ES2197153T3 - Inhibicion de la infeccion por vih. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN METODOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RETROVIRALES DE CELULAS HUESPEDES. EN PARTICULAR LA INVENCION SE REFIERE A LA PREVENCION DE LA INFECCION DE CELULAS HUMANAS PROVOCADA POR EL VIH MEDIANTE UN INHIBIDOR DE LA PROTEASA DE LEUCOCITOS DE SERINA (SLPI).

Description

Inhibición de la infección por VIH.

Esta invención se refiere al campo del tratamiento de infecciones retrovirales y, más en particular, al tratamiento de infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y enfermedad asociada, que incluye el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

Antecedentes de la invención

Se ha visto que los agentes retrovirales están implicados en una serie de enfermedades, entre las que se incluye el cáncer, enfermedad autoinmune y SIDA. La infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) causa un agotamiento progresivo crónico de linfocitos T CD4^{+} (células CD4^{+}) e infección de macrófagos, que da lugar a síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Actualmente la zidovudina (AZT), un análogo de timidina, es el principal fármaco antiviral utilizado en el tratamiento de infección por VIH, aunque también se utilizan otros dos agentes con mecanismo de acción similar, didesoxiinosina (ddI) y didesoxicitosina (ddC). Colley T.P, y col. New Engl. J. Med. (1990) 322:1340-45; Fischl, M-A. y col., New Engl. J. Med. (1987) 317:185-91. Estos agentes son eficaces para inhibir la replicación viral, y pueden estabilizar los niveles de células CD4^{+}, pero son incapaces de eliminar uno de mayores reservorios virales, los macrófagos infectados con VIH. Gartner, S. y col. Science (1986) 233:215-19. Se asocia además una toxicidad grave, en particular la que corresponde a médula ósea del huésped de VIH, con dosis más altas de tratamiento de AZT, así como la disminución de los efectos beneficiosos del fármaco en pacientes de SIDA tras una terapia prolongada; en pacientes tratados se han observado también cepas de VIH resistentes a AZT. Estos hallazgos han movido a buscar fármacos alternativos para el tratamiento de infección por VIH, en particular agentes con un mecanismo de acción diferente.

El virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), un retrovirus, es la causa etiológica del SIDA. La glicoproteína que envuelve al VIH-1, gp120, se une específicamente al receptor de CD4 sobre linfocitos T y sobre monocitos y macrófagos. Aunque la infección de linfocitos T requiere una proliferación celular y síntesis de ADN, la infección productiva de monocitos puede tener lugar independientemente de la síntesis de ADN (Weinberg, J.B. y col. (1991) J. Exp. Med. 174:1477-82). Cuando el VIH-1 infecta linfocitos CD4^{+} activados, es letal, pero los monocitos infectados son relativamente resistentes a la destrucción por el virus. Por consiguiente, estas células, una vez infectadas con VIH-1, sirven como reservorios de vida larga del virus. Estas células no son solo una fuente de virus replicante, sino que también su disfunción mediada por virus puede contribuir a incrementar la susceptibilidad a infecciones oportunistas que son también la marca característica del SIDA.

Dado que los monocito-macrófagos sirven como reservorios de VIH-1, la elección de esta población como objetivo, junto con los linfocitos T, garantiza otras consideraciones (Finberg, R.W, y col, Science 252: 1703-05, 1991. Los primeros trabajos del grupo de Fox (JADA 118:709-711, 1989) indicaban que un componente de saliva humana bloquea la replicación de VIH. Más recientemente, Hattori (FEBS Lett. 248:48-52, 1989) han mostrado que un inhibidor de triptasa (una enzima similar a tripsina) puede inhibir la formación de sincitios de células T inducida por VIH.

En la exploración de varios moduladores potenciales de infección de VIH, los autores de la presente invención han identificado recientemente una fuente endógena de actividad inhibidora que retarda la infección por VIH-1 y/o la replicación.

El factor responsable de la actividad antiviral es el inhibidor de serina proteasa de leucocitos (SLPI). SLPI es un potente inhibidor de elastasa y catepsina G de leucocitos humanos y de tripsina humana, y ha sido purificado desde secreciones de parótida (Thompson, R.C. y K. Ohlsson (1986), Proc. NatL.Acad. Sci. USA, 83:6692-96; y Patente US No, 4.760.130, incorporados aquí ambos como referencia). El SLPI es asequible ahora por producción con técnicas de ADN recombinante (solicitud de Patente U.S. No. 07/712.354, registrada el 7 de junio de 1991, solicitud de Patente PCT No. WO86/03519, registrada el 4 de diciembre, 1985, y solicitud de Patente europea 85 905 953.7, registrada el 4 de diciembre de 1985, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia).

La capacidad de SLPI y/o sus derivados y análogos para bloquear la infección y/o replicación de VIH-1 puede proporcionar las bases para intervención terapéutica en infección por VIH-1.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona la utilización de serina leucocito proteasa (SLPI) o muteína de SLPI para preparar un medicamento para inhibición de la infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

Breve descripción de las Figuras

Figura 1. SLPI bloquea la replicación de VIH en monocitos de una manera dependiente de la dosis. Se cultivaron en placa monocitos humanos elutriados y se expusieron a VIH \pm SLPI durante 1 hora a 37ºC, se lavaron e incubaron a 37ºC, se retiraron los sobrenadantes y se añadió medio fresco cada cuatro días. La EC_{50} para este experimento era <0,1 \mug/ml (8,5 nM) con inhibición completa a 10 \mug/ml (850 nM).

Figura 2. El efecto inhibidor de SLPI es de larga duración. En el punto correspondiente a 18 días, VIH está inhibido aún en un 90%.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para evitar la infección por VIH de células de mamífero, en particular células humanas, y enfermedades asociadas, incluyendo el síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA).

El término ``vehículo farmacéuticamente aceptable'' tal como aquí se usa significa un vehículo no tóxico generalmente inerte para el ingrediente activo, que no afecta adversamente al ingrediente o al paciente para el que se administra la formulación.

El término ``cantidad eficaz'' tal como aquí se emplea significa una cantidad predeterminada de SLPI, o un análogo o derivado del mismo, suficiente para que sea eficaz contra VIH in vivo.

Las infecciones retrovirales se tratan por administración de agentes anti-retrovirales en dosis suficientes para reducir los efectos de tal infección. Las infecciones retrovirales están implicadas en una serie de enfermedades, que incluyen, sin que quede limitado solo a ellas, cáncer, enfermedad autoinmune, y síndrome de inmunodeficiencia adquirida. La infección por virus de inmunodeficiencia humana es de particular interés según la presente invención.

En la técnica, se conoce una diversidad de agente anti-retrovirales. La mayoría de estos inhiben la actividad de transcriptasa inversa retroviral e incluyen zidovudina (AZT), un análogo de timidina, didesoxiinosina (ddl) y didesoxicitosina (ddc). La zidovudina es el principal fármaco antiviral utilizado en el tratamiento de la infección por VIH. Los agentes anti-retrovirales son por lo general eficaces en una dosis que varía entre aproximadamente 50 mg/día y aproximadamente 1000 mg/día, más en particular de aproximadamente 100 mg/día a aproximadamente 500 mg/día, y en el caso de zidovudina, específicamente aproximadamente 300 mg/día a aproximadamente 500 mg/día. Estos agentes se administran por lo general en formulaciones orales.

Los inhibidores de proteasa utilizados en esta invención se pueden preparar por medios bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Patente US No. 4.760.130; Solicitud de Patente europea 85 905 953.7, solicitud PCT WO86/03519, y solicitud de Patente US 07/712.354, supra).

Los inhibidores de serina proteasa de la presente invención son proteínas de una sola cadena de polipéptido y son substancialmente homólogos y biológicamente equivalentes al inhibidor de serina proteasa nativo aislado de secreciones de parótida humana. El inhibidor de serina proteasa nativo se conoce también como inhibidor de parótida nativo. Por ``biológicamente equivalentes'' tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva y reivindicaciones se entiende que las composiciones son capaces de inhibir la proteasa derivada de monocito que es inhibida por SLPI, pero no necesariamente en el mismo grado. Por ``derivados'', tal como se utiliza este término en la memoria descriptiva y reivindicaciones, se entiende un grado de homología de aminoácidos al inhibidor de parótida nativo preferiblemente de más del 40%, más preferiblemente de más del 50%, siendo particularmente preferido el grupo de proteínas con una homología de más del 60% con el inhibidor de parótida nativo. El porcentaje de homología, como antes se ha descrito, se calcula como porcentaje de los componentes encontrados en la más pequeña de las dos secuencias que pueden encontrarse también en la mayor de las dos secuencias, entendiéndose un componente como una secuencia de cuatro amino ácidos contiguos.

Un derivado de SLPI útil es CLPI, una molécula de SLPI truncada que tiene los últimos 60 aminoácidos del inhibidor de parótida nativo. Esos 60 aminoácidos son:

1

\newpage

La siguiente secuencia de nucleótidos se ha utilizado para codificar la anterior molécula de 60 aminoácidos:

2

CLPI ha sido construido eliminando del gen de SLPI la secuencia de señal y los nucleótidos correspondientes a los primeros 47 aminoácidos de la proteína SLPI madura como se describe en la solicitud de patente 07/712.354. El CLPI se puede hacer por el método del Ejemplo 8 descrito en la solicitud PCT WO 86/03519 y solicitud de Patente europea 85 905 953.7. Aunque el Ejemplo 8 en estas dos solicitudes describe un método para hacer SLPI, este método se puede utilizar para hacer CLPI. El CLPI se puede utilizar para generar anticuerpos útiles en la purificación de SLPI. Se pueden producir anticuerpos, por ejemplo, por los métodos discutidos en E. Harlow y D. Lane, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, páginas 92-114 (Cold Springs Harbor Laboratory, 1988).

Se proporciona también la utilización de muteínas de SLPI específicas que tienen al menos actividad equivalente, y en algunos casos mayor, que la proteína natural. Las muteínas de SLPI útiles en particular incluyen la substitución de los siguientes aminoácidos en la en la posición del radical enumerada: Gly 20, Gly 72, Val 72, y Phe 72.

Las muteínas de CLPI entran también dentro del marco de la invención. Las muteínas de CLPI que corresponden a las muteínas de SLPI Gly 72, Val 72 y Phe 72 se designan aquí como Gly 25, Val 25 y Phe 25. Algunas muteínas de CLPI contempladas tienen la siguiente secuencia de amino ácidos:

3

donde R_{7} es alanina, y R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8} son aminoácidos iguales o diferentes y uno o más entre R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8} puede ser metionina, valina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, lisina, glicina o arginina. También se incluyen, por ejemplo, formas PEGiladas de SLPI que pueden tener mejores características terapéuticas que la proteína SLPI nativa. Las muteínas que pueden ser adecuadas para PEGilación incluyen aquellas que tienen un radical de cisteína en las posiciones 13, 23, 52, 58, 68, y/o 75 de SLPI y en los correspondientes lugares 5, 11, 21 y 28 en CLPI. La preparación de muteínas de cisteína para PEGilación está descrita en la solicitud de patente PCT WO 92/16221, registrada el 13 de marzo de 1992, que se incorpora aquí específicamente como referencia. Una etapa útil en la producción de muteína puede incluir una etapa de replegado en que se añade cisteína a la solución que contiene la proteína. La cisteína puede ayudar al replegado y puede unirse a la cisteína libre sustituida en la muteína. Se puede también aislar desde monocitos la proteína SLPI que puede inhibirse (SIP) desde células monocitos humanos empleando técnicas bioquímicas convencionales bien conocidas para los especialistas en este área y purificarse las proteínas que tienen actividad proteolítica que es inhibida por SLPI. Después de purificar la proteína, (y si es necesario secuenciarla, clonar su gen, y expresarla en células huésped, es decir producir SIP recombinantemente), se puede hacer análisis de selección (screen) de inhibidores de SIP por medios muy conocidos por los especialistas. Alternativamente, se puede determinar su estructura y diseñar inhibidores a partir de ella por medios muy conocidos por los especialistas.

Cuando el SLPI o muteína del mismo, se utiliza para combatir las infecciones por VIH en un ser humano, el compuesto se puede administrar por vía oral o parenteral, en un vehículo que comprende uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, cuya proporción se determina por la solubilidad y naturaleza química del compuesto, vía de administración elegida y práctica biológica convencional. Para administración oral, SLPI, o análogo o derivado del mismo, se puede formular en formas de dosificación unitarias tales como cápsulas o tabletas conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del ingrediente activo, que varía entre aproximadamente 10 a 1000 mg, más preferiblemente 10-200 mg por día, por paciente, incluso más preferiblemente 20-200 mg por día por paciente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Para la administración parenteral, el SLPI o una muteína del mismo, se administra por inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, en composiciones con vehículos o soportes farmacéuticamente aceptables. Para la administración por inyección, se prefiere utilizar el compuesto en solución en un vehículo acuoso estéril que puede contener también otros solutos tales como agentes tampón o conservantes así como cantidades suficientes de sales farmacéuticamente aceptables o de glucosa para hacer isotónica la solución. La inyección subcutánea es la vía de administración preferida. Las dosis son esencialmente las mismas que las fijadas antes para administración oral.

Vehículos o soportes adecuados para las formulaciones antes señaladas se pueden encontrar en textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo en ``Remington's Pharmaceutical Sciences'' 16 edición, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980 y que se incorporan aquí como referencia.

La dosis del compuesto variará con la forma de administración y el agente activo particular elegido. Además, variará según el paciente o huésped particular (incluyendo mamíferos, que incluyen personas) bajo tratamiento. En general, el tratamiento se inicia con dosis pequeñas, substancialmente menores que la dosis óptima del compuesto. Después, se va incrementando la dosis en pequeños incrementos hasta alcanzar el efecto óptimo bajo las circunstancias particulares. En general, es más deseable administrar el compuesto a un nivel de concentración tal que conduzca a resultados antivirales eficaces sin causar ningún efecto secundario dañino o perjudicial, Es deseable mantener un nivel en sangre del compuesto suficiente para inhibir la infección por retrovirus de la célula huésped. Esto se puede estimar por ensayo de la cantidad de compuesto que es eficaz para evitar la infección retroviral de células huésped, por ejemplo, VIH en monocitos, in vitro, y después, utilizando técnicas farmacocinéticas convencionales, determinar la cantidad de compuesto requerida para mantener el nivel en plasma al mismo nivel inhibidor, o hasta 10-100 veces más.

Aunque las formulaciones antes descritas aquí son eficaces y son medicaciones relativamente seguras para tratar infecciones por VIH, no queda excluida la posible administración concurrente de estas formulaciones con otras medicaciones antivirales o agentes para obtener resultados beneficiosos. Estas otras medicaciones antivirales o agentes incluyen CD4 soluble, zidovudina, didesoxicitidina, fosfonoformiato, ribavarina, interferones antivirales (por ejemplo alfa-interferon o interleucina-2) o pentamidina aerosol.

La invención queda ilustrada con los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

Se aislaron monocitos de sangre periférica (PBM) de donantes sanos por elutriación, se cultivaron en placa en discos de cultivo y se incubaron durante varios días. Se mezcló SLPI con VIH (Bal) y se aplicó a los PBM durante una hora a 37ºC. Se lavaron las células y se incubaron durante un tiempo adicional, con cambios de medio y se hicieron determinaciones de transcriptasa inversa sobre sobrenadantes cada tres días. Los autores encontraron que el SPLI bloquea efectivamente la replicación de VIH a una concentración de 1 \mug/ml (figura 1). A concentraciones \leq20 \mug/ml, la inhibición de SLPI disminuye. El efecto inhibidor es prolongado, habiéndose visto una inhibición significativa a los 18 días (Figura 2).

Ejemplo 2

Se cultivaron en placa monocitos de sangre periférica (PBM) y se incubaron como en el Ejemplo 1. Se aplicó SLPI a las células durante aproximadamente una hora, se lavaron entonces las células y se trataron con VIH. Se cambió el medio y se hicieron los ensayos como en el Ejemplo 1. Los autores de la presente invención han encontrado que SLPI es más eficaz para bloquear VIH cuando las células se tratan previamente con SLPI que cuando las células se tratan con una mezcla de SLPI y VIH.

Ejemplo 3

Los autores de la presente invención han demostrado también que utilizando esencialmente el mismo protocolo que en el Ejemplo 1, pero sustituyendo células T por monocitos, el SLPI es eficaz en la inhibición de replicación de VIH en células T.

Ejemplo 4

Se mantuvo en cultivo de suspensión una línea celular de linfocitos T humanos (H-9) en RPMI 1640 con suero de ternera fetal (FCS) al 10% y 200 microgramos por litro de gentamicina. Se añadió SLPI al medio de cultivo a una concentración final de 100 microgramos por mililitro. Al cabo de 24 horas, se lavaron las células, se les inoculó durante cuatro horas cepa IIIB de VIH, se lavaron de nuevo, y se volvieron a suspender a una densidad de 500.000 células por mililitro. Se suplementó el medio y se mantuvo con SLPI a una concentración final de 100 microgramos por mililitro inmediatamente después de la re-suspensión (T=0) o 2 días después de la re-suspensión (T=2). Se recogió el sobrenadante del cultivo y se alimentaron los cultivos cada 2 días. El sobrenadante recogido 8 días después de la infección se ensayó en cuanto a actividad de transcriptasa inversa por medida de la absorción de timidina tritiada sobre un patrón poli(rA)-oligo(dT).

Como se muestra en la Tabla 1, en las células pre-tratadas con SLPI, el SLPI inhibía la replicación viral en aproximadamente un 62% y 54% cuando se añadía inmediatamente después de la infección y 2 días después de la infección, respectivamente.

TABLA 1 Células pre-tratadas con SLPI

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Control  \+ Control \+ \+ \\   \+ negativo  \+ positivo  \+ T =
0  \+ T = 2 \\\hline  Actividad RT \+ \+ \+ \+ \\  (cpm de media) 
\+ 955  \+ 86.205  \+ 32.594  \+ 39.554 \\\hline  Desviación típica 
\+  \pm 330  \+  \pm 9.676  \+  \pm 7.220  \+  \pm 8.737
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 5

El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4 excepto en que se incubó cepa IIIB de VIH, concentrada 1000 veces, con 100 microgramos por mililitro de SLPI durante 6 horas con hielo antes de la inoculación. Esta mezcla de VIH/SLPI se diluyó 1000 veces antes de las cuatro horas de la inoculación.

Como se muestra en la Tabla 2, utilizando virus y células pre-tratados con SLPI, el SLPI inhibía la replicación viral en aproximadamente 64% y 26% cuando se añadía inmediatamente después de la infección y 2 días después de la infección, respectivamente.

TABLA 2 Virus y células pre-tratados con SLPI

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Control  \+ Control \+ \+ \\   \+ negativo  \+ positivo  \+ T =
0  \+ T = 2 \\\hline  Actividad RT \+ \+ \+ \+ \\  (cpm de media) 
\+ 2.889  \+ 59.004  \+ 20.676  \+ 43.432 \\\hline  Desviación
típica  \+  \pm 565  \+  \pm 10.988  \+  \pm 4.111  \+  \pm 14.982
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 6

El experimento se llevó a cabo como en el Ejemplo 5 excepto en que las células estaban limpias, es decir, no se habían cultivado con SLPI antes de la inoculación. Utilizando células limpias y virus pre-tratado con SLPI, el SLPI inhibía la replicación viral en aproximadamente 59% y 32% cuando se añadía inmediatamente después de la infección y 2 días después de la infección, respectivamente (Tabla 3).

TABLA 3 Virus pre-tratado con SLPI

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Control  \+ Control \+ \+ \\   \+ negativo  \+ positivo  \+ T =
0  \+ T = 2 \\\hline  Actividad RT \+ \+ \+ \+ \\  (cpm de media) 
\+ 4.763  \+ 70.076  \+ 28.383  \+ 47.436 \\\hline  Desviación
típica  \+  \pm 1.698  \+  \pm 15.803  \+  \pm 5.520  \+  \pm 11.679
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 7

El experimento se realizó como en los Ejemplos 4-6 excepto en que no se expusieron ni células ni virus a SLPI antes de la inoculación. Utilizando células limpias y virus limpios, el SLPI inhibía la replicación viral en aproximadamente un 50% y 42% cuando se añadía inmediatamente después de la infección y dos días después de la infección, respectivamente (Tabla 4). La Tabla 5 muestra la actividad de transcriptasa inversa que estaba presente en el sobrenadante del cultivo ensayado 4, 6 y 8 días después de la infección.

TABLA 4 Células y virus limpios

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Control  \+ Control \+ \+ \\   \+ negativo  \+ positivo  \+ T =
0  \+ T = 2 \\\hline  Actividad RT \+ \+ \+ \+ \\  (cpm de media) 
\+ 531  \+ 79.356  \+ 38.969  \+ 46.004 \\\hline  Desviación típica 
\+  \pm 186  \+  \pm 17.497  \+  \pm 7.700  \+  \pm 8.492
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA 5 Células y virus limpios

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Negativo  \+ Positivo  \+ T = 0  \+  T = 2 \\\hline  Día 4 (cpm
de media)  \+ 435  \+ 1.556  \+ 797  \+ 1.287 \\\hline  Desviación
típica  \+  \pm 85  \+  \pm 300  \+  \pm 222  \+  \pm 204 \\\hline 
Día 6 (cpm de media)  \+ 952  \+ 72.085  \+ 15.846  \+ 41.240
\\\hline  Desviación típica  \+  \pm 715  \+  \pm 12.219  \+
 \pm 5.644  \+  \pm 14.542 \\\hline  Día 8 (cpm de media)  \+ 1.519 
\+ 13.853  \+ 7.617  \+ 11.946 \\\hline  Desviación típica  \+
 \pm 475  \+  \pm 3.458  \+  \pm 3.031  \+  \pm 2.889
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 8

Se investigó también el efecto de diferentes muteínas de SLPI sobre la replicación viral. Se incubaron células H-9 limpias con virus limpios durante 4 horas como en el Ejemplo 7. Después del lavado, las células se volvieron a suspender a una densidad de 500.000 células por mililitro en medio que contenía 30 microgramos por mililitro de SLPI o muteínas de SLPI como se muestra en la Tabla 6. Se ensayó el sobrenadante del cultivo en cuanto a actividad de transcriptasa inversa 8 días después (Tabla 6).

TABLA 6

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Control  \+ Control  \+ Tipo \+ \+ \+ \+ \+ \\   \+ negativo 
\+ positivo  \+ silvestre  \+ Gly 20  \+ Gly 72  \+ Val 72  \+ Lys
72  \+ Phe  72 \\\hline  Actividad RT  \+ 4.815  \+ 55.126  \+
39,323  \+ 39,387  \+ 40,549  \+ 36.077  \+ 52.239  \+ 8.384
\\\hline  Desviación \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  típica  \+
 \pm 2.849  \+  \pm 6.637  \+  \pm 10.933  \+  \pm 11.143  \+
 \pm 3.537  \+   \pm 7.859  \+  \pm 5.863  \+  \pm 1.924
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 9

El experimento se llevó a cabo como en el Ejemplo 8 excepto en que, después de la inoculación, las células se volvieron a suspender en medio que contenía 100 microgramos por mililitro de SLPI o la muteína Phe 72. Se ensayó el sobrenadante del cultivo en cuanto a actividad de transcriptasa inversa 2, 4, 6, 8 y 10 días post-infección (Tabla 7). Las Tablas 6 y 7 muestran que el efecto de muteína Phe-72 era particularmente pronunciado.

TABLA 7

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ Negativo  \+ Positivo  \+ SLPI  \+ PHE  -  72
\\\hline  Día 2 (cpm de media)  \+  \+ 1.386  \+ 995  \+ 897
\\\hline  Desviación típica  \+  \+  \pm 914  \+  \pm 246  \+
 \pm 472 \\\hline  Día 4 (cpm de media)  \+  \+ 1.356  \+ 1.087  \+
1.380 \\\hline  Desviación típica  \+  \+  \pm 370  \+  \pm 414  \+
 \pm 442 \\\hline  Día 6 (cpm de media)  \+ 1.142  \+ 2.103  \+
1.526  \+ 748 \\\hline  Desviación típica  \+  \pm 389  \+  \pm 498 
\+  \pm 508  \+  \pm 243 \\\hline  Día 8 (cpm de media)  \+  \+
77.931  \+ 25.241  \+ 3.491 \\\hline  Desviación típica  \+  \+
 \pm 9,779  \+  \pm 8.399  \+  \pm 1.086 \\\hline  Día 10 (cpm de
media)  \+  \+ 21.431  \+ 12.499  \+ 2.239 \\\hline  Desviación
típica  \+  \+  \pm 1.890  \+  \pm 3.495  \+  \pm 444
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 10

Para determinar el efecto de SLPI solo, se evaluó la proliferación en células H-9 por ensayos de incorporación de timidina utilizando 200.000 células H-9 cultivadas con 100 microgramos por mililitro de SLPI y sin SLPI. Los cultivos se sometieron a impulsos con medios que contenían 2,5 microcurios de timidina tritiada los días 0, 1 y 2; los conteos incorporados se midieron los días 1, 2 y 3. Como se muestra en la Tabla 8, el SLPI no es tóxico para estas células.

TABLA 8 Actividad RT (cpm de media)

PROLIFERACIÓN en H-9

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
  \+ Día 1  \+ Día 2  \+ Día 3 \\\hline  Control (-SLPI)  \+ 20.860 
\+ 67.401  \+ 53.326 \\\hline  Desviación típica  \+  \pm 581  \+
 \pm 2.529  \+  \pm 3.783 \\\hline  + SLPI, 100  \mu g/ml  \+ 20.437
 \+ 61.892  \+ 54.592 \\\hline  Desviación típica  \+  \pm 1.503  \+
 \pm 216  \+  \pm 2.781
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 11

Los autores de la presente invención han realizado también estudios de inhibición de producción viral a partir de células infectadas crónicamente utilizando la línea celular promonocítica U1. Los cultivos de suspensión de U1 se mantuvieron en RPMI con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 200 microgramos por litro de gentamicina. Se recolectaron las células, se lavaron y se suspendieron a una densidad de 2,5 millones de células por mililitro. Las células suspendidas se cultivaron durante toda la noche en medio que contenía 100 o 200 microgramos por ml de SLPI o medio solo. Se indujo el medio por adición de acetato 12-miristato de 13-forbol (PMA) a una concentración final 1 micromolar. Al cabo de 48 horas, se ensayó el sobrenadante del cultivo celular en cuanto a actividad de transcriptasa inversa como en los Ejemplos 4-9. Tal como se muestra en la Tabla 9, el SLPI inhibía significativamente la producción viral de estas células infectadas crónicamente.

TABLA 9

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|}\hline
  \+ - PMA  \+ - PMA  \+ + PMA  \+ + PMA  \+ + PMA \\   \+ - SLPI 
\+ + SLPI  \+ - SLPI  \+ + SLPI  \+ + SLPI \\   \+  \+ (200
 \mu g/ml)  \+  \+ (200  \mu g/ml)  \+ (100  \mu g/ml) \\\hline 
Actividad RT  \+ 1.052  \+ 994  \+ 5.052  \+ 2.864  \+ 2.648
\\\hline  Desviación \+ \+ \+ \+ \+ \\  típica  \+  \pm 352  \+
 \pm 447  \+  \pm 2.053  \+  \pm 403  \+  \pm 374
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

La anterior descripción de la invención tiene propósitos ilustrativos y explicativos. Ha de entenderse que se pueden hacer diversas modificaciones sin separarse del espíritu y marco de la invención. Según esto, ha de interpretarse que las siguientes reivindicaciones abarcan todas estas modificaciones.

Claims (12)

1. Utilización de un inhibidor de serina leucocito proteasa (SLPI) o muteína de SLPI para preparación de un medicamento para inhibir infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH)

2. La utilización según la reivindicación 1, donde el VIH es VIH-1.

3. La utilización según la reivindicación 1, donde el SLPI se administra por vía intraperitoneal.

4. La utilización según la reivindicación 1, donde el SLPI se administra por vía intravenosa.

5. La utilización según la reivindicación 1, donde el SLPI se administra por vía subcutánea.

6. La utilización de la reivindicación 1, donde la muteína de SLPI es la SLPI Phe 72.

7. La utilización según la reivindicación 1, donde la muteína de SLPI es la SLPI Gly 20.

8. La utilización según la reivindicación 1, donde la muteína de SLPI es la SLPI Gly 72.

9. La utilización según la reivindicación 1, donde la muteína de SPLI es la SLPI Val 72.

10. La utilización según la reivindicación 1, donde la muteína de SLPI es la CLPI Phe 25.

11. La utilización según la reivindicación 1, en que la muteína de SLPI es la CLPI Gly 25.

12. La utilización según la reiv.1, en que la muteína de SLPI es la CLPI Val 25.