ES2149772T5 - Receptores humanos pf4a y su utilizacion. - Google Patents

Abstract

SE HA IDENTIFICADO SADNC QUE CODIFICA UNA CLASE DE NUEVOS PF4ARS EN TEJIDO HUMANO. SE PRESENTAN AQUI SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO DE TRES PF4ARS (INCLUIDO EL RECEPTOR DE IL-8 HUMANO) UTILES COMO DIAGNOSTICO Y EN LA PREPARACION RECOMBINANTE DE PF4ARS. LOS PF4ARS SON USADOS EN LA PREPARACION Y PURIFICACION DE ANTICUERPOS CAPACES DE ENLAZARSE A LOS RECEPTORES, Y EN LAS PRUEBAS DE DIAGNOSTICO.

Description

Receptores humanos PF4A y su utilización.

Esta invención se refiere al campo del ensayo de los miembros de la súperfamilia del factor 4 de plaquetas (a partir de ahora "PF4A"), y a la preparación de agonistas y antagonistas contra los miembros de esta familia.

Antecedentes de la invención

Aunque la interleucina-8 fue inicialmente identificada como un quimioatrayente para neutrófilos, y se supo que se unía a un receptor sobre los neutrófilos [8-10], ésta tiene además un amplio rango de actividades pro-inflamatorias, incluyendo la estimulación de la desgranulación y la sobreregulación de la molécula MAC-1 de la adhesión celular, y del receptor de complemento CR1 [1]. La IL-8 también media la inhibición de la adherencia de neutrófilos para activar las células endoteliales [2].

La IL-8 es un miembro de una familia de diez o más citoquinas pro-inflamatorias con un peso molecular de 10.000 [1]. Esta gran familia de proteínas se denomina la súperfamilia del factor 4 de plaquetas (Wolpe et al. FASEB J. 3: 2565-2573 (1989)). Algunos miembros de la súperfamilia del factor 4 de plaquetas, en general el subconjunto denominada péptidos CXC (incluyendo la IL-8), poseen actividad agonista por neutrófilos, por ejemplo, el NAP-2, el MIP-2, el factor 4 de plaquetas, y el NAP-3 (MGSA/gro). Otros miembros de esta familia, los péptidos C-C, no son agonistas de neutrófilos. A partir de ahora, "PF4A" indica la súperfamilia PF4.

Es un objeto de esta invención identificar receptores para la súperfamilia PF4A (a partir de ahora, "PF4AR").

Es otro objeto de esta invención obtener ADN codificando o hibridando estos receptores, y expresar los receptores en células huésped.

Es un objeto adicional de esta invención proporcionar aislados de PF4AR para propósitos diagnósticos y terapéuticos.

Aún otro objeto es obtener ADN codificando variantes de tales receptores y preparar tales variantes en cultivos celulares recombinantes.

Estos y otros objetos de esta invención se manifestarán a partir de la totalidad de la especificación.

Descripción resumida de la invención

En un primer aspecto de la invención se proporciona un polipéptido de PF4AR aislado que tiene al menos un 85% de homología en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos traducida de la Figura 2, 4 ó 5.

En un aspecto ulterior, se proporciona un aislado de polipéptido PF4AR en el que el ácido nucleico codificando el polipéptido PF4AR se hibrida con el complemento del ácido nucleico que codifica los polipéptidos de las Figuras 4 ó 5 bajo condiciones de elevada exigencia.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que incluye el PF4AR, la cual está libre de polipéptido contaminantes de las especies animales de las cuales se deriva el PF4AR.

El PF4AR, o los fragmentos del mismo (los cuales podrían sintetizarse por procedimientos químicos), se fusionan (mediante expresión recombinante o procedimientos covalentes in vitro) a un polipéptido inmunogénico, y, a su vez, este polipéptido de fusión se usa para inmunizar un animal con objeto de generar anticuerpos contra un epítopo del PF4AR. Los anticuerpos anti-PF4AR se recuperan a partir del suero de los animales inmunizados. Alternativamente, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado de la forma convencional.

Los anticuerpos anti-PF4AR son particularmente útiles en el diagnóstico (in vitro o in vivo) o (cuando se inmovilizan sobre una matriz insoluble) en la purificación del PF4AR.

Se preparan las sustituciones, supresiones o inserciones del PF4AR mediante métodos recombinantes in vitro y se tamizan por reactividad inmunológica cruzada con el PF4AR y por actividad agonista o antagonista de PF4AR.

El PF4AR también se derivatiza in vitro para preparar PF4AR inmovilizado y PF4AR marcado, especialmente para fines de diagnosis del PF4AR o sus anticuerpos o por purificación mediante afinidad de los anticuerpos de PF4AR.

El PF4AR, sus derivados, o sus anticuerpos se formulan en vehículos fisiológicamente aceptables, especialmente para uso terapéutico. Tales vehículos incluyen formulaciones para la liberación continuada de PF4AR.

En aún otros aspectos, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, marcada o sin marcar, que codifica el PF4AR, y una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones apropiadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica el PF4AR.

Además, la invención proporciona un vector replicable que incluye la molécula de ácido nucleico que codifica el PF4AR, unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un huésped transformado por el vector; las células huésped transformadas con el vector; y un procedimiento para usar una molécula de ácido nucleico que codifica el PF4AR para efectuar la producción de PF4AR, incluyendo la combinación de la expresión de la molécula de ácido nucleico en un cultivo de las células huésped transformadas, y la recuperación del PF4AR a partir del cultivo de células huésped. La secuencia de ácido nucleico también es útil en los ensayos de hibridación para el ácido nucleico del PF4AR. Las células huésped recombinantes son especialmente útiles para ensayar los miembros PF4A apropiados.

En otras realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para producir PF4AR, el cual incluye la inserción en una célula de ADN que contiene el ácido nucleico que codifica el PF4AR, un elemento modulador de la transcripción, con la suficiente proximidad, y la orientación del ácido nucleico del PF4AR para influir o destruir la transcripción del ADN que codifica el PF4AR biológicamente activo; con un paso adicional opcional que incluye el cultivo de la célula que contiene el elemento modulador de la transcripción y el ácido nucleico del PF4AR.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la elevada afinidad de unión de la IL-8 a las células COS transfectadas con el clon
pRK5B.il8r1.1. A. Competición con IL-8 o fMLP no marcado. B. Análisis "scatchard" de los datos de la competición de la IL-8; kd aparente = 3,6 nM, promedio de 820.000 sitios de unión/célula. Competiciones similares con neutrófilos humanos dieron una kd = 1,1 nM, 31.000 sitios de unión/célula.

La Figura 2a-2c (SEC. ID Nº 1) (a partir de ahora denominada de forma conjunta como Figura 2) muestra las secuencias de aminoácidos y nucleotídicas del inserto de cADN del receptor de la IL-8 procedente del clon pRK5B.il8r1.1. Se muestran los siete dominios transmembrana putativos. Hay 4 segmentos extracelulares y 4 segmentos intracelulares, separados cada uno de ellos por uno de los dominios transmembrana. Los segmentos extracelulares están limitados aproximadamente por los residuos 1-39, 99-111, 134-154, 175-203, y 265-290. El receptor de la IL-8 contiene 3 sitios potenciales de glucosilación unida a N en la primera región extracelular y 3 más en el tercer bucle extracelular.

La Figura 3 muestra la determinación mediante citometría de flujo de la respuesta de Ca^{2+} intracelular de receptores humanos transfectados de la IL-8 y el fMLP frente a sus ligandos. Se transfectaron células 293 embrionarias humanas de riñón mediante electroporación [19] con el receptor de la IL-8 (clon pRK5B.il8r1.1), receptor del fMLP (cADN del receptor del fMLP humano en el vector pRK5), o el ADN del vector (pRK5B [18]). Después de dos días, se cargaron las células con 2 \muM indo-1 acetoximetiléster en medio RPMI durante 30 minutos a 37ºC. El Ca^{2+} intracelular se midió con un citómetro de flujo Coulter 753 usando el cociente de las fluorescencias a 405 y 525 nm.

La Figura 3B ilustra el porcentaje de células por encima de 400 nm de Ca^{2+} durante el periodo de tiempo posterior a la adición de la IL-8 (aproximadamente 15 segundos en cada serie).

La Figura 4 (SEC. ID Nº 2) y 5 (SEC. ID Nº 3) muestra la secuencias de ADN y polipeptídica deducida para dos miembros PF4AR adicionales, identificados mediante sondeo de bibliotecas lambda procedentes de una línea celular del tipo monocito (HL-60) y PLBs humanos usando un gran fragmento de ADN del receptor de la IL-8.

Descripción detallada de la invención

Hemos aislado mediante la clonación y expresión un cADN que codifica el receptor de la IL-8 de neutrófilos humanos junto con otros dos receptores homólogos. La secuencia de aminoácidos muestra que el receptor de la IL-8 es un miembro de la familia de receptores acoplada a la proteína-G, con clara similitud (29% de aminoácidos idénticos) con los receptores de neutrófilos humanos para los quimioatrayentes f-Met-Leu-Phe [3] y C5a [4]. Aunque la secuencia del receptor de la IL-8 podría ser la homóloga humana de la que ha sido identificada como la isoforma del receptor f-Met-Leu-Phe del conejo [5], nosotros mostramos que, cuando se transfecta al interior de células de mamífero, este clon del receptor confiere una elevada afinidad de unión a la IL-8, y produce una movilización transitoria de Ca^{2+} en respuesta a la IL-8, sin unión ni respuesta al f-Met-Leu-Phe.

Se usó una estrategia de clonación para expresión en células COS para aislar los clones que codificaban el receptor de la IL-8. Se construyó una biblioteca de cADN a partir de mARN de neutrófilos humanos en el vector de expresión para mamíferos pRK58, el cual se transfectó al interior de células COS-7 como lotes de 2500 clones, y las células se ensayaron en busca de la unión a la ^{125}I-IL-8. Se partió un lote positivo procedente de las primeras 58 transfecciones en lotes más pequeños, hasta que se obtuvo un clon puro (pRK5B.il8r1.1). La Figura 1 muestra la competencia por parte de la IL-8 sin marcar para unir ^{125}I-IL-8 a células COS transfectadas con el clon aislado. El análisis de estos datos da una kd de 3,6 nM para la unión de la IL-8, la cual está en el rango de 0,8 a 4 nM mencionado para la unión de la IL-8 a neutrófilos humanos [8-10]. No hay competencia de unión de la IL-8 por parte del péptido quimiotáctico f-Met-Leu-Phe (fMLP).

La secuencia de ADN del clon de cADN aislado (Fig. 2) contiene un único y largo marco de lectura abierta, con un residuo de metionina que coincide con el consenso esperado para un sitio de iniciación de la traducción [11]. Este marco de lectura abierta codifica una proteína de 350 aminoácidos (p.m. traducidos, 39,5 kDa). La secuencia de aminoácidos comparte algunas características con la proteína G asociada a receptores de la súperfamilia rodopsina, incluyendo siete dominios hidrofóbicos, que se supone abarcan la membrana celular, y sitios de glucosilación vinculados a N cerca del extremo N-terminal [12] (ver más abajo).

La secuencia de aminoácidos codificada es la más similar a la secuencia del receptor de fMLP de conejo recientemente clonada [5]. La similitud es tan suficientemente elevada (en conjunto 79% de aminoácidos idénticos, con múltiples porciones de más de 20 aminoácidos idénticos contiguos), que estas dos secuencias bien podrían ser especies homólogas del mismo receptor. También el receptor de fMLP humano ha sido clonado [3]; tan sólo tiene un 26% de aminoácidos idénticos con el receptor de fMLP de conejo (y un 29% de identidad con el receptor humano de la IL-8 aquí presentado). La considerable divergencia entre las secuencias de aminoácidos del receptor de fMLP de conejo y humano ha llevado a la sugerencia en la técnica (que ahora se cree que es posiblemente errónea) de que éstos podrían ser dos isoformas del receptor de fMLP [5].

Los neutrófilos responden a los quimioatrayentes IL-8 y fMLP con un aumento rápido y transitorio de la concentración de Ca^{2+} intracelular [1, 13]. Con objeto de verificar la identificación del clon aquí aislado como el receptor de la IL-8, hemos determinado la respuesta de Ca^{2+} intracelular de células transfectadas a la IL-8 añadida, así como al fMLP. Hemos usado experimentos paralelos con el receptor de fMLP humano transfectado o con el vector de expresión como controles. El análisis mediante citometría de flujo muestra un claro incremento transitorio del Ca^{2+} intracelular para el receptor de la IL-8 transfectado en respuesta a la IL-8. No se encontró respuesta alguna al fMLP. De forma opuesta, las células transfectadas con el receptor de fMLP humano respondieron al fMLP pero no a la IL-8. No se encontró respuesta alguna a cualquiera de los quimioatrayentes en células transfectadas con el vector. Se espera que tan sólo un subconjunto de las células responda en estos experimentos, ya que la eficiencia de la transfección se estima que está en 15-25%. Los experimentos de unión [14] también fallaron en detectar cualquier unión de ^{3}H-fMLP al receptor de la IL-8 expresado, o de ^{125}I-IL-8 al receptor de fMLP humano expresado. Estos experimentos muestran claramente la especificidad de los dos receptores por sus respectivos ligandos; un resultado esperado basándonos en la falta de competición de unión por los neutrófilos entre la IL-8 y el fMLP [1]. Estos resultados también demuestran que los receptores clonados funcionan en la señalización de segundos mensajeros en respuesta a la unión de ligando.

La hibridación del cADN del receptor de la IL-8 clonado al mARN de neutrófilos humanos mediante absorción muestra bandas intensas de 2,4 y 3,0 kDa, así como una banda más difusa de 3,5 kDa. Mientras que está claro, a partir de los datos de la secuencia de ADN presentados en la Figura 2, que el mARN para el receptor tiene una larga región 3' no traducida, se precisara de trabajo adicional para establecer si las múltiples bandas de ARN se deben a múltiples sitios de poliadenilación. No se detectó hibridación al mARN a partir de las líneas celulares U266 o Jurkat, las cuales son de los linajes de células B y células T. Tampoco se encontró hibridación para el mARN procedente de la línea celular U937 de monocitos, a pesar de los informes de niveles bajos de unión de IL-8 a estas células [9, 10].

El alineamiento de las secuencias del receptor para los tres quimioatrayentes de neutrófilos, IL-8, fMLP [3] y C5a [4], muestra que forman una subfamilia de los receptores asociados a la proteína G, con un 29-34% de aminoácidos idénticos. Esta subfamilia tiene un tercer bucle intracelular corto si se compara con otros receptores asociados a proteína G, tales como los receptores \beta-adrenérgico [12] o muscarínico de acetilcolina [15]. Este bucle contiene determinantes al menos parcialmente responsables de la unión de las proteínas G a los receptores [12]. La región intracelular C-terminal del receptor de la IL-8, aunque no es muy similar a la de los receptores fMLP y C5a, sí que preserva un elevado número de residuos serina y treonina que podrían funcionar como sitios de fosforilación. Como se ha notado para el receptor del C5a [4], la región extracelular N-terminal para el receptor de la IL-8 tiene varios residuos ácidos. Éstos podrían ayudar en la unión a la IL-8, la cual es bastante básica (pI aproximado de 9,5).

I. Definiciones

En general, las siguientes palabras o frases tiene la definición indicada cuando se usan en la descripción, ejemplos y reivindicaciones:

El término "PF4AR" se define como un polipéptido que tiene una actividad biológica cualitativa en común con los polipéptidos de las Figuras 2, 4 ó 5. Opcionalmente, PF4AR tendrá al menos un 30%, y ordinariamente un 75%, de identidad en la secuencia de aminoácidos con cualquiera de los polipéptidos de las Figura 2, 4 ó 5. El PF4AR excluye el receptor de conejo de fMLP [5], el receptor humano de fMLP [3], el receptor humano de C5a [1].

La identidad u homología con respecto al PF4AR se define aquí como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos a los residuos de las Figuras 2, 4 ó 5 después de alinear las secuencias e introducir discontinuidades, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de homología, sin considerar ninguna sustitución conservadora como representante de la identidad del residuo. Ninguna extensión N- o C-terminal, supresión, ni inserción debería interpretarse como reductora de la identidad u homología.

La actividad biológica cualitativa del PF4AR se define como una cualquiera de (1) reactividad inmunológica cruzada con al menos un epítopo de un polipéptido detallado en las Figura 2, 4 ó 5; (2) la capacidad de unirse específicamente a un miembro de la superfamilia PF4; o (3) cualquier efector o actividad funcional de los polipéptidos de las Figura 2, 4 ó 5, tal y como se encuentra en la naturaleza, incluyendo su capacidad de unir cualquier ligando distinto de los miembros de la súperfamilia.

\newpage

La reactividad inmunológicamente cruzada, tal y como se usa aquí, significa que el polipéptido candidato es capaz de inhibir competitivamente la unión de un PF4AR a anticuerpos policlonales o antisuero generado contra un PF4AR. Tales anticuerpos y antisuero se preparan de la forma convencional inyectando subcutáneamente un animal, tal como una cabra o conejo, por ejemplo, con el PF4AR nativo conocido como adyuvante de Freund completo, seguido por intensificación intraperitoneal como adyuvante de Freund incompleto.

Se incluyen en el ámbito del PF4AR, tal y como aquí se usa este término, los polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos descritas en las Figuras 2, 4 ó 5, secuencias de aminoácidos variantes de tales secuencias de aminoácidos, variantes de glucosilación de los polipéptidos, y modificaciones covalentes de los polipéptidos. Cada uno de éstas se describe más abajo con mayor detalle.

Un ácido nucleico de PF4AR "aislado" es un ácido nucleico o polipéptido de PF4AR, que se identifica y separa a partir de al menos un contaminante (respectivamente ácido nucleico o polipéptido) con el cual está ordinariamente asociado en la naturaleza, tal y como a partir de la fuente animal o humana del ácido nucleico o polipéptido de PF4AR. En realizaciones preferidas, el PF4AR será aislado hasta niveles de pureza farmacéuticamente aceptables con respecto a las proteínas de sus especies de origen. En realizaciones preferidas, la proteína PF4AR será ulteriormente purificada (1) hasta más del 95% en peso de proteína, tal y como se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferiblemente hasta más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante un secuenciador de aminoácidos comercialmente disponible en la fecha de depósito de esta solicitud, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE no reductora convencional, usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El PF4AR aislado incluye el PF4AR in situ en células recombinantes, ya que, en este caso, al menos un componente del entorno natural del PF4AR no estará presente. El PF4AR aislado incluye el PF4AR procedente de una especie en un cultivo celular recombinante de otra especie, ya que el receptor en tales circunstancias estará falto de polipéptidos fuente. No obstante, de forma ordinaria, el receptor aislado se preparará al menos mediante un paso de purificación.

El ácido nucleico del PF4AR aislado incluye un ácido nucleico, que se identifica y separa de al menos un ácido nucleico de contención con el cual está ordinariamente asociado en la fuente natural del ácido nucleico del receptor. Por tanto, el ácido nucleico del PF4AR aislado está presente en otra forma distinta de la forma o disposición en la cual se encuentra en la naturaleza. No obstante, el ácido nucleico aislado que codifica el receptor incluye el ácido nucleico del PF4AR en células que expresan el receptor de forma ordinaria, en donde el ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o, por otra parte, está flanqueado por un secuencia de ADN diferente a la que se encuentra en la naturaleza.

El ácido nucleico o polipéptido podría marcarse para propósitos diagnósticos y de sondeo, usando una marca como se describe y define más abajo en la discusión de ensayos diagnósticos.

El "ácido nucleico" PF4AR se define como ARN o ADN que contiene más de diez bases, que codifica una secuencia polipeptídica de las Figuras 2, 4 ó 5, es complementario a las secuencias de ácido nucleico de las Figuras 2, 4 ó 5, se hibrida a tales ácidos nucleico y permanece estable unido a éste en condiciones de baja exigencia, o codifica un polipéptido que comparte al menos un 30% de identidad en secuencia, preferiblemente al menos el 75%, y más preferiblemente al menos el 85%, con la secuencia de aminoácidos traducida mostrada en las Figuras 2, 4 ó 5, o un fragmento de las mismas. Preferiblemente, el ADN que se hibrida al ácido nucleico de las Figuras 2, 4 ó 5 contiene al menos 20, más preferiblemente 40, y más preferiblemente 60 bases. Más preferiblemente, el ADN o ARN que se hibrida contiene 45 o, incluso más preferiblemente, 90 bases. No obstante, tal ácido nucleicos que se hibrida o es complementario, se define además por ser novedoso y no obvio con respecto a cualquiera otro ácido nucleico de la técnica, incluyendo aquel que codifica, se hibrida bajo condiciones de baja exigencia, o es complementario a un ácido nucleico que codifica el receptor de conejo de fMLP [5], el receptor humano de fMLP, u (opcionalmente) el receptor de la IL-8 de Murphy et al. (ver más arriba).

"Condiciones muy rigurosas" son cualquiera de aquellas que (1) emplean una fuerza iónica baja o elevadas temperaturas para lavar, por ejemplo, NaCl 0,015 M /citrato sódico 0,0014 M/NaDodSO_4 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación formamida al 50% (v/v) con 0,1% de albúmina de suero bovino/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean la hibridación con formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,075 mM, citrato sódico 0,075 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma sonicado de salmón (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, 10% de sulfato de dextrano, a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y 0,1% SDS. Las condiciones de baja exigencia se explican en el Ejemplo 2.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora operativamente unida en un organismo huésped determinado. Por ejemplo, las secuencias de control apropiadas para procariotas incluyen un promotor, opcionalmente en una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, e intensificadores.

El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o para un líder de secreción está operativamente unido al ADN para un polipéptido, si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están siendo unidas son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los intensificadores no tienen por que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligadura en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o eslabones oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los plásmidos iniciales aquí mencionados se encuentran disponibles comercialmente, están disponibles públicamente de forma no restringida, o pueden construirse a partir de tales plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes en la técnica, y serán evidentes a los técnicos comunes. Los procedimientos para la digestión con enzimas de restricción, la recuperación o aislamiento de ADN, los análisis de hibridación, y ligaduras son convencionales, y en este momento bien conocidas por el técnico normal.

"Recuperación" o "aislamiento" de un fragmento determinado de ADN, a partir de un digerido con enzimas de restricción, se refiere a la separación del digerido en gel de poliacrilamida o de agarosa mediante electroforesis, identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad frente a la de fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, retirada de la sección de gel que contiene el fragmento deseado, y separación del ADN a partir del gel. Este procedimiento se conoce de forma general. Por ejemplo, ver Lawn et al. Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 (1981), y Goeddel et al. Nucleic Acids Resl. 8: 4057 (1980).

II. Procedimientos apropiados para practicar la invención 1. Preparación de PF4AR nativo y de sus variantes A. Aislamiento del ADN codificando PF4AR

El ADN codificando el PF4AR podría obtenerse a partir de cualquier biblioteca de cADN preparada a partir de tejido que se cree que contiene el mARN del PF4AR, generalmente bibliotecas HL60 o PBL. El gen del PF4AR también podría obtenerse a partir de una biblioteca genómica. Las bibliotecas se verifican con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Hemos descrito el cADN completo para el receptor de la IL-8 y dos receptores homólogos. El ácido nucleico que codifica esta familia de sondas tiene secuencias de oligonucleótidos de las secuencias del gen del receptor de las Figuras 2, 4 ó 5. Estas sondas habitualmente contendrán aproximadamente 500 o más bases. Como estas sondas hibridarán perfectamente con los tres ADNs ejemplificados, no hay necesidad de usar lotes de sondas que contengan secuencias degeneradas. La verificación con las sondas para identificar los receptores de las Figuras 2, 4 ó 5 es más eficiente si se realiza bajo condiciones muy rigurosas.

Se cree que existe otro PF4AR distinto del de las Figuras 2, 4 ó 5, y que contiene regiones homólogas con los receptores ejemplificados. Por tanto, pueden usarse sondas que tengan las secuencias de los ADNs de las Figuras 2, 4 ó 5 para verificar también durante la búsqueda de estos receptores. Los mejores candidatos para las sondas son las secuencias largas (mayores de aproximadamente 100 bases) que representan secuencias que son muy homologas entre los tres receptores humanos ejemplificados. Los cADNs de IL-8 codificando los residuos 15-34, 78-94, 176-193, 264-282, y 299-312 (y sondas comparables procedentes de otros receptores de la familia IL-8R) son útiles, particularmente en sondear en busca del ADN del receptor de la IL-8. Las sondas útiles para el receptor de la Figura 4 (y proteínas aisladas características del receptor de la Figura 5) están representadas por secuencias que incluyen los residuos 1-48, 77-92, 107-137, 156-177, 189-226, 239-257 y 271-315. También son útiles sondas homólogas y residuos del receptor de la Figura 4, por ejemplo residuos 1-35, 64-78, 94-124, 143-164, 176-197, 219-239 y 251-295. Los cADNs que incluyen cADN que codifica las siguientes regiones de los polipéptidos de las Figuras 2, 4 ó 5 son útiles para sondear en busca de otros receptores: 92-106, 57-72, 138-154, 314-329 y 57-154.

En general, uno identifica primero una célula que es capaz de unir específicamente o que es activada por un PF4A determinado, típicamente mediante bioensayos in vitro y, opcionalmente, mediante análisis de unión a células usando el PF4A marcado. Por tanto, las células identificadas mediante este proceso (y algunas ya son conocidas para PF4As individuales) están expresando un receptor para este PF4A. La biblioteca del cADN se prepara a partir de tales células y es examinada usando las sondas para el receptor mediante procedimientos que son convencionales per se. No obstante, en este caso es preferible usar condiciones de baja exigencia (tales como las del Ejemplo 2) y, a continuación, analizar los clones que hayan resultado positivos en busca de homología con los receptores de las Figura 2, 4 ó 5. En general, los PF4ARs humanos candidatos exhibirán más del 30% de homología en su secuencia de aminoácidos con los receptores de las Figuras 2, 4 ó 5, y tendrán una estructura de bucles transmembrana similares.

A continuación, se realizan ensayos conducentes a confirmar que los genes completos que se hibridan son los PF4AR deseados. El candidato se inserta simplemente en un vector de expresión y se transforma en una célula huésped que de forma ordinaria no se une al ligando PF4A candidato. Por tanto, los transformantes que adquieren la capacidad de unir el ligando son portadores del gen del receptor deseado. En el Ejemplo 2 mostramos que, usando ADN del IL-8R que codifica los residuos 23-314, se identifican dos secuencias polipeptídicas homólogas adicionales que representan PF4ARs, aunque no se cree que la sonda concreta sea crítica.

Un medio alternativo de aislar genes que codifican PF4ARs adicionales es usar la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente EE.UU. nº 4.683.195; Erlich, ed. PCR Technology, 1989) para amplificar el ADN o ARN diana, por ejemplo, tal y como se describe en la sección 14 de Sambrook et al., ver más arriba. Este procedimiento requiere el uso de cebadores oligonucleotídicos que se esperará que se hibriden al PF4AR, y estos se seleccionan fácilmente a partir de los cADNs de los receptores de las Figura 2, 4 ó 5. Las estrategias para la selección de cebadores oligonucleotídicos se describen más arriba.

Las bibliotecas de cADN podrían ser examinadas a partir de diferentes tejidos, preferiblemente lineas celulares de PBL, monocitos, placentarias, fetales, de cerebro y de carcinoma de mamífero, con objeto de obtener ADN codificando los receptores de las Figura 2, 4 ó 5, o receptores homólogos. Más preferiblemente, las bibliotecas de cADN procedente de lineas celulares placentarias, fetales, de cerebro y de carcinoma de humano o de conejo se examinan con sondas oligonucleotídicas marcadas.

Otro procedimiento para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente usando uno de los procedimientos descritos en Engels et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28: 716-734 (1989)). Estos procedimientos incluyen los procedimientos triéster, fosfito, fosforamidito y H-fosfonato, procediendo típicamente mediante síntesis del oligonucleótido en soportes sólidos. Estos procedimientos podrían usarse si se conoce la secuencia completa de aminoácidos o del ácido nucleico, o si está disponible la secuencia del ácido nucleico complementario a la hebra codificante. Si se conoce la secuencia de aminoácidos deseada, uno podría inferir secuencias de ácido nucleico potenciales usando residuos conocidos y preferidos para cada residuo de aminoácido.

B. Variantes de la secuencia de aminoácidos del PF4AR

Las variantes de la secuencia de aminoácidos se preparan introduciendo cambios apropiados en los nucleótidos en el ADN del PF4AR, o mediante síntesis in vitro del polipéptido del PF4AR deseado. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de, residuos en la secuencia de aminoácidos mostrada para los receptores en las Figuras 2, 4 ó 5. Podría hacerse cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, supuesto que la construcción final posea las características deseadas.

Los cambios de aminoácidos también podrían alterar el procesamiento post-traducción del PF4AR, tales como: cambiando el número o posición de los sitios de glucosilación, o alterando sus características de anclaje en la membrana. Se excluyen del ámbito de esta invención las variantes del PF4AR o de secuencias polipeptídicas que no son constitutivamente novedosas y no obvias con respecto al estado de la técnica anterior.

Al diseñar variantes de la secuencia de aminoácidos de los PF4ARs, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de la(s) característica(s) del PF4AR a modificar. Los sitios para las mutaciones pueden ser modificados individualmente o en series, por ejemplo (1) sustituyendo primero con opciones de aminoácidos conservadoras y, a continuación, dependiendo de los resultados conseguidos, con opciones más radicales, (2) suprimiendo el residuo diana, o (3) insertando residuos de una misma o diferente clase adyacentes al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones 1-3.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de los polipéptidos PF4AR que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis es la "mutación de barrido de alaninas" tal y como se describe en Cunningham y Wells (Science 244: 1081-1085 (1989)). En ésta, se identifican un residuo o grupo de los residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se remplaza por un aminoácido neutro o negativamente cargado (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso de los alrededores dentro o fuera de la célula. A continuación, aquellos dominios que demuestran tener sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan introduciendo más de la misma u otras variantes, en o para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para introducir una variante en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no está determinada. Por ejemplo, para optimizar las prestaciones de una mutación en un sitio determinado, podría realizarse una mutación "barrido de alaninas" o aleatoria en el codón o región diana y las variantes del PF4AR expresadas serían verificadas en busca de la combinación óptima de la actividad deseada.

En general, las regiones de las molécula PF4AR preferidas para alteraciones son regiones no hidrofóbicas o regiones que no están muy conservadas. Tales regiones son aquellas en las cuales las secuencias con 5 o más residuos no están sustancialmente conservadas en las posiciones homólogas en el receptor del fMLP de conejo, el receptor del fMLP humano, el receptor del C5a humano, y los receptores de las Figura 2, 4 y 5.

Las variantes del PF4AR exhibirán al menos la actividad biológica de la secuencia progenitora, por ejemplo, actividad unidora al ligando o actividad antigénica. El PF4AR antigénicamente activo es un polipéptido que se une con una afinidad de, al menos, aproximadamente 10^{-9} 1/moles a un anticuerpo generado contra una secuencia de PF4AR que se da de forma natural. Ordinariamente, el polipéptido se une con una afinidad de, al menos, aproximadamente 10^{-8} 1/moles. Más preferiblemente, el PF4AR antigénicamente activo es un polipéptido que se une a un anticuerpo generado contra el receptor en su conformación nativa, entendiéndose generalmente por "conformación nativa" el receptor tal y como se encuentra en la naturaleza, el cual no ha sido desnaturalizado mediante agentes caotrópìcos, calor u otro tratamiento que sustancialmente modifique la estructura tridimensional del receptor (esta puede determinarse, por ejemplo, mediante migración o no reducción, geles de tamaño no desnaturalizantes). El anticuerpo usado en la determinación de actividad antigénica es una anticuerpo policlonal de conejo, generado mediante formulación del receptor nativo que no es de conejo en un adyuvante de Freund completo, inyectando subcutáneamente la formulación, y intensificando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que la valoración del anticuerpo anti-receptor se estabiliza.

Un grupo de variantes son mutaciones supresoras, o fragmentos de las secuencias detalladas en las Figuras 2, 4, 5 u otras PF4AR. En general, los fragmentos son aquellos que constituyen las regiones extracelulares de los receptores (estos receptores difieren de la mayoría en que se cree que contienen una pluralidad de dominios hidrofóbicos trans-membrana separados por secuencias hidrofílicas, que se cree forman bucles dentro del ectoplasma). Es particularmente interesante la región N-terminal extracelular que contiene residuos aminoácidos ácidos. No obstante, es útil cualquier secuencia que sea capaz de generar un anticuerpo que pueda reaccionar de forma cruzada con el receptor intacto, o que se una a un miembro de la superfamilia PF4. Estos fragmentos típicamente contienen una secuencia consecutiva de, al menos, aproximadamente 5 (y ordinariamente al menos aproximadamente 10) residuos.

Las supresiones en la secuencia de aminoácidos generalmente oscilan desde aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos, y típicamente son contiguas. Las supresiones podrían introducirse en regiones de baja homogeneidad entre los receptores de las Figuras 2, 4 y 5 para modificar la actividad de los receptores. Es más probable que tales supresiones modifiquen la actividad biológica de los receptores de forma más significativa que las supresiones hechas en cualquier otra parte. El número de supresiones consecutivas se seleccionará para preservar la estructura terciaria del PF4AR en el dominio afectado, por ejemplo, hoja plegada beta o hélice alfa.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxi-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen un centenar de residuos o más, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones en el interior de la secuencia PF4AR) podrían oscilar generalmente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, más preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 1 a 3.

Las variantes debidas a inserciones del PF4AR o sus segmentos extracelulares incluyen la fusión a los extremos N- o C-terminal del PF4AR de polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos tales como beta-lactamasas o un enzima codificado por el locus trp de E. coli, una proteína de levaduras, y las fusiones C-terminales con proteínas que tengan una elevada vida media tales como las regiones constantes de las inmunoglobulinas (u otras regiones de inmunoglobulinas), albúmina o ferritina, tal y como se describe en WO-89/02922, publicada el 6 de Abril de 1989.

Otro grupo de variantes son las variantes por sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula PF4AR suprimido y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustituidora incluyen los sitios identificados como el/los sitio(s) activo(s) del PF4AR, y los sitios donde los aminoácidos encontrados en los PF4AR procedentes de diferentes especies son sustancialmente diferentes en términos de volumen de cadena lateral, carga y/o hidrofobicidad.

Otros sitios de interés son aquellos en los cuales determinados residuos de los PF4ARs de las Figuras 2, 4 y 5 son idénticos. Estas posiciones podrían poder ser importantes para la actividad biológica de los PF4AR. Estos sitios, especialmente aquellos que se encuentran en una secuencia con al menos otros tres sitios idénticamente conservados, son sustituidos de forma relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadores se muestran en la Tabla 1 bajo la cabecera "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o tal y como se describen más abajo en referencia a las clases de aminoácidos, y se examinan los productos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

Se obtienen modificaciones sustanciales en función de la identidad inmunológica del PF4AR seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los residuos que se dan de forma natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1)

hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2)

hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr;

(3)

ácidos: Asp, Glu;

(4)

básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(6)

aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro. Tales residuos sustituidos podrían introducirse en regiones del PF4AR que son homólogas con otros PF4ARs, o, más preferiblemente, en las regiones no homólogas de la molécula.

Cualquier residuo cisteína que no esté implicado en mantener la conformación apropiada del PF4AR podría ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir uniones cruzadas aberrantes.

El ADN que codifica las variantes de la secuencia de aminoácidos del PF4AR se prepara mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de fuentes naturales (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos que se dan de forma natural), o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida contra un sitio), mutagénesis mediante PCR, y mutagénesis de "cassette" de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del PF4AR. Estas técnicas podrían utilizar ácido nucleico del PF4AR (ADN o ARN), o ácido nucleico complementario al ácido nucleico del PF4AR.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento preferido para preparar variantes mediante sustitución, supresión e inserción del ADN del PF4AR. Esta técnica es bien conocida en la especialidad, por ejemplo, tal y como la describe Adelman et al. DNA 2: 183 (1983). Brevemente, el ADN del PF4AR es alterado mediante hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una plantilla de ADN, en donde la plantilla es la forma de cadena sencilla de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia no alterada o nativa del PF4AR. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria entera de la plantilla la cual, por tanto, incorporará el cebador oligonucleotídico, y codificará la alteración seleccionada en el ADN del PF4AR.

Generalmente se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que serán completamente complementarios a la plantilla en cualquier lado del (de los) nucleótido(s) que codifica(n) la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridará apropiadamente con la molécula plantilla de ADN de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica tales como la descrita por Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765 (1978)).

La plantilla de ADN de cadena sencilla también podría generarse desnaturalizando ADN de doble cadena de plásmido (u otro) usando técnicas estándar.

Para alteraciones de la secuencia de ADN nativa (para generar variantes de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo), se hibrida el oligonucleótido con la plantilla de cadena sencilla bajo condiciones de hibridación apropiadas. Se añade a continuación un enzima polimerizador de ADN, usualmente el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN, para sintetizar la cadena complementaria de la plantilla usando el oligonucleótido como cebador de la síntesis. Por tanto, se forma una molécula heterodúplex tal, que una cadena de ADN codifica la forma mutante del PF4AR y la otra cadena (la plantilla original) codifica la secuencia nativa e inalterada del PF4AR. A continuación esta molécula heterodúplex se transforma en una célula huésped apropiada, usualmente un procariota tal como E. coli JM101. Las células se siembran en placas de agarosa, y se examinan usando el cebador oligonucleotídico marcado radiactivamente con fósforo-32 para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. A continuación se retira la región mutada y se coloca en un vector apropiado para la producción de proteína, generalmente un vector de expresión del tipo típicamente empleado para la transformación de un huésped apropiado.

El procedimiento descrito inmediatamente más arriba podría ser modificado de tal forma que se creara un molécula heterodúplex en donde ambas cadenas del plásmido contuvieran la(s) mutación(es). Las modificaciones son tal y como sigue: Se anilla el oligonucleótido de cadena sencilla con la plantilla de cadena sencilla tal y como se ha descrito más arriba. Se combina un mezcla de tres deoxirribonucleótidos, deoxirriboadenosina (dATP), deoxirriboguanosina (dGTP), y deoxirribotimidina (dTTP), con una tio-deoxirribocitosina denominada dCTP-(aS) (la cual puede obtenerse de Amersham Corporation). Se añade esta mezcla al complejo plantilla-oligonucleótido. A continuación de la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica a la plantilla excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(aS) en vez de dCTP, lo que servirá para protegerla de la digestión con endonucleasas de restricción. Una vez que se ha mordido la cadena plantilla del heterodúplex de cadena doble con un enzima de restricción apropiado, la cadena plantilla puede ser digerida con la nucleasa ExoIII, u otra nucleasa apropiada, una vez sobrepasada la región que contiene el(los) sitio(s) a ser mutados. A continuación se para la reacción para dejar una molécula que, tan sólo parcialmente, es de cadena sencilla. Entonces se forma un ADN homodúplex completo de doble cadena usando la ADN polimerasa en presencia de los cuatro deoxirribonucleótidos trifosfato, ATP, y ADN ligasa. A continuación esta molécula homodúplex puede ser transformada en una célula huésped apropiada tal como E. coli JM101, tal y como se ha descrito más arriba.

Podría generarse ADN codificando mutantes en más de un sitio de PF4AR de una de diversas formas. Si los aminoácidos están localizados juntos en la cadena polipeptídica, podrían ser mutados simultáneamente usando un oligonucleótido que codificara la totalidad de sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están localizados a cierta distancia los unos de los otros (separadas por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique la totalidad de cambios deseados. En lugar de éste, podrían emplearse uno o dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido para cada aminoácidos a sustituir. A continuación se anillan simultáneamente los oligonucleótidos a una plantilla de ADN de cadena sencilla, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir de la plantilla codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas.

El procedimiento alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como la descrita para los mutantes sencillos: se usa ADN de tipo salvaje para la plantilla, se anilla a esta plantilla un oligonucleótido codificando la(s) primera(s) sustitución(es) de aminoácidos deseada(s), y a continuación se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza como plantilla el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis. Por tanto, esta plantilla ya contiene una o más mutaciones. Entonces, el oligonucleótido codificando la(s) sustitución(es) de aminoácidos adicional(es) deseada(s) se anilla a esta plantilla, y la cadena de ADN resultante codifica ahora mutaciones procedentes de ambas, la primera y segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante puede ser usado como plantilla en una tercera ronda de mutaciones, y así sucesivamente.

La mutagénesis mediante PCR también es apropiada para construir variantes de aminoácidos del PF4AR. Mientras que la siguiente discusión se refiere al ADN, se entiende que la técnica también encuentra aplicación con el ARN. La técnica PCR generalmente se refiere al siguiente procedimiento (ver Erlich, más arriba, el capítulo por R. Higuchi, pp. 61-70): Cuando pequeñas cantidades de ADN plantilla se usan como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente de la región correspondiente en el ADN plantilla pueden usarse para generar una cantidad relativamente elevada de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia plantilla sólo en las posiciones en que los cebadores difieren de la plantilla. Para introducir una mutación en un ADN plasmídico, se diseña uno de los cebadores para que solape la posición de la mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a una porción de la cadena opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede estar ubicada en cualquier lugar a lo largo del ADN plasmídico. No obstante, se prefiere que la secuencia del segundo cebador esté ubicada dentro de los 200 nucleótidos a partir de la ubicación del primero, de forma que, al final, toda la región de ADN amplificada limitada por los cebadores puede ser fácilmente secuenciada. La amplificación por PCR usando un par de cebadores como el que se ha descrito resulta en una población de fragmentos de ADN que difiere en la posición de la mutación especificada por el cebador y, posiblemente, en otras posiciones, ya que la copia de la plantilla tiene cierta tendencia a los errores.

Si el cociente de plantilla y material de producto es extremadamente bajo, la mayor parte de los fragmentos de ADN producto incorporan la(s) mutación(nes) deseadas. Este material de producto se usa para remplazar la región correspondiente en el plásmido que sirvió como plantilla de la PCR usando tecnología de ADN estándar. Las mutaciones en posiciones separadas pueden introducirse simultáneamente bien usando un segundo cebador mutante, o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes diferentes, y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes simultáneamente al fragmento vector en una ligación a tres (o más) bandas.

Otro procedimiento para preparar variantes, mutagénesis de "cassettes", se basa en la técnica descrita por Wells et al. (Gene 34: 315 (1985)).

C. Inserción del ADN en vehículos de clonación

El cADN o ADN genómico que codifica PF4AR nativo o una variante se inserta en un vector replicable para posterior clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Hay muchos vectores disponibles y la selección del vector apropiado dependerá de (1) si se ha de usar para amplificación del ADN o para expresión del ADN, (2) el tamaño del ADN a insertar en el vector, y (3) la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped para la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más elementos de los siguientes: una secuencia de señalización, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de finalización de la transcripción.

(i) Componente secuencia de señalización

En general, una secuencia de señalización podría ser un componente del vector, o podría ser parte del ADN del PF4AR que se inserta dentro del vector. El ADN del pro-PF4AR está dirigido hacía la superficie de la célula en nuestras células recombinantes, pero no contiene una señal convencional y ningún polipéptido N-terminal es roto durante el procesamiento post-traducción del polipéptido durante la inserción en membrana del PF4AR.

(ii) Componente origen de replicación

Ambos, los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayor parte de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente el componente origen de replicación no es necesario para la expresión de vectores de mamíferos (el origen del SV40 podría usarse típicamente tan sólo porque contiene el promotor temprano).

La mayor parte de los vectores de expresión son vectores "lanzadera" (shuttle), es decir, son capaces de replicarse en al menos una clase de organismo, pero pueden ser transfectados dentro de otros organismos para su expresión. Por ejemplo, un vector es clonado en E. coli y, a continuación, el mismo vector es transfectado dentro de una levadura o célula de mamífero para su expresión, aunque no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN también podría amplificarse mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se consigue fácilmente usando especies Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia que se encuentra en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector resulta en una recombinación homóloga con el genoma, y la inserción del ADN del PF4AR. No obstante, la recuperación de ADN genómico que codifique el PF4AR es mucho más compleja que la de un vector replicando de forma exógena, porque se precisa de la digestión con enzimas de restricción para extirpar el ADN del PF4AR.

(iii) Componente gen de selección

Los vectores de expresión y clonación deberían contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas por el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de la célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia a la droga y, por tanto, sobreviven el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina (Southern et al. J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al. Science 209: 1422 (1980)), o higromicina (Sudgen et al. Mol. Cell. Biol. 5: 410 (1985)). Los tres ejemplos dados más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para conferir resistencia frente a la droga apropiada G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes que ingieren el ácido nucleico del PF4AR, tales como la reductasa de hidrofolato (DHFR) o la quinasa de timidina. Las células de mamífero transformantes se someten a presión de selección, a la cual tan sólo los transformantes están únicamente adaptados a sobrevivir, gracias a haber ingerido el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio es cambiada sucesivamente, conduciendo por tanto a la amplificación de ambos, el gen de selección y el ADN que codifica el PF4AR. La amplificación es el proceso por el cual los genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son reiterados en tándem en los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. A partir del ADN amplificado se sintetizan cantidades incrementadas del PF4AR.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando la totalidad de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competidor del DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal y como describen Urlaub y Chasm Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4126 (1980). A continuación, se exponen las células transformadas a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR, y, de forma concomitante, múltiples copias de otro ADN que incluye los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica el PF4AR. Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier huésped apropiado, por ejemplo ATCC CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógena si, por ejemplo, se emplea un gen DHFR que sea muy resistente al Mtx (EP 117.600). Alternativamente, pueden seleccionarse células huésped (en particular huéspedes de tipo salvaje que contengan DHFR endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el PF4AR, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como la fosfotransferasa 3' de aminoglicósido (APH), mediante cultivo celular en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver patente EE.UU.-4.965.199.

Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levaduras (Stinchcomb et al. Nature 282: 39 (1979); Kingsman et al. Gene 7: 141 (1979); o Tschemper et al. Gene 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en ausencia de triptófano, por ejemplo, ATCC 44.076 o PEP4-1 (Jones Genetics 85: 12 (1977)). Por tanto, la presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona un entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De la misma forma, las cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20.622 y 38.626) se complementan mediante plásmidos portadores del gen Leu2 conocidos.

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped, y que está operativamente unido al ácido nucleico del PF4AR. Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') respecto el codón inicial de un gen estructural (generalmente entre aproximadamente 100 hasta 1000 p.b.) que controla la transcripción y traducción de una particular secuencia de ácido nucleico, tal como la del PF4AR, a la cual están operativamente unidos. Tales promotores típicamente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles incrementados de transcripción, a partir del ADN que está bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento son bien conocidos un elevado número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Estos promotores están operativamente unidos a ADN que codifica el PF4AR mediante supresión del promotor del ADN fuente, mediante digestión con enzimas de restricción, e inserción de una secuencia de promotor aislada en el vector. Ambas, la secuencia promotora nativa del PF4AR y muchos promotores heterólogos podrían usarse para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN del PF4AR. No obstante, se prefieren los promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de PF4AR expresado en comparación con el promotor del PF4AR nativo.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y lactosa (Chang et al. Nature 275: 615 (1978); y Goeddel et al. Nature 281: 544 (1979)), de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al. Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980) y EP-36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (de Boer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)). No obstante, son apropiados otros conocidos promotores bacterianos. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas, permitiendo por tanto a un trabajador diestro unirlos de forma operativa al ADN codificando el PF4AR (Siebenlist et al. Cell 20: 269 (1980)) usando eslabones o adaptadores para suplir cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente contendrán también una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el PF4AR.

Las secuencias de promoción apropiadas para su uso con levaduras huésped incluyen los promotores para la quinasa de 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al. J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) u otros enzimas glucolíticos (Hess et al. J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); y Holland Biochemistry 17: 4900 (1978)) tales como la enolasa, la deshidrogenasa de 3-fosfato-gliceraldehído, la hexoquinasa, la decarboxilasa de piruvato, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de glucosa-6-fosfato, la isomerasa de triosafosfato, la isomerasa de fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la deshidrogenasa 2 de alcohol, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradadores asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en expresión en levaduras están descritos en más detalle en Hitzeman et al. EP-73.657A. Los potenciadores de levaduras también se usan de forma ventajosa con los promotores de levaduras.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba a partir del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases cadena arriba a partir del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT, donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias son convenientemente insertadas en vectores de expresión en mamíferos.

La transcripción del PF4AR a partir de vectores en células de mamíferos es controlada mediante promotores obtenidos del genoma de virus tales como el virus polioma, virus de la viruela de las gallinas (UK-2.211.504, publicada el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tales como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma de aves, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, y, más preferiblemente, del virus 40 de mono (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de las actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, y a partir del promotor normalmente asociado con la secuencia del PF4AR, supuesto que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen de replicación viral del SV40, Fiers et al. Nature 273: 113 (1978); Mulligan y Berg Science 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402 (1981). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restricción HindIII E, Greenaway et al. Gene 18: 355-360 (1982). En la patente EE.UU.-4.419.446 se descubre un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus de papiloma bovino como un vector. Una modificación de este sistema se describe en EE.UU.-4.601.978. Ver también Gray et al. Nature 295: 503-508 (1982) sobre la expresión de cADN codificando interferón inmune en células de mono, Reyes et al. Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresión de cADN de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control del promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple, Canaani y Berg Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo, y Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células CV-1 de riñón de mono, fibroblastos de embrión de pollo. Células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón usando el largo segmento terminal repetido del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(v) Elemento componente del promotor

La transcripción de un ADN que codifica el PF4AR de esta invención mediante eucariotas superiores a menudo aumenta mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN actuando en cis, usualmente de aproximadamente 10-300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición, habiéndose encontrado 5' (Laimins et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 993 (1981)) y 3' (Lusky et al. Mol. Cell. Biol. 3: 1108 (1983)) con respecto la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al. Cell 33: 729 (1983)) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al. Mol. Cell. Biol. 4: 1293 (1984)). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamífero (globina, elastasa, \alpha-fetoproteína e insulina). No obstante, típicamente uno usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en la parte final del origen de la replicación (p.b. 100-270), el potenciador del citomegalovirus del promotor temprano, el potenciador del polioma sobre la parte final del origen de la replicación, y potenciadores de adenovirus. Ver también, Yaniv Nature 297: 17-18 (1982) sobre la potenciación de elementos para la activación de los promotores eucarióticos. El potenciador puede ser insertado en el vector en la posición 5' o 3' con respecto al ADN del PF4AR, pero estará preferiblemente ubicado en un sitio 5' a partir del promotor.

(vi) Componente terminador de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, de insectos, de plantas, de animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mARN. Tales secuencias son comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADNs o cADNs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el PF4AR. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción.

Se construyen vectores apropiados, que contengan uno o más de los componentes antes listados y las secuencias codificantes y de control deseadas, mediante técnicas de ligadura estándar. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se cortan, ajustan, y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios.

Para los análisis para confirmar secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446), y se seleccionan transformantes exitosos mediante resistencia a la ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o secuencian mediante el procedimiento de Messinger et al. Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al. Methods in Enzymology 65: 499 (1980).

Son particularmente útiles en la práctica de esta invención los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifican el PF4AR. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que sea capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, incluyendo un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la cómoda identificación positiva de polipéptidos codificados por los ADNs clonados, así como la verificación rápida de tales polipéptidos en busca de propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para los propósitos de identificar análogos y variantes del PF4AR que tienen una actividad parecida a la del PF4AR.

Otros procedimientos, vectores, y células huésped apropiados para la adaptación a la síntesis del PF4AR en cultivos de células recombinantes de vertebrados se describen en Gething et al. Nature 293: 620-625 (1981); Mantei et al. Nature 281: 40-46 (1979); Levinson et al. EP-117.060; y EP-117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del PF4AR en cultivos celulares de mamíferos es el pRK5 (EP-307.247).

D. Selección y transformación de células huésped

Son células huésped apropiadas para clonar y expresar los vectores aquí mencionados las células procariotas, levaduras, o eucariotas superiores, descritas más arriba. Las procariotas apropiadas incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, bacilos tales como B. subtilis, especies de pseudomonas tales como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, o Serratia marcescens. Un huésped E. coli de clonación preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son apropiadas. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitativos. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Alternativamente, los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasas de ácidos nucleicos, son apropiados.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes apropiados para vectores que contengan el ADN del PF4AR. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es el más comúnmente usado de entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. No obstante, un cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles aquí, tales como S. pombe (Beach y Nurse Nature 290: 140 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al. J. Bacteriol. 737: (1983)), yarrowia (EP-402.226), Pichia pastoris (EP-183.070), Trichoderma reesia (EP-244.234), Neurospora crassa (Case et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5259-5263 (1979)), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289 (1983); Tilburn et al. Gene 26: 205-221 (1983); Yelton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes EMBO J. 4: 475-479 (1985)).

Las células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos del PF4AR se derivan de organismos multicelulares. Tales células huésped son capaces de actividades de procesamiento y glucosilación complejas. En principio, cualquier cultivo celular de eucariotas superiores es manipulable, sea un cultivo de vertebrado o de invertebrado. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes, y su correspondiente célula huésped de insectos permisivos procedentes de huéspedes tales como células huésped de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Droso- phila melanogaster (mosca del vinagre), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al. Bio/Technology 6: 47-55 (1988); Miller et al. en Genetic Engineering, Setlow J.K. et al. 8: 277-279 (Plenum Publishing, 1986), y Maedaet et al. Nature 315: 592-594 (1985). Una diversidad de tales cepas virales están disponibles libremente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como los virus aquí mencionados según la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Pueden usarse como huéspedes células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual ha sido previamente manipulada para contener el ADN del PF4AR. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, se transfiere el ADN que codifica el PF4AR a la célula vegetal huésped, de forma que ésta es transfectada y, bajo condiciones apropiadas, expresará el ADN del PF4AR. Además, hay disponibles secuencias reguladoras y señalizadoras compatibles con células vegetales, tales como la secuencia del promotor de la nopalina sintetasa y de la señal de poliadenilación. Depicker et al. J. Mol. Anol. Gen. 1: 561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen T-ADN 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables de plantas en tejidos vegetales que contienen ADN recombinante. Ver EP-321.196, publicada el 21 de Junio de 1989.

No obstante, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha pasado a ser un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson editores (1973)). Son ejemplo de líneas celulares huésped de mamífero útiles la línea celular de riñón de mono CV1 transformadas por el SV40 (COS-7, ATCC CRL-1651); la línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento en suspensión en cultivo, Graham et al. J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL-10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de ratón sertoli (TM4, Mather Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL-70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células humanas de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL-2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL-75); células de hígado humanas (Hep G2, HB-8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL-51); células TRI (Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MAC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferidas son las células 293 de riñón de embrión humano, y las de ovario de hámster chino.

Las células huésped se transfectan y se transforman preferiblemente con los vectores de expresión y clonación de esta invención descritos más arriba, y se cultivan en medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la toma de un vector de expresión por parte de una célula huésped, sin que importe si realmente se expresan secuencias codificadoras. Numerosos procedimientos para transfectar son conocidos por parte del técnico ordinariamente experto, por ejemplo, CaPO_4 y electroporación. La transfección satisfactoria se reconoce generalmente cuando ocurre cualquier indicación de la operación de este vector en el interior de la célula huésped.

Transformación quiere decir introducir ADN en un organismo de forma que el ADN sea replicable, sea como un elemento extracromosómico o mediante integración en el cromosoma. Dependiendo de la célula huésped, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio, empleando cloruro cálcico tal y como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., ver más arriba, se usa generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en forma de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa en la transformación de ciertas células vegetales, tal y como se describe en Shaw et al. Gene 23: 315 (1983) y WO-89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al., ver más arriba. Los aspectos generales de la transformación de un sistema huésped de células de mamífero han sido descritos por Axel en la patente EE.UU.-4.399.216, concedida el 16 de Agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen et al. J. Bact. 130: 946 (1977) y Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3829 (1979). No obstante, también podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN dentro de células tales como la inyección nuclear, electroporación, o mediante fusión de
protoplastos.

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E. Cultivo de las células huésped

Las células procariotas usadas para producir el polipéptido PF4AR de esta invención se cultivan en medio apropiado tal y como se describe de forma general en Sambrook et al., ver más arriba.

Las células huésped de mamífero usadas para producir el PF4AR de esta invención podrían cultivarse en una diversidad de medios. Son apropiados para cultivar las células huésped los medios comercialmente disponibles tales como el F10 de Ham (Sigma), el Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma). Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enzymol. 58: 44 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102: 255 (1980); EE.UU.-4.767.74, 4.657.866, 4.927.762, o 4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; o la patente registrada EE.UU.-30.985, podría usarse como medio de cultivo de las células huésped. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según se precisara con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, cálcico, magnésico, y fosfatos), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también podría incluirse en las concentraciones apropiadas, que serán conocidas por aquellos especialistas en el tema. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las anteriormente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes a un especialista común.

Las células huésped mencionadas en este descubrimiento incluyen células en cultivo in vitro así como células que están en el interior de un huésped animal.

Además, también se prevé que el PF4AR de esta invención pudiera producirse mediante recombinación homóloga, o con procedimientos de recombinación homóloga utilizando elementos de control introducidos en células que ya contienen el ADN que codifica el PF4AR. Por ejemplo, un potente elemento promotor/potenciador, un supresor, o un elemento exógeno modulador de la transcripción se inserta en el genoma de la célula huésped prevista con la proximidad y orientación suficientes para influenciar la transcripción del ADN que codifica el PF4AR deseado. El elemento de control no codifica el PF4AR de esta invención, pero el ADN está presente en el genoma de la célula huésped. A continuación, uno busca las células que fabrican el PF4AR de esta invención, o niveles de expresión incrementados o disminuidos, según se desee.

F. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión podrían medirse directamente en la muestra, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mARN (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205 (1980)), transferencia localizada (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiada, basada en las secuencias aquí proporcionadas. Podrían emplearse diversas marcas, más comúnmente radioisótopos, en particular ^{32}P. No obstante, también podrían emplearse otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para introducirlos en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como el sitio de unión a avidina o anticuerpos, los cuales podrían estar marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como núcleos radiactivos, fluoróforos, enzimas, o similares. Alternativamente, podrían emplearse anticuerpos que puedan reconocer parejas específicos, incluyendo parejas de ADN, parejas de ARN, parejas mixtas ADN-ARX, o parejas ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos podrían estar marcados y el ensayo podría llevarse a cabo allí donde la pareja está unida a la superficie, de forma que, a partir de la formación de la pareja sobre la superficie, podría detectarse la presencia del anticuerpo unido a la pareja.

Alternativamente, la expresión de genes podría medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Con técnicas de tinción inmunohistoquímica se prepara una muestra de células, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguida por reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto del gen acoplado, en donde las marcas son de forma habitual visualmente detectables, tales como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes, y similares. Una técnica particularmente sensible apropiada para su uso en la presente invención es descrita por Hsu et al. Am. J. Clin. Path. 75: 734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluidos podrían ser monoclonales o policlonales, y podrían prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos podrían prepararse contra un polipéptido de PF4AR nativo, o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN aquí proporcionadas, tal y como se describe con más detalle en la Sección 4 más adelante.

G. Purificación del polipéptido PF4AR

El PF4AR se recupera a partir del cultivo de células solubilizando la membrana celular en detergente.

Cuando un PF4AR humano se expresa en una célula recombinante distinta de una de origen humano, el PF4AR está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. No obstante, es necesario purificar el PF4AR de proteínas o polipéptidos de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas por lo que respecta al PF4AR. Como primer paso se centrifugan las células para separarlas del medio de cultivo. A continuación se separan la membrana y fracciones proteicas solubles. El PF4AR podría entonces purificarse a partir de la fracción de membranas del lisado del cultivo mediante solubilización con detergentes seguida por procedimientos de purificación apropiados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía con sílice o con una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; resinas de afinidad hidrofóbica y de afinidad por ligando usando el PF4A apropiado inmovilizado sobre una matriz.

Las variantes del PF4AR en las que se han suprimido, insertado o sustituido residuos se recuperan de la misma forma que el PF4AR nativo, tomando nota de cualesquiera cambios sustanciales en las propiedades ocasionados por las variantes. Por ejemplo, la preparación de una fusión de PF4AR con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, una antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación; podría usarse una columna de inmunoafinidad que contuviera anticuerpo contra el antígeno para adsorber la fusión. Pueden emplearse columnas de inmunoafinidad, tales como una columna de anti-PF4AR policlonal de conejo, para adsorber la variante de PF4AR uniéndola al menos por un epítopo inmune que quedara. También podría ser útil un inhibidor de proteasas como el fluoruro de fenilmetil sulfonato (PMSF) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y podrían incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Un especialista en la técnica apreciará que los procedimientos de purificación apropiados para el PF4AR nativo podrían precisar de modificación, para tomar en cuenta los cambios en el carácter del PF4AR o sus variantes a continuación de su expresión en cultivos celulares recombinantes.

H. Modificaciones covalentes de los polipéptidos PF4AR

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos del PF4AR se incluyen en el ámbito de esta invención. Ambos, el PF4AR nativo y las variantes de la secuencia de aminoácidos del PF4AR podrían ser modificadas covalentemente. Las modificaciones covalentes del PF4AR, de fragmentos del mismo, o de anticuerpos contra el mismo, se introducen en la molécula mediante la reacción de los residuos aminoácidos diana del PF4AR, de fragmentos del mismo, o de anticuerpo contra el PF4AR con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o contra los residuos N- o C-terminales. Más comúnmente, el PF4AR y sus anticuerpos se unen de forma covalente a grupos detectables usados en el diagnóstico, por ejemplo, enzimas, radioisótopos, marcadores de espín, antígenos, grupos fluorescentes o quimioluminiscentes, y similares.

De forma habitual, los residuos de cisteína se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y sus aminas correspondientes), tales como el cloroacético o la cloroacetamida, para producir derivados carboximetil o carboxiamidometil. Los residuos de cisteína también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidazolio)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfato, metil 2-piridil disulfato, p-cloromercuriobenzoato, 2-cloromercurio-4-nitrofeno, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.

Los residuos histidina se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de la histidina. También es útil el para-bromofenacilo, la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos de lisina y amino terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisina. Otros agentes apropiados para la derivatización de residuos que contienen \alpha-aminos incluyen los imidioésteres tales como el metilpicolinimidato; el piridoxal fosfato; el piridoxal; el cloroborohidruro; el ácido trinitrobencenosulfónico: O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacciones con glioxilato catalizadas por transaminasa.

Los residuos de arginina se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos el fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina precisa que la reacción se realice en condiciones alcalinas a causa del elevado pKa del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos podrían reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo epsilon amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosina podría hacerse con especial interés en introducir marcadores espectrales en los grupos tirosil, mediante reacción con compuestos aromáticos diazo o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan N-acetilimidazolio y tetranitrometano para formar especies O-acetiltirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodan usando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayos, siendo apropiado el procedimiento de la cloramina T descrito más arriba.

Los grupos laterales carboxílicos (aspartato y glutamato) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), donde R y R' son grupos alquilo, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil)carbodiimida. Más aún, los residuos aspartil y glutamil se convierten a residuos asparaginil y glutaminil mediante reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para unir de forma cruzada el PF4AR, sus fragmentos o anticuerpos, a un soporte matriz insoluble o superficie para usarlo en procedimientos de purificación de anticuerpos anti-PF4AR, y viceversa. El PF4AR inmovilizado también es útil en el examen de los miembros de la superfamilia PF4 a los cuales se une el receptor. Los agentes para reacción cruzada comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano; glutaraldehído, N-hidroxisuccinimida; ésteres, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo disuccinimidilésteres tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como la bis-N-maleimido-1,8-octano.Los agentes de derivatización tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, se emplean para inmovilizar proteínas matrices reactivas insolubles en agua, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en EE.UU.-3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.

Los residuos glutaminil y asparaginil son frecuentemente deamidados respectivamente a los correspondientes residuos glutamil y asparagil. Alternativamente, estos residuos son deamidados bajo condiciones levemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del ámbito de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos seril o treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido 8-beta, incluido en el ámbito de esta invención, incluye la alteración del patrón de glucosilación nativo del polipéptido. Por alteración se entiende la supresión de una o más de las porciones carbohidrato que se encuentran en el receptor nativo, y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no estan presentes en el receptor nativo.

La glucosilación de polipéptidos está típicamente unida a N o a O. Unida a N se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un potencial sitio de glucosilación. La glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también podrían usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Como se ha destacado más arriba, el receptor de la IL-8 contiene 6 sitios de glucosilación putativos unidos a N.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido PF4AR se consigue de forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las antes descritas secuencias tripeptídicas (para sitios de glucosilación unida a N). La alteración también podría hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia de PF4AR nativo (para sitios de glucosilación unidos a O). Por simplicidad, la secuencia de aminoácidos del PF4AR se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, en particular mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido PF4AR en bases preseleccionadas, de tal forma que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La(s) mutación(es) del ADN se harán usando procedimientos descritos más arriba bajo la cabecera de "Variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PF4AR".

Otras formas de incrementar el número de porciones carbohidrato sobre el polipéptido PF4AR es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajoso en que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tenga capacidades de glucosilación para glucosilaciones unidas a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) podría(n) ser unidos a (a) arginina o histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfuro libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en WO-87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem. Pp.259-306 (1981)).

La supresión de porciones carbohidrato presentes en el polipéptido PF4AR nativo podría conseguirse química o enzimáticamente. La desglucosilación química precisa de la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la rotura de la mayor parte de los azúcares excepto el azúcar unidor (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglucosilación química está descrita por Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)) y por Edge et al. (Anal. Biochem. 118: 131 (1981)). La rotura enzimática de las porciones carbohidrato sobre polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglicosidasas, tal y como está descrito por Thotakura et al. (Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)).

La glucosilación en sitios de glucosilación potenciales puede prevenirse mediante el uso del compuesto tunicamicina tal y como describe Duskin et al. (J. Biol. Chem. 257: 3105 (1982)). La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glicósido.

El PF4AR también podría atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o cápsulas de gelaxina y microcápsulas de poli (metilmetacilato), respectivamente), en sistemas coloidales de liberación de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en microemulsiones. Tales técnicas se descubren en Remington's Pharmaceutical Sciencies, 16ª edición, A. Osol Editor, (1980).

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Las preparaciones de PF4AR también son útiles en la generación de anticuerpos, para su uso como estándares en ensayos del PF4AR (por ejemplo, mediante marcaje del PF4AR para su uso como estándar en un radioinmunoensayo, en inmunoensayos unidos a enzima, o ensayos con radiorreceptores), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de tipo competitivo de unión a receptor cuando está marcado con iodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de espín, y similares.

Como es a menudo difícil predecir por adelantado las características de una variante del PF4AR, se apreciará que es necesario cierto examen de las variantes recuperadas para seleccionar la variante óptima. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la molécula del PF4AR, tal como la afinidad por un determinado anticuerpo, se mide mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. La variante se ensaya en busca de cambios en la supresión o potenciación de su activación por comparación con la actividad observada para el PF4AR nativo en el mismo ensayo. Otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o polipéptido tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros, se ensayan mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

3. Composiciones terapéuticas y administración del PF4AR

Las formulaciones terapéuticas del PF4AR (incluyendo sus fragmentos de PF4AR unidores) o anticuerpos contra el mismo se preparan para su almacenamiento mezclando PF4AR que tenga el grado de pureza deseado con portadores, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales, (Remington's Pharmaceutical Sciences, ver más arriba), en forma de pastel liofilizado o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como la albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos tales como el Tween, el Pluronics o el polietilenglicol (PEG).

El PF4AR o anticuerpo a ser usado para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o a continuación de la liofilización y reconstitución. El PF4AR ordinariamente se almacenará en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas del PF4AR o anticuerpo generalmente se colocan en un contenedor que tiene una vía de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede pincharse con una aguja hipodérmica.

La ruta para la administración del PF4AR o anticuerpo está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante ruta intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, o intralesión, o mediante sistemas de liberación continuada tal y como se menciona más abajo.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación continuada incluyen las matrices semipermeables de polímeros en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación continuada incluyen los poliésteres, hidrogeles, poliactidos (EE.UU.-3.773.919, EP-58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al. Biopolymers 22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al. J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) y Langer Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)), etilenvinil acetato (Langer et al., ver más arriba) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP-133.988). La liberación continuada de composiciones de PF4AR o anticuerpos también incluye el PF4AR o anticuerpo atrapado lipososomalmente. Los liposomas que contienen PF4AR o anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE-3.218.121; Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142.641; solicitud de patente japonesa 83-118.008; EE.UU. 4.485.045 y 4.544.545; y EP-102.324. Ordinariamente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los cuales el contenido de lípido es superior a aproximadamente 30 mol. % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con PF4AR o anticuerpo.

Una cantidad efectiva de PF4AR o anticuerpo a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta valorar la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará el PF4AR o anticuerpo hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia puede seguirse fácilmente mediante ensayos convencionales.

4. Preparación de anticuerpos contra el PF4AR

Los anticuerpos policlonales contra el PF4AR se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del PF4AR o de un adyuvante. La inmunización con células recombinantes transformadas con el PF4AR (por ejemplo, células de ratón y CHO transformadas con huPF4AR) podría ser satisfactoria, o podría ser útil para separar el PF4AR y conjugarlo, o un fragmentos conteniendo la secuencia diana de aminoácidos, a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa de ojo de cerradura (keyhole limpet), la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja, usando un agente que deriva o bifuncional, por ejemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_2, o R1N=C=NR, donde R y R' son grupos alquilo diferentes.

Ordinariamente, los animales se inmunizan contra las células, o conjugados o derivados inmunogénicos mediante la combinación de 1 mg o 1 \mug de PF4AR de adyuvante de Freund completo, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, se intensifican los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante de Freund completo mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el suero para valorar el anti-PF4AR. Los animales se intensifican hasta que la valoración se estabiliza. Preferiblemente, el animal se intensifica con el conjugado del mismo PF4AR, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un agente de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden fabricarse en cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También, se usan los agentes de agregación tales como el alum para potenciar la respuesta inmune.

Otra opción es emplear bibliotecas combinatorias de dominios variables, y métodos de búsqueda para identificar los anticuerpos anti-PF4AR deseados.

Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando células del bazo procedentes de animales inmunizados, e inmortalizando las células de la forma convencional, por ejemplo, mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con el virus Epstein-Barr (EB-virus) y búsqueda de los clones que expresan el anticuerpo deseado.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es específico para cada polipéptido diana del PF4AR, y no reaccionará de forma cruzada con el receptor de conejo del fMLP [5], receptor humano del fMLP, receptor humano del C5a, el receptor de baja afinidad de la IL-8, u otros miembros de la familia PF4AR. Los anticuerpos específicos para el receptor de las Figuras 2, 4 ó 5 son los preferidos. El anticuerpo se selecciona para ser agonista, antagonista, o para no tener efecto sobre la actividad de un miembro de la superfamilia PF4 en la unión o activación del receptor.

Murphy et al. (ver más arriba) describen un receptor que tiene un elevado grado de homología con el receptor de la Figura 2. Murphy et al. caracterizaron su receptor en oocitos recombinantes como un receptor con "baja afinidad" por la IL-8, y que tenía una pequeña capacidad de unión del MGSA, sugiriendo, por tanto, que juega un papel menor en la actividad biológica in vivo de la IL-8 y del MGSA. No obstante, nuestros estudios han mostrado que el receptor de Murphy et al. exhibe una afinidad por la IL-8 tanto o más elevada que el receptor de la Figura 2, y que también muestra una elevada afinidad (aproximadamente 1-10 nM) por el MGSA. Por tanto, el antagonismo de la respuesta de la IL-8 y/o el MGSA de la células linfoides muy probablemente requerirá que ambos receptores estén inhibidos o bloqueados. Por ejemplo, uno debería seleccionar un anticuerpo antagonista de la IL-8 que se una a un epítopo del receptor de la Figura 2 que es compartido con el receptor de Murphy et al. Esto podría conseguirse fácilmente mediante procedimientos de búsqueda rutinarios. Por ejemplo, los anticuerpos candidatos pueden ensayarse por su capacidad para competir contra la IL-8 marcada por la unión a células que tienen el receptor de la Figura 2, y entonces realizar el mismo estudio con células portadoras del receptor de Murphy et al. Entonces se seleccionan los anticuerpos que inhiben la activación o unión a ambas células como candidatos terapéuticos. Por otra parte, los anticuerpos que pueden discriminar entre los receptores de la Figura 2 y de Murphy et al., y que se unen tan sólo a uno u otro, son útiles
en la diagnosis. El receptor de la Figura 2 une el MGSA pobremente, en contraste con el receptor de Murphy et al.

5. Usos del PF4AR, su ácido nucleico y sus anticuerpos

El ácido nucleico que codifica el PF4AR podría usarse como un diagnóstico para tipificar específicamente tejidos. Por ejemplo, procedimientos tales como la hibridación in situ, la transferencia northern y Southern, y el análisis mediante PCR podrían usarse para determinar si el ADN y/o ARN codificando el PF4AR están presentes en el/los tipo(s)
celular(es) que se está(n) evaluando. Estos receptores típicamente son diagnóstico de células PBL o monocíticas.

Podrían usarse polipéptidos del PF4AR aislados en ensayos diagnóstico cuantitativos como estándar o control contra el cual podrían compararse muestras, por ejemplo, células PBL o monocíticas conteniendo cantidades desconocidas de PF4AR. Las células recombinantes que expresan el receptor de la IL-8 podrían usarse en ensayos para ligandos del PF4AR de la misma forma que, por ejemplo, se usan los neutrófilos en los ensayos de la IL-8. Los polipéptidos del PF4AR, fragmentos o células (como tales o derivatizados) también pueden usarse como inmunógenos en la producción de anticuerpos contra el PF4AR, para la purificación de tales anticuerpos a partir de ascites o medio de cultivo de células recombinantes, o para su uso como antagonistas competitivos para ligandos de la superfamilia, por ejemplo, la IL-8.

El PF4AR es útil en la búsqueda de secuencias de aminoácidos u otras variantes de miembros de la superfamilia PF4. Por ejemplo, se preparan un banco de variantes candidatas de la secuencia de aminoácidos de la IL-8 mediante mutagénesis dirigida. Éstas se incuban en competencia con la IL-8 nativa marcada por células portadoras del receptor de la IL-8 de la Figura 2, con objeto de identificar variantes agonistas o antagonista de la IL-8. La unión o la activación celular son ensayos de punto final apropiados. Alternativamente, se recupera el receptor en forma libre de células, y se ensaya la unión de la IL-8 y variantes candidatas.

Los anticuerpos contra el PF4AR son útiles en ensayos de diagnóstico para la expresión del PF4AR en células o tejidos específicos, en los que los anticuerpos están marcados de la misma forma que el PF4AR descrito más arriba, y/o están inmovilizados sobre una matriz insoluble. Los anticuerpos contra el PF4AR también son útiles para la purificación mediante afinidad del PF4AR a partir de cultivo de células recombinantes o fuentes naturales. Los anticuerpos contra el PF4AR que no reaccionan de forma cruzada detectablemente con otros PF4ARs pueden usarse para purificar cada PF4AR sin otros receptores homólogos. Los anticuerpos contra el PF4AR que son antagonistas del PF4 son útiles como agentes antiinflamatorios o en el tratamiento de otros desórdenes mediados por la superfamilia PF4.

Los ensayos diagnósticos apropiados para el PF4AR y sus anticuerpos son bien conocidos per se. Tales ensayos incluyen ensayos competitivos y de sandwich, y ensayos de inhibición estérica. Los procedimientos competitivos y de sandwich emplean un paso de separación de fases como parte integral del procedimiento, mientras que los ensayos de inhibición estérica se realizan en una única mezcla de reacción. Fundamentalmente, se usa el mismo procedimiento para el ensayo del PF4AR y de sustancias que se unen al PF4AR, aunque se favorecerán ciertos procedimientos dependiendo del peso molecular de las sustancia que se están analizando. Por tanto, la sustancia a ensayar se refiere aquí como analito, con independencia de su estado, de lo contrario como antígeno o anticuerpo, y las proteínas que unen el analito se denominan parejas de unión, sean anticuerpos, receptores de superficie de células o antígenos.

Todos los procedimientos analíticos para el PF4AR o sus anticuerpos usan uno o más de los siguientes reactivos: análogo marcado del analito, análogo inmovilizado del analito, pareja de unión marcada, pareja de unión inmovilizada, y conjugado estérico. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores".

El marcaje usado (y esto también es útil para marcar el ácido nucleico del PF4AR para su uso como sonda) es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito y su pareja de unión. Se conocen numerosos marcadores para uso en inmunoensayos, los ejemplos incluyen porciones que podrían detectarse directamente, tales como marcadores fluorocromos, quimioluminiscentes y radiactivos, así como porciones tales como enzimas que deben reaccionar o derivatizarse para ser detectados. Los ejemplos de tales marcadores incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C, ^{126}I, ^{3}H y ^{131}I, fluoróforos tales como quelados de tierras raras, o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansil, la umbeliferona, las luciferasas, por ejemplo la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (Pat. EE.UU.-4.737.456), la luciferina, la 2,3-dihidroftalazinedionas, la peroxidasa de rábano silvestre (HRP), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, las oxidasas de azúcares, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, las oxidasa de heterociclos, tales como la uricasa y la xantina oxidasa, acopladas con un enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como la HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.

Hay disponibles procedimientos convencionales para unir covalentemente estos marcadores a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, podrían usarse agentes de acoplamiento tales como los dialdehídos, las carbodiimidas, la dimaleimidas, los bis-imidatos, la benizidina bis-diazotizada, y similares, para marcar anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, y enzimáticos antes descritos. Ver, por ejemplo, Patentes EE.UU.-3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al. Nature 144: 946 (1962); David et al. Biochemistry 13: 1014-1021 (1974); Pain et al. J. Inmunol. Methods 40: 219-230 (1981); y Nygren J. Histochem. Cytochem. 30: 407-412 (1982). Los marcadores aquí preferidos son los enzimas tales como la peroxidasa de rábano silvestre y la fosfatasa alcalina.

La conjugación de tal marcador, incluyendo los enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento estándar de manipulación para cualquiera con habilidad ordinaria en técnicas de inmunoensayo. Ver, por ejemplo, O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyma-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis, vol. 73 (Academic Press, Nueva York, Nueva York, 1981), pp. 147-166. Tales procedimientos de unión son apropiados para su uso con el PF4AR o sus anticuerpos, todos los cuales son proteicos.

La inmovilización de reactivos se requiere en ciertos procedimientos de ensayo. La inmovilización supone la separación de la pareja de unión de cualquier analito que permanezca libre en solución. Esto se consigue convencionalmente, bien insolubilizando la pareja de unión o análogo del analito antes del procedimiento de ensayo, por adsorción a una matriz insoluble en agua o superficie (Bennich et al. EE.UU.-3.720.760) mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento con glutaraldehído), o insolubilizando la pareja o análogo de forma posterior, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.

Otros procedimientos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de sándwich, están bien caracterizados y ampliamente usados en la industria de diagnósticos comerciales.

Los ensayos competitivos se basan en la capacidad de un análogo trazador de competir con el analito de la muestra de ensayo por un limitado número de sitios sobre una pareja de unión común. La pareja de unión generalmente se insolubiliza antes o después de la competición, y entonces se separan el trazador y el analito unidos a la pareja de unión del trazador y el analito no unidos. La separación se consigue mediante decantación (cuando la pareja de unión está inmovilizada) o centrifugación (cuando la pareja de unión fue precipitada después de una reacción competitiva). La cantidad de analito en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido, tal y como se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito, y se comparan con los resultados del ensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando se usan enzimas como marcadores detectables.

Otras especies de ensayos competitivos, denominados ensayos "homogéneos", no requieren una fase de separación. En éstos se prepara un conjugado de un enzima con el analito y se usa de tal forma que, cuando un anti-analito une el analito, la presencia del anti-analito modifica la actividad enzimática. En este caso, el PF4AR o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan con un puente orgánico bifuncional a un enzima tal como la peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para su uso con anti-PF4AR de forma que la unión del anti-PF4AR inhibe o potencia la actividad enzimática del marcador. El procedimiento per se se practica ampliamente bajo el nombre de EMIT.

Los conjugados estéricos se usan en procedimientos de impedimento estérico para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan uniendo covalentemente un hapteno de bajo peso molecular a un analito pequeño, de forma que el anticuerpo contra el hapteno es sustancialmente incapaz de unir el conjugado a la misma velocidad que el anti-analito. En este procedimiento de ensayo, el analito presente en la muestra de ensayo unirá el anti-analito y, por tanto, permitirá al anti-hapteno unirse al conjugado, resultando en un cambio en el carácter del conjugado hapteno, por ejemplo, un cambio en la fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo.

Los ensayos de sandwich son particularmente útiles para la determinación de PF4AR o de anticuerpos contra el PF4AR. En los ensayos de sandwich secuenciales se usa una pareja de unión inmovilizada para adsorber el analito de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo se suprime mediante lavado, se usa el analito unido para adsorber pareja de unión marcada y, a continuación, se separa el material unido del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito en la muestra ensayo. En los ensayos de sandwich "simultáneos" la muestra de ensayo no se separa antes de añadir la pareja de unión marcada. Un ensayo de sandwich secuencial, usando un anticuerpo monoclonal anti-PF4AR como un anticuerpo, y un anticuerpo policlonal anti-PF4AR como el otro, es útil para ensayar muestras en busca de actividad PF4AR.

Los siguientes son meramente ejemplos de ensayos diagnósticos para el PF4AR y anticuerpos. Otros procedimientos desarrollados ahora o a partir de ahora para la determinación de estos analitos están incluidos en éste ámbito, incluyendo los bioensayos descritos más arriba.

Se cree que los polipéptidos detallados en las Figuras 4 y 5 representan receptores para miembros diferentes, y hasta ahora indeterminados, de la superfamilia PF4 (la cual incluye ambas, las subfamilias C-C y CXC). Como el receptor de la IL-8 de la Figura 8, son miembros de la superfamilia acoplada a la proteína G, y tienen una mayor similitud con el receptor de la IL-8 que con otros receptores. En experimentos preliminares, las células recombinantes portadoras de estos receptores no responden a Rantes, MCP1, IL-8 o MGSA, aunque, en último extremo podría mostrarse que se unen a otros miembros de la superfamilia PF4 o a ligandos actualmente desconocidos. No obstante, tanto si los polipéptidos de las Figuras 4 ó 5 se unen a miembros de la superfamilia PF4 como si no, los polipéptidos son útiles en la preparación de anticuerpos para uso diagnóstico en la determinación de la distribución en tejidos de los receptores y, por tanto, como diagnóstico inmunohistoquímico para tales tejidos, en particular como un diagnóstico para células monocíticas o PBL, ya que se sabe que tales células expresan los receptores de las Figuras 4 y 5. Por supuesto, una vez que se hayan identificado los miembros de la superfamilia PF4 que se unen a esos receptores, los receptores podrán usarse para diagnosticar la presencia de los miembros identificados, o en su purificación en procedimientos de afinidad específica. El ADN de las Figuras 4 y 5 también es útil en diagnósticos para la presencia de ADN o ARN que codifique el receptor de la IL-8 cuando se emplean condiciones de baja exigencia.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustrativos y en modo alguno como limitativos.

Ejemplo 1

Para obtener el clon pRK5B.il8r1.1, se construyó una biblioteca de cADN [16] de 1.000.000 de clones, a partir de mARN [17] procedente de neutrófilos humanos, en un vector pRK5B usando eslabones bstXl. Els cADN se produce en forma embotada. Los eslabones Hemi-quinasa bstXl se unen al cADN, y los eslabones se unen en el vector pRK5B, que ha sido digerido con bstXI, tratado con fosfatasas, y el fragmento de vector más largo es aislado. El PRK5B es un derivado del PRK5 [18] que contiene un promotor de citomegalovirus seguido por un intrón 5', sitio de clonación bstXI, y una señal temprana de poliadenilación de SV40, aunque se entenderá que cualquier vector de expresión en células de mamífero sería satisfactorio. Se transfectaron cada uno de los 58 lotes de 2.500 clones en células COS-7 mediante electroporación [19] de 20 \mug de ADN en 3.750.000 células. Después de 2 días de crecimiento en placas de 150 mm en medio (50:50 F12 de Ham:DMEM) que contenía un 10% de suero fetal bovino, se realizó una unión de ^{125}I-IL-B. Se marcó una IL-8 de 72 aminoácidos fabricado en E. coli [20] mediante el procedimiento de la lactoperoxidasa [21] hasta aproximadamente 1.100 Ci/mmol y se pudo unir en al menos el 85%. Se lavaron las placas dos veces con solución salina tamponada con fosfato, y se realizó la unión con 8 ml de medio de cultivo conteniendo 2.5% de suero fetal bovino y aproximadamente 0,5 nM de ^{125}I-IL-8 por placa. Después de 2 horas a 37ºC, se aclararon las placas tres veces con solución salina tamponada con fosfato, se cortaron los fondos [22], y se autoradiografiaron. Cada lote de 2.500 clones de cADN positivo fue subsiguientemente repartido en lotes de 800 clones, y cada uno de estos fue transfectado y ensayado. A su vez, cada lote positivo fue subdividido a través de lotes de 185, 30 y, finalmente, de un único clon, hasta que se identificaron clones positivos únicos, para obtener el clon aislado puro. Ya que tan sólo se usó una porción de cada lote para la transfección, fue innecesario rescatar los clones a partir de los transformantes.

La competición de unión se realizó con células COS-7 electroporadas después de 1 día de expresión en placas de 6 pocillos (aproximadamente 175.000 células/pocillo). La unión se realizó con IL-8 de tipo salvaje radioiodada en medio de unión Hanks, sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}, tamponado con Hepes 25 nM, y suplementado con BSA al 0,5%. A continuación se lavaron los pocillos, se recolectaron las células con tripsina, y se contaron. No se encontró unión específica en pocillos paralelos que contenían células transfectadas con ADN procedente del vector pRK5B. La unión a neutrófilos se realizó tal y como se ha descrito [22], pero durante 2 horas a 4ºC.

Ejemplo 2

Se examinaron bibliotecas existentes de cADN de \lambdagt10, procedentes de la línea celular humana HL60 y de linfocitos de sangre humana periférica, en condiciones de baja exigencia con una sonda de la región codificante del receptor humano de elevada afinidad de la IL-8 clonado (Figura 2). La sonda fue el fragmento PstI/NcoI de 874 p.b. del receptor que contiene la región codificante para los aminoácidos 23-314. La hibridación fue en formamida al 20%, 4 x SSC, tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, 0,2 g/l de ADN de esperma sonicado de salmón, 5 x Denharts, 10% de sulfato dextrano, a 42ºC, con un lavado de 1 x SSC, SDS al 0,1% a 50ºC. Se extrajeron un cierto número de manchas duplicadas de diversa intensidad (aproximadamente 60), se purificaron en placa, se subclonaron en vectores plasmídicos, y se secuenciaron. La secuenciación del ácido nucleico empezó con la selección de manchas de la mayor intensidad. Para una mancha determinada (fago) se obtuvo suficiente secuencia como para determinar si existía o no evidencia de homología estructural o secuencial con el receptor de la IL-8. Si existía, entonces se obtenía el resto del gen (si era necesario) y se secuenciaba en su totalidad. Para evitar secuenciar todos los clones que se hibridaran, se usó la secuencia a continuación para sondear la colección progenitora de clones de ADN del receptor de la IL-8 que se hibridaban bajo condiciones de elevada exigencia con objeto de identificar y descartar otras manchas que contuvieran el mismo gen hibridante. Esta técnica fue muy efectiva para reducir la tarea de secuenciación. Por ejemplo, un clon estaba representado por aproximadamente un tercio de los 60 clones iniciales, y basándonos tan sólo en este resultado se pudo reducir la búsqueda negativa, considerando el trabajo implicado en secuenciar los clones.

A partir de esta búsqueda se encontraron dos secuencias de genes que estaban claramente relacionadas con el receptor de la IL-8. La región codificante para uno de los nuevos genes estaba repartida entre dos clones (8rr.20 y 8rr.15). La secuencia combinada de este gen (8rr.20.15) se muestra en la Figura 4. La región codificante completa para el segundo gen se encuentra en el clon 8rr.9 (Figura 5). La secuencia de aminoácidos predicha del 8rr.20.15 es idéntica en el 34% con ambas, las secuencias de los receptores de alta y baja afinidad de la IL-8. La secuencia del 8rr.9 es respectivamente un 36% y 38% idéntica con las secuencias de los receptores de alta y baja afinidad de la IL-8 (W.E. Holmes et al. Science 253: 1278 (1991) y P.M. Murphy et al. Science 253: 1280 (1991)). Las secuencias de aminoácidos del 8rr.20.15 y 8rr.9 son idénticas en un 31%. El uso de esta sonda en condiciones de baja exigencia no produjo la hibridación detectable con los genes del receptor del fMLP que se esperaba encontrar en estas bibliotecas.

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Referencias

1. Oppenheim, J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617-648 (1991).

2. Gimbrone, M.A.Jr. et al., Science, 246: 1601-3 (1989).

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4. Gerard, N.P & Gerard, C., Nature, 349: 614-617 (1991).

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21. Morrison M. & Bayse, G.S., Biochem., 9: 2995-3000 (1970).

22. Pacholcryk, T., Blakely, R.D. & Amara, S.G., BioTechniques, 9: 556-558 (1990).

23. Grynkiewicz, G., Poenie, M. & Tsien, R.Y., J. Biol. Chem., 260: 3440-3450 (1985).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: GENENTECH, INC.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTORES HUMANOS PF4 Y SU UTILIZACIÓN.

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

A QUIEN SE HA DE DIRIGIR: Genentech, Inc

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(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd.

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAIS: USA

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(F)

CODIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: 5.25 inch,360kb disquette

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 marzo 1992

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD: 07/677211

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29marzo 1991

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(C)

NUMERO DE SOLICITUD: 07/810782

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(D)

FECHA DE PRESENTACIÓN:19 diciembre 1991

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:

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(A)

NOMBRE: Hensley, Max D.

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(B)

NUMERO DE REGISTRO: 27.43

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(C)

NUMERO DE ACTA/REFERENCIA:706P1

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(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELEFONO: 415/266-1994

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(B)

TELEFAX: 415/952-9881

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(C)

TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1933 bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 1:

3

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1737 bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

CADENAS: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº2:

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60

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1679 bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

CADENAS: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 3:

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9

10

11

Claims (42)

1. Polipéptido (PF4AR) receptor de la superfamilia del factor de plaqueta 4 aislado que tiene al menos un 85% de homología en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos traducida de la Figura 2.

2. Polipéptido PF4AR según la reivindicación 1 que comprende el polipéptido de la Figura 2.

3. Polipéptido aislado que comprende el polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores fusionado a un polipéptido heterólogo al polipéptido PF4AR.

4. Polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido se une a la IL-8, sin unirse o sin respuesta al f-Met-Leu-Phe.

5. Polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es humano.

6. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PF4AR definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, la cual es ADN y tiene la secuencia de ADN traducida mostrada en la Figura 2.

8. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 o reivindicación 7, que comprende además un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PF4AR.

9. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, operativamente unida a secuencias de control reconocidas por la célula huésped transformada con el vector.

10. Célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 9.

11. Procedimiento de uso de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped cultivada, transformada con un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PF4AR operativamente unida a secuencias de control reconocidas por la célula huésped transformada con el vector, produciendo, de esta manera, el polipéptido PF4AR, y la recuperación del polipéptido PF4AR a partir de la célula huésped.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en donde el polipéptido PF4AR se recupera a partir de las membranas de la célula huésped.

13. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al polipéptido PF4AR según la reivindicación 1.

14. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al polipéptido PF4AR de la Figura 2.

15. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 14 que es capaz de unirse específicamente a una región N-terminal extracelular del polipéptido PF4AR.

16. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.

17. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 para uso en terapia o diagnóstico.

18. Procedimiento de uso de un polipéptido PF4AR tal y como se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el procedimiento:

la utilización de una célula recombinante que expresa el polipéptido PF4AR, o el polipéptido PF4AR y un adyuvante, o el polipéptido PF4AR conjugado a un péptido inmunogénico, para inmunizar un animal para generar anticuerpos contra un epítopo del PF4AR; y

la preparación de anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado,

en donde los anticuerpos monoclonales son capaces de unirse específicamente a un polipéptido PF4AR como el definido en la reivindicación 1.

19. Procedimiento de uso de un polipéptido tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el procedimiento:

la utilización de una célula recombinante que expresa el polipéptido PF4AR, o el polipéptido PF4AR y un adyuvante, o el polipéptido PF4AR conjugado a un péptido inmunogénico, para inmunizar un animal para generar anticuerpos contra un epítopo del PF4AR; y

la preparación de anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado,

en donde los anticuerpos monoclonales son capaces de unirse específicamente a un polipéptido PF4AR de la Figura 2.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en donde los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región N-terminal extracelular del polipéptido PF4AR.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 que comprende además la mezcla de los anticuerpos con un portador farmacéuticamente aceptable.

22. Procedimiento de preparación de una formulación terapéutica de un polipéptido PF4AR según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un anticuerpo monoclonal según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, comprendiendo el procedimiento la mezcla del polipéptido o anticuerpo con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en donde el anticuerpo es un anticuerpo según la reivindicación 15.

24. Polipéptido (PF4AR) receptor de la superfamilia del factor de plaqueta 4 aislado que tiene al menos un 85% de homología en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos traducida de la Figura 4 o la Figura 5.

25. Polipéptido PF4R aislado, en donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido PF4AR se hibrida con el complemento del ácido nucleico que codifica el polipéptido de las Figuras 4 ó 5 bajo condiciones de elevada astringencia.

26. Polipéptido PF4AR aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es de por lo menos 10 residuos y que está contenida en una región extracelular del polipéptido de las figuras 4 ó 5 y es capaz de generar un anticuerpo que reaccionará de forma cruzada con el polipéptido de las figuras 4 ó 5.

27. Polipéptido PF4AR según la reivindicación 26, donde la región extracelular es la región N-terminal extracelular de las figuras 4 ó 5.

28. Polipéptido aislado que comprende el polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 fusionado a un polipéptido heterólogo al polipéptido PF4AR.

29. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28.

30. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 29 que es ADN y tiene la secuencia de ADN traducida mostrada en la figura 4 o la figura 5.

31. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 29 o la reivindicación 30, que además comprende un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido PF4AR.

32. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, operativamente unido a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

33. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 32.

34. Procedimiento de utilización de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, que comprende la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped en cultivo transformada con un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido PF4AR operativamente unido a las secuencias de control reconocidas por la célula huésped transformada con el vector, produciendo de esta manera el polipéptido PF4AR y recuperando el polipéptido PF4AR de la célula huésped.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, donde el polipéptido PF4AR se recupera de las membranas de la célula huésped.

36. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.

37. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 36 que es capaz de unirse específicamente a una región N-terminal extracelular del polipéptido PF4AR.

38. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 36 ó 37 que es capaz de unirse específicamente al polipéptido PF4AR de la figura 4.

39. Procedimiento de utilización de un polipéptido PF4AR según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, comprendiendo el procedimiento:

la utilización de una célula recombinante que expresa el polipéptido PF4AR, o el polipéptido PF4AR y un adyuvante, o el polipéptido PF4AR conjugado a un péptido inmunogénico, para inmunizar un animal para generar anticuerpos contra un epítopo del PF4AR; y

la preparación de anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado,

donde los anticuerpos monoclonales son capaces de unirse específicamente a un polipéptido PF4AR tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.

40. Procedimiento de utilización de un polipéptido PF4AR tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, comprendiendo el procedimiento:

la utilización de una célula recombinante que expresa el polipéptido PF4AR, o el polipéptido PF4AR y un adyuvante, o el polipéptido PF4AR conjugado a un péptido inmunogénico, para inmunizar un animal para generar anticuerpos contra un epítopo del PF4AR; y

la preparación de anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado,

donde los anticuerpos monoclonales son capaces de unirse específicamente al polipéptido PF4AR de las figuras 4 ó 5.

41. Procedimiento según la reivindicación 40, donde los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región N-terminal extracelular del polipéptido PF4AR.

42. Procedimiento según la reivindicación 40 ó 41, donde los anticuerpos son capaces de unirse específicamente al polipéptido PF4AR de la figura 4.