ES2197196T3

ES2197196T3 - Metodos para identificar individuos que padecen una anormalidad celular.

Info

Publication number: ES2197196T3
Application number: ES95913476T
Authority: ES
Inventors: Pierre Van Der Bruggen; Jean-Pierre Szikora; Pierre Coulie; Claude Wildmann; Pascale Boel; Thierry Boon-Falleur
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-26
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2015-01-26
Also published as: NZ282938A; DE69530410D1; AU2089995A; NO963347D0; WO1995021630A1; FI963170A0; DK0789591T3; FI963170L; AU697246B2; EP0789591A1; FI963170A7; ATE237685T1; CA2182969A1; NO963347L; US6328971B1; EP0789591A4; DE69530410T2; PT789591E; JP2002502224A; EP0789591B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION DE COMPLEJOS DE PEPTIDOS DERIVADOS DE HLA-C-CLON 10 Y MAGE-1 EN LAS SUPERFICIES DE CELULAS ANORMALES. LAS RAMIFICACIONES TERAPEUTICAS Y DIAGNOSTICAS DE ESTA OBSERVACION SON EL OBJETO DE ESTA INVENCION.

Description

Métodos para identificar individuos que padecen una anormalidad celular.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a diferentes metodologías terapéuticas derivadas del reconocimiento de que ciertas células presentan complejos de HLA-Cw*1601 (previamente denominados como clon 10 de HLA, Tissue Antigens 44: 1 (1994)) y péptidos derivados de una molécula denominada MAGE-1 en sus superficies. Además, se refiere a los estados caracterizados por anormalidades celulares cuyas células anormales presentan este complejo.

Antecedentes y estado anterior de la técnica

El proceso mediante el cual el sistema inmune de mamíferos reconoce y reacciona con materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de las células T. Esta respuesta necesita que las células T reconozcan e interactúen con complejos de moléculas de la superficie celular, denominadas antígenos de leucocitos humanos (``HLA'', por sus siglas en inglés), o complejos principales de histocompatibilidad (``MHCs'', por sus siglas en inglés), y péptidos. Los péptidos se derivan de moléculas más grandes que se procesan por las células que también presentan la molécula HLA/MHC. Véase con respecto a esto Male et al., Advanced Immunology (J. P. Lipincott Company, 1987), especialmente capítulos 6-10. La interacción de la célula T con los complejos de HLA/péptido está restringida, necesitando una célula T específica para una combinación particular de una molécula de HLA y de un péptido. Si no está presente una célula T específica, no hay respuesta de la célula T, aunque esté presente su complejo asociado. Similarmente, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero está presente la célula T. Este mecanismo está implicado en la respuesta del sistema inmune a materiales extraños, en patologías autoinmunes y en respuestas a anormalidades celulares. Hace poco, se había enfocado una gran cantidad de trabajo sobre los mecanismos mediante los cuales las proteínas se procesan para dar los péptidos de unión de HLA. Véase con respecto a esto Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992).

El mecanismo por el cual las células T reconocen las anormalidades celulares se ha implicado también en el cáncer. Por ejemplo, en el documento de la solicitud PCT PCT/US92/04354, pedida el 22 de mayo de 1992, publicada el 26 de noviembre de 1992, como WO92/20356, se describe una familia de genes que se procesan en péptidos que, a su vez, se expresan sobre las superficies celulares, y pueden conducir a la lisis de las células tumorales mediante CTLs específicas. Se denominan estos genes la familia ``MAGE'', y se dice que codifican los ``precursores antigénicos de rechazo del tumor'' o moléculas ``TRAP'', y los péptidos derivados de ellos se denominan ``antígenos de rechazo de tumor'' o ``TRAs''. Véase Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van den Bruggen et al. Science 254: 1643 (1991), para más información de esta familia de genes.

En el documento de la solicitud de patente internacional WO94/05304, se describen nonapéptidos que se unen a la molécula de HLA-A1. La referencia muestra que dada la especificidad conocida de péptidos en particular para moléculas de HLA en particular, se debería esperar que un péptido en particular se una a una molécula de HLA, pero no otros. Esto es importante, porque los diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, mientras que la identificación de un péptido en particular que es la asociación para una molécula de HLA en particular tiene ramificaciones diagnósticas y terapéuticas, éstas son solamente relevantes para individuos con este fenotipo de HLA en particular. Existe una necesidad de más trabajo en este campo, porque las anormalidades celulares no se restringen a un fenotipo de HLA en particular, y como resultado la terapia dirigida necesita algo de conocimiento del fenotipo de las células anormales.

En una solicitud de patente presentada el 22 de diciembre de 1992, a nombre de Boon-Falleur et al., titulada ``Método para identificar los padecimientos individuales debidos a una anormalidad celular, algunas de cuyas células anormales presentan péptidos derivados de complejos de HLA-A2/tirosinasa y métodos para tratar dichos individuos'', se identificó que el complejo del título estaba implicado en ciertas anormalidades celulares. Sin embargo, la solicitud no sugiere que otras moléculas cualesquiera de HLA puedan estar implicadas en anormalidades celulares.

Tampoco la presentación anterior de MAGE-1 mediante una molécula de HLA-A, tal como se describe anteriormente, sugiere que la proteína se pueda presentar en otra molécula de HLA. Es por tanto sorprendente, que se haya visto ahora que la propia molécula MAGE presente en HLA-A1, se presente en HLA-Cw*1601. A pesar de que la investigación anterior tiene valor para entender el fenómeno, no predispone de ninguna manera al experto para la descripción que sigue.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada útil para determinar la expresión de HLA-Cw*1601, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un kit útil para determinar la expresión de HLA-Cw*1601, que comprende:

(a): un primer reactivo que contiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7;

(b): un segundo reactivo que contiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y

(c): unos medios de embalaje para retener dichos primeros y segundos reactivos.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de materia útil para determinar la expresión de HLA-Cw*1601 en una muestra que comprende:

(a): una mezcla de la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 o

(b): una mezcla de la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un candidato para el tratamiento con un agente terapéutico específico para complejos de HLA-Cw*1601 y el péptido de la SEQ ID NO: 4, que comprende:

(i): determinar la expresión de HLA-Cw*1601 en un sujeto mediante un método que emplea una molécula, tal como se proporciona en el primer aspecto, un kit, tal como se proporciona en el segundo aspecto, o una composición de materia, tal como se proporciona en el tercer aspecto,

(ii): poner en contacto una muestra de células anormales de dicho sujeto con una célula T citolítica específica para dichos complejos, y

(iii): determinar la lisis de al menos parte de dicha muestra de células anormales como una indicación de un candidato para dicho tratamiento.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende al menos un agente que provoca una respuesta de las células T citolíticas frente a células que presentan complejos de HLA-Cw*1601 y el péptido de la SEQ ID NO: 4 en sus superficies, suficiente para provocar una respuesta a células anormales que presentan dichos complejos en sus superficies.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad de células T citolíticas específicas para complejos de la SEQ ID NO: 4 y de HLA-Cw*1601, suficiente para tener un efecto terapéutico.

Según un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona una célula T citolítica aislada, que es específica para un complejo de HLA-Cw*1601 y para el péptido de la SEQ ID NO: 4.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar una célula anormal que presenta un complejo de HLA-Cw*1601 y el péptido de la SEQ ID NO: 4 en su superficie, que comprende poner en contacto una muestra de células anormales con una célula T citolítca específica para dicho complejo y determinar la lisis de dichas células anormales como una determinación de células que presentan dicho complejo.

Según un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

: SEQ ID NO: 2

: SEQ ID NO: 3 y

: SEQ ID NO: 4.

En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un complejo aislado de HLA-Cw*1601 y el péptido aislado de la SEQ ID NO: 4.

Según un décimo aspecto de la presente invención, se proporciona un nonapéptido aislado de fórmula:

Xaa Ala (Xaa)_{6} Leu

(SEQ ID NO: 10)

en la que Xaa es cualquier aminoácido, que satisfaga al menos dos de las siguientes condiciones: la posición 1 es Ser, la posición 3 es Tyr, la posición 4 es Gly, la posición 5 es Glu, la posición 6 es Pro, la posición 7 es Arg y la posición 8 es Lys, y el nonapéptido es capaz de unirse a HLA-Cw*1601.

Otras características preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes anexas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa experimentos que implican transfección de COS-7 con secuencias codificadoras para MAGE-1 y HLA-Cw*1601.

La Figura 2A muestra resultados de un ensayo de liberación de ^{31}Cr utilizando células MZ2 infectadas con virus de Epstein-Barr, que se ha incubado con el péptido de la SEQ ID NO: 4 durante 30 minutos. Las células efectoras eran procedentes de CTL 81/12.

La Figura 2B es similar a la Figura 2A, siendo la única diferencia que el efector era CTL 82/35.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Ejemplo 1

En los experimentos que siguen, se utilizaron diferentes líneas celulares de melanomas. Se obtuvieron éstas de pacientes con melanomas identificados como MZ2 y LB73. Las líneas celulares MZ2-MEL.43, MZ2-MEL-3.0, y MZ2-MEL 3.1 son sublíneas clonadas de MZ2-MEL, y se describen en Van den Eynde et al., Int. J. Canc. 44: 634 (1989), así como documento de solicitud de patente PCT WO92/20356 (26 de noviembre, 1992).

Se derivó la línea celular LB73-MEL del paciente LB73 de la misma manera que las otras líneas celulares aquí descritas.

Se tomaron del paciente MZ2 muestras que contenían células sanguíneas mononucleares. Se irradió una muestra de la línea celular de melanoma MZ2- MEL.43, y seguidamente se puso en contacto con las muestras que contenían las células sanguíneas mononucleares Se observaron las muestras buscando la lisis de las líneas celulares de melanoma, indicando esta lisis que en la muestra estaban presentes células T citolíticas (``CTLs'', por sus siglas en inglés) específicas para un complejo de péptido y molécula HLA presentados por las células de melanoma.

El ensayo de lisis empleado era un ensayo de liberación de cromo según Herin et al., Int. J. Cancer 39: 390-396 (1987). Sin embargo, se describe aquí el ensayo. Se hicieron crecer in vitro las células diana de melanoma, y a continuación se volvieron a suspender con una concentración de 10^{7} células/ml en DMEM, complementado con HEPES 10 mM y FCS al 30%, y se incubó durante 45 minutos a 37ºC con 200 \muCi/ml de Na(^{51}Cr)O_{4}. Las células marcadas se lavaron tres veces con DMEM, se complementaron con Hepes 10 mM. A continuación se volvieron a suspender en DMEM complementado con Hepes 10 mM y FCS al 10%, después de lo cual se distribuyeron 100 ul de partes alícuotas que contenían 10^{3} células en microplacas de 96 pocillos. Se añadieron muestras de PBLs en 100 ul del mismo medio, y se llevaron a cabo ensayos por duplicado. Se centrifugaron las placas durante 4 minutos a 100g, y se incubaron durante cuatro horas a 37ºC en un 5,5% de atmósfera de CO_{2}.

Se centrifugaron de nuevo las placas, y se recogieron y contaron partes alícuotas de 100 ul del sobrenadante. Se calculó como sigue el porcentaje de liberación de ^{51}Cr:

% de liberación de ^{51}Cr = \frac{(ER-SR)}{(MR-SR)} x 100

en la que ER es la liberación experimental observada de ^{51}Cr, SR es la liberación espontánea mediante la incubación de 10^{3} células marcadas en 200 ul de solamente medio, y MR es la liberación máxima, obtenida mediante la adición de 100 ul de Triton X-100 al 0,3% a células diana.

Las muestras sanguíneas mononucleares que mostraban elevada actividad de CTL se expandieron y clonaron mediante dilución limitante, y se volvieron a explorar de nuevo, utilizando la misma metodología.

Estos experimentos condujeron al aislamiento de varios clones CTL del paciente MZ2 que llevaban el clon CTL ``81/12''.

Se repitió el experimento tal como se describe, utilizando las dos líneas celulares MZ2-MEL 3.0 y MZ2-MEL 3.1. Los resultados indicaban que el clon 81/12 reconocía las dos MZ2-MEL 43 y MZ2-MEL 3.0, pero no MZ2-MEL 3.1. El antígeno reconocido por 81/12 se denomina aquí posteriormente ``antígeno Bb''.

Ejemplo 2

En vista del trabajo anterior, tal como se ha resumido anteriormente, era de interés el determinar el perfil de HLA clase 1 para el paciente MZ2. Esto se determinó siguiendo metodologías normalizadas, que ahora se exponen. Para obtener clones de cDNA que codifican los genes de las moléculas de HLA clase 1 de los pacientes, se preparó una biblioteca de cDNA, empezando con el mRNA total extraído de la línea celular MZ2-MEL.43, utilizando técnicas bien conocidas que no se repiten aquí. Se insertó la biblioteca en el plásmido pcD-SR\alpha, y seguidamente se exploró, utilizando una sonda de oligonucleótido que contenía una secuencia común de todos los genes de HLA clase 1, es decir:

5'-ACTCCATGAGGTATTTC-3'

(SEQ ID NO: 1)

Un clon así identificado era el clon IC4A7, el cual se halló, después de la secuenciación, que era funcionalmente equivalente, si no idéntico, a HLA-Cw*1601, una molécula de antígeno de leucocito humano bien conocida. Se da la secuencia del DNA que codifica HLA-Cw*1601, p. ej., en Cianetti et al., Immunogenetics 29: 80-91 (1989), en donde se le llama clon 10 de HLA-C y la secuencia está disponible bajo el número de acceso de GENBANK HUMMHCACA. Se informa de una secuencia puesta al día por Zemmour et al., Immunogenetics 37: 239-250 (1993). También la secuencia de Zemmour está disponible en el banco de secuencias de EMBL.

Ejemplo 3

Era de interés el determinar si la molécula de HLA identificada anteriormente presentaba un antígeno de rechazo de tumores derivado de MAGE, y si era reconocido el complejo resultante de antígeno y HLA por el clon CTL del paciente MZ2. Para determinar esto, se transfectaron células receptoras con cDNA que codificaba HLA-Cw*1601, y con un cDNA de MAGE-1, MAGE-2, o MAGE-3. Se insertó el cDNA de MAGE-1 en el plásmido pcDNA I/Amp, mientras que los cDNA de MAGE-2 y MAGE-3 se insertaron en el plásmido pcb-SR\alpha.

Se cultivaron muestras de células receptoras COS-7, en una concentración de 15.000 células/pocillo en micropocillos de fondo plano de cultivos celulares, en medio de Eagles modificado por Dulbecco (``DMEM'', por sus siglas en inglés) complementado con suero fetal de ternera al 10%. Se incubaron las células toda la noche a 37ºC, se eliminó el medio y se reemplazó a continuación por 30 \mul/pocillo de medio DMEM, conteniendo suero de Nu al 10 %, 400 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 100 \muM, y 100 ng de los plásmidos objeto (es decir, 100 ng del clon IC4A7, y 100 ng del plásmido de MAGE-cDNA). Después de cuatro horas de incubación a 37ºC, se eliminó el medio, y se reemplazó por 50 \mul de PBS que contenían DMSO al 10%. Se eliminó este medio después de dos minutos y se reemplazó por 200 \mul de DMEM complementado con FCS al 10%.

Después de este cambio en el medio, se incubaron las células COS durante 48 horas a 37ºC. A continuación se descargó el medio, y se añadieron 2000 células de clon de CTL 81/12, en 100 \mul de medio Iscove que contenía suero humano reunido al 10%. Se eliminó el sobrenadante después de 24 horas, y se determinó el contenido de TNF en un ensayo sobre células WEHI, tal como se describe por Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992).

Los resultados, expuestos en la Figura 1 demuestran que está presente mediante HLA-Cw*1601 un antígeno de rechazo de tumores, derivado de MAGE-1, y que es reconocido por el clon de CTL 81/12, mientras que la expresión de MAGE-2 y MAGE-3 no conduce a la presentación del antígeno apropiado.

Ejemplo 4

Después de los experimentos discutidos anteriormente, se realizó trabajo adicional para determinar el péptido que presentaba HLA-Cw*1601.

Se digirió el cDNA de MAGE-1 en el vector de expresión pcDNA I/Amp con endonucleasas de restricción NotI y SphI, siguiendo las instrucciones del proveedor, y a continuación con exonucleasa III. Este tratamiento generó una serie de deleciones progresivas del cDNA de MAGE-1, empezando en el extremo 3'.

Se volvieron a ligar los productos de deleción en el pcDNAI/Amp, y seguidamente por electroporación en la cepa DH5\alphaF'IQ de E. coli, utilizando técnicas bien conocidas. Se seleccionaron los transformantes con ampicilina (50 ug/ml), y se obtuvieron seiscientos clones.

Se eliminó el DNA del plásmido de cada clon, y se transfectó a continuación en células COS-7, junto con un vector que codificaba HLA-Cw*1601. El protocolo utilizado sigue los protocolos descritos anteriormente.

Seguidamente se ensayaron los transfectantes en el ensayo de liberación de TNF descrito en el Ejemplo 3. Esto permitió la separación de clones positivos y negativos. La comparación mostraba que uno de los clones positivos contenía los nucleótidos 1-730 del gen de MAGE-1, mientras que un clon negativo contenía los nucleótidos 1-706. Se comparó la secuencia de los clones positivos y negativos, y se identificó una región de 16 aminoácidos conteniendo aparentemente el péptido antigénico. Esta secuencia es:

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys

Leu Leu Thr Gln Asp Leu

(SEQ ID NO: 2)

En base a esta secuencia, se realizó un primer conjunto de experimentos en donde se hicieron péptidos sintéticos, y se ensayó su capacidad para producir células COS-7 transfectadas con HLA-Cw*1601 capaces de estimular la lisis. Se identificó un dodecámero positivo, es decir:

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu

(SEQ ID NO: 3)

El truncamiento de este dodecámero condujo a la identificación del nonapéptido

Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu

(SEQ ID NO:4)

como el mejor estimulador de la lisis. Se observó lisis semimáxima a una concentración de péptidos de 10 nM.

En experimentos no presentados aquí, pero expuestos en Serie No. 08/196.630, solicitada el 15 de febrero, 1994, se halló también que el péptido

Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu

(SEQ ID NO: 5)

estaba presentado por HLA-Cw*1601, y se lisaba por diferentes clones de células T citolíticas, tal como CTL 82/82.

Ejemplo 5

La identificación de dos péptidos separados que eran presentados por HLA- Cw*1601 sugería la necesidad de un ensayo para determinar la expresión de HLA- Cw*1601 en pacientes. El ensayo serológico no es una opción viable, porque no hay disponibles anticuerpos contra HLA-Cw*1601. Sin embargo, la reacción en cadena de la polimerasa (``PCR''), proporcionaba una alternativa. Sigue a continuación el desarrollo de un ensayo de PCR útil y viable para la expresión de HLA-Cw*1601 basado en un sistema cebador encajado.

Se utilizó el modelo descrito generalmente por Browning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2842 (1993). Esta referencia discute el uso de cebadores de oligonucleótidos, siendo los extremos 3' específicos para la secuencia de codificación para la molécula de HLA. Utilizando este ensayo, se sintetizaron los cebadores:

5'-CAAGCGCCAGGCACAGA-3'

(SEQ ID NO: 6)

y

5'-GCCTCATGGTCAGAGACGA-3'

(SEQ ID NO: 7)

Para ensayar el método, se utilizaron diferentes muestras celulares de pacientes. Se extrajo el RNA total, utilizando el método de isotiocianato de guanidina bien conocido de Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, Nueva York, 1986), página 130. Para la síntesis de cDNA, se diluyeron 2 ug de RNA con agua, y 4 ul de 5 x tampón de transcriptasa inversa. Se añadieron a cada uno 1 ul de dNTP 10 mM, 2 ul de una solución 20 uM de oligo (dT), 20 U de Rnasina, 2 ul de ditiotreitol 0,1M, y 200 U de transcriptasa inversa de MoMLV, en un volumen de reacción de 20 ul. Se incubó la mezcla durante 60 minutos a 42ºC. Para amplificar el cDNA, se complementó 1% de la reacción de cDNA con 5 ul de 10x tampón polimerasa de DNA termoestable, 1 ul a cada uno de dNTP 10 mM, 0,5 ul a cada uno de solución 80 uM de cebadores (SEQ ID NOS: 6 y 7), 1U de DynaZyme, y agua para dar un volumen final de 50 ul. Se realizó la PCR durante 30 ciclos (un minuto a 95ºC, un minuto a 62ºC, dos minutos a 72ºC). Se diluyeron los productos 1/500. Seguidamente, se realizó una segunda PCR, utilizando 1 ul de producto de la PCR diluido, complementado con 5 ul de 10x tampón polimerasa de DNA termoestable, 1 ul a cada uno de dNTP 10 mM, 0,5 uM a cada uno de una solución de cebadores 80 uM:

5'-GAGTGAGCCTGCGGAAC-3'

(SEQ ID NO: 8)

y

5'-CCTCCAGGTAGGCTCTCT-3'

(SEQ ID NO: 9)

y 1U de Dynazyme. SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 representan secuencias de nucleótidos localizados internamente al primer conjunto de cebadores, es decir, SEQ ID NOS: 6 y 7. Se añadió agua hasta 50 u, y se realizaron 20 ciclos de PCR (un minuto 95ºC; un minuto a 65ºC; dos minutos a 72ºC). A continuación se fraccionaron por tamaños los productos de la PCR sobre un gel de agarosa al 1,5% en tampón TAE.

Se utilizó esta metodología en dos conjuntos separados de experimentos. En el primero de éstos, se ensayaron los transfectantes preparados tal como se describe anteriormente y lisados por clones de células T citolíticas contra la SEQ ID NO: 4 o contra la SEQ ID NO: 5 complejados con una molécula de HLA. Se halló que todos los transfectantes positivos presentaban la molécula de HLA-Cw*1601 en sus superficies. Cualquier muestra que no generara productos de la PCR se consideraba negativa. En posteriores experimentos utilizando las muestras negativas, se empleó por segunda vez el protocolo de la PCR utilizado anteriormente, pero los cebadores se basaron en secuencias comunes a todas las secuencias de HLA-C. Véase Zemmour et al., J. Exp. Med. 176: 937 (1992). Se demostró que las muestras negativas eran células que expresaban diferentes subtipos de HLA-C, es decir, no subtipos de HLA-Cw*1601.

Ejemplo 6

En el segundo conjunto de experimentos, se ensayó la capacidad de las células, ya fueran de PBL o de tumores, para presentar péptidos mediante HLA-Cw*1601. Para hacer esto, células tomadas de pacientes se lavaron en solución de Hank, y se volvieron a suspender a una concentración de 5x10^{6} células/ml. A continuación se fijaron mediante su tratamiento durante 10 minutos, a temperatura ambiente, con paraformaldehído al 1%. Después de la fijación, se lavaron dos veces en solución de Hank, y se volvieron a suspender en medio de Iscove con suero humano al 10% añadido.

Seguidamente, las células se distribuyeron en pocillos de fondo 96V, en concentraciones de 3x10^{4} células de PBLs o de 1x10^{4} células tumorales, y se pulsaron con diferentes concentraciones de péptidos. Después de dos horas de incubación a 37ºC, se lavaron las células dos veces, antes de que se añadieran CTLs (1500, 100 ul de medio de Iscove, suero humano al 10 %, 20 U/ml de IL-2 humano recombinante, y se midiera la liberación de TNF de las células WEHI-164. Véase, p. ej., Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992), que se incorpora aquí como referencia para detalles del ensayo. Las células efectoras del ensayo eran de CTL 82/35.

Se resumen los resultados en la siguiente tabla. Solamente se produjo TNF en presencia de las células diana, derivadas de pacientes que habían dado positivo para HLA- Cw*1601, basado en el ensayo de la PCR, expuesto anteriormente, que habían sido pulsados con péptido.

Los experimentos, resumidos en la Tabla 1, usaron células que se habían fijado con glutaraldehído, pulsados con el péptido, y ensayados a continuación para reconocimiento por la línea citolítica de células T CTL 82/35. Como muestra la Tabla, solamente se produjo TNF en presencia de células diana pulsadas con péptido, que habían sido probado ser positivas para HLA-Cw*1601 en el ensayo de PCR discutido anteriormente.

TABLA 1

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Paciente \+ PCR de \+ Presentación\cr  \+
HLA-Cw*1601 \+ de péptidos\cr  \+ \+ a CTL 82/35\cr 
MZ2 \+ + \+ +\cr  LB17 \+ + \+ +\cr  LB678 \+ + \+ +\cr  LB708 \+ +
\+ +\cr  MI4024/1 \+ + \+ +\cr  LB73 \+ - \+ -\cr 
LY-2 \+ - \+ -\cr  SK19 \+ - \+ -\cr  SK37 \+ - \+
-\cr}

Ejemplo 7

Aproximadamente 8% de las muestras ( de 99) eran positivas para este tipo de HLA, y cinco de los positivos se ensayaron para ver la lisis con CTL: tal como se describe anteriormente. Todos provocaron la lisis, tal como se indica en la Tabla 1. En contraste con esto, las muestras de cuatro pacientes que no eran positivos para HLA-Cw*1601, no provocaban la lisis por CTLs.

Ejemplo 8

En otro experimento, se utilizaron células linfoblastoideas MZ2, infectadas con virus de Epstein-Barr, en un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Las células infectadas, denominadas ``MZ2-EBV'', se marcaron con ^{51}Cr, y a continuación se incubaron durante 30 minutos en presencia de péptido de MAGE-1, a concentraciones de 1 a 5000 mM. Se añadieron CTLs (o CTL 81/12 o CTL 82/35) con una relación de efector/diana de :1. Se midió la liberación de cromo después de cuatro horas.

Se muestran los resultados en las figuras 2A y 2B mostrando lisis por CTL 81/12 (figura 2A) y por CTL 82/35 (figura 2B). Las flechas indican el nivel de lisis de las células linfoblastoideas (B^{-}) MZ2-MEL 43(B^{+}) y MZ2, incubadas sin péptidos.

Los experimentos explicados anteriormente sugieren que se necesita un péptido con un motivo de unión en particular para unirse a HLA-Cw*1601. Son una característica de la invención los péptidos de esta fórmula, es decir:

Xaa Ala (Xaa)_{6} Leu

(SEQ ID NO: 10). En la SEQ ID NO: 10, Xaa se refiere a cualquier aminoácido, con las siguientes preferencias:

Ala o Ser en posición 1

Tyr o Arg en posición 3

Gly o Ala en posición 4

Glu o Val en posición 5

Pro o Phe en posición 6

Arg o Leu en posición 7

Lys o Ala en posición 8

Los péptidos aislados de esta fórmula son útiles, p. ej., para diagnosticar el cáncer, tal como se explicará. Se sabe, por las referencias aquí citadas, que los pacientes desarrollan perfectamente células T citolíticas contra sus propios tumores. Para pacientes positivos para HLA-Cw*1601, estas células T citolíticas reconocen y reaccionan con cualquier célula que presente complejos de HLA_Cw*1601 y un péptido de la fórmula de la SEQ ID NO: 10, más preferiblemente SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. Se puede monitorizar el reconocimiento mediante la liberación de TNF por las CTLs, proliferación de las CTLs, y/o liberación de algún agente contenido por las células diana, p. ej., cromo radiactivo (^{51}Cr). De esta manera, en un aspecto de la invención, se pone en contacto una muestra sanguínea de un sujeto que contiene PBLs, con células que presentan HLA-Cw*1601. Estas células se ponen en contacto, tal como mediante pulsación, con un péptido según la SEQ ID NO: 10. Estos péptidos se complejan con las moléculas de HLA-Cw*1601, y cualquier CTL en la muestra que contiene PBL reacciona con eso. De esta manera, un aspecto de la invención es un ensayo de diagnóstico para la determinación de CTLs específicas de tumores, habiéndose establecido que solamente las células tumorales presentan TRAs derivados de MAGE. La única excepción a esto parecen ser las células testiculares, pero es un asunto sencillo excluir simplemente la posibilidad de que CTLs en la sangre del sujeto reaccionen con células testiculares. También se puede transfectar una célula positiva a HLA-Cw*1601 con un gen MAGE, p. ej., MAGE-1, para producir los complejos deseados.

En otro aspecto de la invención, se pueden utilizar los péptidos aquí descritos solos o complejados con proteínas portadoras, y utilizarse a continuación como inmunógenos. Tales inmunógenos se pueden utilizar solos, o preferiblemente con un coadyuvante farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos son útiles, también en los ensayos de diagnóstico, para determinar si y cuando se presentan en células los péptidos particulares. De nuevo una presentación de este tipo es indicativa de cáncer.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención son también útiles, tal como se ha indicado, como sondas para la determinación de la expresión de HLA-Cw*1601. No se debería decir que la tipificación de HLA es importante para, p. ej., tipificación de tejidos para transplante, y para otras áreas. Por ello, es útil tener materiales disponibles, que se puedan utilizar en este contexto. Los cebadores utilizados en el trabajo de PCR se pueden utilizar, solos o en combinación, para ensayos de amplificación, tales como reacción en cadena de la polimerasa. Se pueden utilizar también, cuando están marcados, p. ej., radiactivamente o no radiactivamente, como sondas para determinar si o no se expresa HLA-Cw*1601., en otros ensayos de diagnóstico. Por ello, se pueden utilizar combinaciones de dos o más de las SEQ ID NOS: 6, 7, 8 y 9, en formas de ``un recipiente'' o de kit, como reactivos de diagnóstico. Se prefiere expresamente una forma en kit, si se proporcionan porciones separadas de SEQ ID NOS: 6 y 7 y SEQ ID NOS: 8 y 9, en unos medios de embalaje, para utilizarse en una amplificación o en otros formatos. Los kits pueden llevar también polimerasas, tales como polimerasas Taq, en realizaciones específicas.

Los anteriores experimentos demuestran que HLA-Cw*1601 presenta un péptido derivado de MAGE-1 como un antígeno de rechazo de tumores, llevando a la lisis de las células presentes. Hay derivaciones de este hallazgo discutidas más abajo. Por ejemplo, el clon 81/12 de CTL es representativo de las CTLs específicas para el complejo en cuestión. Se espera que sea terapéuticamente útil la administración de tales CTLs a un sujeto, cuando el paciente presenta fenotipo de HLA-Cw*1601 en células anormales. Depende de la habilidad del experto para desarrollar las CTLs necesarios in vitro. Específicamente, una muestra de células, tal como células sanguíneas, se pone en contacto con una célula que presenta el complejo y es capaz de provocar que una CTL específico prolifere. La célula diana puede ser una transfectante, tal como una célula COS del tipo descrito anteriormente. Estos transfectantes presentan el complejo deseado en su superficie y, cuando se combinan con un CTL de interés, estimulan su proliferación. Se ha indicado que se conoce la secuencia para HLA-Cw*1601 en la técnica mediante GENBANK y EMBL, y la secuencia para MAGE-1, junto con un protocolo detallado para su aislamiento, se proporciona por la solicitud PCT y por Van den Bruggen et al. Las células COS, tal como las que se utilizan aquí, están ampliamente disponibles como otras células hospedadoras apropiadas.

Para detallar la metodología terapéutica, denominada transferencia adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917 (1986); Riddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch et al., Eur. J. Immunol. 211403-1410 (1991); Kast et al., Cell 59: 603-614 (11-17-89)), las células que presentan el complejo deseado se combinan con CTLs llevando a la proliferación de CTLs específicas de ellos. A continuación se administran las CTLs proliferadas a un sujeto con una anormalidad celular que se caracteriza por células anormales que presentan el complejo en particular. Seguidamente las CTLs lisan las células anormales, consiguiendo el objetivo terapéutico deseado.

La terapia anterior presupone que las células anormales del sujeto presentan el complejo peptídico derivado de HLA-Cw*1601/MAGE-1. Esto se puede determinar muy fácilmente. Por ejemplo, se identifican CTLs utilizando los transfectantes anteriormente discutidos, y una vez aislados, se pueden utilizar con una muestra de células anormales de un sujeto para determinar la lisis in vitro. Si se observa la lisis, entonces el uso de CTLs específicas en tal terapia puede aliviar el estado asociado con las célula anormales. Una metodología menos implicada examina las células anormales para ver fenotipos de HLA, utilizando ensayos normalizados, y determina la expresión de MAGE-1 mediante amplificación utilizando, p. ej., PCR.

La transferencia adoptiva no es la única forma de terapia que está disponible según la invención. Se pueden provocar también CTLs in vivo, utilizando varios ensayos. Una aproximación, es decir, el uso de células no proliferantes que expresan el complejo se ha elaborado anteriormente. Las células utilizadas en esta aproximación pueden ser aquellas que normalmente expresan el complejo, tal como células irradiadas de melanoma o células transfectadas con uno o dos de los genes necesarios para la presentación del complejo. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110-114 (enero, 1991) ejemplifican esta aproximación, mostrando el uso de células transfectadas que expresan péptidos de HPVE7 en un régimen terapéutico. Se pueden utilizar diferentes tipos de células. De manera similar, se pueden utilizar vectores que llevan uno o dos de los genes de interés. Se prefieren en particular vectores virales o bacterianos. En estos sistemas, se lleva el gen de interés por, p. ej., un virus de Vaccinia o la bacteria BCG, y los materiales infectan ``de facto'' células hospedadoras. Las células que resultan presentan el complejo de interés, y se reconocen por CTLs autólogas, que proliferan a continuación. Se puede conseguir un efecto similar mediante la combinación del mismo MAGE-1 con un coadyuvante para facilitar la incorporación dentro de las células que presentan HLA-Cw*1601. Seguidamente se procesa la enzima para conseguir el péptido asociado a la molécula de HLA.

La discusión anterior se refiere a ``células anormales'' y ``anormalidades celulares''. Se emplean estos términos en su más amplia interpretación, y se refieren a cualquier situación en donde las células en cuestión exhiben al menos una propiedad que indica que difieren de las células normales de su tipo específico. Ejemplos de propiedades anormales comprenden cambios morfológicos y bioquímicos, p. ej., anormalidades celulares comprenden tumores, tales como melanoma, alteraciones autoinmunes, y etcétera.

Otros aspectos de la invención están claros para el experto y no se necesita que se repitan aquí.

Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o sus partes, reconociéndose que son posible diferentes modificaciones dentro del alcance de la invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTES: Van den Bruggen, Pierre Szikora, Jean-Pierre Coulie, Pierre Wildman, Claude Boël, Pascale Boon-Falleur, Thierry

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS QUE SUFREN UNA ANORMALIDAD CELULAR, PRESENTANDO ALGUNAS DE ESTAS CÉLULAS ANORMALES COMPLEJOS DE HLA-Cw*1601/PÉPTIDOS DERIVADOS DE MAGE-1, Y MÉTODOS PARA TRATAR DICHOS INDIVIDUOS

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): SEÑAS PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Felfe & Lynch

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 805 Third Avenue

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(C): CIUDAD: Nueva York

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(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.333000\baselineskip

(E): NACIÓN: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO: 10022

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete, 5.25 pulgadas, 360 kb

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PS/2

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Wordperfect

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/292.492

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICTUD: 18-AGOSTO-1994

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN: 435

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/195.186

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 14-FEBRERO-1994

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/008.446

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 22-ENERO-1993

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Hanson, Norman D.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30.946

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: LUD 5361.1

\vskip0.666000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIONES.

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 688-9200

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 838-3884

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip12mm

ACTCCATGAG GTATTTC

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 restos de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip0.250000\baselineskip

\blseq Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg
Lys Leu Leu Thr Gln Asp Leu\elseq

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 restos de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip0.250000\baselineskip

\blseq Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg
Lys Leu Leu\elseq

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 restos de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip0.250000\baselineskip

\blseq Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys
Leu\elseq

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 restos de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip0.250000\baselineskip

\blseq Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala
Leu\elseq

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip12mm

CAAGCGCCAG GCACAGA

\hfill

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip12mm

GCCTCATGGT CAGAGACGA

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip12mm

GAGTGAGCCT GCGGAAC

\hfill

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip12mm

CCTCCAGGTA GGCTCTCT

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 restos de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip0.250000\baselineskip

\hskip 1cm

Xaa Ala (Xaa)_{6} Leu

Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico útil para determinar la expresión de HLA-Cw*1601, seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

2. Un kit útil para determinar la expresión de HLA-Cw* 1601, que comprende:

(a): un primer reactivo que contiene SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7;

(b): un segundo reactivo que contiene SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; y

(c): unos medios de embalaje para tener dichos primer y segundo reactivos.

3. Un kit según la reivindicación 2, que comprende además una porción separada de una polimerasa.

4. Una composición de materia útil para determinar la expresión de HLA-Cw*1601 en una muestra, que comprende:

(a): una mezcla de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o

(b): una mezcla de SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

5. Un método para identificar un candidato para el tratamiento con un agente terapéutico específico para complejos de HLA-Cw*1601 y el péptido de SEC ID NO: 4, que comprende:

(i): determinar la expresión de HLA-Cw*1601 en un sujeto mediante un método que emplea una molécula según la reivindicación 1, un kit según la reivindicación 2 ó 3, o una composición de materia según la reivindicación 4,

6. Una composición que comprende al menos un agente que provoca una respuesta de células T citolíticas frente a células que presentan complejos de HLA-Cw*1601 y el péptido de SEQ ID NO: 4 en sus superficies, suficiente para provocar una respuesta a células anormales que presentan dichos complejos en sus superficies.

7. Una composición según la reivindicación 6, en la que dicha anormalidad celular es cáncer.

8. Una composición según la reivindicación 7, en la que dicho cáncer es melanoma.

9. Una composición según la reivindicación 6, 7 u 8, en la que dicho agente comprende un vector que codifica el péptido de la SEQ ID NO: 4.

10. Una composición según la reivindicación 9, en la que dicho agente comprende también un vector que codifica HLA-Cw*1601.

11. Una composición según la reivindicación 9, en la que dicho vector también codifica HLA-Cw*1601.

12. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en la que dicho agente es una muestra de células no proliferantes que presentan dichos complejos en sus superficies.

13. Una composición que comprende una cantidad de células T citolíticas específicas para complejos de SEQ ID NO: 4 y HLA-Cw*1601 suficiente para tener un efecto terapéutico.

14. Una composición según la reivindicación 13, en la que dichas células T citolíticas son autólogas.

15. Una célula T citolítica aislada, que es específica para un complejo de HLA- Cw*1601 y el péptido de SEQ ID NO: 4.

16. Un método para identificar una célula anormal que presenta un complejo de HLA-Cw*1601 y el péptido de SEQ ID NO: 4 en su superficie que comprende poner en contacto una muestra de células anormales con una célula T citolítica específica para dicho complejo y determinar la lisis de dichas células anormales que presentan dicho complejo.

17. Un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en :

: SEQ ID NO: 2

: SEQ ID NO: 3 y

: SEQ ID NO: 4.

18. Un complejo aislado de HLA-Cw*1601 y el péptido aislado de SEQ ID NO: 4

19. Un nonapéptido aislado de fórmula:

Xaa Ala (Xaa)_{6} Leu

(SEQ ID NO: 10)

en el que Xaa es cualquier aminoácido, que satisface al menos dos de las siguientes condiciones: la posición 1 es Ser, la posición 3 es Tyr, la posición 4 3 es Gly, la posición 5 es Glu, la posición 6 es Pro, la posición 7 es Arg y la posición 8 es Lys, y que el nonapéptido es capaz de unirse a HLA-Cw*1601.

20. Una composición inmunogénica que comprende el nonapéptido aislado de la reivindicación 19 y un coadyuvante farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición inmunogénica según la reivindicación 20, en la que dicho nonapéptido aislado está complejado con una proteína portadora.

22. Una composición inmunogénica según la reivindicación 20 ó 21 para uso en la terapia.

23. Una composición según cualquiera de la reivindicaciones 6-14, una célula T citolítica aislada según la reivindicación 15 o un péptido aislado según la reivindicación 17 ó 19, para uso en el tratamiento de un sujeto con una anormalidad celular.

24. Una célula T citolítica aislada según la reivindicación 15 o un péptido aislado según la reivindicación 17 ó 19 para uso en diagnosis.

25. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 6-14, una célula T citolítica aislada según la reivindicación 15, un péptido aislado según la reivindicación 17 ó 19, para la fabricación de un medicamento para tratar un sujeto con una anormalidad celular.

26. Un uso según la reivindicación 25, en el que dicha anormalidad celular es cáncer.

27. Un uso según la reivindicación 26, el que dicho cáncer es melanoma.