ES2182897T5 - Regulacion por proteasoma de la actividad de nf-kappa-b. - Google Patents
Regulacion por proteasoma de la actividad de nf-kappa-b.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA REGULAR LA ACTIVIDAD DE NF- KA}B EN UN ANIMAL, MEDIANTE EL CONTACTO DE LAS CELULAS DEL ANIMAL CON CIERTOS INHIBIDORES DE PROTEASOMAS.
Description
Regulación por proteasoma de la actividad de
NF-\kappa-B.
Esta invención se refiere a un método para
reducir el contenido celular y la actividad de
NF-\kappaB por el uso de inhibidores de la
función de proteasoma o conjugación con ubiquitina.
El factor de transcripción
NF-\kappaB y otros miembros de la familia REL de
complejos proteicos desempeña un papel central en la regulación de
un conjunto de genes notablemente variado implicado en las
respuestas inmunes e inflamatorias (Grilli et al.,
International Review of Citology 143.1-62 (1993)).
Por ejemplo, NF-\kappaB se requiere para la
expresión de un número de genes de respuesta inmune, incluyendo el
gen de inmunoglobulina de cadena ligera
Ig-\kappa, el gen de cadena \alpha receptor de IL-2, el gen de cadena \beta receptor de célula T, y genes de mayor histocompatibilidad de clase I y II. Además, se ha demostrado que NF-\kappaB se requiere para un número de genes implicados en la respuesta inflamatoria, como el gen TNF-\alpha y los genes de adhesión celular, E-selectina, ICAM, y VCAM. NF-\kappaB se requiere también para la expresión de un gran número de genes de citoquina como IL-2, IL-6, G-CSF, y IFN-\beta. Finalmente, NF-\kappaB es esencial para la expresión del virus de inmunodeficiencia humana (HIV).
Ig-\kappa, el gen de cadena \alpha receptor de IL-2, el gen de cadena \beta receptor de célula T, y genes de mayor histocompatibilidad de clase I y II. Además, se ha demostrado que NF-\kappaB se requiere para un número de genes implicados en la respuesta inflamatoria, como el gen TNF-\alpha y los genes de adhesión celular, E-selectina, ICAM, y VCAM. NF-\kappaB se requiere también para la expresión de un gran número de genes de citoquina como IL-2, IL-6, G-CSF, y IFN-\beta. Finalmente, NF-\kappaB es esencial para la expresión del virus de inmunodeficiencia humana (HIV).
En el citosol, hay una vía proteolítica soluble
que requiere ATP e implica conjugación covalente de las proteínas
celulares con el pequeño polipéptido ubiquitina ("Ub")
(Herschko et al., A. Rev. Biochem.
61:761-807 (1992); Rechsteiner et al., A.
Rev. Cell. Biol. 3:1-30(1987)).
Después, las proteínas conjugadas se hidrolizan
por un complejo proteolítico 26S que contiene una partícula
degradativa 20S llamada proteasoma (Goldberg, Eur. J.
Biochem. 203:9-23 (1992); Goldberg et al.
Nature 357:375-379 (1992)). Se sabe que este
sistema multicomponente cataliza la degradación selectiva de
proteínas altamente anormales y proteínas reguladoras de vida
corta. Sin embargo, el sistema también parece ser responsable de la
descomposición de la mayoría de las proteínas en la maduración de
reticulocitos (Boches et al., Science
215:978-980 (1982); Spenser et al.,
J. Biol. Chem. 257:14122-14127 (1985)), en el
crecimiento de fibroblastos (Ciechanover et al., Cell
37:57-66 (1984); Gronostajski et al., J.
Biol. Chem. 260:3344-2249 (1985)) y en la
atrofia del músculo esquelético.
La primera etapa en la degradación de muchas
proteínas implica su conjugación a Ub por un proceso que requiere
ATP. Las proteínas ubiquitinizadas se degradan después por un
complejo proteolítico dependiente de ATP, mencionado antes,
conocido como el complejo proteasoma 26S.
La naturaleza precisa del complejo proteasoma
26S no está clara, aunque se ha demostrado que el complejo (26S) de
1000-1500 kDa puede formarse en extractos de
reticulocitos de energía mermada por una asociación dependiente de
ATP de tres componentes, llamados CF-1,
CF-2, CF-3 (Ganoch, D. et
al., J. Biol. Chem. 263:12412-12419
(1988)). Una proteasa multímera grande (\sim700 kDa) encontrada
en el citoplasma y núcleo de células eucarióticas, mencionada como
proteasoma, es un componente (CF-3) (Driscoll et
al., J. Biol. Chem. 265:4789-4792 (1992);
Eytan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
86:7751-7755 (1989); Orlowsky, Biochemistry
29:10289-10297 (1990) y Rivett, Arch. Biochem.
Biophys. 268:1-8 (1989)).
Se cree que el proteasoma forma el núcleo
catalítico de la partícula grande citoplásmica multisubunidad 26S
necesaria para la vía dependiente de ubiquitina de la proteolisis
intracelular (Driscoll et al., J. Biol. Chem.
265:4789-4692 (1990); Eytan et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:7751-7755 (1989);
Hough et al., Biochemistry
262:8303-8313 (1987); McGuire et al.,
Biochem. Biophys. Acta 967:195-203 (1988);
Rechsteiner et al., A. Rev. Cell. Biol.
3:1-30 (1987); Waxman et al., J. Biol.
Chem. 262:2451-2457 (1987)). Por sí mismo, el
proteasoma es incapaz de degradar las proteínas ubiquitinizadas,
pero proporciona la mayor parte de la actividad proteolítica del
complejo de proteasoma 26S.
Hay otra proteasa dependiente de ATP que está
implicada en la degradación de proteínas ubiquitinizadas, forma un
complejo con el proteasoma, y parece ser parte del complejo
proteasoma 26S, que degrada rápidamente proteínas conjugadas a
ubiquitina. Esta proteasa, denominada multipaina, ha sido
identificada en el músculo y desempeña un papel esencial en la vía
dependiente de ubiquitina-ATP.
El complejo formado entre multipaina y
proteasoma in vitro parece muy similar o idéntico al
conjugado a Ub de 1500 kDa, que degrada la enzima, o el complejo
proteolítico 26S, aislado de reticulocitos y músculo. Los complejos
contienen las características subunidades de proteasoma
20-30 kDa, más un número de subunidades más
grandes, incluyendo los seis polipéptidos grandes encontrados en
multipaina. El complejo formado contiene al menos
10-12 polipéptidos 10-12
polipéptidos de 40-150 kDa.
Un polipéptido de 40 kDa regulador del
proteasoma, que inhibe las actividades proteolíticas del proteasoma
se ha purificado a partir de reticulocitos y se ha demostrado que es
una proteína ligante de ATP cuya liberación parece activar la
proteolisis. El regulador aislado existe como multímero de 250 kDa y
es completamente lábil (a 42ºC). Puede estabilizarse por adición de
ATP o un análogo de ATP no hidrolizable, aunque el regulador
purificado no requiere ATP para inhibir la función de proteasoma y
carece de actividad ATPasa. Se ha mostrado que el regulador
corresponde a un componente esencial del complejo proteolítico de
1500 kDa. El regulador parece idéntico a CF-2 por
muchos criterios. Estos descubrimientos sugieren que el regulador
desempeña un papel en el mecanismo dependiente de ATP del complejo
de proteasoma 26S.
Hay también un sistema en el citosol que genera
partículas antígenas a partir de proteínas celulares y virales
sintetizadas endógenamente (Moore et al., Cell
54:777-785 (1988); Morrison et al., J.
Exp. Med. 163:903-921 (1986); Powis et
al., Nature 354:529-531 (1991); Spies
et al., Nature 351:323-324 (1991);
Townsend et al., Cell 42:457-467
(1985); Townsend et al., Nature
324:575-577 (1986); Monaco et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79:3001-3005 (1982);
Monaco, Immun. Today 13:173-179 (1992);
Yewdell et al., Adv. Immun. 52:1-123
(1992); Townsend et al., J. Exp. Med.
168:1211-1224 (1988)). La evidencia indirecta
sugiere un papel para partículas proteolíticas estrechamente
semejante y quizá idéntico al proteasoma (Goldberg et al.,
Nature 357:375-379 (1992); Monaco, Immun.
Today 13:173-179 (1992); Parham, Nature
348:674-675 (1990); Yang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:4928-4932 (1992);
(Brown et al., Nature 353:355-357
(1991)). Se ha visto que el proteasoma es responsable del
procesamiento citoplásmico de moléculas antígenas de clase I de
MHC.
El proteasoma 20S se compone de aproximadamente
15 subunidades de 20-30kDa distintas. Contiene al
menos tres peptidasas diferentes que actúan específicamente sobre
el lateral carboxilo de los aminoácidos hidrófobos, básicos y
ácidos (Goldberg et al., Nature
357:375-379 (1992); Goldberg, Eur. J.
Biochem. 203:9-23 (1992); Orlowski,
Biochemistry 29:10289-10297 (1990); Rivett
et al., Archs. Biochem. Biophys. 218:1 (1989); Rivett
et al., J. Biol. Chem.
264:12,215-12,219 (1989); Tanaka et al.,
New Biol. 4:1-11 (1992)). Estas peptidasas
se refieren a peptidasa similar a quimotripsina, peptidasa similar a
tripsina, y la peptidilglutamilpeptidasa. No se sabe qué
subunidades son responsables de estas actividades, aunque se han
clonado varias subunidades que codifican el cDNA (Tanaka et
al., New Biol. 4:1-11 (1992)).
Estudios recientes han encontrado que los
proteasomas 20S se parecen en tamaño y composición de subunidad a
partículas LMP unidas a MHC (Driscoll et al., Cell
68:823 (1992); Goldberg et al., Nature
357:375-379 (1992); MaTthews et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:2586 (1989); Monaco et al.,
Human Inmunology 15:416 (1986); Parham, Nature
348:674-675 (1990); Martínez et al.,
Nature 353:664 (1991); Ortiz-Navarrete et
al., Nature 353:662 (1991); Glynne et al.,
Nature 353:357 (1991); Kelly et al., Nature
353:667 (1991); Monaco et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 79:3001 (1982); Brown et al., Nature
353:355 (1991); Goldberg, Eur. J. Biochem.
203:9-23 (1992); Tanaka et al., New
Biol. 4:1-11 (1992)).
Se han señalado varios inhibidores de las
peptidasas del proteasoma (Dick et al., Biochemistry
30:2725:2734 (1991); Goldberg et al., Nature
357:375-379 (1992); Goldberg, Eur. J.
Biochem. 203:9-23 (1992); Orlowski,
Biochemistry 29:10289-10297 (1990); Rivett
et al., Archs. Biochem. Biophys. 218:1 (1989); Rivett
et al., J. Biol. Chem.
264:12,215-12,219 (1989); Tanaka et al.,
New Biol. 4:1-11 (1992). Incluyen inhibidores
conocidos de proteasas similares a quimotripsina y similares a
tripsina, así como inhibidores de tiol (o cisteína) y serina
proteasas. Además, se han aislado algunos inhibidores endógenos de
actividades de proteasoma. Estos incluyen los inhibidores de 240
kDa y 200 kDa aislados de eritrocitos humanos (Murakami et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
83:7588-7592 (1986); Li et al.,
Biochemistry 30:9709-9715 (1991)) y
CF-2 purificados (Goldberg, Eur. J. Biochem.
203:9-23 (1992)). Además de inhibidores antibióticos
originalmente aislados de actinomicetos (Aoyagi et al.,
Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, pp. 429-254 (1975)), se han
sintetizado una variedad de aldehidos peptídicos, como los
inhibidores de proteasa similares a quimotripsina descritos por
Siman et al. (WO 91/13904).
También pueden obtenerse moléculas nuevas y
comprobar su actividad inhibidora. Como se señala en las referencias
citadas antes, se conocen en la técnica varias estrategias para
obtener los inhibidores para una proteasa dada. Bibliotecas
completas o un extracto se pueden explorar para buscar inhibidores
utilizando ensayos con peptidasa. Alternativamente, moléculas de
péptidos y péptidomiméticas pueden diseñarse basadas en el
conocimiento de los sustratos de la proteasa. Por ejemplo, pueden
sintetizarse análogos de sustrato que contienen un grupo reactivo
que probablemente interacciona con el sitio catalítico de la
proteasa (véase, por ejemplo, Siman et al., WO 91/13904;
Powers et al., in proteinase Inhibitors, Barret et
al. (eds.), Elsevier, pp. 55-152 (1986)). Los
inhibidores pueden ser análogos estables de estados de transición
catalítica (inhibidores análogos de estado de transición), como
Z-Gly-Gly-Leu-H,
que inhibe la actividad similar a la de quimotripsina del proteasoma
(Orlowski, Biochemistry 29:10289-10297
(1990)); además véase Kennedy and Schultz, Biochemistry
18:349 (1979)).
Varios inhibidores de proteasa naturales y
químicos señalados en la literatura, o moléculas similares a ellos,
incluyen péptidos que contienen una
\alpha-dicetona o un
\alpha-cetoéster, clorometilcetonas peptídicas,
isocumarinas, fluoruros de sulfonilo peptídicos, peptidilboronatos,
epóxidos peptídicos, y peptidildiazometanos (Angelastro et
al., J. Med. Chem. 33:11-13 (1990); Bey
et al. EPO 363,284; Bey et al., EPO 364,344; Grubb
et al., WO 88/10266; Higuchi et al., EPO 393,457;
Ewoldt et al., Molecular Inmunology
29(6):713-721 (1992); Hernández et
al., Journal of Medicinal Chemistry
35(6):1121-1129 (1992); Vlasak et al.,
Journal of Virology 63(5):2056-2062
(1989); Hudig et al., Journal of Inmunology
147(4):1360-1368 (1991); Odakc et al.,
Biochemistry 30(8):2217-2227 (1991);
Vijayalakshmi et al., Biochemistry
30(8):2175-2183 (1991); Kam et al.,
Thrombosis and Haemostasis
64(1):133-137 (1990); Powers et al.,
Journal of Cellular Biochemistry
39(1):33-46 (1989); Powers et al.,
Proteinase Inhibitors, Barret et al., Eds., Elsevier,
pp. 55-152 (1986); Powers et al.,
Biochemistry 29(12):3108-3118 (1990);
Oweida et al., Thrombosis Research
58(2):391-397 (1990); Hudig et al.,
Molecular Inmunology 26(8):793-798
(1989); Orlowski et al., Archives of Biochemistry and
Biophysics 269(1):125-136 (1989); Zunino
et al., Biochimica et Biophysica Acta.
967(3):331-340 (1988); Kam et al.,
Biochemistry 27(7):2547-3557 (1988);
Parkes et al., Biochem J. 230:509-516
(1985); Green et al., J. Biol. Chem.
256:1923-1928 (1981); Angliker et al.,
Biochem. J. 241:871-875 (1987); Puri et
al., Arch. Biochem. Biophys. 27:346-358
(1989); Hanada et al., Proteinase Inhibitors: Medical and
Biological Aspects, Katanuma et al., Eds.,
Springer-Verlag pp. 25-36 (1983);
Kajiwara et al., Biochem. Int.
15:935-944 (1987); Rao et al., Thromb.
Res. 47:635-637 (1987); Tsujinaka et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1201-1208
(1988)).
También se conocen varios inhibidores de
conjugación de ubiquitina a proteínas (Wilkinson et al.,
Biochemistry 29:7373-7380 (1990)).
Ciertos aldehidos peptídicos y
\alpha-cetoésteres péptidicos que contienen un
residuo hidrófobo en la posición P_{1} los investigaron Vinitsky
et al. (Biochemistry 31:9421-9428
(1992), además véase, Orlowski et al. Biochemistry
32:1563-1572 (1993)) como inhibidores potenciales de
la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma. Se encontró
que tres aldehidos peptídicos,
(benciloxicarbonil)-Leu-Leu-fenilalaninal
(Z-LLF-H),
N-acetil-Leu-Leu-Norleucinal
(Ac-LLnL-H), y
N-acetil-Leu-Leu-metioninal
(Ac-LLM-H) eran inhibidores de unión
lentos con valores K_{i} de 0,46, 5,7, y 33 \muM,
respectivamente. De los distintos inhibidores
\alpha-cetoéster investigados,
Z-Leu-Leu-Phe-COOEt
era el inhibidor más potente de la actividad similar a quimotripsina
con un K_{i} de 53 \muM. Existen muchos de esos
compuestos.
compuestos.
Otros tripéptidos que se han descrito en la
literatura incluyen
Ac-Leu-Leu-Leu-H,
Ac-Leu-Leu-Met-OR,
Ac-Leu-Leu-Nle-OR,
Ac-Leu-Leu-Leu-OR,
Ac-Leu-Leu-Arg-H,
Z-Leu-Leu-Leu-H,
Z-Arg-Leu-Phe-H
y
Z-Arg-Ile-Phe-H,
donde OR, junto con el carbonilo del residuo aminoácido precedente,
representa un grupo éster.
Goldberg, en la Solicitud de Patente de EE.UU.
Nº 07/699,184, registrada el 13 de mayo de 1991, describe que el
proceso dependiente de ubiquitina-ATP es responsable
de la degradación proteica excesiva que tiene lugar en condiciones
o estados de enfermedad en los que hay pérdida importante de masa
corporal y balance de nitrógeno negativo. También se describen un
método para inhibir la proteolisis acelerada o aumentada, un método
de identificación de inhibidores del proceso, inhibidores de
multipaína y proteasoma.
Goldberg et al., en la Solicitud de
Patente de EE.UU. Nº 08/016,066, registrada el 10 de febrero de
1993, describen métodos y fármacos que inhiben el procesamiento de
antígenos para presentación por moléculas de clase I complejas de
histocompatibilidad mayor. Específicamente, se describen inhibidores
de la vía proteolítica dependiente de
ubiquitina-ATP, que pueden inhibir la presentación
de antígeno MHC-I. Estos métodos y fármacos pueden
ser útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y para
reducir el rechazo de trasplantes de órganos e injertos. Véase
también, Michalek et al., Nature
363:552-554 (1993).
Tsubuki et al., Biochem. And Biophys.
Res. Commun. 196(3):1195-1201 (1993)
informaron que un inhibidor de aldehido proteasa tripéptídico,
benciloxicarbonil(Z)-Leu-Leu-leucinal,
inicia la excrecencia de neuritas en células PC12 a una
concentración óptima de 30nM. También se mencionan los siguientes
péptidos sintéticos:
Z-Leu-Leu-Gly-H,
Z-Leu-Leu-Ala-H,
Z-Leu-Leu-Ile-H,
Z-Leu-Leu-Val-H,
Z-Leu-Leu-Nva-H,
Z-Leu-Leu-Phe-H,
Z-Leu-Leu-Leu-H
y
Bz-Leu-Leu-Leu-H,
Ac-Leu-Leu-Leu-H,
Z-Leu-Leu-Leu.sc,
Z-Leu-Leu-Leu.ol,
Z-Leu-Leu-Leu,
Dns-Leu-Leu-Leu-H,
Dns-Leu-Leu-Leu-CH_{2}Cl
y Leupeptina.
Siman et al. (WO 91/13904) describen
proteasas similares a quimotripsina y sus inhibidores. Los
inhibidores tienen la fórmula
R-A4-A3-A2-y,
en que
R es hidrógeno, o un grupo de bloqueo
terminal-N;
A4 es un enlace covalente, un aminoácido o un
péptido;
A3 es un enlace covalente, un
D-aminoácido, Phe, Tir, Val, o un aminoácido
conservador sustituyente de Val;
A2 es un aminoácido hidrófobo o lisina o un
aminoácido conservador sustituyente suyo, o cuando A4 incluye al
menos dos aminoácidos, A2 es cualquier aminoácido; y
Y es un grupo reactivo con el sitio activo de
dicha proteasa.
Powers (WO 92/12140) describe cetoamidas,
cetoácidos y cetoésteres peptídicos y su uso para inhibir serina
proteasas y cisteína proteasas.
Bartus et al. (WO 92/1850) describen usos
para compuestos inhibidores de calpaína y composiciones
farmacéuticas que los contienen. Un uso de estos compuestos es en
el tratamiento de patología neurodegenerativa en un paciente
humano. El descubrimiento también proporciona usos adicionales y
composiciones farmacéuticas que contienen compuestos inhibidores de
calpaína, como cetoamidas peptídicas, cetoácidos peptídicos y
cetoésteres peptídicos.
\newpage
Esta invención se refiere a usos de inhibidores
de la función proteasoma o conjugación con ubiquitina.
En una realización preferida, esta invención se
refiere al uso de un inhibidor de la conjugación con ubiquitina
para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de
un estado inflamatorio.
En una realización preferida adicional, la
presente invención se refiere al uso de un inhibidor de una
peptidasa o de la actividad proteolítica de un complejo de
proteasoma 20S o proteasoma 26S en la fabricación de un medicamento
para usar en el tratamiento de un estado inflamatorio.
En una realización preferida adicional, esta
invención se refiere al uso de un inhibidor de la función proteasoma
o conjugación con ubiquitina para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de infección HIV.
En otra realización preferida adicional, esta
invención se refiere al uso de un inhibidor de la función proteasoma
o conjugación con ubiquitina para la fabricación de un medicamento
para usar en un método de tratamiento para reducir el contenido
celular y la actividad de NF-\kappaB.
Más particularmente, el inhibidor de la función
proteasoma o conjugación con ubiquitina de esta invención tiene la
fórmula I:
donde
P es un resto protector de grupo amino;
B^{1}, B^{2}, B^{3} y B^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que comprende
\hskip0.3cm--
\delm{N}{\delm{\para}{}} --
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{}}H --;
X^{1}, X^{2} y X^{3} se seleccionan
independientemente del grupo que comprende
\hskip0.3cm– C -- N
\delm{H}{\delm{\dpara}{O}}, \hskip0.3cm-- CH_{2} -- NH --,
-- CH --
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H_{2} --,
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --, \hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H – CH_{2} -- NH --,
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm– CH=CH --;
R es un hidrógeno, alquilo, acilo o
carbonilo;
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno,
alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y
-CH2-R^{5};
Donde R^{5} es arilo, aralquilo, alcarilo,
cicloalquilo o -Y-R6;
donde Y es un anfígeno, y R^{6} es alquilo; y
A es 0 ó 1.
Los "animales" indicados aquí son
preferiblemente mamíferos. Ambos términos incluyen a los
humanos.
La figura 1 muestra que el procesamiento
proteolítico del precursor p60Tth a p50 in vitro
requiere ATP.
La figura 2 es un diagrama que muestra el papel
de la ubiquitina y el proteasoma en la generación de
NF-\kappaB activo.
La figura 3 representa el procesamiento de
p105/p60Th en extractos enriquecidos con proteasoma y con merma de
proteasoma.
La figura 4 muestra que la inmunorreducción del
proteasoma inhibe el procesamiento de
NF-\kappaB.
La figura 5 muestra que los proteasomas
purificados estimulan el procesamiento de p60Tth.
La figura 6 muestra que la proteína precursora
p60Tth está ubiquitinizada.
La figura 7 muestra que se requiere ubiquitina
para el procesamiento de NF-\kappaB.
La figura 8 muestra que el procesamiento de p105
en Saccharomyces cerevisiae requiere el proteasoma.
La figura 9 muestra que inhibidores específicos
del proteasoma bloquean el procesamiento de p105 in vivo.
La figura 10 muestra que inhibidores específicos
del proteasoma bloquean la activación de
NF-\kappaB.
NF-\kappaB existe en una forma
inactiva en el citosol complejado con una proteína inhibidora,
I\kappaB. Con el fin de que el NF-\kappaB se
convierta en activo y realice su función, debe entrar en el núcleo
celular. No puede hacer esto, sin embargo, hasta que la porción
I\kappaB del complejo se separa, un proceso mencionado por los
expertos en la técnica como la activación de, o procesamiento de,
NF-\kappaB. En algunas enfermedades, la ejecución
normal de su función por el NF-\kappaB puede ser
perjudicial para la salud del paciente. Por ejemplo, como se ha
mencionado antes, NF-\kappaB es esencial para la
expresión del virus de inmunodeficiencia humana (HIV). Conforme a
esto, un procedimiento que pudiera prevenir la activación del
NF-\kappaB en pacientes que sufren de esas
enfermedades podría ser terapéuticamente beneficioso. Los
inhibidores empleados en la práctica de esta invención son capaces
de prevenir esta activación. Así, bloquear la actividad o producción
de NF-\kappaB podría ser una importante
aplicación en varias áreas de medicina, por ejemplo, inflamación,
sepsis, SIDA, y similares.
Más específicamente, la actividad de
NF-\kappaB está enormemente regulada (Grilli et
al., International Review of citology
143:1-62 (1993); Beg et al., Genes and
Development 7:2064-2070 (1993)).
NF-\kappaB comprende dos subunidades, p50 y un
miembro adicional de la familia de genes REL, por ejemplo, p65
(también conocido como REL A). En la mayoría de las células, los
p50 y p65 están presentes en forma de un precursor inactivo en el
citoplasma, unido a I\kappaB. Además, la subunidad p50 de
NF-\kappaB se genera por el procesamiento
proteolítico de una proteína precursora
NF-\kappaB_{1} (p105) de 105 kD, y este
procesamiento también se regula. La secuencia de la porción de 50
kD N-terminal de p105 es similar a la de p65 y otros
miembros de la familia de genes REL (el dominio de homología REL).
Por contraste, la porción de 55kD C-terminal de
p105 presenta una semejanza sorprendente con
I\kappaB-\alpha (también conocido como MAD3).
Significativamente, p105 no procesado puede asociarse con p65 y
otros miembros de la familia REL para formar un heterodímero
p65/p105. El procesamiento de p105 da lugar a la producción de p50,
que puede formar el heterodímero p50/p105 transcripcionalmente
activo. La secuencia homóloga de I\kappaB-\alpha
C-terminal de p105 se degrada rápidamente por el
procesamiento.
Hay otra proteína relacionada con REL,
NF-\kappaB_{2} (p100), que es similar a p105 en
que, también, se procesa a una subunidad ligante de DNA, p52 (Neri
et al., Cell 67:1075 (1991); Schmid et al.,
Nature 352:733 (1991); Bours et al. Molecular and
Cellular Biology 12:685 (1992); Mercurio et al. DNA
Cell Biology 11:523 (1992)). Muchas de las características
estructurales y reguladoras de p100 son similares a p105. Además, la
proteína p100 puede también formar un heterodímero con p65 y otros
miembros de la familia REL.
En resumen, la actividad transcripcional de
heterodímeros que comprenden p50 y una de las muchas proteínas de
la familia REL, como la p65, puede regularse por al menos dos
mecanismos. En primer lugar, los heterodímeros se asocian con
I\kappaB-\alpha para formar un complejo
citoplásmico ternario inactivo. En segundo lugar, los miembros de
la familia REL se asocian con p105 y p100 para formar complejos
inactivos. El complejo ternario puede activarse por disociación y
destrucción de I\kappaB-\alpha, mientras que los
heterodímeros p65/p105 y p65/p100 pueden activarse por
procesamiento de p105 y p100, respectivamente.
La disociación de
I\kappaB-\alpha puede inducirse por un número
notablemente grande de señales extracelulares, como
lipopolisacáridos, ésteres de forbol, TNF-\alpha,
y una variedad de citoquinas. El I\kappaB-\alpha
se degrada entonces rápidamente. Estudios recientes sugieren que el
procesamiento de p105 y p100 puede también inducirse por al menos
alguna de estas señales extracelulares. No se comprenden ni las vías
de transducción de señal que conducen a activación de
NF-\kappaB, ni el mecanismo de inactivación de
I\kappaB-\alpha o el procesamiento de
p105/p100. Conforme a esto, los inventores no desean limitarse por
ninguna teoría de los mecanismos por los que los inhibidores
empleados en la práctica de esta invención consiguen sus efectos
útiles. Los inventores tienen evidencia clara de los efectos
con ciertos inhibidores que bloquean el sitio hidrófobo en la
partícula del proteasoma (núcleo)20S, pero debe tenerse en
cuenta que existen otros sitios esenciales en esta partícula, que
constituye el núcleo catalítico en el complejo de proteasoma 26S.
Consecuentemente, pueden anticiparse efectos similares con
inhibidores de otras actividades esenciales del proteasoma. La
separación de la partícula de proteasoma por ultracentrifugación o
inmunoprecipitación previene la activación de
NF-\kappaB. Hay muchas otras funciones
catalíticas en esta partícula que, si se bloquean, también podrían
esperar los expertos en la técnica que se impida su capacidad para
procesar NF-\kappaB y/o destruir I\kappaB. Es
también posible que los efectos conseguidos por los inhibidores
usados en el proceso de esta invención se puedan alcanzar por
inhibición de la ubiquitinización de NF-\kappaB
y/o I\kappaB. Ciertamente, los inventores han descubierto que la
conjugación con ubiquitina es necesaria para su degradación.
Conforme a esto, pueden estar específicamente E-2s
o E-3s implicados en el procesamiento de
NF-\kappaB y/o I\kappaB por lo que se podría
predecir que cualquier inhibidor de conjugación de UB dependiente
de E-1, E-2, o E-3
evitaría la activación de NF-\kappaB por bloqueo
de la vía proteasoma-ubiquitina.
Hay estudios que demuestran que p105 o una forma
truncada de p105 (p60Tth) pueden procesarse por p50 in
vitro (Fan et al., Nature
354:395-398 (1991)). Algunos de los requisitos y
características de esta reacción de procesamiento in vitro
(por ejemplo, dependencia de ATP/Mg^{++}) sugirieron a estos
inventores que estaba implicado el complejo proteasa dependiente de
ATP de la vía de degradación de proteínas mediada por
ubiquitina(es decir, proteasoma; Rechsteiner, 1991,
Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992),
Hershko et al., Anun. Rev. Biochem.
61:761-807 (1992)). Sin embargo, se sabía que esta
estructura sólo catalizaba la degradación completa de proteínas a
pequeños péptidos solubles en ácido y no se la creía capaz de
procesar precursores para generar proteínas activas, como p50
NF-\kappaB.
Utilizando una variedad de enfoques
experimentales, estos inventores han demostrado que el proteasoma se
requiere para el procesamiento de p105 a p50. En primer lugar, se
encontró que las proteínas p105/p60Tth no se procesan en
extractos citoplásmico de células de mamíferos con merma de
actividad de proteasoma. Sin embargo, la adición de proteasomas 26S
purificados a estos extractos mermados restaura la actividad de
procesamiento. En segundo lugar, los inhibidores específicos del
proteasoma bloquean la formación de p50 en extractos de células de
mamíferos in vivo. En tercer lugar, la p105 de mamíferos se
procesa a p50 en Sacharomyces cerevisiae in vivo, y
un mutante en la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma
da lugar a disminución significativa en el procesamiento de p105.
EL p60Tth se trata con ubiquitina in vitro y esta
ubiquitinización es un requisito previo para el procesamiento de
p105.
Como se ha mencionado antes, la mitad
C-terminal de p105 (p105C') se degrada rápidamente
durante la formación de p50 y la secuencia de p105C'es notablemente
similar a la de I\kappaB. Debido a la similitud en las estructuras
y actividades de p105C' e I\kappaB-\alpha,
estos inventores iniciaron estudios para determinar si el proteasoma
está también implicado en la inactivación de
I\kappaB-\alpha.
I\kappaB-\alpha se degrada rápidamente en
respuesta a inductores NF-\kappaB y se ha visto
que esta degradación es necesaria para la activación
(Mellitis et al., Nucleics Acids Research
21(22):5059-5066 (1993); Henkel et
al., Nature 365:182-185 (1993); Beg et
al., Molecular and Cellular Biology
13(6):3301-3310 (1993)). Estos inventores han
demostrado ahora que la degradación de
I\kappaB-\alpha y la activación de
NF-\kappaB se bloquea en efecto por inhibidores
de la función proteasoma o conjugación con ubiquitina.
Según esto, el proteasoma desempeña un papel
esencial en la regulación de la actividad de
NF-\kappaB. En primer lugar el proteasoma se
requiere para el procesamiento de p105 y posiblemente p100. La
degradación de C-terminus inhibidor puede también
requerir el proteasoma. En segundo lugar, el proteasoma parece
requerirse para la degradación de
I\kappaB-\alpha en respuesta a inductores
extracelulares.
Esta invención se refiere preferiblemente al uso
de inhibidores de la función proteasoma o conjugación con
ubiquitina de la estructura(1):
donde P es un resto protector de
grupo
amino;
B^{1}, B^{2}, B^{3}, y B^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que comprende
\hskip0.3cm--
\delm{N}{\delm{\para}{}} --
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{}}H -- ; X^{1}, X^{2}, y
X^{3} se seleccionan independientemente del grupo que comprende
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} --
NH --, \hskip0.3cm-- CH_{2} -- NH --,
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{OH}{}}}H -– CH_{2} --,
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{OH}{}}}H --
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{OH}{}}}H,
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{OH}{}}}H – CH_{2} -- NH --,
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm-- CH=CH --;
R es hidrógeno, alquilo, acilo, o carboxilo;
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno,
alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y
-CH2-R^{5},
donde R^{5} es arilo, aralquilo, alcarilo,
cicloalquilo o -Y-R^{6},
donde Y es un anfígeno, y R^{6} es alquilo;
y
A es 0 ó 1.
En una realización preferida de esta invención,
el resto P del inhibidor de proteasoma es (2)
R^{7}-
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}-
y R^{7} es alquilo, arilo,
alcarilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, alcariloxi, o
aralcoxi.
Donde R^{7} es alquilo, es preferiblemente
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
propilo, butilo, o sus isómeros. Adicionalmente, donde R^{7} es
alcarilo, aralquilo, alcoxi, alcariloxi, aralcoxi, su resto alquilo
es también preferiblemente uno que tenga de 1 a 4 átomos de
carbono.
Donde R^{7} es arilo, es preferiblemente arilo
de 6 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, fenilo o naftilo, que
puede, si se desea, estar sustituido en el anillo. Adicionalmente,
donde R^{7} es alcarilo, aralquilo, ariloxi, alcariloxi,
aralcoxi, su resto arilo es también preferentemente uno que tenga de
6 a 10 átomos de carbono.
Se prefiere más que R^{7} sea alquilo o
aralcoxi, lo más preferiblemente metilo o benciloxi, esto es
3 .
En la estructura (1), X representa un enlace
peptídico o un isóstero que puede usarse como una sustitución del
enlace peptídico en los inhibidores de proteasoma para aumentar la
biodisponibilidad y reducir el metabolismo hidrolítico. Como se ha
señalado antes, X puede ser
--
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} -- NH
--, \hskip0.3cm-- CH_{2} -- NH --,
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H –
CH_{2} --, \hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --, \hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H -- CH_{2} -- NH,
\hskip0.3cmo
\hskip0.3cm-- CH=CH --. Preferiblemente X es
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} -- NH --
La introducción de estos restos en los
inhibidores de proteasoma da lugar al siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, si se observa que
Z-Leu-Leu-Leu-H
sufre metabolismo hidrolítico rápido para producir
Z-Leu-OH y
NH_{2}-Leu-Leu-H,
el isóstero de hidroxietileno puede prepararse para eliminar esta
reacción:
Otro isóstero dentro del alcance de esta
invención es el isóstero de azapéptido. Este es el resultado de la
sustitución del átomo de carbono \alpha de un aminoácido con un
átomo de nitrógeno, por ejemplo,
Como se ha indicado antes, A en la estructura
(1) puede ser 0 o 1. Así, cuando A es 0, el residuo aminoácido
dentro de los corchetes no está presente y el inhibidor es un
tripéptido. Similarmente, cuando A es 1, el residuo aminoácido
dentro de los corchetes está presente y el inhibidor es un
tetrapéptido. Se prefiere que A sea 0.
Se prefiere que R^{1} y R^{2} en la
estructura (1) se seleccionen independientemente del grupo que
comprende alquilo y -CH_{2}-R^{5}. Más
preferiblemente, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente
del grupo que comprende grupos alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,
por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, o isómeros suyos, por
ejemplo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, o -CH_{2}-R^{5},
donde R^{5} es cicloalquilo o naftilo. Se prefiere más que al
menos uno de R^{1} y R^{2} sea isobutilo, 12 lo
más preferido es que ambos R^{1} y R^{2} sean isobutilo.
Donde R^{3} es alquilo, es preferiblemente
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
propilo, butilo o sus isómeros, cuyos grupos pueden ser sustituidos
o no sustituidos.
Donde R^{3} es arilo es preferentemente arilo
de 6 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, fenilo o naftilo, cuyos
grupos pueden ser sustituidos o no sustituidos.
Donde R3 es un alquilo sustituido, es
preferiblemente un alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido con
al menos un grupo arilo de 6 a 10 átomos de carbono o al menos un
grupo cicloalquilo, preferiblemente un grupo cicloalquilo que tiene
5 o 6 átomos de carbono, cuyos grupos pueden ser sustituidos o no
sustituidos.
Donde R3 es arilo sustituido, está
preferentemente sustituido con al menos un grupo alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, cuyos grupos pueden ser sustituidos o no
sustituidos.
Donde R^{3} es cicloalquilo, es
preferiblemente cicloalquilo de 5 a 6 átomos de carbono, por
ejemplo, ciclopentilo o ciclohexilo, cuyos grupos pueden ser
sustituidos o no sustituidos.
Donde R^{3} es cicloalquilo sustituido, es
preferentemente sustituido con al menos un grupo arilo de 6 a 10
átomos de carbono o al menos un grupo alquilo, preferiblemente un
grupo alquilo que tiene 1 a 4 átomos de carbono, cuyos grupos
pueden ser sustituidos o no sustituidos.
Donde R^{3} es -Y-R^{6}, Y
es un anfígeno, preferiblemente oxígeno o azufre, más
preferiblemente azufre; y R^{6} es alquilo, preferiblemente
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
propilo, butilo, o sus isómeros.
R en la estructura mostrada antes es hidrógeno,
alquilo, acilo, o carboxilo.
Donde R es alquilo, es preferiblemente alquilo
de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo,
butilo, o sus isómeros.
Donde R es acilo, preferiblemente comprende un
resto carbonilo unido covalentemente a un resto alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo o sus
isómeros, que pueden ser sustituidos o no sustituidos.
Donde R es carboxilo, es preferiblemente un
carboxilo de la estructura [R^{8}]n-COO-,
donde R^{8} es alquileno de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo,
metileno, etileno, propileno, butileno, e isómeros suyos, y n es 0
ó 1, y donde el O final está normalmente unido a un grupo alquilo de
1 a 4 átomos de carbono, que puede ser sustituido o no sustituido,
formando por consiguiente un éster.
R es preferiblemente hidrógeno, alquilo, o
carboxilo; más preferiblemente, hidrógeno.
Ejemplos de inhibidores de proteasoma
convenientes incluyen, sin limitación, los siguientes
compuestos:
(3)Ac-Leu-Leu-Nle-H
(4)Ac-Leu-Leu-Met-H
(5)Z-Leu-Leu-Val-H
(6)Z-Leu-Leu-Nle-H
(7)Z-Leu-Leu-Phe-H
(8)Z-Leu-Leu-Nal-H
(9)Z-Leu-Leu-Gly-H
(10)Zc-Leu-Leu-Ala-H
(11)Z-Leu-Leu-Abu-H
(12)Z-Leu-Leu-Nva-H
\hskip2.9cm
(15)Z-Leu-Leu-Leu-H
(16)Z-Leu-Leu-Ile-H
\hskip3cm
(19)Z-Leu-Leu-Trp-H
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip5.1cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\hskip5cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\hskip3.8cm
\hskip3.8cm
donde:
\hskip3.1cm
Lo más preferible es que los inhibidores de
proteasa sean:
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip2.7cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2.4cm
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.1cm
\newpage
Esta invención se refiere al uso de inhibidores
de la función proteasoma o conjugación con ubiquitina. En esta
invención, la proteolisis acelerada se inhibe por interferencia con
la vía dependiente de Ub-ATP en una o más etapas
posibles (por ejemplo, interfiriendo con la actividad del complejo
de proteasoma 26S, o interfiriendo con la actividad de uno de sus
componentes).
Un enfoque particularmente útil para ensayar
candidatos a fármacos respecto a su capacidad para inhibir el
proceso degradativo dependiente de ubiquitina-ATP es
hacerlo en células cultivadas en las que se produce una proteína de
vida corta cuya degradación es dependiente de ubiquitina. La
inhibición del proceso conduce a acumulación de la proteína en el
citosol. La extensión en que se acumula la proteína en el citosol
puede determinarse utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, un
inhibidor potencial del proceso puede introducirse en las células
cultivadas produciendo una enzima de vida corta y la extensión en
que la enzima está presente en el citosol en presencia del
inhibidor potencial puede compararse con la extensión en que esto
ocurre en su ausencia. La acumulación de la enzima en presencia del
inhibidor potencial es indicativa de la inhibición de los procesos
dependientes de ubiquitina-ATP por el inhibidor
potencial que se ensaya. Pueden utilizarse células cultivadas, como
las células COS, que se transforman establemente con un gen que
codifica una proteína de vida corta cuya degradación es dependiente
de ubiquitina (por ejemplo, una enzima de vida corta, como una
\beta-galactosidasa mutante de E. Coli,
cuya semivida es aproximadamente 15 minutos y cuya degradación es
dependiente de ubiquitina). (Bachmair, A. et al.,
Science 234:179-186 (1986); Gonda, D.K. et
al., J. Biol. Chem. 264:16700-16712
(1989)). También pueden usarse otras formas mutantes de enzimas que
se degradan rápidamente. La acumulación de la
\beta-galactosidasa mutante en citosol COS en
presencia de una sustancia que se evalúa respecto a su capacidad
para inhibir el proceso (un inhibidor potencial) es indicativa de
la inhibición del proceso. Un control apropiado son las células COS
mantenidas bajo las mismas condiciones, pero en ausencia del
inhibidor potencial. Este enfoque puede usarse para investigar los
inhibidores efectivos de caldos microbianos o bibliotecas
químicas.
Las Tablas I-III reúnen
resultados de experimentos cinéticos que midieron la inhibición de
los proteasomas 20S y 26S, así como catepsina B y calpaína. En
estas tablas, se dan los valores K_{i} que son constantes de
disociación para el equilibrio que se establece cuando enzima e
inhibidor reaccionan para formar el complejo enzima:inhibidor.
Las sustancias y las condiciones de ensayo se
indican brevemente en las notas al pie de la Tabla 1. MG 101 y MG
102, también conocidos como Inhibidor de calpaína I y II, se
obtuvieron de Calbiochem como productos de catálogo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- (1)
- La longitud de la cadena peptídica es importante para la potencia inhibidora contra el proteasoma 20S: compárese el K_{i} de 47 nM para Z-Leu-Leu-Nle-H (MG 114) con el K_{i} de 15.000 nM para Z-Leu-Nle-H (MG 105; preparado por Calbiochem como producto de catálogo, no mostrado en las tablas).
- (2)
- La potencia contra el proteasoma 20S aumenta también al aumentar la hidrofobicidad del grupo de bloqueo N-terminal: compárese el K_{i} de 47 nM para Z-Leu-Leu-Nle-H (MG 114) con el K_{i} de 140 nM para Ac-Leu-leu-Nle-H (MG 101).
- (3)
- En la serie de compuestos de la Tabla II en la que la longitud de cadena de alquilo no ramificada aumenta monotónicamente en la posición P_{1} (MG 118 (hidrógeno), MG 111 (metilo), MG 119 (etilo), MG115 (n-propilo), y MG114 (n-butilo)), hay un máximo de potencia con Z-Leu-Leu-Nva-H (MG 115).
- (4)
- La potencia inhibidora contra el proteasoma 26S es siempre menor que la potencia inhibidora contra el proteasoma 20S. La diferencia es más pequeña para Z-Leu-Leu-Nva (MG 115; K_{i20s}=21nM y K_{i26S} =78 nM), Z-Leu-Leu-Nal-H (MG 121; K_{i20S} =25nM y K_{i26S} =70nM), y Z-Leu-Leu-Phe-C(O)-OMe (Mg 113; K_{i20S} =690 nM y K_{i26S} =1.300nM)
- (5)
- Los aldehidos peptídicos que se examinaron inhiben más potentemente la catepsina B y la calpaína que el proteasoma 20S y 26S, excepto para los dos inhibidores con residuos P1 hidrófobos, grandes, Z-Leu-Leu-Phe-H y Z-Leu-Leu-Nal-H (MG 110 y MG 121, respectivamente).
Los datos también muestran que MG 101 es un
inhibidor de la proteasa dependiente de ATP 26S y un inhibidor del
proteasoma (macropaina, proteasa multicatalítica) (Tabla IV).
\vskip1.000000\baselineskip
| MG 101 inhibe formas diferentes de proteasoma muscular | ||
| Preparación de la enzima | Sin inhibidor | MG 101 |
| Eficacia catalítica relativa | K_{i} (\muM) | |
| Proteasoma 20S | 1 | 7 |
| Complejo Proteasoma 26S | 2 | 3 |
| Proteasoma 20S + Activador | 50 | 0,6 |
| muscular de180 kDA | ||
| Proteasoma 20S + SDS | 140 | 0,14 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores pueden usarse in vitro o
in vivo. Pueden administrarse por cualquier número de rutas
alternativas, incluyendo oralmente, por vía intravenosa,
intramuscular, tópicamente, y por infusión. (Platt et al.
EE.UU. Patent Nº 4.510.130; Badalamente et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:5983-5987 (1989);
Staubli et al. Brain Research
444:153-158 (1988)) y se administrarán generalmente
en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable (por
ejemplo, solución salina fisiológica). La cantidad efectiva de
inhibidor a dar se determinará empíricamente y se basará en
consideraciones como el inhibidor particular empleado, la condición
del individuo, y el tamaño y peso del individuo. Pueden
administrarse solos o en combinación con otro inhibidor o un
inhibidor de
otra vía.
otra vía.
\newpage
La Tabla V presenta los datos para la inhibición
de proteasoma 20S por varios inhibidores de aldehídos
tripeptídicos.
\newpage
Esta invención se ilustrará ahora con los
siguientes ejemplos, que no son limitativos en ningún caso.
Ejemplos
1-3
Todas las peptidil
N,O-dimetilhidroxilamidas se prepararon por el
método de fase de disolución utilizando hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
como reactivo de acoplamiento (Sheehan et al. J. Am. Chem.
Soc. 87:2492-2493 (1965)). La reducción de la
hidroxilamida con hidruro de litio y aluminio proporcionó peptidil
aldehido (Fehrentz et al.,
Synthesis:676-678 (1983)); Fehrentz et
al., Int. J. Peptide Protein Res.
26:236-241 (1985)). Todos los compuestos se
caracterizan por espectroscopía de resonancia magnética de núcleos
protónicos. La pureza de los productos se verificó por cromatografía
de capa fina y, en algunos casos, por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC).
Ejemplo
1
Hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(443 mg) en una porción se añadió a una mezcla de sal de
diciclohexilamonio de
N-Boc-L-norvalina
(838), hidrocloruro de N,O-dimetilhidroxilamina (215
mg), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (340 mg), y
N-metilmorfolina (0,28 ml) en dimetilformamida (DMF,
20 ml) a 0ºC. La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas, después a
temperatura ambiente durante 40 horas. La reacción se templó con
agua (80 ml) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (EtOac, 3 x
100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con cloruro de
hidrógeno (HCl) al 10% acuoso, bicarbonato sódico saturado (NaHCO3),
y salmuera, se secaron sobre
sulfato magnésico (MgSO4) anhidro, se filtraron, y se evaporaron para conseguir el producto (546 mg) como un aceite.
sulfato magnésico (MgSO4) anhidro, se filtraron, y se evaporaron para conseguir el producto (546 mg) como un aceite.
Una solución de
N-Boc-L-norvalina
N,O-dimetilhidroxilamida (546 mg) y ácido
trifluoroacético (8 ml) en cloruro de metileno (20 ml) se agitó a
0ºC durante 3 horas. El disolvente se evaporó bajo presión reducida
y el residuo se secó bajo vacío. A este matraz se añadió
Z-L-leucina-L-leucina
(794 mg), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (340
mg), N-metilmorfolina (0,28 ml), y DMF (20 ml). Se
añadió después hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(440 mg) a 0ºC. La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas, después a
temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se templó con
agua (40 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 60 ml) .Las capas
orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3
saturado, y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró, y se
evaporó para conseguir el producto (1,09 g) como un sólido
blanco.
Una solución de
Z-L-leucina-L-leucina-L-norvalina
N,O-dimetilhidroxilamida (1,09 g) se disolvió en 20
ml de tetrahidrofurano (THF ) seco y se enfrió a 0ºC. Se añadió
hidruro de litio y aluminio (solución 1 M en THF; 3,05 ml) y la
mezcla se agitó a 0ºC durante 25 minutos. Se añadió bisulfato
potásico (465 mg) en 20 ml de agua y la mezcla se extrajo con EtOAc
(3 x 80 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 5%
acuoso, NaHCO3 saturado, y salmuera, se secaron sobre MgSO4
anhidro, se filtraron, y se evaporaron para conseguir el producto
(430 mg) como un sólido blanco.
Ejemplo
2
Una mezcla de
N-Boc-L-leucina-L-leucina
(1g), hidrocloruro de N,O-dimetilhidroxilamina (423
mg), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (509 mg), y
N-metilmorfolina (0,42 ml) se disolvió en DMF (20
ml). Se añadió hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(610 mg) a 0ºC durante 2 horas, después a temperatura ambiente
durante 40 horas. La reacción se templó con agua (80 ml) y la mezcla
se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se
lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3 saturado, y salmuera y después
se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron, y se evaporaron para
conseguir el producto (923 mg) como un sólido blanco.
Una solución de
N-Boc-L-leucina-L-leucina
N,O-dimetilhidroxilamida (923 mg) y ácido
trifluoroacético (10 ml) en cloruro de metileno (20 ml) se agitó a
0ºC durante 3 horas. El disolvente se evaporó bajo presión reducida
y el residuo se secó bajo vacío. Una porción de este producto (488
mg) se transfirió a otro matraz se combinó con
Z-L-leucina (451 mg),
1-hidroxibenzotriazol monohidrato (276 mg),
N-metilmorfolina (0,22 ml), y DMF (15 ml). Se
añadió después hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(357 mg) a 0ºC. La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas, después a
temperatura ambiente durante 42 horas. La reacción se templó con
agua (50 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 60 ml). Las capas
orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3
saturado, y salmuera y después se secaron sobre MgSO4 anhidro, se
filtraron y se evaporaron para conseguir el producto como un sólido
blanco. Este se purificó después por cromatografía de gel de sílice
(hexano/acetona 80:20, 70:30) para dar el compuesto del título (546
mg) como un sólido blanco.
Una solución de
Z-L-leucina-L-leucina-L-leucina
N,O-dimetilhidroxilamida (546 mg) se disolvió en 15
ml de tetrahidrofurano seco (THF) y se enfrió a 0ºC. Se añadió
hidruro de litio y aluminio (solución 1M en THF, 4,1 ml) y la
mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos. Se añadió bisulfato
potásico (1,39 g) en 30 ml de agua y la mezcla se extrajo con EtOAc
(3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 5%
acuoso, NaHCO3 saturado, y salmuera y después se secaron sobre
MgSO4 anhidro, se filtraron, y se evaporaron para conseguir el
producto (446 mg) como un sólido blanco. Este se purificó después
por HPLC de fase invertida(agua/acetonitrilo).
Ejemplo
3
Una mezcla de
N-Boc-L-leucina
(2,47 g), hidrocloruro de N,O-dimetilhidroxilamina
(1,09 g), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (1,51
g), y N-metilmorfolina (1,21 ml) se disolvió en DMF
(40 ml), se añadió hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(2,14) a 0ºC y la mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas, después a
temperatura ambiente durante 22 horas. La reacción se templó con
agua (100 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las
capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3
saturado, y salmuera, después se secaron sobre MgSO4 anhidro, se
filtraron, y se evaporaron para conseguir el producto (2,57 g) como
un aceite.
Una solución de
N-Boc-L-Leucina
N,O-dimetilhidroxilamida (983 mg) y ácido
trifluoroacético (8 ml) en cloruro de metileno (20 ml) se agitó a
0ºC durante 3 horas. El disolvente se evaporó bajo presión reducida
y el residuo se secó bajo vacío. Una porción de este producto (208
mg) se transfirió a otro matraz y se combinó con
Boc-L-(1-naftil)-alanina
(378 mg), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (178
mg), N-metilmorfolina (0,15 ml) y DMF (10 ml). Se
añadió después añadió hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(241 mg) a 0ºC durante 2 horas, después a temperatura ambiente
durante 17 horas. La reacción se templó con agua (20 ml) y la mezcla
se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se
lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3 saturado, y salmuera, después
se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron, y se evaporaron para
conseguir el producto como un sólido blanco
(459 mg).
(459 mg).
Una solución de
Boc-L-(1-naftil)-alanina-L-Leucina
N,O-dimetilhidroxilamida (459 mg), ácido
trifluoroacético (5 ml), y tioanisol (2 ml) se agitó a 0ºC durante
2,5 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se secó bajo
vacío. Una porción de este producto (182 mg) se transfirió a otro
matraz y se combinó con
Z-L-(2-naftil)-alanina
(171 mg), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (99
mg), N-metilmorfolina (0,08 ml) y DMF (10 ml). Se
añadió hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(112) a 0ºC. La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas, después a
temperatura ambiente durante 41 horas. La reacción se templó con
agua (20 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las
capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl al 10% acuoso, NaHCO3
saturado, y salmuera, después se secaron sobre MgSO4 anhidro, se
filtraron y se evaporaron para conseguir el producto como un sólido
blanco. Este se purificó después por cromatografía de gel de sílice
(hexano/acetona 80:20, 70:30) para dar el compuesto del título (321
mg).
Z-L-(2-naftil)-Alanina-L-(I-naftil)-Alanina-L-Leucina-N,O-dimetilhidroxilamida
(321 mg) s disolvió en 15 ml de tetrahidrofurano seco (THF) y se
enfrió a 0ºC. Se añadió hidruro de litio y aluminio (1M, solución en
THF, 1,7 ml) y la mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos. Se
añadió bisulfato potásico (0,59 g) en 30 ml de agua y la mezcla se
extrajo con HCl al 10% acuoso, NaHCO3 saturado, y salmuera, después
se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron para
conseguir el producto (274 mg) como un sólido blanco.
El precursor p60Tth (0 p105) se trasladó a
extracto de germen de trigo. La proteína sustrato se mezcló con
extracto citoplásmico celular de HeLa (S100) en un tampón de
procesamiento que contenía Tris 12 mM, pH 7,5, KCl 60 mM, fosfato
de creatina 20 mM, Mg_{2}Cl 3,5 mM y ATP 1 mM. Después de
incubación a 30ºC durante una hora, las mezclas de reacción se
sometieron a inmunoprecipitación con anti-p50 Ab y
las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE. En la
muestra tratada con Apirasa, el p60 se incubó con 10 U de enzima a
37ºC durante 30 minutos para inactivar el ATP residual en el
extracto de germen de trigo antes de añadir el S100 de célula HeLa.
La muestra control no recibió la enzima o ATP. Los resultados se
muestran en la Figura 1.
S100 de célula HeLa se centrifugó durante 6
horas a 100.000xg para separar proteasomas. La pérdida de la
actividad de proteasoma se comprobó utilizando un ensayo de
péptidos fluorogénico específico para el proteasoma. Se muestran
los resultados de dos extractos diferentes mermados en proteasoma
[Pr(I&II)]. El pelet contiene la mayor parte de la
actividad de proteasoma. Las reacciones de procesamiento se
realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 4 y las reacciones se
inmunoprecipitaron con Ab anti-p50 o mAb peptídico
anti-myc. El mAb anti-myc
reconocerá el péptido myc N-terminal sobre una
proteína precursora p60 marcada. Los resultados se dan en la Figura
3.
Anticuerpos monoclonales contra componentes
específicos del proteasoma (MCP20, 29K) y un McAb control McAb
contra hemoglutinina (HA 12CA5) se incubaron con extracto
Pr(II) reconstituido con actividad de proteasoma a partir
del pelet. Los complejos inmunes se separaron y los extractos de la
depleción del proteasoma se usaron en reacciones de procesamiento
de p60 como se describió en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran
en la figura 4.
Cantidades crecientes de proteasomas 20/26S
purificados o una fracción enriquecida con proteasoma de lisato
reticulocito, fracción II, se añadieron solas o se combinaron con
extracto de Pr(II) en una reacción de procesamiento (véase
Ejemplo 4). Además, el procesamiento se inhibió por ATP\gammaS, un
análogo no hidrolizable de ATP que permite la ubiquitinización pero
inhibe la función proteasoma (vías 3-5). Véase
Figura 5.
En este Ejemplo, y en los descritos más arriba,
no hay bandas en forma de escalera que aparezcan cuando el sustrato
se incuba con extractos que carecen de actividad de proteasoma (Pr).
La ubiquitinización de p60 es más pronunciada cuando 7,5 \mug de
ubiquitina purificada (ub) se añaden al extracto (PrII) en una
reacción de procesamiento (vía 5). Véase Figura 6.
Se requiere ubiquitina para el procesamiento de
NF-\kappaB_{1}
A. Cantidades diferentes de fracción II de
reticulocito (+/-7,5 \mug de ub) se usaron en una reacción de
procesamiento (véase Ejemplo 4) con p60 como sustrato. La fracción
II tiene actividad de proteasoma, pero muy poca ubiquitina.
B. S100 de célula HeLa o fracción II se
enriqueció con proteína ub tipo salvaje recombinante de E.
Coli o proteína ub mutante (L>R48), que inhibe la formación
de cadena de ubiquitina. Las reacciones de procesamiento fueron
como se describieron más arriba.
Los resultados se muestran en la Figura 7.
Ambas levaduras tipo salvaje (PRE 1) y mutante
de proteasoma (pr1-1) se transformaron con
p105 humana. Los transformantes se sometieron a pulso con
^{35}S-metionina/cisteína durante 20 minutos y
caza con metionina/cisteína fría durante varios períodos de tiempo.
Se prepararon extractos, los lisatos se inmunoprecipitaron con Ab
anti-p50 y las proteínas se resolvieron por
SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la Figura
8.
Claims (15)
1. Uso de un inhibidor de la conjugación de
ubiquitina para la fabricación de un medicamento para usar en el
tratamiento de un estado inflamatorio.
2. Uso de un inhibidor de una peptidasa o de la
actividad proteolítica de un complejo de proteasoma 20S o
proteasoma 26S en la fabricación de un medicamento para usar en el
tratamiento de un estado inflamatorio.
3. Uso de un inhibidor de la función de
proteasoma o conjugación con ubiquitina para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de la infección con HIV.
4. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de un inhibidor de fórmula I
donde
P es un resto protector del grupo amino;
B^{1}, B^{2}, B^{3}, y B^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en
\hskip0.3cm--
\delm{N}{\delm{\para}{}} --
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{}}H -- X^{1}, X^{2}, y
X^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} --
NH --, \hskip0.3cm-- CH_{2} -- NH --,
\hskip0.3cm
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H -–
CH_{2} --\hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H --, \hskip0.3cm--
\delm{C}{\delm{\para}{OH}}H – CH_{2} --NH --,
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm-- CH=CH -- ;
R es un hidrógeno, alquilo, acilo o
carboxilo;
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno,
alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y
-CH_{2}-R^{5};
R^{5} es arilo, aralquilo, alcarilo,
cicloalquilo o -Y-R^{6};
Y es un anfígeno;
R^{6} es alquilo; y
A es 0 ó 1:
5. Uso como en la reivindicación 4, de un
inhibidor de fórmula I en la que P es
R^{7} --
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}
--y R^{7} es alquilo, arilo,
alcarilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, alcariloxi o
aralcoxi.
6. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 4 y 5, de un inhibidor de fórmula I en la que
X^{1}, X^{2} y X^{3} son
--
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} -- NH --
.7. Uso como en la reivindicación 6, de un
inhibidor de fórmula I en la que A es 0 y B^{1}, B^{2}, y
B^{3} son
--
\uelm{C}{\uelm{\para}{}}H --
.8. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, de un inhibidor de fórmula I en la que
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente del grupo que
consiste en alquilo y -CH-R^{5}, donde R^{5} es
ciclohexilo o naftilo.
9. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8, de un inhibidor de fórmula I en la que
R^{1} y R^{2} son isobutilo.
10. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de un inhibidor seleccionado de lo
siguiente:
Ac-Leu-Leu-Nle-H
Z-Leu-Leu-Val-H
Z-Leu-Leu-Nle-H
Z-Leu-Leu-Nal-H
Z-Leu-Leu-Gly-H
Z-Leu-Leu-Ala-H
Z-Leu-Leu-Abu-H
Z-Leu-Leu-Nva-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Z-Leu-Leu-Leu-H
Z-Leu-Leu-Ile-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Z-Leu-Leu-Trp-H
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
11. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de un inhibidor seleccionado de lo
siguiente:
Ac-Leu-Leu-Met-H
Z-Leu-Leu-Phe-H
(donde Z y Ac son como se define en la
reivindicación 7).
12. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de un inhibidor seleccionado de lo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
13. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de un inhibidor seleccionado de lo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
14. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, de un inhibidor específico de un
complejo de proteasoma 20S o proteasoma 26S.
15. Uso como en una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, de un inhibidor de conjugación con
ubiquitina de NF-\kappaB o I\kappaB.
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|---|---|---|---|
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