ES2194029T5 - Variantes del virus HIV-2 - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Variantes del virus HIV-2
La presente invencion se refiere al HIV D205 (HIV, abreviatura de la expresion inglesa para 'Virus de la Inmunodeficiencia Humana'), una variante del virus HIV-2 que se puede clonar a partir del correspondiente aislado del virus HIV D205 (ECACC V 87122304).
Se cita el trabajo titulado "Molecular cloning of two West African human immunodeficiency virus type 2 isolates which replicate well on macrophages: a Gambian isolate from a case of neurologic acquired immunodeficiency syndrome, and a highly divergent Ghanesian isolate" (Kuhnel, H., v. Briesen, H., Dietrich, U., Adamski, M., Mix, D., Biesert, L. Kreutz, R., Immelmann, A., Henco, K., Meichsner, Ch., Andreesen, R., Gelderblom, H. & Rubsamen-Waigmann, H., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383-2387.)
Al hacer un diagnostico, se requieren dos criterios, principalmente especificidad y sensibilidad al antigeno que se ha de detectar. En el diagnostico del SIDA el requerimiento de especificidad ciertamente se puede conseguir usando los aislados HTLV-NIey LAV-2 (Guyader, M. et al., "Nature" 326, 1987, 662-669) para delimitar las infecciones por HIV de otras infecciones y, asf, hacer una asignacion aproximada a las clases "infecciones relacionadas con el HIV-2" o "infecciones relacionadas con el HIV-1". Sin embargo, la sensibilidad del diagnostico constituye un problema. En el intervalo de la denominada seroconversion, es decir, la aparicion de anticuerpos en la persona infectada, una reduccion en la sensibilidad implica un aumento en el numero de ensayos con resultados "falsamente negativos". De acuerdo con esto, un objetivo principal es acortar el penodo entre la infeccion y la deteccion de esta infeccion tanto como sea posible mejorando la sensibilidad del ensayo.
En la practica del diagnostico ELISA ampliamente usado, la menor reactividad cruzada, se manifiesta, por ejemplo, en una reduccion de la sensibilidad. Asf, el uso del aislado del HIV-1 descrito significa una reduccion media de la sensibilidad del ensayo frente a los sueros HIV-2 de un factor de 100 a 1.000, mientras que el aislado de HTLV- IIIb casi no permite que se realice ninguna deteccion mas.
Un terrible principio de las enfermedades causadas por el HIV reside en el hecho de que no hay solo un tipo de fenotipos y genotipos de cada uno de los virus HIV-1 y HIV-2. Lo que se ha de postular es que mas que un grupo grande de virus relacionados, existen posibles poblaciones uniformes que no estan estrictamente separadas de ninguna manera unas de otras pero que penetran continuamente unas en otras y experimentan un desarrollo evolutivo hasta una divergencia cada vez mayor, mientras que al mismo tiempo comienzan a intercambiar partes del genoma de unas a otras mediante sucesos de recombinacion. Asf, las especies de HIV existentes forman una amplia gama de poblacion continua en la que no hay subpoblaciones estrechamente delimitadas de una variante de virus. Preferiblemente se supone que existe un continuo que esta sometido a permanentes fluctuaciones con el tiempo.
Las variantes del virus clasificadas HIV-1 y HIV-2 son representativas de las subpoblaciones difusamente delimitadas que tienen un grado relativamente bajo de relacion, lo que se manifiesta en una reactividad cruzada solo parcial. Por otra parte, hay variantes del grupo HIV-1 (Rubsamen-Waigmann, H. et al., "AIDS-Forschung" IQ, 1987, 572-575; Rubsamen-Waigmann, H. et al., J. Med. Virol. 19, 1986, 335-344; v. Briesen, H. et al., J. Med. Virol. 23, 1987, 51-66), que reaccionan de manera cruzada mas significativamente con HIV-2 que con el propio aislado HIV-1 que se caracterizo primeramente (Hahn, B. et al., "Nature" 312, 1984, 166-169). Un producto comercial que consiste en tal aislado diagnostica de manera diferenciada mas sueros como HIV-2 positivos que lo hace el aislado estandar descrito HTLV-IIIb.
Un producto ideal de diagnostico o terapeutico debe contener al menos un representante de las poblaciones que sean biologicamente distintas de manera significativa unas de otras.
Los virus HIV-1 en multitud de mutantes geneticos altamente polimorfos pueden causar distintas enfermedades tales como ARC, LAS, SIDA y encefalopatfas (ARC: complejo relacionado con el SIDA, LAS: smdrome de linfadenopatfa, SIDA: smdrome de inmunodeficiencia adquirida). Las variantes del virus clonadas se distinguen en secuencia y modelo de restriccion, incluso si se han aislado al mismo tiempo, en el mismo lugar e incluso del mismo paciente (Rubsamen, H. et al., 1986). Se podna mostrar que las variantes del virus del tipo HIV-1 se distinguen hasta 15 % en algunos antfgenos del virus. Las del HIV-2 son diferentes hasta en mas del 40 % de los aminoacidos de algunos antfgenos, habiendose apreciado sustituciones, inserciones y deleciones (Guyader, M. et al., 1987; Rabson, A.B. y Martin, M.A. "Cell" 40, 1985, 447-480).
La presente invencion proporciona una variante del virus HIV-2. La variante HIV-2 D205 se aislo de un paciente clmicamente asintomatico. Se comprobo que el aislado del virus era un agente de diagnostico, en relacion con DNA/RNA asf como en relacion con los antfgenos del virus, para infecciones por el tipo HIV-2 que se identifican serologica y directamente en las etapas de pre-SIDA y SIDA.
El aislado del virus segun la invencion comprende virus y provirus, cuyas caractensticas son identicas a las del mapa de restriccion descrito y la secuencia de las regiones clonadas parciales (Figuras1-4). Ademas, el aislado del virus comprende variantes que se distinguen de los virus y provirus descritos anteriormente en que sus secuencias
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de nucleotidos son diferentes de las de los virus descritos anteriormente solo hasta 5 %, y preferiblemente en 2 %, particularmente preferido en 1 %.
La variante del virus segun la invencion puede causar linfadenopatfas (que mas adelante se denominan LAS/SIDA).
Una realizacion adicional preferida consiste en secuencias de DNA clonado capaces de hibridarse con RNA y DNA genomico de la variante del virus. Segun la invencion se reivindican sondas genicas estables que contienen tales secuencias de DNA que son adecuadas para la deteccion de la hibridacion de estas y otras variantes de HIV o virus relacionados o provirus de DNA en muestras que se han de examinar, mas particularmente muestras biologicas o semisinteticas.
Una realizacion adicional preferida de la invencion esta comprendida por la variante del virus de RNA/DNA o de sus fragmentos respectivos que se hibridaran con las variantes del virus segun la invencion en condiciones estrictas, mas particularmente DNAc, DNA genomico, DNA recombinante, DNA sintetico o sus fragmentos. Se entiende que se incluyen variantes o fragmentos que muestran deleciones e inserciones comparados con la variante del virus segun la invencion.
Por condiciones estrictas de hibridacion y lavado se pretende que se entiendan las condiciones que aseguran mediante experimentacion o calculo si el punto de fusion de los complejos de acidos nucleicos 100 % homologos en condiciones de hibridacion y lavado estan no mas de 5°C por debajo de las condiciones del tampon empleado.
Los fragmentos de DNA clonados descritos son adecuados para la hibridacion con acidos nucleicos complementarios (DNA/RNA) para la deteccion/diagnostico de las variantes del virus. Los ensayos de diagnostico segun la invencion se llevan a cabo usando sondas de DNA o RNA. Las sondas son radioactivas o se han marcado con grupos o enzimas fluorescentes bio- o quimioluminiscentes o son detectables de manera espedfica con enzimas por medio de sistemas de reaccion acoplados. Las hibridaciones se pueden efectuar en fase homogenea en disolucion o en fase heterogenea con acidos nucleicos inmovilizados en un solido; aunque el solido puede ser una membrana, partfcula, celula o tejido, la hibridacion tambien se puede efectuar in situ.
A partir del aislado del virus reivindicado segun la invencion, las secuencias de DNA correspondientes (Figura 1) se pueden clonar en bacterias E.coli estableciendo un banco genomico de genes lambda, a partir del DNA de los linfocitos infectados con el aislado del virus. Los clones deseados se obtienen llevando a cabo un escrutinio en placa con secuencias STLV-III de la gama gag-pol. De una manera mas espedfica, se puede usar como sonda un DNA derivado de la secuencia HIV-2 ROD publicada (Guyader, M. et al., "Nature" 326, 1987, 662-669), o una sonda de DNA derivada de las secuencias parciales del aislado HIV-2 D205 segun la invencion.
El metodo de diagnostico basado en el uso de los virus reivindicado segun la invencion comprende las siguientes etapas: Extraccion de RNA o DNA de muestras biologicas, posiblemente procesado enzimatico mediante enzimas de restriccion, separacion por electroforesis en gel y/o metodos de transferencia para portadores enlazados a acidos nucleicos, y posteriormente hibridacion con partes de los fragmentos clonados de los virus reivindicados. Las hibridaciones tambien se pueden llevar a cabo directamente en celulas o tejidos tratados qmmicamente. A ese respecto el origen de los tejidos o lfquidos es insignificante.
De manera espedfica, un procedimiento para la deteccion in vitro de anticuerpos frente a productos de expresion de los virus de la presente invencion se caracteriza porque los productos de expresion de los virus o partes de estos productos se detectan mediante metodos inmunologicos. El procedimiento se caracteriza porque los productos de expresion son protemas, peptidos o partes de ellos que han sido codificados dentro del significado de un marco de lectura abierto del DNA de las secuencias parciales provmcas como se caracteriza en la reivindicacion 1 y se preparan mediante procedimientos sinteticos o biosinteticos.
Ademas, el procedimiento se caracteriza porque previamente una cantidad definida o una combinacion de productos de expresion o partes de ellos se fijan en placas de microtitulacion, posteriormente se ponen en contacto muestras biologicas, diluidas o sin diluir con las placas de microtitulacion revestidas y despues de la incubacion y las etapas secuenciales de lavado se pueden identificar mediante un reactivo detector o de anticuerpos anti-HIV marcados.
Alternativamente, se usan tiras de filtro y tiras de plastico o varillas en vez de placas de microtitulacion, cuando los productos de expresion de los virus se han fijado en respectivas posiciones espedficas por aplicacion aislada de los distintos antfgenos.
Los segmentos de DNA descritos tambien se pueden emplear para expresar antfgenos codificados con fines terapeuticos y de diagnostico. En ese respecto los segmentos de dNa bajo el control intencionado de secuencias de regulacion se introducen en celulas diana procariotas o eucariotas, tejidos u organismos multicelulares para estimularles a producir los correspondientes antfgenos codificados, partes o combinaciones de los mismos con antfgenos extranos. Los antfgenos se pueden detectar mediante la reaccion con anticuerpos anti-HIV-2, mas particularmente a partir de los sueros de los respectivos pacientes. Los antfgenos que tienen marcos de lectura abiertos mas largos ( > 50 aminoacidos) se doblan sobre sf mismas asf como los que estan sometidos a procesos de corte y empalme a nivel de RNA y asf solo se componen para formar los marcos de lectura abiertos mas largos.
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Los polipeptidos que se originan a partir de la variante del virus clonada segun la invencion pueden ser usados para detectar tales antfgenos, en el material que se esta investigando, que contienen determinantes antigenicos similares y por tanto reaccionan de forma cruzada inmunologicamente. Esto es particularmente adecuado para el diagnostico en el SIDA y pre-SIDA de portadores del virus o portadores del virus asintomaticos o productos del virus, respectivamente, que se obtienen de la sangre. Tambien es posible la deteccion serologica de los anticuerpos dirigidos contra estos polipeptidos antigenicos como productos de expresion del virus reivindicados segun la invencion empleando sistemas convencionales tales como ELISA. Los polipeptidos inmunogenicos se pueden usar como polipeptidos protectores como vacunas para proteger contra infecciones por SIDA.
Los aislados del virus segun la invencion y los productos derivados de ellos se pueden combinar con otros aislados de la poblacion parcial HIV-2 en sistemas de ensayo, esto es, con los que son tan remotamente posibles en el nivel de poblacion descrito como por ejemplo, el aislado HIV-2 ROD (Guyader, M. et al., 1987). Asf, es posible detectar en un ensayo de forma sensible poblaciones remotamente relacionadas.
La variante del virus segun la invencion es muy diferente del espectro de variantes del HIV-1 y tiene una relacion molecular mas estrecha con los virus HIV-2 descritos por Guyader, aunque se distinguen de ellos de manera significativa (Figura 1). Tambien las propiedades biologicas se distinguen claramente de las del aislado de HIV-2 descrito. Asf, para la replicacion efectiva in vitro, la variante segun la invencion, prefiere celulas que son derivadas de lmeas mieloides. Por el contrario, el virus se reproduce mal en lmeas linfocfticas.
Se ha depositado segun el Tratado de Budapest una muestra del virus reivindicado segun la invencion en forma de aislado en European Collection of Animal Cell Cultures con la designacion HIV D205 (V 87122304).
La Figura 1 muestra los mapas de restriccion del aislado del virus segun la invencion comparados con secuencias de HIV conocidas.
La Figura 2 muestra las secuencias parciales de nucleotidos de HIV-D205 (que corresponden al clon HIV-2 A7.1 de la Figura 1)
La Figura 3 muestra la homologfa de secuencia del HIV-2 D205,7 comparada con el grupo HIV/SIV (a nivel de genes nt/aa).
La Figura 4 muestra una comparacion de las secuencias de nucleotidos del HIV-2 D205 con cadenas de HIV y SIV (en % de homologfa).
Los resultados experimentales y las caractensticas de HIV-D205 se describen en Kuhnel, H. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383-2387.
La secuencia de HIV-D205 muestra muchos de los denominados "marcos de lectura abiertos". La mayona de estos marcos de lectura se pueden relacionar con protemas/antfgenos expresados in vivo por comparacion de homologfas con virus HIV previamente descritos, por comparacion de transferencias Western realizadas con antfgenos de HIV- D205 derivados de celulas HUT78 o U937 infectadas y por sondeo con sueros de los correspondientes pacientes y sueros de referencia.
Otros marcos de lectura abiertos no se identifican a nivel de sus antfgenos expresados definidos por funcion o manchado del anticuerpo en una transferencia Western. Sin embargo, se pueden expresar en otras circunstancias in vivo. Otros marcos de lectura, incluso los cortos, se pueden expresar tambien de forma diffcil de predecir basandose solo en los datos de secuenciacion de acidos nucleicos debido a procesos de corte y empalme.
Los determinantes antigenicos de protemas expresadas que son importantes para la funcion biologica, para antfgenos diana en el diagnostico o para inmunizacion se extienden por toda la secuencia de la protema lineal expresada. Partes de estas secuencias pueden tener mas propiedades antigenicas generales que otras como se puede mostrar mediante la escrutinio/cartograffa de peptidos para sitios antigenicos. Estos sitios se pueden expresar como epitopos unicos o como polipeptidos continuos o en una version de antfgenos cortados y empalmados in vitro o sinteticamente. La antigenicidad de los productos expresados se puede demostrar mediante la fijacion de los antfgenos y la transferencia en el analisis de transferencia Western. Se pueden preparar construcciones para la expresion del antfgeno en E. coli usando tecnicas convencionales empleando genes sinteticos, fragmentos de restriccion de segmentos de genoma viral clonados, productos de recorte de ellos usando exonucleasa o DNasa I o empleando cebadores sinteticos espedficos de una secuencia que definen los deseados extremos 5' y 3' del fragmento que se ha de expresar junto con sitios de restriccion apropiados. Estos sitios de restriccion se pueden usar facilmente para ligacion en un panel de vectores de expresion de distintos organismos como los derivados de PLc24 (Remault et al. 1981 Gene 15, 81-83) con sitios de clonacion multiple (pEX).
Se mostro que los antfgenos expresados reaccionaban espedficamente con los sueros de los pacientes. El p27(24) de gag de HIV-D205 reaccionaba de forma muy sensible tanto con los sueros tfpicos HIV-1 como con los sueros tfpicos HIV-2 (vease Kuhnel et al.)

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un aislado del virus HIV-2 D205 (ECACC V 87122304), que tiene preferencia por celulas que se derivan de celulas mieloides para la replicacion in vitro.
  2. 2. RNA vmco que se diferencia de la secuencia de nucleotidos de los aislados del virus segun la reivindicacion 1, en 5 hasta 5 %.
  3. 3. RNA segun la reivindicacion 2, en donde el RNA esta presente como hforido con cadenas complementarias de RNA marcadas.
  4. 4. Un procedimiento para la deteccion de acidos nucleicos relacionados con HIV (DNA y RNA) en muestras biologicas, celulas y en forma aislada usando los acidos nucleicos segun las reivindicaciones 2 o 3.
    10 5. Celulas aisladas que se han transformado con acidos nucleicos segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 o
  5. 3.
  6. 6. Celulas aisladas que se han infectado con el aislado del virus segun la reivindicacion 1.
ES95100149.4T 1988-06-14 1989-06-13 Variantes del virus HIV-2 Expired - Lifetime ES2194029T5 (es)

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