ES2135249T5

ES2135249T5 - Receptor de estrogenos.

Info

Publication number: ES2135249T5
Application number: ES96931047T
Authority: ES
Inventors: George G.J. M. Kuiper; Eva Enmark; Jan-Ake Gustafsson
Original assignee: Karo Bio AB
Current assignee: Karo Healthcare AB
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-09
Publication date: 2009-09-10
Anticipated expiration: 2016-09-09
Also published as: AU715528B2; JP2005204667A; JP2002010788A; DK0792292T4; DE69603827T3; CA2201098C; AU6988096A; EP0792292B2; EP0792292A2; GR3031618T3; CA2201098A1; EP0935000A3; EP0935000A2; WO1997009348A3; KR100263137B1; EP0792292B1; WO1997009348A2; DE69603827D1; DE792292T1; JPH11502417A

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO RECEPTOR NUCLEAR RELACIONADO CON EL RECEPTOR DE ESTROGENO, DE AHORA EN ADELANTE LLAMADO "ER{BE}" QUE TIENE LA SECUENCIA DE AMINOACIDO DE LAS FIGS. 1, 13A O 14A O SUSTANCIALMENTE LA MISMA SECUENCIA DE AMINOACIDO QUE LA SECUENCIA DE AMINOACIDO MOSTRADA EN LAS FIGS. 1, 13A O 13B O UNA FUNCIONALIDAD DE SECUENCIA DE AMINOACIDO SIMILAR A ESA SECUENCIA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICAN EL RECEPTOR. EL RECEPTOR PUEDE SER UTIL EN EL AISLAMIENTO DE MOLECULAS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS COMO CANCER DE PROSTATA, HIPERPLASIA PROTATICA BENIGNA, OSTEOPOROSIS O TRASTORNOS CARDIOVASCULARES Y EN LA COMPROBACION DE EFECTOS ESTROGENOS Y OTROS EFECTOS HORMONALES EN SUSTANCIAS.

Description

Receptor de estrógenos.

Esta invención se refiere a receptores nucleares celulares y sus usos.

Se ha identificado una gran familia de receptores nucleares que confieren a las células sensibilidad a moléculas tales como ácido retinoide, vitamina D, hormonas esteroideas y hormonas tiroideas. Estudios exhaustivos han demostrado que los miembros de esta superfamilia de receptores nucleares activan y/o suprimen la transcripción de genes mediante la unión directa a elementos que actúan en cis separados denominados "elementos de respuesta a hormonas" (HRE). Se ha demostrado que estos HRE componen repeticiones de motivos de ADN hexanucleotídicos palindrómicos de consenso. La especificidad de los HRE se determina por la orientación de y el espaciamiento entre semi-sitios (es decir, la mitad de un secuencia palindrómica) (Umenesono K., et al, 1991 Cell 65, 1255-1266).

La unión a ADN específica está mediada por un dominio de unión a ADN fuertemente conservado que contiene dos dedos de cinc, que está conservado entre todos los receptores nucleares descubiertos de este modo. Tres aminoácidos en la base C-terminal del primer dedo de zinc (conocida como la "caja-P") son importantes para el reconocimiento de la secuencia de nucleótidos del semi-sitio. Los miembros de la superfamilia de receptores nucleares se han clasificado en diferentes grupos en base a la secuencia de aminoácidos dentro de la caja P.

Todos los miembros de la superfamilia de receptores nucleares contienen también un dominio N-terminal hipervariable y un dominio de unión a ligando que contiene algunos "territorios" de secuencia conservada. Uno de estos se denomina el "dominio Ti".

Las moléculas que se piensa que son receptores nucleares ya que están estructuralmente relacionadas con receptores caracterizados pero para las que no se ha encontrado un ligando se denominan "receptores huérfanos". Se han identificado muchos de dichos receptores huérfanos (véase, por ejemplo, Evans R. M. (1988) Science 24, 889-895 y O'Malley, B. (1990) Mol Endocrinol. 4 363-369).

Actualmente se ha identificado inesperadamente, inicialmente en rata, un nuevo receptor huérfano que está relacionado con el receptor de estrógenos conocido ER\alpha y que se ha denominado "ER\beta" (en concreto, "rER\beta" en rata). En esta memoria descriptiva, se usará "ER\beta" para referirse al receptor rER\beta. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de rER\beta se han determinado ahora y se muestran en la Figura 1.

De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un receptor de estrógenos (denominado ER\beta) que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 y un receptor de estrógenos que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de más del 95% con esa secuencia. El receptor aislado puede ser particularmente útil en la búsqueda de moléculas para usar en el tratamiento de enfermedades o afecciones, tales como enfermedades cardiovasculares, enfer-
medades o afecciones del sistema nervioso central u osteoporosis, cáncer de próstata o hiperplasia prostática benigna.

El receptor de la invención también puede usarse en el ensayo de químicos ambientales para determinar su actividad estrogénica. Ha habido una preocupación creciente sobre el efecto de diversos químicos liberados en el entorno sobre la reproducción de seres humanos y animales. Se han hecho evidentes amenazas para las capacidades reproductivas de aves, peces, reptiles y algunos mamíferos y se han propuesto efectos similares en seres humanos. Actualmente están surgiendo pruebas sustanciales que demuestran que la exposición a ciertos químicos durante periodos críticos de la vida fetal puede alterar el desarrollo de los órganos reproductores y el sistema inmune y nervioso. En base a posibles paralelismos entre los efectos reales sobre la fauna, observados por ejemplo en aves y focas que viven en áreas altamente contaminadas, y los efectos propuestos en seres humanos, en combinación con efectos reproductivos documentados en seres humanos causados por exposición prenatal al estrógeno farmacéutico, dietilestilbestrol (DES), se ha propuesto que los químicos "estrogénicos" amenazan la capacidad reproductiva tanto de animales como de seres humanos. Entre los químicos que se sabe o se sospecha que actúan como miméticos de estrógeno en el cuerpo humano o que alteran de otras formas el sistema endocrino humano, existen varios que ya se han identificado como riesgos ambientales. Entre los químicos que se han mencionado como causas potenciales de alteración de la función reproductiva en animales y seres humanos están compuestos orgánicos clorados como dieldrina, endosulfanos, clordanos, endrinas, aldrina, DDT y algunos PCB, plásticos tales como Bisfenol A, ftalatos y nonilfenol e hidrocarburos aromáticos. Algunos de los efectos propuestos en seres humanos se ha sugerido que se deben a una exposición creciente a estrógenos ambientales -de hecho, la exposición a compuestos químicos a los que reaccionan los organismos superiores durante el periodo fetal de un modo que es similar a cuando se exponen a altas dosificaciones de estrógenos. Los efectos se manifiestan, por ejemplo, por alteraciones de las características sexuales y potencial reproductivo reducido. En seres humanos, también se han analizado como posibles efectos riesgos elevados de cáncer de mama y otras enfermedades relacionadas con hormonas. Además de los efectos "estrogénicos" documentados, se ha demostrado recientemente que los contaminantes ambientales también pueden actuar sobre rutas hormonales distintas de la ruta estrogénica -se ha demostrado que el p,p'-DDE, el metabolito principal del DDT (también en seres humanos) es un agente bastante anti-androgénico (Kelce W. R. et al Nature 1995 375: 581-585). Los estudios epidemiológicos sobre estas cuestiones, sin embargo, son actualmente difíciles de interpretar. No obstante, existe una opinión creciente contra estos químicos que potencialmente alteran hormonas y una demanda pública y ambiental muy palpable para que las agencias gubernamentales y la industria tomen medidas. En vista de las similitudes entre el receptor de la presente invención, ER\beta y el receptor de estrógenos clásico, ER\beta puede usarse en el ensayo de químicos para determinar su efecto estrogénico.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica un receptor de estrógenos de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

El ER\beta es único en el sentido de que es extremadamente homólogo al receptor de estrógenos de rata, en particular en su dominio de unión a ADN. Parece que ER\beta tiene una distribución tisular muy limitada. En ratas hembra, parece estar presente solamente en los ovarios y en ratas macho en la próstata y los testículos. Puesto que estos tejidos son dianas clásicas para la acción de estrógenos, puede deducirse que ER\beta puede mediar algunos de los efectos del estrógeno.

La diferente especificidad de ligando de ER\alpha y ER\beta puede aprovecharse para diseñar agentes farmacéuticos que sean selectivos para cualquiera de los receptores. En particular, las diferencias en la especificidad de ligando pueden usarse para desarrollar fármacos que se dirijan específicamente a enfermedades cardiovasculares en mujeres postmenopáusicas u osteoporosis.

El receptor nuclear de la invención, ER\beta, un método para producirlo y ensayo sobre su funcionalidad se describirán ahora, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos, las Figuras 1 a 8, 10 a 12 y 15, en las que:

la Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de ER\beta y la secuencia de nucleótidos del gen que lo codifica;

la Figura 2A es un árbol filogenético que muestra la evolución de ER\beta y otros receptores;

la Figura 2B muestra la homología entre los diferentes dominios de ER\beta y ciertos otros receptores;

la Figura 2C es un alineamiento de la secuencia de aminoácidos en los dominios de unión a ligando de rER\beta, rER\alpha, mER\alpha y hER\alpha;

la Figura 2D es un alineamiento de la secuencia de aminoácidos en los dominios de unión a ADN de rER\beta, rER\alpha, mER\alpha y hER\alpha;

la Figura 3A es una autorradiografía en una película de glándula prostática que muestra una fuerte expresión de un clon del receptor de la invención, el clon 29;

la Figura 3B es una imagen de campo oscuro que muestra una señal marcada para el clon 29 en epitelio (e) de alvéolos prostáticos. El estroma o estromas presentan una señal más débil;

la Figura 3C es una imagen de bipolarización de una sección contrateñida con violeta de cresilo que muestra granos de plata sobre el epitelio (e), mientras que el estroma o estromas contienen menos granos:

La barra representa 0,7 mm para la Figura 3A, 200 \mum para la Figura 3B y 30 \mum para la Figura 3C;

la Figura 4A, muestra una autorradiografía en una película de ovario que muestra una fuerte expresión del clon 29 en folículos en diferentes estadios de desarrollo (algunos se indican mediante flechas). El tejido intersticial (puntas de flechas) muestra una baja señal;

la Figura 4B muestra una imagen de campo oscuro que muestra una alta expresión del clon 29 en células granulares de folículos primarios (1), secundarios (2), terciarios (3) y maduros (4). Está presente una baja señal en el tejido intersticial (it);

la Figura 4C es una imagen de bipolarización de ovario que muestra una fuerte señal en células granulares (gc) mientras que el ovocito (oc) y la teca interna (ti) carecen de una señal clara:

La barra representa 0,9 mm para la Figura 4A, 140 \mum para la Figura 4B y 50 \mum para la Figura 4C;

la Figura 5A ilustra los resultados de un análisis de saturación de la unión de ligandos de ER\beta clonado;

la Figura 5B ilustra la especificidad de la unión a ligando por ER\beta clonado;

la Figura 5C ilustra la unión a E2 por ER\beta;

la Figura 6 ilustra la activación de la transcripción por ER\beta clonado;

las Figuras 7 y 7A ilustran la estimulación mediante diversos ligandos por ER\beta clonado;

la Figura 8 ilustra los resultados de experimentos de RT-PCR sobre la expresión de receptores de estrógenos de rata;

la Figura 10A es una representación de Hill que compara la unión de ^{125}I-E2 por hER\alpha y rER\beta;

la Figura 10B es una representación de Scatchard que compara la unión de ^{125}I-E2 por hER\alpha y ER\beta;

la Figura 11A ilustra la afinidad de unión relativa de hER\alpha y rER\beta para diversos ligandos;

la Figura 11B es un detalle de la Figura 12A;

la Figura 12 es un alineamiento de diversos receptores de estrógenos; y

la Figura 15 ilustra las afinidades de unión a ligando para diversos fitoestrógenos por ER de la invención.

A. Clonación de ER\beta de rata 1. Amplificación por PCR y clonación de ADN complementario

Se diseñó previamente un conjunto de cebadores degenerados (DBD 1.2.3 y WAK/FAK) de acuerdo con las secuencias más altamente conservadas del dominio de unión a ADN (caja-P) y el dominio de unión a ligando (extensión Ti) de miembros de la familia de receptores nucleares (Enmark, E., Kainu, T., Pelto-Huikko, M., y Gustafsson, J-A (1994) Biochem. Byophys. Res. Commun. 204, 49-56). Se empleó ADN complementario de cadena sencilla obtenido por transcripción inversa de ARN total de próstata de rata con los cebadores en reacciones de PCR como se describe en Enmark, E., Kainu, T., Pelto-Huilkko, M., y Gustafsson. J-\ring{A} (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 49-56. Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% y se aislaron los productos de ADN entre 400 y 700 pb del gel y se ligaron en un vector de clonación TA (Invitrogen). Como alternativas, también se usaron los conjuntos de cebadores RP-I/RP-2 y DBD66-100/DBD210-238 en el dominio de unión a ADN de receptores nucleares exactamente como se describe por Hirose T., Fijimoto, W., Yamaai, T., Kim, K. H., Matsuura, H., y Jetten, A. M (1994) Mol. Endocrinol. 8, 1667-1677 y Chang, C., Lopes Da Silva, S., Ideta, R., Lee, Y., Yeh, S., y Burbach, J. P. H (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 6040-6044, respectivamente. El clon número 29 (obtenido con el conjunto DBD-WAK/FAK) con una longitud de 462 pb mostraba una alta homología (65%) con el ADNc de receptor de estrógenos de rata (65%) que se había clonado previamente a partir de útero de rata (Koike, S., Sakai, M., y Muramatsu, M. (1987) Nucleic Acids Res 15, 2499-2513). Los restos aminoacídicos predichos por las secuencias de ADN del clon 29 sugerían que este fragmento de ADN codificaba parte del dominio de unión a ADN, la región bisagra y el comienzo del dominio de unión a ligando de un nuevo miembro de la familia de receptores nucleares. Se usaron dos cebadores de PCR (Figura 1) para generar una sonda de 204 pb que consistía en la región bisagra del nuevo receptor, que se usó para explorar una genoteca de ADNc de próstata de rata (Clontech gt10) en condiciones rigurosas dando como resultado cuatro clones fuertemente positivos con un tamaño de 0,9 kb, 1,8 kb, 2,5 kb y 5-6 kb, respectivamente. El clon de 2,5 kb se secuenció y la Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos determinada en la instalación central (CyberGene AB) mediante secuenciación cíclica usando terminadores fluorescentes (Applied Biosystems) en ambas cadenas, con una serie de cebadores internos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon 29. Se localizaron dos codones ATG en fase de lectura en el nucleótido 424 y el nucleótido 448, precedidos por un codón de terminación en la fase de lectura en el nucleótido 319, que sugiere que son posibles codones de inicio. La fase de lectura abierta codifica una proteína de 485 restos aminoacídicos (contados desde la primera metionina) con un peso molecular calculado de 54,2 kDa. Los análisis de las proteínas mediante síntesis por traducción in vitro del ARNc del clon 29 en lisado de reticulocitos de conejo reveló una banda proteica que aparecía como un doblete que migraba aproximadamente 57 kDa en geles de SDS-PAGE (no se muestran los datos), confirmando la fase de lectura abierta. La banda proteica que aparecía como un doblete está probablemente causada por el uso de ambos codones ATG para el inicio de la síntesis de proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína del clon 29 muestra el dominio de unión a ADN con módulo de cinc característico, la región bisagra y un supuesto dominio de unión a ligando, que son los rasgos característicos de miembros de la familia de receptores nucleares (Tsai, M-J., y O'Malley, B. W (1994) Ann. Rev. Biochem. 63, 451-486; Härd, T., y Gustafsson, J-\ring{A} (1993) Acc. Chem. Res. 26, 644-650; Laudet, V.; Hänni, C., Coli, J., Catzeflis, F., y Stehelin, D (1992) EMBL J. 11, 1003-1012).

La comparación de secuencias de proteínas con varios miembros representativos de la familia de receptores nucleares (Figura 2) mostraba que la proteína del clon 29 estaba más relacionada con el receptor de estrógenos de rata (ER\alpha), clonado a partir del útero (Koike, S., Sakai M., y Muramatsu, M. (1987) Nucleic. Acids Res. 15, 2499-2513), con una identidad del 95% en el domino de unión a ADN (restos aminoacídicos 103-167) (Griffiths, K., Davies, P., Eaton, C. I., Harper, M. E., Turkes, A., y Peeling, W. B. (1991) en Endocrine Dependent Tumours, eds. Voigt, K-D. y Knabble, C. (Raven Press), págs. 83-125). Se han identificado varias características funcionales dentro del dominio de unión a ADN de receptores nucleares (Hard, T., y Gustafsson, J-\ring{A}, (1993) Acc. Chem. Res 26. 644-650 y Zilliacus, J., Carlstedt-Duke, J., Gustafsson, J-A., y Wright, A. P. H. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4175-4179). La denominada caja-P determina un reconocimiento de secuencia de nucleótidos del semi-sitio del núcleo dentro del elemento de respuesta, mientras que la caja-D media la dimerización entre monómeros de receptores. Las secuencias de la caja-P y la caja-D de la proteína del clon 29 EGCKA y PATNQ, respectivamente, son idénticas a las cajas correspondientes en ER\alpha (Härd, T., y Gustafsson, J-\ring{A}, (1993) Acc. Chem. Res 26, 644-650 y Koike. S., Sakai, M., y Muramatsu, M. (1987)
Nucleic Acids Res. 15, 2499-2513), prediciendo por lo tanto que la proteína del clon 29 se une a secuencias de ERE.

El supuesto dominio de unión a ligando (LBD) de la proteína del clon 29 (restos aminoacídicos 259-457) muestra una homología más próxima con el LBD del ER\alpha de rata (Figura 2), mientras que la homología con las proteínas ERR1 y ERR2 humanas (Giguere, V., Yang, N., Segui, P., y Evans R. M. (1988) Nature 331, 91-94) es considerablemente menor. Con los receptores de estrógenos humanos, de ratón y de xenopus la homología en el LBD también se aproxima al 55%, mientras que la homología con el LBD de otros receptores de esteroides no es significativa (Figura 2). Se ha identificado el resto de cisteína de 530 en el ER\alpha humano como el sitio de unión covalente de un marcador de afinidad estrogénico (Harlow, K. W., Smith D. N., Katzenellenbogen, J. A., Greene, G. L., y Katzenellenbogen, B. S. (1989) J. Biol. Chem. 264, 17476-17485). De forma interesante, la proteína del clon 29 (Cys-436) así como los ER\alpha de ratón, rata y xenopus, tienen un resto de cisteína en la posición correspondiente. Además, otros dos restos aminoacídicos que se ha descrito que están próximos a o son parte del bolsillo de unión a ligando del LBD del ER\alpha humano (Asp 426 y Gly 521) están conservados en el LBD de la proteína del clon 29 (Asp 333 y Gly 427) y en el LBD de ER\alpha de diversas especies (20.21). La función de transactivación dependiente de ligando TAF-2 identificada en ER\alpha (Danielian, P. S., White, R., Lees, J. A., y Parker, M. G. (1992) EMBO J. 11, 1025-1033), que se piensa que está implicada en poner en contacto otros factores de transcripción y, por lo tanto, influir en la activación de la transcripción de genes diana, está casi completamente conservada en la proteína del clon 29 (restos aminoacídicos 441-457). Los receptores de hormonas esteroideas son fosfoproteínas (Kuiper. G., y Brinkmann, A. O. (1994) Mol. Cell. Endocrinol. 100, 103-107), y varios sitios de fosforilación identificados en el domino N-terminal y el LBD de ER\alpha (Arnold, S. F., Obourn, J. D., Jaffe, H., y Notides, A. C. (1995) Mol. Endocrinol. 9, 24-33 y Le Goff, P., Montano, M. M., Schodin, D. J., y Katzenellenbogen, B. S (1994) J. Biol. Chem. 269, 4458-4466) están conservados en la proteína del clon 29 (Ser 30 y 42, Tyr 443). La proteína del clon 29 consiste en 485 restos aminoacídicos mientras que los ER\alpha de humano, ratón y rata consisten en 590-600 restos aminoacídicos. La diferencia principal es un dominio N-terminal mucho más corto en la proteína del clon 29, es decir, 103 restos aminoacídicos en comparación con 185-190 restos aminoacídicos en las otras proteínas receptoras. Además, el denominado dominio F no conservado en el extremo C-terminal de ER\alpha es 15 restos aminoacídicos más corto en la proteína del clon 29. El inserto de ADNc de un clon positivo de 2,6 kb se subclonó en el sitio EcoR1 del pBluescript (marca comercial) (Stratagene). Se determinó la secuencia de ADN completa del clon 29 (CyberGene AB) mediante secuenciación cíclica usando terminadores fluorescentes (Applied Biosystems) en ambas cadenas con una serie de cebadores internos.

Las Figuras 2C y 2D respectivamente comparan el dominio de unión a ligando y a ADN de Er\beta en comparación con Er\alpha de rata, ratón y humano.

2. Análisis de saturación de la unión de ligandos y estudios de competición de ligandos

Se subclonó el ADNc del clon 29 en pBluescript cadena abajo del promotor T7 para dar p29-T7. Se sintetizó la proteína del clon 29 in vitro usando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TnT (Promega). Las mezclas de reacción de traducción se diluyeron cinco veces con tampón TEDGMo (Tris/HCl 40 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 10% (v/v), Na_{2}MoO_{4} 10 mM, DTT 10 mM) y se incubaron alícuotas de 0,1 ml durante 16 h a 8ºC con [2,4,6,7-^{3}H]-17\beta-estradiol 0,3-6,2 nM (NEN-Dupont; radiactividad específica 85 Ci/mmol) en presencia o ausencia de un exceso de 200 veces de E2 sin marcar.

La Figura 5A ilustra los resultados de un análisis de saturación de ligandos de proteína del clon 29. Se incubó un lisado de reticulocitos que contenía proteína del clon 29 con 6 concentraciones de [^{3}H]E2 entre 0,3 y 6,0 nM. Tubos en paralelo contenían 200 veces adicionales de E2 no radiactivo. Se separó ligando unido y libre con un ensayo de carbón recubierto con dextrano. La Kd (0,6 nM) se calculó a partir de la pendiente de la línea que se muestra en la representación de Scatchard (r = 0,93) y el número de sitios de unión se extrapoló del corte con el eje de abscisas (Bmáx = 1400 fmol/ml de mezcla de traducción no diluida).

Para estudios de competición de ligandos se incubó lisado de reticulocitos diluido con [2,4,6,7-^{3}H]-17\beta-estradiol 5 nM en presencia de 0, 5, 50, 500 ó 5.000 nM de E2 no radiactivo, estrona, estriol, testosterona, progesterona, corticosterona, 5\alpha-androstano-3\beta,17\beta-diol, 5\alpha-androstano-3\alpha,17\beta-diol y dietilestilbestrol (DCES) durante 16 h a 8ºC. Se separaron los esteroides unidos y no unidos con un ensayo de carbón recubierto con dextrano (Ekman, P., Barrack, E. R., Greene, G. L., Jensen, E. V., y Walsh, P. C (1983) J. Clin. Endocrinol Metab. 57, 166-176).

La Figura 5B ilustra la especificidad de la unión a ligando por la proteína del clon 29. Se equilibró un lisado de reticulocitos que contenía proteína del clon 29 durante 16 h con [^{3}H]E2 5 nM y el exceso en veces indicado de competidores. Los datos representan [^{3}H]E2 unido en presencia de E2 sin marcar, testosterona (T), progesterona (prog), corticosterona (cortico), estrona (E1), dietilestilbestrol (DES), 5\alpha-androstano-3\alpha,17\beta-diol (3\alpha-AD), 5\alpha-androstano-3\beta,17\beta-diol (3\beta-AD) y estriol (E3). La unión de [^{3}H]E2 en ausencia de competidor se ajustó al 100%.

3. Hibridación in situ

La hibridación in situ se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente (Dagerlind \ring{A}., Friberg, K., Bean. A. J., y Hökfelt, T (1992) Histochemistry 98, 39-49). En resumen, dos sondas oligonucleotídicas dirigidas contra los nucleótidos 994-1041 y 1981-2031 se marcaron cada una en el extremo 3' con ^{33}P-dATP usando desoxinucleotidiltransferasa terminal (Amersham, Reino Unido). Se usaron ratas Sprague-Dawley macho y hembra adultas (2 a 3 meses de edad, n = 10) para este estudio. Las ratas se decapitaron y los tejidos se extirparon rápidamente y se congelaron en nieve carbónica. Los tejidos se seccionaron en un criostato Microm HM500 a 14 \mum y se descongelaron sobre portaobjetos de vidrio Probe-On (Fisher Scientific, PA, Estados Unidos). Los portaobjetos se almacenaron a -20ºC hasta el uso. Los portaobjetos se incubaron en cajas humidificadas a 42ºC durante 18 h con 1 x 10^{6} cpm de la sonda en una solución de hibridación que contenía formamida al 50%, SSC 4x (SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M), Denhard 1x (BSA al 0,02%, Ficoll al 0,02%, PVP al 0,02%), sarcosil al 1%, fosfato de sodio 0,02 M (pH 7), sulfato de dextrano al 10%, ADN de esperma de salmón 500 \mug/ml y DTT 200 mM. Posteriormente los portaobjetos se aclararon en SSC 1x a 55ºC durante 60 min con cuatro cambios de SSC y, por último, en SSC 1x, comenzando a 55ºC y enfriando lentamente a temperatura ambiente, se pasaron por agua destilada y se deshidrataron brevemente en etanol al 50% y al 95% durante 30 s cada uno, se secaron al aire y se cubrieron con una película de autorradiografía \beta-man de Amersham durante 15 a 30 días. Como alternativa, los portaobjetos se sumergieron en emulsión nuclear de rastreo Kodak NTB2 (diluida 1:1 con agua destilada) y se expusieron durante 30 a 60 días a 4ºC. Por último, las secciones se tiñeron con violeta de cresilo.

Se observó una expresión clara del clon 29 en el tracto reproductivo tanto de ratas macho como hembra, mientras que en todos los demás tejidos de rata la expresión era muy baja o estaba por debajo del nivel de detección con hibridación in situ (no se muestra). En los órganos reproductores masculinos se observó una alta expresión en la glándula prostática (Figura 3), mientras que se observó una expresión muy baja en testículo, epidídimo y vesícula seminal (no se muestra). En las secciones sumergidas, la expresión era claramente visible en células epiteliales de la próstata (alvéolos secretores), mientras que la expresión en células musculares lisas y fibroblastos del estroma era baja (Figura 3). En órganos reproductores femeninos se observó expresión en el ovario (Figura 4), mientras que útero y vagina fueron negativos (no se muestra). En las secciones sumergidas se observó una alta expresión en la capa celular granulosa de folículos primarios, secundarios y maduros (Figura 4), mientras que los folículos primordiales, ovocitos y cuerpos lúteos aparecían completamente negativos. Se observó una baja expresión en las células intersticiales del ovario. Las dos sondas oligonucleotídicas antisentido usadas producían resultados similares. La adición de un exceso de 100 veces de las sondas oligonucleotídicas sin marcar respectivas durante las reacciones de hibridación suprimía todas las señales.

4. Análisis de transactivación en células CHO

Se construyó el vector de expresión pCMV29 por inserción del fragmento del clon 29 de 2,6 kb en el sitio EcoRI del vector de expresión pCMV5 (Andersson, S., Davis, D. L., Dahbäck, H., Jörnvall, H., y Russel, D. W. (1989) J. Biol. Chem. 264, 8222-8229). La construcción indicadora pERE-ALP contiene una forma secretada del gen de la fosfatasa alcalina placentaria (Berger, J., Hauber, J., R., Geiger, R., y Cullen, B. R. (1988) Gene 66, 1-10) y el MMTV-LTR, en el que los elementos de respuesta a glucocorticoides se sustituyeron por el elemento de respuesta a estrógenos (ERE) del promotor de vitelogenina.

Se sembraron células CHO-K1 en placas de 12 pocillos a aproximadamente 1,7 x 10^{5} células por pocillo en medio F12 de Ham sin rojo fenol con FCS al 5% (tratado con carbón recubierto con dextrano) y Lglutamina 2 mM. Después de 24 h las células se transfectaron con 250 ng de vector pERE-ALP y 50 ng de pCMV29 usando lipofectamina (Gibco) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de cinco horas de incubación las células se lavaron y se les volvió a suministrar 0,5 ml de medio F-12 de Coon sin rojo fenol que contenía sustituto de suero al 5% (SRC 3000, Tissue Culture Services Ltd., Botolph Claydon, Buckingham, Reino Unido), L glutamina 2 mM y gentamicina 50 \mug/ml más hormonas según se indicaba. Después de 48 h, el medio se ensayó para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Se mezcló una alícuota de 10 \mul del medio de cultivo de células con 200 \mul de tampón de ensayo (dietanolamina 10 mM a pH 10,0, MgCl_{2} 1 mM y CSPD 0,5 mM (Tropix Inc. Boston, Estados Unidos)) y se incubó durante 20 min a 37ºC antes de medir en un luminómetro de microplacas (Luminoskan; Labsystems, Finlandia) con medición integral durante 1 segundo. La actividad de ALP del indicador de ERE en solitario se ajustó a 1.

5. Características de unión a ligando y función de transactivación de la proteína del clon 29

En base a la alta homología descrita entre la proteína del clon 29 y el ER\alpha de rata en el DBD y el LBD se formuló la hipótesis de que la proteína del clon 29 podría codificar un nuevo ER. Además, se conocen bien efectos biológicos de estrógenos sobre próstata y ovario de rata, que muestran una alta expresión de ARN del clon 29 (Griffiths, D., Davies, P., Eaton, C. I., Harper, M. E., Turkes, A., y Peeling W. B. (1991) en Endocrine Dependent Tumours, eds. Voigt, K-D. y Knabbe, C (Raven Press), págs. 83-125; Richards, J. S (1994) Endocrine Rev. 15, 725-745; y Habenicht, U-F., Tunn, U. W., Senge, Th., Schroder, R. H., Schweikert, H. U., Bartsch, G., y El Etreby, M. F. (1993) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 44, 557-563). Para analizar las propiedades de unión a esteroides de la proteína del clon 29 sintetizada in vitro, se incubó el lisado de reticulocitos a 8ºC durante 16 h con concentraciones crecientes (0,3-6,0 nM) de [^{3}H]E2 en presencia o ausencia de un exceso molar de 200 veces de E2 sin marcar. La transformación lineal de los datos de saturación reveló una sola población de sitios de unión para E2 con una K_{d} (constante disociación) de 0,6 nM (Figuras 5A y C). Se midió la especificidad de unión a esteroides por incubación del lisado de reticulocitos con [^{3}H]E2 5 nM en presencia de 0,5, 50, 500 y 5.000 nM de competidores sin marcar. Las curvas de competición generadas son indicativas de un receptor de estrógenos en el sentido de que sólo los estrógenos competían eficazmente con [^{3}H]E2 por la unión (Figura 5B). Se producía un cincuenta por ciento de inhibición de la unión específica mediante un exceso de 0,6 veces de E2 sin marcar; el dietilestilbestrol, estriol, estrona y 5\alpha-androstano-3\beta,17\beta-diol eran 5, 15, 50 y 150 veces, respectivamente, menos eficaces como competidores. Ni la testosterona, progesterona, corticosterona ni el 5\alpha-androstano-3\alpha,17\beta-diol eran competidores eficaces, ni siquiera a las mayores concentraciones usadas (exceso de 1000 veces). La constante de disociación y las especificidades de unión a esteroides medidas concuerdan muy bien con los datos descritos previamente para ER en próstata de rata y humana, células de la granulosa de rata, folículos antrales de rata y tejido ovárico de rata completo (Ekman, P., Barrack, E. R., Greene, G. L., Jensen, E. V., y Walsh, P. C (1983) J. Clin. Endocrinol. Metab. 57, 166-176; van Beurden-Lamers, W. M. O., Brinkmann, A-O., Mulder, E., y van der Molen, H. (1974) Biochem. J 140, 495-502; Kudolo, G. B., Elder, M. G., y Myatt, L. (1984) J. Endocrinol. 102, 83-91; y Kawashima, M., y Greenwald, G. S. (1993) Biology of Reprod. 48 172-179).

Cuando se marcó la proteína del clon 29 con una dosis saturante de [^{3}H]E2 y se analizó en gradientes de densidad de sacarosa, se observó un solo pico de radiactividad unida específicamente. El coeficiente de sedimentación de este complejo era de aproximadamente 7S y se desplazó a 4S en presencia de NaCl 0,4 M (no se muestra). Para investigar las propiedades reguladoras de la transcripción de la proteína del clon 29, se realizaron experimentos de cotransfección en los que se transfectaron células CHO con un vector de expresión de proteína del clon 29 y/o una construcción de gen indicador sensible a estrógenos. Se incubaron células en ausencia de E2 (clon 29) o en presencia de E2 100 nM (Clon 29 + E2) o en presencia de E2 100 nM y Tamoxifeno 12 \muM (Clon 29 + E2/Tam). En ausencia de E2 añadido exógenamente, la proteína del clon 29 mostraba una actividad transcripcional considerable que podía aumentarse adicionalmente mediante la adición de E2 100 nM (Figura 6). La adición simultánea de un exceso de 10 veces del antiestrógeno Tamoxifeno suprimía parcialmente la actividad estimulada por E2 (Figura 6). La actividad transcripcional constitutiva de la proteína del clon 29 podía suprimirse por el antiestrógeno ICI-1624384 (no se muestra). Se ha demostrado anteriormente que los ER humano y de ratón de tipo silvestre son activadores constitutivos de la transcripción y que la actividad transcripcional puede estimularse adicionalmente mediante la adición de E2 (Txukerman, M., Xiao-Kun Zhang., Herman, T., Wills, K. N., Graupner, G., y Phal, M, (1990) New Biologist 2, 613-620 y Lees, J. A., Fawell, S. E., y Parker, M. G. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 5477-5488). Para obtener más percepciones sobre qué concentraciones de E2 logran actividad transcripcional de la proteína del clon 29, se llevaron a cabo experimentos de transfección transitoria en presencia de concentraciones crecientes de E2. Se transfectaron de forma transitoria células CHO con el plásmido indicador de ERE y el plásmido de expresión de proteína del clon 29. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de E2 (0,1-1.000 nM), estrona (E1, 1000 nM), 5\alpha-androstano-3\beta,17\beta-diol (3\beta-AD, 1000 nM) o sin ligando añadido. Se midió la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) como se describe y la actividad en ausencia de ligando (control) se ajustó a 1. La figura muestra las actividades de ALP relativas (= DT) de tres experimentos independientes. La proteína del clon 29 comenzaba a responder a E2 0,1 nM y se observó una estimulación máxima entre 1 nM y 10 nM de E2 (Figura 7). El factor de estimulación máxima era de 2,6 \pm 0,5 veces (media = DT, n = 9) en comparación con la incubación en ausencia de E2. Aparte de E2, también la estrona y el 5\alpha-androstano-3\beta, 17\beta-diol podían estimular la actividad transcripcional, aunque a concentraciones superiores (Figura 7). La dexametasona, testosterona, progesterona, 5\alpha-androstano-3\alpha,17\beta-diol, hormona tiroidea y el ácido todo-trans-retinoico no podían estimular la actividad transcripcional de la proteína del clon 29, ni siquiera a la mayor concentración (1000 nM) ensayada (no se muestra). Los resultados de los experimentos de cotransfección concuerdan con los datos de unión a ligando y de especificidad de la proteína del clon 29 presentados en la Figura 5. En experimentos de control, el ER\alpha humano de tipo silvestre también demostró actividad transcripcional en ausencia de E2, que podía aumentarse mediante la adición de E2 (no se muestra).

6. Detección de expresión de ER de rata mediante RT-PCR

Se determinó la especificidad tisular de la expresión de ER\beta y ER\alpha de rata usando reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Los resultados del experimento se muestran en la Figura 8.

2. Comparación de la afinidad de unión a ligando de hER\alpha y rER\beta

Se ensayó la afinidad por ligando de los dos receptores de estrógenos, ER\alpha humano (ovario) (hER\alpha) y ER\beta de rata (rER\beta) en experimentos de saturación de la unión y en experimentos de competición de la unión.

Se tradujo in vitro el ADNc de los subtipos de receptores hER\alpha y hER\beta en lisado de reticulocitos de conejo en presencia de aminoácidos no radiactivos de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante (Promega).

El ligando radiactivo usado en todos los experimentos era 16\alpha-[^{125}I]-17\beta-estradiol ([^{125}I]-E2) (NEX-144, New England Nuclear). El método para los experimentos de unión se describió previamente en: Salomonsson M, Carlsson B, Haggblad J. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 50, Nº 5/6 págs. 313-18, 1994. En resumen, se incubaron receptores de estrógenos con [^{125}I]-E2 hasta el equilibrio (16-18 h a +4ºC). La incubación se detuvo por separación del [^{125}I]-E2 unido a proteína del [^{125}I]-E2 libre en columnas de Sephadex G25. Se midió la radiactividad del eluido en un contador gamma.

En los experimentos de competición, se diluyeron ligandos no radiactivos en DMSO, se mezclaron con [^{125}I]-E2 (aproximadamente 100-200 pM), se dividieron en alícuotas en paralelo y por último se añadió hER\alpha o rER\beta. La concentración final de DMSO en el tampón de unión era del 2%.

El tampón usado en los experimentos era de la siguiente composición: Hepes (pH = 7,5) 20 mM, KCl 150 mM, EDTA 1 mM, glicerol (8,7%), monotioglicerol 6 mM, Na_{3}MO_{4} 10 mM.

3. Experimentos de saturación de la unión en equilibrio (determinaciones de K_{d})

Se mezclaron un intervalo de concentraciones de [^{125}I]-E2 con los ER: y se incubaron como se ha descrito anteriormente, se determinó el [^{125}I]-E2 libre restando el [^{125}I]-E2 unido del [^{125}I]-E2 añadido. Se analizaron los datos de unión mediante representaciones de Hill y mediante representaciones de Scatchard (Figura 11). Los resultados de la unión en equilibro se muestran en la Tabla 1. Los valores de K_{d} aparente para [^{125}I]-E2 diferían entre los dos ER: con aproximadamente un factor de cuatro: K_{d}(hER\alpha):K_{d}(rER\beta) = 1:4.

TABLA 1

1

4. Experimentos de competición (determinaciones de CI_{50})

Los experimentos se realizaron como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron los valores de CI_{50} por aplicación de un análisis logístico de cuatro parámetros; b = ((b_{\text{máx}} - b_{\text{mín}})/(1 + (I/CI_{50})^{S})) + b_{\text{mín}}, en el que I es la concentración añadida de inhibidor de la unión, CI_{50} es la concentración de inhibidor a la unión semimáxima y S es un factor de pendiente. La concentración libre de [^{125}I]-E2 se determinó por muestreo de una alícuota de los pocillos al final de la incubación y después restando la radiactividad unida de la radiactividad total muestreada.

Puesto que los experimentos de unión en equilibrio (anteriores) mostraban que los valores de K_{d} para [^{125}I]-E2 diferían entre los dos ER:, se calcularon los valores de K_{i} (a partir de la ecuación de Cheng-Prussoff: K_{i} = CI_{50}/(I+L/K_{d}) en los que L es ([^{125}I]-E2) libre, para los compuestos investigados. Se usaron dos enfoques para calcular la RBA (Afinidad de Unión Relativa). Los valores de RBA se obtuvieron usando los valores de CI_{50} o los valores de K_{i}. En ambos enfoques, el valor para el compuesto 16\alpha-bromoestradiol se seleccionó como el valor de referencia (100%). Ambos enfoques dieron resultados similares. Los resultados se resumen en la Figura 12. En estas Figuras "4-OH-Tam" = 4-hidroxi-tamoxifeno; "DES" = dietilestilbestrol; "Hexestr" = hexestrol: "ICI-164384" = ICI pcl compuesto nº 164382; "17\beta-E2" = 17\beta-estradiol; "16a-B-E2" = 16\alpha-bromo-estradiol; "Ralox" = Raloxifeno; y "17a-E2" = 17\alpha diol.

Los resultados muestran que Er\alpha y Er\beta tenían afinidades de unión a ligando significativamente diferentes -los valores de K_{d} aparente para [^{125}I]-E2 diferían entre los dos ER en un factor de aproximadamente 4 (K_{d}(hER\alpha):K_{d}(rER\beta) \approx 1:4). Algunos compuestos investigados mostraban diferencias significativas en la competición por la unión de [^{125}I]-E2 a los ER. Se descubrió que ciertos compuestos eran inhibidores más potentes de la unión de [^{125}I]-E2 a hER\alpha en comparación con rER\beta, mientras que se descubrió que otros eran inhibidores más potentes de la unión de [^{125}I]-E2 a rER\beta que a hER\alpha.

Claims

1. Un receptor de estrógenos aislado (denominado ER\beta) que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1.

2. Un receptor de estrógenos aislado (denominado ER\beta) que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de más del 95% con la secuencia de aminoácidos de la Figura 1.

3. Una secuencia de ADN aislado que codifica un receptor de estrógenos de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

4. Una secuencia de ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la secuencia de ADN se proporciona en la Figura 1.

5. El uso de un receptor de estrógenos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en un ensayo para determinar moléculas que se unen a un receptor de estrógenos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. El uso de un receptor de estrógenos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en un ensayo para determinar moléculas para el uso en el tratamiento del cáncer de próstata o de ovario, hiperplasia prostática benigna, enfermedades del sistema nervioso central, osteoporosis o enfermedad cardiovascular.

7. Un método de diseño de fármacos que comprende comparar la unión de un compuesto de ensayo a ER\alpha y a un receptor de estrógenos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

8. El uso de un receptor de estrógenos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el ensayo de los posibles efectos estrogénicos de una sustancia.