ES2193896T3 - Procedimiento para producir peptidos por el uso de un sistema de transcripcion/traduccion in vitro. - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir un péptido o un derivado peptídico usando bien sea: (a) un sistema de reacción para transcribir DNA en RNA y luego traducir el RNA producido o bien sea (b) un sistema de reacción para traducir RNA in vitro, caracterizado porque todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción están marcados con un marcador capaz de unirse selectivamente a un adsorbente y dicho adsorbente se usa para capturar dichos componentes proteínicos marcados después de la traducción del péptido o derivado peptídico, permitiendo así que el péptido o derivado peptídico producido sea separado de los componentes proteínicos marcados que constituyen el sistema de reacción.

Description

Procedimiento para producir péptidos por el uso de un sistema de transcripción/traducción in vitro.

Campo técnico al que pertenece la invención

Esta invención se refiere a un proceso para producir un péptido o un derivado peptídico empleando un sistema de reacción de transcripción de un DNA en un RNA y luego de traducción del RNA producido o un sistema de reacción de traducción de un RNA in vitro (en lo sucesivo denominado "sistema de reacción de transcripción /traducción in vitro") y a un kit de componentes proteínicos que comprende enzimas y factores para la constitución de este sistema de reacción.

Fundamento de la invención

Se conocen desde hace tiempo sistemas de síntesis de proteínas exentos de células, derivados de Escherichia coli, reticulocitos de conejo, o germen de trigo. (Current Opinion in Biotechnology 9:534-548 (1998), J. Biotechnology 41:81-90 (1995)). En todos estos sistemas exentos de células, los péptidos pueden sintetizarse en varias horas. Es decir, las proteínas pueden sintetizarse en un corto periodo de tiempo en comparación con el caso en el que se insertan genes extraños en células hospedantes y luego se expresan en ellas (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), FEBS Letters 414:268-270 (1997)). Además, se reconoce o se espera que la síntesis de proteínas en sistemas exentos de células tenga cierto número de ventajas técnicas, al menos teóricamente, respecto al caso de insertar genes extraños en células hospedantes y expresar dichos genes. Es decir, el uso de estos sistemas de síntesis de proteínas exentos de células hace posible producir péptidos que podrían ser digeridos por proteasas que se originan en células hospedantes, y péptidos que muestran toxicidad en células hospedantes. También es posible usando estos sistemas producir derivados peptídicos que no se presentan en la naturaleza incorporando residuos de aminoácidos no naturales en posiciones específicas usando aminoacil-tRNA cargado por residuos de aminoácidos naturales (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:435-462 (1995)), o complejos (conjuntos de polisoma) compuestos de mRNA, ribosoma y péptido. Estos conjuntos de polisoma y su utilización se describen por He M. et al., J. Immunological Methods 231 (2000) pp. 105-117, Schaffitzel C., J. Immunological Methods 231 (2000) pp. 119-135, Roberts RW., Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) pp. 268-273 and ibid. 9 (1998) pp. 534-548 (en particular, en la página 453 y siguientes) y, además, se describen, por ejemplo en FEBS Lett. 450:105-110 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135 (1998), y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997).

Aunque en la primera etapa se emplearon extractos de células crudos per se, por ello solamente podían realizarse reacciones inestables y así se sintetizaron solamente péptidos con bajo rendimiento, es decir, desde 0,1 a 0,01% de células vitales. Estudios posteriores han clarificado los componentes contenidos en los extractos que son necesarios para la expresión de genes y simultáneamente revelaron que componentes innecesarios e inhibidores (por ejemplo nucleasa endógena que degrada el mRNA (RNA 6:1079-1090 (2000)) están contenidos en dichos extractos. Por tanto se han hecho intentos de eliminar estos componentes innecesarios. Sin embargo, el método convencional, que comprende usar un extracto exento de células como una base y eliminar los componentes no necesarios de dicha base, adolece del problema de que se consume energía de reacción y por tanto la reacción se detiene en aproximadamente 1 hora en la síntesis de proteínas cuando se usa un sistema por lotes. Se señala que los factores causantes de estos problemas incluyen el agotamiento de los trifosfatos de nucleótidos (Biochim. Biophys. Acta. 1293:207-212 (1996), J. Biotechnol. 48:1-8 (1996)), la acumulación de pequeños sub-productos, tales como hidrolizados de trifosfatos formados por enzimas endógenas (Biochemistry 22:346-354 (1983), J. Biol. Chem. 260:15585-15591 (1985)) y consumo de energía por factores no necesarios para la reacción de transcripción/traducción (J. Ferment. Bioeng. 84:7-13 (1997), J. Biotechnol. 61:199-208 (1998)).

El problema de la terminación de la reacción dentro de un corto tiempo puede evitarse suministrando continuamente un sustrato a un sistema de reacción de transcripción/traducción para sintetizar un péptido. Sin embargo, también en este caso se produce otro problema de mala reproducibilidad. Este problema se ha resuelto clarificando la presencia de un inactivador de un ribosoma de germen (tritina) y un inhibidor de la iniciación de la traducción en estudios en un sistema que usa germen de trigo y que emplea medios de eliminar estas sustancias del germen (Bio Industria Vol.17, No.5, 20-27 (2000)). Sin embargo, todavía existe otro problema que es que tal sistema consume una fuente energética masiva que se desperdicia independientemente de la traducción.

Se consideró que estos problemas que se encuentran en los métodos convencionales eran causados por la presencia de diversos componentes desconocidos en los extractos de células, los cuales no eran necesarios en la reacción de transcripción o traducción, pero que difícilmente podían eliminarse por completo. Desde este punto de vista, se hizo un intento para sintetizar un péptido in vitro usando exclusivamente enzimas y factores esencialmente requeridos en la traducción (The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894 (1997)). Para la síntesis dirigida por DNA de \beta-galactosidasa en este caso, se usó exclusivamente, además de ribosomas de E. coli, los siguientes 33 componentes purificados de extracto de E. coli como factores y enzimas para la transcripción y la traducción: RNA-polimerasa, N^{10}-formiltetrahidrofolato-Met-tRNA^{f}-transformilasa, 20 aminoacil-tRNA-sintetasas, IF-1, IF-2, IF-3, EF-Tu, EF-G, RF-1 y/o RF-2, CRP, L y L_{\alpha}... En este estudio, sin embargo, el producto deseado sólo podía obtenerse en una cantidad traza, puesto que en aquellos días sólo estaban disponibles una defectuosa información acerca del mecanismo de la traducción y técnicas de purificación insuficientes.

Subsiguientemente, Gonza y sus colaboradores construyeron un sistema de síntesis de péptidos in vitro a partir de diversos aminoacil-tRNAs pre-cargados (es decir, que tenían aminoácidos activados unidos a ellos) y factores de traducción purificados (Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:792-798 (1985)). Por otra parte, Pavlov y sus colaboradores reconstruyeron un sistema de traducción in vitro usando una mezcla parcialmente purificada de aminoacil-tRNA-sintetasa con factores de traducción purificados (Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No.1, 9-16 (1996)). También construyeron un sistema de traducción in vitro completamente purificado usando un corto mRNA artificial (J. Mol. Biol. 273:389-401 (1997)). Sin embargo, nunca se ha descrito, que sepan los inventores de la presente solicitud, que una proteína se sintetiza satisfactoriamente a partir de mRNA natural usando un sistema de traducción que comprende exclusivamente enzimas y factores esenciales. En los sistemas de síntesis de péptidos convencionales exentos de células y en los sistemas de síntesis de péptidos in vitro que usan extractos de células, además, se necesitan métodos engorrosos para aislar y purificar un producto peptídico diana de los componentes proteínicos del sistema de reacción y, por consiguiente, el péptido deseado puede obtenerse sólo con un pobre rendimiento.

Sumario de la invención

La presente invención pretende construir un sistema eficaz de síntesis de proteínas, con el cual puede superarse el problema del consumo de energía de los sistemas para sintetizar péptidos in vitro, y proporcionar un sistema de síntesis de péptidos in vitro, con el cual puede aislarse eficazmente el producto peptídico del sistema de reacción con una alta pureza.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un péptido o un derivado peptídico empleando bien sea: (a) un sistema de reacción para transcribir DNA en RNA y luego traducir el RNA producido o bien sea (b) un sistema de reacción para traducir RNA in vitro, caracterizado porque todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción están marcados con un marcador capaz de unirse selectivamente a un adsorbente y dicho adsorbente se usa para capturar dichos componentes proteínicos marcados después de la traducción del péptido o derivado peptídico, permitiendo así que el péptido o derivado peptídico producido sean separados de los componentes proteínicos marcados que constituyen el sistema de reacción. En este procedimiento, puede emplearse un número variado de combinaciones de marcador y adsorbente en el sistema de reacción de transcripción/traducción.

Los componentes proteínicos marcados son factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción y otras enzimas requeridas para la constitución del sistema de reacción.

Ejemplos particulares de los factores y enzimas incluyen factores de iniciación, factores de prolongación (también denominados en español factores de elongación, factores de terminación, aminoacil-tRNA-sintetasa, metionil-tRNA-transformilasa y RNA-polimerasa.

Ejemplos de las enzimas requeridas en la constitución del sistema de reacción distintas de los factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción incluyen enzimas para regenerar energía en el sistema de reacción y enzimas para hidrolizar ácido pirofosfórico inorgánico formado durante la reacción de transcripción o de traducción.

De acuerdo con la presente invención, se pueden producir péptidos no naturales que llevan residuos de aminoácidos no naturales incorporados en las posiciones deseadas y derivados peptídicos, tales como conjuntos de polisoma, empleando el sistema de reacción para transcribir un DNA en un RNA y luego traducir el RNA producido o traducir un RNA in vitro que esta libre de los factores de terminación.

En la presente invención, luna combinación de sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad, es decir, marcador y adsorbente, pueden seleccionarse de entre una combinación de un fragmento de una proteína o de un péptido con un ion metálico, una combinación de un antígeno con un anticuerpo, una combinación de una proteína con un fragmento de proteína o de péptido, una combinación de una proteína con un compuesto específico de bajo peso molecular seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos, DNAs, colorantes, vitaminas y lectinas, una combinación de una proteína con un sacárido y una combinación de una proteína o un fragmento de péptido con una resina de cambio iónico. Entre todos, es favorable usar una combinación de cola marcadora (en lo sucesivo simplemente "cola") de histidina con un quelato metálico, tal como un complejo de níquel o un complejo de cobalto aprovechando un enlace entre un fragmento de péptido o de proteína y un ion metálico.

Las sustancias que se adhieren entre una a la otra utilizables en la presente invención, es decir, marcador y adsorbente, no están restringidas a una combinación de sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad. Para ello se puede hacer uso de, por ejemplo, sustancias que también se adhieren magnéticamente una a la otra.

La presente invención se refiere a demás a un kit de componentes proteínicos para un sistema de reacción para producir un péptido o un derivado peptídico transcribiendo bien sea (a) DNA en RNA y luego traduciendo el RNA producido o bien sea (b) traduciendo RNA in vitro, caracterizado porque el kit comprende todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción y porque todos los componentes proteínicos del kit están marcados con un marcador que es capaz de adherirse selectivamente a un adsorbente.

En este kit, los componentes proteínicos marcados son factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción y otras enzimas requeridas en la constitución del sistema de reacción. Ejemplos particulares de los factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción incluyen factores de iniciación, factores de prolongación, factores de terminación, aminoacil-tRNA-sintetasa, metionil-tRNA transformilasa y RNA-polimerasa. Ejemplos particulares de las enzimas requeridas en la constitución del sistema de reacción distintas de los factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción incluyen enzimas para regenerar energía en el sistema de reacción y enzimas para hidrolizar ácido pirofosfórico inorgánico formado durante la reacción de transcripción o traducción. El kit de componentes proteínicos de acuerdo con la presente invención puede comprender un adsorbente para capturar los componentes proteínicos marcados con un marcador.

El kit de componentes proteínicos de acuerdo con la presente invención comprende combinaciones, diferentes unas de otras, del marcador y el adsorbente para capturar los componentes proteínicos marcados.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1

La Fig. 1 muestra fracciones de ribosoma de E. coli bajo un gradiente de densidad de sacarosa.

Fig. 2

La Fig. 2 muestra modelos o pautas en SDS-PAGE al 12% de factores de iniciación, factores de prolongación y factores de terminación (teñidos con azul brillante Coomassie), teniendo todos ellos colas de His.

Fig. 3

La Fig. 3A muestra las actividades relativas de DHFR de factores de iniciación con colas de His, y la Fig. 3B muestra las concentraciones óptimas de factores de iniciación con colas de His expresados en las actividades relativas de DHFR.

Fig. 4

La Fig. 4 muestra las actividades de factores de terminación con colas de His expresados en los rendimientos de fMFL.

Fig. 5

La Fig. 5A muestra un diagrama de absorción UV a 570nm de eluato que incluye SerRS con cola de His. La Fig. 5B muestra un cromatograma de SerRS con cola de His.

Fig. 6

La Fig. 6 muestra modelos de SDS-PAGE al 12% de ARSs y MTF con colas de His.

Fig. 7

La Fig. 7A muestra las concentraciones óptimas de factores de terminación con colas de His en el sistema de síntesis in vitro de poli(Phe), de acuerdo con la presente invención, expresadas en los niveles de incorporación de Phe. La Fig. 7B muestra el progreso de las reacciones de síntesis de poli(Phe) (expresado en los niveles incorporación de Phe) en el sistema de síntesis in vitro de acuerdo con la presente invención y en el sistema de extracto
S100.

Fig. 8

La Fig. 8A muestra modelos de SDS-PAGE al 12% de productos DHFR que contienen [^{35}S]Met, que se sintetizaron respectivamente usando el sistema de síntesis in vitro de acuerdo con la presente invención y el sistema S30. La Fig. 8B muestra las actividades de DHFR de estos productos.

Fig. 9

La Fig. 9 muestra los tiempos de las reacciones de síntesis de DHFR en el sistema de síntesis in vitro de la presente invención y en el sistema S30.

Fig. 10

La Fig. 10 muestra el consumo de la fuente de energía en el sistema de síntesis in vitro de la presente invención (lado derecho) y en el sistema S30 (lado izquierdo) con el paso del tiempo.

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Fig. 11

La Fig. 11 muestra la formación de DHFR que lleva un residuo de valina incorporado en la posición 37 como un modelo de incorporación de un aminoácido no natural en el sistema de síntesis in vitro de la presente invención.

Fig. 12

La Fig. 12A muestra un diagrama de absorción UV a 570nm de eluato que incluye T7RNA-polimerasa con cola de His. La Fig. 12B muestra un cromatograma de T7RNA-polimerasa con cola de His.

Fig. 13

La Fig. 13 muestra modelos de SDS-PAGE de diversas proteínas sintetizadas usando el sistema de síntesis in vitro de la presente invención.

Fig. 14

La Fig. 14 muestra la pureza de DHFR, que es el producto de la traducción en el sistema de síntesis in vitro de la presente invención, después de pasar a través de una membrana de ultrafiltración con un límite de exclusión de 100kDa y una columna de níquel. En esta figura, la flecha muestra la posición de la DHFR.

Descripción detallada de la invención

El sistema de síntesis in vitro de la presente invención es un sistema de reacción para sintetizar un péptido transcribiendo un DNA en un RNA y luego traduciendo el RNA producido o traduciendo un RNA sin usar células per se. El término "péptido" como se usa en la presente memoria significa una sustancia compuesta de 2 o más aminoácidos naturales o no naturales unidos el uno al otro mediante un enlace peptídico e incluye dentro de sus alcance oligopéptidos y polipéptidos. Además, las proteínas que tienen una estructura tridimensional específica de polipéptidos caen dentro de esta categoría. El término "RNA" como se usa en la presente memoria incluye RNAs y mRNAs sintéticos en su categoría, mientras que el término "DNA" como se usa en la presente memoria incluye DNAs y cDNAs en su categoría.

El sistema de síntesis in vitro de la presente invención, en el que un DNA se transcribe en un RNA y luego el RNA producido se traduce o un RNA se traduce, es un sistema de reacción que existe en células procarióticas o células eucarióticas y que consta de ribosoma, factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción, otras enzimas requeridas en la constitución del sistema de reacción, diversos sustratos, tampones y sales. Aunque los excelentes efectos de la presente invención se pueden establecer en un sistema de reacción que haya sido completamente reconstituido artificialmente, la presente invención también es aplicable a sistemas de reacción en los que algunos de los constituyentes se añaden en forma de un extracto de células.

Los factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción no están restringidos a los que se originan en las células procarióticas, tal como E. coli, pero puede hacerse uso de los que se originan en células eucariotas. En caso (1) de traducir un RNA, estos factores y enzimas incluyen factores de iniciación, factores de prolongación, factores de terminación, 20 aminoacil-tRNA-sintetasas, y tRNAs unidos a aminoácidos naturales y no naturales, y además está incluida metionil-tRNA-transformilasa en un sistema de reacción procedente de E. coli. En caso (2) de transcribir un DNA en un RNA y luego traducir el RNA producido, estos factores y enzimas incluyen, además de los citados anteriormente en el caso (1), RNA-polimerasa, tal como T7RNA-polimerasa. La reacción de traducción puede regularse eliminando los factores de terminación del sistema de reacción del caso (1) o (2) antes descritos, como se analizará más adelante.

Ejemplos de enzimas distintas de los factores y enzimas para la reacción de transcripción o traducción incluyen enzimas que regeneran energía en el sistema de reacción, tales como creatina-quinasa, mioquinasa y nucleósido-difosfato-quinasa (NDK), y enzimas para hidrolizar el ácido pirofosfórico inorgánico formado durante la reacción de transcripción o traducción, tal como pirofosfatasa inorgánica.

Ejemplos de los diversos sustratos incluyen aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, trifosfatos de nucleótidos, como fuente de energía, fosfato de creatina y ácido formilfólico. Los trifosfatos de nucleótidos incluyen ATP, GTP, CTP y UTP. En el caso (1) antes descrito se usan ATP y GTP, mientras que se usan ATP, GTP, CTP y UTP en el caso (2) antes descrito.

Como tampón se emplea usualmente tampón de fosfato de potasio (pH 7,3). Como sales, se emplean usualmente, por ejemplo, glutamato de potasio, cloruro de amonio, acetato de magnesio, cloruro de calcio, putrescina, espermidina y ditiotreitol (DTT). Por supuesto, en el sistema de reacción también pueden emplearse componentes adecuados distintos de los citados anteriormente.

La primera característica de la presente invención reside en que, en un sistema para sintetizar un péptido transcribiendo un DNA en un RNA y luego traduciendo el RNA producido o traduciendo un RNA in vitro, todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción transcripción/traducción están marcados con un marcador y la otra sustancia se usa como adsorbente para capturar dichos componentes proteínicos marcados después de la traducción. Así, el péptido deseado puede separarse fácilmente de los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción y se obtiene con una pureza extremadamente alta.

La adición de una cola de histidina se ha empleado algunas veces en la producción y purificación de componentes proteínicos individuales que constituyen un sistema de reacción, en particular, factores y enzimas para la reacción de transcripción/traducción. Por ejemplo, se describe el uso de una cola de histidina en, por ejemplo, la producción y purificación de los factores de prolongación EF-Tu (Eur. J. Biochem. 210:177-183 (1992)), EF-G (Cell 92: 131-139 (1998)) y EF-Ts (Archives of Biochemistry and Biophysics 348:157-162 (1997)), la producción y purificación de un factor de terminación RF2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8165-8169 (1998)), y la producción y purificación of fenilalanil-tRNA-sintetasa (Protein Expression and Purification 8: 347-357 (1996)). En estos casos, sin embargo, la producción y purificación se llevaron a cabo no para construir un sistema de síntesis de péptidos in vitro, sino simplemente para examinar las funciones o propiedades de proteínas individuales.

Para separar una proteína o un derivado proteínico producido por expresión de un gene en un transformante, tal como E. coli, se ha usado cromatografía de afinidad con el uso de, por ejemplo, una combinación de cola de histidina con una columna de níquel, una combinación de glutation-S-transferasa con una columna de resina de glutation-Sepharose o una combinación de una cola de un epítopo con un anticuerpo. En tal caso, una práctica ha sido incorporar un residuo capaz de unirse selectivamente a la columna de adsorción en el péptido diana. En sistemas exentos de células con el uso de extractos de células marcados, se hace uso de un vector para incorporar una cola de histidina en un péptido diana. En tal caso, por tanto, el producto se obtiene en forma de una proteína fusionada del péptido diana con la cola de histidina que debe ser cortada enzimáticamente del péptido después de la síntesis.

Al contrario que estos métodos convencionales, los autores de la presente invención han introducido un par de sustancias que se adhieren una a la otra no en el péptido diana, sino en los componentes proteínicos que constituyen el sistema de síntesis del péptido in vitro, basado en el nuevo descubrimiento de que la reacción de transcripción o traducción puede transcurrir incluso aunque los factores y enzimas para la transcripción o traducción y otras enzimas estén marcados con una de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra.

La combinación de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra para ser usada en la presente invención puede ser arbitraria, siempre que la reacción de transcripción o traducción no se perturbe con ello. Aunque la adhesión de estas sustancias una a la otra puede ser reversible o irreversible, es preferible usar un par de sustancias que se adhieran una a la otra reversiblemente. Esto es debido a que en tal caso los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción pueden ser usados repetidamente.

Como un ejemplo de la combinación de las sustancias que se adhieren una a la otra, puede citarse una combinación de una columna de adsorción con una sustancia capaz de unirse selectivamente a la columna de adsorción. Los ejemplos típicos de dichas sustancias incluyen sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad. Por ejemplo, un complejo metálico, tal como un complejo de níquel o cobalto sirve como un ligando de una columna de adsorción, mientras que la cola de histidina sirve como una sustancia capaz unirse selectivamente a la columna de adsorción. Además, se puede hacer uso de combinaciones de diversos ligandos con sustancias capaces de unirse selectivamente a ellos como se analizará con detalle más adelante, siempre que la reacción no se perturbe por ello. Es decir, la combinación de las sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad utilizables en la presente invención pueden seleccionarse de entre, por ejemplo, una combinación de un fragmento de proteína o de péptido con un ion metálico, una combinación de un antígeno con un anticuerpo, una combinación de una proteína con un fragmento de proteína o de péptido, una combinación de una proteína con un compuesto específico de bajo peso molecular seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos, DNAs, colorantes, vitaminas y lectinas, una combinación de una proteína con a sacárido y una combinación de una proteína o un fragmento de péptido con una resina de cambio iónico.

Las sustancias que se adhieren una a la otra utilizables en la presente invención no están restringidas a una combinación de sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad, pero pueden seleccionarse arbitrariamente dependiendo de la finalidad. Por ejemplo, para ello se puede hacer uso de sustancias que se adhieren magnéticamente una a la otra. Como un ejemplo de las mismas, puede citarse una combinación de una perla magnética-proteína marcada con un imán. En este caso, los componentes proteínicos que constituyen el sistema de síntesis del péptido, que han sido marcados individualmente con las perlas magnéticas, pueden ser adsorbidos por el imán y por tanto capturados.

En la presente invención, el adsorbente se usa en la forma de, por ejemplo, una columna, una matriz, un filtro o una perla. Alternativamente, puede estar fijado a un vehículo (soporte), si se desea. Para fijar el adsorbente al vehículo, pueden seleccionarse medios apropiados de entre las técnicas conocidas dependiendo de las propiedades del adsorbente.

Hay un número variado de combinaciones de la sustancia para marcar una parte o la totalidad de los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción con la sustancia usada como adsorbente para capturar los componentes proteínicos así marcados. Es posible usar dichas combinaciones que difieren una de otra en un único sistema de reacción. Puede ser considerado como bastante favorable seleccionar los marcadores más adecuados para los componentes proteínicos respectivos y luego seleccionar los adsorbentes apropiados para estos marcadores.

Puesto que los factores y enzimas para el sistema de reacción de transcripción/traducción y otras enzimas se marcan con una de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra en la presente invención, los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción pueden obtenerse cada uno en un alto estado de pureza y el sistema de reacción no está contaminado con componentes desconocidos e innecesarios o inhibidores. Por tanto, puede establecerse el sistema de reacción y, consecuentemente, puede elevarse ampliamente la eficacia de la reacción. Además, llega a ser posible separar rápidamente el péptido deseado de estos constituyentes de reacción después de sintetizar el péptido. En los sistemas convencionales exentos de células, un péptido formado por la reacción se purifica por extracción. Por lo tanto se necesita seleccionar un método de purificación apropiado en cada caso dependiendo de las propiedades físicas y químicas del producto de reacción. En la presente invención, en contraste con lo anterior, los componentes que constituyen el sistema de reacción se eliminan usando el adsorbente y por tanto se purifica el producto de reacción. Por consiguiente, teóricamente es posible aplicar el mismo método de purificación a cualesquiera productos de reacción, independientemente de sus propiedades físicas y químicas. Además, el péptido diana así obtenido tiene una pureza muy alta.

De acuerdo con la presente invención, además, los componentes del sistema de reacción pueden controlarse con seguridad, lo que hace posible establecer un sistema de reacción exento de factores de terminación. Debido a esta característica, la presente invención permite la construcción de conjuntos de polisoma de diversos tipos, ampliando con ello la gama de aplicaciones de los sistemas de síntesis de péptidos in vitro. Hablando más particularmente, los complejos ternarios (conjuntos de polisoma) compuestos de péptido, RNA y ribosoma pueden obtenerse expresando diversos DNAs o RNAs en el sistema de síntesis de péptidos in vitro exento de factores de terminación de acuerdo con la presente invención. Separando dicho conjunto de polisoma de otros complejos con el uso del péptido como diana, el péptido diana y el RNA pueden obtenerse al mismo tiempo. Tratando el producto con factores de terminación, puede obtenerse el RNA correspondiente. En este caso, el péptido, que ha sido cortado del ribosoma, y el RNA correspondiente a él pueden aislarse fácilmente por tratamiento con factores de terminación marcados con una de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra. Por ejemplo, un DNA correspondiente puede obtenerse a partir de un conjunto de polisoma aislado usando el método RT-PCR, como se describe en Current Opinion in Biotechnology 9:534-548 (1998). Descomponiendo este conjunto de polisoma con EDTA, puede obtenerse un RNA. En particular, es técnicamente ventajoso que puede obtenerse fácilmente en expresión aleatoria un RNA o un DNA correspondiente a un péptido diana seleccionado. Aunque ya se conoce la expresión semialeatoria de DNAs y RNAs, en un sistema exento de células con el uso de un kit de reticulocitos de conejo, en este caso se necesitan métodos complicados (WO91/05058).

Controlando con seguridad los componentes que constituyen el sistema de reacción, llega a ser posible sintetizar un péptido que tiene un residuo de aminoácido no natural por el sistema de síntesis de péptidos in vitro. Es decir, puede sintetizarse un péptido que tiene un residuo de aminoácido no natural usando el proceso de producción de acuerdo con la presente invención como sigue. Al sistema de reacción se añade un tRNA supresor cargado por un residuo de aminoácido no natural y correspondiente a un codón de terminación que difiere del codón de terminación C-terminal. Luego un DNA o un RNA, que se ha modificado por inserción de un codón de terminación correspondiente al tRNA supresor en una posición para la incorporación de un residuo de aminoácido no natural, se transcribe o traduce para dar de este modo un péptido que tiene el residuo de aminoácido no natural incorporado en él. Hablando con mayor detalle, la síntesis puede realizarse como sigue. Para incorporar el residuo de aminoácido no natural, uno de los codones de terminación (UAA, UAG y UGA), tal como UGA o UAG se inserta en una posición deseada dentro del marco de lectura abierto (abreviadamente ORF por la expresión inglesa open reading frame) y se emplea UAA para terminar la traducción. Subsiguientemente, se forma un tRNA supresor que lleva un anticodón para UGA y/o UAG por transcripción in vitro y cargado por el aminoácido no natural. A continuación se realiza el proceso de producción de acuerdo con la presente invención usando este RNA y tRNA supresor como se describe anteriormente para traducir el RNA. De este modo, puede sintetizarse un péptido que tiene el residuo de aminoácido no natural insertado específicamente en el sitio. Alternativamente, el péptido puede sintetizarse por separado sintetizando el DNA correspondiente seguido por transcripción y traducción.

El uso de un sistema de reacción obtenido por eliminación de factores de terminación del sistema de reacción antes descrito hace posible obtener un conjunto de polisoma compuesto de péptido, mRNA y ribosoma, que lleva uno o más residuos de aminoácidos no naturales en la(s) posición(es) deseada(s). Tratando este conjunto de polisoma con factores de terminación marcados con una de un par de sustancias que se adhieren una a la otra como en el caso anterior, pueden aislarse fácilmente el péptido, que ha sido cortado del ribosoma, y el RNA correspondiente al mismo. Por ejemplo, un DNA correspondiente puede obtenerse a partir de un conjunto de polisoma usando el método RT-PCR como se describe en Current Opinion in Biotechnology 9:534-548 (1998). Descomponiendo este conjunto de polisoma con EDTA, también es posible obtener el RNA.

Por consiguiente, los derivados peptídicos producidos por el proceso de la presente invención implican conjuntos de polisoma y péptidos no naturales que tienen residuos de aminoácidos no naturales en las posiciones deseadas.

El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico de acuerdo con la presente invención puede realizarse usando un sistema de lotes de un modo convencional. Alternativamente, puede llevarse a cabo usando diversos métodos ya conocidos o usuales, tal como un método de flujo, en el que los materiales que incluyen los sustratos se suministran continuamente o el producto de reacción se retira ocasionalmente, o un método de diálisis (véase, por ejemplo, la publicación de patente japonesa 110236/1995, Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic acids and Enzymes) Vol.44, No.4, 598-605 (1999), Current Opinion in Biotechnology 9:534-548 (1998)).

A continuación, la presente invención se ilustrará con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que la invención no ha de ser considerada como limitada a dichos ejemplos.

(1) Péptidos y derivados peptídicos que pueden producirse por la invención

De acuerdo con el proceso de producción de la presente invención, pueden producirse péptidos naturales y péptidos no naturales de cualquier tipo. Es decir, el uso del proceso de la presente invención hace posible producir péptidos que serían digeridos por las proteasas que se originan en las células hospedantes, tal como dihidrofolato-reductasa (DHFR), lisozima (que se origina en el fago X) y proteínas fluorescentes verdes (abreviadamente GFPs por la expresión inglesa green fluorescent proteins), y péptidos que muestran toxicidad en células hospedantes. La expresión "péptidos naturales", como se usa en la presente memoria significa péptidos compuestos de los 20 aminoácidos naturales usados en los códigos genéticos, mientras que los péptidos que contienen otros \alpha-aminoácidos se denominan "péptidos no naturales".

Además, pueden obtenerse fácilmente complejos ternarios (conjuntos de polisoma) compuestos de péptido, RNA y ribosoma usando un sistema de reacción exento de factores de terminación en el proceso de producción de la presente invención.

Ejemplos de péptidos no naturales que pueden producirse por el procedimiento de acuerdo con la presente invención incluyen péptidos que tienen aminoácidos naturales modificados, aminoácidos no cargados modificados, aminoácidos ácidos modificados, aminoácidos básicos modificados, no-\alpha-aminoácidos, aminoácidos con desplazamiento del ángulo \Phi,\Phi, y aminoácidos que tienen grupos funcionales seleccionados de los grupos que consisten en nitro, amidina, hidroxilamina, quinona, compuestos alifáticos, y cíclicos y grupos hidrocarbilo insaturados. Existen procesos conocidos para sintetizar estos péptidos en sistemas de síntesis de proteínas exento de células con el uso de extractos de células (véase, por ejemplo, JP-W-Hei-4-504651/WO90/05785). Como un ejemplo particular de estos péptidos no naturales, puede citarse DHFR que tiene un residuo de cisterna protegido insertado en una posición apropiada, el cual no se presenta en la naturaleza. Se puede hacer otra cita de péptidos que tienen un residuo de aminoácido no natural tal como p-fluorofenilalanina, p-nitrofenilalanina u homofenilalanina incorporado en una posición deseada. Ya es conocido que variantes de \beta-lactamasa que tienen estos 3 residuos de aminoácidos no naturales incorporados como sustitutos de fenilalanina en la posición 66 muestran suficiente actividad enzimática (Bio Industry 8:749-759 (991)). Estos péptidos no naturales también pueden producirse fácilmente por el proceso de acuerdo con la presente invención.

(2) Ribosoma

El ribosoma es una partícula en la que se sintetizan los péptidos. Se une al mRNA y coordina el aminoacil-tRNA para la posición A y formilmetionil-tRNA o peptidil-tRNA para la posición P, formando un enlace peptídico (Science 289: 920-930 (2000)). En la presente invención, puede usarse cualquier ribosoma independientemente de su origen, siempre que tenga la función que se describe anteriormente. Aunque generalmente se emplea el ribosoma de E. coli también se pueden usar ribosomas eucarióticos. Es preferible en la presente invención usar el ribosoma de E. coli, por ejemplo, los obtenidos de la cepa E. coli A19 o la cepa MRE600.

(3) Factores y enzimas para la transcripción o traducción que han de ser usados en el sistema de síntesis in vitro de péptidos de acuerdo con la presente invención (3-1) Factores de iniciación (abreviadamente IF por la expresión inglesa initiation factors)

Factores de iniciación significa factores que se requieren esencialmente en la formación de un complejo de iniciación en el proceso de síntesis de péptidos o que notablemente la promueven. IF1, 1F2 y IF3 son conocidos como factores de iniciación que proceden de E. coli (Biochemistry 29:5881-5889 (1990)). El IF3 promueve la disociación del ribosoma en las subunidades 30S y 50S (es decir, la etapa requerida para iniciar la traducción) e impide la inserción de tRNAs distintos de formilmetionil-tRNA en la posición P en la etapa de formación del complejo de iniciación. El IF2 se une al formilmetionil-tRNA y transfiere el formilmetionil-tRNA a la posición P de la subunidad 30S, formando con ello el complejo de iniciación. El IF1 potencia las funciones de IF2 e IF3. En la presente invención es preferible usar factores de iniciación que proceden de E. coli, por ejemplo, los obtenidos a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar factores de iniciación eucarióticos.

(3-2) Factores de prolongación (abreviadamente EF por la expresión inglesa elongation factors)

Un factor de prolongación EF-Tu se clasifica en 2 tipos, es decir, los tipos GTP y GDP. El EF-Tu del tipo GTP se une al aminoacil-tRNA y lo transfiere a la posición A del ribosoma. Cuando se libera EF-Tu del ribosoma, el GTP se hidroliza en GDP (EMBO J. 17:7490-7497 (1998)). Otro factor de prolongación el EF-Ts se une al EF-Tu del tipo GDP y promueve la conversión de él en el tipo GTP (Archives of Biochemistry and Biophysics 348:157-162 (1997)). Otro factor de prolongación el EF-G promueve la translocación que sigue a la formación de enlace peptídico en el proceso de prolongación de la cadena peptídica (Nature Structural Biology 6:643-647 (1999), FEMS Microbiology Reviews 23:317-333 (1999)). En la presente invención, es preferible usar factores de prolongación procedentes de E. coli, por ejemplo, los obtenidos a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar factores de prolongación eucarióticos.

(3-3) Factores de terminación

Los factores de terminación se requieren esencialmente en la terminación de la síntesis de proteínas, liberando la cadena peptídica traducida y reciclando el ribosoma para la iniciación de la subsiguiente traducción del mRNA. Cuando se sintetiza una proteína en un sistema de reacción exento de factores de terminación, la reacción se detiene antes del codón de terminación y por tanto puede formarse fácilmente un complejo ternario estable (conjunto de polisoma) compuesto de ribosoma, péptido y mRNA. Un aminoácido no natural se incorpora en una cadena peptídica, eliminando bien sea RF1 o bien sea RF2 del sistema de reacción. Es decir, un aminoácido no natural se incorpora con alta eficacia en el codón UAG en el caso de eliminar RF1 o en el codón UGA en el caso de eliminar RF2.

Cuando un codón de terminación (UAA, UAG o UGA) está localizado en la posición A del ribosoma, los factores de terminación RF1 y RF2 entran en la posición A y promueven la disociación de la cadena peptídica a partir del peptidil-tRNA en la posición P. RF1 reconoce UAA y UAG entre los codones de terminación, mientras que RF2 reconoce UAA y UGA. Otro factor de terminación RF3 promueve la disociación de RF1 y RF2 del ribosoma después de la disociación de la cadena peptídica por RF1 y RF2. El factor de reciclo del ribosoma (abreviadamente RRF por sus iniciales en inglés recycling ribosome factor) promueve la disociación del tRNA que queda en la posición P después de la síntesis de proteína y el reciclo de ribosoma para la subsiguiente síntesis de proteína. En la presente invención, el RRF se considera como uno de los factores de terminación. Las funciones de estos factores de terminación RF1, RF2, RF3 y RRF se describen en EMBO J. 16:4126-4133 (1997) y EMBO J. 16:4134-4141 (1997). En la presente invención, es preferible usar factores de terminación procedentes de E. coli, por ejemplo, los obtenidos a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar factores de terminación eucarióticos.

(3-4) Aminoacil-tRNA-sintetasa

La aminoacil-tRNA-sintetasa es una enzima mediante la cual un aminoácido se une covalentemente al tRNA en presencia de ATP para sintetizar con ello aminoacil-tRNA (RNA 3:954-960 (1997), Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes) 39: 1215-1225 (1994)). En la presente invención, es preferible usar aminoacil-tRNA-sintetasa procedente de E. coli, por ejemplo, una obtenida a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar aminoacil-tRNA-sintetasas eucarióticas.

(3-5) Metionil-tRNA-transformilasa

La N-formilmetionina (fMet) que lleva grupos formilo unidos a los grupos amino en el extremo de metionina sirve como el aminoácido de iniciación en un sistema procariótico de síntesis de proteínas. Este grupo formilo se une a la metionina en metionil-tRNA por metionil-tRNA-transformilasa (MTF). Es decir, la metionil-tRNA-transformilasa transfiere el grupo formilo de N^{10}-formiltetrahidrofolato al N-terminal del metionil-tRNA correspondiente al codón de iniciación, dando con ello formilmetionil-tRNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:875-880 (1999)). El grupo formilo así unido es reconocido por IF2 y de este modo actúa como señal de iniciación para la síntesis de proteína. Aunque la MTF no está presente en el sistema de síntesis en el citoplasma eucariótico, está presente en los sistemas de síntesis en mitocondrias eucarióticas y cloroplastos. En la presente invención, es preferible usar metionil-tRNA-transformilasa procedente de E. coli, por ejemplo, una obtenida a partir de la cepa E. coli K12.

(3-6) RNA-polimerasa

Se sabe que la RNA-polimerasa, que es una enzima que transcribe una secuencia de DNA en un RNA, está presente en varios organismos. Como un ejemplo de la misma, se puede citar la T7RNA-polimerasa procedente del fago T7 que es una enzima que se une a una secuencia específica de DNA denominada promotor T7 y luego transcribe la secuencia de DNA que se encuentra en sentido descendente (downstream) en un RNA. Los autores de la presente solicitud unieron una cola de His al N-terminal de esta T7RNA-polimerasa y lo expresaron como una proteína fusionada en una gran cantidad de la cepa E. coli BL21. Luego, purificaron el producto de expresión por cromatografía de afinidad con el uso de una columna de níquel. La T7RNA-polimerasa con cola de His así obtenida es una enzima nueva. Además de la T7RNA-polimerasa, se usan en la presente invención diversas RNA-polimerasas. Por ejemplo, pueden usarse T3RNA-polimerasa y SP6RNA-polimerasa disponibles en el comercio.

(3-7) Aminoacil-tRNA unido a aminoácidos no naturales

Por incorporación de residuos de aminoácidos, distintos de los 20 aminoácidos que constituyen las proteínas naturales, en proteínas, es posible mejorar las funciones inherentes a las proteínas o impartir nuevas funciones o características útiles a las proteínas. El aminoacil-tRNA unido a un aminoácido no natural puede producirse sintetizando un tRNA supresor deficiente en CA 3'-terminal mediante transcripción in vitro y ligación a aminoacil-pCpA sintetizado químicamente que tiene el aminoácido no natural usando RNA-ligasa (Baiosaiensu to Indasutori (Bioscience and Industry) 47:16-24 (1989)).

(4) Enzimas requeridas en la constitución del sistema de reacción distintas de factores y enzimas para la transcripción o traducción para se usadas en el sistema de síntesis in vitro de péptidos de acuerdo con la presente invención (4-1) Enzimas para regenerar energía en el sistema de reacción

Ejemplos de las enzimas de este tipo incluyen creatina-quinasa, mioquinasa y nucleósido-difosfato-quinasa (NDK). La creatina-quinasa, que también se denomina creatina-fosfoquinasa (CPK), cataliza la transferencia de grupos fosfato desde ATP a creatina. La mioquinasa, que también se denomina adenilato-quinasa, participa en la regeneración de ATP a partir de ADP y la formación simultánea de AMP. La NDK cataliza la transferencia de grupos \gamma-fosfato entre difosfato de nucleósido y trifosfato de nucleósido. En la presente invención, es preferible usar estas enzimas que proceden de E. coli, por ejemplo, las obtenidas a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar otras enzimas eucariotas.

(4-2) Enzimas para hidrolizar ácido pirofosfórico inorgánico formado durante la reacción de transcripción o traducción

Como un ejemplo de las enzimas de este tipo, puede citarse la pirofosfatasa inorgánica. En la presente invención, es preferible usar enzimas procedentes de E. coli, por ejemplo, las obtenidas a partir de la cepa E. coli K12. Sin embargo, también es posible usar enzimas eucariotas.

Entre los constituyentes del sistema de reacción como se ha descrito antes en (3) y (4), los componentes proteínicos son expresados en una gran cantidad en E. coli (por ejemplo, la cepa E. coli BL21 comercialmente asequible) en la forma de proteínas fusionadas (por ejemplo, proteínas con colas de His) marcadas en los N-o C-terminales con una de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra como se describirá con mas detalle en lo sucesivo. Luego estas proteínas así expresadas se purifican usando una columna de níquel conectada a un adsorbente que contiene la otra sustancia, tal como cromatografía liquida rápida de proteínas (abreviadamente FPLC por la expresión inglesa fast protein liquid chromatography) y luego se suministran al sistema de reacción. Además de en E. coli, es posible expresar estas proteínas en células de animales, levaduras, Bacillus subtilis y similares. Alternativamente, es posible producir estas proteínas usando un sistema de síntesis de péptidos in vitro.

(5) Marcador y adsorbente, es decir, un par de sustancias que se adhieren una a la otra

En la presente invención, todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción como se describe antes en (3) y (4) están marcados con una de un par de sustancias que se adhieren una a la otra y los componentes proteínicos así marcados son capturados usando la otra sustancia como un adsorbente para aislar de este modo el péptido deseado formado en el sistema de reacción. Como ejemplos típicos de un par de las sustancias que se adhieren una a la otra, pueden citarse las sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad. Sin embargo, se pueden usar en la presente invención cualquier par de sustancias que se adhieren una a la otra, sin restricción a las sustancias que interactúan mutuamente en cromatografía de afinidad, siempre que estas sustancias puedan usarse en capturar los componentes proteínicos.

Las proteínas ejercen efectos fisiológicos mediante interacciones mutuas específicas con ciertas sustancias. La cromatografía de adsorción que se lleva a cabo aprovechando dicha interacción específica (afinidad) entre una proteína y una cierta sustancia (ligando) se denomina cromatografía de afinidad. Ejemplos de una combinación de sustancias que se adhieren específicamente una a la otra incluyen un fragmento de péptido o proteína con un ion metálico o un compuesto, un antígeno con un anticuerpo, una citoquina o una hormona con un receptor, y una enzima con un sustrato o un inhibidor. Además, aminoácidos específicos, DNAs, colorantes, vitaminas, lectinas y similares se unen mutuamente a proteínas que tienen afinidades para ellos respectivamente.

Una de las sustancias de dicha combinación se fija como ligando a un vehículo o un soporte para formar un adsorbente. Luego los materiales marcados con la otra sustancia (los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción en el caso de la presente invención) se hacen pasar a su través. De este modo, el marcador se une específicamente al ligando. La cromatografía de afinidad basada en esta unión específica se ha empleado comúnmente como medio de purificar proteínas. Se han comercializado diversos vehículos por diferentes fabricantes, lo que hace que estos medios estén altamente disponibles. Al purificar una proteína usando una reacción antígeno-anticuerpo, por ejemplo, se usa una combinación de un determinante antigénico (un epítopo) que tiene estructura conocida con un anticuerpo específico para el epítopo. Se han comercializado diversas combinaciones de vectores y adsorbentes para llevar a cabo este medio. En una realización preferida de la presente invención, se usa una combinación de dichas sustancias que se adsorben una a la otra, la cual se emplea en cromatografía de afinidad. Al preparar los componentes proteínicos marcados que han de usarse en la presente invención, el marcador es útil en la purificación. También es posible marcar los componentes proteínicos con varios marcadores al mismo tiempo. En este caso, es posible que se separe por corte el marcador utilizable para la purificación en el proceso de producción, mientras que los otros marcadores se usen para la separación del producto deseado formado en el sistema de síntesis de péptidos in vitro.

A continuación, se ilustrarán realizaciones de la presente invención dando algunos ejemplos de la combinación de las sustancias que se adhieren una a la otra. Sin embargo, ha de entenderse que la presente invención no ha de ser considerada como restringida a estos ejemplos.

(5-1) Proceso que usa la unión de un fragmento de una proteína o de un péptido a un ion metálico o un compuesto quelato A. Cola de His con complejo metálico tal como complejo de níquel o complejo de cobalto

Ha sido una práctica común purificar una proteína usando la unión de una cola de His a un complejo metálico, tal como un complejo de níquel o un complejo de cobalto. Concretamente, una cola de His se une a un DNA para ser expresado dando una proteína fusionada que tiene una cola de His. Luego esta proteína fusionada es capturada y purificada usando una columna que tiene, por ejemplo, un complejo de níquel, un complejo de cobalto, un complejo de cobre o un complejo de zinc. A continuación la proteína puede ser eluída desde la columna con un eluyente que contienen imidazol (véase, por ejemplo, Tanpakushitsu Jikken Noto (Protein Experiment Note) (1), en la p.139, Chap. 5: 1. His-Tag Tanpakusthitu no Hatugen to Seisei (Expression and Purification of His-Tag Protein), Yasumitsu and Wakui, publicado por Yodosha; J. A. Bornhorst and J. J. Faike, Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods in Enzymology 326:245-254, (2000); Proteins 41:144-53 (2000), FEMS Microbiol. Lett. 188:147-51 (2000); y J. Bacteriol. 182: 4304-9 (2000)). Estas combinaciones se pueden usar en la presente invención.

Para expresar genes que codifican componentes proteínicos con colas de His, es conocido usar, por ejemplo, E. coli (M. W. Van Dyke, M. Sirito, and M. Sawadogo, Gene 111:95, 1992), Saccharomyces cerevisiae (D. C. Kaslow and J. Shiloach, Bio/Technology 12:494, 1994), células de mamíferos (R. Janknecht and A. Nordheim, Gene 121:321, 1992), y células de insectos infectadas con baculovirus (A. Kuusinen, M. Arvola, C. Oker-Blom, y K. Keinanen, Eur. J. Biochem. 233:720, 1995). Estas células pueden emplearse opcionalmente en la presente invención.

El siguiente protocolo muestra de modo general un ejemplo del proceso de purificación de un componente proteínico con cola de His, usando una cola de His y una columna de níquel. Se han conocido varias variaciones de este proceso y un puede seleccionarse una apropiada de ellas.

1. Unir una cola de His que consiste en 6 residuos de His al N-terminal de una proteína diana por una técnica de ingeniería genética para obtener una proteína fusionada.

2. Romper las células que expresan la proteína diana por tratamiento con ultrasonidos en hielo y suspender las células rotas en un tampón de carga (NaCl 300 mM, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 8,0).

3. Centrifugar el lisado de células (30.000g, 4ºC, 30 min).

4. Añadir al sobrenadante una suspensión al 50% de Ni^{2+}-NTA (Qiagen) pre-equilibrada en tampón de carga enfriado con hielo. Agitar a 4ºC durante 1 hora.

5. Cargar la resina en una columna. Lavar la columna con 20 volúmenes de columna de tampón de carga a 4ºC.

6. Lavar la columna con 20 volúmenes de columna de tampón de carga (que contiene imidazol 10 mM, pH 8,0) a 4ºC.

7. Eluir la proteína diana con 20 volúmenes de columna de tampón de carga bajo un gradiente de concentración de imidazol de 10 a 250 mM en el tampón de carga. Recoger las fracciones de 1 ml e identificar la proteína diana por SDS-PAGE.

B. Tioredoxina con óxido de fenilarsina (abreviadamente PAO por la expresión inglesa phenylarsine oxide)

En este proceso, se forma una proteína fusionada compuesta de una proteína diana con tio-redoxina y se adsorbe por un gel de agarosa fijado por PAO (resina ThioBond^{TM}, Invitrogen) aprovechando la unión de la tio-redoxina al PAO seguido por elución con (\beta-mercaptoetanol (\beta-ME) (A. Alejo, R. J. Yanez, J. M. Rodríguez, E. Viñuela, and M. L. Salas, African Swine Fever Virus trans-Preniltransferase, The Journal of Biological Chemistry 272: 9417-9423, 1997). Este proceso también se puede usar en la presente invención.

El siguiente protocolo muestra en líneas generales un ejemplo del proceso de la purificación de una proteína usando este proceso.

1. Diluir durante una noche un cultivo de células transformadas (E. coli/vector pTrxFus, Invitrogen) 20 veces en medio RM (Na_{2}HPO_{4} al 0,6%, KH_{2}PO_{4} al 0,3%, NaCl al 0,05%, NH_{4}Cl al 0,1%, 2% de casaminoácidos, y MgCl_{2} al 0,0095%) que contiene 100 \mug/ml (la concentración final) de ampicilina e incubar a 30ºC.

2. Después de incubar a A_{550} = 0,5, añadir 100 \mug/ml (la concentración final) de triptófano para inducir la expresión de la proteína fusionada. Luego confirmar la incubación a 34ºC durante 2 horas más.

3. Recoger las células por centrifugación. Suspender el sedimento de células en 5 ml de tampón de desplazamiento (running buffer) [Tris-HCl 100 mM (pH 7), NaCl 150 mM, EDTA1 mM y \beta-mercaptoetanol 1 mM. Luego romper las células por tratamiento con ultrasonidos.

4. Centrifugar la suspensión de células (10.000g, 15 min) y recoger el sobrenadante.

5. Incubar el sobrenadante con 2 ml de resina ThioBond^{TM} a 4ºC durante 60 minutos para unir a la resina la proteína fusionada contenida en el sobrenadante.

6. Rellenar una columna con la suspensión y lavar la columna con 30 volúmenes de columna de tampón de desplazamiento [Tris-HCl 100 mM (pH 7), NaCl 150 mM, EDTA1 mM y \beta-mercaptoetanol 20 mM.

7. Eluir la proteína diana con el tampón de desplazamiento bajo un gradiente de \beta-mercaptoetanol.

(5-2) Proceso que usa la unión de un antígeno o un fragmento de antígeno (cola de epítopo) a un anticuerpo A. Cola T7 y anticuerpo monoclonal especifico para la cola T7

Cola T7 significa una secuencia que consiste en 11 aminoácidos del gen 10 procedente del fago T7. Se emplea una combinación de cola T7 con un anticuerpo contra un anticuerpo contra ella en un medio de purificar proteínas. Concretamente, este proceso comprende unir una secuencia de DNA que codifica la cola T7 a un gen, luego expresar la proteína diana, y capturar y purificar la proteína fusionada con la cola T7 así obtenida usando un anticuerpo monoclonal específico para la cola T7 como adsorbente. Como un ejemplo de adsorbente, se comercializa el anticuerpo para cola de T7 (Novagen). Se usa ácido cítrico como eluyente. Esta combinación también se puede usar en la presente invención. Véase R. Deora, T. Tseng and T. K. Misra, Alternative Transcription Factor \sigma^{SB} of Staphylococcus Aureus: Characterization and Role in Transcription of the Global Regulatory Locus sar. Journal of Bacteriology 179:6355-6359, 1997.

El siguiente protocolo muestra de modo general un ejemplo del proceso de purificación de un componente proteínico con cola T7. Se han conocido varias variaciones de este proceso y se puede seleccionar una apropiada de las mismas.

1. Se hacen crecer células transformadas de E. coli/vector pET (Novagen) en medio 2xYT (Bacto Trypton al 1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 0,5%, glucosa al 0,4%) que contienen 20 \mug/ml de cloranfenicol y 30 \mug /ml de kanamicina.

2. Después de incubar a A_{600} = 0,6, añadir IPTG para inducir la expresión de la proteína diana. Luego continuar la incubación durante 2 horas más.

3. Recoger las células por centrifugación. Suspender el sedimento de células en 10 ml de tampón de unión/lavado de cola T7 enfriado con hielo (Na_{2}HPO_{4} 4,29 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, Tween-20 al 1%, y azida de sodio al 0,02% (pH 7,3)).

4. Romper las células por tratamiento con ultrasonidos en hielo hasta que la suspensión ya no muestre viscosidad.

5. Centrifugar (39.000g, 20 min) para eliminar el residuo de células. Filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 \mum.

6. Aplicar el extracto de células a una columna de anticuerpo de cola de T7-agarosa (Novagen) pre-equilibrada con tampón de unión/lavado de cola de T7. Lavar la columna con el mismo tampón para eliminar las proteínas unidas no específicamente.

7. Eluir la proteína diana con tampón de elución (ácido cítrico 0,1 M (pH 2,2)).

B. Proceso que usa cola de péptido FLAG^{TM} (Sigma) para un anticuerpo anti-FLAG^{TM} (Sigma)

Cola de péptido FLAG^{TM} (Sigma, y otros), que es un péptido que consiste en 8 aminoácidos, se usa para purificar proteínas en forma de una denominada cola de epítopo junto con un anticuerpo contra ella. Concretamente, se construye una proteína que tiene la cola de péptido FLAG en el N-terminal y es capturada por una columna rellena de anticuerpo FLAG. En la elución se usa el péptido FLAG. Véase P. J. Woodring and J. C. Garrison, Expression, Purification, and Regulation of Two Isoforms of the Inositol 1,4,5-Trisphosphate 3-Kinase. The Journal of Biological Chemistry 272: 30447-30454, 1997.

El protocolo siguiente muestra de modo general un ejemplo de este proceso que puede modificarse apropiadamente.

1. Recoger células (hospedante: células B31 (línea celular de fibroblastos Rat-1), vector: vector de expresión de mamíferos pDouble-Trouble (pDT)) que muestran la expresión de la proteína diana por centrifugación y homogeneizar en 8 ml de tampón de lisis hipotónico que contiene inhibidores de proteasa (10 \mug/ml de inhibidores I y II de calpaína, 100 \mug/ml de Pefabloc, 2m5 ng/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de bacitracina y 20 \mug/ml de benzamidina).

2. Centrifugar (2.000g) para eliminar el residuo de células y ácidos nucleicos y recoger el sobrenadante.

3. Centrifugar de nuevo y aplicar el extracto de células así obtenido a 1 ml de una columna rellena de anticuerpo FLAG. Lavar la columna con 35 ml de TBSC (Tris-HCl (50 mM pH 7,4), NaCl 150 mM, CHAPS al 0,1% (v/v)).

4. Eluir la proteína diana con 5 ml de TBSC que contienen 200 \mug/ml del péptido FLAG.

C. Proteína A y IgG

En este proceso, se usa la unión de Proteína A estafilocócica (abreviadamente SPA por la expresión inglesa Staphylococal Protein A) a un anticuerpo IgG de la misma. Se captura una proteína A fusionada compuesta de una proteína diana con SPA, usando una columna de IgG-Sepharose. En la elusión se usa un tampón con un bajo valor de pH. Véase B. Nilsson and L. Abrahmsen, Fusion to Staphylococcal Protein A. Methods in Enzymology 185: 144-161, 1990.

El protocolo siguiente muestra de modo general un ejemplo de este proceso que puede modificarse apropiadamente.

1. Añadir un cultivo de una noche de células transformadas (hospedante: E. coli o S. aureus, vector: serie pRIT 20 o pRIT30) a 25 ml de medio de Luria (LB) (medio LB + 0,1% (p/v) de glucosa y 250 mg/l de ampicilina) e incubar a 37ºC durante 4 horas.

2. Recoger las células por centrifugación (10.000g, 5ºC, 20 min) y filtrar el sobrenadante a través de una membrana filtrante de 0,45 \mum.

3. Aplicar el filtrado a 5 ml de una columna de IgG-Sepharose pre-equilibrada con TST (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05%(v/v)).

4. Lavar la columna sucesivamente con partes alícuotas de 15 ml de TST dos veces y 5 ml de acetato de amonio 1 mM.

5. Eluir la proteína con 1 ml de acetato de amonio 0,5 M (pH 3,3).

D. Proteína y anticuerpo monoclonal

Se conoce un método de purificar un canal con puerta de nucleótido cíclico (abreviadamente CNG por la expresión inglesa cyclic nucleotide-gated channel), que es una proteína procedente de retina de ganado bovino, usando un anticuerpo monoclonal PMc 6E7 (dominio N-terminal de una subunidad \alpha del polipéptido de 63 kDa) (R. S. Molday and L. L. Molday, Purification, Characterization, and Reconstitution of Cyclic Nucleotide-Gated Channels. Methods in Enzymology 294: 246-260, 1999). Se usa como adsorbente Sepharose 2B (Pharmacia) que lleva el anticuerpo monoclonal fijado. Para eluir la proteína diana, se usa el péptido competidor 6E7 que es un péptido que se une competitivamente al anticuerpo monoclonal y que tiene una secuencia de aminoácidos Ser-Asn-Lys-Glu-Gln-Glu-Pro-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Seq. ID. No. 2). Esta combinación también se puede usar en la presente invención.

El protocolo siguiente muestra un ejemplo del proceso para purificar la proteína procedente de retina de ganado bovino con el uso del anticuerpo monoclonal.

1. Recoger fracciones de los segmentos exteriores de bastoncitos (abreviadamente ROS por la expresión inglesa rod outer segment) a partir de un homogeneizado de retina de ganado bovino por centrifugación bajo un gradiente de densidad de sacarosa de 30 a 50% (Tris-acetato 20 mM (pH 7,4), glucosa 10 mM y MgCl_{2} 1 mM; 82.500g, a 4ºC durante 45 min).

2. Diluir la fracción de ROS en 5 volúmenes de tampón de homogeneización (sacarosa al 20% (p/v), Tris-acetato 20 mM (pH 7,4), glucosa 10 mM y MgCl_{2} 1 mM) y centrifugar (20.000g, 4ºC, 20 min).

3. Volver a suspender el sedimento de ROS en 8 ml de tampón de homogeneización para obtener un extracto de ROS en bruto.

4. Suspender ROS en 10 volúmenes de tampón de lisis hipotónico (HEPES-KOH 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM y DTT 1 mM) y centrifugar (20.000g, 10 min).

5. Suspender el sedimento de membrana en el mismo tampón y lavar repetidamente dos veces.

6. Suspender el sedimento en HEPES-KOH 10 mM (pH 7,4).

7. Añadir las membranas de ROS a un tampón de solubilización de CHAPS (sulfonato de 3-[3-(colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano), [HEPES-KOH 10 mM (pH 7,4), CaCl_{2} 10 mM, KCl 0,15M, CHAPS 18 mM, 2 mg/ml del inhibidor de proteasa asolectina (fosfatidilcolina de semilla de soja, tipo IV-S; Sigma) (fluorofosfato de diisopropilo 0,1 mM, 5 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de pepstatina o Pefabloc SC20 \muM)] y agitar lentamente.

8. Centrifugar (27.000g, 4ºC, 30 min) para eliminar el residuo de células.

9. Aplicar 20 ml de la membrana de ROS solubilizada a una columna de Sepharose 2B que tiene PMc 6E7 (anticuerpo) fijado sobre ella. Lavar con 10 volúmenes de tampón de columna CHAPS (HEPES-KOH 10 mM (pH 7,4), CaCl_{2} 1 mM, KCl 0,15M, CHAPS 12 mM y 2 mg/ml de asolectina).

10. Eluir la proteína diana con tampón de columna CHAPS que contienen 0,1 mg/ml del péptido competitivo 6E7.

(5-3) Proceso que usa la unión de una proteína a un fragmento de una proteína o de un péptido A. Cola de Strep y estreptavidina

Es conocido un proceso para purificación por afinidad de una proteína que tiene un cola de Strept que es un oligopéptido que tiene afinidad para estreptavidina (véase, por ejemplo, A. Skerra and T. G. Schmidt, Use of the Strep-Tag and Streptavidin for Detection and Purification of Recombinant Proteins. Methods in Enzymology 326: 271-311(2000), BioTechniques 28: 338-344 (2000)). Esta combinación también se puede usar en la presente invención.

En este proceso que emplea la unión de la cola de Strep a estreptavidina, se usa como cola de Strep, por ejemplo, Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ. ID. No. 2) o Asn-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,(SEQ. ID. No. 3) (cola de Strep II). Se sintetiza en un sistema exento de células una proteína con cola de Strep, tal como DHFR (dihidrofolato-reductasa). Luego se purifica por adsorción por estreptavidina o StrepTactin fijada. Como eluyente se emplea destiobiotina.

El protocolo siguiente muestra un ejemplo del proceso de producción de un componente proteínico con cola de Strep que usa una cola de Strep y estreptavidina. Se conocen varias variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Añadir el cultivo de una noche de células transformadas de E. coli (usando un vector pASK-IBA) a 2 litros de medio LB (caldo de Luria) reciente (que contiene ampicilina a una concentración final de 100 \mug/ml) e incubar a DO_{550} = 0,5 bajo agitación (200 rpm) a 22ºC.

2. Para inducir la expresión génica, añadir 200 \mul de una solución de 2 mg/ml de anhidrotetraciclina-dimetilformamida (DMF). Luego continuar la incubación durante 3 horas más.

3. Recoger las células por centrifugación (4.200g, 4ºC, 12 minutos). Suspender las células en 20 ml de tampón P (Tris-Cl 100 mM (pH 8,0), sacarosa 500 mM y Na_{2}EDTA 1mM) e incubar en hielo durante 30 min.

4. Eliminar los esferoplastos por centrifugación (27.000g, 4ºC, 15 min).

5. Dializar la fracción periplásmica así obtenida frente a 2 litros de tampón (Tris-Cl 100 mM (pH 8,0) y Na_{2}EDTA 1 mM) durante la noche.

6. Equilibrar una columna de StrepTactin-Sepharose con tampón W. Aplicar la solución de proteína a la columna empleando un sistema provisto de una bomba peristáltica, un detector de UV (A_{280}) y un colector de fracciones.

7. Lavar la columna con tampón W hasta que la A_{280} alcance la línea base.

8. Eluir la proteína diana con tampón W que contienen 2,5 mM de destiobiotina.

B. S-péptido y S-proteína

Se sabe que el fragmento proteínico de la ribonucleasa S (S-proteína) se une firmemente a su fragmento de S-péptido (S-péptido) de modo reversible. La proteína puede purificarse mediante el uso de esta unión. Concretamente, una proteína con cola de S (es decir, que tiene el S-péptido unido a ella) puede ser capturada por agarosa que tiene fijada a ella la S-proteína. La elución se lleva a cabo escindiendo el enlace entre la cola de S y la S-proteína con, por ejemplo, tiocianato de guanidinio 3 M; tampón de citrato de potasio 0,2 M, pH 2 y MgCl_{2} 3 M (R. T. Raines, M. McCormick, T. R. V. Oosbree, R. C. Mierendorf, The S-Tag Fusion System for Protein Purification. Methods in Enzymology 326:362-376, 2000).

El siguiente protocolo muestra en líneas generales un ejemplo de este proceso que opcionalmente puede modificarse.

1. Añadir 2 ml de una suspensión de S-proteína y agarosa (Novagen) a un extracto de células que expresan la proteína diana (hospedante: bacterias, insectos, mamíferos, vector: pET, pBAC (Novagen) y agitar intensamente durante 30 min.

2. Centrifugar (500g, 10 min) y eliminar el sobrenadante.

3. Suspender la S-proteína-agarosa que tiene la proteína diana unida a ella en un tampón de unión/lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7.5), NaCl 0,15 M, Triton X-1000 al 1% (v/v)).

4. Después de centrifugar (500 g, 10 min), desechar el sobrenadante para eliminar de este modo las proteínas unidas no específicamente.

5. Suspender suspensión de S-proteína-agarosa en 1,5 volúmenes de tampón de elución (tampón de unión/lavado + tiocianato de guanidinio 3 M y citrato de potasio 0,2 M (pH 2) o MgCl_{2}3 M).

6. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min mientras que se agita ocasionalmente para mantener el estado de suspensión.

7. Después de centrifugar, recoger la proteína diana así eluída.

C. Proteína de unión a calmodulina (abreviadamente CBP por la expresión inglesa Calmodulin-binding protein) y calmodulina (CaM)

En este proceso, se purifica una proteína empleando una interacción entre la proteína de unión a calmodulina (CBP) y calmodulina (P. Vaillancourt, Chao-Feng Zheng, D. Q. Hoang, and L. Breister, Affinity Purification of Recombinant Proteins Fused to Calmodulin or to Calmodulin-Binding Peptides. Methods in Enzymology 326: 340-362(2000)). Esta combinación también puede usarse en la presente invención.

Se prepara una proteína fusionada a CBP compuesta de un componente proteínico y CBP unida a ella. Luego se purifica por adsorción mediante una resina con afinidad para CaM basada en Sepharose 4B o otras resinas con afinidad para CaM comercialmente asequibles. En la elución, se usa EGTA capaz de formar un quelato estable con Ca^{2+}.

El protocolo siguiente muestra un ejemplo del proceso de preparación de una proteína fusionada a CBP que emplea CBP y CaM. Se conocen diversas variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Añadir 20 ml del cultivo de una noche de células transformadas (serie pCA construida sobre la base de pET-11 como vector) durante la noche a 1 litro de medio LB (caldo de Luria) que contiene 50 \mug/ml de ampicilina o carbenicilina. Incubar a DO_{600} = 0,6 \sim10. Después de añadir IPTG para obtener una concentración final de 1 mM, continuar la incubación durante 3 a 5 horas más bajo agitación.

2. Recoger las células por centrifugación. Suspender el sedimento de células en un tampón A (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, 2-mercapto-etanol 10 mM, acetato de magnesio 1 mM, imidazol 1 mM y CaCl_{2}2 mM) que contiene 0,2 mg/ml de lisozima. Romper las células por tratamiento con ultrasonidos.

3. Centrifugar el lisado de células (25.000g, 15 min) y recoger el sobrenadante.

4. Equilibrar 10 ml de una resina de CaM-Sepharose con el tampón A.

5. Mezclar la resina de CaM-Sepharose con el lisado de células y agitar suavemente durante 1 hora. Centrifugar a baja velocidad y eliminar la suspensión para eliminar de este modo la materia no unida específicamente.

6. Lavar con 40 ml de tampón A. Re-suspender en 20 a 30 ml de tampón A y luego colocarla como relleno en una columna. Lavar sucesivamente con 5 volúmenes de lecho de columna de tampón A y tampón B (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, acetato de magnesio 1 mM, imidazol 1 mM y CaCl_{2} 0,1 mM) hasta que la A_{280} del detector de UV del alcance la línea base.

7. Eluir la proteína diana con tampón B que contiene 2mM de EGTA.

D. HSA y ABP

Se ha descrito un proceso para purificar una proteína empleando la unión de seroalbúmina humana (abreviadamente HAS por la expresión inglesa human serum albumina) a un asa de afinidad de unión a seroalbúmina (abreviadamente ABP por la expresión inglesa affinity binding protein) (T. Graslund, J. Nilsson, A. M. Lindberg, M. Uhen, and Per-Ake Nygren, Production of a Thermostable DNA-polimerase by Site-Specific Cleavage of A Heat-Eluted Affinity Fusion Protein. Protein Expression and Purification 9: 125-132, 1997). Este proceso comprende expresar una proteína diana como una proteína fusionada con un asa de afinidad de unión a seroalbúmina (ABP), capturarla por una columna de HSA-Sepharose y eluir con tampón que tiene un bajo valor de pH. Esta combinación también puede emplearse en la presente invención.

El siguiente protocolo muestra de modo general este proceso para la purificación de la proteína.

1. Añadir 5 ml del cultivo de una noche de células transformadas (hospedante: E. coli, vector: pET-21a (Novagen)) a 500 ml de medio de TSB + YE (30 g/l de caldo de soja tríptico, 5 g/l de extracto de levadura, 100 mg/l de ampicilina, 34 mg/l de cloramfenicol seguido por incubación bajo agitación hasta DO_{600} = 0,8 a 1,5.

Para inducir la expresión de la proteína fusionada, añadir 1mM (la concentración final) de isopropil-\beta-D-tiogalactósido y continuar la incubación durante 3 a 5 horas más.

3. Recoger las células por centrifugación. Suspender el sedimento de células en TST (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M y Tween 20 al 0,05%, EDTA 1 mM) y romper las células por tratamiento con ultrasonidos.

4. Centrifugar la suspensión de células rotas (20.000g, 30 min). Filtrar el sobrenadante así obtenido a través de un filtro hidrófilo de 1,2 \mum.

5. Aplicar el extracto de células a una columna de HSA-Sepharose.

6. Eluir la proteína diana con una solución de Hac 0,5 M (pH 2,8).

(5-4) Proceso que usa la unión de una proteína a un compuesto específico de bajo peso molecular, tal como aminoácidos, DNA, colorante, vitamina o lectina A. Glutation-S-transferasa (GST) y glutation

Se ha realizado usualmente un proceso para purificar una proteína empleando una interacción entre GST y glutation que se denomina el método de arrastre con GST. (Véase, por ejemplo, Tanpakushitsu Jikken Noto (Protein Experiment Note) (1), en la p.162 y siguientes, Chap. 5: 1. GST-Yugo Tanpakusthitu no Hatugen to Seisei (Expression and Purification of GST-fused Protein), Suetake, D. B. Smith, Generating Fusions to Glutathione S-Transferase for Protein Studies. Methods in Enzymology 326:254-270, (2000)). Esta combinación también puede usarse en la presente invención.

Este proceso comprende la preparación de una proteína fusionada compuesta de una proteína diana con GST y la adsorción por glutation-agarosa empleada como adsorbente. Como eluyente, se usa glutation reducido. En caso de preparar la GST-proteína fusionada mediante una técnica de ingeniería genética, es conocido usar como hospedante, por ejemplo, E. coli, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe.

El siguiente protocolo muestra en términos generales un ejemplo del proceso de la producción de GST-proteína fusionada empleando GST y glutation. Se conocen diversas variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Diluir 100 ml de un cultivo de una noche de células transformadas en 1 litro de medio L que contiene 100 \mug/ml de ampicilina seguido por incubación.

2. Recoger las células por centrifugación (5000g). Suspender el sedimento de células en 20 ml de PBS enfriada con hielo que contienen un agente reductor, tal como 1 a 5 mM ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol al 0,1%.

3. Tratar suavemente con ultrasonidos las células en suspensión con hielo de modo que no permanezca la suspensión. Controlar el tratamiento por ultrasonidos hasta un nivel tal que la solución se vuelva de color gris claro dentro de aproximadamente 5 min.

4. Añadir Triton X-100 para obtener una concentración final de 1% y centrifugar (10.000g, 4ºC, 5 min). Aplicar el sobrenadante a un tubo de 50 ml. Añadir 1 ml de perlas de glutation-agarosa al 50% pre-hinchadas, invertir ocasionalmente e incubar a 4ºC durante 30 min.

5. Recoger las perlas por centrifugación (500g, 30 min) y lavar tres veces con 50 ml partes alícuotas de PBS enfriada con hielo.

6. Eluir la proteína fusionada agitando suavemente las perlas con un volumen igual de Tris-HCl (pH 8) 50 mM recientemente preparado a temperatura ambiente durante 5 min.

7. Eliminar el sobrenadante centrifugando (500g, 30 segundos), añadir glicerol para obtener una concentración final de 10% y conservar en partes alícuotas a -80ºC.

B. Proteína y colorante-ligando

Se ha descrito que una proteína natural de Zymononas mobilis muestra afinidad para colorantes específicos, tal como C.I. 17908, Rojo reactivo 8 y azul reactivo C.I. 187 y esta proteína y esta proteína pude purificarse usando esta característica (R. K. Scopes and K. Griffiths-Smith, Use of Differential and Dye-Ligand Chromatography with Affinity Elution for Enzime Purification: 6-Phosphogluconate Dehydratase from Zymononas mobilis. Analytical Biochemistry 136: 530-534, 1984). Concretamente, una proteína diana puede purificarse marcando la proteína diana con la totalidad o parte de esta proteína, adsorbiendo por una columna de afinidad de Sepharose empleando el colorante anterior como ligando y eluyendo luego. El siguiente protocolo muestra el proceso para purificar la proteína que procede de Z. mobilis.

1. Partiendo de un cultivo líquido de Z. mobilis, preparar un extracto de células usando un tampón de extracción (K-Mes 20 mM (pH 6,5), NaCl 30 mM, MnCl_{2} 5 mM, sulfato ferroso-amónico 0,5 mM, y \beta-mercaptoetanol 10 mM).

2. Aplicar el extracto de células sucesivamente a una columna Scarlet MX-G (C.I. 17908, Rojo reactivo 8)-Sepharose CL-4B (Pharmacia) y una columna de colorante azul HE-G (Azul reactivo C. I. 187)-Sepharose CL-4B.

3. Lavar la columna con 100 ml del tampón de extracción.

4. No lavar la columna Scarlet MX-G sino exclusivamente la columna Blue-HE-G con el tampón de extracción que contiene 20 mM de Na_{2}SO_{4}.

5. Eluir la proteína diana procedente de Z. mobilis con DL-\alpha-glicerofosfato 20 mM.

C. Proceso que emplea la unión de biotina a avidina

Es conocido desde hace bastante tiempo un proceso para purificar una proteína usando la unión específica de biotina a avidina (véase, por ejemplo, J. D. Alche, and H. Dickinson, Affinity Chromatographic Purification of Antibodies to a Biotinilated Fusion Protein Expression in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 12:138-143, 1998). Este proceso comprende preparar una proteína fusionada compuesta de biotina y una proteína diana usando una secuencia (122 aminoácidos) que está biotinilada en un hospedante (por ejemplo, E. coli), capturar esta proteína fusionada por una columna que tiene fijada a ella avidina (por ejemplo, resina de avidina de liberación suave SoftLink (Promega)) y luego eluir competitivamente con biotina. Esta combinación también se puede usar en la presente invención.

1. Para inducir la expresión del gen, añadir 1 mM de IPTG (la concentración final) a un cultivo de una noche de células transformadas (hospedante: E. coli, vector: PinPoint Xa-2 (Promega)) e incubar durante 5 horas más. En el caso de que la proteína expresada esté presente dentro de las células, tratarla como sigue.

2. Lisar las células añadiendo 10 ml por gramo del sedimento de células del tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA1 mM, NaCl 50 mM, PMSF 0,1 mM y 1 mg/ml de lisozima).

3. Recoger el precipitado que contiene la proteína diana, centrifugar (18.000g, 15 min) y suspender en tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 8), EDTA10 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 al 0,5% y PMSF 0,1 mM) seguido por un lavado doble.

4. Después de centrifugar (18.000g, 15 min), suspender el sedimento así obtenido en tampón de solubilización (Tris-HCl 50 mM (pH 8), EDTA 10 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 al 0,5%, PMSF 0,1 mM, y guanidina.HCl 6 M).

5. Aplicar el extracto de células a una columna de 3 ml de la resina de avidina de liberación suave SoftLink (Promega) pre-equilibrada con 30 ml de tampón de solubilización. Lavar con 60 ml del tampón de solubilización.

6. Eluir la proteína diana biotinilada con eluyente de solubilización que contiene 5 mM de biotina.

(5-5) Proceso que usa la unión de una proteína a un sacárido

En este proceso, se purifica una proteína empleando una interacción entre un sacárido-proteína de unión con un sacárido. Por ejemplo, es conocido usar proteína de unión a maltosa (abreviadamente MBP por la expresión inglesa maltose binding protein) junto con amilosa (D. Sachdev and J. M. Chirgwin, Fusions to Maltose-Binding Protein: Control of Folding and Solubility in Protein Purification. Methods in Enzymology 326: 312-321 (2000)). Además, se espera que pueda usarse la interacción entre proteínas de unión a \beta-galactosa, tal como galectina y \beta-galactosa. Estas combinaciones también se pueden usar en la presente invención.

A. Proteína de unión a maltosa y amilosa

En el proceso en el que una proteína fusionada de maltosa-proteína de unión se adsorbe por una resina que tiene amilasa fijada a ella se usa maltosa como eluyente. El siguiente protocolo muestra un ejemplo del proceso de producción de una proteína fusionada de maltosa-proteína de fusión. Se conocen diversas variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Añadir 2 ml de un cultivo de una noche de células transformadas (E. coli/vector pMAL-c2 (New England Biolabs)) a 225 ml de medio LBD que contiene 100 \mug/ml de ampicilina (medio LB (caldo de Luria) que contiene 0,2% de glucosa) e incubar con agitación hasta DO_{600} = 0,5a 37ºC.

2. Para inducir la expresión del gen, añadir 0,3 mM de isopropanol-(3-tioga-lactoporanósido (IPTG) y continuar la incubación durante 2 a 3 horas a 30ºC.

3. Recoger las células centrifugando (6.800g, 5 min). Suspender el sedimento de células en 10 ml de tampón de columna (Tris 20 mM (pH 7,4), NaCl 200 mM, EDTA1 mM, Tween 80 al 0,02%) y congelar a -20ºC durante la noche.

4. Descongelar la suspensión de células congeladas en hielo-agua y diluir en 10 ml del tampón de columna. Romper las células por tratamiento con ultrasonidos (intensidad: 75% del nivel máximo).

5. Después de centrifugar (20.000g, 4ºC, 15 min), diluir el sobrenadante con 10^{-}ml del tampón de columna (extracto crudo).

6. Aplicar el extracto crudo a 10 ml de una columna de resina de amilosa.

7. Lavar la columna varias veces con partes alícuotas de 20 a 30 ml del tampón de columna. Luego eluir la proteína diana con el tampón de columna que contiene 10 mM de maltosa.

B. Quitina y dominio de unión a quitina (abreviadamente CBD por la expresión inglesa chitin binding domain)

En este proceso, se usa la unión de quitina al dominio de unión a quitina (CBD) para purificar una proteína. Concretamente, se expresa una proteína fusionada compuesta de proteína de unión a quitina (CBD) unida a una proteína diana mediante inteína (actividad de auto-escisión inducible de elementos de empalme de proteínas obtenidos por ingeniería genética) y luego se adsorbe por una columna de afinidad para quitina (New England Biolabs). En la elución, el enlace entre la inteína y la proteína diana se escinde con un agente reductor, tal como DTT, \beta-mercaptoetanol o cisteína (véase, por ejemplo, Chung-Mo Park, Jae-Yoon Shim, Song-Sook Yang, Jeong-GuKang, Jeong-Il Kim, Z. Luka,and Pill-Soon Song, Chromophore - Apoprotein Interactions in Synechocystis sp. PCC6803 Phytochrome Cph1. Biochemistry 39: 6349-6356, 2000). En el caso de aplicar este proceso a los componentes proteínicos de la presente invención, los componentes proteínicos se marcan también con una sustancia adhesiva distinta de CBD-inteína y este marcador adhesivo se usa en la separación de los componentes proteínicos de la proteína diana formada el sistema de síntesis in vitro.

El siguiente protocolo muestra en general muestra un ejemplo de este proceso para purificar una proteína. Se conocen diversas variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Añadir 3 ml de un cultivo de una noche de células transformadas (hospedante: E. coli, vector: pTYB2 (New England Biolabs)) a 250 ml de medio RB (extracto de levadura al 0,5%, triptona al 1%, NaCl al 0,5%, glucosa al 0,2% (pH 7,5) e incubar hasta DO_{600} =0,6 a 30ºC.

2. Para inducir la expresión de la proteína fusionada, añadir 1 mM de IPTG (la concentración final) y continuar la incubación durante 14 a 16 horas a 20ºC.

3. Recoger las células centrifugando (5.000g, 5 min). Suspender el sedimento de células en tampón de lisis (Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 500 mM, Triton X-100 al 0,1%, EDTA 1 mM) bajo enfriamiento con hielo. Romper las células por tratamiento con ultrasonidos.

4. Recoger el sobrenadante centrifugando (100.000g, 30 min) y filtrar a través de una membrana filtrante de 0,2 mm.

5. Añadir 20 \mul de DMSO 2 mM a 1,5 ml del extracto de células. Incubarlo en hielo durante 1 hora y luego aplicarlo a una columna de afinidad para quitina.

6. Lavar la columna con tampón (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y Triton X-100 al 0,1%). Incubar en tampón que contiene 1 mM de DTT (la concentración final) a 4ºC durante la noche para inducir la auto-escisión de la inteína. Luego recoger la proteína diana así liberada.

(5-6) Proceso que usa la unión de un fragmento de una proteína o de un péptido a una resina de cambio iónico A. PoliArg y resina de cambio iónico

En este proceso, la proteína se purifica aprovechando el fenómeno de que una proteína diana con cola de PoliArg, que está cargada positivamente, se adsorbe por una resina de cambio catiónico (por ejemplo, una columna para HPLC de SP-TSK). La elución se lleva a cabo controlando la fuerza iónica (J. C. Smith, R. B. Derbyshire, E. Cook, L. Dunthorne, J. Viney, S. J. Brewer, H. M. Sassenfeld, and L. D. Bell, Chemical Syhthesis and Cloning of a Poly(Arginine)- Coding Gene Fragment Designed to Aid Polypeptide Purification. Gene 32: 321-327, 1984).

El siguiente protocolo muestra en general un ejemplo del proceso antes descrito. Se conocen diversas variaciones de este proceso y puede seleccionarse una de ellas.

1. Añadir 6 ml de un cultivo de una noche de células transformadas (hospedante: E. coli, vector: pWT221) a 300 ml de medio M9 que contienen 100 \mug/ml de ampicilina e incubar hasta A_{600} = 0,4 bajo agitación a 37ºC.

2. Añadir una solución de IAA (20 mg/ ml en etanol) para dar una concentración final de 20 \mug/ml.

3. Añadir 0,1% de Polymin P (la concentración final) y recoger las células por centrifugación.

4. Lisar el sedimento celular en tampón (Tris-acetato 40 mM (pH 5,5), urea 5 M) y dializar contra el mismo tampón.

5. Aplicar 0,1 ml del extracto de células a una columna para HPLC de SP-TSK y lavar la columna con el mismo tampón.

6. Eluir la proteína diana en el tampón (PIPES 40 mM (pH 6,0) y urea5 M) bajo un gradiente de concentración NaCl (100 mM a 350 mM).

(5-7) Proceso que usa perlas

Se han comercializado perlas magnéticas (Dynabeads^{TM}, DYNAL, Noruega) que tienen un tamaño de partículas uniforme, las cuales consisten en un núcleo de un polímero que tiene sustancias magnetizables (por ejemplo, \gammaFe_{2}O_{3} y Fe_{3}O_{4}) uniformemente dispersado en ellas y un revestimiento de polímero hidrófilo. Uniendo diversos anticuerpos a la superficie, estas perlas pueden unirse a células y proteínas. Cuando se encuentran próximas a un imán potente (MPC), las perlas magnéticas se magnetizan y por tanto son atraídas magnéticamente. Cuando se retira el imán, las perlas se desmagnetizan y se dispersan de nuevo. Debido a estas características, las perlas magnéticas se han usado, por ejemplo, en purificar células y proteínas. Por ejemplo, se ha descrito que los linfocitos B de sangre periférica B se aislaron por el uso de perlas de poliestireno magnéticas (DYNAL) revestidas con el anticuerpo CD19 (Kanegasaki, S. et al, J. Biochem. 117:758-765(1995)). En la presente invención, también es posible marcar los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción con perlas magnéticas y eliminarlos magnéticamente del sistema de reacción. Es decir, dicha combinación de perlas magnéticas con un imán también cae dentro de la categoría de las sustancias que interactúan mutuamente de acuerdo con la presente invención.

Ahora la presente invención será ilustrada con mayor detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo ha de entenderse, que la invención no ha de considerarse restringida a estos ejemplos.

Ejemplo 1 Preparaciones de ribosomas de E. coli y extracción de S100

300 g de células de E. coli A19 (cosechadas en fase semilogarítmica) se molieron con alúmina. Las células molidas se pusieron en suspensión de tampón A (Hepes-KOH 10mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10mM, KCl 50mM, DTT 1mM) y alúmina y los residuos de células se eliminaron por centrifugación a 30.000g durante 1 hora a 4ºC. A la fracción sobrenadante resultante se añadió DNasa (desoxi-ribonucleasa) para obtener una concentración final de 1 \mug/ml seguido por centrifugación a 100.000g durante 4 horas a 4ºC. La fracción sobrenadante así obtenida se denominó S100. El sedimento se volvió a poner en suspensión en el tampón A y la suspensión se denominó extracto ribosómico bruto. De este extracto ribosómico bruto, se obtuvo una fracción ribosómica fuertemente acoplada bajo un gradiente de densidad en sacarosa de 6 a 36%. Esta fracción ribosómica fuertemente acoplada se centrifugó a 100.000g y el sedimento se puso en suspensión en tampón de ribosoma (Hepes-KOH 20mM (pH 7,6), MgOAc 6mM, NH_{4}Cl 30mM y \beta-mercaptoetanol 7mM) para preparar de este modo la fracción ribosómica fuertemente acoplada. La Fig. 1 muestra las fracciones ribosómicas bajo el gradiente de densidad de sacarosa.

Ejemplo 2 Construcción de plásmidos para sobre-expresar factores de iniciación, factores de prolongación y factores de terminación

Usando el genoma de E. coli A19 como molde, se amplificó la secuencia génica que codifica el gen EF-Tu por PCR para dar un fragmento de DNA que tiene una secuencia de reconocimiento de EcoRI en el extremo 5' y una secuencia de reconocimiento de BglII en el extremo 3'. El fragmento de DNA así obtenido se insertó en un plásmido pQE60 (QIAGEN) que había sido escindido con EcoRI y BglII. De este modo se construyó un vector para sobre-expresar EF-Tu fusionado con una cola His en el terminal C. A continuación, E. coli BL21/pREP4 se transformó por el vector obtenido anteriormente. Del mismo modo se construyeron vectores para sobre-expresar otros factores de prolongación, factores de iniciación y factores de terminación. La Tabla 1 recoge los vectores y enzimas de restricción empleadas y las colas de His.

Ejemplo 3 Construcción de plásmidos para sobre-expresar aminoacil-tRNA-sintetasa (ARS) y metionina-tRNA-formilasa (MTF)

Usando el genoma de E. coli A19 como molde, se amplificó por PCR una secuencia genómica que codifica el gen de la alanil-tRNA-sintetasa para obtener un fragmento de DNA que tiene una secuencia de reconocimiento de Sphl en el 5'-terminal y una secuencia de reconocimiento de HindIII en el extremo 3'. El fragmento de DNA así obtenido se insertó en un plásmido pQE30 (QIAGEN) que había sido escindido con Sphl y HindIII. De este modo, se construyó un vector para sobre-expresar alanil-tRNA-sintetasa fusionada con una cola de His N-terminal. A continuación, se transformó E. coli BL21/pREP4 por el vector obtenido anteriormente. Los vectores para sobre-expresar otras ARS y MTF se construyeron del mismo modo. La Tabla 1 recoge los vectores y enzimas de restricción empleadas y los sitios de las colas de His, en donde los plásmidos obtenidos se transformaron en la cepa E. coli BL21/pREP4 (serie pQE) o BL21/DE3(serie pET).

TABLA 1

1

Ejemplo 4 Construcción de un plásmido para sobre-expresar T7RNA-polimerasa

Usando el genoma del fago T7 como molde, se amplificó por PCR una secuencia génica que codifica el gen de la T7RNA-polimerasa para obtener un fragmento de DNA que tiene una secuencia de reconocimiento de BamHI en el extremo 5' y una secuencia de reconocimiento de PstI en el extremo 3'. El fragmento de DNA así obtenido se insertó en un plásmido pQE30 (QIAGEN) que había sido escindido con BamHI y PstI. De este modo, se construyó un vector para sobre-expresar T7RNA-polimerasa fusionada con una cola de His N-terminal. A continuación, se transformó E. coli BL21/pREP4 por el vector obtenido anteriormente.

Ejemplo 5 Construcción de plásmidos para sobre-expresar nucleósido-difosfato-quinasa (NDK) y otras enzimas

Usando el genoma de E. coli A19 como molde, se amplificó por PCR una secuencia génica que codifica el gen de NDK para obtener un fragmento de DNA que tiene una secuencia de reconocimiento de BamHI en el 5'-terminal y una secuencia de reconocimiento de HindIII en el extremo 3'. El fragmento de DNA así obtenido se insertó en un plásmido pQE30 (QIAGEN) que había sido escindido con BamHI y HindIII. De este modo, se construyó un vector para sobre-expresar NDK fusionada con una cola de His en el N-terminal. A continuación, se transformó E. coli BL21/pREP4 con el vector obtenido anteriormente. Si se desea, los plásmidos para otras enzimas ilustradas en los apartados (4-1) y (4-2) en la página 18 pueden construirse del mismo modo.

Ejemplo 6 Sobre-expresión y purificación de factores de iniciación, factores de prolongación y factores de terminación

Para sobre-expresar EF-Tu (EF-Tu*) con cola de His, las células transformantes BL21/pREP4 obtenidas en el Ejemplo 2 se hicieron crecer en 6 litros de medio LB hasta que la densidad óptica obtenida (DO_{660}) alcanzó 0,7. Al cultivo se añadió IPTG (isopropil-1-tio-\beta-D-galactósido) para obtener una concentración final de 0,1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas más a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de suspensión (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1M, MgCl_{2} 10 mM, 0,3 mg/ml de lisozima, Triton X-100 al 0,1%, PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) 0,2mM y \beta-mercaptoetanol 6mM) y se rompieron por tratamiento con ultrasonidos. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación a 100.000g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante obtenido se aplicó a una columna quelante Hi-Trap(Pharmacia) de 10 ml pre-cargada con Ni^{2+} y se lavó con 100 ml de tampón HT (Hepes-KOH 50mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1M y MgCl_{2} 10mM) que contenía 10 mM de imidazol. Luego el EF-Tu* se eluyó de la columna bajo un gradiente lineal de concentración de imidazol (10 a 400 mM) contenido en el tampón HT. Las fracciones EF-Tu* así purificadas se recogieron y dializaron contra el tampón de reserva (Hepes-KOH 50mM (pH 7,6), KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, 30% de glicerol). La concentración del EF-Tu* purificado se determinó basándose en una curva patrón formada usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad que emplea BSA (seroalbúmina bovina) como patrón. El EF-Tu* obtenido se congeló rápidamente en partes alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido y se conservó a -80ºC. De la misma manera se purificaron otros factores de prolongación, factores de iniciación y factores de terminación con colas de His. La Fig. 2 muestra modelos de SDS-PAGE al 12% de factores con colas de His (teñidos con azul Coomassie brillante).

Las actividades y concentraciones óptimas de los factores de iniciación (IF1, IF2 y IF3: "*" significa "con colas de His") se midieron usando mRNA de un sistema de traducción de DHFR in vitro (Ejemplo 17 que aparece más adelante en la presente memoria). Usando un sistema que contiene la totalidad de IF1*, IF2* y 1F3* como control positivo, se llevó a cabo la incubación durante 30 minutos en sistemas que carecían de los factores de iniciación respectivos y luego se compararon las actividades relativas de las DHFR así formadas (Fig. 3.A.). Concretamente, se determinaron las actividades de factores de iniciación con colas de His por referencia a la actividad del control positivo como 100. Como resultado, se confirmó que el rendimiento de DHFR en cada uno de los sistemas que carecían de IF* correspondía a 1/2 o menos del control positivo, lo cual indica que todos los IF1*, IF2* y 1F3* tienen la actividad. Las concentraciones óptimas de los factores de iniciación con colas de His se midió traduciendo un sistema in vitro en condiciones constantes, pero variando la concentración de cada factor de iniciación y midiendo la actividad relativa de de la DHFR así formada (Fig. 3B). En la Fig. 3B, \medbullet, \ding{115} y \blacksquare respectivamente muestran los datos de IFl*, 1F2* y IF3*.

Ejemplo 7 Sobre-expresión y purificación de ARSs y MTF con colas de His

Células transformantes BL21/DE3 para sobre-expresar Ser-tRNA-sintetasa con cola de His ("*" significa "con cola de His") se hicieron crecer en 2 litros de medio LB hasta que la densidad óptica (DO_{660}) alcanzó 0,7. Al cultivo, se añadió IPTG (isopropil-1-tio-\beta-D-galactósido) para obtener una concentración final de 0,1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas más a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de suspensión (Hepes-KOH 50mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1 M, MgCl_{2} 10 mM, 0,3 mg/ml de lisozima, Triton X-100 al 0,1%, PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) 0,2 mM y \beta-mercaptoetanol 6 mM) y se rompieron por tratamiento con ultrasonidos. Los residuos de células se eliminaron por centrifugación a 100.000g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante obtenido se aplicó a una columna quelante Hi-Trap (Pharmacia) de 10 ml pre-cargada con Ni^{2+} y se lavó con 100 ml de tampón HT (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1 M, MgCl_{2} 10 mM) que contenía 10 mM de imidazol. Luego se eluyó la Ser-tRNA-sintetasa* de la columna bajo un gradiente lineal de concentración de imidazol (10 a 400 mM) contenido en el tampón HT. Las fracciones de Ser-tRNA-sintetasa* así purificadas se recogieron y dializaron contra tampón de reserva (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y 30% de glicerol). La concentración de Ser-tRNA-sintetasa* purificada se determinó basándose en una curva patrón formada usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad que emplea BSA (seroalbúmina bovina) como patrón. La Ser-tRNA-sintetasa* así obtenida se congeló rápidamente en partes alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido y luego se conservó a -80ºC. Las Fig. 5 muestra un cromatograma de la Ser-tRNA-sintetasa* así obtenida.

Se sobre-expresaron y se purificaron del mismo modo otras ARS* y MTF. La Fig. 6 muestra modelos de SDS-PAGE al 12% de factores y enzimas con colas de His (teñidos con azul Coomassie brillante). Las dos bandas de Gly RS* y Phe RS* observadas en la Fig. 6 son asignables al hecho de que estas enzimas tienen los tipos \alpha2 y \beta2. La Fig. 6 indica que estos factores y enzimas con colas de His se obtuvieron cada uno con alta pureza.

Ejemplo 8 Sobre-expresión y purificación T7RNA-polimerasa con cola de His

Se hicieron crecer células transformantes BL21/pREP4 para sobre-expresar T7RNA-polimerasa con cola de His ("*" significa "con cola de His") en 6 litros de medio LB hasta que la densidad óptica (DO_{660}) alcanzó 0,7. Al cultivo se añadió, IPTG (isopropil-1-tio-P-D-galactósido) para obtener una concentración final de 0,1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas más a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de suspensión (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1M, MgCl_{2} 10 mM, 0,3 mg/ml de lisozima, Triton X-100 al 0,1%, PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) 0,2 mM, \beta-mercaptoetanol 6 mM) y se rompieron por tratamiento con ultrasonidos. Los residuos de células se eliminaron centrifugando la suspensión de células rotas a 100.000g durante 1 hora a 4ºC. La fracción sobrenadante obtenida se aplicó a una columna quelante Hi-Trap (Pharmacia) de 10 ml pre-cargada con Ni^{2+} y se lavó con 100 ml de tampón HT (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1 M, MgCl_{2} 10 mM) que contenía 10 mM de imidazol. Luego la T7RNA polimerasa* se eluyó de la columna bajo un gradiente de concentración de imidazol (10 a 400 mM) contenido en el tampón HT. Las fracciones de la T7RNA-polimerasa* así purificada se recogieron y dializaron contra un tampón de reserva (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y 30% de glicerol). La concentración de la T7RNA-polimerasa* se determinó basándose en una curva patrón formada usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad que emplea BSA (seroalbúmina bovina) como patrón. La T7RNA-polimerasa* obtenida se congeló rápidamente en partes alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido y luego se conservó a -80ºC. Las Figuras 12A y B muestran cromatogramas de la T7RNA-polimerasa* así obtenida.

Ejemplo 9 Sobre-expresión y purificación de NDK y otras enzimas con cola de His

Se hicieron crecer células transformantes BL21/pREP4 para sobre-expresar NDK con cola de His ("*" significa "con cola de His") en 2 litros de medio LB hasta que la densidad óptica (DO_{660}) alcanzó 0,7. Al cultivo se añadió IPTG. (isopropil-1-tio-\beta-D-galactósido) para obtener una concentración final de 0,1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas más a 37ºC.

Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de suspensión (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1 M, MgCl_{2} 10 mM, 0,3 mg/ml de lisozima, Triton X-100al 0,1%, PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) 0,2 mM, \beta-mercaptoetanol) 6 mM y se rompieron por tratamiento con ultrasonidos. Los residuos de células se eliminaron por centrifugación a 100000g durante 1 hora a 4ºC. La fracción sobrenadante obtenida se aplicó a una columna quelante Hi-Trap (Pharmacia) de 10 ml precargada con Ni^{2+} y se lavó con 100 ml de tampón HT (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), NH_{4}Cl 1 M, MgCl_{2} 10 mM) que contenía 10 mM de imidazol. Luego la NDK* se eluyó de la columna bajo un gradiente lineal de concentración de imidazol (10 a 400 mM) contenido en el tampón HT. Las fracciones NDK* así purificadas se recogieron y dializaron contra el tampón madre (Hepes-KOH 50 mM (pH 7,6), KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, 30% de glicerol). La concentración de la NDK* purificada se determinó basándose en una curva patrón formada usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad que emplea BSA (seroalbúmina bovina) como patrón. La NDK* obtenida se congeló rápidamente en partes alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC. Si se desea, otras enzimas con colas de His ilustradas en los apartados (4-1) y (4-2) en la página 18 pueden obtenerse del mismo modo.

Ejemplo 10 Construcción del gen de DHFR y preparación del mRNA

Se amplificó por PCR el gen de DHFR (dihidrofolato-reductasa) añadiendo una secuencia HindIII y una secuencia BamHI respectivamente a los extremos 5' y 3'. El gen contenía un promotor T7 aguas arriba (upstream) de un sitio de unión a ribosoma con la "secuencia epsilon" del gen 10 procedente del bacteriófago T7 seguido por una secuencia de Shine-Dalgarno (SD). Este fragmento de DNA se clonó en un plásmido vector pUC18 (Takara Shuzo). Después de tratar con SmaI, este plásmido se usó como molde en la transcripción no iniciada (run-off transcription) o en la traducción con transcripción in vitro con el uso de T7RNA-polimerasa. La reacción de transcripción in vitro se llevó a cabo a 42ºC durante 3 horas. La mezcla de reacción (1 ml) comprendía Hepes-KOH 40mM (pH 7,8), 20 nM de MgCl, 1 mM de espermidina, 5 mM de DTT, 2 mM de cada uno de ATP, UTP, CTP, y GTP, 20 \mug del plásmido molde tratado con SmaI, 50 \mug de BSA, 1,78 unidades de PPiasa (pirofosfatasa) y 10 \mug de T7RNA-polimerasa con cola de His así purificada. Para detener la reacción, se añadió EDTA (ácido etilendinitrotetraacético) para obtener una concentración final de 50 mM. El mRNA así obtenido se extrajo con fenol/cloroformo y luego se precipitó con etanol. A continuación, se purificó usando un kit de purificación de RNA (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.

Ejemplo 11 Construcción de mRNA de MFL

Para obtener un molde para el mRNA de MFL una secuencia de DNA AUGUUCUUGUAA (SEQ. ID No. 4) (traducida en fMet-Phe-Leu-Stop; formilmetionina-fenilalanin-leucina-codón de parada (Stop); en lo sucesivo denominada simplemente MFL) se construyó como sigue. Un oligonucleótido A: 5'-TATGTTCTTGTAAC(SEQ. ID. No. 5) se asoció con otro oligonucleótido B: 5'-TCGAGTTACAAGAACA (SEQ. ID. No. 6) para dar un DNA bicatenario que contenía secuencias Nde I y Xho I. A continuación, este DNA se clonó en sitios Nde I y Xho I de un plásmido vector pET29a (Novagen). El plásmido resultante se transcribió como en el caso del gen de DHFR.

Ejemplo 12 Actividades de aminoacil-tRNA-sintetasa con cola de His

Las actividades de ARSs (aminoacil-tRNA-sintetasas) con colas de His se midieron como sigue. Cada mezcla de reacción (50 \mul) comprendía tampón polymix (véase experimentos de traducción) que contenía 1 mM de ATP, 2,8A_{660} unidades de tRNAmix (Boehringer), 50 \muM de cada aminoácido marcado, y cada ARS con cola de His purificada. Las reacciones se realizaron a 37ºC y se precipitaron aminoacil-tRNAs radiactivos en filtros 3MM a diferentes tiempos de incubación y se lavaron con ácido tricloroacético al 5%, seguido por la medida de la radiactividad. Una unidad de actividad se define como la cantidad de la enzima capaz de sintetizar 1 pmol de aminoacil-tRNA por minuto. La Tabla 2 muestra los resultados.

TABLA 2

2

Ejemplo 13 Actividades de metionil-tRNA-transformilasa con cola de His

Las actividades de MTFs con colas de His se midieron como sigue ("*" significa "con colas de His"). Cada mezcla de reacción (50 \mul) comprendía tampón polymix (véase experimentos de traducción) que contenían 1mM ATP, 2,8 unidades A_{260} de tRNAmix (Boehringer), 50 \muM de metionina marcada con [^{3}H], 0,5 \mug de ácido 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofólico, 3000 unidades de MetRS, y MTF*. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC y los metionil-tRNAs no formilados se desacilaron en un tampón que contenía 0,175 M de CuSO_{4} y 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,5) durante 8 minutos a 30ºC. Los formil-metionil-tRNAs radiactivos se precipitaron en filtros 3MM y se lavaron con ácido tricloroacético frío al 5% seguido por medida de la radioactividad. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima capaz de sintetizar 1 pmol de formil-metionil-tRNA por minuto. La Tabla 2 muestra los resultados (en la última columna).

Ejemplo 14 Experimentos de traducción (método general)

Se prepararon mezclas de traducción (50 \mul) modificando ligeramente el tampón empleado por Jelenc et al. (1979) y Wagner et al. (1982). El tampón polymix contenía 5 mM de acetato de magnesio, 5 mM de fosfato de potasio (pH 7,3), 95 mM de glutamato de potasio, 5 mM de cloruro de amonio, 0,5 mM de cloruro de calcio, 1 mM de espermidina, 8 mM de putrescina y 1 mM de DTT. Cada mezcla de reacción contenía 1 mM de ATP, 1 mM de GTP, 10 mM de fosfato de creatina, 2.8 unidades de A_{660} de tRNAmix, 0,5 \mug de ácido 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofólico, 1 mM de cada uno de aminoácido y factor mix que se describirá más adelante en la presente memoria. En caso de reacción de traducción acoplada con transcripción, a la mezcla de reacción anterior se añadieron 1 mM de cada uno de NTP y 4 mM de acetato de magnesio. El factor y la enzima mix comprendían 12 pmol de ribosoma, 1 \mug de IF1*, 2 \mug de IF2*, 0,75 \mug de IF3*,1 \mug de EF-G*, 2 \mug de EF-Tu*, 1 \mug de EF-Ts*, 0,5 \mug de RF1*, 0,5 \mug de RF3*, 0,5 \mug de RRF*, 30 a 300 unidades de cada una de ARS* o MTF, 0,2 \mug de creatina-quinasa (CK), 0,15 \mug de mioquinasa (MK) y 0,054 \mug de nucleósido-difosfato-quinasa* (NDK). En caso de traducción acoplada con transcripción se añadieron además 1,78 unidades de PPiasa y 0,5 \mug de T7RNA-polimerasa*. Entre los factores y enzimas, los marcados con "*" significan los que tienen colas de His. Las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante 5 minutos, luego se añadió DNA o RNA molde y se comenzó la reacción. La traducción se llevó a cabo a 37ºC. Después de completarse la reacción, se eliminó primeramente el ribosoma que tiene un alto peso molecular haciendo pasar la mezcla de reacción a través de una membrana de ultrafiltración con un límite de exclusión de 100 kDa. A continuación la fracción que había pasado a través de la membrana de ultrafiltración se aplicó a una columna de Ni y se eliminaron las proteínas de fusión con cola de His. El componente que pasa a través de la columna fue el producto de la traducción que tiene una alta pureza y que mostraba una sola banda en SDS-PAGE. El sistema S30 empleado en los siguientes experimentos se adquirió a Promega y la traducción se realizó de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.

Ejemplo 15 Expresión de varias proteínas

Después de confirmar las actividades de los constituyentes del sistema de reacción con colas de His, se construyó un sistema de síntesis in vitro de proteínas como en el Ejemplo 14 con el uso de T7RNA-polimerasa con cola de His. Usando este sistema de síntesis, se sintetizaron polipéptidos de longitud completa de DHFR de E. coli, \lambda-lisozima, proteína fluorescente verde (GFP), glutation-transferasa (GST) y la proteína 10 del gen T7 y se midió el rendimiento de cada producto. La Fig. 13 muestra los resultados. Por tanto, se ha clarificado que el sistema de síntesis de acuerdo con la presente invención contiene todos los componentes requeridos en la traducción.

Ejemplo 16 Síntesis de poli(U)-poli(Phe)

Se sintetizó poli(U)-poli(Phe) en un sistema de reacción in vitro como sigue. Cada mezcla de reacción comprendía tampón polymix que contenía 1 mM de ATP, 1 mM de GTP, 10 mM de fosfato de creatina, 2,8 unidades A_{260} de tRNAmix, 1 mM de fenilalanina marcada con [^{14}C], y un factor mix. El factor mix contenía 12 pmol de ribosoma, 1 \mug de EF-G*, 2 \mug de EF-Tu*, 1 \mug de EF-Ts*, 60 unidades de PheRS*, 0,2 \mug de creatina-quinasa (CK), 0,15 \mug de mioquinasa (MK) y 0,054 \mug de nucleótido-difosfato-quinasa* (NDK*). Entre los factores y enzimas, los marcados con "*" significan los que tienen colas de His. Las mezclas de reacción se incubaron 37ºC durante 5 minutos, luego se añadieron 5 \mug de poli U) y se comenzó la reacción. La poli(Phe) se muestreó en partes alícuotas de 8 \mul con el paso del tiempo y se precipitó en filtros 3MM con ácido tricloroacético al 10%. Los aminoacil-tRNAs se desacilaron a 85ºC y se lavaron con ácido tricloroacético al 10% seguido por medida de radiactividad. Por tanto se confirmó, la formación del producto diana.

En las reacciones de traducción que se han descrito antes, las concentraciones óptimas de EF-G*, EF-Tu* y EF-Ts* se determinaron examinando el rendimiento de poli(Phe) en el sistema de reacción in vitro en condiciones constantes pero variando la concentración de cada factor de prolongación. Fig. 7 (A) muestra los resultados así obtenidos. En Fig. 7 (A), \medbullet, \ding{115} y \blacksquare muestran los datos de EF-G*, EF-Tu* y EF-Ts*, respectivamente.

Además, los datos de la síntesis de poli(Phe) en el sistema de reacción antes descrito de acuerdo con la presente invención se compararon con los datos del sistema de traducción que usa el extracto S100. La Fig. 7 (B) muestra el resultado. Aunque la reacción se detuvo después de 20 min en el último sistema (\medcirc), la reacción transcurrió incluso después de 40 minutos en el sistema de la presente invención (\medbullet).

Ejemplo 17 Actividades de factores de terminación y factor de reciclo de ribosoma

Se midieron las actividades de los factores de terminación (RF1*, RF3* y RRF*; "*" significa "con colas de His") de acuerdo con Pavrov et al. (8) con ligera modificación. Las mezclas de reacción (50 \mul) se prepararon basándose en el tampón polimix usado en el experimento de traducción. Cada mezcla de reacción comprendía 1 mM de ATP, 1 mM de GTP, 2,8A_{260} unidades de tRNAmix, 1 mM de fenilalanina y leucina, 50 pmol de formilmetionil-tRNA preparado usando metionina radiactiva [^{35}S] y un factor con cola de His y la enzima mix (descrita más adelante). El factor y la enzima mix comprendían 12 pml de ribosoma, 1 \mug de IF1*, 2 \mug de IF2*, 0,75 \mug de IF3*, 1 \mug de EF-G*, 2 \mug de EF-Tu*, 1 \mug de EF-Ts*, 0,5 \mug de RF1*, 0,5 \mug de RF3*, 0,5 \mug de RRF*, 50 unidades de PheRS* y 300 unidades de LeuRS*. Los RF1*, RF3* y RRF* fueron separados cada uno de este factor y la enzima mix dependiendo de la finalidad que se iba a dar a las respectivas mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción se pre-incubó a 37ºC durante 5 minutos, y luego se añadió 1 \mug de mRNA de MFL para iniciar la traducción. La mezcla de reacción se muestreó en partes alícuotas de 5 \mul con el paso del tiempo y cada muestra se añadió al mismo volumen de HCl 1 N para detener la reacción. Además se añadieron 200 \mul de acetato de etilo para fluir el tripéptido (fMFL) y se midió la radioactividad con un contador de centelleo de líquidos.

Las actividades de los factores de terminación RF1*, RF3* y RRF* se midieron usando un sistema de traducción in vitro para mRNA sintético que codifica fMet-Phe-Leu-Stop (fMFL). Concretamente, se tradujo mRNA de fMFL en un sistema que contenía RF1*, RF3* y RRF* como factores de terminación (\bullet), un sistema que contenía RF1* y RRF* (\medbullet), un sistema que contenía RF1* y RF3* (\ding{115}), un sistema que contenía RF1* solo (\blacksquare), un sistema que contenía RF3* y RRF* (\medcirc) y un sistema exento de cualquier factor de terminación* (RRF* también) (\blacklozenge) | y se midieron los rendimientos. La Fig. 4 muestra los resultados. En la Fig. 4, el péptido sintetizado en el primer ciclo corresponde a aproximadamente 1000 cpm en el eje y. El sistema que contenía RF1*, RF3* y RRF* (\medbullet) muestra un aumento lineal en el rendimiento de fMFL con el paso del tiempo, lo cual indica que RF1*, RF3* y RRF* tienen las actividades comparadas con otros sistemas. En el sistema que carece RF1* (\medcirc), no ocurrió síntesis de péptido. En el sistema que carece de RRF* (\ding{115}\blacksquare\blacklozenge |), no ocurrió reciclo de ribosomas.

Ejemplo 18 Síntesis de DHFR

Se sintetizó DHFR que contenía metionina [^{35}S] usando el sistema de traducción in vitro de acuerdo con la presente invención y otro sistema de traducción que usaba el sistema S30 sistema (Promega). Cada producto se separó por SDS-PAGE al 12% (gel para electroforesis en dodecil-sulfato sódico-poliacrilamida) y se detectó por un sistema BAS-1000 (Fuji Film) seguido por seguido por la medida de la radioactividad. La Fig. 8(A) muestra los resultados de la separación por SDS-PAGE.

Por otro lado se midió la actividad de DHFR como sigue. En una mezcla de reacción que contenía tampón de fosfato de potasio 50mM (pH 7,0), 50 \muM de DHF (ácido dihidrofólico) y 60 \muM de NADPH (fosfato de dinucleótido de nicotinamida-adenina reducido), se sintetizó DHFR a 30ºC y se midió la disminución en A_{390} cada 1 minuto. La Fig. 8(b) muestra los resultados.

La Fig. 9 muestra lo procesos de reacción en el sistema de traducción in vitro de acuerdo con la presente invención y en el sistema S-30. En el sistema de traducción in vitro de la presente invención (\blacksquare), la reacción transcurría incluso después de 120 minutos, mientras que el rendimiento de DHFR alcanzó el máximo después de 20 minutos en el sistema S-30 (\medbullet).

Para examinar el consumo de energía se hidrolizó trifosfato de nucleósido en el sistema de traducción in vitro de acuerdo con la presente invención y en el sistema S-30. La hidrólisis en cada sistema se monitorizó del siguiente modo, mientras se comparaban los datos. Usando moldes de DHFR, la traducción se llevó a cabo en mezclas de reacción que contenían [\alpha-^{32}P] ATP o GTP a 37ºC. Cada mezcla de reacción se muestreó en partes alícuotas de 2 \mul con el paso del tiempo y cada muestra se añadió a 150 \mul de ácido fórmico al 10%. Luego las muestras se depositaron en forma de manchas sobre placas para TLC (cromatografía de capa delgada) de polietilenimina y los productos de reacción se revelaron usando tampón de fosfato de potasio 0,75M (pH 3,75). Después de secar al aire, la placa de TLC se cubrió con una tapa de plástico y se auto-radiografió. La Fig. 10 muestra los resultados en donde los datos del sistema S30 se dan en la parte izquierda, mientras que los datos del sistema de la presente invención se dan en el lado derecho. En el sistema S-30 el ATP fue disminuyendo a medida que pasaba el tiempo, mientras que la cantidad de ATP se mantuvo en un nivel casi constante en el sistema de acuerdo con la presente invención.

Para purificar la DHFR sintetizada, se eliminó el ribosoma usando una membrana de ultrafiltración con un límite de exclusión de 100 kDa. A continuación, se eliminaron todos los componentes con colas de His que constituían el sistema de reacción haciendo pasar la mezcla de reacción a través de una columna de níquel. La mezcla de reacción antes de pasar a través de la columna de níquel y el producto obtenido después de pasar a través de la columna de níquel se desarrollaron por SDS-PAGE al 12% y se tiñeron con azul Coomassie. La Fig. 14 muestra los resultados en donde la pista 1 representa los marcadores, la pista 2 representa la mezcla de reacción y la pista 3 representa los productos (DHFR), indicando que el producto se obtuvo como una sola banda.

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Ejemplo 19 Incorporación de un residuo de valina por valil-tRNA supresor (modelo de incorporación de aminoácidos no naturales)

En el sistema de traducción in vitro de acuerdo con la presente invención que contenía RF2* ("*" significa "con colas de His") como sustituto de RF1* como factor de terminación, se tradujo un molde de DHFR, en el cual Asn en la posición 37 (codón ATA) había sido convertido en el codón UAG, usando un valil-tRNA supresor sintetizado químicamente. Como resultado se sintetizó una proteína truncada que terminaba en el residuo 37 en la muestra que contenía RF1* (Fig. 11, pista 2), mientras que se observó una banda débil asignable a esta proteína truncada en el sistema exento de RF1* (que no contenía RF2) (Fig. 11, pista 3). Incorporando en él RF2*, se observó un producto proteínico en la misma posición (Fig. 11, pista 4) como DHFR normal (Fig. 11, pista 1). En base a estos resultados se confirmó, que el residuo de valina unido al tRNA supresor se había incorporado en la posición en la posición 37 de DHFR.

Aplicabilidad industrial

Marcando los componentes proteínicos que constituyen un sistema de reacción, los componentes proteínicos individuales que constituyen el sistema de reacción pueden purificarse con seguridad y por tanto puede establecerse un sistema de reacción no contaminado con componentes desconocidos. Además, llega a ser posible de este modo aislar con alta pureza una proteína diana así sintetizada.

Aunque se ha señalado que los lipopolisacáridos (LPSs) contenidos en células y extractos de células ejercen varios efectos indeseables como endotoxinas en el cuerpo vivo, hay un problema técnico consistente en que estos LPSs pueden separarse difícilmente de los productos peptídicos. Sin embargo, este problema, puede resolverse usando el sistema de síntesis in vitro de péptidos de acuerdo con la presente invención.

Debido al establecimiento de un sistema de reacción exento de cualquier componente desconocido una reacción puede ser continuada durante un largo tiempo, por ejemplo, 2 horas o incluso más en un sistema por lotes. Además, se considera como teóricamente posible aumentar el volumen de una mezcla de reacción.

Usando un sistema de flujo, la reacción puede ser continuada durante un mayor tiempo, lo cual facilita la producción y purificación prácticas de una proteína en un sistema de reacción in vitro. Es decir, este proceso lo hace posible suministrando económicamente ciertas enzimas las cuales han sido vacilantemente aplicadas a tratamientos médicos debido a su alto coste. Como resultado de lo anterior, puede ampliarse la gama de aplicaciones de tratamientos médicos con administración de enzimas, que se emplean como sustitutos para al menos una parte de la terapia génica que adolece de un problema técnico en su suministro.

De acuerdo con la presente invención, puede establecerse definitivamente un sistema que contienen factores de terminación y un sistema exento de factor de terminación y por tanto y pueden producirse fácil y selectivamente conjuntos de polisoma. Además, llega ser posible incorporar con más precisión residuos de aminoácidos no naturales en posiciones deseadas.

Los sistemas convencionales de síntesis de proteínas exentos de células que emplean un extracto de células procarióticas adolecen del problema de que la estabilidad de un mRNA es notablemente disminuida cuando la transcripción y la traducción no se llevan a cabo simultáneamente. En contraste, una reacción de traducción de un mRNA puede transcurrir establemente en el sistema de reacción de la presente invención.

Después de completarse el análisis del genoma, los principales estudios de biología molecular están dirigidos ahora al análisis de genes. En estas circunstancias, el sistema de reacción de la presente invención, que acelera la expresión e identificación de genes de productos proteínicos y por tanto facilita el examen de las funciones de los genes, contribuye considerablemente a avances en la tecnología científica.

Referencias

1) Crowe, J., Dobeli, H., Gentz, R., Hochuli, E., Stuber, D., and Henco, K. (1994). 6xHis-Ni-NTA chromatography as a superior technique in recombinant protein expression/purification. Methods Mol Biol 31, 371-87.

2) Hochuli, E., Dobeli, H., and Schacher, A. (1987). New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr 411, 177-84.

3) Smith, D. B., and Johnson, K. S. (1988). Single-step purification of polipeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67, 31-40.

<110> POST GENOMA INSTITUTE CO., LTD.

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<120> Proceso para producir péptidos usando un sistema de transcripción/traducción in vitro.

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<130> NTK01-1399

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<140> PCT/JP 01/10682

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<141> 6 diciembre de 2001

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<150> JP 294795/2001

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<151> 26 septiembre de 2001

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<150> JP 227094/2001

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<151> 27 junio 2001

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<150> JP 6910/2001

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<151> 15 enero de 2001

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<150> JP 401417/2000

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<151> 28 diciembre de 2000

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<160> 6

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> especie bovina

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<400> 1

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\sa{Ser Asn Lys Glu Gln Glu Pro Lys Glu Lys Lys Lys Lys Lys}

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Unión de cola de Strep a estreptavidina

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<220>

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<221> ASPECTO MISCELÁNEO

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<222> (1)... (9)

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<223> Schmidt & Skerra, 1993, "The random peptide library-assisted enginering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a function IgFv fragment" Protein Eng. 6 (1):109-122.

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<400> 2

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\sa{Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly}

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cola de Streg II usada en la unión de estreptavidina

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<220>

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<221> ASPECTO MISCELÁNEO

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<222> (1)... (9)

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<223> Schmidt et al., 1996, "Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin", J. of Mol. Biol. 255(5):753-766.

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<400> 3

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\sa{Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys}

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<210> 4

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<211> 12

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<212> RNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de RNA para obtener un molde de mRNA de MFL

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<220>

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<221> mRNA

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<222> (1).. (12)

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<223>

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

AUGUUCUUGU AA

\hfill

12

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<210> 5

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<211> 14

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido A que se asocia a la SEQ ID NO:6 para dar un DNA bicatenario que contiene secuencias de NdeI y XhoI

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

TATGTTCTTG TAAC

\hfill

14

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<210> 6

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<211> 16

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido B que se asocia a la SEQ ID NO: 5 para obtener un DNA bicatenario que contiene secuencias de NdeI y Xho I

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGTTACA AGAACA

\hfill

16

Claims (15)

1. Un proceso para producir un péptido o un derivado peptídico usando bien sea: (a) un sistema de reacción para transcribir DNA en RNA y luego traducir el RNA producido o bien sea (b) un sistema de reacción para traducir RNA in vitro, caracterizado porque todos los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción están marcados con un marcador capaz de unirse selectivamente a un adsorbente y dicho adsorbente se usa para capturar dichos componentes proteínicos marcados después de la traducción del péptido o derivado peptídico, permitiendo así que el péptido o derivado peptídico producido sea separado de los componentes proteínicos marcados que constituyen el sistema de reacción.

2. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según la reivindicación 1, en el que sistema de reacción es un sistema de reacción procariótico.

3. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según la reivindicación 2, en el que dicho sistema de reacción procariótico es un sistema de reacción de Escherichia coli.

4. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en el proceso se usan varios números de combinaciones de marcador y adsorbente.

5. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: (a) el sistema de reacción para transcribir DNA en RNA y luego traducir el RNA producido o (b) el sistema de reacción para traducir RNA in vitro está exento de factores de terminación.

6. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un par de dicho marcador y dicho adsorbente pueden interactuar mutuamente en cromatografía de afinidad.

7. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según la reivindicación 6, en el que la combinación de dicho marcador y dicho adsorbente que pueden interactuar mutuamente en cromatografía de afinidad se selecciona entre combinaciones de sustancias que pueden formar un enlace entre un fragmento de una proteína o de un péptido y un ion metálico, un enlace entre un antígeno y un anticuerpo, un enlace entre una proteína y un fragmento de una proteína o de un péptido, un enlace entre una proteína y un compuesto específico de bajo peso molecular seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos, DNAs, colorantes, vitaminas y lectinas, un enlace entre una proteína y un sacárido, o un enlace entre un fragmento de una proteína o de un péptido y una resina de cambio iónico.

8. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según la reivindicación 7, en donde dicha combinación de sustancias que forman un enlace entre un fragmento de proteína o de un péptido y un ion metálico consiste en una cola de histidina y un complejo de níquel o un complejo de cobalto.

9. El proceso para producir un péptido o un derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un par de dicho marcador y adsorbente pueden adherirse magnéticamente uno al otro.

10. Un kit de componentes proteínicos para un sistema de reacción para producir un péptido o un derivado peptídico para transcribir bien sea (a) DNA en RNA y luego traducir el RNA producido o bien sea (b) traducir RNA en vitro, caracterizado porque el kit comprende los componentes proteínicos que constituyen el sistema de reacción y porque todos los componentes del kit están marcados con un marcador capaz de unirse selectivamente a un adsorbente.

11. El kit de componentes proteínicos según la reivindicación 10, en donde dicho sistema de reacción es un sistema de reacción procariótico.

12. El kit de componentes proteínicos según la reivindicación 11, en el que dicho sistema de reacción procariótico es un sistema de reacción de Escherichia coli.

13. El kit de componentes proteínicos según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el sistema de reacción está exento de factores de terminación.

14. El kit de componentes proteínicos según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que comprende un adsorbente para capturar los componentes proteínicos marcados.

15. El kit de componentes proteínicos según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que comprende un número variado de combinaciones o pares de marcador con dicho adsorbente para capturar los componentes proteínicos marcados.