ES2146574T5 - Secuencias de nucleotidos y polipeptidos, en particular del virus del colera del cerdo. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos y polipeptidos, en particular del virus del colera del cerdo.Info
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Abstract
UN METODO PARA PROTEGER UN SUJETO, EN PARTICULAR UN ANIMAL DOMESTICO, CONTRA UNA INFECCION MICROBIANA COMPRENDE EL USO DE UNA COMBINACION DE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA CODIFICANDO UN ANTIGENO RELACIONADO CON LA INFECCION Y UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA DE TRANSFERENCIA DE INTERRUPCION. UN METODO PARA CONSTRUIR UN ANIMAL TRANSGENICO QUE ES RESISTENTE AL ORGANISMO INFECCIOSO COMPRENDE EL INCORPORAR UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA RELACIONADA CON LA INFECCION EN EL GENOMA DEL ANIMAL. EL METODO ES ESPECIALMENTE UTIL PARA PROPORCIONAR PROTECCION CONTRA INFECCIONES DE VIRUS DE PESTES TALES COMO COLERA DE LOS CERDOS (FIEBRE PORCINA). TAMBIEN SE DESCRIBEN SECUENCIAS NUCLEOTIDAS Y SUS CONSTRUCTORES DE VECTOR, Y POLIPEPTIDOS UTILES PARA PRODUCIR VACUNAS Y PARA DIAGNOSIS. SE DESCRIBE UN METODO DE DIAGNOSTICO QUE DIFERENCIA ANIMALES INFECTADOS Y ANIMALES VACUNADOS.
Description
Secuencias de nucleótidos y polipéptidos, en
particular del virus del cólera del cerdo.
La invención se refiere a nucleótidos y
polipéptidos que proporcionan protección contra las infecciones por
pestivirus y diagnóstico de las mismas, en particular infecciones
por el virus del cólera del cerdo.
El virus del cólera del cerdo (o virus de la
fiebre porcina) en los lechones y otros dos virus, el virus de la
diarrea vírica bovina (BVDV) en el ganado vacuno y el virus de la
enfermedad de la frontera ("border disease virus") (BDV) en las
ovejas, pertenecen todos ellos a un solo género, el género
pestivirus, dentro de la familia de las Togaviridae (Westaway et
al., Intervirology, 24, 125-139 (1985));
estos virus poseen un genoma de RNA de cadena más, es decir,
infeccioso. Estructural y antagónicamente, estos tres virus están
estrechamente relacionados entre sí: un antisuero dirigido contra
uno cualquiera de los tres reaccionará también generalmente con los
otros dos. BVDV y BDV se asemejan uno a otro tan estrechamente que
en la actualidad están considerados como un solo tipo de virus
(Terpstra, en: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology.
Compilador: R. Pandey, Vol 1, pp. 175-198
(1985)). Aunque cada uno de los tres virus tiene su propio huésped
primario, BVDV y BDV pueden infectar también a otros rumiantes, e
incidentalmente, también a los lechones. Una propiedad común a los
tres virus es que pueden causar infecciones congénitas (Van
Oirschot, Veterinary Microbiology 9, 113-120
(1983)). Se conoce la secuencia nucleotídica completa de una cepa de
BVDV por el documento EP-A-208672;
no se conocen todavía secuencias nucleotídicas completas del virus
del cólera del cerdo ni de BDV.
Una revisión de la investigación sobre genomas y
proteínas de pestivirus (con inclusión de HCV) se presenta en J.
Gen. Virol. 70, 253-266 (1989). El
documento EP-A-381034, publicado el
26 de septiembre de 1990 y basado parcialmente en una fecha de
prioridad de 19 de marzo de 1989, describe la secuencia de
nucleótidos y aminoácidos de la cepa Alford de HCV.
La vacunación contra las infecciones por
pestivirus se realiza generalmente utilizando cepas vivas atenuadas
del virus. Así, la vacunación contra el cólera del cerdo se realiza
usualmente con ayuda de cepas específicas del virus del cólera del
cerdo (HCV), por ejemplo la denominada cepa de China. Aun cuando
tales vacunaciones proporcionan usualmente suficiente protección
contra el cólera del cerdo, la multiplicación de las cepas del virus
de la vacuna es a menudo un problema. Adicionalmente, la cepa de
China y otras cepas de la vacuna pueden pasar a través de la
placenta de las cerdas preñadas después de la vacunación, y de este
modo los fetos pueden infectarse con el virus de la vacuna. Como
resultado, los fetos pueden morir o padecer enfermedad de larga
duración después de su nacimiento (Overby y Eskildsen, CEC Report
Hog Cholera/Classical and African Swine Fever EUR 5904,
420-429 (1976)). Se ha encontrado el virus de la
vacuna de China en las amígdalas hasta 15 días después de la
vacunación (Terpstra, Tijdschrift voor Diergeneeskunde, 103,
678-684 (1978)) y puede persistir más largo tiempo
en el porcino. Esto puede ser causa de confusión si un animal
vacunado de este tipo se somete a diagnóstico; la diferenciación del
virus nativo es posible únicamente después de examen de diagnóstico
ulterior.
Los anticuerpos dirigidos contra la cepa de China
y también contra otros virus de la vacuna HCV no pueden distinguirse
de los dirigidos contra el virus nativo. En consecuencia, la
vacunación de una población de lechones contra el cólera del cerdo y
la detección simultánea de las infecciones nativas por HCV en esta
población por medio de escrutinio serológico es imposible.
Los métodos conocidos para protección del ganado
vacuno y ovino contra las infecciones por BVDV y BDV respectivamente
tienen inconvenientes correspondientes.
Existe por consiguiente la necesidad de medios
mejorados y más simples para protección contra las infecciones por
pestivirus y el diagnóstico de las mismas, en particular el cólera
del cerdo.
Se ha encontrado ahora la secuencia nucleotídica
completa de RNA de la cepa virulenta de HCV Brescia.
Adicionalmente, se ha encontrado que secuencias
que codifican partes específicas de proteínas estructurales de un
organismo infeccioso son particularmente adecuadas como material
base para protección contra la infección. Estas partes se definen en
las reivindicaciones.
La invención se refiere por consiguiente a estas
secuencias nucleotídicas, que son adecuadas para protección contra
una infección por pestivirus. La infección se refiere adicionalmente
a polipéptidos recombinantes codificados por tales secuencias
nucleotídicas y a un proceso de preparación de tales polipéptidos
por medios recombinantes. Asimismo, la invención se refiere a
vacunas y estuches (kits) de diagnóstico que contienen tales
secuencias de nucleótidos o polipéptidos. La invención se define en
las reivindicaciones del apéndice.
La secuencia nucleotídica de HCV se muestra en la
Figura 1. La secuencia representada es la de la cepa Brescia, clon
Nº 111 (CDI, Lelystad). Se ha encontrado que las cepas del virus del
cólera del cerdo poseen un alto grado de homología serológica; las
cepas del cólera del cerdo no pueden diferenciarse unas de otras por
medio de ensayos de neutralización cruzada, pero pueden
diferenciarse de BVDV (virus de la diarrea vírica bovina) y BDV
(virus de la enfermedad de la frontera) (Wensvoort et al.,
Vet. Microbiol., 20: 291-306 (1989); Tesis,
Universidad de Utrecht (1989), capítulo 3). Se ha encontrado también
que cepas del cólera del cerdo son reconocidas uniformemente por un
grupo de anticuerpos monoclonales contra la proteína E1 de la
envoltura. Este grupo de anticuerpos monoclonales no reconoce cepas
de BVDV o BDV (Wensvoort et al., Vet. Microbiol., 21:
9-20 (1989); Tesis (1989), capítulo 4). Se han
encontrado epítopos conservados en la proteína E1 de la envoltura de
HCV en la totalidad de 94 cepas de HCV investigadas (Wensvoort,
Tesis 1989, pp. 47 y 78). Secuencias de cepas de HCV distintas de
Brescia que exhiben ligeras diferencias con relación a la secuencia
correspondiente a la Fig. 1 pertenecen por tanto también
esencialmente a la invención. En el texto que sigue, los números se
refieren al genoma de la cepa Brescia de HCV; las posiciones pueden
ser ligeramente diferentes para otras cepas, pero estas diferencias
no son significativas para la invención. La secuencia que se muestra
comprende un marco de lectura abierto de 11.694 nucleótidos que está
limitado a ambos lados por una región no codificante. Esta región no
codificante tiene una longitud de 360 nucleótidos en el extremo 5' y
una longitud de 229 nucleótidos, que comienza con la señal de parada
TGA, en el extremo 3'. El marco de lectura abierto se numera por
consiguiente (5')361-12054(3'). La sección
desde el nucleótido 361 al 3804 codifica proteínas estructurales.
Estas incluyen una proteína de cápsida que es codificada por la
región localizada aproximadamente entre 361 y 1162, una proteína de
envoltura, denominada también E2, que es codificada por los
nucleótidos adyacentes 1162-2070, una proteína (no
identificada todavía en detalle), denominada también E3, que es
codificada por los nucleótidos adyacentes 2071-2430,
y una proteína de envoltura, denominada también E1, que es
codificada por los nucleótidos adyacentes 2431-3804.
Las proteínas de envoltura denominadas E2 y E1 tienen por
consiguiente las posiciones aproximadas 267-570 y
691-1148, respectivamente, en la secuencia de
aminoácidos correspondiente a la Fig. 1.
En particular, E1 parece ser eficaz en la
generación de anticuerpos que proporcionan protección contra
infecciones por pestivirus. Subsecciones inmunodominantes de la
secuencia E1 parecen estar presentes en la región que va desde Leu
691 a Glu 1030, mientras que la región hidrófoba que se extiende
aproximadamente desde Phe 1031 a Asp 1148 parece ser otra subsección
de la secuencia E1 que es esencial para la acción protectora. La
última subsección contiene tres regiones transmembrana (TMR), que
permiten que el péptido se ancle en la membrana celular. Se ha
encontrado que la presencia de al menos una de tales regiones
trans-membrana en el péptido es muy importante para
conseguir un alto grado de protección contra el pestivirus. Una TMR
está localizada entre los restos Phe 1031 y Leu 1063, y está
presente preferiblemente en la secuencia utilizada para la
protección. Los polipéptidos que corresponden solamente a una
sección de E1 y que incluyen una región transmembrana son también
adecuados para proporcionar protección.
Otra secuencia que es importante para
proporcionar protección es una región polar cargada que comienza
aproximadamente en Tyr 1012 y termina en Phe 1031. Esta secuencia,
junto con la región transmembrana codificada por Phe 1031 hasta Leu
1063, tal como se encuentra en E1, está presente muy preferiblemente
en la secuencia utilizada para protección. La secuencia codificada
por Tyr 1012 - Leu 1063 es una región denominada de parada de la
transferencia (y está anclada a una proteína en la membrana del
retículo endoplasmático rugoso). Las secuencias de parada de la
transferencia están constituidas por un dominio hidrófobo de
20-25 restos (a saber, TMR) y una región polar de
10-15 restos (a saber, Tyr 1012-Phe
1031) (E. Perara y V.R. Lingappa, R.C. Das y P.W. Robbins,
compiladores (Academic Press, Nueva York, 1988), pp.
3-47). Esta secuencia puede acoplarse también a otro
antígeno codificado por el RNA del pestivirus (por ejemplo E2, E3,
p80), o a un antígeno heterólogo (a saber, toxina bacteriana,
antígeno peplómero o un coronavirus, por ejemplo TGE, hemaglutinina
o un virus de la influenza, por ejemplo el virus de la influenza de
los porcinos, etc. etc.) y aumenta por consiguiente la
inmunogenicidad de un antígeno de este tipo (con indiferencia del
sistema de expresión). Asimismo, puede utilizarse la TMR aparte de
la región polar, o la región polar aparte de la TMR. La TMR y la
región polar pueden utilizarse también en asociación con una región
polar heteróloga y TMR respectivamente. El uso de una región de
parada de la transferencia no se limita a tales regiones derivadas
de un pestivirus. Adicionalmente, la inmunogenicidad de un antígeno
de pestivirus, pero también de otros antígenos, puede aumentarse
también cuando la secuencia que codifica el antígeno está acoplada a
una región heteróloga de parada de la transferencia o parte de la
misma.
Debe entenderse que el término polipéptidos
utilizado en esta memoria significa oligopéptidos y polipéptidos.
Los polipéptidos pueden estar opcionalmente glicosilados o
modificados de cualquier otro modo.
Secuencias de nucleótidos importantes para la
protección de acuerdo con la invención son por consiguiente aquéllas
que codifican la proteína E1 de la envoltura, y secciones de la
misma, con inclusión de una secuencia de parada de la
transferencia. La secuencia de acuerdo con la invención contiene por
consiguiente preferiblemente al menos una sección como se define en
las reivindicaciones de la secuencia nucleotídica (5')
1-3804 (numeración de acuerdo con la Fig. 1). Dichas
áreas son válidas para HCV; para BVDV y BDV sus posiciones son algo
diferentes, pero la disposición general es la misma; las secuencias
de las proteínas de envoltura correspondientes y secciones de las
mismas son también particularmente útiles para protección y
diagnóstico.
La importancia de las proteínas estructurales y
de polipéptidos que corresponden completa o parcialmente a ellas
para la acción protectora contra las infecciones por pestivirus es
evidente partiendo del hecho de que los lechones inoculados con un
virus recombinante que comprende una secuencia de cDNA que codifica
una proteína estructural de HCV, en particular E1, producen
anticuerpos contra E1, forman anticuerpos neutralizantes contra HCV
y están protegidos contra la infección con el virus virulento del
cólera del cerdo.
La infección se refiere adicionalmente a RNA y
DNA recombinantes en los cuales está incorporada una de las
secuencias descritas anteriormente; un polinucleótido recombinante
de este tipo tiene, por ejemplo, la forma de un virus recombinante.
Un virus portador adecuado para esto es el virus de la
pseudo-rabia (PRV), pero pueden utilizarse también
otros virus, tales como el virus de la viruela vacuna, adenovirus,
baculovirus, SV40, retrovirus, virus de la hepatitis B y sus
derivados. Adicionalmente, se pueden utilizar células que han
sufrido una transformación estable con uno de estos virus, células
en las cuales estos virus se replican episómicamente o por lisis y
células que han sufrido transformación estable con vectores
adecuados y expresan la proteína estructural, en particular la
proteína E1 o una parte de la misma, es decir,
sub-unidades como se definen en las reivindicaciones
obtenidas de manera opcional por la vía de DNA recombinante en
sistemas procariotas o eucariotas. Un sistema recombinante de este
tipo es excepcionalmente adecuado como base para una vacuna contra
una infección por pestivirus, en particular contra HCV. La invención
se refiere también, por consiguiente, a vacunas que contienen la
secuencia de nucleótidos en un virus recombinante o en otra
forma.
La invención incluye adicionalmente vacunas que
contienen los polipéptidos, como se ha descrito anteriormente.
La invención se refiere, adicionalmente, a medios
para diagnóstico de una infección, en los cuales se utiliza un
polipéptido antigénico como se ha descrito anteriormente, así como a
estuches que contienen tales medios como componente esencial.
Un diagnóstico particularmente útil es aquél en
el cual es posible diferenciar serológicamente entre un animal
vacunado de acuerdo con la invención y un animal infectado, en
particular con HCV. En este caso, se utiliza un polipéptido distinto
de aquél que genera los anticuerpos protectores: el suero de los
animales infectados contiene entonces anticuerpos contra este
segundo polipéptido, mientras que el suero de los animales vacunados
no lo contiene. La proteína E2 es un polipéptido adecuado para este
propósito.
A continuación se describen métodos para cultivo
de los virus, aislamiento y clonación del RNA, determinación de la
secuencia y preparación de péptidos y antisueros.
Se cultivaron células SK-6 [Kasza
et al., Research Vet. Sc. 13 46-51
(1979)] en medio basal de Eagle que contenía 5% de suero de bovino
fetal (FBS). Se irradió el FBS con radiación gamma y se examinó
luego concienzudamente respecto a BVDV por cultivo prolongado de
células epiteliales de bovino fetal (FBE) en medios que contenían
dichos sueros. Las células se ensayaron respecto a BVDV en un ensayo
sensible de monocapas de inmunoperoxidasa (IPMA) (Wensvoort et
al., Vet. Microbiol. 12, 101-108 (1986)).
Se investigó también el FBS respecto a anticuerpos BVDV por medida
del índice de neutralización de un pie estándar de BVDV en un IPMA.
Los únicos sueros utilizados fueron aquéllos que estaban exentos de
BVDV y no contenían anticuerpo alguno de BVDV, o tenían un título
bajo de anticuerpos de BVDV.
La cepa Brescia de HCV no era citopatógena y se
clonó biológicamente por medio de una dilución triple de punto
final. Después de tres pasos de multiplicación, se obtuvo un pie de
virus clonado (Brescia, clon Nº 111) que tenía un título de
3.10^{7} TCID_{50}/ml.
Monocapas de células SK-6 en
frascos de 175 cm^{2} (Nunclon) se infectaron con HCV a una
multiplicidad de infección (MOI) de 10 TCID_{50} por célula. Se
incubaron las células a 37ºC durante 1,5 horas, y después de ello se
añadió medio de cultivo nuevo hasta un volumen final de 40 ml. Al
cabo de 7 horas, se añadió actinomicina D para dar una concentración
final de 1 \mug/ml. 24 horas después de la infección, las células
se lavaron dos veces con PBS enfriada en hielo. Las células se
lisaron en un tampón de lisis enfriado en hielo
(Tris-HCl 50 mM, pH 8,2, NaCl 0,14 M, MgCl_{2} 2
mM, DTT 5 mM, NP-40 al 0,5% (vol/vol), desoxicolato
de sodio al 0,5% y complejos de
vanadil-ribonucleósido 10 mM (New England
Biolabs)).
Se centrifugaron los lisados (4ºC, 5 min, 4000
rpm) y el sobrenadante se trató con proteinasa K (250 \mug/ml,
concentración final) a 37ºC durante 30 minutos, se extrajo dos veces
con fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (49:49:2) y una sola vez
con cloroformo y alcohol isoamílico (24:1). Se obtuvo el RNA
intracelular por precipitación con etanol, se purificó por medio de
una capa de almohadilla de CsCl 5,7 M y se enriqueció con RNA
específico para HCV en un gradiente de sacarosa desnaturalizante
isocinético de 5-29% (peso/volumen) que contenía 50%
de formamida. El gradiente de sacarosa se centrifugó a 200.000 x g
durante 16 horas en un rotor Beckmann SW40 Ti a 5ºC (Moormann y
Hulst, Virus Res. 11, 281-291 (1988)).
El virus Brescia se purificó esencialmente como
ha sido descrito por Moormann y Hulst (véase anteriormente).
Monocapas confluentes de células SK-6 se infectaron
con una MOI de 0,5, y se cultivaron en 200 ml de medio a 37ºC
durante 48 horas. Las células se suspendieron subsiguientemente en
50 ml de medio y se liofilizaron dos veces. La suspensión de células
se clarificó y el sobrenadante se llevó a NaCl 0,5 M y 10% m/v de
polietilenglicol 6000 (BDH). El virus se redujo a un sedimento por
centrifugación durante 20 minutos a 6000 x g a 4ºC, se disolvió en
TNE (Tris-HCl 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM)
y se purificó en un gradiente de 30-50%
glicerol/(0-50%) de tartrato
sódico-potásico. Las fracciones del gradiente se
titularon para determinar si el virus estaba presente en un IPMA.
Las fracciones adecuadas para uso se combinaron, y el virus se
redujo a un sedimento por centrifugación durante 4 horas a 150.000 x
g a 4ºC. Se extrajo el RNA vírico de los sedimentos con tampón de
lisis enfriado en hielo y proteinasa K, como se ha descrito
anteriormente. El RNA vírico se recuperó por precipitación con
etanol.
Se incubó RNA de HCV intracelular enriquecido
(aproximadamente 1,5 \mug de RNA específico de HCV) con hidróxido
de metil-mercurio 10 mM durante 10 minutos a la
temperatura ambiente. La muestra de RNA desnaturalizado se incubó a
42ºC con Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM,
KCl 70 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP 0,5 mM, 0,6 \mug de iniciadores
oligonucleotídicos de timo de ternero pd(N)6
(Pharmacia) y 300 unidades de transcriptasa inversa del virus de la
leucemia murina de Moloney (Bethesda Research Laboratories) en un
volumen total de 100 \mul. Se añadió EDTA 20 mM al cabo de una
hora; la mezcla de reacción se extrajo luego con fenol/cloroformo,
se pasó a través de una columna Sephadex G50 y se precipitó con
etanol.
Para síntesis de la segunda cadena de cDNA, se
utilizaron DNA-polimerasa I (Boehringer) y RNAsa H
(Pharmacia) (Gübler y Hoffman, Gene 25,
263-269 (1983)).
El cDNA bicatenario se incubó con
DNA-polimerasa T4 (Pharmacia) en una mezcla de
reacción que contenía desoxinucleótido-trifosfatos
0,05 mM, y se metiló con metilasa de EcoRI (New England Biolabs),
añadiendo luego enlazadores de EcoRI (New England Biolabs) a los
extremos romos del cDNA con DNA-ligasa T4
(Pharmacia). Después de digestión con EcoRI (New England Biolabs),
se separó el cDNA en un gel de agarosa al 0,8%. Fragmentos de 1 kb a
4 kb se sometieron a electroelución, se ligaron en el sitio EcoRI de
pUC19 y se utilizaron para transformación de la cepa JM 83 de E.
coli (Vieira y Messing, Gene 19, 259-269
(1982)), como ha sido descrito por Hanahan, J. Mol. Biol.
166, 577-580 (1983). Los filtros de colonias
se hibridaron con una sonda de cDNA monocatenaria marcada con
^{32}P. La sonda se sometió a transcripción inversa a partir de
RNA de HCV que se había fraccionado en un gel neutro de agarosa
(Moormann y Hulst, véase anteriormente). Antes de su utilización, la
sonda de DNA monocatenario se incubó con el RNA citoplásmico de
células SK-6 falsamente infectadas.
La relación entre los clones
HCV-cDNA se determinó por análisis con enzimas de
restricción y por hibridación de transferencias Southern (Southern,
J. Mol. Biol. 89, 503-517 (1975)) del DNA
digerido con sondas de cDNA sometidas a traslación de la mella
(Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y.
1982).
Los clones aislados de la genoteca de cDNA
descrita anteriormente representan el 90% del RNA de HCV. Sin
embargo, no se clonaron secuencias de RNA en el extremo 5' y el
extremo 3'.
Para obtener clones de cDNA del extremo 3', se
poliadenilaron 20 \mug de RNA vírico in vitro con
polimerasa poliA de E. coli (Pharmacia) en 300 \mul de una
mezcla de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM, pH
7,8, MnCl_{2} 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 250 mM, DTT 5 mM, 800
\mug/ml de BSA, 180 unidades de RNasin (Promega Biotec), ATP 0,2
mM, 4 \muCi de ^{3}H-ATP y 2 unidades de
polimerasa. La reacción duró 90 minutos a 37ºC y se terminó por
extracción con fenol (véase anteriormente). El RNA adenilado con
poliA se recuperó con etanol y la síntesis del cDNA de la primera
cadena se cebó con oligo-dT (12-18)
(Pharmacia). Con objeto de obtener clones de cDNA del extremo 5', se
sintetizó un oligonucleótido sintético que es complementario a la
secuencia nucleotídica 308-347 (Fig. 1) y se utilizó
para cebar la síntesis del cDNA de la primera cadena sobre RNA
vírico molde.
Las condiciones para la síntesis de las cadenas
primera y segunda de cDNA de los extremos 5' y 3' fueron como se ha
descrito anteriormente.
El cDNA bicatenario se incubó con polimerasa T4
(véase anteriormente), se fraccionó en un gel de agarosa al 0,8% y
se ligó en el sitio SamI de azul pGEM-4 (Promega
Biotec). El DNA ligado se utilizó para transformación de
oH5-\alpha de E. coli (Hanahan, en DNA
Cloning, Vol. I; A Practical Approach. Capítulo 6, pp.
109-135, 1985).
El análisis de la secuencia se realizó en gran
parte después de subclonación de fragmentos de restricción adecuados
en M13mp18 y mp19 (Yanisch-Perron et al.,
Gene 33, 103-119, (1985)). La sección
restante de la secuencia se determinó por determinación directa de
la secuencia de DNA bicatenario de clones plasmídicos con un estuche
de secuencia basado en polimerasa T7 (Pharmacia). Además del
iniciador universal M13 de 15 nucleótidos de longitud (Boehringer),
la secuenciación se llevó a cabo también utilizando iniciadores
oligonucleotídicos preparados en un sintetizador de DNA en ciclón
(New Brunswick Scientific). Las secuencias de nucleótidos de los
fragmentos de restricción subclonados específicos de HCV se
determinaron por el método de terminación de cadenas didesoxi
(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
54-63, 54-67 (1977)) utilizando
DNA-polimerasa Klenow (Pharmacia) o transcriptasa
inversa (Life Sciences) (Sanger et al., véase anteriormente);
Swith, DNA Sequence Analysis by Primed Synthesis, en "Methods in
Enzymology", vol. 65, pp. 560-580,
Academic Press, Nueva York) y
\alpha-^{35}S-dATP
(Amersham).
Las fracciones de secuenciación se analizaron en
un gel de acrilamida al 6% con urea 8 M. Los datos se analizaron con
un ordenador M24 de Olivetti utilizando un programa de análisis de
secuencias de PC Gene (Genofit, Ginebra, Suiza) y con un ordenador
Macintosh SE de Apple utilizando DNA "Strider" (Marck, Nucl.
Acids Res. 16, 1829-1836 (1988)).
Se sintetizaron péptidos por métodos conocidos
utilizando una fase sólida y reactivo BOP [hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-Tris(dimetilamino)fosfonio]
(Fournier et al., Int. J. Peptide Protein Res. 31,
86-97 (1988)).
Se prepararon antisueros contra los péptidos por
inmunización de conejos con 1 mg de péptido conjugado con
hemocianina de lapa perforada (KLH) (KLH: péptido = 1:1) en
adyuvante completo de Freund. Los conejos se sangraron 70 días
después de la inmunización.
La proteína E1 de la envoltura de Brescia HCV se
purificó por medio de inmunoafinidad, se fraccionó por
electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio/poliacrilamida, y
se transfirió a papel de nitrocelulosa (transferencias) como ha sido
descrito por Wensvoort (Tesis: Epitopes on Structural Proteins of
Swine Fever (Hog cholera) Virus. Universidad de Utrecht, pp.
71-85). Las transferencias se empaparon durante 30
minutos a 37ºC en PBS + NaCl 0,85 M + Tween 80 al 0,05% y suero de
caballo al 5% (tampón de transferencia), y se incubaron luego
durante 60 minutos a 37ºC con los sueros antipéptido, diluidos en
relación 1:10 en tampón de transferencia. Después de lavar cuatro
veces en PBS + Tween 80 al 0,05%, las inmunoglobulinas de conejo
fijadas se detectaron por una segunda incubación durante 60 minutos
a 37ºC con un conjugado de HRPO dirigido contra IgG e IgM de conejo.
Las transferencias se lavaron luego como anteriormente y se
incubaron con solución de substratos como ha sido descrito por
Wensvoort (véase anteriormente). Como controles positivos, se
tiñeron transferencias de E1 con concanavalina-A y
con conjugado 8 de anticuerpo monoclonal-HRPO
(Wensvoort, véase anteriormente).
Se infectaron monocapas de 3 x 10^{6} células
SK-6 con HCV, M203, M204, M205 o M206 a una
multiplicidad de infección de 10. Las células se marcaron con
^{35}S de 6 a 18 horas después de la infección por incubación en 2
ml de medio basal de Eagle exento de cisteína, suplementado con
glutamina, antibióticos, 5% de suero de ternero fetal dializado y
100 \muCi de [^{35}S]cisteína por ml. Al cabo de 18
horas de la infección, se recogieron por separado las células y los
sobrenadantes. Las células se lisaron en 1 ml de
PBS-TDS (1% (volumen/volumen) de Triton
X-100, 0,5% (peso/volumen) de desoxicolato de sodio,
0,1% (peso/volumen) de dodecil-sulfato de sodio en
solución salina tamponada con fosfato). Los lisados se trataron por
ultrasonidos y se clarificaron por centrifugación durante 10 min a
80.000 g. Los sobrenadantes se clarificaron por centrifugación
durante 2 horas a 80.000 g. Muestras de 100 microlitros de lisados o
muestras de 200 \mul de sobrenadantes se incubaron durante 16
horas a 4ºC con 2 \mul de una mezcla 1:1:1 de MAbs 3, 6, y 8
específicos de E1 (Wensvoort, J. Gen. Virol. 70, 2865
(1989)). Estas mezclas se incubaron luego durante 2 horas a 4ºC con
1 mg de proteína A-Sepharose y se centrifugaron
durante 1 min a 1000 g. Las proteínas precipitadas se lavaron cuatro
veces con PBS-TDS, se incubaron durante 5 min a
100ºC en tampón de muestra (Tris-HCl 60 mM de pH
6,8, 2% de dodecil-sulfato de sodio, 10% de
glicerol, 5% de 2-mercaptoetanol, 0,01% de azul de
bromofenol), y se analizaron por electroforesis en geles de
SDS-poliacrilamida al 10%.
Fig.
1
Secuencia nucleotídica completa de la copia de
DNA del RNA del virus del cólera del cerdo de la cepa Brescia.
El resto metionina codificado por los nucleótidos
361-363 es el primer amino-ácido del marco de
lectura abierto que se extiende en la secuencia desde el nucleótido
361 al 12054.
Las áreas subrayadas indican la secuencia de
péptidos sintéticos (18-meros) 1-3
que se utilizan para preparación de los antisueros peptídicos en
conejos (véase anteriormente).
Las flechas verticales indican Leu en la posición
del aminoácido 691, Phe en la posición 1031, Leu en la posición 1063
y Asp en la posición 1148 (véase también la Fig. 4).
Fig.
2
Análisis por transferencia Western de antisueros
de conejo, preparados contra los péptidos 1-3 (véase
Fig. 1).
Las transferencias se analizaron con (de
izquierda a derecha): concanavalina-A, anticuerpo
monoclonal 8, (Wensvoort, 1989, véase anteriormente); antisueros
contra los péptidos 1-3.
El doblete gp54-51 forma la
fracción de glicoproteína E1 de la cepa Brescia de HCV; la
naturaleza de gp31 no ha sido establecida todavía.
Fig.
3
Mapa de los nucleótidos 1-4440 de
la secuencia representada en la Fig. 1 para las enzimas de
restricción AccI, EcoRI, EcoRV y NaeI. Se ha indicado la posición en
la secuencia (Fig. 1) del primer nucleótido de un sitio de
reconocimiento para una enzima de restricción.
Los sitios de los fragmentos de restricción de
E1, M203 (NaeI-EcoRI), M204
(NaeI-AccI), y M205 (NaeI-EcoRV) en
esta secuencia están subrayados. Estos fragmentos se subclonaron en
pHBdelta2,4 (véase Fig. 4).
Fig.
4
Construcción de recombinantes entre
HCV-E1 y pHBdelta2,4. La construcción de pHBdelta2,4
ha sido descrita por Quint et al., J. Gen. Virol. 68,
523-534 (1987). El triángulo indica una supresión de
aproximadamente 2,05 kb en la región corta singular de pHBdelta2,4
(Van Zijl, pendiente de publicación). Los sitios BamHI se indican
con una B. La secuencia de gX ha sido descrita por Rea et
al., J. Virol. 54, 21-29 (1985), la
secuencia de gp50 por Petrovskis et al., JK. Virol.
59, 216-223 (1986), y la secuencia de gp63
por Petrovskis et al., J. Virol. 60,
185-193 (1986). Se construyeron los recombinantes
por supresión del fragmento de restricción BalI-NdeI
a partir de pHBdelta2,4. Dicho fragmento de restricción comprende la
mayor parte de la región codificante (1380 nucleótidos) de gX (Rea
et al., véase anteriormente). El sitio NdeI se rellenó con
polimerasa Klenow, y se insertaron en pHBdelta2,4 las secuencias de
E1 M203, M204 y M205, representadas en la Fig. 3.
En el extremo 5', todas las secuencias de E1
poseen un extremo romo (de NaeI) que comienza con GG. Este extremo
está ligado directamente al extremo romo, generado después de
digestión con BalI, de pHB-delta2,4. La fusión en el
extremo 5' conduce a un codón Gly en el sitio de ligación en todos
los constructos pHBdelta2,4-E1. El codón Leu situado
aguas abajo de este Gly codifica el número de aminoácido de número
691 en la secuencia de HCV (Fig. 1).
En el extremo 3', se insertaron codones de parada
en los constructos mediante el uso de enlazadores de
oligonucleótidos específicos. El codón que se encuentra
inmediatamente aguas arriba del codón de parada en el constructo
M203 codifica el aminoácido 1031 en la secuencia de HCV (Fig. 1). En
los constructos M204 y M205, estos codones codifican los aminoácidos
1063 y 1148, respectivamente (Fig. 1).
Los puntos de partida de las secuencias gX a lo
largo de las inserciones de E1 en los extremos 5' y 3' se indican
por flechas. Los codones de parada y las secuencias hasta los puntos
de partida de gX en los extremos 3' de los constructos se derivan de
los enlazadores oligonucleotídicos utilizados.
Los procedimientos de clonación molecular se
llevaron a cabo como ha sido descrito por Maniatis et al.
(1982, véase anteriormente).
Fig.
5
Regeneración del virus recombinante de la
pseudorrabia (PRV) a partir de fragmentos solapantes del subgenoma
de PRV (Van Zigl et al., J. Virol. 62,
2191-2195 (1988)).
pMZ66 contiene el fragmento de E1 M203, pMZ65
contiene el fragmento de E1 M204, y pMZ63 contiene el fragmento de
E1 M205.
Las posiciones de los clones transfectados en el
mapa físico de la cepa NIA-3 de PRV (véase 5a) se
indican por barras verticales (véase 5b).
(a): mapa físico de NIA-3 (Quint
et al., J. Gen. Virol. 68, 523-524,
(1987)). El genoma está constituido por una molécula de DNA
bicatenario lineal que puede dividirse en una región corta singular
dentro de repeticiones invertidas (indicadas por rectángulos vacíos)
y una región larga singular. Se muestran los sitios de BamHI,
HindIII y KpnI.
(b): serie de cinco clones solapantes.
Los clones de cósmidos c-179,
c-1 y c-443 han sido descritos por
Van Zigl et al., (véase anteriormente). El clon pMZ64
contiene el fragmento BglII B de la cepa 783 (Moormann et
al., Abstract 12th Int. Herpes Virus Workshop, p. 255 (1987)) en
un vector de plásmido. El gen Tk en la cepa 783 (pMZ64) se ha
inactivado por introducción de una supresión de 19 pares de bases
(Moormann et al., véase anteriormente). La posición de esta
supresión en pMZ64 se indica por un triángulo. La construcción de
los clones pMZ63/65 y 66 se describe en la Fig. 4. La regeneración
de los recombinantes PRV-E1 se llevó a cabo como ha
sido descrito por Van Zigl et al. (véase anteriormente).
Correspondiendo al área de E1 insertada (Figuras 3 y 4), las cepas
recombinantes de PRV-E1 se designaron por
PRV-M203, PRV-M204 y
PRV-M205.
La construcción de PRV-M206 era
idéntica a la de las cepas PRV-M203 a M205
inclusive; la cepa PRV-M206 es idéntica a dichas
cepas, pero carece de la secuencia E1 específica de HCV.
\newpage
Fig.
6
Autorradiografía de un gel de
SDS-poliacrilamida, que muestra inmunoprecipitados
de lisados y sobrenadantes (medio) de células infectadas con M203,
M204, M205 y M206 con una mezcla de MAbs específicos de E1. Se pasó
en paralelo E1 de tipo salvaje (peso molecular de 51 a 54 kD),
precipitado a partir de lisados de células infectadas con HCV. Se
coprecipita siempre con E1 una glicoproteína de 31 kD.
Ejemplo
Los ensayos que siguen se llevaron a cabo para
determinar si, como resultado de la vacunación de lechones con uno
de los tres constructos de PRV M203, M204 y M205 o con el constructo
de PRV M206, los lechones producían anticuerpos neutralizantes
contra el virus de la pseudorrabia y el virus del cólera del cerdo y
formaban anticuerpos específicos de HCV-E1.
Se determinó adicionalmente si la vacunación de
lechones con uno de los tres constructos PRV-M203,
-M204 y -M205 conduce a la protección de estos lechones contra una
infección virulenta con el virus del cólera del cerdo.
Los animales de ensayo utilizados fueron cuatro
grupos (A-D) que comprendían lechones SPF de 10
semanas de edad que no poseían anticuerpos contra HCV ni BVDV. Cada
grupo de ensayo comprendía cuatro lechones.
El día 0, los cuatro lechones del grupo A se
vacunaron por vía intramuscular con 10^{7,3} PFU de
PRV-M203 (véase Fig. 4), los del grupo B con
10^{7,3} PFU de PRV-M204, los del grupo C con
10^{7,3} PFU de PRV-M205, y los del grupo D con
10^{7,3} PFU de PRV-M206.
Esta vacunación se repitió el día 28. El día 42,
todos los lechones de los cuatro grupos se infectaron por vía
intranasal con 100 dosis DL_{50} de la cepa virulenta de HCV
Brescia 456610 (Terpstra y Wensvoort, Vet. Microbiol. 16,
123-128 (1988)).
Se tomaron muestras de suero sanguíneo los días
-3, 28, 42 y 63. Los sueros se examinaron en el ensayo de
neutralización del suero (SNT-PRV) (De Leeuw et
al., Vet. Quarterly 4, 49-56 (1982)) para
detectar anticuerpos neutralizantes contra PRV. Se examinaron los
sueros en el ensayo de neutralización enlazado a peroxidasa (NPLA)
(Terpstra et al., Vet. Microbiol. 9,
113-120 (1984)) para detectar anticuerpos
neutralizantes contra HCV. Los sueros se investigaron ulteriormente
en el ensayo ELISA complejo de bloqueo con atrapamiento (CTB)
(Wensvoort et al., Vet. Microbiol. 17,
129-140 (1988)) para detectar anticuerpos
específicos de HCV-E1.
Se tomaron muestras de sangre con EDTA los días
42, 45, 47, 49, 52 y 56, así como el día 63. Se contó el número de
eritrocitos, trombocitos y leucocitos en estas muestras.
Ulteriormente, se aislaron los leucocitos de estas muestras y se
determinaron los títulos de HCV de las fracciones de leucocitos por
titulación de diluciones logarítmicas de las fracciones en células
PK-15. Las células se cultivaron posteriormente
durante 4 días a 37ºC y con 5% de CO_{2}, después de lo cual se
determinó la presencia de virus en un ensayo IPMA con anticuerpos
monoclonales generados contra la cepa Brescia de HCV (Wensvoort
et al., Vet. Microbiol. 12, 101-108
(1986)).
Se midieron diariamente las temperaturas rectales
de todos los lechones, y los lechones se examinaron a diario
respecto al desarrollo de síntomas de enfermedad.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- Los lechones vacunados con uno de los tres
constructos PRV-203, M204 y M205 desarrollan
anticuerpos neutralizantes contra PRV y HCV y anticuerpos
específicos para HCV-E1. Los lechones vacunados con
PRV-M206 desarrollan anticuerpos neutralizantes
contra PRV, pero no anticuerpos neutralizantes contra HCV o
anticuerpos específicos para HCV-E1 (Tabla 1). En el
compuesto con PRV-M206, la única información
genética adicional contenida en los tres constructos
PRV-HCV es la secuencia genómica que codifica
HCV-E1 o secciones de HCV-E1: esto
significa que los sueros de los lechones dirigidos contra
HCV-E1 pueden neutralizar HCV.
- Los lechones vacunados con
PRV-M203 están protegidos parcialmente contra la
infección virulenta por HCV. Los lechones vacunados con los
constructos PRV-HCV M204 o M205 están protegidos
completamente contra la infección virulenta por HCV.
Los lechones vacunados con
PRV-M206 no están protegidos contra la infección
virulenta por HCV (Tablas 2 y 3). Los lechones pueden protegerse por
consiguiente contra la infección virulenta por el virus del cólera
del cerdo por vacunación con una vacuna que contenga la información
genética para HCV-E1 o partes de
HCV-E1, o por vacunación con una vacuna en la cual
el producto genético de HCV-E1 o partes de
HCV-E1 se utilice como el único polipéptido contra
el cual se genera una respuesta de anticuerpos para HCV, o por
vacunación con polipéptidos que se deriven de algún modo de la
información genética que codifica HCV-E1 o partes de
HCV-E1.
Claims (13)
1. Secuencia de nucleótidos que codifica una
parte de la secuencia de amino-ácidos de la cepa Brescia del virus
del cólera del cerdo (HCV), comprendiendo dicha parte una o más de
las secuencias de aminoácidos 1-1148,
1-267, 268-570,
571-690, 691-1148,
691-1030, 1012-1031,
1012-1063, 1031-1148 y
1031-1063 de la secuencia de aminoácidos
representada en la Fig. 1.
2. Secuencia de nucleótidos que comprende una
parte del genoma de un pestivirus, codificando dicha secuencia de
nucleótidos un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos correspondiente a las secuencias de aminoácidos
268-570, 691-1148,
691-1030 o 1031-1063 representadas
en la Fig. 1.
3. Polinucleótido recombinante que contiene una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 o la
2.
4. Polinucleótido recombinante de acuerdo con la
reivindicación 3, en el cual la secuencia está contenida en un
vector del virus de la pseudorrabia.
5. Sistema de expresión que contiene un
polinucleótido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 3-4 capaz de expresar la secuencia
de nucleótidos.
6. Polipéptido recombinante que comprende una
parte de la secuencia de aminoácidos de la cepa Brescia del virus
del cólera del cerdo (HCV), teniendo dicha parte una de las
secuencias de aminoácidos 1-1148,
1-267, 268-570,
571-690, 691-1148,
691-1030, 1012-1031,
1012-1063, 1031-1148 y
1031-1063 de la secuencia de aminoácidos
representada en la Fig. 1, y estando el polipéptido opcionalmente
glicosilado.
7. Polipéptido recombinante que comprende una
parte de la secuencia de aminoácidos del virus del cólera del cerdo
(HCV), constando dicha parte de una secuencia de aminoácidos
correspondiente a las secuencias de aminoácidos
268-570, 691-1148,
691-1030 ó 1031-1063 representadas
en la Fig. 1.
8. Un proceso para preparar un polipéptido
recombinante que comprende una parte de la secuencia de aminoácidos
de la cepa Brescia de HCV, que comprende el paso de expresar una
secuencia de aminoácidos que comprende una de las secuencias de
aminoácidos 1-267, 268-570,
571-690, 691-1148,
691-1030, 1012-1031,
1012-1063, 1031-1148 y
1031-1063 de la Fig. 1, utilizando DNA que codifica
dicha secuencia de aminoácidos a expresar.
9. Un proceso para preparar un polipéptido
recombinante que comprende una parte de la secuencia de aminoácidos
del virus del cólera del cerdo (HCV), donde dicha parte consta de
una secuencia de aminoácidos correspondiente a las secuencias de
aminoácidos 268-570, 691-1148,
691-1030 o 1031-1063 representadas
en la Fig. 1, comprendiendo el proceso el paso de expresar el
polipéptido usando ADN que codifica dicho polipéptido a
expresar.
10. Vacuna para protección contra una infección
por pestivirus, que contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2.
11. Vacuna para protección contra una infección
por pestivirus, que contiene un polipéptido producido de acuerdo con
la reivindicación 6 ó 7, o un polipéptido preparado de acuerdo con
la reivindicación 8 ó 9.
12. Estuche de diagnóstico, conteniendo dicho
estuche al menos un polipéptido producido de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7, o un polipéptido preparado de acuerdo con la
reivindicación 8 ó 9.
13. Estuche de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 12 para el diagnóstico del cólera del cerdo, que
contiene un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
correspondiente a la secuencia de aminoácidos
268-570 de la Fig. 1.
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