ES2183752T3 - Vectores adenovirales recombinantes y su utilizacion en el tratamiento de la cirrosis de higado. - Google Patents

Abstract

Vector adenoviral recombinante que contiene ungenoma adenoviral del cual se han suprimido los tramos delectura abierta E1 y/o E3, pero mantiene una secuencia suficiente para que el vector adenoviral sea capaz de replicar in vitro, conteniendo también dicho vector un gen terapéutico o una secuencia de ADN de interés regulada por promotores ubicuos y/o promotores específicos de tejidos que codifican para proteínas terapéuticas que son útiles en el tratamiento de la fibrosis.

Description

Vectores adenovirales recombinantes y su utilización en el tratamiento de la cirrosis de hígado.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la creación de vectores RECOMBINANTES ADENOVIRALES que vehiculizan genes exógenos que codifican proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la cirrosis HEPÁTICA, y se refiere, asimismo, a un mecanismo de reconocimiento histoespecífico de las células afectadas que se suministra procurando genes terapéuticos a los órganos cirróticos.

Por otra parte, la invención proporciona un procedimiento efectivo para el tratamiento de la fibrosis mediante la utilización de vectores adenovirales recombinantes que se reivindican en la presente memoria, así como el procedimiento para preparar dichos vectores, la composición farmacéutica que los contiene, y sus usos terapéuticos en el tratamiento de varias fibrosis, que representan una gran esperanza comercial en la industria farmacéutica y también una alternativa importante como terapia génica para tratar enfermedades degenerativas crónicas caracterizadas por fibrosis, con una importante aplicación terapéutica en el campo médico.

Introducción Fisiopatología de la cirrosis hepática

La cirrosis hepática es una enfermedad que resulta de una afectación hepática crónica. Esta afectación puede ser tóxica (ingestión crónica de alcohol), infecciosa (hepatitis vírica, principalmente por el virus B y/o C de la hepatitis), inmunológica (cirrosis biliar primaria), por obstrucción biliar (cirrosis biliar secundaria), metabólica (enfermedad de Wilson). Todas las formas de cirrosis tienen características comunes: síntesis y depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (ECM), principalmente colágeno I y en un grado menor, los colágenos IV y III, y consecuentemente la formación de nódulos de hepatocitos, vascularización anormal e hipertensión portal (Antoni PP, Ishak KG, Nayak Nc, Poulsen HE, Sheuer PJ, Sobin LH). Estos procesos fisiopatológicos conducen a una alteración en el suministro sanguíneo y consecuentemente, en la nutrición de las células hepáticas. Sin tener en cuenta el agente etiológico y las diferencias morfológicas, todas las formas de cirrosis tienen como final común la insuficiencia hepática que provoca la muerte del paciente.

Como consecuencia del depósito excesivo de las proteínas del colágeno en el espacio subendotelial de los sinusoides (Espacio de Disse), tienen lugar varios cambios en el microentorno hepático: pérdida de vellosidades del hepatocito, formación de una membrana basal compuesta por los colágenos IV y I que cubren los sinusoides, y pérdida de la comunicación de las células endoteliales que forman los sinusoides. Todos estos procesos son conocidos como "capilarización" de los sinusoides (Scott L. Friedman, The Cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies. The New England Journal of Medicine 1993, vol 328 nº.25:1828-1835). Por tanto, el hígado no es capaz de mantener la concentración fisiológica de solutos en la vena hepática terminal, es decir, se establece la insuficiencia HEPÁTICA. Esta capilarización, con la formación de los endotelios continuos (colágeno de la membrana basal) y la acumulación de otras proteínas colagénicas, representa una barrera para el intercambio molecular normal y bi-direccional entre el plasma y los hepatocitos, como puede apreciarse en la Figura 1, en la que la cirrosis hepática se caracteriza por la acumulación en el hígado del colágeno de tipo I. Con un depósito excesivo de esta proteína, se impide el intercambio libre de nutrientes entre la sangre y las células hepáticas, y no puede llevarse a cabo la inactivación de agentes tóxicos por este órgano, convirtiéndose esto en la causa principal de la patofisiología de la enfermedad. Hasta la fecha, no se ha descrito ningún agente terapéutico que pudiera revertir y/o evitar con una efectividad del 100% la acumulación progresiva del colágeno hepático.

Dichas alteraciones fisiopatológicas que se presentan en la cirrosis hepática son constantes y habituales para los órganos que experimentan asimismo la fibrosis, tales como el pulmón, corazón, riñones, piel, entre otros, que no deberán considerarse como limitaciones del alcance de la protección de la presente invención. Por tanto, la metodología que se presenta en la presente memoria para el tratamiento de la cirrosis hepática podría aplicarse también a aquellos órganos que son susceptibles a, o están dañados por la fibrosis.

Vectores virales y terapia génica hepática

Esta tecnología puede ser aplicada con vectores virales o no víricos. Se han diseñado estudios previos utilizando plásmidos y liposomas (DOTMA) catiónicos y aniónicos, etc. Entre los procedimientos que utilizan vectores virales, los utilizados más habitualmente incluyen el uso de retrovirus y adenovirus.

En algunos protocolos, se han utilizado los vectores retrovirales para introducir genes en hepatocitos (JT, y Curiel DT, Adenoviruses as Vectors for gene Therapy, Science and medicine/1997, 44-53). Sin embargo, tienen que tomarse precauciones, pues estos vectores pueden generar virus potencialmente competentes en la replicación. Entre las ventajas de estos vectores se encuentra su capacidad para integrar su genoma de una forma estable en los cromosomas de la célula huésped, lo que confiere la posibilidad de expresión, de una forma indefinida, del transgén terapéutico clonado en el retrovirus. Por otra parte, hasta la fecha, ningún estudio informó de incidencias en la mutagénesis debidas a la inserción o activación de oncogenes por la incorporación del retrovirus deficiente en la replicación. Sin embargo, la utilización de vectores retrovirales para transducir genes al hígado está limitada por las consideraciones siguientes: 1) estos vectores infectan sólo células que se dividen activamente y 2) se obtienen títulos muy bajos de partículas víricas en las progenies de las células de empaquetamiento que se utilizan para amplificar estos virus (Graham FL, y Van Der Eb AJ. A New technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 ADN. Virology 1973, 52:456-467). Estas dos limitaciones se han superado con éxito en otros protocolos de Terapia Génica mediante la inducción de la proliferación de hepatocitos "in vivo", a través de la utilización de Factores de Crecimiento Hepático y de la hepatectomía parcial, procedimiento quirúrgico mediante el cual la eliminación del 70% de la masa hepática induce la división "in vivo" de las células hepáticas restantes. La utilización de vectores lentivirus ha permitido superar parcialmente dichas limitaciones, a causa de que son capaces de transducir células que no se están dividiendo actualmente.

Antecedentes de la invención

La cirrosis hepática es una enfermedad crónica del hígado, en la que la necrosis celular difusa y una regeneración limitada de las células del parénquima hepático da lugar a un aumento porcentual difuso del tejido conjuntivo, que provoca la deformación de la arquitectura lobular hepática e induce alteraciones hemodinámicas. Por tanto, algunas estrategias para el tratamiento de la cirrosis hepática podrían incluir la prevención y/o la reversión del "proceso fibrogénico", la estimulación de la mitosis hepática y la reorganización de la arquitectura del tejido hepático. Los documentos del estado de la técnica que se relacionan con la presente invención, en lo sucesivo se mencionan únicamente a título de referencia.

La patente US nº 5.240.846 se refiere a la utilización de la terapia génica denominada "CFTR", que induce una corrección estable de la regulación del canal de cloro. Este defecto se encuentra en las células epiteliales. En dicha invención, se utilizan vectores adenovirales recombinantes, así como vectores plasmídicos. Sin embargo, no hay ninguna asociación con los genes terapéuticos de la presente invención. Del mismo modo, la patente US nº 5.910.487 da a conocer la utilización de vectores plasmídicos para enviar moléculas terapéuticas, pero no existe asociación con el suministro de genes de las metaloproteasas MMP-8 latentes y/o activas, MMP-1, MMP-2, MMP-9, y MMP-13; o el "uPA"(uPA tipo salvaje y/o sus versiones modificadas), o "Smad7", o los receptores truncados para el factor-\beta transformante de crecimiento (TGF-\beta tipo II), tal como se presentan en la presente memoria. La patente US nº 5.827.703 se refiere a la utilización del vector adenoviral y del vector adenoviral modificado para enviar genes, no conteniendo ninguno de estos vectores, sin embargo, los genes utilizados en la presente invención para el tratamiento de la fibrosis.

La patente US nº 5.770.442 reivindica la utilización de un adenovirus recombinante que contiene un gen que dirige la expresión de una proteína denominada "fibra" o una proteína denominada "Fibra-quimera", no mencionando específicamente dicha patente, sin embargo, cuál es el gen terapéutico. Asimismo se presenta un procedimiento de terapia génica que implica la utilización de dicho adenovirus y de un vector de transferencia para la generación de dicho adenovirus recombinante. Sin embargo, no se menciona nada respecto a la utilización de genes terapéuticos clonados e insertos en vectores adenovirales recombinantes utilizados en la presente invención en hígados fibróticos, o para otros órganos diana tales como el riñón, pulmón, y las cicatrices hipertróficas. Estos genes terapéuticos son el gen que codifica las metaloproteasas humanas MMP-8 latentes y/o activas, MMP-1, MMP-2, MMP-9, y MMP-13; o el "uPA", el Activador Plasminogénico de la uroquinasa humana (tipo salvaje y/o el huPA modificado), "Smad7", y el receptor truncado para TGF-\beta tipo II, que se reivindica en la presente memoria. Se incluyen asimismo otros miembros de la familia de los genes representados.

La patente US nº 5.166.320 se refiere a la utilización de un sistema de suministro dirigido para introducir genes exógenos en células hepáticas de mamíferos. Pero no existe asociación con genes putativos enviados directamente a hígados cirróticos o a riñones o pulmones cirróticos.

La patente US nº 5.872.154 da a conocer un procedimiento para reducir la respuesta inmune inducida por un vector adenoviral recombinante y un modulador inmune seleccionado, que funciona inhibiendo la formación de anticuerpos neutralizantes y/o reduciendo la muerte de las células infectadas víricamente.

La patente US nº 5.871.982 se refiere a un vector híbrido, en el cual se incluye una parte de un adenovirus, junto con una parte de un vector viral adeno-asociado que contiene un transgén seleccionado. También se da a conocer un virus híbrido formado por la unión de un conjugado con un policatión a una red genómica del vector viral adeno-asociado, para formar una partícula única. Esto es lo contrario a la presente invención, en la que no se utilizan virus híbridos, sino sólo vectores adenovirales. Además, en la patente mencionada anteriormente, el gen, transgén o gen terapéutico utilizado no se da a conocer.

La patente US nº 5.856.152 se refiere a la creación de un vector híbrido que contiene la parte de un vector adenoviral en combinación con un virus adeno-asociado y un gen seleccionado. Mediante el mismo se producen grandes cantidades de vectores recombinantes, pero no vehiculizan genes terapéuticos clonados tales como los que se describen en la presente invención, en la que se utilizan genes terapéuticos específicos para tratar la fibrosis renal y hepática y las cicatrices hipertróficas.

La patente US nº 5.547.932 reivindica un compuesto de complejos de ácidos nucleicos para transfectar células eucarióticas. Estos complejos están formados por ácidos nucleicos y otra sustancia con afinidad por los ácidos nucleicos y opcionalmente, un factor de internalización, tal como un virus o un componente del virus que puede conjugarse. Asimismo, utiliza componentes de vectores adenovirales específicos o de virus específicos tal como Ad2 o Ad5, pero no menciona los genes que son internalizados en el citoplasma celular y eventualmente, en el núcleo de estas células eucarióticas. De modo similar, la patente US nº 5.521.291 se refiere a adenovirus conjugados unidos mediante un anticuerpo a una sustancia con afinidad con los ácidos nucleicos. De esta forma, genes recombinantes son transportados al interior de las células eucarióticas. Estos complejos conjugados y los ácidos nucleicos son internalizados en la célula, pero los genes que pueden ser enviados no se mencionan específicamente. En dicha patente, contrariamente a lo que se da a conocer en la invención inmediata, la utilización de dicho adenovirus para tratar la fibrosis o la cirrosis hepática o cualquier otro tipo de fibrosis, no se menciona.

La patente US nº 5.585.362 se refiere a un vector adenoviral mejorado y a procedimientos para obtener y utilizar dichos vectores. La utilización de vectores adenovirales no se menciona en dicha patente. Sin embargo, los vectores adenovirales que se dan a conocer en la presente invención se utilizaron como vectores para enviar genes terapéuticos.

La patente US nº 5.756.086 reivindica un adenovirus, que está representado mediante una proteína denominada "fibra", incluyendo asimismo el adenovirus un ligando, que es específico para un receptor localizado en un tipo celular específico. Este adenovirus puede tener por lo menos una parte de esta proteína denominada "fibra" y puede ser eliminado y reemplazado con un ligando, el cual es específico para un receptor en células específicas de la economía, tal como los hepatocitos. Este adenovirus puede incluir un gen que codifica un agente terapéutico. Basándose en la declaración anterior, la diferencia técnica destacada de la invención inmediata comparada con el estado de la técnica, es la especificidad del agente terapéutico como las metaloproteasas humanas MMP-8 latentes y activas, MMP-1, MMP-2, MMP-9, y MMP-13; el uPA humano (Activador Plasminogénico de la uroquinasa, tipo salvaje y/o modificado), el receptor truncado para TGF-\beta tipo II y "Smad7" para el tratamiento de varias fibrosis.

La patente US nº 5.895.759 reivindica un vector histo-específico (hígado) para terapia génica que puede utilizarse para enviar genes a un hígado dañado. Estos vectores están química o enzimáticamente acoplados a un promotor y pueden asimismo estar acoplados a un anticuerpo empaquetado en una envuelta polipeptídica. Además, el vector o el virus para su ensayo es el virus B de la hepatitis. Por ello, el envío de genes a hígados dañados que se da a conocer en esta patente, utiliza un sistema completamente diferente del de la presente invención, y no existe relación con el procedimiento de la fibrosis o cirrosis que va a tratarse.

La patente US nº 5.559.099 da a conocer un vector adenoviral recombinante que contiene una proteína quimérica procedente del adenovirus denominada pentona, que incluye una secuencia no-pentona y un gen terapéutico, para desarrollar un procedimiento de terapia génica que implica la utilización de dicho adenovirus, vectores de transferencia adenovírica para la recombinación de dichos vectores adenovirales que contienen un gen terapéutico.

La patente US nº 5.885.808 reivindica asimismo la utilización de adenovirus con moléculas de unión del adenovirus a células diferentes, cuyas moléculas se han modificado, como en las patentes US nº 5.846.782 y 5.712.136, en cuyos vectores adenovirales se utilizan, que se han modificado para contener dominios peptídicos diferentes.

Finalmente, la patente US nº 5.670.488 se refiere a vectores para terapia génica, que son especialmente útiles para la fibrosis quística y menciona asimismo el desarrollo de procedimientos para la utilización de estos vectores. La posible relación de la invención inmediata con el estado de la técnica mencionado, se refiere a la utilización de vectores adenovirales, que pueden ser modificados, así como a la utilización de promotores inducibles que gobiernen la expresión de genes que vayan a ser insertados en estos vectores adenovirales. Sin embargo, las características técnicas de la presente invención se focalizan en la utilización específica de genes terapéuticos para tratar fibrosis de distintos tipos: hepática, renal y pulmonar, así como las cicatrices hipertróficas.

La importancia de la presente invención, contrariamente al estado de la técnica descrito en los documentos mencionados anteriormente, se basa en las características técnicas de la invención en sí misma, así como en las ventajas adicionales derivadas de la misma, que se describen más detalladamente a continuación.

Vectores adenovirales

En la invención inmediata, la utilización de vectores adenovirales se determinó basándose en varias consideraciones: 1) estos vectores pueden generarse para títulos muy altos de partículas infecciosas por ml: (10^{9}-10^{10}); 2) infectan una gran variedad de células, pero sin embargo, cuando se administran intravenosamente, la mayoría de ellos se localizan en el órgano hepático; 3) transfieren eficientemente genes a células que no se están dividiendo, y 4) raramente se integran en el genoma del huésped, lo que evita el riesgo de transformación celular por mutagénesis insercional (Douglas JT, y Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for gene Therapy. Science and Medicine, marzo/abril 1997. 44-53, y Zern AM, y Kresina TF. Hepatic Drug delivery and Gene Therapy. Hepatology 1997, vol. 25, nº 2, 484-491).

Los adenovirus son probablemente los vehículos o vectores más prometedores para el suministro de genes en los protocolos de terapia génica en los seres humanos, pues poseen un único atributo que les proporciona una gran estabilidad cuando se administran en la corriente sanguínea. Esta característica específica les permite ser utilizados eficientemente en ensayos clínicos con una administración intravenosa confortable para el paciente (Douglas JT, y Curiel DT. Adenoviruses as vectors for gene Therapy. Science and Medicine, marzo/abril 1997, 44-53).

Los adenovirus son virus de ADN bicatenario. Poseen una estructura icosahédrica, infectan una gran variedad de tipos celulares de los mamíferos, y soportan la expresión ubicua de un receptor específico en la superficie celular que todavía no se ha identificado. Su unión a las células tiene lugar mediante el componente proteico de la cápside y el virus penetra en la célula mediante endocitosis mediada por el receptor.

Se han identificado más de 40 serotipos de adenovirus humanos distintos, de los cuales el tipo 2 (Ad2) y 5 (Ad5) se han estudiado más extensamente y, por tanto, se han utilizado más ampliamente como vectores para la terapia génica. Una característica muy importante de estos dos serotipos Ad es que nunca se han asociado con procesos malignos en el hombre.

La estrategia para la creación de adenovirus recombinantes se basa en la organización del genoma adenoviral. La expresión de los genes adenovirales tiene lugar en dos fases, temprana y tardía, que se definen por el tiempo de replicación del genoma adenoviral. Los genes tempranos codifican ellos mismos en 4 unidades transcripcionales distintas: E1, E2 y E4 codifican las proteínas reguladoras esenciales que inducen la replicación del ADN adenoviral. El gen E3 no es un gen esencial. Los productos de los genes tardíos incluyen las principales proteínas de la cápside, que se transcriben a partir de un promotor único (Graham FL, y Van Der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973, 52:456-467).

Los adenovirus recombinantes se generan mediante la introducción del gen exógeno o de la secuencia de ADN de interés en sustitución de las regiones del genoma adenoviral necesarias para la replicación del virus. Los vectores adenovirales recombinantes presentan deleciones en las regiones genómicas E1 y E3. La generación de adenovirus recombinantes se lleva a cabo tanto mediante el reemplazo de las regiones E1 ó E3 como mediante la inserción del gen exógeno entre la región E4 y el extremo derecho del genoma adenoviral. Los vectores basados en la inserción del gen exógeno en el extremo derecho del genoma adenoviral o en el reemplazo de la región E3, conservan su capacidad de replicación. Por el contrario, la sustitución de la región temprana E1 produce un vector defectuoso en su capacidad replicativa, que, por tanto, sólo puede multiplicarse en una progenie celular que suministre in "trans" las funciones ausentes de la región adenovírica reemplazada, o en presencia de un virus colaborador. De éstos, los utilizados más habitualmente como vectores de transferencia génica son el adenovirus deficiente en la replicación (Douglas JT, y Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine, marzo/abril 1997. 44-53).

La creación de vectores adenovirales, así como su aplicación para el tratamiento de la fibrosis, se muestran en los ejemplos que se describen a continuación en la presente memoria.

Objetivos de la invención

A continuación se presentan en la presente memoria los objetivos y ventajas derivados de la presente invención.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para preparar los vectores adenovirales recombinantes pAdGFP-MMP-8, mediante la clonación de los genes informadores: lac-7 y GFP y el gen terapéutico de la colagenasa o metaloproteasa MMP-8 en sus formas latentes y/o activas.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un vector radenoviral recombinante con un gen exógeno o secuencia de ADN de interés que codifique proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la fibrosis generalizada, en órganos diana susceptibles de sufrirla. Dichos genes se limitan al MMP-8 activo y latente, (tipo salvaje y/modificado).

Asimismo, en la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen los vectores adenovirales recombinantes en cantidades terapéuticamente efectivas de partículas víricas, para el tratamiento de la fibrosis generalizada; así como su utilización y aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la fibrosis.

Una ventaja de mayor importancia en el tratamiento de las fibrosis generalizadas, particularmente de la cirrosis hepática, es que el suministro de genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el reconocimiento histoespecífico por la vía de administración utilizada.

Otra ventaja de las utilizaciones terapéuticas de la invención, que se dirige inicialmente a revertir la cirrosis hepática, es el tratamiento de la fibrosis generalizada en otros órganos diana susceptibles de padecerla, que no incluye el tratamiento de la fibrosis en el pulmón, corazón, piel, riñón, entre otros, en los mamíferos, incluyendo a los seres humanos.

Otro objetivo es el diseño de una tecnología para enviar genes eficientemente a hígados de animales afectados por la cirrosis, que se parece a dos tipos de cirrosis que afectan habitualmente a los seres humanos (cirrosis alcohólica y Cirrosis Biliar Primaria).

Otra ventaja que resulta del tratamiento de la fibrosis es que el adenovirus recombinante no induce toxicidad letal en ninguno de los animales inyectados con los vectores.

Otro objetivo de la invención nos permite discriminar la modificación de la reacción de tinción con X-Gal entre la actividad histo-galactosidásica endógena y la galactosidásica bacteriana inducida por la acción infecciosa del vector adenoviral. La utilización de la proteína fluorescente verde nos permite comprobar la transducción in vivo de distintos órganos en ratas para comprobar si la administración del vector fue la apropiada. Si la expresión permanece, y además no mata a los animales, es posible llevar a cabo una observación de seguimiento después de la cirugía.

Finalmente, toda esta evidencia nos permitió sugerir que nuestro sistema comprende un vehículo eficiente para suministrar genes terapéuticos tales como los de las metaloproteasas MMP-8 activas y latentes, a hígados de ratas cirróticas, con la finalidad de restablecer las funciones hepáticas normales o las funciones normales de otros órganos afectados por la misma patología.

Así, en la presente invención se proporciona un procedimiento de preparación de vectores adenovirales recombinantes, composiciones farmacéuticas y utilizaciones terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis, especialmente para el tratamiento de la cirrosis hepática.

Breve descripción de los dibujos

Otras particularidades y ventajas de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente de los objetivos y formas de realización preferidas y a partir de las reivindicaciones y de los dibujos adjuntos, en los que:

la Figura 1 muestra la fisiopatología celular de la cirrosis hepática;

la Figura 2 muestra la demostración conceptual de cómo actúa la terapia génica revertiendo el proceso cirrótico;

la Figura 3 es la representación esquemática que muestra la clonación y producción del vector adenoviral Ad5-gal;

la Figura 4 muestra el desarrollo esquemático del sistema AdEasy para generar adenovirus recombinantes, específicamente el pAdGFP-MMP-8;

la Figura 5 muestra los análisis de la expresión de la galactosidasa en las células cultivadas.

la Figura 6 muestra la determinación de la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) en las células cultivadas;

la Figura 7 muestra la expresión de -galactosidasa en distintos órganos después de la infusión con Ad5 gal a través de la vena ilíaca.

la Figura 8 muestra el análisis del tropismo del vector Ad5-gal para diferentes órganos de animales experimentales cirróticos por la intoxicación crónica con CCl_{4}, demostrando que el principal órgano diana es el hígado;

la Figura 9 muestra el análisis del tropismo del vector Ad5-gal para diferentes órganos de animales experimentales cirróticos. La cirrosis fue inducida por la ligadura de las vías biliares y se demostró que el principal órgano diana es el hígado,

la Figura 10 muestra cortes histológicos de imágenes representativas de los ensayos de transducción de la eficiencia in vivo del vector Ad5-gal en ratas cirróticas con administración crónica de CCl_{4};

la Figura 11 muestra cortes histológicos de imágenes representativas de los ensayos de transducción de la eficiencia in vivo del vector Ad5-gal en ratas cirróticas por la ligadura habitual de las vías biliares;

la Figura 12 muestra la determinación in vivo de la expresión de la proteína fluorescente verde;

la Figura 13 muestra la estrategia de clonación del MMP-8 latente y del MMP-8 activo;

la Figura 14 muestra los mecanismos de la formación del complejo con ADN de MMP-8s para ensayos de transfección in vitro en células de origen hepático (HepG2);

la Figura 15 muestra la comprobación mediante electroforesis en geles de agarosa del éxito de la clonación de los cADNs MMP-8 en los plásmidos apropiados;

la Figura 16 muestra la eficiencia de transfección en células HepG2 (Células de origen hepático) con los plásmidos de -galactosidasa y cADN-MMP-8;

la Figura 17 muestra el análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a la transcriptasa inversa (RT-PCR) de los ARNs mensajeros MMP-8;

la Figura 18 muestra el análisis de la actividad colageno-lítica en la proteína secretada al medio de cultivo por las células HepG2 después de la transfección con los cADNs para la MMP-8 latente y la MMP-8 activa;

la Figura 19 muestra la regulación hormonal de la expresión del gen MMP-8 bajo el control transcripcional del promotor regulable PEPCK; y

la Figura 20 muestra el ensayo dosis-respuesta de las distintas dosis utilizadas para determinar la mejor respuesta de la transducción hepática "in vivo" con el gen informador de la galactosidasa.

Descripción detallada de la invención

Existen muchos informes que muestran que mediante la administración sistémica de los vectores adenovirales recombinantes (AdR) a animales experimentales sanos, se observó un tropismo buscador y altamente preferente por el hígado de estos vectores. Hasta la fecha, no se conocía si los AdR eran capaces de transducir hígados cirróticos de rata. Como se ha mencionado anteriormente, la cirrosis hepática se caracteriza por un aumento de la fibrosis en la totalidad del parénquima hepático, alrededor principalmente de las venas centrales y portales, creando una barrera que obstaculiza el intercambio de macromoléculas entre los sinusoides y los hepatocitos (Antoni PP, Hishack KG, Nayak NC, Poulsen HE, Scheuer PJ, Sobin LH). The morphology of cirrhosis: Definition, nomenclature and classification. Bulletin of the World Health Organization. 1977; 55:521-540 y Scott L. Friedman: The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies, The New England Journal of Medicine, 1993, Vol. 328, nº 25: 1828-1835), y este protocolo se diseñó para comprobar si incluso en presencia de esta barrera, los genes exógenos podrían suministrarse sistémicamente al hígado cirrótico.

Por tanto, la hipótesis según la presente invención es que los AdRs que contienen los genes informadores LacZ y GFP (proteína fluorescente verde) son capaces de transducir hígados de ratas cirróticas incluso si la arquitectura lobular hepática está deformada.

Por lo tanto, se podría enviar a estos hígados genes terapéuticos tales como los de las metaloproteasas o los de las colagenasas MMP-8 humanas latentes y activas, MMP-1, MMP-2, MMP-9, y MMP-3; o el "uPA", el Activador Plasminogénico de la uroquinasa humana (tipo salvaje y/o modificado); o el Smad7, o el receptor truncado para el TGF-\beta tipo II, que degradan el exceso de proteínas colagénicas depositadas y/o evitan la síntesis exacerbada de proteínas colagénicas, tal como se muestra en las Figuras 2 y 18; y/o genes que codifican proteínas que estimulan la regeneración hepática tal como uPA, para restablecer el funcionamiento normal del hígado, tal como se muestra en la Figura 2.

La invención actual inicia una línea de investigación para llevar a cabo la terapia génica como una alternativa para el tratamiento de enfermedades degenerativas crónicas, específicamente de la cirrosis hepática en los seres humanos, estableciendo un vehículo eficiente para enviar genes al hígado que producirán proteínas terapéuticas para ayudar a restablecer las funciones normales del hígado, véase la Figura 2. Ésta muestra cómo enviando eficientemente un gen terapéutico al hígado, en este caso, una colagenasa (metaloproteasa de la matriz, MMPs), es posible promover la degradación del colágeno mediante la sobre-expresión de estas metaloproteasas.

En la Figura 3 se muestra la estrategia para la clonación y producción de un vector adenoviral. El plásmido pDeltaE1sp1B contiene secuencias del adenovirus Ad5, en las cuales se insertó el gen bacteriano Lac-z. Este plásmido se recombinó con el pBHG10 para obtener partículas víricas completas después de co-transfección en la progenie celular 293. El vector pAdGFP se obtuvo de la siguiente manera: el gen MMP-8 (procedente del plásmido PEPCK-MMP-8) se clonó en el vector vehículo pAdTrack-CMV, linearizándose el plásmido resultante con la endonucleasa de restricción Pme l, y entonces se transformó en E. coli (BJ5183) con el plásmido pAdEASY-1. Las colonias recombinantes se seleccionaron respecto a la resistencia a la kanamicina, y se confirmó la recombinación mediante análisis de restricción con endonucleasas. Finalmente, el plásmido recombinante linearizado se transfectó en la progenie celular de empaquetamiento (células 293), obteniéndose los adenovirus recombinantes entre los 7 y 12 días, tal como se ilustra en las Figuras 3 y 4 (Tong Chuan H., Shibin Z., Luis T. Jian Y, Kenneth W. y Volgestein Bert: A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Prod. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95:2509- 2514, marzo 1998). Para evaluar el grado de transducción in vitro, se utilizaron la progenie celular hepática HepG2 y macrófagos peritoneales aislados del ratón. En la Figura 5, se muestra la expresión de la -galactosidasa en las células cultivadas. A), B) y C) corresponden a las células HepG2 (32OX); D), E) y F), son macrófagos peritoneales del ratón (100X). En C) y en F) las células transducidas se muestran con 1 x 10^{8} partículas víricas/ml del vector Ad5.Gal. Se utilizaron tres técnicas para comparar el grado de incorporación del gen informador Lac-Z, que se administró a cada placa de cultivo en forma de ADN PGK-Gal plasmídico, mediante precipitación con fosfato Ca^{++}: (Chen C, y Okayama H: Calcium Phosphate mediated gene transfer, a highly efficient system to establish transforming cells with plasmidic DNA. Biotechniques 1988, 6:632-638), complejos de ADN-polilisina-lactosa: (Martínez-Fong D., Mullersman JE, Purchio AF, Armendariz-Borunda J., y Martínez-Hernández A., Non enzymatic glycosylation of poly-L-lysine: A new tool for targeted gene delivery. Hepatology, Vol 20, nº.6: 1602-1608), con los vectores Ad5-gal y pAdGFP-MMP8. Visualización de la actividad de Gal: Se comprobó con el reactivo Xgal y el GFP en un microscopio-estereoscopio de fluorescencia. Para el ensayo in vivo, se estandarizó la tinción gal utilizando distintos pHs de la suspensión con el reactivo Xgal (Weiss DJ, Ligitt D., y Clark JG. In situ photochemical detection of galactosidase activity in lung: assessment of Xgal reagent in distinguished Lac-Z gene expression and endogenous galactosidase activity. Human being therapy. 1 septiembre, 1997, 8:1545-1554).

Los modelos de cirrosis hepática experimental que se utilizaron fueron: a) Intoxicación crónica causada por tetracloruro de carbono (CCl_{4}), en la que la cirrosis hepática se estableció a partir de la 8ª semana de administración peritoneal (Mion F, Geloen A, Agosto E. y Minaire Y. Carbon tetrachloride induced cirrhosis in rats: influence of the acute effects of the toxin on glucose metabolism. Hepatology 1996, vol. 23, nº 2:582-587), y b), ligadura de las vías biliares (LCB) en la que se observa la cirrosis después de la cuarta semana de cirugía (Lee S, Giraud C., Draillon A., HADengue A., y Lebec D., Hemodynamic characterization of chronic bile duct ligated rats; effect of pentobarbital sodium. AM Journal fisiol. 1986; 251:176-180; Nakano S., Harakane J. y Hashimoto H., Alteration in peribiliary ducts microcirculation in rats after common bile duct ligation. Hepatology, 1995, vol. 21, nº: 5: 1380-1995; Dumas Walla R., Belcowitz D., y H.Eubi JE. Adaptive response of the Enterohepatic circulation of bile acid to extra hepatic. Cholestiasis hepatology 1996, Vol. 23, nº 3:623-629 y Poo J.L., Stanes A., Pedraza-Chaverri J., Cruz C., Pérez C., Huberman A., y Uribe M: Cronología de la Hipertensión Portal, Disminución de la Excreción de sodio y activación del sistema renina-angiotensina en cirrosis biliar experimental. Rev. Invest Clin., 49:15-23, 1997).

Ad5 gal se administró al mismo tiempo y a partir del mismo lote para controlar las ratas sin cirrosis. Las ratas con 5 y 8 semanas de intoxicación por CCl_{4} y las ratas con 2 y 4 semanas con ligadura de las vías biliares (BDL), se sacrificaron 72 horas después de la administración del adenovirus recombinante, para llevar a cabo el análisis histológico y la determinación de la expresión de la proteína galactosidasa (gal) codificada por los AdR. Con esta finalidad, se extrajeron el hígado, bazo, corazón, pulmones, riñones y cerebro, realizándose cortes tisulares en forma de cubo de 5 a 6 mm, que se absorbieron en medio Tissue-Tek O.C.T. congelado; los tejidos se congelaron a -30ºC y se cortaron con un crióstato para obtener cortes de 8 \mum. Estos cortes se situaron sobre portaobjetos silanizados de vidrio y se fijaron con formalina, pH 8,5, durante 15-30 minutos, exponiéndose a Xgal durante 16-18 horas, sometiéndose a tinción de contraste con Rojo N Neutro. (Weiss DJ. Ligitt D. y Clark JG. In situ Hiti Chemical Detection of galactosidase activity in lung: assessment of Xgal reagent in distinguishing 1AC-Z Gene expression and endogenous galactosidase activity. Human Gene Therapy, 1 septiembre, 1997, 8:1545-1554). El porcentaje de células positivas se determinó mediante análisis morfométrico en múltiples campos del mismo tamaño, y calculando el promedio. Además, se obtuvieron cortes hepáticos de ratas cirróticas y se absorbieron los tejidos en parafina, seccionándose y tiñéndose con rojo Sirius, que tiñe específicamente las proteínas colagénicas (Armendariz-Borunda J., y Rojkind M., A simple quantitative method for collagen typing in tissue samples: its application to Human liver with schistosomiasis. Collagen Rel. Res 1984, Vol 4, 35-47). Mediante esta técnica se puede comprobar claramente el grado de fibrosis y el aumento de las vías biliares en el parénquima hepático. Para comprobar la transducción in vivo de células con GFP, se utilizaron ratas Wistar sanas que recibieron el vector pAdGFP-MMP-8. 72 horas después, se llevó a cabo una laparatomía y los órganos expuestos se visualizaron en el microscopio de fluorescencia, cerrando posteriormente la herida para dejar que el animal siguiera viviendo.

Los resultados previos que se presentan en la presente memoria con respecto al estudio de la fisiopatología de la cirrosis hepática experimental, se sumarizan en la Figura 2. Dicha figura muestra el papel de las citoquinas proinflamatorias y profibrogénicas producidas in vivo por las células de Kupffer, las cuales, a su vez, activan las células hepáticas estrelladas (HSC) para que ellas produzcan colágeno en exceso que se deposite en el espacio subendotelial, que obstruya el intercambio entre los hepatocitos y los sinusoides (Armendariz-Borunda J., Katayama K., y Seyer J.M: Transcriptional mechanisms of tipe I collagen gene expression are differentially regulated by IL-beta, TNF alfa y TGF into cells. J. Biol. Chem. 267:14316-14321, 1992; Armendariz-Borunda J., Katai H., Jones C.M. Seyer J.M. Kang A.H. y Raghow R: Transforming grow factor beta is transiently enhanced at a critical stage during liver regeneration following CCL4 treatment. Laboratory Investigation. 69:283294, 1993 y Armendariz-Borunda J., Roy N., Simjewish C., Raghow R., Seyer J.M. y Kang A.H.: activation of Ito cells involves regulation of APl collagen Gene Expression. Biochemical Journal 304: 817-824, 1994). El grado de incorporación del gen Lac-Z en las células cultivadas mostró diferencias visibles entre las técnicas de Fosfato de Calcio, los complejos ADN-polilisina-lactosa y (las técnicas) con el vector adenoviral recombinante en HepG2 y PMM (macrófagos peritoneales del ratón). El grado de transducción con adenovirus alcanza el 100% y con las otras dos técnicas, el 1% aproximadamente, tal como se muestra en la Figura 5. La Figura 6 muestra la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) en células cultivadas. A). Macrófagos peritoneales del ratón transducidos con el vector adenoviral pAdGFP-MMP8, 72 horas después de su administración (50X). B). Células HepG2 transducidas con el vector adenoviral pAdGFP-MMP8, 72 horas después de su administración (50X) y C). Células HepG2 sin el vector adenoviral. Todas las fotografías se tomaron en un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Es necesario puntualizar que en el desarrollo para identificar la actividad galactosidásica, las células deben fijarse y mueren. En el ensayo GFP, las células están todavía intactas y vivas.

La Figura 7 muestra la expresión de gal en distintos órganos d después de la infusión con Ad5 gal por la vena ilíaca. Las soluciones de fijación, lavado y Xgal utilizando diferentes pHs, se utilizaron para discriminar entre la expresión galactosidásica endógena y la bacteriana exógena. En la Figura A, se utilizó un pH de 7,0 y en la Figura B el pH fue de 8,5. Este es el sumario de los resultados de los ensayos de las distintas condiciones experimentales y puede apreciarse que la exposición tisular a la solución de Xgal con un pH de 8,5 nos permitió eliminar la expresión de la galactosidasa endógena. Se obtuvieron cortes de tejido congelado de distintos órganos: hígado, bazo, corazón, pulmones, riñones y cerebro de ratas normales y de las intoxicadas con CCl_{4} durante cinco y ocho semanas. Tal como se representa en la Figura 8, los gráficos muestran claramente que el principal órgano diana es el hígado, tanto en las ratas sanas como en las ratas a las que se había administrado crónicamente el CCl_{4}. A) 5 semanas de administración de CCl_{4} B) 8 semanas de administración de CCl_{4}. El bazo y el pulmón presentan un grado de transducción inferior al 1%, y por tanto, esto no es evidente a partir de los gráficos. Las ratas recibieron dosis de 3 x 10^{11} partículas víricas/ml del vector Ad5 gal. Las ratas de control sanas presentaban un total del 70% de hepatocitos transducidos, mientras que el bazo y el pulmón mostraron una transducción de menos del 1%. En los otros órganos, no se encontró transducción. Se obtuvieron cortes tisulares a partir de ratas sanas tal como se ha descrito anteriormente, y se compararon con los tejidos de las ratas con 2 y 4 semanas de BDL. La Figura 9 muestra claramente cómo el principal órgano diana es el hígado, tanto en ratas sanas como en ratas BDL. A) 2 semanas de LCB y B) 4 semanas de BDL. El bazo y el pulmón presentan un grado de transducción inferior al 1%, y por tanto, es apenas evidente en los gráficos. Con una dosis de 3 x 10^{11} partículas víricas/ml del vector AD5gal, las ratas BDL presentan un total del 10% de los hepatocitos transducidos. Además del hígado, el bazo y el pulmón presentaban una transducción menor del 1%. Los otros órganos no mostraron transducción. En la Figura 10, se muestran los resultados histológicos con el modelo de cirrosis hepática inducido por la administración crónica de CCl_{4}, en el que A) representa un corte hepático de una rata normal, 72 horas después de la administración de Ad5 gal por la vena ilíaca (un corte representativo de los experimentos de un total de 5 ratas). Más del 70% de los hepatocitos son positivos para la expresión de gal (200X); D) El mismo hígado que en la Figura A, pero teñido con Rojo Sirius para observar la síntesis del colágeno y el depósito (200X); B) hígado con 5 semanas de intoxicación crónica con CCl_{4}. A Alrededor del 30-40% de los hepatocitos fueron transducidos con é éxito; E) Los mismos hígados que en B, pero teñidos con Rojo S Sirius, el aumento en la cantidad de colágeno es notable y la a arquitectura hepática empieza a deformarse (200X); C) hígado de rata después de 8 semanas de intoxicación crónica con CCl_{4} para provocar cirrosis, fueron positivas más del 40% de las células hepáticas, una vez más, para la expresión de \betagal, y F) los mismos hígados que en C, pero teñidos con Rojo Sirius. Los abundantes depósitos de colágeno formados entre las venas central y portal (200X), son característicos. En la Figura 11, se muestran los resultados obtenidos en el modelo de cirrosis inducida por la ligadura de las vías biliares (BDL). A) muestra un corte hepático de una rata normal 72 horas después de la administración de Ad5 gal por la vena ilíaca (una incisión representativa de los experimentos de un total de 5 ratas). Más del 70% de los hepatocitos son positivos para la expresión de gal (200X); D) el mismo hígado que en la Figura A, pero teñido con Rojo Sirius para observar el colágeno (200X); B) hígado de rata después de 2 semanas de BDL. El ensayo \beta-gal se llevó a cabo 72 horas después de la administración de Ad5\betaGal, vía vena ilíaca. Alrededor del 10% de los hepatocitos fueron transducidos con éxito con el gen informador; E) Los mismos hígados que en B, pero teñidos con Rojo Sirius. La arquitectura hepática empieza a deformarse debido a la fibrosis inducida por la coléstasis, a así como por el importante aumento de las vías biliares (200X); C) hígado de rata después de 4 semanas de BDL para provocar cirrosis. El ensayo \beta-gal se llevó a cabo 72 horas después de la administración de Ad5\betaGal, vía vena ilíaca. Una vez más, el 10% de los hepatocitos fueron transducidos con éxito, y F) los mismos hígados que en C, pero teñidos con Rojo Sirius. Obsérvese el abundante depósito formado por proteínas del colágeno, así como la proliferación de las vías biliares (200X). La Figura 12 muestra una laparatomía de una rata Wistar sana que recibió el vector pAdGFP-MMP-8. La expresión del GFP se aprecia claramente en el hígado, y en cantidades insignificantes en el bazo. Un hecho muy importante es que la inyección de vectores adenovirales no indujo toxicidad letal en los animales de experimentación, tanto en los sanos como en los controles.

La forma preferida de poner en práctica la presente invención es mediante la administración endovenosa de los vectores adenovirales recombinantes de la presente invención o de la composición farmacéutica que los contiene, en el cual la cantidad terapéuticamente efectiva se administra en un régimen de dosis unitaria que sea conveniente para un individuo con fibrosis. Este régimen puede ajustarse según el grado de afectación. Generalmente, se utilizan dosis unitarias de alrededor de 10^{7} a 10^{14} partículas víricas por individuo. La preparación de una composición farmacéutica que incluye los vectores adenovirales recombinantes de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando técnicas estándar muy bien conocidas por los expertos en la materia, en combinación con cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptables que se describen en e el estado de la técnica, que incluyen sin limitación almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gel, malta, arroz, harina de trigo, creta, gel silíceo, estearato de magnesio, estearato de sodio, polvo de monoestearato de glicerilo, NaCl, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares. Estas composiciones pueden adoptar la forma farmacéutica de soluciones, suspensiones, grageas, comprimidos, cápsulas, polvos, fórmulas de liberación lenta, y similares.

La descripción anterior y los ejemplos siguientes tienen la finalidad de ilustrar las formas de realización particulares de la invención, y no deben considerarse como limitaciones del alcance de la presente patente.

Ejemplos Ejemplo 1 Metodología para demostrar la actividad de la metaloproteasa o de la colagenasa (MMM-8) y cómo regular su función a)Cultivo celular

Las células HepG2 son una progenie celular de origen parenquimático derivadas de un hepatoma humano, y se cultivaron en una placa de cultivo de 60 mm, a 37ºC, en una atmósfera húmeda, con un 95% de aire y un 5% de CO_{2} en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM L-Glutamax y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina).

b) Vectores de Expresión de los genes MMP-8 latentes y activos

Se utilizaron dos plásmidos con 2 tipos de genes MMP-8 para transfectar las células hepáticas: el plásmido pcD-NA-MMP-8 que contiene el cADN que codifica el MMP-8 latente (pro-MMP-8) junto con el potente promotor vírico del citomegalovirus (CMV); y el plásmido pcDNA_{3}MMP-8, que contiene el cADN que codifica el MMP-8 activo, junto con el promotor CMV. Este último se creó mediante subclonación, utilizando los plásmidos pcDNA_{3} y PETIIa-HNC, seccionando con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, e insertando el producto PCR que codifica el dominio catalítico de MMP-8 (al que le faltan los fragmentos propéptido y terminal carboxilo), como muestra en la Figura 13, el suministro de los genes MMP-8 latentes y activos. Con el gen MMP-8, se utilizaron dos tipos de plásmidos para ser suministrados a células hepáticas en cultivo: 1) PcDNA_{3}-MMP-8, plásmido con el potente promotor vírico del citomegalovirus (CMV) y el cADN que codifica la colagenasa en su forma activa.

Como gen informador, se utilizó un plásmido pSV_{2}-gal. Dicho plásmido posee el gen que codifica el enzima galactosidasa insertado, adyacente al promotor del virus SV40.

c) Transformación plasmídica, amplificación y purificación

Para obtener una cantidad lo bastante grande para la utilización de cada uno de los plásmidos en los diversos ensayos, cada plásmido se introdujo en E. coli DH5^{TM} (este proceso se conoce como transformación), según las instrucciones del proveedor. (Life Technologies, Gaithersburg, MD): en un tubo de reacción se utilizaron 50 l de la cepa competente DH5, añadiéndose 2 l de plásmidos (1-10 ng de ADN). Después de mezclar, se incubó en hielo durante 30 minutos, aplicándose entonces un choque térmico (37ºC durante 20 segundos), y enfriándose después en hielo durante 2 minutos. Al final del este período de tiempo, se añadieron 0,95 ml del medio de cultivo bacteriano Luria Base (LB) y se agitó a 225 rpm durante una hora, a 37ºC, por la noche, para permitir que se llevara a cabo la expresión plasmídica. Después de la expresión, se tomaron 50 l de la mezcla reactiva y se sembraron en una placa de Agar con 100 g/ml de ampicilina, incubándose a 37ºC durante la noche. Las colonias que se desarrollaron después de este período son las que contienen el plásmido de interés, a causa de la resistencia contra el antibiótico.

Para amplificar el plásmido, se tomaron dos colonias de la placa de agar y se hicieron crecer durante 24 horas a 37ºC, con agitación constante a 225 rpm, en 1 litro de medio LB que contenía 100 g/ml de ampicilina. Una vez que la densidad óptica del cultivo alcanzó 0,6, se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para recuperar el sedimento bacteriano. A partir de éste, se separó el ADN plasmídico del ADN genómico de la bacteria utilizando un equipo de purificación de plásmidos (Monster-prep, BIO101, Vista, CA), que se basa en la lisis alcalina de la pared bacteriana, la liberación del plásmido en su interior y la separación de este ADN a través de una resina particular. La cuantificación del ADN plasmídico se realizó midiendo espectrofotométricamente la absorbancia resultante a \lambda = 260 nm.

d) Transfección de las células cultivadas

Uno de los procedimientos más utilizados habitualmente para introducir genes en las células eucarióticas, es la transfección del ADN con fosfato de calcio, en la que el ADN exógeno se precipita como un fino complejo sobre la superficie celular, para ser incorporado posteriormente por la célula e integrarse transitoriamente en el ADN cromosómico. Para suministrar el ADN con más selectividad para las células hepáticas, el ADN se utiliza en forma de complejo con polilisina-lactosa, a causa de que las células hepáticas tienen un receptor específico para la Galactosa en su membrana celular. Para esto, las células HepG2 se cultivaron con una confluencia del 70-80%, y se transfectaron entonces con los plásmidos pcADN-MMP-8, pcADN_{3}-MMP-8 y pSV_{2}-galactosidasa. La transfección se llevó a cabo mediante la precipitación del ADN con el fosfato de calcio (Graham, y Van derEb, 1973; Chen y Okayama 1988) y mediante la formación de complejos con polilisina-lactosa (Martinez-Fong et al, 1994). Brevemente, las células cultivadas se añadieron al precipitado nuevamente formado, producto de la adición al ADN plasmídico de una solución de ADN con CaCl_{2} 2M; y en el caso de transfección con fosfato cálcico o complejo del ADN con polilisina-lactosa, se añade solución tampón HEPES pH 7,12. Las células se incuban entre 4 y 16 horas para permitir que el precipitado aparezca en la superficie celular, y posteriormente, el ADN puede ser endocitado e introducido transitoriamente en el núcleo. Al final de este tiempo, el medio de cultivo se reemplaza por uno recién preparado, (véase la Figura 14, en la que las células HepG2 se cultivan con medio DMEM con suero fetal bovino al 10%). Cuando se alcanza una confluencia del 60-80%, 10 mg del plásmido con el gen MMP-8 se añaden en su forma latente, así como en la forma activa o madura. Al mismo tiempo, el gen procariótico de galactosidasa (-gal) se añade para controlar la transfección y la eficiencia de la expresión. El gen MMP-8 se envió en formas diferentes: desnudo, formando complejo con CaPO_{4} o formado complejo con la polilisina-lactosa.

e) Formación de complejos polilisina-lactosa y ADN: polilisina- lactosa (ADN:PL)

El complejo polisina-lactosa se forma cuando 14,8 mg de poli-L-Lisina (0,1 N) reaccionan con 200 l de lactosa 0,5 N (relación lactosa-polilisina: 1,0 N). Entonces, se añaden 20 mg del agente reductor cianoborohidruro sódico 3M, incubándose a 37ºC durante 48 horas agitando constantemente a 225 rpm. Entonces, la reacción se desarrolla a través de una columna de desalación (BioRad 10-DG) acondicionada previamente con tampón fosfato (PBS pH 7,2), que se eluyó con el mismo tampón. Se determinó el contenido en hidratos de carbono en las fracciones eluídas mediante el procedimiento de DuBois (1956) para analizar el grado de lactosilación del complejo y el contenido de polilisina según el procedimiento de Shen et al (1984), que se considera como una base para evaluar la concentración final del complejo PL. La fracción con una mayor concentración de PL se utilizó para que reaccionara posteriormente con el ADN del plásmido que contenía el gen de interés, tal como se muestra en las figuras 14 y 16.

Para evaluar la relación molar óptima ADN:PL de utilización en los ensayos de transfección, el ADN se hizo reaccionar con varias concentraciones de PL. Al final de una hora de incubación, las muestras se aplicaron a un gel retardador de agarosa al 1%, sometiéndose a electroforesis del ADN (60 milivoltios, 1,5 h), en la que el complejo ADN:PL con el contenido más importante de PL recorre una distancia más corta que la recorrida por el plásmido libre (retraso del 0%). La relación ADN:PL que provocó del 80 al 90% del retraso de la migración en el gel de agarosa se utilizó, tal como se muestra en la Figura 16, para obtener una expresión eficiente de los genes exógenos de -galactosidasa y pcADN-MMP-8 suministrados a las células HepG2 en complejos con CaPO_{4} y polilisina-lactosa.

f) Ensayos de expresión transitoria utilizando el sistema gen informador de -galactosidasa (gal)

Este sistema determina la actividad de la enzima -galactosidasa como medida del nivel de expresión del gen transfectado de interés, junto con el gen lacZ que codifica esta enzima. La galactosidasa es una enzima bacteriana que cataliza la conversión del sustrato X-gal incoloro a un producto de color azul. A causa de esto, la actividad galactosidásica observada en las células eucarióticas sometidas a transfección indicará la incorporación exitosa del gen de interés asociado al gen bacteriano.

El ensayo de -gal para la tinción de las células en la placa de cultivo consiste en la fijación de las células a 4ºC durante 5 minutos con p-formaldehído al 2%, el lavado subsiguiente con PBS (3X) y la adición de un ml de una solución colorante en PBS conteniendo 20 mM de ferricianuro de potasio, 20 mM de ferrocianuro de potasio y 2 mM de cloruro magnésico, seguido por la adición del sustrato Xgal a una concentración final de 0,5 mg/ml. Después de la incubación a 4ºC por la noche (18 horas), las células azules se identificaron bajo el microscopio (Ausubel, 1995).

g) Extracción del ARN

48 horas después de la transfección, se recuperaron las células para extraer el ARN mediante el Procedimiento de Chomczynski y Sacchi (1987), utilizando el reactivo de Trizol^{TM}, tal como se describe a continuación: a cada una de las placas con los cultivos celulares se añadió un ml de solución PBS, recuperándose las células raspándolas de la placa y trasfiriéndolas a un tubo de Eppendorf. Se centrifugó entonces a 1000 rpm durante 1 minuto, tratándose el sedimento celular con 500 l de Trizol, homogeneizándose e incubándose durante 5 minutos a 4ºC. Se añadieron 100 \mul de cloroformo, y se llevó a cabo la incubación durante 5 minutos a 4ºC. Después de esto, se centrifugó a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC y la fase acuosa superior se transfirió a un tubo limpio en el que se añadió un volumen idéntico de isopropanol y se incubó a -70ºC durante 15 minutos para precipitar el ARN extraído. Entonces, se centrifugó a 12.000 g durante 115 minutos a 4ºC, eliminándose el sobrenadante mediante decantación y secando el tubo con un papel limpio y esterilizado. Entonces, 500 l de etanol al 75% se añadieron, centrifugándose a 12.000 g durante 10 minutos a 40ºC. Finalmente, el sedimento de ARN se volvió a suspender con 20 a 50 l de agua desionizada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y se cuantificó la concentración de ARN mediante espectrofotometría a \lambda=260 nm.

h) Análisis de la expresión del gen MMP-8 mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) asociada a la reacción de la transcriptasa inversa (RT-PCR)

Para determinar el grado de expresión del gen exógeno de MMP-8 incorporado a la célula, se obtuvo ADN complementario (cADN) a partir del ARN previamente extraído, amplificando entonces la señal de expresión mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Para obtener el cADN, se utilizó el siguiente procedimiento: se tomaron 2 g del ARN total hasta un volumen de 8 l con agua desionizada y esterilizada, incubándose a -70ºC durante 10 minutos. Entonces, la muestra se agitó en agua helada durante 5 minutos y todavía en el hielo, se añadieron los siguientes reactivos: 4l de 5X tampón para el enzima RT, 4l de una mezcla de dNTP's 2,5 mM, 1l de cebadores al azar (1 g/l), 1l del inhibidor de la RNAsa (una U/l) y, finalmente, 2 l de la enzima Transcriptasa Inversa (200 U/l). La mezcla reactiva se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y entonces, a 37ºC durante 1 hora. Al finalizar ésta, se puso inmediatamente a una temperatura de 95ºC durante 10 minutos, y a continuación, en agua helada durante 5 minutos con agitación constante, almacenándose a -70ºC hasta utilización posterior.

Para analizar la expresión específica del gen MMP-8, se llevó a cabo una reacción PCR utilizando los cebadores u oligonucleótidos específicos para este gen, según las condiciones experimentales que se describen a continuación en la presente memoria: en un tubo de reacción que contiene 2l de cADN, 5l de 2,5 mM MgCl_{2}, 5l 5X tampón para la enzima polimerasa del virus murino Moloney de la leucemia (MMLV), 1 de 2,5 mM dNTPs, 5 l del cebador con sentido 3.\muM, 5l del cebador antisentido 3\muM, 1l de la enzima polimerasa (U/l), se toma hasta un volumen final de 50 l con agua desionizada (Innis et al, 1990). El cebador oligonucleótido con sentido, específico para MMP-8 es 5'-AGCTGTCAGAGGCTGGAGGTAGAAA-3' y el cebador antisentido es 5'-CCTGAAAGCATAGTTGGGATACAT-3' (Cole et al,. 1996). Después de la adición de estos reactivos, la mezcla se situó en un ciclador térmico durante 30 ciclos según el programa siguiente: desnaturalización, (94ºC, 5 min), hibridación (60ºC,1 min), y extensión (72ºC, 1,5 min). Entonces, los productos PCR se sometieron a electroforesis (60mV, 1,5 h) en un gel de agarosa al 1,5%.

i) Ensayo de actividad colagenásica

El análisis de la actividad enzimática de la colagenasa se llevó a cabo para determinar la funcionalidad de la enzima producida, porque esta proteína podría encontrarse enzimáticamente inactiva, incluso si la expresión del ARN fuera positiva. Las células se cultivan en medio sin suero durante 24 horas, recuperándose el medio de cultivo y determinándose la colagenasa secretada por las células mediante un procedimiento modificado de Hasty et al (1986) para identificar productos de degradación del sustrato colágeno específico mediante una electroforesis en g gel de poliacrilamida al 8%.

Brevemente: los sobrenadantes celulares que contienen de 1 a 1,5 g de proteínas, se incubaron a 27ºC durante 18 horas con 5g de colágeno nativo tipo l y 60 l del tampón de incubación: 50 mM Tris-HCl, 5 mm CaCl_{2}, NaN_{3} al 0,02%, 50 mM de arginina, Tritón X-100 al 1% y en ausencia o presencia de 1 mM APMA, pH 7,6. Finalmente, 30 l del producto de la reacción se mezclaron con 30 l de tampón de la muestra para proteínas, llevándose a cabo la electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (7,5%) para identificar los productos de degradación 1^{A} y 2^{A} del colágeno de tipo 1.

Ejemplo 2 Resultados para demostrar la actividad de la metaloproteasa o la colagenasa (MMP-8) y por lo tanto para regular su función

La subclonación permitió incorporar el cADN MMP-8 que codifica la enzima plenamente funcional a un vector apropiado para nuestras necesidades. Así, la Figura 15 muestra una electroforesis de fragmentos de ADN liberados seccionando los plásmidos MMP-8 con los enzimas de restricción. Carril A). Marcador de pares de bases del ADN escalonado de 1Kb (Gibco BRL); B). Marcador absoluto del ADN (Novagen, Inc.); 1) Sección de pcD-NA-MMP-8 con BamHI y Xbal; 2) sección de pcADN3-MMP-8 con BamHI y Xbal; C) marcador \phiX174 (Gibco BRL); Marcador \lambdaHind (III (Gibco BRL), en el que el MMP-8 cADN (carril 1) y el MMP maduro (carril 2) se subclonaron con éxito en los vectores de expresión pcADN y pcADN3. Los insertos liberados se observan después de tratamiento con los enzimas de restricción BamH1 y Xbal. Las bandas teñidas con bromuro de etidio corresponden a cada uno de los cADN (entre 506 y 560 pares de bases) para el MMP-8 cADN maduro y latente, respectivamente. Para evaluar la eficiencia de la incorporación del cADN para MMP-8 suministrada a las células HepG2 en forma de complejo con CaPO_{4} y con la polilisin-lactosa, la co-transfección de este plásmido se llevó a cabo conjuntamente con el gen informador de la -galactosidasa. De esta forma, las células que se observaron en el microscopio con tinción azul, indican indirectamente que asimismo han incorporado al plásmido de interés. La Figura 16 muestra la expresión de -galactosidasa en las células HepG2, cotransfectadas con el plásmido libre, en forma de complejo con CaPO_{4}, o en su forma de complejo con polilisina-lactosa. Esta Figura muestra que se llevó a cabo la unión del ADN con la polilisina-lactosa, porque cuanto más alta era la concentración de polilisina, más claro era el retraso del plásmido-gal. La relación seleccionada para transfectar las células fue la que retrasó un 80% la migración del plásmido.

Una vez demostrado que las células cultivadas son capaces de incorporar y expresar genes que se han transfectado, fue necesario corroborar, mediante ensayos RT-PCR, que dichos genes se han transcrito mediante la maquinaria de las células huésped. La Figura 17 muestra un análisis mediante RT-PCR del ARN mensajero para MMP-8 y MMP-13. (Este plásmido se utilizó como ootro control positivo de la transducción); en el cual una electroforesis del ADN de los productos amplificados mediante PCR del cADN para la MMP-8 suministrada como complejo con CaPO_{4} y polilisina-lactosa, se transcribió en ambos casos en las células HepG2 transfectadas. Se observa que la señal del producto de la PCR de MMP-8 (359 pares de bases), fue más intensa cuando el plásmido se suministró como un complejo con polilisina-lactosa.

Para demostrar que el transcrito de MMP-8 expresado por las células HepG2 se tradujo en una proteína funcional, se llevó a cabo el ensayo respecto a la actividad enzimática, utilizando el colágeno de tipo I como sustrato. La Figura 18 muestra la actividad enzimática de la degradación del colageno tipo I de la proteína secretada en el medio de cultivo, que se observó en las células transfectadas con el gen de la MMP-8 latente, con una activación previa con el agente mercurial APMA (carril 7) y con CaPO_{4} (carril 9) y con la polilisina-lactosa (carril 10) formando complejo con el gen de la MMP-8 activa, y su inhibición específica con EDTA 2 mM. Controles negativos: colágeno de tipo Sin añadir sobrenadantes de células (carril 1) y añadiendo tripsina (carril 3), colágeno con sobrenadantes de células sin transfección (carril 2). Controles positivos: colágeno de tipo I con sobrenadante de leucocitos humanos (carril 3), colágeno de tipo I añadiendo colagenasa bacteriana al 0,015% (carril 4); y productos de degradación del colágeno nativo de tipo I separados en un gel de poliacrilamida al 6%, incubándose después con el sobrenadante de células transfectadas con genes MMP-8 activos y latentes. Se observó cómo en ambos casos la actividad colagenolítica es clara en presencia de APMA en el caso de la MMP-8 latente y su inhibición por EDTA tanto para la MMP-8 latente como para la activa. Este hecho muestra que esta actividad proteolítica corresponde a una metaloproteasa de la matriz intersticial. La incubación del colágeno nativo de tipo I con tripsina no mostró degradación. Por tanto, este experimento muestra claramente que la acción de la MMP-8 fue específica, considerando la naturaleza intacta de la molécula de colágeno.

La Figura 19 muestra evidencia de que actividades de las enzimas que degradan específicamente al colágeno pueden ser controladas (suprimidas y/o puestas en marcha) mediante la clonación de sus cADNs respectivos, que están ellos mismos bajo el control transcripcional de promotores de genes regulables, tales como el gen PEPCK (Fosfoenol-piruvato carboxiquinasa). Está claro que la estimulación, tanto de las células cultivadas con glucagón (carriles 5 y 6), como con el AMP cíclico (carriles 7 y 8), regula al alta su producción de ARN mensajero, que codifica la MMP-8. Asimismo, está claro que la insulina disminuye dicha producción (carriles 9 y 10).

Las observaciones con respecto a la actividad de la -galactosidasa endógena sugieren que esta actividad se expresa en gránulos y con un color más débil que el azul oscuro, debido a la actividad de la enzima exógena (Shimohama S., Rosenbergh MB. Fagan AM, Wolff JA, Short MP, Bradfield XO, Friedman T., y Gage FH: Genetically Modified Cells into the rat brain: Characteristics of E. coli-Galactosidase as a reporter gene. Brain Res.5: 271-278, 1989). Se han descrito muchas modificaciones para aumentar la especificidad en la determinación del ensayo del gen Lac-Z exógeno. Así, según la información previa proporcionada por Weiss, DJ, Ligitt D., y Clark JG, (In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung. Assessment of Xgal reagent in distinguishing Lac Z gene Expression and endogenous -galactosidase activity. Human Gene Therapy, September 1, 1997,8:1545-1554), en la presente invención se utilizó una solución de X-gal con un pH de 8,5; de esta forma, se demostró la actividad de la -gal exógena, minimizando la actividad endógena in vivo.

Uno de los indicadores que se utilizan actualmente para el control in vivo de la eficiencia y localización de las células transducidas con adenovirus recombinantes, es la detección de la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP). A este respecto, el gen que codifica esta proteína se subclona en los vectores adenovirales, y entonces, mediante la utilización de un microscopio de fluorescencia, puede observarse directamente la fluorescencia proporcionada por GFP sin sacrificar al animal de experimentación que recibió el vector (Rojas-Martinez, A, Wyde PR, Montgomery CA, Chen SH, Woo SLC y Aguilar-Cordova E: Distribution toxicity and lack of replication of an E1A-recombinant adenoviral vector after systemic delivery in the cotton rat. Cancer Gene Ther. 1988, y TongChuan H., Shibin Z., Luis T., Jian Y, Kenneth W., y Vogelstein Berth: A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci.USA Vol 95:2509-2514, marzo 1998). Se ha obtenido un gran número de datos que muestran que, después de la administración por vía intravenosa de los adenovirus en animales sanos, las principales células diana fueron los hepatocitos. Esto se ha observado en ratones, conejos, perros y primates (Zem AM: y Kresina TF, Hepatic drug delivery and gene Therapy. Hepatology 1996, vol 25, nº2, 484-491), pero no en ratas cirróticas. Probablemente, la inyección en la vena porta podría resultar más eficiente para alcanzar las células diana en el hígado, proporcionando a éstas un inóculo favorable de partículas víricas para la totalidad del hígado, antes de que las partículas se diluyan en la corriente sanguínea. Esta vía es eficiente, pero tiene el inconveniente de que requiere una laparatomía. Por otra parte, la administración peritoneal es una infusión más rápida y simple, pero no promueve la transducción hepatocítica. Los resultados de la presente invención muestran que la inyección de 3 X 10^{11} partículas víricas por la vena ilíaca en ratas Wistar normales de 200 g aproximadamente, da lugar a un nivel muy alto de expresión (70% de los hepatocitos transducidos). Nuestros resultados están de acuerdo con un informe previo en el cual el suministro específico de genes informadores a los primates por la vena safena produjo casi el mismo nivel de transducción y expresión del transgén en el hígado, comparado con la infusión a través de la vena portal (Marie Jean TFD, Poeters V., Lieber A., Perkins J., y Kay MA. Methods for multiple portal vein infusion in mice: Quantitation of adenovirus-mediated hepatic gene transfer. Biotechniques February 1996, 20; 278-285 y Zhu G. Nicholson AG. Zheng X., Strom TB, y Sukhame VP. Adenovirus mediated-galactosidase gene delivery to the liver leads to protein deposition in kidney glomeruli. Kidney International, 1997, vol 52, 992-999). Además, la expresión del gen informador en nuestros animales con cirrosis inducida mediante administración crónica de CCl_{4} fue sorprendentemente casi tal alta como en las ratas normales (40% de los hepatocitos transducidos). Estos resultados son muy excitantes, porque nuestros animales cirróticos apenas pudieron sobrevivir al procedimiento quirúrgico requerido para administrar el adenovirus por la vena portal. Esto es debido a ensayos hepáticos funcionales alterados, y a un tiempo elevado de protrombina, así como a hemorragias importantes. Aunque las ratas con ligadura de vías biliares mostraron una reducción sustancial en el número de hepatocitos transducidos (entre el 5 y el 10%), es también importante el número de hepatocitos que podrían ser transducidos eventualmente con genes terapéuticos, tal como las metaloproteasas (MMP-8) y/o genes que codifican proteínas estimulantes para la regeneración hepática, tal como uPA (Activador Plasminogénico de la Uroquinasa) y Smad 7.

Las definiciones de los símbolos utilizados en las figuras que corresponden a la presente invención, se muestran a continuación:

Figura 1

CEH = célula hepática estrellada

CES = célula sinusoidal endotelial

CK = célula de Kupffer

ESET = espacio subendotelial

HE = hepatocitos

HIDC = hígado con lesión crónica

HN = hígado normal

SINU = sinusoide

Figura 2

COLASA = colagenasa

DCA = degradación del colágeno

TGE = terapia génica experimental

MMPs = metaloproteasas

Figura 3

CT293 = co-transfección en células 293

PG CsCl = purificación con gradientes de CsCl

Figura 4

BD = brazo derecho

BI = brazo izquierdo

CTBK = co-transfección en bacterias y selección en kanamicina.

CUL = cultivo

Ll Pacl = linearización con Pac I

Li Pmel = linearización con Pme I

PV = partículas víricas

t293 = transfección de células 293

GENADR = generación de adenovirus recombinantes.

Figura 7

B = bazo

CE = cerebro

CO = corazón

%CT = porcentaje de células transducidas

H = hígado

P = pulmón

R = riñón

Sad-gal = sin el vector Ad-gal

CAD-gal = con el vector Ad-gal

X-GAL7 = Reactivo X-gal, pH 7,0

X-Gal 8.5 = Reactivo X-gal, pH 8,5

Figura 8

B = Bazo

CCl45 = 5 semanas de intoxicación con CCL_{4}

CCl48 = 8 semanas de intoxicación con CCL_{4}

CE = Cerebro

CO = Corazón

%CT = % de células transducidas

H = Hígado

P = Pulmón

R = Riñón

PV = partículas víricas

HN = hígado normal

Figura 9

B = Bazo

CE = Cerebro

CO = Corazón

% CT = Porcentaje de células transducidas

H = Hígado

LCB2S = 2 semanas de ligadura de las vías biliares

LCB4S = 4 semanas de ligadura de las vías biliares

P = Pulmón

R = Riñón

PV = partículas víricas

HN = hígado normal

Figura 13

PROT = Proteína

APMA = ACETATO AMONOFENIL DE MERCURIO

Figura 14

ACT-gal = actividad galactosidasa

CES = Células

EAC = Actividad enzimática

PL = Polilisina

PROT = Proteína

RGAL = Residuos de galactosa

SNAD = Sobrenadante

Figura 16

ADND = ADN desnudo

GELRADN-PL = Gel de retardo para la polilisina

Figura 18

CA = Con APMA

CACE = Con APMA y EDTA

CaPO_{4} = Fosfato

CE = Con EDTA

COB = Colagenasa bacteriana

COL1 = Colágeno de tipo I

PL = Polilisina

SA = Sin APMA

SNL = Sobrenadante leucocitario

ST = No transfectada

TRIP = Tripsina

Figura 20

% CT = % de células transducidas

PV = partículas víricas.

Claims (8)

1. Vector adenoviral recombinante que contiene un genoma adenoviral del cual se han suprimido los marcos abiertos de lectura E1 y/o E3, pero conserva una secuencia suficiente para que el vector adenoviral sea capaz de replicarse in vitro, conteniendo asimismo dicho vector un gen terapéutico o una secuencia de interés de ADN, regulada por promotores ubicuos y/o promotores histoespecíficos, que codifica una proteína terapéutica formada por MMP-8.

2. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 1, en el que el promotor histoespecífico es PEPCK.

3. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 1, que consiste en un vector viral o un vector no vírico.

4. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 3, que consiste en un vector no vírico seleccionado a partir de un plásmido o de un liposoma catiónico o aniónico.

5. Procedimiento para preparar un vector adenoviral recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho procedimiento comprende una etapa de clonación de genes informadores Lac-Z y GFP y del gen terapéutico o la secuencia de interés del ADN.

6. Composición farmacéutica que comprende un vector adenoviral recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, combinado con un vehículo farmacéuticamente compatible.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que cada dosis unitaria comprende entre 10^{7} y 10^{14} partículas víricas para un individuo afectado de fibrosis.

8. Utilización del vector adenoviral recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de la cirrosis hepática.