ES2197147T3 - Inhibicion del crecimiento de celulas tumorales mediante la administracion de celulas transfectadas b7. - Google Patents
Inhibicion del crecimiento de celulas tumorales mediante la administracion de celulas transfectadas b7.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE LAS CELULAS DE TUMORES. LAS CELULAS DE LOS TUMORES DE UN PACIENTE SE MODIFICAN RECOMBINANTEMENTE MEDIANTE TECNICAS DE INGENIERIA, PARA QUE EXPRESEN LA PROTEINA SUPERFICIAL B7 Y A CONTINUACION SE VUELVEN A ADMINISTRAR ESTAS CELULAS AL PACIENTE. LA PRESENCIA DE LA MOLECULA B7 EN LA SUPERFICIE DE LAS CELULAS DE TUMORES ESTIMULA UNA AMPLIA RESPUESTA INMUNOLOGICA TANTO CONTRA LAS CELULAS DE TUMORES B7-TRANSFECTADAS COMO CONTRA LAS NO TRANSFECTADAS Y DA COMO RESULTADO LA MATANZA INMUNOLOGICA DE CELULAS DE TUMORES LOCALIZADAS Y METASTATICAS. LA TRANSFECCION B7 DE LAS CELULAS DE TUMORES, O DE LAS MEMBRANAS DE LAS CELULAS, SIRVE COMO ESTIMULANTE PARA PRODUCIR UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA POTENTE CONTRA LOS ANTIGENOS SUPERFICIALES PRESENTES EN LAS CELULAS DE TUMORES.
Description
Inhibición del crecimiento de células tumorales
mediante la administración de células tranfectadas B7.
Un antiguo objetivo de la investigación en cáncer
ha sido estimular el rechazo inmunológico de los tumores. Este
objetivo se basa en la hipótesis de que los tumores expresan
antígenos extraños que pueden potencialmente servir de dianas del
sistema inmunitario (Himmelweit (1957) The Collected Papers of
Paul Ehrlich, Pergamon Press, Oxford, Inglaterra). Aún se
polemiza sobre en qué medida los tumores espontáneos expresan
antígenos que pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario como
extraños en los experimentos convencionales de inmunización y
provocación (Hewitt et al. (1976) Br. J. Cancer,
33: 241-259); no obstante, está bien
documentado que muchos tumores experimentales expresan antígenos
que pueden mediar el rechazo del tumor en esos experimentos
(Hellström y Hellström (1991) Principles of Tumor Immunity: Tumor
Antigens, en: The Biologic Therapy of Cancer. DeVita, Jr.
et al., eds., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, pág.
35-52; Boon (1992) Adv. Cancer Res.
58: 177-211).
La inmunidad celular, mediada principalmente por
los linfocitos T, desempeña un papel clave en el rechazo de los
tumores antigénicos. Están involucrados los linfocitos T auxiliares
(Th: T helpers) y los linfocitos T citotóxicos (CTL: cytolytic T
lymphocytes) (Melief (1992) Adv. Cancer Res.
58:143-175; Greenberg (1991) Adv.
Immunol. 49:281-355). El reconocimiento
y la destrucción de las dianas inmunológicos requieren que los
linfocitos T reconozcan, mediante su receptor (TCR:
T-cell receptor), los péptidos antigénicos
presentados en el contexto de las moléculas del complejo principal
de histocompatibilidad (MHC: major histocompatibility complex)
(Bjorkman et al. (1988) Nature
329:512-518; Unanue (1984) Annu. Rev.
Immunol. 2:395; Townsend et al. (1986) Cell
44:959-968). En algunos animales y en los
seres humanos se ha detectado inmunidad mediada por los linfocitos
T contra antígenos tumorales específicos (van der Bruggen et al.
(1991) Science 254:1643-1647; van den
Eynde et al. (1991) J. Exp. Med.
173:1373-1384; Anichini et al., (1987)
Immunol. Today 8:385-389); sin
embargo, estos tumores ``inmunógenos'' por lo general crecen
progresivamente y con el tiempo matan a sus anfitriones.
Hay varias razones por las cuales incluso esos
tumores que expresan antígenos de rechazo pueden evadir la
destrucción inmunitaria. Entre ellas, la falta de un procesamiento
y una presentación adecuados de los antígenos a los linfocitos por
parte de estos tumores debido a sus niveles bajos de expresión de
los genes de clase I del MHC (Elliot et al. (1989) Adv. Cancer
Res. 53:181-244). Este problema se
podría soslayar por transfección de genes de clase I del MHC (Hui et
al. (1984) Nature 311:750-752, Tanaka
et al. (1984) Science 228:26-30;
Wallich et al. (1985) Nature
315:301-305) o con ADN del
interferón-\gamma que mejora el procesamiento
antigénico (Restifo et al. (1992) J. Exp. Med.
175:1423-1431). La falta de una respuesta
inmunitaria antitumoral eficaz en animales que padecen un tumor
también puede obedecer a una deficiencia de las funciones de los
linfocitos T auxiliares necesarias para la expansión clonal de los
CTL (Fearon et al. (1990) Cell
60:397-403) y para la activación de los
macrófagos y otras células inflamatorias que pueden causar la
destrucción del tumor. La transfección de células tumorales con ADNc
que codifica la interleucina-2
(IL-2) ó la interleucina-4
(IL-4) da como resultado la secreción paracrina de
linfocinas IL-2 que reponen la cooperación de los
linfocitos T, inducen los CTL específicos del tumor y producen el
rechazo del tumor (Fearon et al. (1990) Cell
60:397-403; Gansbacher et al. (1990) J.
Exp. Med. 172:1217-1224; Ley et al.
(1991) Eur. J. Immunol. 21:851-854;
Golumbek et al. (1991) Science
254:713-716). De forma similar, la
transfección de tumores con ADNc que codifica la
IL-4 también puede producir el rechazo del tumor
(Tepper et al. (1989) Cell 57:503-512)
y la generación de inmunidad tumoral mediada por los linfocitos T
(Golumbek et al. (1991) Science
254:713-716).
Otro mecanismo que puede contribuir a la
inducción de linfocitos T reactivos al tumor eficaces está
relacionado con el modelo de dos señales para la activación de las
células inmunitarias. Este modelo fue propuesto originalmente para
los linfocitos B (Bretscher and Cohn (1970) Science
169:1042-1049) para explicar la razón por la
cual los antígenos expresados en células que no tienen un origen
hematopoyético son ineficaces para inducir un rechazo a los
transplantes (Lafferty et al. (1983) Ann. Rev. Immunol.
1:143). En la actualidad, los modelos de dos señales se han
extendido a todos los linfocitos (Janeway (1989) Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-13; Nossal
(1989) Science 245:147-153; Schwartz
(1989) Cell 57:1073-1081). Estos
modelos postulan que, para realizar una activación óptima, los
linfocitos requieren una señal específica del antígeno enviada a
través del receptor del antígeno y una segunda señal inespecífica
del antígeno o señal coestimuladora. Las vías de la coestimulación
de los linfocitos T determinan si el acoplamiento del complejo TCR
da como resultado una activación o inactivación de las células
inmunitarias (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol.
7:445; Schwartz (1989) Cell
57:1073-1081); y la presentación del
antígeno en ausencia de la coestimulación de los linfocitos T da
lugar a la inactivación funcional o anergia clonal o incluso a la
muerte celular (Schwartz (1989) Cell
57:1073-1081).
Las bases moleculares de la coestimulación de los
linfocitos T es poco conocida, pero es posible que estén
involucradas varias moléculas de las células presentadoras de
antígenos (APC: antigen presenting cells) que son reconocidas por
los receptores de superficie de los linfocitos T (van Seventer et
al. (1991) Curr. Opinion Immunol.
3:294-303). Una molécula coestimuladora
importante es la B7 que se expresa en los linfocitos B activados
(Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714) y otras
APC (Freeman et al., 1989; Razi-Wolf et al. (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4210-4214). La B7 se une a los receptores
CD28 (Linsley et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:5031-5035) y CTLA-4
(Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
173:721-730) de los linfocitos T y coestimula
la proliferación de los linfocitos T CD4^{+} humanos y murinos
(Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
174:561-569; Gimmi et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:6575- 6579; Kuolova et al. (1991)
J. Exp. Med. 173:759-762; Damle et al.
(1992) J. Immunol. 132:1985-1992).
Los experimentos in vitro indican que las señales
transducidas por el receptor CD28 (June et al. (1990) Immunol.
Today 11:211-216) pueden determinar si la
ocupación de los TCR da como resultado la respuesta inmunitaria o la
anergia clonal (Jenkins et al. (1991) J. Immunol.
147:2461-2466; Harding et al. (1992)
Nature 356:607-609). Los experimentos
in vivo indican que el bloqueo de la coestimulación de las
moléculas B7 puede suprimir con eficacia las respuestas humorales
(Linsley et al. (1992) Science
257:792-795) y hacer posible la aceptación
duradera de los xenoinjertos (Lenschow et al. (1992) Science
257:792-795).
La molécula B7 se expresa principalmente en las
células hematopoyéticas (Freeman et al. (1989) J. Immunol
143:2714), y está presente sólo en concentraciones muy bajas
o casi nulas en muchas líneas celulares de tumores humanos. Estos
datos permiten suponer que una de las razones por las cuales con
frecuencia los tumores inmunógenos escapan a la destrucción de los
linfocitos T es que carecen de moléculas coestimuladoras adecuadas.
Una predicción derivada de esta hipótesis es que la introducción de
moléculas coestimuladoras en los tumores que poseen antígenos de
rechazo tumoral mejoraría su potencia inductora de una inmunidad
antitumoral específica que dé lugar a la erradicación del tumor en
huéspedes inmunocompetentes. Esta hipótesis se puso a prueba usando
un modelo murino para tumores que expresan antígenos de ``rechazo''
pero que, a pesar de ello, crecen progresivamente en sus
anfitriones. En este modelo, se transfectó el gen E7 del
papilomavirus humano-16 (HPV-16:
human papillomavirus-16) en el melanoma poco
inmunógeno K1735-M2 (Fidler and Hart (1981)
Cancer Res. 41:3266-3267). Se eligió
un transfectante tumorígeno E7C3 contra el cual es posible generar
inmunidad tumoral, mediada por el linfocito T CD8^{+} y específica
del gen E7 del HPV-16, por inmunización de ratones
singénicos C3H/HeN con fibroblastos que expresan E7 (Chen et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:110-114; Chen et al. (1992) J.
Immunol 148:2617-2621). La presente
invención demuestra que la transfección de células tumorales E7C3
con la molécula coestimuladora B7 induce inmunidad antitumoral
contra los tumores E7^{+}.
La presente invención está dirigida a una
composición y un método nuevos para inhibir con eficacia el
crecimiento de células tumorales. En este método se extraen células
del tumor y luego se las transfecta con ADN que codifica una porción
inmunógena del ligando B7 de los linfocitos B. Las células tumorales
transfectadas expresan B7 en su superficie y entonces se las vuelve
a inyectar al paciente. Las células tumorales transfectadas con B7
provocan eficazmente una respuesta inmunitaria que se dirige contra
las células tumorales transfectadas y sin transfectar. De modo que
el método de la presente invención estimula una respuesta
inmunitaria contra las células tumorales originales y sus
metástasis. La presencia de B7 sobre las células transfectadas
sirve como un catalizador o estimulante inesperado de esta mayor
respuesta. Este método brinda la posibilidad de tratar el cáncer
metastásico diseminado mediante la extracción de algunas células de
los focos, la transfección o transducción de estas células para que
expresen B7, y luego la readministración de las células
transfectadas al paciente para estimular una respuesta inmunitaria
específica y amplia contra las células tumorales diseminadas. En
esta invención también se contempla una composición farmacéutica que
contenga las células tumorales recombinantes que se han transfectado
para expresar B7 o las membranas de estas células que expresan
B7.
La presente invención también comprende un método
para inmunizar un paciente contra células tumorales específicas,
mediante la administración al paciente de membranas de células
tumorales transfectadas con B7, para producir una respuesta
inmunitaria capaz de inducir una respuesta de rechazo o citólisis al
exponerse luego a las células tumorales.
En las figuras:
La Figura 1 ilustra la expresión de B7 en líneas
celulares transfectadas. Las células se tiñeron con CTLA4Ig (líneas
continuas) o con el anticuerpo monoclonal (mAb: monoclonal antibody)
L6 quimérico (líneas punteadas) seguido de suero Ig C\gamma de
cabra antihumano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC:
fluorescein isothiocyanate) de control, según lo descrito en
Procedimientos experimentales. Se analizó un total de 5.000 células
para cada muestra. La parte A muestra las células E7C3 y sus
transfectantes B7, y la parte B muestra las células
K1735-M2 y sus transfectantes B7.
La Figura 2 ilustra el rechazo de los tumores
inducidos por las células E7C3 B7^{+} por parte de ratones
inmunocompetentes singénicos.
- (A)
- Fotografía de tumores inducidos por células E7C3 B7^{-} y B7^{+}. Los ratones C3H/HeN recibieron por inyección subcutánea 5 x 10^{6} células E7C3 (tres ratones de la izquierda) o células PB7^{+} (tres ratones de la derecha). La fotografía se sacó 21 días después de la inyección de las células tumorales.
- (B)
- Cinética del crecimiento de los tumores inducidos por células E7C3 B7^{-} y B7^{+}. Los ratones C3H/HeN recibieron por inyección subcutánea las células indicadas (5 x 10^{6}). Los tamaños de los tumores se evaluaban semanalmente midiendo los diámetros perpendiculares con un calibre. Los resultados se expresan como diámetros medios de los tumores, en milímetros, para grupos de cinco ratones cada uno. Las barras de error representan la desviación típica de la media. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos como mínimo para cada línea celular.
La Figura 3 ilustra la histología de los tumores
inducidos por las células E7C3 B7^{-} y B7^{+}. Los ratones
C3H/HeN recibieron por inyección subcutánea células PB7^{-}
(parte A) o células PB7^{+} (partes B-D). Diez
días después de la inyección se escindieron los tumores y se
prepararon para el análisis histológico. (A) Tumor inducido por
células PB7^{-}. Obsérvese la presencia de nódulos tumorales sin
cápsula que se extienden dentro de la dermis superficial. Se puede
observar la necrosis localizada de las células neoplásicas (aumento
66x). (B) Tumor inducido por células PB7^{+}. Obsérvese la
presencia de un área central amplia de necrosis tumoral y la
infiltración de células inflamatorias entre las células tumorales
(aumento 66x). (C) Aumento mayor de (B). Obsérvense la infiltración
prominente de células inflamatorias (aumento 660x). (D) Aumento
mayor de (B). Las células tumorales varían de tamaño y forma, y
tienen un citoplasma eosinófilo pálido con bordes celulares
indiferenciados. Se ven los linfocitos y los macrófilos (aumento
1.350x).
La Figura 4 ilustra el bloqueo del rechazo de las
células E7C3 B7^{+} por la CTLA4Ig. Los ratones C3H/HeN recibieron
por inyección subcutánea sobre el lomo 5 x 10^{6} células BC22 que
se habían mezclado previamente con 50 \mug de CTLA4Ig. El
tratamiento con CTLA4Ig continuó durante dos semanas en total por
inyección intravenosa cada dos días (50 \mug por tratamiento). Se
usaron como controles ratones tratados con solución salina
equilibrada de Hank (HBSS: Hank's balanced salt solution) o
mAb L6 (ChiL6) quimérico. Se hizo un seguimiento del crecimiento del
tumor según se describió la Figura 2. Este experimento se repitió y
los resultados fueron similares.
La Figura 5 ilustra la mediación del rechazo de
los tumores E7C3 B7^{+} por parte de los linfocitos T CD8^{+}.
Los ratones C3H/HeN recibieron dos veces inyecciones intravenosas a
intervalos semanales de los anticuerpos purificados
anti-CD4 ó anti-CD8 a razón de 1
mg/ratón. Se inyectó como control la misma cantidad de anticuerpo
anti-humano CD5 10.2. Luego se inocularon células
BC16 a los ratones por inyección subcutánea y se evaluó el
crecimiento tumoral según lo descrito en la Figura 2. Se obtuvieron
resultados similares en otro experimento.
La Figura 6 ilustra la generación de CTL a partir
de ratones inoculados con células E7C3 B7^{+}.
- (A)
- Generación de CTL que lisan objetivos que expresan el gen E7 del MHC clase I de forma restringida. Ratones C3H/HeN recibieron por inyección subcutánea células BC16 (5 x 10^{6}). Se extrajeron los bazos de los ratones sin tumor y se cocultivaron los esplenocitos con células 16N7 tratadas con radiación \gamma y se midió la actividad de los CTL contra células objetivo marcadas con ^{51}Cr según lo descrito en Procedimientos experimentales. Este y otros experimentos de citotoxicidad se repitieron 3-5 veces y se obtuvieron resultados similares.
- (B)
- La actividad citotóxica es mediada por los linfocitos T CD8^{+}. Células efectoras generadas a partir de ratones inoculados con células BC22 recibieron tratamiento previo a 37ºC durante 1 hora con anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 o anti-asialoGM1 en presencia del complemento, y se lavaron dos veces antes de incubar con células 16N7 marcadas con ^{51}Cr con diferentes relaciones de efectoras:objetivo (E:T = effector-to-target).
- (C)
- Actividad de los CTL en ratones inyectados con diferentes tumores. Los ratones C3H/HeN recibieron por inyección subcutánea células K1735-M2, E7C3, BC16 o E7C3 irradiadas (10.000 rad). Cuatro semanas más tarde, se prepararon los esplenocitos de los ratones y se cocultivaron in vitro con células 16N7 tratadas con radiación \gamma durante 6 días. Se midió la actividad citotóxica contra las células 16N7 marcadas con ^{51}Cr según lo descrito en Procedimientos experimentales.
La Figura 7 ilustra la inmunidad inducida por las
células E7C3 B7^{+} contra los tumores E7C3 B7^{-} de una
localización distante. Ratones C3H/HeN recibieron HBSS, células
E7C3 o BC22 (5 x 10^{6}) por inyección subcutánea en sus flancos
izquierdos. Inmediatamente después se aplicó a los ratones una
inyección subcutánea de provocación en el flanco derecho con células
E7C3 (parte superior) o E6B2 (parte inferior) (5 x 10^{6}
células). Se midió el crecimiento de los tumores del flanco derecho
según lo descrito en la Figura 2. Cuatro de los cinco animales
inyectados con células BC22 rechazaron totalmente los tumores E7C3;
mientras que se observó crecimiento progresivo del tumor E7C3 en el
resto de los grupos. Se volvió a repetir este experimento y se
obtuvieron resultados similares.
La Figura 8 ilustra la inmunidad inducida por las
células E7C3 B7^{+} contra tumores metastásicos establecidos.
Ratones C3H/HeN (10 por grupo) recibieron 1 x 10^{5} células E7C3
(A), E6B2 (B) o K1735-M2 (C) por inyección
intravenosa. Cuatro días más tarde, se trataron los ratones con
células BC16 (1 x 10^{6}) por inyección intravenosa. Luego se
repitió el tratamiento dos veces más a intervalos de cinco días. Se
hizo un seguimiento de la supervivencia de los animales con
tumores. La supervivencia de los animales sin tumores E7C3 no
resultó afectada por el tratamiento con células BC16.
La presente invención está orientada a un método
para tratar e inhibir el crecimiento de un tumor mediante la
administración de células tumorales transfectadas con ADN que
codifica la proteína B7 presente en los linfocitos B. Esta
transfección estimula al sistema inmunitario a preparar una
respuesta contra las células tumorales, tanto contra las que están
transfectadas con B7 como contra las que no lo están.
Hemos demostrado que la transfección de la
molécula B7 coestimulante de los linfocitos T en células tumorales
murinas que expresan el marco de lectura abierto del gen E7 del
HPV-16 provocó que estas fueran rechazadas cuando se
transplantaron en anfitriones singénicos inmunocompetentes. El
rechazo requirió la expresión de E7 y B7, y fue mediada por los
linfocitos T, puesto que las células tumorales B7^{+} y B7^{-}
crecieron igualmente bien en ratones atímicos. La respuesta
inmunitaria que causó el rechazo fue dependiente de B7, puesto que
el tratamiento de los ratones con CTLA4Ig, un receptor soluble con
gran afinidad por B7, bloqueó el rechazo de las células tumorales
B7^{+}E7^{+} (Figura 4). El rechazo de los tumores B7^{+} dio
lugar también al rechazo de las células tumorales B7^{-}E7^{+}
de localizaciones distantes.
Hay muchos indicios que permiten suponer que B7
puede coestimular la activación de los linfocitos T in vitro
(Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
174:561-569; Gimmi et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579;
Kuolova et al. (1991) J. Exp. Med.
173:759-762; Damle et al. (1992) J.
Immunol. 148:1985-1992. En la presente
invención se ampliaron estas observaciones demostrando directamente
el papel de B7 en la estimulación de la activación de los
linfocitos T in vivo y en la regulación de la inmunidad
tumoral. Por consiguiente, esta información apoya el modelo de las
``dos señales'' para la activación linfocítica. De acuerdo con este
modelo, el antígeno del tumor E7 transfectado, cuando es presentado
por las moléculas del MHC clase I, proporciona la ``señal uno''
específica del antígeno que activa el complejo TCR de los linfocitos
T reactivos. El B7 expresado sobre las células tumorales brinda la
``señal dos'' inespecífica del antígeno al unirse a los receptores
CD28 y CTLA-4 sobre los linfocitos T, coestimulando
así la respuesta inmunitaria a los tumores E7^{+}.
Se ha comprobado adecuadamente que los
anticuerpos monoclonales (mAb: monoclonal antibodies)
anti-CD28 pueden estimular la producción de varias
linfocinas durante la activación de los linfocitos T (June et al.
(1990) Immunol. Today 11:211-216), y
más recientemente se ha comprobado que el acoplamiento de los CD28
con su receptor opuesto, el B7, estimula la producción de
IL-2 por parte de los linfocitos T (Linsley et al.
(1991) Exp. Med. 174:561-569; Gimmi
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:6575-6579). En conjunto estos estudios
permiten suponer que el CD28 funciona como un regulador importante
de la producción de linfocinas de los linfocitos T. En la actualidad
se desconoce si el CTLA-4 tiene una función
similar. Los resultados de los experimentos que implican la
transfección de genes de linfocinas en los tumores (Tepper et al.
(1989) Cell 57:503-512; Fearon et al.
(1990) Cell 60:397-403; Gansbacher et
al. (1990) Cancer Res. 50:7820-7825;
Gansbacher et al. (1990) J. Exp. Med.
172:1217-1224; Ley et al. (1991) Eur. J.
Immunol. 21:851-854; Golumbek et al.
(1991) Science 254:713-716) sugieren
que los linfocitos reactivos a los tumores están presentes algunas
veces en los animales con tumores, pero son incapaces de causar el
rechazo debido a una disponibilidad insuficiente de linfocinas
provenientes de los linfocitos T. El presente estudio indica que la
falta de activación de los receptores CD28 puede ser un factor que
contribuye a una producción deficiente de linfocinas por parte de
los linfocitos T en los animales que padecen tumores.
La inmunidad antitumoral fue anulada in
vivo e in vitro por los mAb anti-CD8,
pero no por los anti-CD4, y se generaron fácilmente
CTL CD8^{+} a partir de ratones que habían rechazado tumores
B7^{+}E7^{+}. Los CTL CD8^{+} también son responsables del
rechazo de los tumores B7^{-}E7^{+} (Chen et al. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114;
Chen et al. (1992) J. Immunol.
148:2617-2621) en los experimentos de
inmunización y provocación. El rechazo de los tumores in
vivo y la citólisis in vitro no requirió la expresión del
B7 en las células objetivo (Figuras 6 y 7), lo cual indica que los
efectos de B7 sobre la fase efectora de la citólisis (Azuma et al.,
(1992) J. Exp. Med. 175:353-360) no
pudieron explicar los resultados. Es más probable que el papel del
B7 en estos experimentos haya sido más bien el de desencadenar
directamente la producción de citocinas y la expansión de los CTL
CD8^{+}. Los linfocitos Th CD4^{+} no parecieron desempeñar un
papel importante en la generación de estos CTL, puesto que la
disminución in vivo de > 95% de linfocitos T CD4^{+} no
bloqueó el rechazo al tumor (Figura 5). Estudios recientes han
demostrado que B7 estimula la producción de citocinas y la
expansión clonal de los linfocitos T CD8^{+} que expresan un TCR
transgénico específico anti-antígeno masculino
(H-Y) en ausencia de linfocitos T CD4^{+}, y
también hay indicios de que la activación del CD28 usando mAb
específicos induce la actividad de los CTL (Jung et al. (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4611; Nijuis et al. (1990)
Cancer Immunol. Immunother.
32:245-250. La estimulación de la liberación
de linfocinas por activación del CD28 puede haber contribuido
también al rechazo del tumor, por una regulación que determina un
aumento de la expresión de las moléculas del MHC clase I en las
células tumorales in vivo, o por proliferación de células
inflamatorias (Figura 3) que contribuyen a la destrucción del
tumor.
El bloqueo de las interacciones de los receptores
CD28 y CTLA-4 con el B7 in vivo puede dar
lugar a una tolerancia prolongada de un injerto que es específica
del donante (Lenschow et al. (1992) Science,
257:789-792), lo cual indica que el bloqueo
de la coestimulación del receptor CD28 en presencia continua de
antígenos extraños da lugar a la inactividad de los linfocitos T.
Los antígenos tumorales y los complejos inmunitarios en circulación
intervienen en la evasión del tumor al rechazo inmunológico
(Hellström y Hellsöm (1991) Principles of Tumor Immunity: Tumor
Antigens. En: The Biologic Therapy of Cancer. DeVita, Jr.
et al. eds., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, págs.
35-52); por consiguiente, es tentador especular que
la estimulación continua del TCR por antígenos extraños, que se
presentan en los tumores o se liberan desde estos, en ausencia de
una coestimulación adecuada por moléculas tales como B7 suprimen la
inmunidad antitumoral.
El fracaso al inducir una respuesta de rechazo
por parte de muchos tumores en los experimentos de inmunización y
provocación se ha interpretado como una prueba de que estos tumores
no expresan los determinantes de antígenos extraños (Hewitt et al.
(1976) Br. J. Cancer 33:241-259). Es
posible que la falta de inducción de una respuesta inmunitaria por
parte de los tumores no se deba a que carezcan de los determinantes
antígenos extraños, sino a que no envíen o no produzcan las señales
coestimulantes de los linfocitos T. Tumores de ese tipo pueden no
expresar las moléculas coestimulantes de T de la forma apropiada
como para que estimulen directamente el aumento de los linfocitos T
CD8^{+} que reconocen los antígenos tumorales procesados
internamente. Como alternativa, es posible que las APC B7^{+} no
presenten las cantidades adecuadas de péptidos antigénicos como
para producir una respuesta de los linfocitos T CD4^{+}. En otras
palabras, los tumores pueden no ser inmunógenos debido a la falta de
la ``señal uno'' o de la ``señal dos''.
Las células K1735-M2 no
inmunógenas no fueron rechazadas incluso después de la transfección
con B7, de modo que el método usado aquí no supera la falta de
inmunogenicidad de ciertos tumores. Sin embargo, también es posible
que se requirieran otras moléculas, aparte de la B7, para obtener
una coestimulación óptima de los linfocitos T in vitro (van
Seventer et al. (1991) Curr. Opinion Immunol.
3:294-303). Actualmente se ignora si
moléculas tales como ICAM-1, LFA-3,
VCAM-1 (van Seventer et al. (1991) Curr. Opinion
Immunol. 3:294-303) o el antígeno
termoestable (Liu, Y. et al. (1992) Eur. J. Immunol.,
22:2855-2859) son capaces de estimular la
inmunidad antitumoral. El método experimental presentado aquí da a
entender la posibilidad de que es posible inducir el rechazo de los
tumores ``no inmunógenos'' como el K1735-M2
transfectándolos con moléculas coestimuladoras diferentes de la B7 o
además de la B7.
Por último, estos datos indican que la respuesta
inmunitaria antitumoral en los pacientes cancerosos podría
aumentarse mediante la estimulación in vivo del receptor
CD28. Es posible ejercer una regulación para aumentar la expresión
de B7 (o dirigir el B7 a la superficie celular del tumor) in
vivo sobre los tumores o sobre las APC que presentan péptidos
potencialmente antigénicos de células tumorales. También es posible
transferir B7 dentro de células tumorales in vitro, y
expandir las poblaciones de linfocitos reactivos al tumor exponiendo
los linfocitos del paciente a sus células tumorales B7^{+} para su
infusión in vivo. Un objetivo a largo plazo sería generar
inmunidad sistémica a un antígeno tumoral introduciendo B7
directamente dentro de las células tumorales in vivo. Las
células tumorales B7^{+}E7^{+} estimularon inmunidad a tumores
B7^{-}E7^{+} de localizaciones distantes (Figura 7); por tanto,
la generación de una respuesta de rechazo beneficiosa desde el punto
de vista terapéutico sólo puede requerir la introducción de B7 en
algunas células tumorales in vivo.
Habiendo descrito en líneas generales esta
invención, se puede lograr una mayor comprensión haciendo referencia
a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan sólo con fines
ilustrativos y no tienen la intención de ser restrictivos a no ser
que se especifique lo contrario.
Con el objeto de llevar a cabo los estudios
ilustrados en los ejemplos descritos en este documento, se
utilizaron los siguientes procedimientos experimentales.
Se compraron a Charles River Breeding
Laboratories (Wilmington, Massachusetts, EE.UU.) ratones
hembra
\breakC3H/HeN de 6-8 semanas. Se compraron a Harlan Sprague Dawley Co. (Indianápolis, Indianápolis, EE.UU.) ratones hembra BALB/c (nu/nu) de 4-8 semanas.
Las células K1735-M2 provenían de
ratones C3H/Hen (H-2^{k}) (Fidler and Hart, 1981).
E7C3 y E6B2 son transfectantes K1735-M2 que expresan
el gen E7 ó E6 del HPV-16 (Chen, et al. (1992) J.
Immunol. 148:2617-2621). Las líneas
p2555 y 16N7 se derivan de un fibrosarcoma NCTC2555
(H-2^{k}) (American Type Culture Collection,
Rockville, MD) y se transfundieron con retrovirus parental pLXSN o
retrovirus que contenían el gen E7 del HPV-16,
respectivamente (Chen et al. (1992) J. Immunol.
148:2617-2621). El p815E7 es un mastocitoma
derivado de DBA/2 (H-2^{d}) (ATCC) transducido con
E7 del HPV-16 retroviral (Halbert et al. (1991)
J. Virol. 65:4417). Todas las células se mantuvieron a
37ºC en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM: Dulbecco's
modified Eagle's medium) que contenía un 10% de suero fetal bovino
(Sterile System HyClone, Logan, UT).
Un fragmento de ADN que codifica el murina B7
(Freeman et al. (1991) J. Immunol
143:2714-2722) se amplificó por la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction) según
lo descrito anteriormente (Liu et al. (1992) Eur. J. Immunol.
En prensa) y se clonó en un vector plásmido con expresión pLN
(proporcionado amablemente por A. Aruffo del
Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research
Institute, Seattle, Washington, EE.UU.). La construcción genética de
expresión resultante (pmurB7) se cotransfectó dentro de células E7C3
con un mutante expresible que contiene ADNc de dihidrofolato
reductasa (DHFR) (D^{R}/pic, un obsequio de S. Yarnold y P. Fell,
Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research
Institute, Seattle, Washington, EE.UU.) usando un reactivo para
lipofecciones (Gibco BRL, Grand Island, Nueva York, EE.UU.). Los
transfectantes se eligieron en DMEM más 10% de suero fetal bovino
(FBS: fetal bovine serum) que contiene 0,33 \muM de metotrexato
(MTX). Se recogieron colonias individuales resistentes al MTX y se
analizó su expresión de B7 por unión a la CTLA-4Ig
(Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
174:561-569). Las colonias agrupadas (\sim
25) también se separaron en poblaciones B7 positivas (PB7^{+}) y
B7 negativas (PB7^{-}) mediante dos ciclos de clasificación por
citometría de flujo. Las células K1735-M2 también
se cotransfectaron con pmurB7 y PCMIpola (Stratagene, La Jolla,
California, EE.UU.) y se eligieron en DMEM con un 10% de FBS que
contenía 1 mg/ml de G418 (Gibco, Grand Island, Nueva York,
EE.UU.).
Se compraron hibridomas a ATCC que produjeron mAb
GK1.5 de murina anti-CD4 de ratón (L3T4), mAb
116-13.1 murino anti-CD8 de ratón
(Lyt2.1) y mAb 15-3-1S con
anti-H-2K^{k}D^{k} murino. Se
usó como control el mAb 10.2 murino anti-CD5 humano
(Chen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:110-114). Se inyectaron los hibridomas por
vía intraperitoneal a ratones atímicos tratados con pristano y se
purificaron las ascitis por cromatografía de afinidad sobre
proteína A acoplada a Sepharosa CL-4B (Pharmacia
Fine Chemicals, Piscataway, Nueva Jersey, EE.UU.). Se compraron
sueros anti-asialoGMI de conejo a Wako Chemicals USA
Inc. (Richmond, Virginia, EE.UU.). La CTLA-4Ig, una
proteína soluble de fusión entre el dominio extracelular del
CTLA-4 humano y una cadena de Ig C\gamma humana
(Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
174:561-569) se ha descrito anteriormente.
Se preparó Ig purificada de mAb L6 quimérico
humano-murino (con porción C\gamma1 Fc humana)
según lo descrito (Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:3439-3443).
Los métodos de inmunotinción de la expresión B7
ya han sido descritos (Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
174:561-569). Brevemente, en primer lugar
las células transfectadas se incubaron con L6 quimérico o
CTLA-4Ig a razón de 10 \muml en DMEM que contenía
FBS al 10% durante 30 minutos a 4ºC. Luego se lavaron las células y
se incubaron durante 1 hora más a 4ºC con suero Ig \gamma
antihumano de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC: fluorescein isothiocyanate) (Tago Corp., Burlingame,
California, EE.UU.). Para el análisis de la expresión de los CD4 y
CD8 de las células esplénicas, se incubaron suspensiones simples de
células con mAb anti-CD4 (GF1.5) o
anti-CD8 (53.6) conjugado con FITC a 4ºC durante 30
minutos y se lavaron dos veces con medio de cultivo. Se analizaron
un total de 10.000 células por citometría de flujo (Becton
Dickinson & Co., Mountain View, California, EE.UU.).
Cada uno de los ratones, reunidos en grupos de
cinco o diez, recibió una inyección subcutánea sobre el flanco
afeitado a razón de 5 x 10^{6} células. Semanalmente se evaluó el
tamaño del tumor en cada animal midiendo dos diámetros
perpendiculares en milímetros (mm) mediante un calibre. Los
resultados se expresaron como diámetros tumorales medios.
Para los experimentos de disminución del número
de linfocitos T in vivo se inyectó a los ratones por vía
intravenosa mAb purificado anti-CD4 (GK1.5) o
anti-CD8 (116.13.1) a dosis de 1 mg/ratón dos veces,
7 días antes y el mismo día de la inoculación del tumor. Se usó
como control la misma cantidad de mAb 10.2 anti-CD5
humano. Cuatro a cinco días más tarde, se sacrificaron los ratones,
se prepararon suspensiones de células esplénicas, y se examinó la
eficacia en la disminución del número de linfocitos T por citometría
de flujo a través de los anticuerpos anti-CD4 y CD8
marcados con FITC. Se alcanzó una disminución mayor del 95% en el
subgrupo específico de células T sin afectar los otros
subgrupos.
Se extrajeron tejidos del sitio de inoculación de
células tumorales 10 días después de la inyección, se fijaron con
formalina al 10%, se bloquearon con parafina, se hicieron cortes a
4-6 \mum, y se tiñeron con hematoxilina y eosina
(H y E). Se realizó una evaluación microscópica según lo indicado en
la Figura 4.
Los procedimientos experimentales para medir la
actividad de los CTL se han descrito anteriormente (Chen et al.
(1992) J. Immunol 148: 2617-2612).
Brevemente, se extrajeron los bazos de los ratones
4-10 semanas después de la inoculación del tumor y
se cocultivaron las células esplénicas (5 x 10^{6}) con células
16N7 (5 x 10^{5}) tratadas con radiación \gamma en 2 ml de medio
de cultivo por pocillo en una placa de 24 pocillos (Costar,
Cambridge, Massachusetts, EE.UU.). Seis días más tarde se recogieron
las células y se contaron como células efectoras. Se marcaron 2
millones de células objetivo con 250 \muCi de ^{51}Cr (New
England Nuclear, Boston, Massachusetts, EE.UU.) durante 45 minutos
(para p815E7) o durante toda la noche (para las células p2555 y
16N7), después de lo cual las células objetivo marcadas (5.000
células/pocillo) se cocultivaron con células efectoras a diferentes
relaciones efectora/objetivo (E%) durante 4 horas. Se recogieron los
sobrenadantes y se contaron con un contador \gamma. La citólisis
porcentual específica se calcula de la siguiente forma: 100 x {(cpm
experimental - cpm espontáneo) / (cpm máximo - cpm espontáneo). La
liberación espontánea en ausencia de CTL fue del
5-20% de la liberación máxima por Triton
X-100 (1:100) en todos los experimentos. En las
evaluaciones de la disminución del número de células, las células
efectoras a 1 x 10^{6}/ml se trataron previamente durante 60
minutos a 37ºC con 30 \mug/ml de mAb según lo indicado en
presencia de complemento de conejo diluido 1/10 (Cedarlane
Laboratories, Hornby, Ontario, Canadá) y se lavó tres veces antes de
usar.
La línea de células de melanoma de murina E7C3
(B7^{-}E7^{+}) se derivó transfectando el gen E7 del
HPV-16 (Chen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:110-114) en la línea
K1735-M2 (Fidler y Hart, 1981). Las células E7C3 se
cotransfectaron con pmB7 y D^{R}/pic según lo descrito en
Procedimientos experimentales y se seleccionaron los transfectantes
por su resistencia al metotrexato (MTX). Las células
K1735-M2 se cotransfectaron con pmB7 y pCM1neoPolyA
y se seleccionaron por resistencia a la neomicina. En los clones
celulares resistentes al fármaco se probó la expresión de B7 por
citometría de flujo después de tinción indirecta por
inmunofluorescencia con CTLA4Ig, una forma soluble del dominio
extracelular de CTLA-4 que se une con gran afinidad
al B7 humano (Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.
173:721-730) y murino (Liu et al. (1992)
Eur. J. Immunol. 22:2855-2859). Se
eligieron tres transfectantes para seguir estudiándolos; en la
tinción para determinar la presencia de B7, dos de ellos (BC16 y
BC22) dieron positivo y el restante (BC13) dio negativo. Un grupo
de \sim 25 clones resistentes al MTX de la transfección E7C3
también se clasificaron por citometría de flujo en poblaciones B7
positivas (PB7^{+}) y B7 negativas (PB7^{-}). De la
transfección de K1735-M2, se eligieron dos clones B7
positivos (K/18.2 y K/P12). Se compararon los niveles de expresión
de B7 en estas células por citometría de flujo (Figura 1). En los
otros experimentos, todas las líneas celulares elegidas mostraron
niveles aproximadamente similares de expresión del gen E7 del
HPV-16 por determinación semicuantitativa mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) acoplada a la
transcriptasa inversa. Todas las líneas expresaron niveles bajos de
moléculas del MHC clase I según lo evaluado mediante citometría de
flujo y también mostraron una inducción similar de moléculas del MHC
clase I tras el tratamiento con
interferón-\gamma.
Para examinar si la expresión de E7 aumenta la
inmunidad mediada por los linfocitos T contra los tumores E7C3, se
inyectaron por vía subcutánea transfectantes B7^{+} y B7^{-} en
ratones C3H/HeN y ratones atímicos con deficiencia de linfocitos T
(BALB/c nu/nu) para probar su tumorigenicidad (Tabla 1). Las células
E7C3 fueron menos tumorígenas en ratones C3H/HeN no sometidos
previamente a tratamiento que las células K1735-M2
parentales, pero ambas líneas mostraron una tumorigenicidad similar
en los ratones atímicos (Tabla 1). Estos resultados permiten suponer
que el tumor E7C3 indujo una respuesta inmunitaria mediada por los
linfocitos T en los ratones inmunocompetentes que ralentizó el
crecimiento del tumor pero no llevó a su erradicación en la mayoría
de estos animales, puesto que sólo 2/15 (\sim13%) rechazaron sus
tumores.
Por el contrario, la inoculación de células BC16,
BC22 o PB7^{+} en ratones C3H/HeN dio lugar a un crecimiento
transitorio seguido de regresión en el 100% de los animales antes de
transcurrir 2-3 semanas (Tabla 1). El clon BC13 y la
población PB7^{-} formaron tumores que crecieron de forma similar
a las células parentales E7C3 (10% y 0% de regresión
respectivamente). En la Figura 2A se muestra una fotografía de los
ratones C3H/HeN inyectados con E7C3 y PB7^{+}, y en la Figura 2B
se muestra la cinética del crecimiento del tumor E7C3 y de varios
derivados transfectados. Todas las células derivadas de E7C3
formaron tumores en los ratones atímicos (Tabla 1). La expresión de
B7 en las células E7C3 dio lugar al rechazo del tumor por los
ratones C3H/HeN; mientras que la expresión de B7 en dos clones
derivados de K1735-M2 E7-negativos
(K/18.2 y K/P12) no lo hizo.
En la Figura 3 se presentan los cortes
histológicos de los tumores B7^{-} en crecimiento y de los tumores
B7^{+} sujetos a rechazo. Un tumor inducido por células PB7^{-}
10 días después de la inyección mostró células neoplásicas en
crecimiento progresivo desde la dermis profunda hacia dentro de la
dermis superficial. Los cortes histológicos de los tumores inducidos
por E7C3 parecieron similares. El examen del tumor de células
PB7^{+} reveló un centro muy necrótico, como se muestra en la
Figura 3B, rodeado por un borde delgado de células neoplásicas
infiltradas por células inflamatorias (Figura 3B-D).
Se obtuvieron resultados similares con los tumores BC16.
Estado del tumor 21 días después de la
inoculación subcutánea al
ratón
| C3H/HeN | BALB/c (nu/nu) | |||||
| Incidencia del | Intervalo del | Intervalo del | ||||
| Líneas | E7 | B7 | tumor | diámetro | Incidencia | diámetro |
| celurares | diámetro | tumoral | del tumor | tumoral | ||
| (%)^1 | medio (mm)^2 | (%) | medio (mm) | |||
| E7C3 | + | - | 13/15 (87) | 0-12 | 15/15 (100) | 14-19 |
| PB7^{-} | + | - | 9/10 (90) | 0-7 | 10/10(100) | 15-20 |
| BC13 | + | - | 10/10 (100) | 4-8 | 10/10(100) | 18-24 |
| PB7^{+} | + | + | 0/10 (0) | 0 | 10/10(100) | 14-21 |
| BC16 | + | + | 0/9 (0) | 0 | 10/10(100) | 16-21 |
| BC22 | + | - | 0/15 (0) | 0 | 10/10(100) | 5-10 |
| K1735-M2 | - | - | 10/10 (100) | 15-23 | 15/15(100) | 16-26 |
| K/18.2 | - | + | 10/10 (100) | 12-24 | ND ^{3} | ND ^{3} |
| K/P12 | - | + | 9/9 (100) | 13-21 | ND ^{3} | ND ^{3} |
^{1} Se inyectaron por vía subcutánea alícuotas
de 5 x 10^{6} células en 0,1 ml de HBSS a ratones C3H/HeN y
BALB/c (nu/nu) de 6-8 semanas. El tamaño del tumor
se evaluó midiendo semanalmente en cada animal dos diámetros
perpendiculares en mm con un calibre. Los ratones con tumores < 2
mm de diámetro se consideraron negativos para la incidencia del
tumor.
^{2} Los resultados se expresaron como
diámetros medios de los tumores. Se muestra el intervalo del
diámetro de tumor en el número de ratón
indicado.
^{3} ND: No
determinado
Para determinar si el rechazo de las células
tumorales B7^{+}E7^{+} es causado por una respuesta inmunitaria
mediada por B7 se probó si el rechazo del tumor se bloqueaba con el
tratamiento in vivo con CTLA4Ig, que bloquea la unión del B7
al CD28 y al CTLA-4 y, por tanto, suprime la
respuesta inmunitaria in vitro e in vivo (Linsley et
al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730;
Linsley et al. (1992) Science
257:792-795; Lenschow et al. (1992)
Science 257:792-795). Células BC22 se
mezclaron con 50 \mug de CTLA4Ig antes de la inyección a ratones
C3H/HeN, seguida de la inyección de 50 \mug de CTLA4Ig por vía
intravenosa cada dos días durante 12 días; este régimen de
tratamiento con CTLA4Ig se ha usado anteriormente para el rechazo
por bloqueo de los injertos heterólogos de células de islote
pancreático en ratones (Lenschow et al. (1992) Science
257:792-795). Como control se utilizaron
cantidades equivalentes de un anticuerpo monoclonal (mAb) quimérico
L6 combinado con isótopo (Fell et al. (1992) J. Biol. Chem.
267:15552-15558). Como se ilustra en la
Figura 4, el tratamiento con CTLA4Ig evitó el rechazo de los tumores
causados por las células BC22, mientras que el control con mAb no lo
hizo. Se obtuvieron resultados similares con células BC16. Estos
resultados indican que el rechazo de las células E7C3 B7^{+} en
anfitriones inmunocompetentes singénicos es mediado por las
interacciones entre B7 y sus receptores.
Para analizar el papel de los subgrupos de
linfocitos T en el rechazo de las células tumorales E7C3 B7^{+},
se inyecto a los ratones con mAb contra los linfocitos T CD4^{+}
o contra los linfocitos T CD8^{+} para reducir específicamente el
número de estos linfocitos in vivo. Este procedimiento
eliminó > 95% de la población de linfocitos T sin afectar
otras poblaciones de linfocitos, según lo evaluado por citometría de
flujo. La eliminación de los linfocitos T CD8^{+} suprimió por
completo el rechazo de las células E7C3 B7^{+}, incluyendo las
BC16 (Figura 5) y las BC22. Por el contrario, la inyección de mAb
anti-CD4 o mAb de control, no afectó el rechazo
tumoral (Figura 5). Estos resultados indican que el rechazo inducido
contra las células E7C3 B7^{+} fue mediado principalmente por los
linfocitos T CD8^{+}.
La inyección de células tumorales
B7^{+}E7^{+} dio lugar a la generación de CTL (Figura 6). Se
inyectaron células tumorales a los ratones por vía subcutánea, se
extrajeron los bazos, y las células esplénicas se sometieron a una
estimulación secundaria con células tumorales E7^{+} in
vitro para generar CTL policlonales (Chen et al. (1992) J.
Immunol. 148:2617-2621). Se midió la
citotoxicidad contra células objetivo 16N7 marcadas con ^{51}Cr;
estas son células MHC Clase I (H-2^{k})
positivas, fibrosarcoma E7 positivas (Chen et al. (1992) J.
Immunol. 148:2617-2621) que dieron
resultados más consistentes en las pruebas de citotoxicidad in
vitro que las células E7C3. Se detectó una actividad intensa de
los CTL en los esplenocitos tomados de animales inyectados con
células BC16 después de la reestimulación in vitro por
células 16N7 (Figura 6A). Los CTL no lisaron las células de
fibrosarcoma de control que no expresaban E7 (células p2555) ni las
células que expresaban E7^{-} (p815E7) de haplotipo MHC diferente
(Figura 6A), lo cual permite suponer que la lisis de las células
objetivo fue antígeno específica y restringida por el MHC clase I.
La actividad citolítica fue muy disminuida por el pretratamiento de
las células efectoras con un mAb anti-CD8 en
presencia del complemento, pero no por el tratamiento con
anticuerpos anti-CD4 o anti-células
NK (Figura 6B). Los niveles de actividad citolítica se midieron en
células esplénicas de ratones inyectados con células E7C3, BC16 o
E7C3 irradiadas y sujetas a estimulación secundaria in vitro
con células 16N7 (Figura 6C). Sólo las células esplénicas de los
ratones inyectados con células BC16 tuvieron una actividad
significativa de los CTL. En conjunto, estos resultados indican que
la expresión de B7 en las células E7C3 aumenta la inducción de los
CTL CD8^{+} específicos para las células tumorales E7^{+} sin
importar la expresión de B7.
Para determinar si la inmunidad mediada por los
linfocitos T inducida por células E7C3 B7^{+} era a eficaz contra
células E7C3 B7^{-} transplantadas en una localización distante,
se inyectaron ratones C3H/HeN con células BC22, células E7C3 o medio
de cultivo solo en un flanco del animal y se hizo un seguimiento
del crecimiento de las células tumorales E7C3 inyectadas en el otro
flanco. El crecimiento de los tumores E7C3 fue inhibido
significativamente en animales que tenían células BC22 inoculadas en
el flanco opuesto; 4/5 de estos ratones rechazaron por completo los
tumores. El crecimiento de los tumores E7C3 no resultó afectado en
los animales inoculados con medio de cultivo o con tumores E7C3
B7^{-} (Figura 7A). Los tumores E7C3 irradiados no afectaron el
crecimiento de los tumores E7C3 inoculados en el flanco opuesto
(datos no presentados). La inyección de BC22 no inhibió el
crecimiento del tumor E6B2, un transfectante E6 del
HPV-16 derivado de K1735-M2 (Chen et
al. (1992) J. Immunol. 148:2617-2621)
inyectado en el flanco opuesto (Figura 7B). Estos resultados
demuestran que el transplante de células B7^{+}E7^{+} indujo una
respuesta sistémica de rechazo al tumor contra la provocación con
los tumores parentales E7C3 B7^{-} y que el rechazo fue específico
para las células tumorales E7^{+}.
Luego se realizaron otros estudios usando células
BC16 para el tratamiento de tumores metastásicos establecidos. Se
separaron ratones C3H/HeN en grupos de 10 ratones por grupo, y cada
ratón recibió por inyección intravenosa x 10^{5} células E7C3
(Figura 8A), E6B2 (Figura 8B) o K1735-M2 (Figura
8C). Cuatro días más tarde cada ratón recibió una inyección
intravenosa de 1 x 10^{6} células BC16; esta inoculación de
células BC16 se repitió dos veces a intervalos de cinco días. Se
hizo un seguimiento de la supervivencia de los animales que se
ilustra en la Figura 8, donde se observa que la administración de
células BC16 aumentó significativamente la supervivencia de los
ratones con tumores E7C3 y no afectó la supervivencia de los
animales con otros tumores.
Diferentes líneas de células tumorales se
dividieron cada una en dos grupos generales. El primer grupo de
células no estaba modificado genéticamente (falso), mientras que el
segundo grupo de células estaba transfectado con ADN que codifica el
gen B7 (células B7^{+}), de modo tal que las células tumorales
transfectadas expresaban B7.
Luego se inocularon los ratones con una cantidad
tumorígena de células (que varió entre 1 x 10^{5} y 5 x 10^{6}
células por ratón) de cada uno de los dos grupos de las diferentes
líneas de células tumorales, y se observó la incidencia de tumor a
las cuatro semanas de la inoculación. Los resultados de estos
estudios se muestran en la Tabla 2, que ilustra que el desarrollo
tumoral a partir de las células transfectadas con el gen B7 fue
eliminado o resultó inhibido de forma significativa en comparación
con la incidencia tumoral de las líneas de células tumorales sin
transfectar.
Como se ha demostrado más arriba, la inmunidad
generada por las células E7 positivas B7 positivas fue eficaz para
tratar los tumores establecidos. Los ratones se inyectaron por vía
intravenosa con células E7C3 capaces de formar metástasis
diseminadas en los pulmones. La inyección de células E7 positivas B7
positivas cuatro días después del establecimiento de los tumores
E7C3 prolongó la supervivencia de todos los ratones tratados y llevó
a una supervivencia a largo plazo del 40%.
En otro estudio, células de melanoma murino
K1735-M2 en las cuales se había insertado el gen
para antígeno p97 de rechazo al tumor asociado (cl62), se inocularon
en ratones inmunocompetentes, y crecieron bien produciendo tumores.
Cuando estas células se transfectaron con células B7, y las células
cl62 B7 positivas se inocularon a los ratones inmunocompetentes, no
se produjo desarrollo del tumor.
\newpage
| Incidencia del tumor \# | |||||
| Tumor | Tipo | Estirpe | Inmunogenicidad* | Falso | Células |
| B7^{+} | |||||
| E7C3 (E7^{+}) | Melanoma | C3H/HeN | ++ | 18/20 | 0/30 |
| E6B2 (E6^{+}) | Melanoma | C3H/HeN | ++ | 20/20 | 0/10 |
| cl62 (p97^{+}+) | Melanoma | C3H/HeN | ++ | 19/20 | 0/10 |
| K1735-M2 | Melanoma | C3H/HeN | - | 20/20 | 20/20** |
| EL-4 | Linfoma | C57BL/6 | + | 20/20 | 1/10 |
| B16 | Melanoma | C57BL/6 | - | 15/15 | 2/10 |
| p815 | Mastocitoma | DBA/2 | + | 15/15 | 0/5 |
* Evaluada a partir de experimentos normales de
inmunización y
provocación.
# Incidencia del tumor la semana 4 después de la
inoculación.
** Tumores más
pequeños.
Se obtuvieron resultados similares en estudios
con diferentes líneas de células tumorales tales como el linfoma
murino EL-4 de linfocitos T, el melanoma B16 y el
mastocitoma p815.
La descripción y los ejemplos anteriores tienen
la intención de ilustrar la presente invención, pero no son
restrictivos. Es posible realizar numerosas variaciones y
modificaciones sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la
presente invención.
Claims (13)
1. Una célula tumoral recombinante transfectada
con un vector de ADN que incluye ADN que codifica el antígeno
superficial B7, tal que la célula expresa el antígeno superficial B7
para el uso terapéutico .
2. La célula tumoral recombinante de la
reivindicación 1 que expresa una porción extracelular de B7.
3. La célula tumoral recombinante de la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 que es una célula infectada
por un HPV.
4. El uso de una célula tumoral recombinante de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la
fabricación de una composición para el uso en la inhibición del
crecimiento de células tumorales en un paciente.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que las células tumorales recombinantes y las células tumorales
son rechazadas en el paciente.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que las células se diseminan como metástasis en el cuerpo de un
paciente.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que se rechazan las metástasis.
8. Una membrana celular derivada de una célula de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para un uso
terapéutico.
9. Una composición para usar como vacuna que
comprende una membrana de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica para el uso en
la inhibición del crecimiento de células tumorales que comprende
una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3
y/o una membrana de acuerdo con la reivindicación 8.
11. Una composición farmacéutica para el uso en
la inhibición del crecimiento de células tumorales, que comprende
células tumorales recombinantes transfectadas con un vector de ADN
que comprende un ADN que codifica el antígeno superficial B7, tal
que las células expresan el antígeno superficial B7, o membranas
celulares derivadas de las células tumorales recombinantes, en la
cual dichas células recombinantes o membranas se pueden administrar
a pacientes para estimular y aumentar la respuesta inmunitaria
contra dichas células tumorales.
12. Un procedimiento para preparar una
composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor que
comprende células tumorales que se han extraído de un paciente y su
transfección con un ácido nucleico para expresar un antígeno
superficial B7.
13. Un método para preparar una composición
farmacéutica que comprende alícuotas de células tumorales que se han
extraído de un paciente afectado por un tumor, y la transfección o
transducción mediante un vector retroviral de dichas células
tumorales con ADN que codifica la proteína B7 de la superficie de
los linfocitos B tal que dichas células tumorales expresan B7.
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