ES2114064T5 - Inmunoanalisis para la deteccion de colageno o fragmentos de colageno. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A ANTIGENOS PARA LA ELABORACION DE ANTICUERPOS CONTRA COLAGENO, UN PROCESO PARA LA ELABORACION DE TALES ANTIGENOS, ANTICUERPOS CONTRA COLAGENO, QUE SON OBTENIBLES MEDIANTE INMUNIZACION CON UN ANTIGENO DE ACUERDO CON LA INVENCION, ASI COMO LA UTILIZACION DE TALES ANTICUERPOS PARA LA DETECCION DE COLAGENOS.
Description
Inmunoanálisis para la detección de colágeno o
de fragmentos de colágeno.
El invento se refiere a un inmunoanálisis
competitivo para la detección de colágeno del tipo I.
El colágeno constituye una importante proteína
estructural en el tejido conjuntivo de la piel, los cartílagos y
los huesos. Se conocen 11 tipos, los cuales constan en cada caso de
tres cadenas. Cada tipo se compone de 1 - 3 diferentes cadenas, las
cuales son designadas como \alpha1, \alpha2 y \alpha3 (E.
Miller y colaboradores en Methods in Enzymology 144, Structural and
Contractile Proteins (proteínas estructurales y contráctiles),
compilador L. Cunningham, Academic Press Inc. 1987, páginas 3 - 41).
Una propiedad característica del colágeno maduro de determinados
tejidos, tales como especialmente huesos o cartílagos, es el
entrecruzamiento de fibras situadas unas junto a otras mediante
hidroxilisil-piridinolina o
lisil-piridinolina (D. Fujimoto y colaboradores, J.
Biochem 83 (1978), 863-867; D. Eyre y colaboradores,
Ann. Rev. Biochem 53 (1984), 717-748 y D. Eyre,
Methods in Enzymology 144 (1987), 115-139). Estos
entrecruzamientos se pueden utilizar como marcadores bioquímicos
para la detección específica de colágeno (Z.
Gunja-Smith y colaboradores, Biochem. J. 197 (1981),
759-762). Al degradarse el colágeno extracelular,
los derivados de hidroxilisil-piridinolina o
lisil-piridinolina, que contienen cadenas laterales
de péptidos, o los derivados de piridinolina libres con radicales
lisilo o hidroxilisilo, tal como se describen en el documento de
patente PCT WO 91/10141, llegan a líquidos corporales tales como
sangre u orina. La detección de estos compuestos en líquidos
corporales proporciona por lo tanto indicaciones acerca de la
degradación de colágeno extracelular, tal como aparece ésta p. ej.
en el caso de la osteoporosis y como consecuencia de tumores del
tejido óseo. Para la detección de tales hidroxilisil- o
lisil-piridinolinas con cadenas laterales de
péptidos, se describieron en el documento WO 89/12824 anticuerpos
monoclonales, que se habían obtenido por inmunización con
correspondientes fragmentos de colágeno entrecruzados, los cuales
se pueden aislar a partir de la orina. También en el caso del
procedimiento descrito en el documento WO 91/08478, la detección de
colágeno se efectúa a través de un anticuerpo contra productos de
degradación de colágeno naturales, es decir entrecruzados que han
sido producidos in vivo.
Una desventaja de estos péptidos aislados a
partir de fuentes naturales consiste en que no está presente en el
ensayo ninguna fuente segura para una producción reproducible de los
antígenos o participes en la fijación. Otra desventaja de los
péptidos aislados a partir de fuentes naturales la constituye el
peligro de una contaminación con material
infeccioso.
infeccioso.
Se pueden obtener antígenos definidos p. ej.
mediante síntesis química de un péptido, que corresponde a un
epítopo del antígeno. Si para ello se utilizan péptidos pequeños con
un peso molecular de aproximadamente 700 - 1.500 D, se necesita la
fijación a una molécula de soporte, a fin de obtener un antígeno con
efecto inmunógeno. Mediante la fijación a la molécula de soporte no
se debe modificar en tal caso la estructura del epítopo. El
acoplamiento a la molécula de soporte se efectúa por lo tanto hasta
ahora preferiblemente en los extremos de la cadena del péptido a
una distancia suficiente de la supuesta zona con epítopo (Laboratory
Technics in Biochemistry and Molecular Biology, Synthetic
Polypeptides as Antigens (técnicas de laboratorio en bioquímica y
biología molecular, polipéptidos sintéticos como antígenos),
compiladores R.H. Burdon y P.H. van Knippenberg, Elsevier,
Amsterdam, Nueva York, Oxford, 1988, páginas 95 - 100).
Un problema que se plantea al efectuar la
síntesis química de un antígeno definido, que corresponde a un
producto natural de degradación de colágeno entrecruzado, lo
constituye la estructura de la hidroxilisil- o
lisil-piridinolina que resulta del entrecruzamiento,
cuya síntesis química no se ha conseguido hasta ahora.
Fue misión del presente invento, por lo tanto,
poner a disposición un antígeno definido para la producción de
anticuerpos contra colágeno del tipo I o de fragmentos de colágeno
de este tipo, para su empleo como partícipes específicos en la
fijación del anticuerpo contra colágeno o fragmentos de colágeno en
un inmunoanálisis competitivo y como material de patrón para el
establecimiento de una curva patrón o de calibración en un
inmunoanálisis competitivo para la detección de colágeno o de
fragmentos de colágeno del tipo I.
Hasta ahora, siempre se partía del supuesto de
que para la detección de colágeno o de productos de degradación de
colágeno en una muestra, sería necesario detectar las estructuras de
entrecruzamiento de péptidos, de por sí o denominados
entrecruzados, que se formaban por el entrecruzamiento de los
radicales hidroxilisilo o lisilo, puesto que esta estructura de
hidroxilisil- o lisil-piridinolina es característica
para un colágeno. Ejemplos de tales métodos de detección se
describen en los documentos WO 89/12824, WO 91/08478, WO 89/04491 y
WO 91/10141.
Se encontró por fin, sorprendentemente, que para
la resolución de la misión antes mencionada es suficiente utilizar
un antígeno definido, un partícipe en la fijación o material de
patrón, que contiene un péptido lineal sintético, que corresponde a
una secuencia de la zona del extremo de N, lineal y no helicoidal,
de colágeno del tipo I o a la secuencia SEQ ID NO 1 de la zona del
extremo de C no helicoidal de colágeno del tipo I y no contiene
ningún entrecruzamiento con hidroxilisil- o
lisil-piridinolina. Las ventajas en el caso de
utilizarse péptidos lineales sintéticos para su utilización como
participes en la fijación en inmunoanálisis, como material de
patrón o como inmunógeno en la producción de anticuerpos, consiste
en que estos péptidos, en contraposición con péptidos procedentes
de fuentes naturales, se pueden preparar de manera reproducible en
una estructura exactamente definida. Además de ello, un
inmunoanálisis, en el que se emplean tales péptidos sintéticos
cortos, muestra una menor susceptibilidad a perturbaciones.
Es objeto del invento, por lo tanto, un
inmunoanálisis competitivo para la detección de colágeno del tipo I
o de fragmentos de colágeno de este tipo en una muestra, el cual
está caracterizado porque un participe en la fijación, que contiene
un péptido lineal sintético, que contiene un péptido lineal
sintético, que corresponde a una secuencia de la zona del extremo
de N, lineal y no helicoidal, de colágeno del tipo I, o a la
secuencia SEQ ID NO 1 de la zona del extremo de C no helicoidal de
colágeno del tipo I y no contiene ningún entrecruzamiento con
hidroxilisil- o lisil-piridinolina, se incuba con un
anticuerpo, que es capaz de fijar al péptido lineal sintético, y
con la muestra, y se determina de manera apropiada la fijación del
anticuerpo al partícipe en la fijación.
Otro objeto del invento es la utilización de un
antígeno que contiene un péptido lineal sintético, que corresponde
a una secuencia de la zona del extremo de N no helicoidal de
colágeno del tipo I o a la secuencia SEQ ID NO 1 de la zona del
extremo de C no helicoidal de colágeno del tipo I y no contiene
ningún entrecruzamiento con hidroxilisil- o
lisil-piridinolina, como material de patrón para el
establecimiento de una curva patrón o de calibración en un
inmunoanálisis competitivo para la detección de colágeno del tipo I
o de fragmentos de colágeno de este tipo
Como péptidos lineales sintéticos son apropiadas
todas las secuencias conexas de aminoácidos de la zona del extremo
de N no helicoidal de colágeno del tipo I o la secuencia SEQ ID NO 1
de la zona del extremo de C no helicoidal de colágeno del tipo I,
que no contiene ningún entrecruzamiento con hidroxilisil- o
lisil-piridinolina. Estas zonas son conocidas a
partir de los artículos de Chu y colaboradores, Nature 310,
337-340 (1984), Click y colaboradores, Biochemistry
9, 4.699-4.706 (1970), Morgan y colaboradores, J.
Biol. Chem. 245, 5.042-5.048 (1970), y Bernard y
colaboradores, Biochemistry 22, 5.213-5.223 (1983).
Preferiblemente, se utilizan péptidos a base de por lo menos 5
aminoácidos, de modo especialmente preferido a base de por lo menos
8 aminoácidos. En tal caso no es necesario que la secuencia abarque
la zona del entrecruzamiento. Sin embargo, se puede solapar muy
bien asimismo con esta zona. En ningún caso, sin embargo, se
presenta en el péptido sintético un entrecruzamiento con
hidroxilisil- o lisil-piridinolina. El péptido con
la secuencia mostrada en SEQ ID NO 1, procedente de la zona del
extremo de C de la cadena \alphal de colágeno, es especialmente
apropiado.
La concentración de productos de degradación de
colágeno es un marcador de diagnóstico importante para la magnitud
de una osteolisis. Con ayuda de los péptidos lineales sintéticos es
posible llevar a cabo un inmunoanálisis competitivo para la
detección de colágeno o de fragmentos de colágeno.
Sorprendentemente, se ha puesto de manifiesto que estos péptidos
compiten muy bien con los fragmentos de colágeno, que se presentan
en muestras naturales tales como plasma, suero u orina, en cuanto a
anticuerpos contra estos fragmentos de colágeno y por consiguiente
hacen posible un ensayo competitivo. Tales anticuerpos contra
colágeno o productos de degradación de colágeno son obtenibles
comercialmente, por ejemplo en el estuche (kit) de
radioinmunoanálisis de telopéptidos ICTP [^{125}I] de la Entidad
Orion Diagnostica, Finlandia. Sin embargo, se pueden también
conforme al invento mediante el péptido lineal sintético. El
documento WO-A 90/08915 describe un ensayo para la
detección de colágeno del tipo IX, mediante un anticuerpo
monoclonal, que había sido producido mediante péptidos sintéticos,
que constituyen secuencias del dominio globular NC 4. Las
condiciones en el caso de colágeno del tipo IX no se pueden
comparar con las de colágeno del tipo I; especialmente, en el
dominio globular no aparece en el caso de colágeno del tipo IX
ningún entrecruzamiento característico. En el documento
EP-A-0298210 se utiliza para la
inmunización de animales una secuencia de péptidos, a fin de obtener
anticuerpos que reconozcan al procolágeno del tipo III. El
procolágeno no constituye ningún marcador de diagnóstico para la
osteolisis.
Para su empleo en un inmunoanálisis competitivo,
el péptido lineal sintético se puede utilizar directamente como
participe en una fijación, que está unido a una fase sólida, o
también se puede acoplar a un segundo componente. El acoplamiento
al segundo componente se efectúa preferiblemente a través de los
aminoácidos en los extremos de N y C del péptido lineal.
Eventualmente entre el péptido y el segundo componente se puede
insertar además un espaciador. El segundo componente puede servir
por ejemplo para acoplar el péptido indirectamente a una fase
sólida. Ejemplos de ello son conocidos por un experto en la materia.
Preferiblemente, el péptido es acoplado a albúmina de suero bovino
y el producto del acoplamiento es fijado por adsorción a una fase
sólida, por ejemplo a un tubito de material sintético. El péptido
puede ser también unido covalentemente a biotina. La adhesión a la
fase sólida se efectúa entonces a través de la fijación a avidina o
estreptavidina, que a su vez se había fijado a la fase sólida. El
segundo componente puede servir también como soporte para varios
péptidos, por ejemplo en un inmunoanálisis de inhibición
turbidimétrica competitiva (TINIA), estando acoplados varios
péptidos por ejemplo a albúmina, inmunoglobulinas,
\beta-galactosidasa, polímeros tales como
polilisina o moléculas de dextrano tal como se describen en el
documento EP-A-0.545.350, o
partículas tales como látex. Preferiblemente, se acoplan de 30 a 40
moléculas de péptidos por cada molécula de soporte. El péptido puede
estar acoplado también a un componente que constituye una
marcación. Ejemplos de todas estas variantes de ensayo son
conocidos por un experto en la materia.
En la realización de los ensayos, el anticuerpo
puede ser incubado de modo simultáneo o consecutivo con la muestra
así como con el participe en la fijación, que contiene el péptido
lineal sintético. A continuación, de un modo usual, se determina la
cantidad del anticuerpo fijado o no fijado. Como variantes de ensayo
competitivas para la determinación de la cantidad de anticuerpos
fijados o no fijados pueden servir por ejemplo ensayos de
aglutinación, tales como el TINIA, o los principios de FPIA
(inmunoanálisis de polarización con fluorescencia) (W. Dandliker y
colaboradores, J. Exp. Med. 122 (1965), 1.029), de EMIT
(inmunoanálisis multiplicado de enzimas) (Gunzer y colaboradores,
Kontakte III (1980), 3-11) y de CEDIA (Henderson y.
colaboradores, Clinical Chemistry 32 (1986),
1.637-1.641). Los péptidos conformes al invento se
han manifestado como especialmente apropiados para la utilización
como partícipes definidos en la fijación para la competición con la
muestra en cuanto a la fijación a los anticuerpos. Es especialmente
preferido el péptido lineal sintético con la secuencia que se
muestra en SEQ ID NO 1.
Después de la determinación de la magnitud de la
fijación del anticuerpo al participe en la fijación, que constituye
una medida de la cantidad de antígeno en la muestra, se puede
determinar la cantidad exacta de antígeno en la muestra de un modo
usual por comparación con un patrón tratado de igual manera.
Como patrón se pueden utilizar productos de
degradación de colágeno aislados a partir de un material natural.
Estos se distinguen sin embargo naturalmente por una determinada
fluctuación. Se ha manifestado más apropiado como material de
patrón un antígeno, que contiene el péptido lineal sintético
conforme al invento. El antígeno del patrón puede constar en tal
caso solamente de este péptido o también de este péptido, que está
acoplado a un soporte apropiado, que sirve por ejemplo para obtener
la mejor solubilidad en agua del péptido. Para la preparación del
material de patrón a partir del péptido y del soporte, se sintetiza
el péptido lineal, que corresponde a una secuencia de la zona del
extremo de N no helicoidal de colágeno del tipo I, o a la secuencia
SEQ ID NO 1 de la zona del extremo de C no helicoidal de colágeno
del tipo I, y no contiene ningún entrecruzamiento con hidroxilisil-
o lisil-piridinolina, y se une a la molécula de
soporte a través de su aminoácido del extremo de N ó C mediante
métodos apropiados de acoplamiento. Se pueden unir uno o varios
péptidos por cada molécula de soporte. Eventualmente, el
acoplamiento puede efectuarse a través de un espaciador. Para
determinadas finalidades, tales como por ejemplo para ensayos de
aglutinación, puede ser ventajoso fijar a una molécula de soporte
varios péptidos conformes al invento de diferentes secuencias,
sobre todo en el caso de que se empleen en el ensayo anticuerpos
policlonales, que no habían sido producidos con ayuda del antígeno
conforme al invento y por consiguiente reconocen la mayor parte de
las veces a varios epítopos.
Como anticuerpos en el inmunoanálisis
competitivo se pueden utilizar los anticuerpos ya conocidos contra
productos de degradación de colágeno. Son apropiados también los
anticuerpos, que se habían obtenido con ayuda de un antígeno que
contiene el péptido sintético lineal conforme al invento.
Para la inmunización, los péptidos sintéticos
lineales, que corresponden a una o varias secuencias de la zona del
extremo de C ó N no helicoidal de colágeno del tipo I, deben ser
fijados a una proteína de soporte apropiada, tal como por ejemplo
hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero bovino o
edestina. Para la producción de estos antígenos o inmunógenos, se
sintetizan químicamente de un modo usual en primer lugar los
péptidos lineales. A continuación, se efectúa el acoplamiento de
los péptidos sintéticos con las proteínas de soporte antes
mencionadas, a través del grupo amino del extremo de N, mediante el
éster N-hidroxi-succinimídico de
ácido maleinimido-hexanoico. Se ha puesto de
manifiesto que para la producción de anticuerpos, que son apropiados
para la realización competitiva del ensayo, se adecuan
especialmente péptidos lineales sintéticos con la secuencia que se
muestra en SEQ ID NO 1, 2 ó 3.
Con los antígenos, que contienen un péptido
lineal sintético, que corresponde a una secuencia de zona del
extremo de C ó N no helicoidal de colágeno del tipo I, es posible
obtener anticuerpos, que reconocen no solamente al péptido conforme
al invento sino también a los productos de degradación de colágeno,
que se presentan en líquidos corporales.
La producción de anticuerpos contra colágeno o
fragmentos de colágeno, se puede efectuar mediante inmunización con
un antígeno conforme al invento y aislamiento del anticuerpo deseado
a partir del suero de los animales inmunizados según procedimientos
conocidos. Preferiblemente, el aislamiento del anticuerpo deseado se
efectúa a través de inmunoadsorción a un péptido que tiene la
secuencia mostrada en SEQ ID NO 1, 2 ó 3, acoplado a una proteína de
soporte, preferiblemente a Sepharose.
La producción de anticuerpos monoclonales contra
colágeno o fragmentos de colágeno se puede efectuar mediante
inmunización con un antígeno conforme al invento, inmortalización de
las células esplénicas (de bazo) de los animales inmunizados,
clonación de las células esplénicas inmortalizadas, que producen los
anticuerpos deseados, y aislamiento del anticuerpo a partir de las
células clonadas o a partir del material sobrenadante de cultivo de
estas células.
La inmunización se efectúa en los animales
utilizados usualmente para ello; preferiblemente, se utilizan
ratones o conejos.
La inmortalización de las células esplénicas de
los animales inmunizados se efectúa según procedimientos habituales
para un experto en la materia, tales como p. ej. la técnica del
hibridoma (Köhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495 - 497) o por
transformación con el virus de Epstein-Barr (=
transformación con EBV). Para la detección de las células
inmortalizadas, que producen los deseados anticuerpos, se incuba una
muestra del material sobrenadante de cultivo en un usual
inmunoanálisis con el antígeno conforme al invento, utilizado para
la inmunización, y se investiga si un anticuerpo se fija a este
antígeno.
Los anticuerpos policlonales y monoclonales no
solamente reaccionan con el hapteno conforme al invento utilizado
para la inmunización, sino que igualmente reaccionan bien con
colágeno, así como con los productos naturales de degradación de
colágeno que son encontrados en líquidos corporales.
Los anticuerpos se pueden utilizar por lo tanto
en los procedimientos antes descritos de detección para la
determinación de colágeno o de fragmentos de colágeno.
Los anticuerpos policlonales o monoclonales se
pueden utilizar para la determinación de la osteolisis por
incubación del anticuerpo con una muestra de tejido y determinación
del producto de degradación de colágeno que se fija al
anticuerpo.
El invento se explica con mayor detalle mediante
los siguientes Ejemplos en vinculación con los protocolos de
secuencias.
- La SEQ ID NO 1
- muestra la secuencia de un péptido conforme al invento a base de 9 aminoácidos, significando Xaa un aminoácido cualquiera.
- La SEQ ID NO 2
- muestra la secuencia de un péptido comparativo a base de 16 aminoácidos.
- La SEQ ID NO 3
- muestra la secuencia de un péptido comparativo a base de 10 aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos que presentan una secuencia parcial
de la secuencia de aminoácidos de colágeno, con las secuencias
mostradas en los protocolos de secuencias SEQ ID NO 2 y 3, se
preparan mediante síntesis de péptidos en fase sólida con
fluorenil-metiloxi-carbonilo (Fmoc)
en a) un sintetizador de péptidos Labortec SP 640 o b) un
sintetizador de péptidos Zinsser Analytic SMPS 350.
\vskip1.000000\baselineskip
En el orden de sucesión indicado se emplean en
cada caso 4,0 equivalentes de los siguientes
Fmoc-derivados de aminoácidos:
- Lys
- con grupo protector terc.-butiloxicarbonilo
- Glu
- con grupo protector éster terc.-butílico
- Gln
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Pro
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Pro
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Gln
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Pro
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Leu
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Phe
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Ser
- con grupo protector terc.-butil-éter
- Phe
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Asp
- con grupo protector éster terc.-butílico
- Phe
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Gly
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Ala
- sin grupo protector de la cadena lateral
- Ser
- con grupo protector terc-butil-éter
- Acetil
- anhídrido de ácido acético
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos o derivados de aminoácidos son
disueltos en
N-metil-pirrolidona.
El péptido es sintetizado junto a 3 g de 4-
(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi-resina
(Tetrahedron
Letters 28 (1987), 2.107) con una carga de 0,87 mmol/g (JACS 95 (1973), 1.328). Las reacciones de acoplamiento se llevan a cabo durante 60 minutos en lo referente al Fmoc-derivado de aminoácido con 4,4 equivalentes de diciclohexil-carbodiimida y 4,8 equivalentes de N-hidroxi-benzotriazol en dimetilformamida como medio de reacción. El éxito del acoplamiento se controla mediante el ensayo de Kaiser (Anal. Biochem 34 (1970), 595) en la resma sintética lavada con isopropanol. Si en este caso se establece una conversión química todavía incompleta, esta conversión es completada mediante acoplamiento posterior según las condiciones antes indicadas. Después de cada etapa de síntesis se separa el grupo Fmoc mediante piperidina al 20% en dimetilformamida en el transcurso de 20 minutos. La carga en la resina se determina mediante adsorción de UV (ultravioletas) del grupo fulveno puesto en libertad después de cada tratamiento con piperidina. Después de la síntesis, la carga es todavía de 0,68 mmol/g.
Letters 28 (1987), 2.107) con una carga de 0,87 mmol/g (JACS 95 (1973), 1.328). Las reacciones de acoplamiento se llevan a cabo durante 60 minutos en lo referente al Fmoc-derivado de aminoácido con 4,4 equivalentes de diciclohexil-carbodiimida y 4,8 equivalentes de N-hidroxi-benzotriazol en dimetilformamida como medio de reacción. El éxito del acoplamiento se controla mediante el ensayo de Kaiser (Anal. Biochem 34 (1970), 595) en la resma sintética lavada con isopropanol. Si en este caso se establece una conversión química todavía incompleta, esta conversión es completada mediante acoplamiento posterior según las condiciones antes indicadas. Después de cada etapa de síntesis se separa el grupo Fmoc mediante piperidina al 20% en dimetilformamida en el transcurso de 20 minutos. La carga en la resina se determina mediante adsorción de UV (ultravioletas) del grupo fulveno puesto en libertad después de cada tratamiento con piperidina. Después de la síntesis, la carga es todavía de 0,68 mmol/g.
La puesta en libertad del péptido desde la
resina sintética y la separación de los grupos protectores
inestables frente a ácidos se efectúa con 80 ml de ácido
trifluoroacético, 5 ml de etanoditiol, 2,5 g de fenol, 2,5 ml de
m-cresol y 5 ml de agua en 60 minutos a la
temperatura ambiente.
La solución de reacción es concentrada a
continuación en vacío. El residuo es recogido en diisopropil-éter,
agitado enérgicamente durante 1/2 - 2 horas y luego separado por
filtración. A continuación, el material es purificado previamente
mediante una cromatografía de penetrabilidad en gel en presencia de
Sephadex G15, utilizándose como agente de elución ácido acético al
0,5%. El material bruto obtenido es a continuación separado por
filtración y aislado mediante una cromatografía de líquido de alto
rendimiento (HPLC) preparativa en presencia de Nucleosil RP18
(columna de 40 mm x 250 mm, 300 \ring{A}, 5 \mum) a través de un
gradiente de desde 100% del tampón A (agua, ácido trifluoroacético
al 0,1%) hasta 100% del tampón B (60% de acetonitrilo, 40% de agua,
0,1% de ácido trifluoroacético) en el transcurso de 120 minutos. La
identidad del material eluido es comprobada mediante espectrometría
de masas con bombardeo por átomos rápidos
(FAB-MS).
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido fue preparado junto a 30 mg de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi-resina
SA 5030 de la entidad Advanced Chemtech con una carga de 0,47
mmol/g. De los siguientes Fmoc-derivados de
aminoácidos se acoplaron dos veces en cada caso 140 \mumol en
común cada vez con 140 \mumol de
1-hidroxi-benzotriazol en
dimetilformamida (DMF) y 10 \mumol de
N,N-diisopropil-carbodiimida en DMF,
con el péptido fijado a la fase sólida, que se ha de constituir:
- Glu
- con grupo protector tritilo
- Ser
- con grupo protector terc.-butilo
- Asp
- con grupo protector terc.-butilo
- Pro
- |
- Leu
- |
- Phe
- > en cada caso sin grupo protector de la cadena lateral
- Gly
- |
- Ala
- |
\vskip1.000000\baselineskip
Los períodos de tiempo de acoplamiento fueron de
30 y 40 minutos. El período de tiempo de separación fue de 20
minutos y se llevó a cabo con una solución de piperidina al 50% en
DMF. Las etapas de lavado se llevaron a cabo con DMF ocho veces
después de cada etapa de reacción. La puesta en libertad del péptido
se efectuó por tratamiento de la resina, que ha sido separada del
disolvente por filtración y lavada con diclorometano y metanol, con
1 ml de una solución de ácido trifluoroacético al 90%, tioanisol al
3%, etanoditiol al 3% y tiocresol al 3% en el transcurso de 20
minutos y 140 minutos. El producto se precipitó por adición de 15
ml de diisopropil-éter frío al material filtrado reunido y se aisló
por filtración. El residuo se disolvió en un ácido acético al 50% y
se liofilizó. Se obtuvieron 8 mg de un liofilizado de color blanco
con una pureza de 79% según la HPLC. La identidad fue confirmada
mediante espectrometría de masas con FAB.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido preparado según el Ejemplo la) fue
activado mediante acilación con
maleinimido-hexanoíl-N-hidroxi-succinimida
(MHS). Para esto, se disuelven 0,1 mmol del péptido en 20 ml de un
tampón fosfato de potasio 0,1 mmol/l de pH 7,5, se mezclan con una
solución de 0,1 mmol de MHS en 6 ml de dioxano y se agitan durante
20 min a 20ºC. A continuación se ajusta a pH 4 el valor del pH con
ácido acético glacial y la mezcla de reacción se liofiliza
inmediatamente. El material liofilizado se disuelve en 5 ml de agua
y se purifica a través de una HPLC preparativa en una columna con
Waters Delta-Pak® C18 (100 \ring{A}, 15 \mum, de
50 x 300 mm) a través de un gradiente de elución de desde 100% del
tampón A (agua, ácido trifluoroacético al 0,1%) hasta 100% del
tampón B (99,9% de acetonitrilo, 0,1% de ácido
trifluoroacético).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe el acoplamiento de péptidos
activados a hemocianina de lapa de bocallave (KLH de
Keyhole Limpet Hemocyanine), albúmina de suero
bovino (RSA, de Rinderserumalbumin) y
\beta-galactosidasa (\betaGal). Para el
acoplamiento de los péptidos activados con MHS según el Ejemplo 2 es
necesario que la proteína de soporte lleve grupos SH libres. La
\betaGal ya tiene a éstos de modo natural, y por lo tanto no
necesita de ningún tratamiento previo adicional. En los casos de
KLH y RSA los grupos NH_{2} de la cadena lateral
\varepsilon-amino de radicales de lisina son
derivatizados por tratamiento con
N-succinimidil-S-acetil-tiopropionato
(SATP) y con ello son transformados en grupos SH.
Se obtiene por consiguiente una proteína de
soporte, que presenta un número de grupos SH elevado con relación
al estado nativo. Para ello, a una solución de 1,39 g de KLH en 500
ml de un tampón de fosfato de potasio 0,1 mol/l, de pH 8,5, se le
añaden gota a gota en el transcurso de 20 min 113,51 mg de SATP
(disueltos en 10 ml de dioxano). Después de haber agitado durante
30 min a 20ºC, el valor del pH de la solución de reacción se ajusta
posteriormente a pH 8,5 con lejía de sosa 0,1 mol/l y se agita
durante otras 24 horas. A continuación, la solución es aumentada de
concentración hasta 100 ml con ayuda de una celda Amicon (con
membrana YM1O), es dializada 3 veces cada vez durante 24 (3 x 24)
horas, en cada caso frente a 3 l de un tampón de fosfato de potasio
0,1 mol/l de pH 8,5 y cloruro de sodio 0,05 mol/l, y a continuación
es liofilizada.
Para la separación del grupo protector
S-acetilo, se disuelven 481 mg del liofilizado de
KLH-SATP en 20 ml de un tampón de fosfato de
potasio 0,1 mol/l de pH 8,5 y cloruro de sodio 0,05 mol/l, se
mezclan con 0,5 ml de una solución de hidroxilamina 1 mol/l
recientemente preparada, y se agita durante 90 min a 20ºC.
7,23 mol del péptido activado, obtenido a partir
del Ejemplo 2, en 4 ml de agua se añaden a la proteína de soporte
derivatizada y se agitan a 20ºC durante 20 horas. A continuación, la
solución turbia se dializa 2 veces frente a 1 l de un tampón de
fosfato de potasio 0,1 mol/l, de pH 8,5, y cloruro de sodio 0,05
mol/l. El material dializado se centrifuga, el material
sobrenadante transparente se separa por decantación y se
liofiliza.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada caso 5 corderos fueron inmunizados de
manera en sí conocida con el inmunógeno del Ejemplo 3. Los
inmunógenos contenían el péptido con la secuencia mencionada en SEQ
ID NO 2, que corresponde a los aminoácidos números 892 hasta 907 en
la secuencia de la cadena \alpha de colágeno del tipo I. Como
proteína de soporte sirvió KLH o
\beta-galactosidasa. Los animales fueron
inmunizados a intervalos mensuales con los inmunógenos en adyuvante
completo de Freund. La dosis fue de 500 \mug por cada animal y
cada inmunización. A los cuatro meses después de la primera
inmunización se extrajeron muestras de sangre y los anticuerpos
obtenidos se comprobaron en cuanto a reacción con fragmentos de
colágeno.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se utilizaron el material y los reactivos
siguientes:
Las cavidades de las placas de titulación fueron
llenadas en cada caso con 100 \mul de una solución, que contenía
10 \mug/ml de fragmentos de colágeno en un tampón de
revestimiento. Los fragmentos de colágeno se prepararon
correspondientemente a los datos que se presentan en el documento de
solicitud de patente europea EP-A 0.505.210,
mediante digestión del colágeno humano procedente de huesos, con una
proteasa. Después de una incubación durante una hora a la
temperatura ambiente mediando sacudimiento, se lavó tres veces con
la solución de lavado.
Los antisueros fueron diluidos con el tampón de
incubación a 1 : 4.000 y se incubaron en cada caso 100 \mul en
las cavidades de la placa de microtitulación durante una hora
mediando sacudimiento a la temperatura ambiente. A continuación las
cavidades se lavaron tres veces con una solución de lavado.
Un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano
con anticuerpos de conejo contra la parte Fc de IgG de cordero, se
diluye en el tampón de incubación hasta llegar a la concentración de
12,5 mU/ml y los pocillos de la placa de microtitulación se cargan
en cada caso con 100 \mul de aquél. Después de una incubación
durante una hora, mediando sacudimiento a la temperatura ambiente,
las placas de titulación se lavan tres veces con una solución de
lavado.
Se añaden a ello 100 \mul de una solución de
substrato y se incuban, hasta que se haga manifiesto un desarrollo
de color (10 - 60 minutos). La extinción se determina como medición
de diferencias a 405 y 492 nm.
Los sueros de la mayor parte de los animales
pusieron de manifiesto una intensa reacción con los fragmentos de
colágeno situados sobre la fase sólida. El suero de un animal no
inmunizado manifestó en iguales condiciones solamente una débil
señal de medición. Los resultados están representados en la Tabla
1.
Las cavidades de una placa de microtitulación,
que tiene 96 de ellas, se revisten durante una noche a 4ºC según el
documento EP-A 0.344.578 con estreptavidina (100
\mul de una solución de 1 \mug/ml en PBS) y los sitios de
fijación inespecíficos, todavía libres, se bloquean mediante
incubación con 300 \mul de BSA (albúmina de suero bovino,
10 mg/ml) durante 2 horas a la temperatura ambiente.
10 mg/ml) durante 2 horas a la temperatura ambiente.
El decapéptido con la secuencia mostrada en SEQ
ID NO 3, que se había preparado según el Ejemplo 1b), es biotinilado
en el extremo de amino con el éster N-succinimídico
de ácido
D-biotinil-\varepsilon-amido-caproico
(Boehringer Mannheim, Nº de catálogo 1008960) de acuerdo con los
datos del fabricante. El péptido biotinilado es disuelto en PBS
(solución salina tamponada con fosfato de Phosphate
Buffered Saline), Tween 20 al 0,05%, BSA al 1% en una
concentración de 10 ng/ml, y por incubación durante 1 hora de 100
\mul por cada cavidad es fijado en la placa de microtitulación
revestida con estreptavidina. A continuación de ello, el péptido no
fijado se elimina lavando tres veces con PBS y Tween 20 al
0,05%.
En cada caso 150 \mul de la muestra a
investigar (suero, plasma o un patrón) se incuban con 150 \mul
del anticuerpo según el Ejemplo 4 durante 2 horas a 37ºC (o durante
una noche a 4ºC). En cada caso 100 \mul de esta tanda se añaden
al decapéptido fijado en las cavidades de la placa de
microtitulación y se incuban durante 60 minutos a 37ºC. En tal caso
solamente el exceso de anticuerpo del antisuero, todavía no fijado
después de la incubación con la muestra, se puede fijar al
decapéptido inmovilizado.
Después de lavar tres veces con PBS/Tween 20 al
0,05% se detecta el anticuerpo fijado por subsiguiente incubación
con un conjugado de IgG anti-conejo y POD
(Boehringer Mannheim GmbH nº de catálogo 1238850) y ABTS®
(1 mg/ml).
(1 mg/ml).
Con el ensayo (ensayo competitivo MTP) se
sometieron a medición 164 sueros de pacientes. Los resultados
fueron puestos en relación con los datos que se habían determinado
con un radioinmunoanálisis (RIA). Este RIA de
ICTP (telopéptidos de ICTP [^{125}I de Orion Diagnostica,
Finlandia) se basa en fragmentos entrecruzados de colágeno, que son
preparados y aislados mediante digestión enzimática y procedimientos
bioquímicos. A partir de la Figura 1 se desprende por tanto que el
procedimiento aporta unos valores de medición que se correlacionan
bien con los valores del RIA, es decir que el procedimiento
proporciona datos clínicamente relevantes. Se determinó un
coeficiente de correlación de 0,959.
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO 2.
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (2)
1. Inmunoanálisis competitivo para la detección
de colágeno del tipo I o de fragmentos de colágeno de este tipo en
una muestra, caracterizado porque
un partícipe en la fijación, que contiene un
péptido lineal sintético, y que corresponde a una secuencia de la
zona del extremo de N no helicoidal de colágeno del tipo I o a la
secuencia SEQ ID NO 1 de la zona del extremo de C no helicoidal de
colágeno del tipo I y no contiene ningún entrecruzamiento con
hidroxilisil- o lisil-piridinolina,
se incuba con un anticuerpo, que es capaz de
fijar al péptido lineal sintético,
y con la muestra,
y se determina de manera apropiada la fijación
del anticuerpo al participe en la fijación.
2. Utilización de un antígeno, que contiene un
péptido lineal sintético, y que corresponde a una secuencia de la
zona del extremo de N no helicoidal de colágeno del tipo I o a la
secuencia SEQ ID NO 1 de la zona del extremo de C no helicoidal de
colágeno del tipo I y no contiene ningún entrecruzamiento con
hidroxilisil- o lisil-piridinolina, como material de
patrón para el establecimiento de una curva patrón o de calibración
en un inmunoanálisis competitivo para la detección de colágeno o de
fragmentos de colágeno del tipo I.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
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