ES2177474T3

ES2177474T3 - Sensor desechable y metodo para su fabricacion.

Info

Publication number: ES2177474T3
Application number: ES00938127T
Authority: ES
Inventors: Handani Winarta; Xiaohua Cai; Fung Seto; Chung Chang Young
Original assignee: Nova Biomedical Corp
Current assignee: Nova Biomedical Corp
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: US6287451B1; ATE273511T1; JP2003501627A; WO2000073785A2; DE60012946D1; CA2375092A1; JP4060078B2; AU5321200A; ES2177474T1; WO2000073785A3; DE1212609T1; EP1212609B1; EP1212609A2; DE60012946T2; CA2375092C

Abstract

Tira de electrodo desechable para analizar una muestra fluida que comprende: una tira laminada que tiene un primer extremo de tira, un segundo extremo de tira y una abertura de ventilación espaciada desde dicho primer extremo de tira, comprendiendo dicha tira laminada una capa base con al menos tres electrodos delineados sobre ella, una capa de retención del reactivo dispuesta sobre dicha capa base, teniendo dicha capa de retención del reactivo al menos dos ventanillas, una capa de formación de canal dispuesta sobre dicha capa de retención del reactivo, y una cubierta; un canal encerrado entre dicho primer extremo de tira y dicha abertura de ventilación, conteniendo dicho canal encerrado al menos dichas dos ventanillas; un primer reactivo dispuesto en una primera ventanilla de dichas al menos dos ventanillas formando un electrodo de referencia; un segundo reactivo dispuesto en una segunda ventanilla de dichas al menos dos ventanillas formando un primer electrodo de trabajo, siendo dicho segundo reactivo sustancialmente similar a dicho primer reactivo y que contiene una enzima; y contactos conductores en dicho segundo extremo de tira y aislados de dicho canal encerrado.

Description

Sensor desechable y método para su fabricación.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a sensores electroquímicos que se pueden usar para la cuantificación de un componente o analito específico en una muestra líquida. Concretamente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico nuevo y mejorado y a un método nuevo y mejorado para fabricar sensores electroquímicos. Más concretamente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico desechable cuya producción es económica. Aún más concretamente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico desechable que da lecturas precisas en presencia de interferentes y células sanguíneas rojas variables (hematocrito). Todavía más concretamente, esta invención se refiere a sensores electroquímicos desechables que se usan para realizar análisis electroquímicos para la determinación precisa de analitos en fluidos fisiológicos.

2. Descripción de la técnica anterior

Los biosensores se conocen desde hace más de tres décadas. Se usan para determinar las concentraciones de diversos analitos en los fluidos. La medición de la glucosa en sangre es especialmente interesante. Se conoce bien que la concentración de la glucosa en sangre es extremadamente importante para mantener la homeostasis. Los productos que miden las fluctuaciones en el azúcar en sangre de una persona, por ejemplo, o niveles de glucosa, se han convertido en requisitos indispensables cotidianos para muchos de los millones de diabéticos de la nación. Debido a que este trastorno puede causar anomalías peligrosas en la química sanguínea y se cree que contribuye a la pérdida de la visión y la insuficiencia renal, la mayoría de los diabéticos necesitan analizarse ellos mismos periódicamente y ajustar su nivel de glucosa en consecuencia, por lo general, con inyecciones de insulina. Si la concentración de la glucosa en sangre está por debajo del intervalo normal, los pacientes pueden padecer inconsciencia y presión sanguínea más baja que puede incluso producir la muerte. Si la concentración de la glucosa en sangre es superior al intervalo normal, la glucosa en sangre excedente puede producir la síntesis de los ácidos grasos y el colesterol y, en los diabéticos, el coma. Así, la medición de los niveles de glucosa en sangre se ha convertido en un requisito indispensable para los individuos diabéticos que controlan sus niveles de glucosa en sangre mediante la terapia de insulina.

A los pacientes que dependen de la insulina los médicos les mandan que comprueben sus niveles de azúcar en sangre hasta cuatro veces al día. Para adaptar un estilo de vida normal a la necesidad de supervisar con frecuencia los niveles de glucosa, el análisis doméstico de la glucosa en sangre se hizo disponible con el desarrollo de las tiras de reactivos para el análisis de sangre completo.

Un tipo de biosensores de la glucosa en sangre es un electrodo de enzima combinado con un compuesto mediador que transporta constantemente electrones entre la enzima y el electrodo, produciendo una señal de corriente mensurable cuando la glucosa está presente. Los mediadores usados más comúnmente son el ferricianuro potásico, el ferroceno y sus derivados, así como otros complejos metálicos. Se han descrito muchos sensores basados en este segundo tipo de electrodo. Ejemplos de este tipo de dispositivo se describen en las patentes siguientes.

La patente U.S. No. 5.628.890 (1997, Carter y col.) describe una tira de electrodo con un soporte de electrodo, un electrodo de referencia o contador dispuesto en el soporte, un electrodo de trabajo espaciado del electrodo de referencia o contador en el soporte, una capa de recubrimiento que define un espacio cerrado sobre los electrodos de referencia y de trabajo y con una abertura para recibir una muestra en el interior del espacio cerrado y una pluralidad de capas de malla intercaladas en el espacio cerrado entre la capa de recubrimiento y el soporte. La capa de recubrimiento tiene una abertura de aplicación de la muestra espaciada de los electrodos. El electrodo de trabajo incluye una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato para la enzima y un mediador capaz de transferir electrones entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo.

Este dispositivo propone reducir el efecto hematocrito en las lecturas del sensor. Según la descripción, esto resulta de la separación flujo abajo del electrodo de referencia respecto al electrodo de trabajo en combinación con la capa fina de la solución de la muestra creada por las capas de malla.

La patente U.S. No. 5.708.247 (1998, McAleer y col.) describe una tira de prueba de glucosa desechable con un sustrato, un electro de referencia, un electrodo de trabajo y un medio para hacer una conexión eléctrica. El electrodo de trabajo tiene una capa base conductora y una capa de revestimiento dispuesta sobre la capa base conductora. La capa de revestimiento es una carga con regiones superficiales tanto hidrófoba como hidrófila que forman una red, un enzima y un mediador.

La patente U.S. No. 5.682.884 (1997, Hill y col.) describe un electrodo de tira con estampación por serigrafía. La tira tiene un soporte alargado que incluye un primer y segundo conductor, extendiéndose cada uno a lo largo del soporte. Un electrodo activo, situado para entrar en contacto con la mezcla líquida y el primer conductor, tiene un depósito de una enzima capaz de catalizar una reacción y un mediador de electrones. Un electrodo de referencia está situado para entrar en contacto con la mezcla y el segundo conductor.

La patente U.S. No. 5.759.364 (1998, Charlton y col.) describe un biosensor electroquímico con una placa base aislante que lleva un electrodo en su superficie que reacciona con un analito para producir electrones móviles. La placa base está unida a una tapa de material deformable que tiene un área cóncava rodeada por una superficie plana, de modo que cuando está unida a la placa base se forma un espacio capilar en el que se puede introducir una muestra de análisis fluida. El lado de la tapa opuesto a la base está revestido con un material polimérico que sirve para adherir la tapa a la placa base y para aumentar el carácter hidrófilo del espacio capilar.

La patente U.S. No. 5.762.770 (1998, Pritchard y col.) describe una tira de análisis de biosensor electroquímico que tiene un requisito mínimo de volumen de muestra sanguínea de alrededor de 9 microlitros. La tira de prueba tiene electrodos de trabajo y contador que sustancialmente tienen el mismo tamaño y están hechos del mismo material conductor eléctricamente colocado en un primer sustrato aislante. Recubriendo los electrodos está un segundo sustrato aislante que incluye una porción de ventanilla que forma una cavidad de reactivo. La porción de ventanilla expone un área del electrodo contador menor que del electrodo de trabajo. Un reactivo para el análisis de un analito cubre sustancialmente las áreas expuestas de los electrodos de trabajo y contador en la cavidad de reactivo. Recubriendo la cavidad de reactivo y unida a un segundo sustrato aislante está una malla dispersiva que está impregnada con un tensioactivo.

La patente U.S. No. 5.755.953 (1998, Henning y col.) describe un biosensor de interferencia reducida. El dispositivo comprende generalmente un electrodo usado para medir electroquímicamente la concentración de un analito de interés en una solución. El dispositivo incluye una enzima de peroxidasa fijada mediante enlace covalente con carbono en micropartículas y retenida en una matriz en estrecho contacto con el electrodo. Según esta descripción, la enzima/carbono en micropartículas del dispositivo es lo que proporciona una composición que presenta poca sensibilidad a las sustancias interferentes conocidas.

La patente U.S. No. 5.120.420 (1992, Nankai y col.) describe un biosensor con una plancha base con un sistema de electrodos hecho principalmente de carbono, una capa aislante, una capa de reacción que contiene una capa de encima sobre ésta, un espaciador y una cubierta. El espaciador crea un canal con una entrada y una salida para contener una muestra. El documento EP 0 735 363 A1 describe un biosensor de tira desechable para medir una concentración de una sustancia, por ejemplo, la glucosa, en una muestra sanguínea. El biosensor está formado como una tira laminada que comprende un sustrato aislante, un espaciador y una cubierta con una abertura de ventilación. En el sustrato están impresos los sistemas de electrodos principal y auxiliar, estando compuesto cada sistema de electrodos de un electrodo de trabajo y un electrodo contador. Cada sistema de electrodos está cubierto por una capa de reacción que contiene un polímero hidrófilo en el que están incorporados los reactivos requeridos para una reacción electroenzimática. El espaciador intercalado entre el sustrato y la cubierta está formado con una ventanilla que define un canal que expone los sistemas de electrodos. El canal se extiende a lo largo de una distancia desde un extremo de entrada de suministro del biosensor. La abertura de ventilación abierta en la cubierta expone una porción de extremo distante del canal.

El documento US 5.437.999 describe un método para fabricar electrodos biocompatibles de resolución elevada. A un primer sustrato aislante se une material electroconductor. Un segundo sustrato aislante se une después al material electroconductor y se estampa usando fotolitografía para definir un área de electrodo expuesta. Un sensor electroquímico se fabrica disponiendo dos electrodos de forma opuesta o adyacente y aplicando un reactivo a una o ambas áreas de electrodo de los electrodos.

Por el documento WO 99/13099 A1, se conoce una tira de sensor electroquímico que comprende un cuerpo laminado que consta de una pluralidad de capas superpuestas. Una capa base está formada de material aislante y está provista de una pluralidad de pistas conductoras impresas sobre ésta. Varias capas dieléctricas, teniendo cada una de ellas una porción de ventanilla, se colocan una sobre otra sobre la capa base con las porciones de ventanillas dispuestas de modo que se expone una disposición de electrodos formada por áreas de trabajo de las pistas conductoras. Entre cada par de capas dieléctricas adyacentes están dispuestas capas de malla, recubriendo estas capas de malla la disposición de electrodos. Una abertura en una capa superior permite la aplicación de una muestra fluida.

No obstante, los dispositivos de la técnica anterior padecen diversos inconvenientes. Uno de estos inconvenientes es la interferencia con las lecturas del biosensor causada por otras sustancias en el fluido de muestra que se pueden oxidar al mismo potencial. Entre éstas predominan el ácido ascórbico, el ácido úrico y el paracetamol. Al oxidarse estas y otras sustancias interferentes, la corriente que resulta de su oxidación se añade a la corriente que resulta de la oxidación del analito sanguíneo que se está midiendo, y es indistinguible de ésta. Por consiguiente, se produce un error en la cuantificación del analito sanguíneo.

Otro inconveniente es la interferencia causada por las células sanguíneas rojas (el efecto hematocrito). Esta interferencia tiende a causar una velocidad de respuesta artificialmente elevada para niveles de hematocrito reducidos y, a la inversa, una velocidad de respuesta artificialmente reducida para niveles de hematocrito elevados.

Inconvenientes adicionales de los dispositivos de la técnica anterior son que tienen un intervalo lineal más limitado y requieren una cantidad relativamente grande de volumen de muestra. Además, requieren un tiempo de espera relativamente más largo para el desarrollo de una respuesta de estado estacionario antes de que se pueda lograr una lectura. Cada uno de estos inconvenientes puede, bien individualmente o bien combinado con uno o más de los otros inconvenientes, contribuir a lecturas de medición erróneas durante el análisis. Las pruebas preliminares realizadas por los inventores de la presente invención han mostrado que la técnica anterior que reivindica reducir el efecto hematocrito en las lecturas de glucosa se limitaba a concentraciones de glucosa reducidas, y sólo funcionaba en éstas.

Debido a la importancia de obtener lecturas de glucosa precisas, sería muy conveniente desarrollar un sensor electroquímico fiable y fácil de utilizar que no tenga todos los inconvenientes mencionados anteriormente.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un dispositivo de tira desechable alternativo para analizar una muestra fluida que permita lecturas precisas y fiables.

Para lograr este objeto, la presente invención proporciona una tira de electrodo desechable según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. La presente invención proporciona además un método para usar una tira de electrodo para determinar la concentración de un analito según la reivindicación 31. Asimismo, la presente invención proporciona un método para hacer sensores desechables múltiples según la reivindicación 36.

La invención permite proporcionar un sensor electroquímico que incorpora un electrodo corrector de interferencias para minimizar la interferencia causada por sustancias oxidables presentes en la muestra fluida. La respuesta del sensor electroquímico puede ser sustancialmente independiente de los niveles de hematocrito de la muestra fluida. Un sensor electroquímico construido según los principios de la presente invención requiere un volumen de muestra menor que el que requería previamente la técnica anterior. Además, puede tener un amplio intervalo de medición lineal, esto es, tiene un efecto de interferencia reducido o insignificante y se puede usar en una amplia concentración de glucosa.

La presente invención tiene un cuerpo alargado laminado con un canal del fluido de muestra conectado entre una abertura en un extremo del cuerpo laminado y un orificio de ventilación espaciado de la abertura. Dentro del canal del fluido están situados al menos dos electrodos de trabajo y un electrodo de referencia. La disposición de los dos electrodos de trabajo y el electrodo de referencia no es importante para los fines de los resultados obtenidos del sensor electroquímico. Los electrodos de trabajo y el electrodo de referencia están cada uno en contacto eléctrico con conductos conductores independientes, respectivamente. Los conductos conductores independientes terminan en un dispositivo de lectura, y están expuestos para hacer una conexión eléctrica con éste, en el extremo opuesto al extremo abierto del canal del cuerpo laminado.

El cuerpo laminado tiene una capa base aislante hecha de un material de plástico. En la capa base aislante están delineados varios conductos conductores. Los conductos conductores se pueden depositar sobre la capa aislante mediante estampación por serigrafía, mediante deposición en fase de vapor o mediante cualquier método que proporcione una capa conductora que se adhiera a la capa base aislante. Los conductos conductores se pueden depositar individualmente en la capa aislante o se puede disponer una capa conductora sobre la capa aislante seguido del decapado/trazado del número requerido de conductos conductores. El procedimiento de decapado se puede llevar a cabo químicamente, trazando mecánicamente líneas en la capa conductora, usando un láser para trazar la capa conductora como conductos conductores independientes o por cualquier medio que cause una ruptura entre los conductos conductores independientes requeridos por la presente invención. Los revestimientos conductores preferentes son la película de oro o una composición de película de óxido de estaño/oro. Se debe señalar que, aunque se usa la misma sustancia electroconductora (película de oro o película de óxido de estaño/oro), después del estriado como material conductor tanto para los electrodos de trabajo como para el electrodo de referencia, este material en sí no puede funcionar como un electrodo de referencia. Para hacer que funcione el electrodo de referencia, debe haber una reacción redox (por ejemplo,
Fe(CN)_{6}^{3-} + e^{-} \rightarrow Fe(CN)_{6}^{4-}) en el material electroconductor cuando se aplica un potencial. Por consiguiente, debe estar presente un mediador redox en el material conductor usado para el electrodo de referencia.

Encima de la capa base aislante y los conductos conductores, el cuerpo laminado tiene una primera capa media aislante que contiene ventanillas para al menos dos electrodos de trabajo y un electrodo de referencia. La primera capa media aislante se puede describir también como la capa que contiene al reactivo. Uno de los electrodos de trabajo y el electrodo de referencia pueden compartir la misma ventanilla, siempre que el material del electrodo (descrito más adelante) dispuesto en la ventanilla esté estriado para aislar el electrodo de trabajo del electrodo de referencia. Cuando se usan tres ventanillas, cada ventanilla corresponde a y expone una pequeña porción de un único conducto conductor. Las ventanillas para los electrodos de trabajo tienen sustancialmente el mismo tamaño. La ventanilla para el electrodo de referencia puede tener el mismo o diferente tamaño que las ventanillas para los electrodos de trabajo. La colocación de todas las ventanillas es tal que todas coexistirán dentro del canal del fluido de muestra descrito anteriormente. Esta primera capa media aislante está hecha también de un material dieléctrico aislante, preferentemente de plástico, y puede hacerse cortando a troquel el material mecánicamente o con un láser y sujetando después el material a la capa base. Se puede usar un adhesivo, como, por ejemplo, un adhesivo sensible a la presión, para fijar la primera capa media aislante a la capa base. La adhesión se puede llevar a cabo también adhiriendo mediante ultrasonidos la primera capa media a la capa base. La primera capa media aislante se puede hacer también estampando por serigrafía la primera capa media aislante sobre la capa base.

El grosor de la primera capa media debe ser un grosor suficiente para cargar una cantidad suficiente de material de electrodo para su uso como un sensor electroquímico. Cada ventanilla contiene material de electrodo. El material de electrodo tiene un mediador redox con al menos un estabilizante, un aglutinante, un tensioactivo o un tampón. Al menos una de las ventanillas contiene también una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato para la enzima. El mediador redox es capaz de transferir electrones entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo.

El cuerpo laminado tiene también una segunda capa media aislante encima de la primera capa media. La segunda capa media está hecha también de un material aislante de plástico y crea el canal del fluido de muestra del cuerpo laminado. La segunda capa media se puede describir también como la capa formadora del canal. Contiene una ventanilla con forma de U en un extremo que recubre las ventanillas de la primera capa media, correspondiendo el extremo abierto al extremo abierto del cuerpo laminado descrito anteriormente.

El cuerpo laminado de la presente invención tiene una capa superior con una abertura de ventilación. La abertura de ventilación está situada de tal modo que al menos una porción de la abertura de ventilación recubre la parte inferior de la ventanilla con forma de U de la segunda capa media aislante. La ventilación permite que el aire del canal del fluido de muestra escape al entrar el fluido de muestra en el extremo abierto del cuerpo laminado. El fluido de muestra generalmente llena el canal del fluido de muestra mediante acción capilar. En situaciones de volúmenes pequeños, el grado de la acción capilar depende del carácter hidrófobo/hidrófilo de las superficies en contacto con el fluido que experimenta la acción capilar. Esto se conoce también como la capacidad de humectación del material. Las fuerzas capilares se aumentan bien usando un material aislante hidrófilo para formar la capa superior o bien revistiendo al menos una porción de un lado de un material aislante hidrófobo con una sustancia hidrófila en el área de la capa superior que está enfrente del canal del fluido de muestra entre el extremo abierto del cuerpo laminado y la abertura de ventilación de la capa superior. Se debe comprender que se puede revestir un lado entero de la capa superior con la sustancia hidrófila y después adherir a la segunda capa media.

Las capas aislantes del cuerpo laminado pueden estar hechas de cualquier material dieléctrico. El material preferente es un material de plástico. Ejemplos de composiciones aceptables para su uso como material dieléctrico son el cloruro de polivinilo, el policarbonato, la polisulfona, el nilón, el poliuretano, el nitrato de celulosa, el propionato de celulosa, el acetato de celulosa, el acetato-butirato de celulosa, el poliéster, el acrílico y el poliestireno.

El número de ventanillas en la primera capa media puede ser dos y tres o más.

En una forma de realización con dos ventanillas, una de las ventanillas que contiene material de electrodo está estriada en dos partes, sirviendo una parte como un primer electrodo de trabajo y sirviendo la segunda parte como el electrodo de referencia. La segunda ventanilla sirve como un segundo electrodo de trabajo. Esta versión de la forma de realización de dos ventanillas tiene las características de corrección de interferencia y hematocrito pero también tiene en cuenta la medición de un volumen de muestra aún menor que el de la forma de realización de tres ventanillas.

En la forma de realización de tres ventanillas, dos ventanillas contienen material para los electrodos de trabajo (W1 y W2) y una para el electrodo de referencia (R). W2 contiene además la enzima capaz de catalizar un sustrato de la enzima. Los tres electrodos están situados y dimensionados de tal modo que la resistencia de la muestra fluida podría medirse con precisión y se podría minimizar el posible remanente de W2. Las disposiciones de electrodo posibles dentro del canal del fluido de muestra pueden ser W1-W2-R, W1-R-W2, R-W1-W2, W2-W1-R, W2-R-W1 o R-W2-W1, presentándose la disposición enumerada como la disposición de electrodos desde el extremo abierto del cuerpo laminado a la abertura de ventilación. Se comprobó que la posición preferente era W1-R-W2; esto es, al entrar el fluido de muestra en el extremo abierto del cuerpo laminado, el fluido cubría W1 en primer lugar, después R y después W2. La posición preferente tiene en cuenta la medición precisa de la resistencia de la muestra sanguínea. Esto es necesario para una buena correlación entre la resistencia y el nivel del hematocrito en la muestra sanguínea.

Como se mencionó antes, los interferentes oxidables, como, por ejemplo, el ácido ascórbico, el ácido úrico y el paracetamol, entre otros, causan lecturas imprecisas en la salida de un biosensor electroquímico. La presente invención anula este efecto restando la respuesta de corriente en W1 (primer electrodo de trabajo) de la respuesta de corriente de W2 (segundo electrodo de trabajo) para calcular la concentración de la enzima en el fluido de muestra. Esto se logra manteniendo el área superficial de W1 sustancialmente igual que el área superficial de W2. También es importante la composición de los reactivos dispuestos en W1 y W2. Los reactivos están diseñados para que tengan un efecto mínimo en la respuesta de las interferencias, lo que también contribuye a la precisión de la medición del analito.

La interferencia del hematocrito se reduce usando un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se mide la resistencia (valor-r) entre W1 (primer electrodo de trabajo) y R (electrodo de referencia). El valor-r se usa después para estimar el nivel de hematocrito en el fluido de la muestra. La ecuación siguiente es una representación de esta relación:

Ec. (1)r = k_{1}/ (1-H)

en la que

: r es el valor de la resistencia medido en ohmios o kilo-ohmios

: H es el nivel de hematocrito

: k_{1} es una constante igual a 4,6 (r medido en kilo-ohmios).

En segundo lugar, el nivel de hematocrito se usa después para corregir matemáticamente la concentración de la enzima obtenida de lo anterior. La ecuación siguiente es una representación del cálculo realizado usando el nivel de hematocrito calculado a partir de la Ec. (1):

Ec. (2)C_{corr} = C_{med} / (k_{2}+k_{3}C_{med}+(k_{4}+k_{5} C_{med})(1-H))

en la que

: C_{corr} es la concentración de analito corregida

: C_{med} es la concentración de analito medida

: k_{2} es una constante igual a 1,03

: k_{3} es una constante igual a -0,003

: k_{4} es una constante igual a -0,1

: k_{5} es una constante igual a 0,0054

: H es el nivel de hematocrito calculado a partir de la Ec. (1).

Los valores constantes anteriores se han determinado para la forma de realización preferente de la presente invención. Variar el área superficial de las áreas de electrodo y las formulaciones de los reactivos puede requerir a un experto en la técnica calcular nuevos valores para las constantes k_{1}-k_{5} para determinar con más precisión la concentración de glucosa corregida.

Todas las ventajas de la presente invención se harán más claras con la revisión de la descripción detallada, dibujos y reivindicaciones anexas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es una vista en perspectiva de la presente invención que muestra el extremo abierto, la ventilación y los puntos de contacto eléctrico del cuerpo laminado.

Figura 2 es una vista en perspectiva en despiece de la presente invención que muestra las diversas capas del cuerpo laminado.

Figuras 3A, 3B, 3C y 3D son vistas desde arriba de una tira de cada capa de la presente invención que muestran los patrones para hacer múltiples sensores de la presente invención.

Figura 3E es una vista desde arriba de un segmento de la tira laminada de la presente invención que muestra los patrones para hacer múltiples sensores de la presente invención.

Figuras 4A y 4B son gráficas que muestran el efecto hematocrito en la respuesta de la concentración de la presente invención en concentraciones de glucosa en sangre normal y elevada.

Figura 5 es una correlación del volumen de muestra en la respuesta de la concentración de la presente invención.

Figura 6 es una curva de correlación de las lecturas de la concentración usando sensores de la presente invención frente a las lecturas de la concentración obtenidas en las mismas muestras usando un analizador de glucosa YSI.

Descripción detallada de la forma de realización preferente

La forma de realización preferente de la presente invención se ilustra en las Figuras 1-6. La Figura 1 muestra un sensor 10 de la presente invención. El sensor 10 tiene un cuerpo laminado 100, un extremo de muestreo del fluido 110, un extremo del contacto eléctrico 120 y una abertura de ventilación 52. El extremo de muestreo del fluido 110 incluye un canal del fluido de muestra 112 entre una abertura del extremo de muestreo 114 y la abertura de ventilación 52. El extremo del contacto eléctrico 120 tiene al menos tres contactos conductores discretos 122, 124 y 126.

Haciendo referencia ahora a la Figura 2, el cuerpo laminado 100 está compuesto de una capa base aislante 20, una primera capa media 30, una segunda capa media 40 y una capa superior 50. Todas las capas están hechas de un material dieléctrico, preferentemente de plástico. Ejemplos de un material dieléctrico preferente son el cloruro de polivinilo, el policarbonato, la polisulfona, el nilón, el poliuretano, el nitrato de celulosa, el propionato de celulosa, el acetato de celulosa, el acetato-butirato de celulosa, el poliéster, el acrílico y el poliestireno. La capa base aislante 20 tiene una capa conductora 21 sobre la que está delineado un primer conducto conductor 22, un segundo conducto conductor 24 y un tercer conducto conductor 26. Los conductos conductores 22, 24 y 26 se pueden formar trazando o estriando la capa conductora 21 como se ilustra en la Fig. 2 o estampando por serigrafía los conductos conductores 22, 24 y 26 sobre la capa base 20. El trazado o estriado de la capa conductora 21 se puede hacer trazando mecánicamente la capa conductora 21 lo suficiente como para crear los tres conductos conductores independientes 22, 24 y 26. El método preferente de trazado o estriado de la presente invención está hecho usando un láser de dióxido de carbono (CO_{2}), un láser YAG o un láser excimer. Se puede hacer una línea de estriado adicional 28 (aumentada y no a escala; sólo con fines ilustrativos), pero no es necesaria para la funcionalidad del sensor 10, a lo largo del borde exterior de la capa base 20 para evitar los problemas potenciales de electricidad estática que podrían dar lugar a una señal confusa. La capa conductora 21 se puede hacer de cualquier material conductor eléctricamente, preferentemente oro u óxido de estaño/oro. Un material utilizable para la capa base 20 es una película de poliéster de óxido de estaño/oro (No. de Cat. FM-1) o una película de poliéster de oro (No. de Cat. FM-2) vendido por Courtaulds Performance Films, Canoga Park, California (EE.UU.)

La primera capa media 30 tiene una primera ventanilla de electrodo 32 que expone una porción del primer conducto conductor 22, una segunda ventanilla de electrodo 34 que expone una porción del segundo conducto conductor 24 y una tercera ventanilla de electrodo 36 que expone una porción del tercer conducto conductor 26. La primera capa media 30 está hecha de un material de plástico, preferentemente una cinta de calidad médica por un solo lado comercializada por Adhesive Research, Inc., de Glen Rock, Pensilvania (EE.UU.) Los grosores de la cinta aceptables para el uso en la presente invención están en el intervalo de alrededor de 0,003 pulgadas (0,76 mm) a alrededor de 0,005 pulgadas (0,127 mm). Una cinta de este tipo, Arcare® 7815, se prefirió debido a su facilidad de manejo y mostró buen rendimiento por lo que se refiere a su capacidad de contener una cantidad suficiente de los reactivos químicos y promover una velocidad de flujo sanguíneo favorable (acción capilar) a través del canal del fluido 112 del sensor 10. Se debe comprender que no se requiere el uso de una cinta. Una capa aislante de plástico puede revestirse con un adhesivo sensible a la presión, o puede adherirse mediante ultrasonidos a la capa base 20, o se puede estampar por serigrafía sobre la capa base 20 para lograr los mismos resultados que usando la cinta de poliéster mencionada.

Las tres ventanillas 32, 34 y 36 definen áreas de electrodo W1, R y W2, respectivamente, y contienen reactivos químicos que forman dos electrodos de trabajo y un electrodo de referencia. Típicamente, el área de electrodo R se debe cargar con un reactivo o mediador redox para hacer la función de electrodo de referencia. Si R no está cargado con un reactivo o mediador redox, los electrodos de trabajo W1 y W2 no funcionarán. Las áreas de electrodo W1 y R están cargadas preferentemente con el mismo reactivo químico, descrito en el presente documento como un primer reactivo y hecho preferentemente mediante el procedimiento descrito en el apartado "Reactivo 1" más adelante, para facilitar la medición de la resistencia antes descrita. Los reactivos contienen preferentemente una forma oxidada de mediador redox, un estabilizante, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. Típicamente, el mediador redox puede ser al menos ferroceno, ferricianuro potásico u otros derivados del ferroceno. El estabilizante preferente es polietilenglicol, el aglutinante preferente es metilcelulosa, el tensioactivo preferente es t-octilfenoxi-polietoxietanol y el tampón preferente es un tampón de citrato. El área de electrodo W2 está cargada preferentemente con los mismos reactivos químicos cargados en las áreas de electrodo W1 y R pero con la adición de una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato para la enzima o un sustrato reactivo catalíticamente con una enzima y un mediador capaz de transferir electrones transferidos entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo para crear una corriente representativa de la actividad de la enzima o el sustrato y representativa del compuesto. El reactivo en el área de electrodo W2, descrito en este documento como un segundo reactivo, está hecho preferentemente mediante el procedimiento descrito en el apartado "Reactivo 2" más adelante.

Las ventanillas y áreas de electrodo de la primera capa 30 están situadas relativas entre sí y al flujo del fluido de muestra en el canal del fluido de muestra 112 de tal modo que la resistencia del fluido de muestra se puede medir con precisión y se podría minimizar el posible remanente del área de electrodo W2 al área de electrodo W1. Usando el extremo de la muestra fluida 110 del sensor 10 como un punto de referencia, las disposiciones de las áreas de electrodo podrían ser W1-W2-R, W1-R-W2, R-W1-W2, W2-W1-R, W2-R-W1 o R-W2-W1. Se encontró que la posición preferente era W1-R-W2.

La segunda capa media 40 tiene una ventanilla de canal con forma de U 42 situado en el extremo del sensor de la capa segunda 41. La longitud de la ventanilla del canal 42 es tal que, cuando la segunda capa media 40 está extendida encima de la primera capa media 30, las áreas de electrodo W1, W2 y R están dentro del espacio definido por la ventanilla de canal 42. Se encontró que el grosor de la segunda capa media 40 era crítico para la velocidad del flujo del fluido de muestra en el interior del canal 112, que se llena mediante acción capilar del fluido de muestra.

La capa superior 50, que está colocada sobre la segunda capa media 40, tiene una abertura de ventilación 52 espaciada del extremo de la muestra fluida 110 del sensor 10 para asegurar que el fluido de muestra en el canal del fluido 112 cubrirá completamente las áreas de electrodo W1, W2 y R. La abertura de ventilación 52 está colocada en la capa superior 50, de modo que se alineará algo con el fondo de la ventanilla de canal 42 de la segunda capa media 40. Preferentemente, la abertura de ventilación 52 expondrá y recubrirá parcialmente una porción del fondo de la ventanilla con forma de U de la segunda capa media 40.

Preparación de los reactivos 1 y 2

Los reactivos 1 y 2 comprenden la forma oxidada de un mediador redox, un estabilizante, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. El reactivo 2, además, contiene una enzima. Se comprobó que la forma oxidada del mediador redox, el ferricianuro potásico, era estable en las matrices. La cantidad usada en la formulación debe ser suficiente para alcanzar un intervalo lineal práctico. La enzima debe tener también suficiente actividad, pureza y estabilidad. Una glucosa-oxidasa comercializada se puede obtener de Biozyme, San Diego, California (EE.UU.) como el No. de cat. G03A, alrededor de 270 U/mg. El estabilizante debe ser suficientemente soluble en agua y ser capaz de estabilizar tanto el mediador como la enzima. El aglutinante debe ser capaz también de fijar todos los demás productos químicos en los reactivos de las áreas de electrodo W1, W2 y R a la superficie/capa conductora 21 de la capa base 20. El estabilizante preferido es el polietilenglicol (No. de cat. P4338, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, EE.UU.) El aglutinante preferido es Methocel 60 HG (No. de cat. 64655, Fluka Chemical, MilWaukee, Wisconsin, EE.UU.) La solución tampón debe tener suficiente capacidad tampón y valor de pH para optimizar la reacción de la enzima. Se prefiere un tampón de citrato de 0,05M. El tensioactivo es necesario para facilitar la dispensación de los Reactivos 1 y 2 a las ventanillas 32, 34 y 36 de la capa media 30, así como para disolver rápidamente los reactivos químicos secos. La cantidad y tipo de tensioactivo se selecciona para asegurar las funciones mencionadas previamente y para evitar un efecto desnaturalizante en la enzima. El tensioactivo preferente es el Triton X-100. Los reactivos se preparan de la siguiente forma:

Reactivo 1

Etapa 1

Preparar 50 mM de tampón de citrato (pH 5,7) disolviendo 0,1512 gramos de ácido cítrico y 1,2580 gramos de citrato de sodio en 100 ml de agua desionizada.

Etapa 2

Preparar una solución de methocel 60HG al 1% agitando 1 gramo de methocel en 100 ml de tampón de citrato de la Etapa 1 durante 12 horas.

Etapa 3

Añadir 0,3 ml de Triton X-100 al 10% a la solución de methocel.

Etapa 4

Añadir 2,5 gramos de polietilenglicol a la solución de la Etapa 3.

Etapa 5

Mientras se agita, añadir 1 gramo de ferricianuro potásico a la solución de la Etapa 4.

Reactivo 2

Etapa 1-Etapa 4

Mismas etapas que el Reactivo 1.

Etapa 5

Mientras se agita, añadir 6,5 gramos de ferricianuro potásico a la solución de la Etapa 4.

Etapa 6

Añadir 1,0 gramos de glucosa-oxidasa a la solución de la Etapa 5 y agitar durante 10 minutos o hasta que todos los materiales sólidos estén completamente disueltos.

Construcción del electrodo

Se corta a la forma adecuada, como se ilustra en la Fig. 2, un fragmento de una película de poliéster de óxido de estaño/oro comercializada por Courtaulds Performance Films, que forma la capa base 20 del sensor 10. Se usó un láser de CO_{2} para estriar la película de poliéster de óxido de estaño/oro. Como se ilustra en la Fig. 2, la película se estrió mediante el láser de tal modo que se formaron tres electrodos en el extremo del fluido de muestra 110 y tres puntos de contacto 122, 124 y 126 en el extremo del contacto eléctrico 120. La línea de estriado es muy fina pero suficiente para crear tres conductores eléctricos independientes. Se puede hacer una línea de estriado 28, pero no es necesario, a lo largo del borde exterior de la capa base 20, para evitar los problemas potenciales de electricidad estática que podrían causar una señal confusa del sensor terminado 10.

Se corta después un fragmento de cinta adhesiva por un solo lado al tamaño y forma adecuados formando la primera capa media 30, de modo que recubra una mayoría de la capa conductora 21 de la capa base 20 excepto para exponer una pequeña área de contacto eléctrico ilustrada en la Fig. 1. Se perforan tres ventanillas rectangulares, cuadradas o circulares 32, 34 y 36 de tamaño sustancialmente igual mediante láser de CO_{2} (láser de 25 W comercializado por Synrad, Inc., San Diego, California, EE.UU.) Las ventanillas 32, 34 y 36 definen las áreas de electrodo W1, W2 y R que contienen los reactivos químicos. Se prefiere hacer el tamaño de las ventanillas tan pequeño como sea posible para hacer el canal de la muestra fluida 112 del sensor 10 tan corto como sea posible con tal de que sea todavía capaz de contener suficiente reactivo químico para funcionar adecuadamente. El tamaño de orificio preferente para la presente invención tiene una dimensión típica de alrededor de 0,033 pulgadas (0,84 mm) por alrededor de 0,043 pulgadas (1,09 mm). Como se ilustra en la Fig. 2, las ventanillas 32, 34 y 36 están alineadas unas con otras y con una separación de alrededor de 0,028 pulgadas (0,71 mm) entre ellas. Las ventanillas rectangulares lo son sólo con fines ilustrativos. Se debe comprender que la forma de las ventanillas no es crítica siempre que el tamaño de las ventanillas sea lo suficientemente grande para contener suficientes reactivos químicos para que los electrodos funcionen adecuadamente pero lo suficientemente pequeño para tener en cuenta un canal de muestra razonablemente pequeño. Como se observó antes, cambiar la forma de las ventanillas o el área superficial de las ventanillas puede requerir cambiar los valores constantes k_{1} - k_{5} para la Ec. 1 y la Ec. 2. Como se ha expuesto previamente, la disposición preferente de los electrodos formados en las ventanillas 32, 34 y 36 es W1 (electrodo de trabajo 1), R (electrodo de referencia) y W2 (electrodo de trabajo 2).

Se dispensan 0,4 microlitros de Reactivo 1 a las áreas de electrodo W1 y R. El Reactivo 1 es una mezcla de un mediador redox, un estabilizante, un aglutinante, un tensioactivo y un búfer. La mezcla preferente para el Reactivo 1 se hace mezclando los siguientes componentes en los porcentajes descritos (% en peso): alrededor de un 1% de ferricianuro potásico, alrededor de un 2,5% de polietilenglicol, alrededor de un 1% de methocel 60 HG, alrededor de un 0,03% de Triton X-100 y alrededor de 0,05M de tampón de citrato (pH 5,7). Se dispensan 0,4 microlitros de Reactivo 2 al área de electrodo W2. El Reactivo 2 es una mezcla similar a la del Reactivo 1 pero con la adición de una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato de la enzima. La enzima preferente es la glucosa-oxidasa. La mezcla preferente para el Reactivo 2 se hace mezclando los siguientes porcentajes (% en peso) de los siguientes ingredientes: alrededor de un 6,5% de ferricianuro potásico, alrededor de un 2,5% de polietilenglicol, alrededor de un 1% de methocel 60 HG, alrededor de un 0,03% de Triton X-100, alrededor de 0,05M de tampón de citrato (pH 5,7) y alrededor de un 1% de glucosa-oxidasa. Después de la adición de los reactivos, el dispositivo se secó durante alrededor de 2 minutos a 55º en un horno. Después de secar, un fragmento de cinta de doble lado 40 comercializada por Adhesive Research se adaptó a la segunda capa media 40 con el canal 42 con forma de U. La segunda capa media 40 se extiende después sobre la primera capa media 30. Como se mencionó antes, esta segunda capa media 40 sirve como un espaciador y define el tamaño del canal de la muestra fluida 112. Su anchura y longitud están optimizadas para prevenir una muestra fluida móvil relativamente rápida. El tamaño preferente del canal 42 con forma de U es alrededor de 0,063 pulgadas (1,60 mm) de anchura por alrededor de 0,248 pulgadas (6,30 mm) de longitud.

Un fragmento de una película de transparencia (No. de cat. PP2200 o PP2500 comercializada por 3M) se adapta a la capa superior 50. Se hace un orificio de ventilación rectangular 52 usando el láser de CO_{2} mencionado previamente. El tamaño preferente del orificio de ventilación 42 es alrededor de 0,075 pulgadas (1,91 mm) por alrededor de 0,059 pulgadas (1,50 mm). El orificio de ventilación 52 está situado aproximadamente a 0,130 pulgadas (3,3 mm) del extremo del fluido 110 del sensor 10. La capa superior 50 se alinea y extiende sobre la segunda capa media 40 para completar el conjunto, como se ilustra en la Fig. 1, del sensor 10.

Aunque la descripción de la construcción del electrodo anterior describe la construcción para un único sensor, el diseño y los materiales usados son ideales para hacer múltiples sensores de una pieza de cada material de capa como se muestra en las Fig. 3A-3E. Esto se llevaría a cabo partiendo de una pieza relativamente grande de la capa base 20 con la capa conductora 21 sobre ésta. Se hacen una pluralidad de líneas estriadas en la capa conductora 21, de tal modo que se crea, como se ilustra en la Fig. 3A, un patrón repetitivo usando el método de estriado preferente descrito previamente, por el que cada patrón definirá eventualmente los tres caminos conductores 22, 24 y 26 para cada sensor. Similarmente, una pieza grande de la primera capa media 30, que se ilustra en la Fig. 3B y que tiene también una pluralidad de ventanillas 32, 34 y 36 en un patrón repetitivo, se dimensiona para que ajuste sobre la capa base 20, de tal modo que cuando esté completo se tendrá una pluralidad de sensores. El tamaño de cada ventanilla y el material de electrodo dispuesto en la pluralidad de áreas de electrodo W1, R y W2 son similares al descrito anteriormente. Después de disponer los Reactivos 1 y 2 en sus ventanillas respectivas y secarse, una pieza grande de la segunda capa media 40 con una pluralidad de ventanillas alargadas 42 e ilustrada en la Fig. 3C se extiende sobre la primera capa media 30 de tal modo que cada ventanilla alargada 42 de la segunda capa media 40 contiene las ventanillas correspondientes 32, 34 y 36 de la primera capa media 30. Una capa superior de tamaño comparable 50 con una pluralidad de aberturas de ventilación 52 en un patrón repetitivo, como se muestra en la Fig. 3D, se extiende sobre la segunda capa media 40. La Fig. 3E es una vista desde arriba de las capas combinadas. La tira laminada creada por las cuatro capas 20, 30, 40 y 50 tiene una pluralidad de sensores 10 que se pueden cortar de la tira laminada. La tira laminada se corta longitudinalmente a lo largo de la línea A-A' en el extremo de muestreo del fluido 210 para formar una pluralidad de aberturas de muestreo 114 y longitudinalmente a lo largo de la línea B-B' en el extremo del contacto eléctrico 220 para formar una pluralidad de contactos conductores 122, 124 y 126. La tira laminada se corta también a intervalos predeterminados a lo largo de la línea C-C' formando una pluralidad de sensores individuales 10. Si se desea se puede realizar el conformado del extremo de muestreo del fluido 120 de cada sensor 10, como se ilustra en la Fig. 1. Los expertos en la técnica deben comprender que el orden en que se puede cortar la tira laminada no es importante. Por ejemplo, la tira laminada se puede cortar en los intervalos predeterminados (C-C') y después se pueden hacer los cortes a lo largo de A-A' y B-B' para completar el procedimiento.

Los ejemplos siguientes ilustran las características únicas de la presente invención que incluye la compensación para los niveles de hematocrito variables midiendo la resistencia del fluido de muestra y la anulación de los efectos de interferencia de especies oxidables presentes en el fluido de muestra. Todos los sensores de la presente invención se analizaron en un medidor de glucosa de montaje experimental fabricado por Nova Biomedical Corporation de Waltham, Massachusetts, (EE.UU.) Se aplicó un potencial de 0,35 voltios entre los electrodos de trabajo y el electrodo de referencia y las señales de corriente resultantes se convirtieron a concentraciones de glucosa de acuerdo con la descripción de la presente invención. Las lecturas se compararon con lecturas (lecturas de control) obtenidas en las mismas muestras usando el Analizador de glucosa YSI (Modelo 2300) comercializado por Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, Ohio.

Ejemplo 1 Demostración de la compensación del hematocrito

El diseño único de la presente invención hace posible medir la resistencia de la muestra del fluido. Esto se logra aplicando el mismo reactivo, el Reactivo 1, al electrodo de referencia R y al primer electrodo de trabajo W1. Los reactivos químicos usados en el Reactivo 1 son críticos para la medición precisa de la resistencia. El Reactivo 1 no puede contener una gran cantidad de sales ni nada de glucosa-oxidasa. De otro modo, la resistencia resultante no sería precisa y dependería de la glucosa. Para el funcionamiento adecuado de la presente invención, se debe observar que para el electrodo de referencia es esencial una cantidad mínima de un mediador como, por ejemplo, el ferricianuro potásico.

La resistencia de un fluido de muestra, en este caso muestras sanguíneas, entre W1 y R se mide en cualquier momento, preferentemente 20 segundos después de que las muestras sanguíneas inicien un dispositivo de lectura (medidor de glucosa de Nova). Se prepararon muestras sanguíneas con diferentes niveles de hematocrito haciendo girar una muestra sanguínea completa y recombinando el plasma y las células sanguíneas rojas en razones variables. Los niveles de hematocrito se midieron con una microcentrífuga de hematocrito. Las concentraciones de glucosa en los diversos ejemplos se midieron mediante sensores de la presente invención (C_{med}) y mediante un analizador de glucosa en sangre YSI (el control), Modelo 2300, Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, Ohio. Se usaron las ecuaciones (1) y (2), mencionadas previamente, para calcular la concentración corregida de glucosa (C_{corr}) medida mediante sensores de la presente invención para demostrar la característica de compensación del hematocrito de la presente invención. Se trazaron los datos obtenidos y las Fig. 4A y 4B muestran dos gráficas que representan la correlación porcentual de las lecturas obtenidas usando sensores de la presente invención con el medidor de glucosa de Nova con las lecturas obtenidas para las muestras usando el analizador de glucosa en sangre YSI a niveles reducidos y elevados de glucosa en muestras con niveles variables de hematocrito.

Ejemplo 2 Demostración de la característica de ausencia de interferencia

El diseño único de la presente invención hace posible eliminar la interferencia de las sustancias oxidables como, por ejemplo, el ácido ascórbico, el paracetamol, el ácido úrico y otros posibles interferentes presentes en la muestra. Esto se logra restando la respuesta obtenida de W1 de la respuesta obtenida de W2, y se representa mediante la siguiente ecuación:

Ec. (3)I = I_{W2} - I_{W1}

en la que

: I_{W2} es la corriente en W2 (segundo electrodo de trabajo)

: I_{W1} es la corriente en W1 (primer electrodo de trabajo)

: I es la diferencia entre W2 y W1 y representa la corriente debida a la oxidación del mediador de su forma reducida, que es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra.

Debido a que W1 y W2 tienen la misma área superficial, la interferencia potencial presente en el fluido de muestra debería dar señales relativamente idénticas de cada electrodo de trabajo. Aun cuando W1 y W2 tenían diferentes reactivos, se comprobó que no había diferencia notable en la respuesta a la interferencia. Así, la diferencia en la respuesta de corriente obtenida en las muestras sanguíneas se debió a la glucosa presente en las muestras. Esto se analizó sembrando muestras sanguíneas de glucosa normal y elevada con 1 mM y 5 mM de ácido ascórbico, paracetamol y ácido úrico. La Tabla 1 muestra el cambio porcentual de la respuesta de las lecturas obtenidas con sensores de la presente invención y diversos sensores comercializados (a los que se hace referencia como Tira 1, Tira 2, Tira 3 y Tira 4) en muestras sanguíneas con una concentración de 100 mg/dl de glucosa y 300 mg/dl al añadir los interferentes.

TABLA 1 Cambio de la respuesta (%) al añadir interferente

1

A partir de los datos de prueba, se observa que las lecturas obtenidas de los sensores de la presente invención no muestran esencialmente cambios en presencia de 1 mM y 5 mM de ácido ascórbico y paracetamol y 1mM de ácido úrico. Todos los sensores comercializados excepto uno, la Tira 4, padecen interferencia grave. La Tira 4 mostró un "error" para 5 mM de ácido ascórbico. A concentraciones de 300 mg/dl de glucosa, los sensores de la presente invención tampoco mostraron interferencia (cambio de respuesta de menos de un 5%) al sembrar las muestras con 1 mM y 5 mM de ácido ascórbico. Los sensores comercializados mostraron alrededor de un 7% a alrededor de un 15% de aumento de respuesta para las muestras sembradas de 1 mM de ácido ascórbico y mostraron una lectura "Hi" para las muestras sembradas de 5 mM de ácido ascórbico. En las muestras que contenían paracetamol y ácido úrico, todas las tiras comercializadas mostraron grados variables de error, excepto la Tira 4 en las muestras que contenían ácido úrico.

Ejemplo 3 Demostración de la característica de mínimos volúmenes de muestra

El diseño único de la presente invención permite la medición de tamaños de muestra menores que lo que ha sido posible hasta ahora. Las muestras sanguíneas se aplican a los sensores y las muestras se desplazan a lo largo del canal de la muestra fluida hasta el orificio de ventilación. El volumen de sangre requerido para la medición de la glucosa en sangre está determinado por el volumen del canal. El volumen calculado para la configuración es 1,44 microlitros. Para analizar el efecto del volumen sobre la respuesta del sensor, se aplicaron diferentes volúmenes de muestra de sangre a los sensores y las lecturas de concentración resultantes se trazaron frente al volumen. Los datos de prueba se muestran en la Fig. 5.

Los sensores de la presente invención no muestran dependencia de la respuesta con el volumen de la muestra si el volumen está por encima de 1,5 microlitros. Se comprobó que los sensores de la presente invención daban todavía lecturas razonables en tamaños de muestra tan reducidos como 1,0 microlitros. Esto es posible porque el carácter hidrófilo del Reactivo 1 aplicado a W1 y R y el Reactivo 2 aplicado a W2 permitió que la muestra cubriera las áreas de electrodo incluso aunque el volumen de sangre no llenara todo el canal de la muestra.

Ejemplo 4 Demostración de la característica de amplio intervalo lineal y precisión

Se recogió una muestra de sangre venosa y se separó en varias partes alícuotas. Cada parte alícuota se sembró con diferentes concentraciones de glucosa que variaban entre 35 y 1.000 mg/dl. Las partes alícuotas se midieron cada una con un analizador de glucosa YSI y después con sensores de la presente invención usando el medidor de glucosa de Nova. Los sensores de la presente invención muestran una relación lineal de la respuesta de corriente frente a la concentración de glucosa de entre 35 y 1.000 mg/dl. Las lecturas de concentración se trazaron frente a los valores de concentración obtenidos usando el medidor de YSI (el control) y se ilustran en la Fig. 6.

Un coeficiente de regresión de 0,9988 indicó una correspondencia casi perfecta con las lecturas obtenidas con el analizador de glucosa en sangre YSI. Las mismas partes alícuotas se analizaron usando cuatro sensores diferentes comercializados con sus medidores asociados. Los sensores comercializados mostraron una respuesta lineal sólo hasta alrededor de 600 mg/dl. Por encima del intervalo 500-600 mg/dl, todos los sensores comercializados presentaron "Hi" como resultado de la prueba.

La precisión de los sensores de la presente invención se investigó en el mismo intervalo de nivel de glucosa de entre alrededor de 35 y 1.000 mg/dl. En las pruebas de precisión se usaron cuatro lotes diferentes de sensores de la presente invención. Típicamente, la desviación típica fue alrededor de 9,5%, 5,0%, 3,5%, 2,9% y 2,6% para las muestras que contenían niveles de glucosa de 35, 100, 200, 500 y 1.000 mg/dl, respectivamente.

Claims

1. Tira de electrodo desechable para analizar una muestra fluida que comprende un cuerpo laminado de la tira (100) con un primer extremo de la tira (110), un segundo extremo de la tira (120), una abertura de ventilación (52) espaciada de dicho primer extremo de la tira (110) y un canal cerrado (112) que se extiende entre dicho primer extremo de la tira (110) y dicha abertura de ventilación (52), comprendiendo dicho cuerpo laminado de la tira (100) una capa base (20) con al menos tres caminos electrodos distintos eléctricamente (22, 24, 26) delineados sobre ésta, una cubierta (50) con dicha abertura de ventilación (52), una segunda capa media aislante (40) intercalada entre dicha capa base (20) y dicha cubierta (50) y que tiene una ventanilla (42) formando dicho canal (112) y contactos conductores (122, 124, 126) en el segundo extremo de la tira (120), estando conectados eléctricamente dichos contactos (122, 124, 126) a dichos caminos electrodos (22, 24, 26) y aislados de dicho canal (112),

caracterizada por una primera capa media aislante (30) intercalada entre dicha capa base (20) y dicha segunda capa media (40), teniendo dicha primera capa media aislante (30) al menos tres ventanillas (32, 34, 36) espaciadas de dicho primer extremo de la tira (110) y en comunicación con dicho canal (112), exponiendo cada ventanilla (32, 34, 36) un área limitada de al menos uno de dichos caminos respectivos (22, 24, 26), estando dispuesto un primer reactivo en una primera (32) de dichas ventanillas (32, 34, 36) para formar un primer electrodo de trabajo (W1), estando dispuesto un segundo reactivo en una segunda (36) de dichas ventanillas (32, 34, 36) para formar un segundo electrodo de trabajo (W2) y estando dispuesto un tercer reactivo en una tercera (34) de dichas ventanillas (32, 34, 36) para formar un electrodo de referencia (R), conteniendo dicho segundo reactivo una enzima, siendo dicho tercer reactivo de la misma composición que dicho primer reactivo.

2. Tira de electrodo desechable para analizar una muestra fluida, que comprende un cuerpo laminado de la tira (100) con un primer extremo de la tira (110), un segundo extremo de la tira (120), una abertura de ventilación (52) espaciada de dicho primer extremo de la tira (110) y un canal cerrado (112) que se extiende entre dicho primer extremo de la tira (110) y dicha abertura de ventilación (52), comprendiendo dicho cuerpo laminado de la tira (100) una capa base (20) con al menos tres caminos electrodos distintos eléctricamente (22, 24, 26) delineados sobre ésta, una cubierta (50) con dicha abertura de ventilación (52), una segunda capa media aislante (40) intercalada entre dicha capa base (20) y dicha cubierta (50) y que tiene una ventanilla (42) formando dicho canal (112) y contactos conductores (122, 124, 126) en el segundo extremo de la tira (120), estando conectados eléctricamente dichos contactos (122, 124, 126) a dichos caminos electrodos (22, 24, 26) y aislados de dicho canal (112),

caracterizada por una primera capa media aislante (30) intercalada entre dicha capa base (20) y dicha segunda capa media (40), teniendo dicha primera capa media aislante (30) al menos dos ventanillas espaciadas de dicho primer extremo de la tira (110) y en comunicación con dicho canal (112), exponiendo una primera de dichas ventanillas un área limitada de un primero y un segundo de dichos caminos electrodos y exponiendo una segunda de dichas ventanillas un área limitada de un tercero de dichos caminos electrodos, estando dispuesto un primer reactivo en dicha primera ventanilla para formar un primer electrodo de trabajo (W1) y un electrodo de referencia (R), estando dispuesto un segundo reactivo en dicha segunda ventanilla para formar un segundo electrodo de trabajo (W2), estando estriado dicho reactivo para aislar una primera porción de dicho primer reactivo dispuesto en dicho primer camino electrodo de una segunda porción de dicho primer reactivo dispuesto en dicho segundo camino de electrodo, formando dicha primera porción de dicho primer reactivo dicho primer electrodo de trabajo (W1) y formando dicha segunda porción de dicho primer reactivo dicho electrodo de referencia (R), conteniendo dicho segundo reactivo una enzima.

3. Tira de electrodo según la reivindicación 1 ó 2, en la que dichas ventanillas (32, 34, 36) en dicha primera capa media (30) están situadas una por detrás de la otra en una dirección desde dicho primer extremo de la tira (110) a dicho segundo extremo de la tira (120).

4. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que cada uno de dichos reactivos contiene un mediador redox.

5. Tira de electrodo según la reivindicación 4, en la que dicho mediador redox es al menos un complejo metálico.

6. Tira de electrodo según la reivindicación 4, en la que dicho mediador redox es seleccionado de un grupo consistente en ferroceno, derivados de ferroceno, ferricianuro potásico y otros mediadores redox inorgánicos y orgánicos.

7. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha capa base (20) tiene un revestimiento conductor (21) dispuesto sobre ella para formar dichos caminos electrodos (22, 24, 26).

8. Tira de electrodo según la reivindicación 7, en la que dicho revestimiento conductor (21) es oro.

9. Tira de electrodo según la reivindicación 7, en la que dicho revestimiento conductor (21) comprende oro y oxido de estaño.

10. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicha capa base (20), dicha primera capa media (30), dicha segunda capa media (40), y dicha cubierta (50) están hechas de un material dieléctrico de plástico.

11. Tira de electrodo según la reivindicación 10, en la que dicho material de plástico se selecciona de entre el grupo formado por cloruro de polivinilo, policarbonato, polisulfona, nilón, poliuretano, nitrato de celulosa, propionato de celulosa, acetato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, poliéster, acrílico, y poliestireno.

12. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho canal (112) es hidrófilo.

13. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho canal (112) tiene un volumen de alrededor de 1,44 microlitros.

14. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha cubierta (50) tiene un revestimiento hidrófilo en por lo menos un lado.

15. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 14, en la que cada uno de los reactivos contienen además por lo menos uno de un estabilizante, un aglutinante, un tensioactivo, y un tampón buffer.

16. Tira de electrodo según la reivindicación 15, en la que dicho estabilizante es un polialquilenglicol, dicho aglutinante es un material celulósico, y dicho tensioactivo es un polioxietilen-éter.

17. Tira de electrodo según la reivindicación 15 ó 16, en la que dicho tampón tiene un PH comprendido entre 5 y 6 aproximadamente.

18. Tira de electrodo según la reivindicación 16, en la que dicho estabilizante es polietilenglicol, dicho aglutinante es metilcelulosa, dicho tensioactivo es t-octilfenoxi-polietoxietanol, y dicho tampón es un tampón de citrato.

19. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dichos reactivos están hechos de una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden alrededor de un 1% en peso a alrededor de un 6,5% en peso de dicho mediador redox, alrededor de un 2,5% en peso de dicho estabilizante, alrededor de un 1% en peso de dicho aglutinante, y alrededor de un 0,03% en peso de dicho tensioactivo en dicho tampón.

20. Tira de electrodo según la reivindicación 19, en la que dicho tampón es alrededor de 0,05 M.

21. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 20, en la que dicha segunda capa media (40) tiene un grosor suficiente para optimizar el flujo de dicha muestra fluida a lo largo de dicho canal.

22. Tira de electrodo según la reivindicación 21, en la que dicho grosor de dicha segunda capa media (40) es de alrededor de 0,1778 mm.

23. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 18 a 22, en la que dicho primer reactivo está hecho de una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden alrededor de un 1% en peso de ferricianuro potásico, alrededor de un 2,5% en peso de polietilenglicol, alrededor de un 1% en peso de metilcelulosa, alrededor de un 0,03% en peso de t-octilfenoxipolietoxietanol, y alrededor de 0,05 M de tampón de citrato.

24. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 18 a 23, en la que dicho segundo reactivo se obtiene de una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden alrededor de un 6,5% en peso de ferricianuro potásico, alrededor de un 2,5% en peso de polietilenglicol, alrededor de un 1% en peso de metilcelulosa, alrededor de un 0,03% en peso de t-octilfenoxipolietoxietanol, alrededor de 0,05 M de tampón de citrato, y alrededor de un 1% en peso de dicha enzima.

25. Tira de electrodo según la reivindicación 24, en la que dicha enzima es glucosa-oxidasa.

26. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 25, en la que el área superficial de dicho primer electrodo de trabajo (W1) es sustancialmente la misma que el área superficial de dicho segundo electrodo de trabajo (W2).

27. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 26, en la que dicha primera capa (30) está dimensionada más pequeña que dicha capa base (20) de tal modo que una porción de dicha capa base (20) está expuesta en dicho segundo extremo de la tira (120).

28. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 27, en la que dicha segunda capa (40) está dimensionada para ajustarse sobre dicha primera capa media (30) y coextenderse con ésta y dicha cubierta (50) está dimensionada para ajustarse sobre dicha segunda capa media (40) y coextenderse con ésta.

29. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 7 a 28, en la que dicho revestimiento conductor está trazado para delinear dichos caminos electrodos.

30. Tira de electrodo según una de las reivindicaciones 1 a 29, en la que dicho primer reactivo es un material adecuado para medir la resistencia de dicha muestra fluida y dicho segundo reactivo es un material adecuado para medir la concentración de al menos un analito en dicha muestra fluida.

31. Método para usar una tira de electrodo (100) para determinar la concentración de un analito, teniendo dicha tira de electrodo (100) un primer electrodo de trabajo (W1), un segundo electrodo de trabajo (W2) y un electrodo de referencia (R), en que dicho segundo electrodo de trabajo (W2) contiene una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato para la enzima, estando dispuestos dicho primer electrodo de trabajo (W1), dicho segundo electrodo de trabajo (W2) y dicho electrodo de referencia (R) en un canal de muestras fluidas (112) para medir una muestra fluida, comprendiendo dicho método las etapas de:

-: disponer dicha muestra fluida en dicho canal (112) de dicha tira de electrodo (100),

-: aplicar un potencial entre dicho electrodo de referencia (R) y dicho segundo electrodo de trabajo (W2) que contiene dicha enzima,

-: medir una primera corriente generada entre dicho segundo electrodo de trabajo (W2) y dicho electrodo de referencia (R), y correlacionar dicha primera corriente con una concentración de dicho analito en dicha muestra fluida,

-: medir un valor de resistencia (r) de dicha muestra fluida entre dicho primer electrodo de trabajo (W1) y dicho electrodo de referencia (R),

-: aplicar dicho valor de resistencia (r) a una primera ecuación y determinar el nivel de hematocrito (H) de dicha muestra fluida, y

-: calcular una concentración corregida de dicho analito (C_{corr}) usando una segunda ecuación para corregir la presencia de hematocrito en dicha muestra fluida.

32. Método según la reivindicación 31, que comprende además las etapas de:

-: aplicar un potencial entre dicho electrodo de referencia (R) y dicho primer electrodo de trabajo (W1),

-: medir una segunda corriente generada entre dicho primer electrodo de trabajo (W1) y dicho electrodo de referencia (R),

-: restar dicha segunda corriente de dicha primera corriente y obtener una diferencia de corriente,

-: correlacionar dicha diferencia de corriente a una concentración de dicho analito en dicha muestra fluida.

33. Método según la reivindicación 32, que comprende además iniciar la medición de dichas corrientes cuando dicha muestra fluida entra en contacto con dicho primer electrodo de trabajo (W1), creando dicho segundo electrodo de trabajo (W2) y dicho electrodo de referencia (R) dicha primera corriente y dicha segunda corriente.

34. Método según la reivindicación 33, que comprende además leer un valor de corriente para cada una de dicha primera corriente y dicha segunda corriente cerca del momento en que dichos valores de corriente de cada una de dicha primera corriente y dicha segunda corriente alcanzan un estado estacionario.

35. Método según la reivindicación 34, en el que dicha lectura se toma alrededor de 20 segundos después de que dicha medición de corriente se ha iniciado.

36. Método para fabricar detectores desechables múltiples (10), en el que cada detector tiene un primer electrodo de trabajo (W1), un segundo electrodo de trabajo (W2) y un electrodo de referencia (R), en el que dicho segundo electrodo de trabajo (W2) contiene una enzima capaz de catalizar una reacción que implica a un sustrato para la enzima, estando dispuestos dicho primer electrodo de trabajo (W1), dicho segundo electrodo de trabajo (W2) y dicho electrodo de referencia (R) en un canal de muestra fluida para medir una muestra fluida, comprendiendo dicho método:

-: obtener una tira base (20) de un material aislante que tiene una capa de material conductor (21) dispuesto sobre ella, teniendo dicha tira base (20) un primer borde (210) y un segundo borde (220);

-: trazar en dicho material conductor (21) una pluralidad de líneas en un patrón repetitivo en el que dicha pluralidad de líneas contiene un patrón repetitivo que forma tres caminos conductores (22, 24, 26) en cada uno de dichos patrones repetitivos;

-: disponer una primera capa media (30) de material aislante sobre dicha tira base (20), teniendo dicha primera capa media (30) un patrón repetitivo de tres ventanillas (32, 34, 36) en el que cada ventanilla de cada uno de dichos patrones repetitivos expone una porción de electrodo de cada uno de dichos tres caminos conductores (22, 24, 26) de cada patrón repetitivo en el que dichos patrones repetitivos de dichas tres ventanillas (32, 34, 36) está espaciado de dicho primer borde (210) de dicha tira base (20), y en el que dicha primera capa media (30) está dimensionada para exponer una porción de contacto (122, 124, 126) de cada uno de dichos tres caminos conductores (22, 24, 26) de cada patrón repetitivo para una distancia de dicho segundo borde (220) de dicha tira base (20);

-: disponer un primer material reactivo sobre dos de dichas tres ventanillas (32, 34, 36) de cada patrón repetitivo y un segundo material reactivo sobre la otra de dichas tres ventanillas (32, 34, 36) de cada patrón repetitivo;

-: secar dicho primer material reactivo y dicho segundo material reactivo;

-: recubrir una segunda capa media (40) de material aislante sobre y coextenderse con dicha primera capa media (30), teniendo dicha segunda capa media (40) una pluralidad de porciones de ventanillas alargadas (42) en un patrón repetitivo en el que cada una de dichas porciones de ventanilla alargadas (42) se expone a correspondientes patrones repetitivos de dichas tres ventanillas (32, 34, 36) de dicha primera capa media (30);

-: disponer una capa superior (50) de material aislante sobre y coextenderse con dicha segunda capa media (40), teniendo dicha capa superior (50) una pluralidad de aberturas de ventilación (52) en un patrón repetitivo en el que cada una de dichas aberturas de ventilación (52) expone una porción de un patrón repetitivo correspondiente de dicha porción de ventanilla alargada más allá de dicho primer borde (210) de dicha tira base (20); y

-: separar cada uno de dichos patrones repetitivos que forma uno de cada uno de dichos detectores desechables (10).

37. Método según la reivindicación 36 que comprende además secar dicho primer material reactivo y dicho segundo material reactivo a una temperatura y por un período de tiempo suficiente para permitir que dicho primer material reactivo y dicho segundo material reactivo se solidifiquen y se adhieran a cada una de dicha porción de electrodo de cada uno de dichos patrones repetitivos de dichos tres caminos conductores (22, 24, 26).

38. Método según la reivindicación 36 ó 37, que comprende además un corte a lo largo de dicho primer borde (210) de cada uno de dichos detectores (10) y transversal a dichos detectores (10) a una distancia predeterminada creando un puerto de entrada de muestra.