ES2119769T5 - Derivado del factor viii humano recombinante. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA APLICAR UN REVESTIMIENTO DURO SOBRE NUCLEOS DE MATERIAL COMESTIBLE O MASCABLE Y MATERIAL REVESTIDO OBTENIDO SEGUN EL METODO UN METODO PARA APLICAR UN REVESTIMIENTO DE SORBITOL DURO A NUCLEOS DE MATERIAL COMESTIBLE O MASCABLE DONDE LOS NUCLEOS SE ENCUENTRAN EN UN LECHO MOVIL. LOS NUCLEOS SE RECUBREN A BASE DE APLICAR UNA SUSPENSION QUE CONTENGA SORBITOL SEGUIDO DEL ALISADO Y DESHIDRATADO EN UNO O MAS CICLOS. A CONTINUACION COLOCA UN REVESTIMIENTO DURO A PRESION CON UNA SUSPENSION DE SORBITOL, SEGUIDO DE UN POLVO DE SORBITOL DESHIDRATADO EN MAS CICLOS Y SE LLEVA A CABO EL ACABADO, EN UNO O MAS CICLOS, CON UN REVESTIMIENTO DURO CON UNA SUSPENSION QUE CONTENGA SORBITOL. SE OBTIENE UNA GRAGEA CON UN REVESTIMIENTO DE SORBITOL CRUJIENTE CUANDO SE MASTICA.

Description

Derivado de factor VIII humano recombinante.

La presente invención se refiere a una secuencia de DNA que codifica un factor VIII humano recombinante biológicamente activo, a un vector de expresión recombinante que contiene dicha secuencia de DNA, a células huésped transformadas con dicho vector de expresión recombinante, y a un procedimiento para preparar el derivado de factor VIII humano recombinante. La invención cubre también el derivado de factor VIII humano recombinante que comprende dos polipéptidos unidos por un puente de ion metálico.

Antecedentes de la invención

La hemofilia clásica o hemofilia A es el más común de los trastornos hemorrágicos heredados. Es un resultado de una deficiencia en el factor VIII de coagulación sanguínea ligada al cromosoma X. Afecta casi exclusivamente a los varones, y la incidencia es de uno a dos individuos por cada 10.000 hombres. El defecto en el cromosoma X es transmitido por portadores femeninos que no son ellos mismos hemofílicos. Dependiendo del tipo de mutación del cromosoma X, el factor VIII es disfuncional, o bien está ausente, lo cual conduce a una coagulación sanguínea retardada. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia anormal a la hemorragia, y antes de que se introdujese el tratamiento con concentrados de factor VIII, la duración de vida media para una persona con hemofilia A grave era inferior a 20 años. El empleo de concentrados de factor VIII procedentes de plasma ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes hemofílicos. La duración media de vida se ha incrementado grandemente, y la mayoría de los pacientes tienen la posibilidad de llevar una vida más o menos normal. No obstante, se han dado ciertos problemas con los concentrados y su uso. Los más graves han sido la transmisión de virus. Hasta la fecha los virus causantes del SIDA, de la hepatitis B, y de la hepatitis no A no B, han atacado a la población hemofílica de manera considerable. Recientemente se han introducido diversos métodos de inactivación de virus en los procesos de producción de muchos concentrados comerciales. Están llegando también al mercado nuevos concentrados de factor VIII sumamente purificados que se espera sean mucho más seguros en comparación con los concentrados antiguos por lo que respecta al riesgo de transmisión de virus. No obstante, no puede garantizarse la ausencia de virus. Además, los concentrados son bastante caros ya que el plasma materia prima es asimismo caro a causa de su limitada
disponibilidad.

Es probable que un factor VIII recombinante resuelva una gran cantidad de los problemas asociados con el uso de concentrados de factor VIII derivados del plasma. En vista de la necesidad de un factor VIII recombinante para el tratamiento de la hemofilia A, un par de grupos está trabajando actualmente en el desarrollo de un producto semejante. Sin embargo, el desarrollo de un factor VIII recombinante ha encontrado algunas dificultades. Uno de los mayores problemas reside en producir factor VIII recombinante con rendimientos suficientemente altos. La mayoría del trabajo de desarrollo realizado se ha hecho usando el gen de cDNA que codifica la molécula de factor VIII de longitud completa.

Esta invención describe un cDNA de factor VIII sometido a deleción que codifica un derivado de factor VIII recombinante, correspondiente, en lo que se refiere a peso molecular y otras características bioquímicas, a una forma de factor VIII de plasma descrito con anterioridad, presente en cantidades considerables en concentrados comerciales (Anderson, L-O. y otros (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983). El nivel de expresión obtenido al expresar esta molécula en un cultivo de células animales ha resultado ser considerablemente mayor en comparación con el uso del cDNA de factor VIII sometido a deleción de longitud completa para expresar el factor VIII. Es probable que el nuevo cDNA de factor VIII sometido a deleción proporcione rendimientos de factor VIII recombinante suficientemente elevados para ser empleado en un procedimiento industrial para una preparación farmacéutica de factor VIII recombinante.

Definiciones empleadas

En las secciones que siguen, la nomenclatura de los diferentes dominios estructurales del factor VIII de longitud completa, monocatenario, de 2.332 aminoácidos, es similar a la definida por Vehar, G.A. y otros (1984), Nature 312, 337-342. De acuerdo con esto, los dominios A1 y A2 están contenidos dentro de la forma de cadena pesada del factor VIII de aproximadamente 200 kDa (aminoácidos 1 a 1648) hasta aproximadamente 90 kDa (aminoácidos 1 a 740). Los dominios A3, C1 y C2 están contenidos dentro de la cadena ligera del factor VIII de aproximadamente 80 kDa (aminoácidos 1649 a 2332). El dominio B constituye la región media, fuertemente glicosilada, del factor VIII monocatenario de longitud completa, o bien la parte C-terminal de la forma de 200 kDa de la cadena pesada del factor VIII (aminoácidos 741 a 1648). La expresión "derivado de deleción de factor VIII" se define como una o más cadenas polipeptídicas que tienen actividad de factor VIII:C derivadas del polipéptido de factor VIII de cadena completa por deleción de uno o más aminoácidos. La expresión "factor VIII:QD" se define como una cadena polipeptídica derivada del polipéptido de factor VIII de cadena completa, que carece de los aminoácidos 745 a 1562. La expresión "factor VIII:RE" se define como una cadena polipeptídica derivada del polipéptido de factor VIII de cadena completa, que carece de los aminoácidos 741 a 1648. La expresión "factor VIII:SQ" se define como una cadena polipeptídica derivada del polipéptido de factor VIII de cadena completa, que carece de los aminoácidos 743 a 1636.

Técnica anterior

Se ha demostrado que, en plasma fresco preparado en presencia de inhibidores de proteasa, el factor VIII tiene un peso molecular de 280 kDa y está compuesto por dos cadenas peptídicas con pesos moleculares de 200 kDa y 80 kDa, respectivamente (Andersson, L-O. y otros (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983). Estas cadenas se mantienen unidas por puentes de ion metálico. Se han encontrado formas más o menos degradadas proteolíticamente de la molécula de factor VIII como fragmentos activos en material de factor VIII purificado procedente de concentrados comerciales (Andersson, L-O. y otros (1986), (Andersson y otros (1985), patente europea EP 0197901). Las formas fragmentadas de factor VIII que tienen pesos moleculares de 260 kDa hasta 170 kDa, consistían en una cadena pesada con un peso molecular desde 180 kDa hasta 90 kDa (todas las variantes tienen extremos N-terminales idénticos) en combinación con la cadena ligera de 80 kDa. La región N-terminal de las cadenas pesadas es idéntica a la del factor VIII monocatenario obtenido de los datos de secuencia nucleotídica del cDNA de factor VIII (Wood, W.I., y otros (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A. y otros (1984), Nature 312, 337-342).

La forma activa más pequeña, con un peso molecular de 170 kDa, que contiene una cadena de 90 kDa y otra de 80 kDa, puede ser activada con trombina en el mismo grado que las formas de peso molecular superior. Representa por tanto una forma no activada. Se ha demostrado también que tiene actividad biológica completa in vivo, en el ensayo con perros hemofílicos (Brinkhous, K.M. y otros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756). Así, la eficacia hemostática era la misma que la de las formas de peso molecular superior del factor VIII. Además, existía un indicio de que la forma de 170 kDa tenía un tiempo de supervivencia in vivo 50% superior en comparación con las formas de peso molecular superior.

El hecho de que la parte media, fuertemente glicosilada, de la cadena polipeptídica del factor VIII situada entre los aminoácidos Arg-739 y Glu-1649 no parece ser necesaria para la actividad biológica completa, ha llevado a varios investigadores a intentar producir derivados de factor VIII recombinante que carezcan de esta región. Esto se ha conseguido mediante la deleción, parcial o completa, de una porción del cDNA que codifica la parte media, fuertemente glicosilada, del factor VIII.

Por ejemplo, J.J. Toole y otros han informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 982 a 1562 y 760 a 1639, respectivamente (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 5939-5942). D.L. Eaton y otros han informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 797 a 1562 (Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). R.J. Kaufman ha descrito la expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 741 a 1646 (solicitud PCT nº WO 87/04187). N. Sarver y otros han informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 747 a 1560 (DNA (1987) 6, 553-564). M. Pasek ha informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 745 a 1562, y de los aminoácidos 741 a 1648, respectivamente (solicitud PCT nº WO 88/00831). K.-D. Langner ha informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 816 a 1598, y de los aminoácidos 741 a 1689, respectivamente (Behring Inst. Mitt., (1988) nº 82, 16-25, patente europea 295597). P. Meulien y otros han informado de la construcción y expresión de factor VIII que carece de los aminoácidos 868 a 1562, y de los aminoácidos 771 a 1666, respectivamente (Protein Engineering (1988) 2(4), 301-306, documento EP 0.303.540 A1). Cuando se expresan estas formas sometidas a deleción de cDNA de factor VIII en células de mamíferos, el nivel de producción es típicamente 10 veces superior en comparación con el factor VIII de longitud completa.

Además, se han realizado intentos de expresar separadamente las cadenas de 90 kDa y 80 kDa a partir de dos derivados de cDNA diferentes en la misma célula (Burke, R.L. y otros (1986), J. Biol. Chem. 261, 12574-12578, Pavirani, A. y otros (1987), Biochem. Biophys. Res. Comm. 145, 234-240). Sin embargo, en este sistema la reconstitución in vivo parece tener limitada eficacia en términos de actividad de factor VIII:C recuperada.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para producir proteínas que se componen de una o más cadenas polipeptídicas que tienen actividad de factor VIII:C. Más específicamente, la presente invención proporciona una secuencia de cDNA modificada derivada del cDNA de factor VIII de longitud completa que, al ser expresada en células animales, da lugar a la producción con nivel elevado de una proteína con actividad de factor VIII:C, consistente esencialmente en dos cadenas polipeptídicas de peso molecular 90 kDa y 80 kDa, respectivamente.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona una secuencia de DNA que codifica un derivado de factor VIII humano recombinante, que comprende un primer segmento de DNA que codifica la cadena de 90 kDa de factor VIII humano y un segundo segmento de DNA que codifica la cadena de 80 kDa de factor VIII humano, estando dichos segmentos interconectados por un segmento de DNA enlazante que codifica un péptido enlazante de 14 residuos de aminoácido del dominio B del factor VIII humano, en el que dicho segmento de DNA enlazante codifica 12 residuos de aminoácido que proceden del extremo C-terminal y 2 residuos de aminoácido que proceden del extremo N-terminal del dominio B del factor VIII humano.

La invención también se refiere a un vector de expresión recombinante que contiene una unidad de transcripción que comprende la secuencia de DNA que se ha bosquejado anteriormente y, además, un promotor y una secuencia de señal de poliadenilación.

La invención cubre también células huésped de origen animal transformadas con el vector de expresión recombinante tal como se ha definido anteriormente.

La invención también se refiere a un procedimiento para fabricar un derivado de factor VIII humano recombinante biológicamente activo expresado por una secuencia de DNA que codifica un derivado de factor VIII humano recombinante biológicamente activo compuesto por dos cadenas polipeptídicas de peso molecular 90 kDa y 80 kDa, respectivamente, siendo dicha secuencia de DNA capaz de expresar, en una célula huésped apropiada, dicho derivado para la secreción desde dicha célula, y que comprende un primer segmento de DNA que codifica la cadena de 90 kDa de factor VIII humano y un segundo segmento de DNA que codifica la cadena de 80 kDa de factor VIII humano, estando dichos segmentos interconectados por un segmento de DNA enlazante que codifica un péptido enlazante de al menos 7 y de hasta 20 residuos de aminoácido del dominio B del factor VIII humano, procediendo al menos 4 de dichos residuos de aminoácido del extremo C-terminal de dicho dominio y procediendo al menos 2 residuos de aminoácido del extremo N-terminal de dicho dominio, proceso caracterizado por

a)

cultivar una línea de células animales transformada con un vector de expresión recombinante que contiene una unidad de transcripción que comprende dicha secuencia de DNA, un promotor y una secuencia de señal de poliadenilación en un medio nutriente;

b)

permitir la expresión y secreción de un derivado de factor VIII humano compuesto por dos polipéptidos con pesos moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente, unidos entre sí por un puente de ion metálico,

c)

recuperar del medio de cultivo dicho derivado; y

d)

formular dicho derivado en preparaciones farmacéuticas.

Para obtener una proteína con actividad de factor VIII:C compuesta por las anteriores dos cadenas polipeptídicas, la cadena polipeptídica sencilla creada durante la traducción in vivo debe ser escindida, bien sea por elaboración pos-traducción en la célula productora, o por elaboración proteolítica in vitro, o de ambas maneras. Puesto que puede aislarse de plasma humano proteína con actividad de factor VIII compuesta por las dos cadenas polipeptídicas de peso molecular 200 kDa y 80 kDa, se supone que existe un lugar de escisión adecuado para las enzimas de elaboración, de acuerdo con lo anterior, en el producto de traducción primario de factor VIII de longitud completa monocatenario. Con gran probabilidad, un lugar de elaboración in vivo importante está situado en el extremo carboxi-terminal de Arg-1648. Durante la maduración, la escisión en Arg-1648 da lugar a proteína de factor VIII compuesta por dos cadenas de pesos moleculares 200 kDa y 80 kDa. Puesto que Arg-1648 está situado al parecer en una frontera entre dominios estructurales de la molécula de factor VIII, constituye un blanco estéricamente accesible para la enzima o enzimas de elaboración. Es concebible que exista otro lugar de elaboración en Arg-740 que daría lugar a la conversión in vitro de la cadena de 200 kDa en una cadena de 90 kDa, creando así las formas de factor VIII de 90 kDa y 80 kDa presentes en concentrados comerciales de factor VIII derivado de plasma humano. De acuerdo con la presente invención, se ha hallado que, para producir un derivado de deleción de factor VIII que pueda ser elaborado, bien sea in vivo o in vitro, o de ambas maneras, para dar una proteína bicatenaria compuesta de cadenas polipeptídicas de 90 kDa y 80 kDa, debe conservarse la secuencia de aminoácidos que rodean a Arg-740 y Arg-1648, a fin de preservar los requisitos estructurales para la correcta escisión. Más específicamente, si por ejemplo se eliminan los aminoácidos 743 a 1636 del polipéptido de factor VIII de cadena completa, se obtiene una nueva cadena polipeptídica en la cual existen 14 aminoácidos que enlazan Arg-740 y Arg-1648. De estos 14 aminoácidos, la secuencia de los cinco amino-terminales corresponde directamente a los cinco aminoácidos que siguen a Arg-740 en el factor VIII de longitud completa. Del mismo modo, la secuencia de los 12 aminoácidos carboxi-terminales del anterior fragmento de 14 aminoácidos corresponde directamente a los 12 aminoácidos que preceden a Glu-1649 en el factor VIII de longitud completa, creando así un solapamiento de 3 aminoácidos entre las regiones N- y C-terminales del dominio B.

Para producir a un nivel elevado una proteína de factor VIII:SQ compuesta de dos cadenas polipeptídicas de acuerdo con lo anterior, el cDNA que codifica este derivado por deleción del factor VIII es ensamblado en una unidad de transcripción eficaz, junto con elementos reguladores adecuados, en un vector de clonación que puede ser propagado en E. coli de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Del DNA cromosómico de células eucariotas pueden derivarse elementos reguladores de transcripción eficaces. Por ejemplo, pueden utilizarse combinaciones promotor-reforzador, preferentemente metalotienina, beta-actina o GRP78, procedentes de genes transcritos de manera fuertemente constitutiva. También pueden derivarse elementos reguladores de transcripción eficaces de virus que tengan células eucariotas como sus huéspedes naturales. Por ejemplo, pueden utilizarse combinaciones promotor-reforzador derivadas de virus que residen en huéspedes animales, preferentemente el reforzador y promotor que se encuentran en la repetición larga terminal del virus del sarcoma de Rous, el virus símico 40, el promotor tardío principal de adenovirus, y el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Para obtener cantidades de nivel elevado y estables de mRNA transcrito desde el cDNA de factor VIII:SQ, la unidad de transcripción debe contener en su parte 3-proximal una región que codifique una secuencia de poliadenilación de terminación de transcripción. Preferentemente, esta secuencia se deriva de la región de transcripción temprana del virus símico 40, o del gen de la beta-globina del conejo.

El cDNA de factor VIII:SQ ensamblado en una unidad de transcripción eficaz es introducido a continuación en un organismo huésped adecuado para expresar la proteína de factor VIII:SQ. Preferentemente, este organismo debe ser una línea celular animal de origen vertebrado, para asegurar el plegamiento, formación de enlaces disulfuro y secreción correctos, así como otras modificaciones pos-traducción. Son ejemplos de estas últimas la glicosilación ligada a asparagina, la O-sulfatación de tirosina, y la elaboración proteolítica de la monocadena polipeptídica naciente, que es esencial para la formación de la proteína de factor VIII bicatenaria de 90 kDa y 80 kDa. Son ejemplos de líneas celulares que pueden utilizarse: células COS de mono, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, y preferentemente células CHO.

La unidad de transcripción que codifica el cDNA de factor VIII:SQ puede ser introducida en una línea celular animal de varias maneras diferentes. Un ejemplo de éstas es crear recombinantes entre la unidad de transcripción anterior y vectores basados en diferentes virus animales. Son ejemplos de los mismos vectores basados en el virus de la viruela vacuna, en el virus SV40, y preferentemente en el virus del papiloma bovino.

La unidad de transcripción que codifica el cDNA de factor VIII:SQ puede ser introducida también en una línea de células animales conjuntamente con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador seleccionable dominante en estas células, a fin de facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que han integrado el DNA recombinante en el genoma. Son ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes la aminoglicósido-fosfotransferasa Tn5 (resistencia a geneticina, G418), y la puromicina-acetiltransferasa (resistencia a puromicina). La unidad de transcripción que codifica un gel marcador seleccionable semejante puede residir o no en el mismo vector que la que codifica la unidad de factor VIII:SQ. Puede ser codificada también en un vector separado que es simultáneamente introducido e integrado en el genoma de la célula huésped, lo que con frecuencia da como resultado una estrecha unión física entre las diferentes unidades de transcripción.

Otros tipos de genes marcadores seleccionables dominantes que pueden ser utilizados junto con el cDNA de factor VIII:SQ están basados en diversas unidades de transcripción que codifican dihidrofolato-reductasa (dhfr). Tras la introducción de este tipo de gen en células que carecen de actividad endógena de dhfr, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG-44), éstas serán capaces de crecer en un medio que carezca de nucleósidos. Un ejemplo de dicho medio es el F12 de Ham sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos genes de dhfr pueden ser utilizados en combinación con la unidad de transcripción de factor VIII:SQ en células CHO del tipo anterior, bien sea unidos dentro del mismo vector, o en dos vectores diferentes, creando así líneas celulares dhfr-positivas que producen proteína de factor VIII:SQ recombinante.

Si las anteriores líneas celulares se hacen crecer en presencia del inhibidor de dhfr citotóxico metotrexato, emergerán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína de factor VIII:SQ recombinante a un ritmo elevado debido al número amplificado de unidades de transcripción de dhfr y de factor VIII:SQ unidas. Cuando se propagan estas líneas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10.000 nM), pueden obtenerse nuevas líneas celulares que produzcan la proteína de factor VIII:SQ a un ritmo muy elevado.

Las anteriores líneas celulares que producen la proteína de factor VIII:SQ pueden ser cultivadas a gran escala, bien sea en cultivo en suspensión o bien sobre diversos soportes sólidos. Son ejemplos de estos soportes microsoportes basados en matrices de dextrano o de colágeno, o bien soportes sólidos en forma de fibras huecas o diversos materiales cerámicos. Cuando son cultivadas en cultivo en suspensión o sobre microsoportes, el cultivo de las anteriores líneas celulares puede ser realizado bien como un cultivo por lotes o bien como un cultivo de perfusión, con producción continua de medio acondicionado a lo largo de prolongados períodos de tiempo. Así, de acuerdo con la presente invención, las anteriores líneas celulares son muy adecuadas para el desarrollo de un procedimiento industrial para la producción de factor VIII:SQ recombinante que corresponde al auténtico factor VIII de dos cadenas polipeptídicas (90 kDa y 80 kDa) que puede ser aislado del plasma humano.

La proteína de factor VIII:SQ recombinante que se acumula en el medio de las células CHO del tipo anterior puede ser concentrada y purificada mediante diversos métodos bioquímicos, incluyendo métodos que utilizan diferencias en tamaño, carga, solubilidad, hidrofobicidad, afinidad específica, etc., entre la proteína de factor VIII:SQ y otras sustancias presentes en el medio acondicionado.

Un ejemplo de una purificación semejante es la adsorción de la proteína de factor VIII:SQ recombinante a un anticuerpo monoclonal que está inmovilizado sobre un soporte sólido. Tras la desorción, la proteína de factor VIII:SQ puede ser purificada adicionalmente mediante diversas técnicas cromatográficas basadas en las propiedades anteriormente citadas.

La proteína con actividad de factor VIII descrita en esta invención puede ser formulada en preparaciones farmacéuticas para el uso terapéutico. La proteína de factor VIII:SQ recombinante producida puede ser disuelta en soluciones tampón acuosas, fisiológicamente compatibles, convencionales, a las cuales pueden añadirse, opcionalmente, coadyuvantes farmacéuticos para proporcionar preparaciones farmacéuticas.

La presente invención será descrita con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes de la misma. Esta descripción de realizaciones específicas de la invención se hará en unión con los dibujos adjuntos, en los cuales:

la Figura 1 es una representación esquemática de la relación entre el factor VIII de longitud completa y el factor VIII:SQ. Se muestra la estructura primaria de la región entre el extremo C-terminal de la cadena de 90 kDa y el extremo N-terminal de la cadena de 80 kDa. La flecha vertical indica el enlace peptídico que es escindido para proporcionar el producto bicatenario;

la Figura 2 es una ilustración del plásmido pKGE436 que contiene el cDNA de factor VIII:SQ bajo control de transcripción del promotor de citomegalovirus humano;

la Figura 3 es una ilustración del plásmido pKGE327 que contiene el cDNA de dihidrofolato-reductasa de ratón bajo control de transcripción de la repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón;

la Figura 4 es una ilustración de inmunotinción de factor VIII:SQ recombinante tras electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico;

la Figura 5 muestra un diagrama de cambios en la actividad de factor VIII, de factor VIII:SQ recombinante, después de incubación con trombina; y

la Figura 6 ilustra el cambio en las figuras de SDS-PAGE e inmunotinción de factor VIII:SQ recombinante, después de incubación con \alpha-trombina humana.

Ejemplo 1

Se ha construido un derivado de deleción de cDNA de factor VIII que codifica una cadena polipeptídica desprovista de la mayoría del dominio B, pero que contiene partes de las secuencias amino-terminales y carboxi-terminales del dominio B que son esenciales para la elaboración proteolítica in vivo del producto de traducción primario para dar dos cadenas polipeptídicas.

Mutagénesis de cDNA de factor VIII

De acuerdo con los métodos estándar de la técnica se introdujo en el vector de bacteriófago M13mp19 (Yanisch-Perron, C. y otros (1985) Gene 33, 103-119), un fragmento de restricción KpnI-PstI de 894 pares de bases, obtenido del cDNA del derivado de deleción del factor VIII:QD (M. Pasek, solicitud PCT nº WO88/00831) que codifica los aminoácidos Leu 587 hasta Ala 1702. Se utilizó el clon de fago recombinante resultante como fuente para la preparación de DNA monocatenario utilizado como plantilla para la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Nakamaye, K. y Eckstein, F. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698). Se reanillaron (término correspondiente al inglés "annealing", o hibridación de extremos complementarios) 10 \mug de DNA de vector monocatenario circular purificado, a 8 pmoles de un oligonucleótido 5'-fosforilado con la siguiente secuencia:

5'-GCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAGAATCCACCAGTCTTGAAACGC-3'

La segunda cadena de DNA circular fue sintetizada sobre la plantilla resultante de la adición de los cuatro deoxinucleótidos, dCTP\alphaS, 12 unidades de fragmento Klenow de DNA-polimerasa I, y 12 unidades de DNA-ligasa T4. Después de incubar durante una noche, se enriqueció la mezcla de reacción en DNA bicatenario filtrando a través de nitrocelulosa en presencia de NaCl 500 mM. Se generaron muescas (término inglés "nick") sobre una quinta parte del DNA bicatenario purificado, mediante incubación con 5 unidades de la enzima de restricción NciI, y se trató con 50 unidades de Exonucleasa III de manera tal que se eliminó parcialmente la cadena plantilla del DNA del fago. El dúplex parcial resultante fue reconvertido a DNA bicatenario mediante tratamiento con 3 unidades de DNA-polimerasa I y 2 unidades de DNA-ligasa T4 en presencia de los cuatro deoxinucleótido-trifosfatos a 16ºC durante 3 horas. Se utilizó una cuarta parte de la mezcla resultante para transformar 300 \mul de TG1 de E. coli. De los clones de fago mutagenizados resultantes, se sometieron diez a secuenciamiento de dideoxi (Sanger, F. y otros 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Uno de los clones de fagos resultante mostró la secuencia nucleotídica esperada, indicando que se había eliminado un segmento de 228 pares de bases que corresponde a los aminoácidos Asp 1563 hasta Ser 1637 del factor VIII:QD. Esto crea un nuevo fragmento KpnI-PstI de 666 pares de bases del cDNA del factor VIII dentro del vector M13mp19, que codifica una fusión entre Phe 742 y Ser 1637 de la proteína de factor VIII (factor VIII:SQ).

Construcción de un vector de expresión en mamíferos que codifica el factor VIII:SQ

De la forma replicativa, bicatenaria, del DNA de fago M13mp19 se aisló el fragmento KpnI-PstI de 666 pares de bases que codifica la fusión del factor VIII:SQ de acuerdo con lo indicado anteriormente, y se introdujo en el vector pKGE431. Este vector consiste en un fragmento KpnI-SphI de 2.046 pares de bases procedente del cDNA de factor VIII:RE (M. Pasek, solicitud PCT nº WO88/00831, admisión ATCC nº 53517) que codifica los aminoácidos Leu 587 hasta Met 2176 de la proteína del factor VIII:RE en pUC19. Para acomodar el fragmento KpnI-PstI de 666 pares de bases del factor VIII:SQ de una manera deseada, se tuvo que abrir el DNA de pKGE431 mediante digestión completa con KpnI y digestión parcial con PstI. Se aisló el fragmento de pKGE431 en el cual PstI había realizado la escisión en una posición correspondiente a Ala 1702 en la proteína de factor VIII:RE, y se ligó al anterior fragmento KpnI-PstI del cDNA de factor VIII:SQ, creando el vector pKGE432. Se digirió con KpnI y ApaI este último vector, y se ligó el correspondiente fragmento KpnI-ApaI de 1.700 pares de bases, que codificaba desde Leu 587 hasta Ala 2047 de la proteína de factor VIII:SQ, al fragmento grande del vector pKGE347 que había sido digerido con KpnI y ApaI. El vector pKGE347, que está basado en el vector de clonación en E. coli pBR327, se compone del reforzador/promotor de citomegalovirus humano codificado en un segmento de DNA de 741 pares de bases (posiciones de nucleótidos -671 a +71, Boshart, M. y otros (1985) Cell 41, 521-530), aguas arriba del cDNA del factor VIII:QD, con el intrón t-antígeno SV40 y la secuencia de poliadenilación en la parte 3'-proximal. El vector resultante (pKGE436), que está dibujado en la Figura 2, contiene el cDNA completo de factor VIII:SQ, y es idéntico a pKGE347 salvo por el diferente derivado de deleción de factor VIII que está codificado.

Ejemplo 2 Transfección de células ováricas de Hámster Chino

En una placa de cultivo de células de 10 centímetros de diámetro se sembraron, en medio de Eagle modificado por Dulbecco/medio de Ham F12 (1:1) suplementado con 10% de suero fetal de bovino, 0,5 millones de células ováricas de Hámster Chino deficientes en dihidrofolato-reductasa (CHO-DG44, obtenidas del Dr. L.A. Chasin, Columbia University, New York), y se incubaron durante una noche a 37ºC en un incubador de dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente se lavaron las células con medio fresco, y a continuación se transfectaron por el método del fosfato cálcico, con 10 \mug de una mezcla 1:1 del vector de expresión pKGE436 de factor VIII:SQ y el vector pKGE437 de dihidrofolato-reductasa, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. El vector pKGE327 contiene una unidad de transcripción que se compone de la repetición terminal larga del virus de tumor mamario de ratón, aguas arriba del cDNA de dihidrofolato-reductasa de ratón, con el t-antígeno de SV40 y la secuencia de poliadenilación en la parte 3'-proximal, clonados en el vector pML2 en el sentido de las agujas del reloj (Figura 3). El tercer día se retiró el medio, se lavaron las células, y se dividieron a nuevas placas de cultivo celular. El cuarto día se inició la selección de las células positivas para dihidrofolato-reductasa, sustituyendo el medio por el anterior medio de cultivo celular careciente de hipoxantina, glicina y timidina, y suplementado con 10% de suero fetal de bovino perfectamente dializado. Se cambió dos veces por semana el medio, y al cabo de aproximadamente dos semanas se pudieron cosechar colonias de células positivas para dihidrofolato-reductasa. Se hicieron continuar creciendo estas colonias en frascos de cultivo de 25 cm^{2}, y tras haber alcanzado la subconfluencia, se sustituyó el medio por medio fresco que contenía 3% de suero fetal de bovino. Tras un período de 24 horas se ensayó la actividad de factor VIII:C en el medio de cultivo empleando el método de sustrato sintético (Coatest factor VIII:C, KABI). Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1.

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TABLA 1 Líneas celulares de CHO-DG44 productoras de FVIII:SQ

Nº de línea	Ensayo Coatest	Nº de línea	Ensayo Coatest
celular	(mU/ml)	celular	(mU/ml)
208:1		10		208:13		107
2		73		14		167
3		147		15		253
4		27		16		253
5		107		17		313
6		80		18		307
7		73		19		27
8		87		20		287
9		93		21		393
10		33		22		467
11		47		23		107
12		147		24		180

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Amplificación de gen de las líneas celulares de CHO-DG44 que producen factor VIII:SQ

Se eligió la línea celular 208:22 de CHO-DG44 de la Tabla 1, que producía 467 mU/ml/día de factor VIII:SQ, para la amplificación adicional de gen, mediante selección y crecimiento en metotrexato. Tras varias semanas de cultivo en metotrexato 20 nM, la línea celular 208:22 había originado varios clones celulares resistentes nuevos. Se cosecharon individualmente estos clones y se expandieron adicionalmente como cultivos separados tal como se ha descrito anteriormente. Se determinó la productividad de factor VIII:C en el medio, de estos clones, del mismo modo que en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 2.

TABLA 2 Líneas celulares amplificadas, productoras de factor VIII:SQ, derivadas de la línea celular 208:22 de CHO-DG44

Nº de línea	Ensayo Coatest	Nº de línea	Ensayo Coatest
celular	(mU/ml)	celular	(mU/ml)
208:22:1		1.040		208:22:13		1.070
2		690		14		860
3		660		15		930
4		720		16		680
5		800		17		790
6		940		18		750
7		1.100		19		960
8		260		20		80
9		900		21		1.130
10		660		22		920
11		720		23		950
12		870		24		1.010

Ejemplo 3 Purificación y caracterización bioquímica de factor VIII:SQ

Se examinó en cuanto a características bioquímicas el factor VIII:SQ producido por la línea celular CHO-DG44 amplificada 208:22. Antes del estudio se realizó una purificación parcial del material de factor VIII del medio cultivo. Esta incluyó una etapa de cromatografía de inmunoafinidad con el uso de una matriz que contenía anticuerpos monoclonales dirigidos contra factor VIII, seguida de una etapa de cromatografía de intercambio iónico. La actividad específica del material de factor VIII purificado obtenido estaba en el intervalo de 3.000-4.000 IU/A_{280}, y la relación de actividad de factor VIII/antígeno de factor VIII era cercana a 1 (la actividad se midió con Coatest (KABI), y el antígeno se determinó mediante un ensayo ELISA con uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la cadena de 80 kDa). El material de factor VIII:SQ purificado fue sometido a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y análisis por tinción tipo Western. El SDS-PAGE se llevó a cabo de acuerdo con Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. Para el análisis por tinción tipo Western se utilizaron anticuerpos de conejo policlonales anti-factor VIII humano, y el análisis se realizó esencialmente como describen Towbin, H. y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos. Pista 1: factor VIII plasmático que contiene una cadena ligera de 80 kDa y cadenas pesadas que varían de 200 kDa a 90 kDa. Pistas 2 y 3: factor VIII:SQ recombinante que contiene una cadena de 80 kDa y una cadena de 90 kDa. Se purificaron tal como se ha descrito anteriormente materiales originados de dos lotes diferentes de factor VIII:SQ. El análisis demostró así la presencia de dos bandas principales en el material de factor VIII:SQ; una a 90 kDa, y una banda doblete a 80 kDa. Las dos bandas se encontraban en la misma posición sobre el gel que los péptidos de 90 kDa y 80 kDa que representan el complejo biológicamente activo más pequeño de factor VIII plasmático. En el material de factor VIII:SQ se encontró también una cantidad secundaria de una banda de 170 kDa (menos de 5% del material total), representando probablemente producto de traslación primario sin escindir. Además, la determinación, con degradación de Edman automatizada, de la secuencia N-terminal de la proteína de factor VIII:SQ indicó que los extremos N-terminales de las cadenas de 90 kDa y de 80 kDa eran idénticos a los de factor VIII de 90 kDa más 80 kDa derivado de plasma. Este resultado demostró así que la elaboración proteolítica in vivo del producto de traducción primario para dar dos cadenas polipeptídicas había sido
eficaz.

El factor VIII:SQ pudo ser activado por la trombina humana de una manera dependiente de la dosis. A continuación siguió la inactivación. En la Figura 5 se muestra la curva de los cambios de actividad obtenidos cuando se añadieron 0,1 U de trombina por 1 U de factor VIII:SQ purificado. Para la valoración inmediata de muestras de la mezcla de reacción se empleó un método de coagulación en una sola etapa (Mikaelson, M. y otros (1983) Blood 62, 1006-1015). En el espacio de un minuto se obtuvo una activación de 15 veces, que fue seguida de inactivación. Se añadió dodecilsulfato sódico en una concentración de 0,02 g/ml para detener la reacción en las muestras para análisis. Sobre las muestras tomadas a intervalos de tiempo durante la reacción se realizaron análisis mediante electroforesis en gel de DSD-poliacrilamida y de tinción tipo Western, con anticuerpos policlonales de conejo contra factor VIII humano (Figura 6). La electroforesis y la inmunotinción se realizaron tal como se ha descrito en relación con la Figura 4.

Los resultados obtenidos mostraron un cambio molecular de péptidos de factor VIII, durante la incubación con trombina, idéntico al de factor VIII de plasma. Así, el péptido de 90 kDa fue escindido por trombina y se formaron un péptido de 50 kDa más un péptido de 40 kDa. El péptido de 80 kDa fue escindido y se formó un péptido de 70 kDa. La banda débil observada a 170 kDa en la muestra de factor VIII:SQ desapareció durante el primer minuto de incubación con trombina, y aparentemente se formaron péptidos idénticos a los formados a partir del complejo de 90 kDa - 80 kDa. Los estudios con trombina mostraron que el factor VIII:SQ se comporta como factor VIII de plasma en la interacción con esta enzima. Esta característica se considera esencial para la actividad biológica in vivo.

Se estudió la interacción de factor VIII:SQ con factor de von Willebrand humano, mediante el empleo de cromatografía de exclusión por tamaño sobre Sepharose CL-6B. Se incubaron a 37ºC, durante 20 minutos, diez (10) IU de factor VIII:SQ con 30 U de factor de von Willebrand humano. Se aplicó a continuación la mezcla de incubación sobre una columna empaquetada con Sepharose CL-6B. Todo el material con actividad de factor VIII fue eluido en el volumen muerto, junto con factor de von Willebrand. Cuando se aplicó a la columna factor VIII:SQ sin factor de von Willebrand añadido, el material con actividad de factor VIII fue eluido sólo en las fracciones internas, en una posición en la cual también fue eluida la forma de 90 kDa-80 kDa de factor VIII de plasma. Este resultado muestra que el factor VIII:SQ tiene la capacidad de fijarse a factor de von Willebrand, lo cual es una propiedad necesaria para una buena supervivencia in vivo (Brinkhous, K.M. y otros (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756).

El DNA de factor VIII:SQ de la presente invención ha sido depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen el 13 de diciembre de 1989, y se le ha concedido el número de depósito DSM 5693.

Claims (5)

1. Una secuencia de DNA que codifica un derivado de factor VIII humano recombinante biológicamente activo compuesto por dos cadenas polipeptídicas de peso molecular 90 kDa y 80 kDa, respectivamente, siendo dicha secuencia de DNA capaz de expresar, en una célula huésped apropiada, dicho derivado para la secreción desde dicha célula, y que comprende un primer segmento de DNA que codifica la cadena de 90 kDa de factor VIII humano y un segundo segmento de DNA que codifica la cadena de 80 kDa de factor VIII humano, estando dichos segmentos interconectados por un segmento de DNA enlazante que codifica un péptido enlazante de 14 residuos de aminoácido del dominio B del factor VIII humano, en la cual dicho segmento de DNA enlazante codifica 12 residuos de aminoácido que proceden del extremo C-terminal y 2 residuos de aminoácido que proceden del extremo N-terminal del dominio B del factor VIII humano.

2. Una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho segmento de DNA enlazante codifica un fragmento enlazante que consiste en la secuencia Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Pro-Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg.

3. Un vector de expresión recombinante que contiene una unidad de transcripción que comprende la secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, un promotor y una secuencia de señal de poliadenilación.

4. Una célula huésped de origen animal transformada con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 3.

5. Un procedimiento para fabricar un derivado de factor VIII humano recombinante biológicamente activo expresado por una secuencia de DNA que codifica un derivado de factor VIII humano recombinante biológicamente activo compuesto por dos cadenas polipeptídicas de peso molecular 90 kDa y 80 kDa, respectivamente, siendo dicha secuencia de DNA capaz de expresar, en una célula huésped apropiada, dicho derivado para la secreción desde dicha célula, y que comprende un primer segmento de DNA que codifica la cadena de 90 kDa de factor VIII humano y un segundo segmento de DNA que codifica la cadena de 80 kDa de factor VIII humano, estando dichos segmentos interconectados por un segmento de DNA enlazante que codifica un péptido enlazante de al menos 7 y de hasta 20 residuos de aminoácido del dominio B del factor VIII humano, procediendo al menos 4 de dichos residuos de aminoácido del extremo C-terminal de dicho dominio y procediendo al menos 2 residuos de aminoácido del extremo N-terminal de dicho dominio, proceso caracterizado por

a)

cultivar una línea de células animales transformada con un vector de expresión recombinante que contiene una unidad de transcripción que comprende dicha secuencia de DNA, un promotor y una secuencia de señal de poliadenilación en un medio nutriente;

b)

permitir la expresión y secreción de un derivado de factor VIII humano compuesto por dos polipéptidos con pesos moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente, unidos entre sí por un puente de ion metálico,

c)

recuperar del medio de cultivo dicho derivado; y

d)

formular dicho derivado en preparaciones farmacéuticas.