El perfil farmacológico de Y5 ofrece además un nuevo patrón por medio del cual se puede revisar la base molecular de todos los procesos dependientes de NPY; los ejemplos se indican en la tabla 11. Tal ejercicio sugiere que el receptor Y5 probablemente tendrá un significado fisiológico más allá del comportamiento alimentario. Por ejemplo, se ha notificado que un receptor de tipo Y puede regular la liberación de la hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH) a partir de la eminencia media de ratas inducidas con esteroides in vitro con un perfil farmacológico de Y1 atípico. NPY, NPY_{2-36} y LP-NPY fueron eficaces a una concentración 1 \muM, pero la deleción de tan sólo cuatro aminoácidos del extremo N de NPY destruyó la actividad biológica. Por lo tanto, el receptor Y5 puede representar una diana terapéutica para trastornos sexuales o reproductores. Preliminarmente, la hibridación in situ de ARNm de Y5 de rata en hipocampo y en otros sitios sugiere además que falta por mencionar otros papeles adicionales, por ejemplo, en la regulación de la memoria. Debe considerarse que el Y5 es tan similar en perfil farmacológico a los otros receptores de tipo Y que puede haberse pasado por alto entre una población mixta de receptores Y1, Y2 e Y4. Por lo tanto, ciertas funciones asociadas ahora con estos subtipos podrían reasignarse a Y5 según se vayan sofisticando más nuestras herramientas farmacológicas (tabla 18). Al ofrecer una nueva perspectiva a la farmacología de los receptores de NPY, la terapia con Y5 proporciona una mayor claridad y enfoque en el campo del diseño de fármacos.
TABLA 17
21
Una estrategia satisfactoria para el diseño de un fármaco basado en el receptor Y5 o para cualquier fármaco dirigido a un solo subtipo de receptor acoplado a la proteína G implica la selección de compuestos candidatos 1) en ensayos de unión a radioligandos para detectar la afinidad por receptores acoplados a la proteína G que presenten reacción cruzada y 2) en ensayos fisiológicos para detectar efectos secundarios indeseables. En el proceso específico de selección de un fármaco selectivo por Y5, los subtipos de receptores con más probabilidad de presentar reacción cruzada y, por lo tanto, más importantes para las selecciones de unión de radioligando incluyen los otros receptores de "tipo Y", Y1, Y2, Y3 e Y4. La reactividad cruzada entre Y5 y cualquiera de los otros subtipos podría ocasionar complicaciones potenciales como las sugeridas por las indicaciones patofisiológicas presentadas en la tabla 17. Para diseñar un antagonista de Y5 para el control de la obesidad y del apetito, por ejemplo, es importante no diseñar un antagonista de Y1 que produzca hipertensión o aumente la ansiedad, un antagonista de Y2 que produzca pérdida de memoria, o un antagonista de Y4 que ocasione un aumento del apetito.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 18
22
La clonación del receptor Y5 a partir de ser humano y de rata es especialmente valiosa para la caracterización de receptores basada en la localización in situ, el knockout funcional anti-sentido y la inducción génica. Estos estudios generarán una información importante relacionada con la función del receptor Y5 y su significado terapéutico. El receptor Y5 clonado se presta a estudios de mutagénesis en los que pueden modelarse interacciones de receptor/ligando. El receptor Y5 además nos permite investigar la posibilidad de otros receptores de tipo Y por medio de una clonación de homología. Estos podrían incluir nuevos subtipos de receptores así como homólogos de especie de Y5 para el establecimiento de modelos animales experimentales con relevancia para la patología humana. Por lo tanto, el receptor Y5 representa una enorme oportunidad para el desarrollo de terapias de fármacos nuevos y selectivos, particularmente dirigidas al control del apetito y del peso, pero también a la pérdida de memoria, depresión, ansiedad, ulcera gástrica, ataque epiléptico, dolor, hipertensión, hemorragia subaracnoidea, alteraciones del sueño, congestión nasal, disfunción de evacuación neurogénica y diarrea.
En particular, el descubrimiento de antagonistas selectivos por Y5 que inhiben la ingesta de alimentos en ratas proporciona un método para modificar el comportamiento alimentario en una amplia diversidad de animales vertebrados.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Synaptic Pharmaceutical Corporation
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS PARA MODIFICAR EL COMPORTAMIENTO ALIMENTARIO, COMPUESTOS ÚTILES EN TALES MÉTODOS, Y ADN QUE CODIFICA UN RECEPTOR (Y5) DEL NEUROPÉPTIDO Y/PÉPTIDO YY ATÍPICO HIPOTALÁMICO.
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Cooper & Dunham LLP
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 1185 Avenue of the Americas
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10036
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatenIn Release Nº. 1.0, Versión Nº. 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: White, John P.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 28.678
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1795/46166-A-PCT
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 278-0400
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212) 391-0525
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1501 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 61..1432
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTAGTTTTGT TCTGAGAACG TTAGAGTTAT AGTACCGTGC GATCGTTCTT CAAGCTGCTA 
\hfill
60
24
25
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
27
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1457 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 61..1432
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
29
30
31 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
32
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1457 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3..1004
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 334 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
37
370 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGGATCAGTG GATGTTTGGC AAAG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GTCTGTAGAA AACACTTCGA GATCTCTT 
\hfill
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTTCCAGTGT TTCACAGTCT GGTGG 
\hfill
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGAGCAGCA GGTATTTATG TGTTG 
\hfill
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGGATGAAG AATGCTGACT TCTTAGAG 
\hfill
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTCTTGAGTG GTTCTCTTGA GGAGG 
\hfill
25

Claims (43)

1. Un ácido nucleico que codifica un receptor Y5 de mamífero, conteniendo dicho ácido nucleico:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 6; o
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 5; o
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 15; o
(d) una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor Y5 en un mamífero distinto de un ser humano, una rata o un perro, y que hibrida en condiciones adecuadas con una cualquiera de (a) a (c);
donde el receptor se caracteriza por (1) un perfil farmacológico característico del receptor Y5 humano como el mostrado en la tabla 6 o en la tabla 7; o (2) un perfil farmacológico característico del receptor Y5 de rata como el mostrado en la tabla 4 o en la tabla 5.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, que es ADN o ARN, donde si es ARN, el ARN es preferiblemente ARNm.
3. El ácido nucleico de la reivindicación 2, que es ADNc o ADN genómico.
4. El ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico codifica un receptor Y5 caracterizado por una secuencia de aminoácidos en cada una de las regiones transmembrana I-VII que es idéntica a la secuencia de aminoácidos en la región transmembrana correspondiente del receptor Y5 humano mostrado en la figura 8.
5. Una proteína receptora Y5 purificada codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Un vector de la reivindicación 6 adaptado para la expresión en una célula hospedadora que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula hospedadora unidos operativamente al ácido nucleico que codifica un receptor Y5, para permitir su expresión.
8. El vector de la reivindicación 7, donde la célula hospedadora es una célula bacteriana, de levadura, de insecto de mamífero.
9. El vector de la reivindicación 8, que es un baculovirus o un plásmido.
10. El plásmido de la reivindicación 9, que es pcEXV-hY5 (Nº de Acceso de la ATCC 75943) o pcEXV-rY5 (Nº de Acceso de la ATCC 75944).
11. Una célula hospedadora que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.
12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero.
13. La célula hospedadora de la reivindicación 11 ó 12, que es de origen no neuronal.
14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es una célula COS-7, una célula 293 de riñón embrionario humano, una célula NIH-3T3 o una célula LM(tk-).
15. La célula 293 de riñón embrionario humano de la reivindicación 14, que es 293-rY5-14 (Nº de Acceso de la ATCC CRL 11757).
16. La célula NIH-3T3 de la reivindicación 14, que es N-hY5-8 (Nº de Acceso de la ATCC CRL-11994).
17. La célula LM(tk-) de la reivindicación 14, que es L-hY5-7 (Nº de Acceso de la ATCC CRL-11995).
18. La célula hospedadora de la reivindicación 12, donde la célula de insecto es una célula Sf9 o una célula Sf21.
19. Un método para preparar el receptor Y5 humano, de rata o canino purificado de la reivindicación 5, que comprende:
a. construir un vector adaptado para la expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión de un ácido nucleico en la célula unidos operativamente al ácido nucleico que codifica el receptor Y5 humano, de rata o canino para permitir su expresión, donde la célula se selecciona entre el grupo compuesto por células bacterianas, células de lavadura, células de insecto y células de mamífero;
b. insertar el vector de la etapa a en una célula hospedadora adecuada;
c. incubar las células de la etapa b en condiciones que permitan la expresión del receptor Y5 humano, de rata o canino;
d. recuperar el receptor producido de esta manera; y
e. purificar el receptor recuperado de esta manera, preparando de esta forma un receptor Y5 humano, de rata o canino.
20. Un método para preparar un receptor Y5 purificado, que comprende:
(a) poner la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en condiciones adecuadas que permitan la producción del receptor Y5,
(b) recuperar el receptor producido de esta manera por la célula hospedadora; y
(c) purificar el receptor recuperado de esta manera.
21. Un receptor Y5 purificado preparado por el método de la reivindicación 19 ó 20.
22. Una preparación de membrana aislada a partir de la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, célula hospedadora que no expresa naturalmente un receptor Y5.
23. Un anticuerpo capaz de unirse el receptor de la reivindicación 21.
24. Un anticuerpo capaz de inhibir competitivamente la unión a un receptor Y5 del anticuerpo de la reivindicación 23.
25. El anticuerpo de la reivindicación 23 ó 24, que es un anticuerpo monoclonal.
26. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 25, que está dirigido contra un epítopo de un receptor Y5 presente en la superficie de una célula que expresa el receptor Y5.
27. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. Un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto las células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la unión, y detectar la unión específica del compuesto químico al receptor Y5.
29. Un proceso que implica la unión competitiva para identificar un compuesto químico que se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, tanto con el compuesto químico como con un segundo compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5, y sólo en el caso del segundo compuesto químico, en condiciones adecuadas para la unión de compuestos, y detectar la unión específica del compuesto químico al receptor Y5, indicando una reducción en la unión del segundo compuesto químico al receptor Y5 en presencia del compuesto químico que el compuesto químico se une al receptor Y5.
30. Un proceso que implica una unión competitiva para identificar un compuesto químico que se une específicamente a un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, tanto con un compuesto químico que se sabe que se une específicamente al receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen específicamente al receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5, en condiciones adecuadas para la unión de compuestos, detectar la unión específica de la pluralidad de compuestos químicos, indicando una disminución en la unión del compuesto químico que se sabe que se une al receptor Y5 en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une al receptor Y5, y detectar por separado la unión de cada compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos al receptor Y5.
31. Un proceso para determinar si un compuesto químico es un agonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, con el compuesto químico en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar un aumento en la actividad del receptor Y5, para determinar de esta manera si el compuesto químico es un agonista del receptor Y5.
32. Un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente y activa un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia y en ausencia del compuesto químico, indicando un cambio en la respuesta del segundo mensajero en presencia del compuesto químico que el compuesto químico activa el receptor Y5.
33. Un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente y activa un receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, con una pluralidad de compuestos químicos que no se sabe si se unen y activan el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia y en ausencia de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio en la respuesta de un segundo mensajero en presencia de la pluralidad de compuestos químicos que al menos un compuesto químico de la pluralidad de compuestos químicos activa el receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos se une a y activa el receptor Y5.
34. El proceso de la reivindicación 32 ó 33, donde la respuesta del segundo mensajero comprende la actividad adenilato ciclasa y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una reducción de la actividad adenilato ciclasa.
35. El proceso de la reivindicación 32 ó 33, donde la respuesta del segundo mensajero comprende la concentración de calcio intracelular y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es un aumento de la concentración de calcio intracelular.
36. Un proceso para determinar si un compuesto químico es un antagonista del receptor Y5, que comprende poner en contacto células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, con el compuesto químico en presencia de un agonista del receptor Y5 conocido, en condiciones que permitan la activación del receptor Y5, y detectar una disminución en la actividad del receptor Y5, para determinar de esta manera si el compuesto químico es un antagonista del receptor Y5.
37. Un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, tanto con el compuesto químico como con un segundo compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, y sólo en el caso del segundo compuesto químico, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de sólo el segundo compuesto químico y en presencia tanto del segundo compuesto químico como del compuesto químico, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico con respecto a la presencia de sólo el segundo compuesto químico que el compuesto químico inhibe la activación del receptor Y5.
38. Un proceso para determinar si un compuesto químico se une específicamente e inhibe la activación de un receptor Y5, que comprende poner en contacto por separado células hospedadoras de la reivindicación 11, o la preparación de membrana de la reivindicación 22, tanto con un compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como con una pluralidad de compuestos que no se sabe si inhiben la activación del receptor Y5, y sólo en el caso del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, en condiciones adecuadas para la activación del receptor Y5, y medir la respuesta de un segundo mensajero en presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos, indicando un cambio más pequeño en la respuesta del segundo mensajero en presencia tanto del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 como de la pluralidad de compuestos químicos con respecto a la presencia de únicamente el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5, que al menos un compuesto químico incluido en la pluralidad de compuestos químicos inhibe la activación del receptor Y5, y determinar por separado si cada compuesto incluido en la pluralidad de compuestos químicos se une específicamente e inhibe la activación del receptor Y5.
39. El proceso de la reivindicación 37 ó 38, donde la respuesta del segundo mensajero comprende la actividad adenilato ciclasa y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una reducción en el nivel de actividad adenilato ciclasa en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y la pluralidad de compuestos químicos, menor que en presencia de sólo el segundo compuesto químico o el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5.
40. El proceso de la reivindicación 37 ó 38, donde la respuesta del segundo mensajero comprende la concentración de calcio intracelular y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es un aumento de la concentración de calcio intracelular en presencia tanto del compuesto químico como del segundo compuesto químico, o del compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5 y la pluralidad de compuestos químicos, menor que en presencia de sólo el segundo compuesto químico o el compuesto químico que se sabe que activa el receptor Y5.
41. Un método para detectar la presencia de un receptor Y5 humano en la superficie de una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 en condiciones que permitan la unión del anticuerpo al receptor, detectar la presencia del anticuerpo unido a la célula, y de esta manera detectar la presencia de un detector Y5 humano en la superficie de la célula.
42. Un método para preparar una composición, que comprende determinar si un compuesto químico es un agonista del receptor Y5 usando el método de la reivindicación 31, separar el compuesto químico que se ha determinado de esta manera que es un agonista del receptor Y5 a partir de las células hospedadoras o la preparación de membrana, y poner el compuesto químico en un vehículo.
43. Un método para preparar una composición, que comprende determinar si un compuesto químico es un antagonista del receptor Y5 usando el método de la reivindicación 36, separar el compuesto químico que se ha determinado de esta manera que es un antagonista del receptor Y5 de las células hospedadoras o la preparación de membrana, y poner el compuesto químico en un vehículo.
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