ES2171404T5 - Ligandos del tnf. - Google Patents
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Abstract
SE PREVEN LIGANDOS A UN ELEMENTO DE LA FAMILIA DE RECEPTORES TNF NGF. LOS LIGANDOS SE ENLAZAN A LA REGION DEL BUCLE DE CISTEINA TERMINAL C DE TAL RECEPTOR. UN PROCESO PARA LA PREPARACION DEL LIGANDO TAMBIEN SE PREVE, ASI COMO COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN LOS LIGANDOS
Description
Ligandos del TNF.
La presente invención se refiere al uso de
ligandos para los receptores del Factor de Necrosis Tumoral
(TNF-R) que inhiben el efecto del TNF pero no su
unión a los TNF-R, así como a ligandos que
interaccionan con otros receptores de la familia de receptores de
TNF/NGF. Estos ligandos son anticuerpos o derivados peptídicos de
ellos o una sal o muteina de dichos anticuerpos. De acuerdo con la
invención los ligandos son utilizados para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de choque séptico,
caquexia, enfermedades
injerto-versus-huésped y
enfermedades autoinmunes, en particular artritis reumatoide.
El factor de necrosis tumoral (TNF) es un
citoquina pleiotrópica, producida por numerosos tipos de células,
principalmente por los macrófagos activados. Es uno de los
mediadores principales de la respuesta inmune e inflamatoria.
Recientemente el interés por su función ha aumentado enormemente, en
vista de la evidencia de la implicación del TNF en la patogénesis
de una amplia gama de enfermedades, incluyendo el choque por
endotoxinas, la malaria cerebral y la reacción
injerto-versus-huésped. Puesto que
muchos de los efectos del TNF son deletéreos para el organismo,
tiene un gran interés descubrir caminos para bloquear su acción
sobre las células huésped. Una diana evidente para semejante
intervención son las moléculas a las cuales se tiene que unir el TNF
para ejercer sus efectos, es decir los TNF-R. Estas
moléculas existen no sólo en las formas unidas a las células, sino
también en formas solubles, que constan de los dominios
extra-celulares escindidos de los receptores
intactos (ver Nophar y col., EMBO Journal,
9(10):3269-78, 1.990). Los receptores
solubles conservan la capacidad de unirse al TNF, y por tanto
tienen la capacidad de bloquear su función mediante la competencia
con los receptores de superficie.
Otro método de inhibición del TNF basado en el
principio de competencia con las moléculas unidas a las células, es
el uso de anticuerpos que reconozcan los receptores del TNF y
bloqueen la unión del ligando.
Los TNF-R de la superficie
celular se expresan en casi todas las células del organismo. Los
diferentes efectos del TNF, el citotóxico, el promotor del
crecimiento y otros, están todos señalados por los receptores del
TNF tras la unión del TNF a ellos. Se han descrito dos formas de
estos receptores, que difieren en el tamaño molecular: 55 y 75
kilodaltons, y aquí se denominarán TNF-R p55 y p75,
respectivamente. Se deberá observar, no obstante, que existen
publicaciones que hacen referencia a estos receptores también como
p60 y p80.
Los TNF-R pertenecen a una
familia de receptores que están implicados en otros procedimientos
biológicos críticos. Un ejemplo de estos receptores es el receptor
de NGF de baja afinidad, que juega un importante papel en la
regulación del crecimiento y la diferenciación de las células
nerviosas. Otros receptores distintos están implicados en la
regulación del crecimiento de los linfocitos, tales como CDw40 y
algunos otros. Otro miembro de la familia es el receptor FAS
también denominado APO, un receptor que está implicado en la
señalización de las apoptosis y que, basándose en un estudio con
ratones deficientes en su función, parece jugar un importante papel
en la etiología de una enfermedad similar al lupus. Aquí, esta
familia de receptores se denomina "familia de receptores
TNF/NGF".
Una de las características más sorprendentes del
TNF en comparación con otras citoquinas, que se piensa que
contribuye a la patogénesis de diversas enfermedades, es su
capacidad de provocar la muerte celular. Se piensa que la actividad
de destrucción celular del TNF está inducida por el receptor p55.
Sin embargo, esta actividad del receptor p55 puede estar asistida
por el receptor p75, a través de un mecanismo desconocido
todavía.
En las publicaciones de las patentes Europeas
Núms. 0.398.327 y 0.412.486 se describen anticuerpos para los
TNF-R solubles. Se encontró que estos anticuerpos
reconocían los TNF-R solubles e inhibían la unión
del TNF a los TNF-R de la superficie celular. Los
fragmentos F(ab) monovalentes bloqueaban el efecto del TNF,
mientras se observaba que los anticuerpos intactos imitaban el
efecto citotóxico del TNF.
Marsters y col. (J. Biol. Chem. 267 (1.992),
5747-5750) describen la identificación de dominios
ricos en cisteína del receptor del factor de necrosis tumoral de
tipo 1 implicados en la unión al ligando y también describen un
anticuerpo monoclonal que se une al receptor 1 del TNF. Sin embargo,
este anticuerpo no es capaz de inducir un cambio conformacional del
receptor en contraste con los ligandos de la presente solicitud. Por
otra parte, no se demuestra concluyentemente que los anticuerpos
monoclonales interaccionen realmente con la región del receptor 1
del TNF correspondiente a CDR4. En EP-A1 0.444.560
se describen anticuerpos concretos contra un receptor de TNF. No
obstante, en EP-A1 0,444,560 no se describen
anticuerpos que tengan las características de los anticuerpos de la
presente solicitud, por ejemplo no se describen anticuerpos que se
unan a la región del receptor del TNF que corresponde a la región a
la cual se unen los ligandos de la presente solicitud. A partir de
EP-A1 0.444.560 ni siquiera está claro si los
anticuerpos están dirigidos contra el epítopo extracelular del
receptor.
\newpage
La presente invención proporciona el uso de un
ligando tal como se caracteriza en las reivindicaciones para un
miembro de la familia de receptores TNF/NGF, que se une a la región
del bucle de cisteína C terminal de semejante receptor y que es
inhibidor de la señalización para el efecto citocida de dicho
receptor, donde el bucle de cisteína incluye la secuencia de
aminoácidos cys-163 a thr-179 del
TNF-R p75 o un bucle de cisteína C terminal
correspondiente de otro miembro de la familia TNF/NGF.
Preferiblemente, el receptor es el
TNF-R, en concreto el TNF-R p75.
Uno de tales ligandos incluye la secuencia de
aminoácidos de la región CDR de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal núm. 32, mostrada en la Fig. 11, y/o la secuencia de
aminoácidos de la región CDR de la cadena ligera de este anticuerpo
mostrada en la Fig. 12.
Otro de tales ligandos incluye la secuencia de
aminoácidos de la región CDR de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal núm. 70 mostrada en la Fig. 11.
Otro más de tales ligandos incluye la secuencia
de aminoácidos de la región CDR de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal núm. 57, mostrada en la Fig. 11.
Los anticuerpos anteriores son denominados aquí,
por motivos de simplicidad, anticuerpos del "grupo 32".
En otro aspecto de la invención, los ligandos
comprenden el scFv de un anticuerpo del grupo 32.
Los ligandos son aquellos que están
caracterizados en las reivindicaciones.
El ligando pueden comprender una proteína de
fusión con otra proteína, opcionalmente conectada por un conector
peptídico. Semejante proteína de fusión puede aumentar el tiempo de
retención del ligando en el organismo, y por tanto puede incluso
permitir emplear el complejo ligando-proteína como
agente latente o como vacuna.
Los péptidos de la invención pueden ser
sintetizados mediante diferentes métodos que son conocidos en
principio, es decir mediante métodos de acoplamiento químico (véase
Wunsch, E: "Methoden der organischen Chemie", Volumen 15, Band
1 + 2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1.974), y
Barrany, G.; Marrifield, R.B.: "The Peptides", eds. E. Gross,
J. Meienhofer, Volumen 2, Capítulo 1, págs. 1-284,
Academic Press (1.980)), o mediante métodos de acoplamiento
enzimático (véase Widmer, F. Johansen, J.T., Carlsberg Res. Commun.,
Vol. 44, págs. 37-46 (1.979), y Kullman, W.:
"Enzymatic Peptide Synthesis" CRC Press Inc. Boca Raton, Fl.
(1.987), y Widmer, F., Johansen, J.T. en "Synthetic Peptides in
Biology and Medicines":, eds. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri,
A., págs. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1.985)), o
mediante una combinación de métodos sintéticos y enzimáticos si esta
es ventajosa para el diseño y la economía del procedimiento.
Se puede añadir un resto cisteína en los
extremos tanto amino como carboxi del péptido, lo que permitirá la
ciclación del péptido mediante la formación de un enlace
disulfuro.
Cualquier modificación de los péptidos de la
presente invención que no produzca una disminución de la actividad
biológica se encuentra dentro del alcance de la presente
invención.
La especificidad individual de los anticuerpos
reside en las estructuras de los bucles de péptidos que forman las
Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR) de los dominios
variables de los anticuerpos.
Todas las moléculas (péptidos, etc.) pueden ser
producidas mediante métodos químicos convencionales, como se
describe aquí, o mediante métodos de recombinación de ADN.
La invención también proporciona moléculas de
ADN que codifican los ligandos según la invención, vectores que los
contienen y células huésped que comprenden los vectores y capaces de
expresar los ligandos según la invención.
La célula huésped puede ser eucariota o
procariota.
La invención proporciona adicionalmente
moléculas de ADN que hibridan con las moléculas de ADN anteriores y
que codifican ligandos que tienen la misma actividad.
Asimismo la invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden los ligandos anteriores que son útiles
para tratar enfermedades inducidas o causadas por los efectos del
TNF, ya sea producido endógenamente o administrado exógenamente.
La Figura 1 muestra una ilustración esquemática
de los constructos bacterianos utilizados para determinar la
secuencia a la cual se unen los anticuerpos del grupo 32.
La Figura 2 muestra un ejemplo de la técnica de
análisis de transferencia Western por medio de la cual se ha
determinado la unión de los anticuerpos a los constructos mostrados
en la Figura 1.
Las Figuras 3 y 4 muestran la competencia de
péptidos sintéticos cuyas secuencias contienen la región del epítopo
reconocida por los anticuerpos monoclonales del grupo 32, o partes
de ella, con la unión de un anticuerpo de este grupo a un constructo
que comprende parte de TBP-II en el que está
presente este epítopo.
La Figura 5 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos deducidas del receptor p75. Los
dominios TBP-II y transmembrana están recuadrados y
sombreados. La región reconocida por los anticuerpos del grupo 32
está subrayada.
La Figura 6 muestra el patrón de protección de
células HeLa p75.3 (como se define aquí más adelante) de la
toxicidad del TNF mediante diferentes anticuerpos monoclonales
frente a TNF-R p75, y fragmentos del mismo.
La Figura 7 muestra los efectos de un anticuerpo
monoclonal contra TBP-I y varios contra
TBP-II sobre el grado de destrucción de células U937
por el TNF.
Las Figuras 8a y 8b muestran los efectos del
anticuerpo monoclonal 70 y los fragmentos Fab del mismo sobre la
unión del TNF a células HeLa p75.3 y células U937,
respectivamente.
La Figura 9 muestra una comparación de los
efectos del anticuerpo 32 con otros anticuerpos contra el
TNF-R p75 sobre la unión del TNF a células HeLa
p75.3.
La Figura 10 muestra la disociación del TNF de
las células HeLa p75.3 en presencia y ausencia de anticuerpo núm. 70
y su fragmento monovalente Fab.
La Figura 11 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos deducidas para la región CDR de las
cadenas pesadas de tres anticuerpos monoclonales del grupo 32.
La Figura 12 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos deducidas para la región CDR de las
cadenas ligeras del anticuerpo monoclonal Núm. 32.
La Figura 13 muestra la homología de secuencias
entre diversos miembros de la familia de receptores TNF/NGF.
El TNF, como se ha establecido antes, es una
citoquina que inicia su efecto sobre la función celular uniéndose a
dos receptores de la superficie celular específicos: los receptores
p55 y p75. La unión de los anticuerpos al dominio extracelular de
estos receptores puede interferir en su efecto. Sin embargo, como se
muestra en numerosos estudios, la unión de los anticuerpos al
dominio extracelular de los receptores también puede desencadenar
los efectos del TNF induciendo la agregación de los receptores p55,
así como induciendo la agregación de los receptores p75.
(Engelmann, y col. J. Biol. Chem., Vol. 265, Núm. 24, págs.
14497-14504, 1.990; y datos no publicados).
Los autores de la presente invención han
encontrado que ciertos anticuerpos que se unen a una región concreta
del receptor p75 no son miméticos sino bastante inhibidores de la
señalización del efecto citocida por este receptor. Esto, a pesar
del hecho de que cuando se unen a esta región, estos anticuerpos no
bloquean la unión del TNF, sino que la incrementan hasta cierto
punto.
La presente invención revela que esta región
reconocida por estos anticuerpos que los autores de la presente
invención llaman grupo 32, es la región que se extiende entre las
dos cisteínas C terminales del dominio extracelular del receptor
p75, más un aminoácido adicional, thr179. Esta región, por motivos
de simplicidad, se denomina "bucle de cisteína" en toda esta
memoria.
La presente invención también proporciona las
secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de la CDR de
la cadena pesada de los tres anticuerpos pertenecientes a este
grupo, denominados 32 y 57. Además, la invención también
proporciona la secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos deducida de la cadena ligera del anticuerpo 32.
Basándose en estas secuencias, compuestos peptídicos que inhibirán
la función de los
receptores p75.
receptores p75.
En vista de estos descubrimientos, así como de
la íntima similitud de los receptores en esta familia concreta,
esta invención hace referencia también a agentes que se unen al
bucle de cisteína C terminal del dominio extracelular de otros
miembros diferentes de la familia de receptores TNF/NGF y modulan la
función de los otros receptores, de un modo similar a la modulación
de la función del TNF. En esta familia de receptores, la
localización de la cisteína en el dominio extracelular y el
espaciamiento están altamente conservados. Ciertos miembros de esta
familia, v.g., CDw40, manifiestan una similitud particularmente
elevada con el receptor p75. Concretamente en tales receptores, se
espera que los agentes que se unan a estas regiones tengan efectos
similares al efecto de los anticuerpos 32 sobre el receptor p75.
Las moléculas activas obtenidas mediante los
procedimientos anteriores, en tanto que son sustancias biológicas,
también pueden ser preparadas mediante enfoques biotecnológicos. De
este modo, se hará posible la producción masiva de estas moléculas.
Los péptidos pueden ser producidos mediante métodos de síntesis
peptídica conocidos o utilizando vectores de expresión que
contengan secuencias de ADN que los codifiquen. Se pueden elaborar
otras moléculas, si son producidas de forma enzimática, produciendo
las enzimas implicadas en las células cultivadas apropiadas.
Se pueden emplear composiciones farmacéuticas
que contengan los ligandos de la presente invención para el
antagonismo de los efectos del TNF en mamíferos.
Semejantes composiciones comprenden los ligandos
según la invención como ingrediente activo. Las composiciones
farmacéuticas están indicadas para estados tales como el choque
séptico, la caquexia, las reacciones
injerto-versus-huésped,
enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, y
similares. También están indicadas para contrarrestar v.g. una
sobredosis de TNF administrado exógenamente.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención son administradas dependiendo de la afección a tratar, a
través de las vías de administración aceptadas. Por ejemplo, en el
caso del choque séptico, se preferirá la administración
intravenosa. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser
administradas continuamente, es decir, por medio de infusión, u
oralmente. La formulación y la dosificación dependerán de la
afección a tratar, de la ruta de administración y del estado y el
peso corporal del paciente a tratar. La dosis exacta será
determinada por el médico que atienda.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención se preparan de la manera habitual, por ejemplo mezclando
el ingrediente activo con portadores y/o estabilizadores y/o
excipientes farmacéutica y fisiológicamente aceptables, dependiendo
del caso, y se preparan en una forma de dosificación, v.g., mediante
liofilización en viales de dosificación.
Utilizado aquí el término "muteínas" hace
referencia a análogos de los ligandos en los que uno o más de los
restos aminoácido del ligando que se ha encontrado que se unen son
repuestos por restos aminoácido diferentes o son suprimidos, o uno
o más restos aminoácido son añadidos a la secuencia original, sin
cambiar considerablemente la actividad del producto resultante.
Estas muteínas son preparadas mediante mecanismos de síntesis y/o de
mutagénesis dirigida al sitio conocidos, o cualquier otro mecanismo
conocido adecuado para ello.
El término "proteína fusionada" hace
referencia a un polipéptido que comprende los ligandos o una muteína
del mismo fusionados con otra proteína que tiene un tiempo de
permanencia prolongado en los fluidos corporales. Los ligandos
pueden estar fusionados de ese modo con otra proteína, polipéptido o
similar, v.g. una inmunoglobulina o un fragmentos de la misma.
El término "sales" hacer referencia aquí
tanto a las sales de grupos carboxilo como a las sales de adición
de ácido de grupos amino de los ligandos, muteínas y proteínas
fusionadas de los mismos. Las sales de un grupo carboxilo pueden
estar formadas mediante métodos conocidos en la técnica e incluyen
las sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio,
férricas o de cinc, y similares, y las sales con álcalis orgánicos
como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como
trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y
similares. Entre las sales de adición de ácido se incluyen, por
ejemplo, las sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo,
ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y las sales con ácidos
orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido
oxálico.
Los derivados incluyen cadenas laterales de
polietilenglicol que pueden enmascarar los sitios antigénicos y
prolongar la permanencia de los ligandos en los fluidos
corporales.
La invención se ilustra por medio de ejemplos no
limitantes:
En el ejemplo 5 de la solicitud principal, se
prepararon numerosos constructos mediante la expresión en E.
coli, y se concluyó que el epítopo reconocido por el anticuerpo
núm. 32 se localiza en el mapa entre los aminoácidos
125-182.
Los autores de la presente invención han
preparado ahora constructos adicionales y la lista completa de
constructos examinados, así como su relación con la estructura del
p75R soluble se muestran en la Fig. 1. Los constructos reconocidos
por los anticuerpos del grupo 32 se exponen en números en negrita y
se ilustran como líneas gruesas. Aquellos que no reaccionan con
estos anticuerpos se exponen en números poco densos y se ilustran
mediante líneas discontinuas. Todos los constructos se identifican
por sus restos aminoácido N y C terminales.
La Figura 1, encima de la ilustración
esquemática de los constructos, muestra la secuencia de aminoácidos
de parte del TNF-R p75, estando recuadradas las
regiones correspondientes a la forma soluble del receptor y la
región transmembrana. Los restos aminoácido conservados entre el
hombre y el ratón están subrayadas.
El análisis de transferencia Western mostrado en
la Figura 2, de la unión de los anticuerpos del grupo 32 a algunos
de los constructos mostrados en la Figura 1 se llevó a cabo como en
el Ejemplo 5 de la solicitud principal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron numerosos péptidos sintéticos
cuyas secuencias corresponden a diferentes partes de la región del
TNF-R que se sospechaba que era el epítopo del grupo
32 (restos 160-179, 162-179,
163-179, 165-179 y
167-179). Los péptidos fueron examinados en un
ensayo ELISA en cuanto a su capacidad para competir por la unión a
los anticuerpos del grupo 32.
Un constructo producido por medio de bacterias
correspondiente a los aminoácidos 3 a 180 del TNF-R
p75 (constructo p75 de la Fig. 3) fue aplicado, a las
concentraciones indicadas, a placas de PVC revestidas previamente
con anticuerpo 32 seguido de aplicación de antisuero de conejo a
TBP-II (TNF-R soluble p75). La
cantidad de antisuero de conejo unido a la placa fue determinada
aplicando antisuero de cabra frente a inmunoglobulina de conejo,
acoplada a peroxidasa de rábano picante y evaluación enzimática de
la cantidad de inmunoglobulina de cabra unida a la placa. La figura
3 muestra los datos de un experimento en el que se encontró que un
péptido sintético correspondiente a los restos aminoácido 163 a 179
competía por la unión.
La figura 4 muestra los datos de un experimento
en el que se utilizaba una proteína de fusión de la proteína de
unión a maltosa (MBP) con la secuencia de aminoácidos que se
extendía de 125 a 192 del receptor p75 para revestir placas de PVC
a una concentración de 10 \mug/ml, después se aplicó el McAb Núm.
32 a una concentración de 2 \mug/ml junto con las concentraciones
indicadas de diferentes péptidos:
DW16 - aminoácidos 165-179
DW18 - aminoácidos 163-179
DW19 - aminoácidos 162-179
DW21 - aminoácidos 160-179
Después de eso, se desarrolló la reacción
añadiendo anti-ratón de cabra acoplada a peroxidasa
de rábano picante. Como se muestra en la Fig. 4, se observaba una
marcada inhibición del reconocimiento de la proteína de fusión por
el anticuerpo monoclonal Núm. 32 sólo con los tres péptidos que
abarcaban el epítopo completo.
\vskip1.000000\baselineskip
La reposición de la cisteína 178 por alanina en
un péptido recombinante cuya secuencia corresponde a los aminoácidos
3 a 181, hizo irreconocible esta proteína por los anticuerpos del
grupo 32. Este descubrimiento sugiere que con el fin de ser
reconocidas por estos anticuerpos, las dos cisteínas de la región
del epítopo del grupo 32 deben estar libres de interacción entre
sí; es decir que la estructura reconocida por los anticuerpos sea
un bucle. En apoyo de esta noción, los autores de la presente
invención descubrieron que la reducción del péptido con
ditiotreitol antes de la SDS-PAGE y el análisis de
transferencia Western disminuía algo la eficacia de su
reconocimiento por los anticuerpos del grupo 32, y la reducción con
ditiotreitol seguida de alquilación con yodoacetamida lo hacía
completamente irreconocible por los anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
- (a)
- Con el fin de comparar la función de los anticuerpos del grupo 32, no sólo los anticuerpos que se unen al receptor aguas arriba de la región del epítopo 32 (como se espera de la mayoría de los anticuerpos anti-TBP-II), sino también los anticuerpos que se unen al receptor aguas abajo de la región del epítopo, los autores de la presente invención inmunizaron ratones con un constructo quimérico correspondiente a la región que se extiende aguas abajo del epítopo 32 (aminoácidos 181 a 235; la región "tallo" (del inglés stalk)), conectada a MBP. Los conejos desarrollaban anticuerpos que se unían a la quimera con la que eran inmunizados así como al receptor de TNF p55 intacto. Estos anticuerpos eran purificados por afinidad mediante la unión a la proteína quimérica, conectados a una columna Affi-gel 10, y sometidos a ensayo en cuanto al efecto sobre la función y la unión del TNF. (La preparación de anticuerpo purificado por afinidad se denominaba "318").
- (b)
- Se sometió a ensayo el efecto sobre la toxicidad del TNF en clones de células HeLa epitelioides que se habían elaborado para sobreexpresar los receptores p75 (por su transfección con el ADNc del receptor p75. Los autores de la presente invención llaman al clon sobreexpresado concreto utilizado en los experimentos presentados aquí HeLa p75.3) de todos los anticuerpos anti-TBP-II monoclonales así como los anticuerpos anti-tallo purificados por afinidad. Los únicos anticuerpos que se encontró que inhibían la función del TNF fueron los anticuerpos del epítopo del grupo 32; que, a pesar del hecho de que no inhibían aumentaban algo la unión del TNF al receptor (Figs. 8 y 9). Dos de los otros anticuerpos anti-TBP-II (Núm. 67 de las Figs. 6 y 9 y Núm. 81) tenían un efecto muy pequeño sobre la unión del TNF al receptor o sobre la toxicidad del TNF. Todos los demás anticuerpos anti-TBP-II monoclonales potenciaban algo el efecto citocida del TNF incluso aunque competían por la unión al TNF (v.g. anticuerpo 36 de las Figs. 6 y 9). Los anticuerpos "anti-tallo" tenían un efecto muy pequeño sobre la unión o la función del TNF (Figs. 6 y 9). Aplicando los anticuerpos anti-tallo a las células junto con los anticuerpos del grupo 32 no se interfería en el efecto inhibidor del último sobre la función del TNF.
- (c)
- Se sometió a ensayo el efecto sobre la destrucción de células U937 mielocíticas por el TNF del mismo panel de anticuerpos. En oposición al efecto mimético de los anticuerpos anti-receptor de TNF de las células HeLa, se encontró que ni los anticuerpos anti-receptor p55 ni anti-receptor p75 eran miméticos para el efecto citocida del TNF sobre las células U937 en las condiciones del experimento llevado a cabo. No teniendo la capacidad de imitar el efecto del TNF, todos los anticuerpos monoclonales que compiten por la unión del TNF o bien al receptor p75, (v.g. los anticuerpos 14, 31 y 36 de la Figura 9) o bien o bien al receptor p55 (v.g. el anticuerpo número 18 de la Figura 7) son inhibidores de los efectos del TNF. Los anticuerpos que no tenían efecto sobre la unión del TNF a los receptores (v.g. el número 67 de la Figura 9) no tenían efecto sobre la función del TNF (Figura 6). Los anticuerpos del grupo 32 eran los únicos que tenían la capacidad de inhibir la función del TNF en esta célula sin tener efecto inhibidor alguno sobre la unión del TNF. Los anticuerpos realmente incrementaban la unión del TNF a estas células, mucho más que en las células HeLa p75.3 (Figura 8). El efecto inhibidor de los anticuerpos del grupo 32 era aditivo al de los anticuerpos que bloquean la unión del TNF al receptor p55 (v.g. la combinación 18/32 de la Figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de explorar el mecanismo por medio
del cual los anticuerpos del grupo 32 ocasionan un incremento en la
unión del TNF, los autores de la presente invención compararon la
velocidad de disociación del TNF de las células HeLa p75.3 en
presencia y ausencia de estos anticuerpos.
Se añadió TNF marcado radiactivamente a células
HeLa p75.3 confluentes y las células fueron incubadas durante 2
horas sobre hielo. El ligando que no se había unido se separó
lavando y se aplicó 1 ml de tampón de unión que contenía 500 ng/ml
de TNF frío a pocillos por cuadruplicado para los períodos de tiempo
indicados sobre hielo. Después de eso, los pocillos fueron lavados
una vez más con PBS frío, y se determinó la cantidad de ligando
residual midiendo la radiactividad de las células separadas de las
placas mediante incubación con solución de PBS/EDTA. Estos
anticuerpos fueron aplicados en todo el análisis a una concentración
de 10 \mug/ml.
Como se ilustra en la Fig. 10, ambos anticuerpos
así como sus fragmentos monovalentes F(ab) ocasionaban un
descenso de la velocidad de disociación del TNF de los receptores.
Además de proporcionar una posible explicación del modo en el que
estos anticuerpos afectan a la unión del TNF a sus receptores, este
descubrimiento indicaba una explicación adicional de este efecto.
Las formas solubles de los TNF-R p75 o del receptor
p55 o de cualquier otro miembro de la familia de receptores TNF/BGF
en el que se producirá un cambio conformacional como el impuesto
por el anticuerpo del grupo 32, servirán como mejores inhibidores
del respectivo agonista.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar las secuencias de
nucleótidos de la CDR de las cadenas pesadas de los anticuerpos 32,
57 y 70, se aisló el ARN total mediante el protocolo de Promega a
partir de las respectivas células de hibridoma, utilizando
tioisocianato de guanidinio. La síntesis de la primera hebra de ADNc
sobre este ARN se realizó utilizando la transcriptasa inversa de
AMV y oligo(dT)15-18 o un
oligonucleótido complementario a la región constante de la cadena
pesada de la IgG murina como cebador. El ADNc fue utilizado como
molde para la PCR, aplicando un cebador 5' parcialmente degenerado.
Se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR. Los productos de la PCR con un
tamaño de aproximadamente 350 pb fueron purificados
electroforéticamente y clonados en el vector Bluescript. Los clones
que tenían insertos del tamaño correcto fueron secuenciados. En ADNc
de doble hebra de la región CDR de la cadena ligera del anticuerpo
núm. 32 fue sintetizado de una manera similar.
Las secuencias de nucleótidos obtenidas mediante
el método de terminación de la cadena didesoxi, y las secuencias de
aminoácidos deducidas de allí se muestran en las Figuras 11 y 12.
Las regiones CDR1, 2, y 3 están subrayadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones variables de las cadenas pesadas y
ligeras de los anticuerpos monoclonales del grupo 32 son conectadas
con un conector de 15 aminoácidos de longitud e introducidas en un
vector de expresión comercial. El vector contiene un promotor, v.g.
lac, una secuencia líder v.g. pel-B, así como una
secuencia que codifica un péptido pequeño (péptido "tag")
contra el cual está disponible comercialmente un anticuerpo
monoclonal. El plásmido es introducido ahora en E. coli y
las bacterias se hacen crecer a una D.O de 0,5-1,0.
La expresión de scFv es inducida por la adición de IPTG y el
crecimiento continúa durante 6-24 horas. El complejo
scFv-tag soluble es aislado después del medio de
cultivo mediante purificación por inmunoafinidad utilizando el
anticuerpo monoclonal contra tag y después purificado en una columna
de metaloafinidad.
Cualquier scFv que se acumule dentro de las
bacterias es purificado mediante aislamiento y lavando repetidamente
los cuerpos de inclusión, seguido de solubilización v.g. mediante
urea o guanidinio y posterior renaturalización.
Como posibilidades alternativas se están
empleando una oligohistidina como tag, utilizando un promotor más
potente en lugar de lac, es decir T7, construyendo el vector sin la
secuencia líder o introduciendo una secuencia que codifique una
"cola" de secuencias irrelevantes en el vector en el extremo 5'
del scFv. Esta "cola" no deberá ser biológicamente activa,
puesto que su único propósito es la creación de una molécula más
larga que el scFv nativo, ocasionando de ese modo un tiempo de
retención en el organismo más largo.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 13 muestra las repeticiones ricas en
cisteína interna en los dominios extracelulares de los dos
TNF-R y su alineamiento con las repeticiones
homólogas en el dominio extracelular del FAS humano, el receptor
del factor de crecimiento nervioso (NGF) y CDw40, así como Ox40 de
rata. Las secuencias de aminoácidos (símbolos de una letra) están
alineados para una máxima homología. Las posiciones de los
aminoácidos en los receptores están indicadas en el margen
izquierdo.
\vskip1.000000\baselineskip
También se pueden preparar los péptidos y otras
moléculas mediante mecanismos de ingeniería genética y su
preparación abarca todas las herramientas utilizadas en estos
mecanismos. Así se proporcionan moléculas de ADN que comprenden la
secuencia de nucleótidos que codifica tales péptidos y otras
moléculas biológicas. Estas moléculas de ADN pueden ser ADN
genómico, ADNc, ADN sintético y una combinación de los mismos.
La creación de moléculas de ADN que codifican
tales péptidos y moléculas se lleva a cabo mediante métodos
convencionales, una vez que la secuencia de aminoácidos de estos
péptidos y otras moléculas ha sido determinada.
La expresión de las proteínas recombinantes
puede ser efectuada en células eucariotas, bacterias o levaduras,
utilizando los vectores de expresión apropiados. Se puede emplear
cualquier método conocido en la técnica.
Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican
los péptidos y otras moléculas obtenidas mediante los métodos
anteriores son insertadas en vectores de expresión apropiadamente
construidos mediante mecanismos bien conocidos en la técnica (ver
Maniatis, T. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor (1.982)). El ADNc de doble
hebra es conectado a vectores plasmídicos mediante formación de
colas homopoliméricas o mediante conexión de restricción que
implica el uso de conectores de ADN sintético o mecanismos de
ligadura de extremos romos. Se utilizan ADN ligasas para ligar las
moléculas de ADN y se evitan los empalmes no deseados mediante
tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con el fin de poder expresar una sustancia
biológica deseada, es decir un péptido o proteína (de aquí en
adelante "proteína" por motivos de simplicidad), el vector de
expresión también deberá comprender secuencias de nucleótidos
específicas que contengan la información reguladora transcripcional
y traduccional conectadas con el ADN que codifica la proteína
deseada de tal manera que permita la expresión génica y la
producción de la proteína. Primero, con el fin de que el gen sea
transcrito, este debe estar precedido por un promotor reconocible
por la ARN polimerasa, al cual se une la polimerasa y de ese modo
inicia el proceso de transcripción. Existen una variedad de
semejantes promotores en uso, que funcionan con diferentes eficacias
(promotores potentes y débiles). Son diferentes para las células
procariotas y eucariotas.
Los promotores que pueden ser utilizados en la
presente invención pueden ser o bien constitutivos, por ejemplo, el
promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla
del gen de la \beta-lactamasa de pBR322, y el
promotor CAT del gen de la
cloramfenicolacetil-transferasa de pBR325, etc., o
inducibles, tales como los promotores procariotas incluyendo los
promotores derecho e izquierdo principales del bacteriófago lambda
(P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI,
ompF y gal de E. coli, o el promotor híbrido
trp-lac, etc. (Glick, B.R. (1.987) J. Ind.
Microbiol., 1:277-282).
Además del uso de promotores potentes para
generar grandes cantidades de ARNm, con el fin de lograr elevados
niveles de expresión génica en células procariotas, es necesario
utilizar también sitios de unión al ribosoma para asegurarse de que
el ARNm es eficazmente traducido. Un ejemplo es la secuencia de
Shine-Dalgarno (SD) apropiadamente situada desde el
codón de iniciación y complementaria a la secuencia terminal 3' del
ARN de 16S.
Para los huéspedes eucariotas, se pueden emplear
diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y la
traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Pueden derivar
de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma
bovino, virus de simios, o similares, donde las señales reguladoras
están asociadas a un gen concreto que tiene un elevado nivel de
expresión. Los ejemplos son el promotor TK del herpes virus, el
promotor temprano de SV40, el promotor del gen ga14 de levadura,
etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de iniciación de la
transcripción que permitan la represión y la activación, de manera
que se pueda modular la expresión de los genes.
La molécula de ADN que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica los péptidos u otras moléculas de la
invención y las señales reguladoras de la transcripción y la
traducción conectada operativamente es insertada en un vector que
es capaz de integrar las secuencias de genes deseadas en el
cromosoma de la célula huésped. Las células que han integrado
establemente el ADN introducido en sus cromosomas pueden ser
seleccionadas introduciendo también uno o más marcadores que
permitan la selección de las células huésped que contengan el vector
de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un
huésped auxótrofo, resistencia biocida, v.g., antibióticos, o
metales pesados, tales como cobre, o similares. El gen marcador
seleccionable puede ser conectado directamente a las secuencias
génicas de ADN que van a ser expresadas, o puede ser introducido en
la misma célula mediante transfección simultánea. También se pueden
necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima del ARNm de
la proteína de unión de cadena sencilla. Entre estos elementos se
pueden incluir señales de empalme, así como promotores,
intensificadores, y señales de terminación de la transcripción.
Entre los vectores de expresión de ADNc que incorporan semejantes
elementos se incluyen los descritos por Okayama, H., (1.983) Mol.
Cell Biol., 3:280.
En una realización preferida, la molécula de ADN
introducida será incorporada a un vector plasmídico o viral
susceptible de replicación autónoma en el huésped receptor. Entre
los factores de importancia al seleccionar un vector plasmídico o
viral concreto se incluyen; la facilidad con la que las células
receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y
seleccionadas entre las células receptoras que no contienen el
vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped
concreto; y si es deseable poder "lanzar" el vector entre
células huésped de diferentes especies.
Entre los vectores procariotas preferidos se
incluyen plásmidos tales como los que son susceptibles de
replicación en E. coli, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101,
pACYC 184, etc. (ver Maniatis y col., (1.982) op. cit.); plásmidos
de Bacillus tales como pC194, pC221, pT127, etc. (Gryczan, T.,
The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY
(1.982)); plásmidos de Streptomyces incluyendo pIJ101 (Kendall, K.J.
y col., (1.987) J. Bacteriol. 169:4177-83);
bacteriófagos de Streptomyces tales como \phiC31 (Chater, K.F. y
col., en: Sixth International Symposium on Actinomycetales
Biology, (1.986)); y plásmidos de Pseudomonas (John, J.F., y
col. (1.986) Rev. Infect. Dis. 8:693-704; e
Izaki, K. (1.978) Jpn. J. Bacteriol.,
33:729-742).
Entre los plásmidos eucariotas preferidos se
incluyen BPV, vaccinia, SV40, circular de 2 micras, etc., o sus
derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en la técnica
(Botstein, D., y col. (1.982) Miami Wint. Symp. 19, págs.
265-274; Broach, J.R., in: The Molecular Biology
of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, págs.
445-470 (1.981); Broach, J.R., (1.982) Cell,
28:203-204; Bollon, D.P., y col. (1.980) J.
Clin. Hematol. Oncol., 10:39-48; Maniatis,
T., en: Cell Biology: A Comprehensive Treaties, Vol. 3: Gene
Expression, Academic Press, NY, págs. 563-608
(1.980)).
Una vez que se ha preparado el vector o la
secuencia de ADN que contiene el constructo o los constructos para
la expresión, se pueden introducir el o los constructos de ADN en
una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de
métodos apropiados: transformación, transfección, conjugación,
fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato
de calcio, microinyección directa, etc.
Las células huésped que se van a utilizar en
esta invención pueden ser procariotas o eucariotas. Entre los
huéspedes procariotas preferidos se incluyen las bacterias tales
como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas,
Salmonella, Serratia, etc. El huésped procariota más preferido es
E. coli. Entre los huéspedes bacterianos de particular
interés se incluyen E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31446), E.
coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F^{-},
lambda^{-}, prototrópico (ATCC 27325)), y otras enterobacterias
tales como Salmonella typhimurium o Serratia
marcescens y diferentes especies de Pseudomonas. En semejantes
condiciones, la proteína no estará glicosilada. El huésped
procariota debe ser compatible con el replicón y las secuencias de
control del plásmido de expresión.
\newpage
Los huéspedes eucariotas preferidos son las
células de mamíferos, v.g., células humanas, de mono, de ratón y de
ovario de hámster chino (CHO), debido a que proporcionan
modificaciones post-traduccionales a las moléculas
de proteína incluyendo el correcto plegado o la glicosilación en los
sitios correctos. Asimismo las células de levadura pueden llevar a
cabo modificaciones peptídicas post-traduccionales
incluyendo la glicosilación. Existen numerosas estrategias de
recombinación de ADN que utilizan secuencias promotoras potentes y
un elevado número de copias de plásmidos que pueden ser utilizadas
para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. La
levadura reconoce la secuencia líder sobre los productos génicos de
mamíferos clonados y secreta péptidos que portan las secuencias
líder (es decir pre-péptidos).
Tras la introducción del vector, se hacen crecer
las células huésped en un medio selectivo, que selecciona el
crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de
la secuencia o las secuencias génicas clonadas da como resultado la
producción de las proteínas deseadas.
La purificación de las proteínas recombinantes
se lleva a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos para
este propósito.
\vskip1.000000\baselineskip
El hibridoma TBP-II
70-2 fue consignado en la Collection National de
Cultures de Microorganismes, Institute Pasteur (CNCM) el 12 de Marzo
de 1.990 y se le asignó el número I-928.
El hibridoma TBP-II
32-5 fue consignado en la (CNCM) el 1 de Septiembre
de 1.993 y se le asignó el número
I-1358.
I-1358.
Los hibridomas TBP-II
70-2 y TBP-II 32-5
consignados son subclones de los hibridomas TBP-II
70 y TBP-II 32, respectivamente y tienen propiedades
idénticas. La producción y clonación de estos hibridomas ha sido
descrita en EP-A 398.327.
Claims (21)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. El uso de un ligando para un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral/factor de crecimiento nervioso (TNF/NGF) que se une a la región del bucle de cisteína C terminal de semejante receptor y que es inhibidor de la señalización para el efecto citocida de dicho receptor sin bloquear la unión del TNF o del ligando natural receptivo al receptor, donde en el bucle de cisteína se incluye la secuencia de aminoácidos cys-163 a thr-179 del TNF-R p75 (Fig. 5), o un bucle de cisteína C-terminal correspondiente en otro miembro de la familia de receptores TNF/NGF, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de choque séptico, caquexia, enfermedad injerto-versus-huésped y enfermedades autoinmunes, en particular artritis reumatoide, donde dichos ligando es un anticuerpo, un derivado peptídico de ellos o una sal o muteina de dicho anticuerpo. - 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ligando comprende un ligando para un TNF-R.
- 3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el receptor es el TNF-R p75.
- 4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ligando incluye la secuencia de aminoácidos de la región CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Núm. 32 mostrada en la Fig. 12.
- 5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ligando incluye la secuencia de aminoácidos de la región CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Nº57 mostrada en la Fig. 11.
- 6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ligando incluye la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo originado contra el bucle C terminal de un miembro de la familia de receptores de TNF/NGF.
- 7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ligando comprende el scFv de un anticuerpo monoclonal nº 32 (CNCM 1-1358) ó 70 (CNCM 1-928).
- 8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 donde el ligando incluye cadenas laterales de polietilenglicol.
- 9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde el ligando es una proteína de fusión que comprende dicho ligando que todavía se une a la región del bucle de cisteína C terminal del receptor de TNF/NGF y que todavía es inhibidor de la señalización para el efecto citocida de dicho receptor.
- 10. Un ligando según la reivindicación 1 que comprende el scFv del anticuerpo monoclonal Nº32 (CNCM1-1358).
- 11. Un ligando según la reivindicación 1 que incluye la secuencia de aminoácidos de la región CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Nº 32 mostrada en la Fig. 12.
- 12. Un ligando según la reivindicación 1 que incluye la secuencia de aminoácidos de la región CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Nº 57 mostrada en la Fig. 11.
- 13. Una molécula de ADN que codifica un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, capaz de expresar semejante ligando.
- 14. Una molécula de ADN que hibrida con una molécula de ADN según la reivindicación 13 y capaz de expresar un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
- 15. Un vehículo de expresión replicable que comprende una molécula de ADN según la reivindicación 13 o 14, y capaz de expresar un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en una célula huésped transformante.
- 16. Una célula huésped transformada con el vehículo de expresión replicable de la reivindicación 15.
- 17. Una célula huésped según la reivindicación 16, que es una célula procariota.
- 18. Una célula huésped según la reivindicación 16, que es una célula eucariota.
- 19. Un procedimiento para la producción de un ligando recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende cultivar una célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 y recuperar el ligando recombinante.
- 20. Una composición farmacéutica que comprende un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
- 21. Un ligando de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que incluye cadenas laterales de polietilinglicol que todavía se une a la región del bucle de cisteína C terminal del receptor de TNF/NGF y que todavía es inhibidor de la señalización para el efecto citocida de dicho receptor.
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