ES2197294T3

ES2197294T3 - Metodo para reducir inhibidores de la hibridacion de acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2197294T3
Application number: ES97122878T
Authority: ES
Inventors: Matthew P. Collis; Michael C. Little; Oscar J. Llorin
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1996-12-30
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: JP4271273B2; DE69722159T2; US5763185A; DE69722159D1; AU4931497A; BR9706374A; MX9709074A; AU728014B2; EP0851032B1; CA2220270C; EP0851032A1; CA2220270A1; JPH10191978A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA REDUCIR LA CANTIDAD DE SUSTANCIAS CAPACES DE INHIBIR LA HIBRIDACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS PRESENTES EN LAS MUESTRAS. EL METODO SE APLICA ANTES DE LIBERAR EL ACIDO NUCLEICO DIANA DE LAS CELULAS DE INTERES Y CONSISTE EN PONER EN CONTACTO LA MUESTRA CON UN AGENTE QUE SOLUBILIZA LAS SUSTANCIAS INHIBIDORAS Y NO EFECTUA LA LIBERACION DE ACIDOS NUCLEICOS DE LAS CELULAS PRESENTES EN LA MUESTRA NI LAS CELULAS DEL AGENTE.

Description

Método para reducir inhibidores de la hibridación de ácidos nucleicos.

El campo de la presente invención se refiere en sentido amplio a la hibridación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a la reducción de sustancias en muestras que inhiben los eventos de hibridación de ácidos nucleicos. Entre tales eventos se incluyen la hibridación de sondas de ácidos nucleicos para determinar la presencia y/o cantidad de un ácido nucleico blanco y la hibridación de cebadores de ácidos nucleicos para la iniciación de un proceso de amplificación de ácidos nucleicos.

Los procesos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), la amplificación mediada por transcripción (TMA) y otros se utilizan para crear múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular de interés (secuencia blanco) que está presente en un menor número de copias en una muestra. No obstante, una serie de sustancias habitualmente encontradas en tales muestras ocasionan la inhibición de los procesos de amplificación de ácidos nucleicos debido a la inhibición de la hibridación de los cebadores para iniciar el proceso de amplificación. De forma similar, tales sustancias inhiben las reacciones directas de hibridación de sondas de ácidos nucleicos utilizadas para la detección de ácidos nucleicos blanco sin amplificar.

Un ejemplo de tales sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos son los compuestos porfirínicos derivados de hemo y hematina, ambos habitualmente encontrados en muestras de sangre e inhibidores de la PCR (PCR Technology, Stockton Press, Henry A. Erlich ed., pp 33-34, 1989). Para reducir la cantidad de estos inhibidores se han utilizado protocolos que usan la lisis osmótica y el apastillamiento de residuos nucleicos y celulares.

También se han informado muestras salivares que contenían sustancias inhibidoras de la PCR. Ochert y otros, PCR Methods and Applications 3, 365-368 (1994). Aunque no se identificaron las sustancias inhibidoras, se encontró que el tratamiento prolongado en microondas o a ebullición de las muestras salivares eliminaba totalmente la inhibición de la PCR.

Frickofen y Young, J. Virol. Methods 35, 65-72 (1991) informan que el calentamiento de muestras séricas durante 45 segundos a 70ºC mejora la amplificación por PCR de secuencias de ácidos nucleicos víricos. Se teoriza que esta mejora es debida a la inactivación térmica de enzimas séricas tales como aprotinina, leupeptina, PMSF y pepstatina que se cree son inhibidoras de los procesos PCR.

Otra aproximación para eliminar del suero sustancias inhibidoras de la PCR previamente a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico vírico se revela en Zeldis y otros, J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989). Esta aproximación conlleva adsorber el virus en micropartículas recubiertas de anticuerpo, lavar las micropartículas y luego destruir las proteínas restantes que pueden ser inhibidoras de la PCR con proteinasa K.

En un intento de detectar Treponema pallidum en líquido amniótico, líquido cefaloraquídeo y suero fetal y neonatal mediante PCR, se intentaron cuatro procesos diferentes para eliminar los compuestos inhibidores de la PCR. Grimprel y otros, J. Clin. Microbiol. 29, 1711-1718 (1991). Brevemente, los cuatro procesos para la eliminación de compuestos inhibidores de la PCR eran: (1) un método de ebullición en el que un tubo con una muestra se colocaba en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, se enfriaba sobre hielo y luego se centrifugaba; (2) un método de separación a bajas revoluciones en el que la muestra se añadía a medio salino tamponado con fosfato estéril y se sometía a una serie de centrifugaciones, resuspendiéndose después la pastilla que se llevaba a ebullición durante 10 minutos tras los que se enfriaba sobre hielo; (3) un método de extracción por lisis alcalina en el que la muestra se llevaba a ebullición durante 1,5 minutos en NaCl 1 M, NaOH 1 N y SDS al 0,1%, luego se neutralizaba con Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0) y después se sometía a una serie de extracciones con fenol y cloroformo-alcohol isoamílico y se precipitaba con alcohol isopropílico; y (4) un método de extracción por revoluciones en el que la muestra se sometía a una separación de bajas revoluciones como se describió anteriormente en (2), seguida de 10 minutos de ebullición y una extracción en fenol-cloroformo antes de su precipitación en etanol absoluto frío. Los autores informaron éxitos variables de estos métodos dependiendo del tipo de muestras utilizado.

Con muestras de heces, se encontró que la precipitación en polietilenglicol eliminaba una cantidad significativa de pequeñas partículas y sustancias solubles que podrían ser inhibidoras de un proceso de PCR con transcriptasa reversa. Jiang y otros, J. Clin. Microbiol. 30, 2529-2534 (1992). A continuación de la precipitación, se efectuó un proceso de extracción utilizando el detergente catiónico bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) en alta concentración salina conjuntamente con extracción en fenol- cloroformo.

Una aproximación diferente para eliminar sustancias inhibidoras de la PCR de muestras de heces la informan Wilde y otros, J. Clin. Microbiol. 28, 1300- 1307 (1990). Antes de usar la PCR para detectar ácido nucleico de rotavirus a partir de muestras de heces, se modificó el proceso de extracción con un paso añadido que utilizaba polvo de fibra de celulosa cromatográfica (polvo CF11) para purificar el ARN del rotavirus durante una serie de rápidos pasos de lavado y elución.

Al efectuar un estudio para detectar citomegalovirus (CMV) en orina usando PCR, se encontró que la urea es inhibidora de la PCR. Khan y otros, J. Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991). Esta referencia informa que los efectos inhibidores de la PCR de la urea en orina se eliminan de forma efectiva mediante simple diálisis o ultracentrifugación.

Otro proceso para eliminar sustancias inhibidoras de la PCR de la orina antes de la detección de ácido nucleico de CMV lo informan Buffone y otros, Clin. Chem. 37, 1945-1949 (1991). Este proceso ocurre de forma subsiguiente a la liberación del ácido nucleico de los organismos CMV y utiliza finas perlas de vidrio para adsorber ácido nucleico de modo que puedan hacerse eluir selectivamente la proteína y otras sustancias antes de la recuperación del ácido nucleico para su amplificación.

Un proceso alternativo para eliminar sustancias inhibidoras de la PCR se divulga también en el documento EP-A-O 626 456.

Como evidencian las referencias anteriormente descritas, la mayoría de las publicaciones referentes a la inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos se refieren a la PCR. No obstante, se ha encontrado que estas mismas sustancias que son inhibidoras de la PCR, además de una serie de otras sustancias habitualmente encontradas en muestras clínicas tales como sustancias proteináceas, EDTA, ADN humano y hierro, son inhibidoras también de la SDA y otros procesos de amplificación de ácidos nucleicos.

Igualmente, la mayoría de estos métodos para reducir o eliminar sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos conllevan pasos complicados que llevan bastante tiempo y que deben añadirse a la metodología de procesado de la muestra. Otro problema con los métodos que utilizan pasos o condiciones de procesado relativamente severos y/o requieren la separación del ácido nucleico blanco de otras sustancias es la pérdida de algo de la secuencia de ácido nucleico blanco. A pesar de la habilidad de los procesos de amplificación de ácidos nucleicos para hacer múltiples copias de la secuencia blanco (amplicones) a partir de muy pocos blancos originales, la eficacia de la amplificación y la habilidad de detección mejoran si hay números más altos de blancos originales en la muestra. La mayor habilidad de detección puede ser muy importante cuando se procesan muestras particularmente difíciles de detectar tales como muestras de Mycobacterium tuberculosis con baciloscopía AFB (bacilos resistentes a ácidos) negativa.

Resumen de la invención

Con el fin de hacer frente a los problemas asociados con la presencia de sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos en las muestras y de ese modo obtener los beneficios de una amplificación más eficaz y una detección mejorada de las secuencias de ácido nucleico blanco, la presente invención proporciona un método para reducir la cantidad de tales sustancias en muestras mediante, previamente a la lisis de las células de la muestra que contienen el ácido nucleico a amplificar, el contacto de la muestra con un agente que no efectúa la liberación del ácido nucleico de las células y la posterior separación de las células del agente.

Las características específicas del método de la invención se divulgan en la reivindicación 1. En las reivindicaciones dependientes se divulgan realizaciones preferidas del mismo.

Son agentes útiles para uso en la presente invención los caótropos tiocianato de guanidina, perclorato sódico y tiocianato sódico. Asimismo, la separación de las células del agente se consigue generalmente mediante un paso de lavado y centrifugación con una disolución en la que el agente es soluble.

Breve descripción de los dibujos

Los distintos objetos, ventajas y características novedosas de la invención se apreciarán más fácilmente a partir de la descripción detallada siguiente cuando se lea conjuntamente con las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 es una representación gráfica de los resultados de un experimento llevado a cabo para determinar si el método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos de una muestra clínica en comparación con un método de procesado estándar de la muestra de control.

La figura 2 es una representación gráfica de los resultados de un experimento llevado a cabo para determinar los valores óptimos de pH y concentración para un agente particular utilizado en el método de la presente invención.

Las figuras 3A y 3B son representaciones gráficas de los resultados de un experimento que muestran la efectividad del método de la presente invención en la reducción de la cantidad de inhibidores de la hibridación de ácidos nucleicos de muestras clínicas.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere a un método para reducir la cantidad de sustancias que son inhibidoras de procesos de hibridación de ácidos nucleicos en muestras que contienen células con ácido nucleico y van a ser sometidas a un proceso de hibridación. En el método, se pone en contacto con una muestra un agente que solubiliza tales sustancias y no efectúa la liberación del ácido nucleico de las células previamente a la lisis de las células de la muestra de modo que las células que contienen ácido nucleico permanezcan en la muestra. Entonces, se separan tales células del agente.

Los resultados de este método fueron particularmente inesperados debido a la complejidad de algunos de los procesos probados por otros para eliminar sustancias inhibidoras como evidencian las descripciones de la sección de antecedentes anterior. Asimismo, se creía de forma general entre los diestros en la técnica que los agentes usados en el método de la presente invención eran útiles para efectuar la liberación de ácido nucleico de las células mediante solubilización o lisis de la pared celular, como evidencian varias referencias tales como el documento US-A-5 482 834 en el que se revela que sales caotrópicas son útiles específicamente para la solubilización o lisis de las células. En general, tales agentes se usaban en combinación con calor para conseguir la lisis o solubilización de las células.

Las propiedades lisogénicas de la pared celular de caótropos tales como el tiocianato de guanidina (GuSCN) se han informado también en referencias tales como Hubbard y otros,

\def\x{Experimental \textamp{}  Applied  Acarology}\ul\x

19, 473-478 (1995), Boom y otros, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990), Reek y otros, BioTechniques 19, 282-285 (1995), Chunge y otros, J. Med. Virol. 40, 142-145 (1993) y Shah y otros, J. Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995). De forma similar, caótropos y detergentes tales como GuSCN se han utilizado extensamente en la extracción de ácidos nucleicos a partir de células tal como se revela en referencias como Delacourt y otros, J. Pediatrics 126, 703-710 (1995), Lee y Choi,

\def\x{J.
Microbiol. \textamp{}   Biotechnol.}\ul\x

5, 181-187 (1995), Cano y otros, J. Food Protection 58, 614-620 (1995), Bartolomé y otros, J. Hepatol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian y otros, Lett. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) y Shieh y otros, J. Virol. Methods 54, 51-66 (1995). Así pues, el método simple y rápido de la presente invención en el que las células de una muestra se ponen en contacto (se lavan) con un tal agente previamente a la lisis celular para eliminar sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos era inesperado a la vista de otros procesos que se utilizaban en la técnica.

Asimismo, una de las ventajas del método de la presente invención es la habilidad para aumentar el rendimiento inicial de ácido nucleico blanco procedente de las células de una muestra. Aunque los procesos de amplificación de ácidos nucleicos son capaces de crear muchas copias de una secuencia blanco (amplicones) a partir de muy pocos blancos iniciales, resulta ventajoso comenzar el proceso de amplificación con tantos blancos iniciales como sea posible. Otros procesos para eliminar sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos subsiguientemente a la lisis de las células son notoriamente ineficaces porque están basados en la separación del ácido nucleico de otras sustancias presentes en el lisado y, así pues, muchos blancos iniciales no se recuperan. En el presente método, donde las sustancias inhibidoras se eliminan previamente a la lisis celular, no es necesaria tal separación subsiguiente y se obtienen mejores rendimientos de blanco inicial.

Las muestras que pueden ser sometidas al método de la presente invención incluyen virtualmente todas las muestras clínicas humanas y veterinarias tales como muestras de esputo, muestras de sangre, muestras de orina, muestras de líquido cefalorraquídeo (``LCF'') y otras, muestras medioambientales tales como muestras de agua, aire y suelo, y muestras de alimentos. Las muestras que pueden ser sometidas al método de la presente invención son sospechosas de contener células con una secuencia de ácido nucleico blanco a someter a un proceso de hibridación tal como la hibridación directa de sondas o la hibridación de un cebador para la iniciación de un proceso de amplificación.

Las sustancias que son inhibidoras de procesos de hibridación de ácidos nucleicos y se encuentran típicamente en tales muestras incluyen materiales proteináceos y ADN humano en muestras humanas y ADN animal en muestras veterinarias. Como se discutió en la sección de antecedentes anterior, se sabe que estas sustancias son inhibidoras de procesos de amplificación de ácidos nucleicos tales como SDA, PCR, LCR, NASBA, TMA y otros.

El primer paso del método de la presente invención es poner en contacto la muestra con un agente en el que la sustancia inhibidora es soluble y que no efectúa la liberación del ácido nucleico de las células. Este contacto puede ocurrir en cualquier momento previo a la lisis de las células para liberar el ácido nucleico blanco. No obstante, un momento preferido para poner en contacto las células con un tal agente es tras alguna manipulación de la muestra para concentrar la ubicación de las células o apastillar las células. Típicamente, tal concentración es resultado de la centrifugación, aunque también puede ser resultado de una filtración o una adsorción selectiva.

Tal concentración de las células proporciona una mayor garantía de que el agente entrará en contacto con las células y permite un uso más eficiente del agente debido a la ubicación definida de las células. La puesta en contacto de las células con el agente es preferiblemente un lavado relativamente breve de las células. Típicamente, el contacto de las células y el agente dura hasta aproximadamente cinco minutos.

Muchos agentes son útiles en un método contra la inhibición de procesos de hibridación de ácidos nucleicos. Entre los ejemplos de tales agentes útiles se incluyen caótropos y detergentes que son bien conocidos para los diestros en la técnica tales como Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40, Brij 35, Brij 58, Tween 20®, Tween 80®, octil glucósido, octil tioglucósido, Chaps, ioduro sódico, perclorato sódico, ioduro potásico, tiocianato sódico, tiocianato potásico, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, tricloroacetato sódico, trifluoroacetato sódico y urea. Otros agentes útiles en tal método pueden ser identificados por alguien diestro en la técnica con una expectativa de éxito razonable realizando ensayos de cribado rutinarios dirigidos hacia las dos características primarias de tales agentes: grado de solubilización de sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos y ausencia de efectuación de la liberación de ácidos nucleicos de las células.

Brevemente, se pone un agente en contacto con las células, se centrifugan las células y se lleva a cabo en el sobrenadante una reacción de amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco común a las células en un ensayo de cribado rutinario. Si la secuencia blanco se amplifica, entonces el agente no cumple los requisitos para uso en el método, ya que ha efectuado la liberación del ácido nucleico de las células, mientras que la ausencia de amplificación de la secuencia blanco y la amplificación de una secuencia de control interno indicaría que el agente puede ser útil en el método de la presente invención. A continuación, el agente que no ha efectuado la liberación del ácido nucleico de las células se pone en contacto con sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos conocidas y se determina rápidamente el grado de solubilización de la sustancia inhibidora en un ensayo de cribado rutinario. Aquellos agentes que solubilizan la sustancia inhibidora son útiles en el método para inhibir procesos de hibridación de ácidos nucleicos.

La concentración y la cantidad del agente utilizadas en tal método dependen del tipo de muestra que se esté sometiendo al método. En la tabla 1 a continuación se presentan ejemplos de concentraciones adecuadas de caótropos y detergentes para uso en tal método.

TABLA 1 Concentraciones de caótropo/detergente

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Caótropo/detergente \+ Concentraciones\cr  Triton
X  -  100® \+ 0,024 mM; 0,24 mM; 2,4 mM\cr  Triton
X  -  114® \+ 0,021 mM; 0,21 mM; 2,1 mM\cr 
NP  -  40 \+ 0,029 mM; 0,29 mM; 2,9 mM\cr  Brij 35 \+
0,009 mM; 0,09 mM; 0,9 mM\cr  Brij 58 \+ 0,0077 mM; 0,077 mM; 0,77
mM\cr  Tween 20® \+ 0,006 mM; 0,06 mM; 0,6 mM\cr  Tween 80® \+
0,0012 mM; 0,012 mM; 0,12 mM\cr  Octil glucósido \+ 2,4 mM; 24 mM\cr
 Octil tioglucósido \+ 0,9 mM; 9,0 mM\cr  Chaps \+ 0,9 mM; 9,0 mM\cr
 NaI \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr  NaClO _{4}  \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5
M, 6 M\cr  KI \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr  NaSCN \+ 2 M, 3 M, 4 M,
5 M, 6 M\cr  KSCN \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr  Isotiocianato de
guanidina \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr  Tricloroacetato sódico \+ 2
M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr  Trifluoroacetato sódico \+ 2 M, 3 M, 4 M,
5 M, 6 M\cr  Urea \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6
M\cr}

Generalmente, el volumen del agente usado en tal método es al menos igual al volumen de muestra. Más particularmente, la relación volumen:volumen del agente a la muestra es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1. También, generalmente, es preferible que el agente se prepare como disolución básica, determinándose los pHs más preferibles para agentes particulares mediante un ensayo de cribado rutinario basado, por ejemplo, en los experimentos presentados en el ejemplo 3 aquí expuesto, en el que se encontró que una disolución de isotiocianato de guanidina 6,0 M de pH 9,0 era particularmente ventajosa para reducir la cantidad de sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos. La concentración (molaridad) óptima de un agente particular puede determinarse asimismo usando el mismo tipo de ensayo de cribado rutinario basado en los experimentos presentados en el ejemplo 3 aquí expuesto. También, generalmente, el agente se pone en contacto con la muestra a temperatura ambiente.

Cuando el agente se pone en contacto con las células de la muestra, las sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos resultan solubilizadas por el agente, lavándose así tales sustancias de las paredes de las células. Puesto que los agentes adecuados no efectúan la liberación del ácido nucleico de las células, no es motivo de preocupación la pérdida de ácido nucleico blanco cuando se separe el agente de las células.

No obstante, los agentes usados en el método de la presente invención pueden afectar también adversamente a los procesos de hibridación de ácidos nucleicos y, así pues, tales agentes se separan subsiguientemente de las células. Tal separación puede conseguirse mediante cualquier medio adecuado tal como filtración o lavado y centrifugación con o sin un tampón en el que el agente es soluble. Preferiblemente, se utiliza un tal tampón con el fin de asegurar la eliminación de las sustancias inhibidoras así como el agente previamente a la lisis celular. Así pues, cuando tales células se someten a lisis, el ácido nucleico blanco se encuentra en un entorno con mínimas cantidades de sustancias inhibidoras del proceso de hibridación al que se va a someter el ácido nucleico blanco.

Actualmente se utilizan una variedad de procesos para preparar ácidos nucleicos blanco en muestras para hibridación o amplificación. Por ejemplo, las muestras de esputo que se procesan para amplificar secuencias de ácido nucleico micobacteriano se someten típicamente a un proceso con NALC/NaOH. El método de la presente invención puede ser particularmente útil con muestras micobacterianas sometidas a tal proceso con NALC/NaOH debido a su solubilización selectiva de las pastillas de NALC/NaOH para reducir el aglutinamiento de tales muestras. Similarmente, otros tipos de muestras clínicas se someten a otros procesos estándar bien conocidos, por ejemplo centrifugación para muestras de gran volumen como sangre y orina. El método de la presente invención puede usarse antes, como parte de, o después de esos procesos estándar, con tal de que el método se practique previamente a la lisis de las células que contienen el ácido nucleico blanco.

El método de la presente invención no requiere la fijación y liberación cuantitativa de ácido nucleico blanco en una superficie de fijación, y así pues permite el uso de más muestra que la que convencionalmente se utiliza en ensayos de amplificación o hibridación basados en ácidos nucleicos. Esa habilidad de usar más muestra confiere una mayor sensibilidad a tales ensayos, ya que hay más ácido nucleico blanco presente en las etapas iniciales del ensayo. La selectividad de los agentes al solubilizar las sustancias inhibidoras pero no solubilizar de forma concomitante el ácido nucleico blanco o las paredes celulares es una de las características de los agentes que contribuye a los resultados del método de la presente invención como se evidencia en los ejemplos expuestos a continuación.

Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones específicas de la invención aquí descrita. Como resultará patente para los artesanos diestros, son posibles varios cambios y modificaciones que se contemplan dentro del alcance de la invención descrita.

Ejemplo 1 Comparación del método de la presente invención con un método de procesado de muestras de control

El propósito de este ejemplo era determinar si un método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos en una muestra clínica y por lo tanto arroja mejores valores de detección del blanco en comparación con un método de procesado de muestras estándar de control.

Materiales Reactivos de procesado de la muestra:

\bullet: Perclorato sódico (Sigma)

\bullet: Tiocianato sódico (Sigma)

\bullet: Tiocianato de guanidina (Sigma)

\bullet: H_{2}O destilada por ósmosis inversa (``RODI'')

\bullet: MycroPrep (BBL)

\bullet: Diluyente de muestras MAC/TB

\bullet: Disolución de tampón fosfato (BBL)

\bullet: Cápsulas que contienen perlas de circonio (Becton Dickinson)

\bullet: Muestras de esputo clínicas; identificadores de muestra 785, 657, 634, 8594, 8894, 13883, 8396, 13867, 13088 y 146

\bullet: Células de complejo micobacteriano M. avium (``MAC'')

Reactivos de amplificación

\bullet: H_{2}O RODI

\bullet: KPO_{4} 500 mM

\bullet: PBA 50x

\bullet: dCAG 50x

\bullet: BSA, 5 mg/ml

\bullet: DTT 100 mM

\bullet: Trehalosa al 50%

\bullet: UDG, 1 U/ul

\bullet: Magnesio 192 mM

\bullet: dU 50x

\bullet: UDI, 5 U/ul

\bullet: Bst, 120 U/ul

\bullet: Bso BI, 160 U/ul

\bullet: Control de amplificación interno (``IAC'') 10^{3}

\bullet: Glicerol al 55%

\bullet: DMSO

\bullet: ADN placental humano

\bullet: Antiespumante

\bullet: Diluyente del blanco

Reactivos de detección

\bullet: Mezcla de hibridación de M tb.

\bullet: Sondas de MAC

\bullet: Diluyente de hibridación

\bullet: Mezcla de hibridación del IAC

\bullet: Fluido del sistema

\bullet: Fluido de lavado

\bullet: Dispositivo de ensayo (``AD'')

\bullet: LUMIPHOS 530

\bullet: Tubos Labcraft® de 2,0 ml

\bullet: Calibradores de ensayo de MAC

\bullet: Calibradores de ensayo

Procedimiento

Se preparó NaClO_{4} en concentración 2 M en agua destilada. Se preparó NaSCN en concentración 3 M en agua destilada. Se preparó GuSCN en concentración 4 M en agua destilada. Se dispensaron cada una de estas tres disoluciones caotrópicas en diez tubos LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0 ml/tubo. Se dispensó una alícuota de 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB en diez tubos LabCraft® de 2,0 ml.

Se descongelaron hasta temperatura ambiente diez muestras de esputo clínicas. Se añadió tampón MycoPrep en un volumen igual a los volúmenes de las muestras de esputo; se sometieron a vórtice las muestras y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Se añadió entonces tampón fosfato a cada muestra para ajustar el volumen total de cada muestra a 50 ml. Las muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron con una fuerza centrífuga relativa (FCR) de 3.000 durante 20 minutos. Se decantó el sobrenadante, se añadieron 2,0 ml de tampón fosfato a cada muestra y se sometieron a vórtice las muestras. Las muestras resultantes se doparon con células MAC a razón de 75 partículas/ml.

Se dispensó entonces una alícuota de 500 ul de cada muestra en los cuatro tipos de tampón de lavado descritos (tampón de muestra, NaClO_{4} 2 M, NaSCN 3 M y GuSCN 4 M a razón de 1,0 ml/tubo, véase anteriormente). Las muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla con 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB, y luego se centrifugó con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. De nuevo, se decantó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla con 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB y se centrifugó con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos.

Se insertó una cápsula que contenía perlas de circonio en cada tubo, y se resuspendió cada pastilla con 400 ul de tampón de muestra MAC/TB. Las muestras se calentaron durante 30 minutos a 105ºC en un horno de aire caliente forzado para producir la lisis de las células micobacterianas y convertir cualquier organismo micobacteriano en no infeccioso. Se cargaron entonces los tubos de muestra en un instrumento Savant CellPrep™ que se hizo funcionar con un parámetro de 5,0 m/s durante 45 segundos para separar los ácidos nucleicos de otros componentes celulares. Las muestras se procesaron entonces adicionalmente en un sistema de amplificación y detección de MAC/TB como sigue.

Se efectuó una SDA termofílica esencialmente como se describe en la solicitud de patente europea publicada con el nº 0 684 315 en una mezcla de reacción que comprendía fosfato potásico 25 mM de pH 7,6, 100 \mug/ml de albúmina sérica bovina acetilada (BSA), dUTP 0,5 mM, dATP y dGTP cada uno 0,2 mM, y 2'-desoxicitidin 5'-O-(1-tiotrifosfato) (\alpha-tio dCTP) 1,4 mM, glicerol al 12%, acetato magnésico 6,5 mM, cebadores de amplificación 0,5 \muM, cebadores deflectores 0,05 \muM, 50 ng de ADN placental humano, 12,5 unidades de polimerasa Bst, 160 unidades de BsoBI, 1 unidad de uracil-N- glicosilasa (UNG) y 2 unidades de inhibidor de la uracil-N-glicosilasa (Ugi).

Previamente a la adición de las enzimas y la iniciación de la reacción de amplificación, se llevaron a ebullición las muestras durante 2 minutos. Las muestras se incubaron entonces a 41ºC durante 2 minutos y se añadió UNG para degradar cualquier amplicón contaminante. Tras 30 minutos de incubación con UNG, se transfirieron las muestras a 52ºC durante 5 minutos. Se añadió la mezcla enzimática (polimerasa Bst, BsoBI, Ugi y glicerol) y se dejó proceder la amplificación durante 30 minutos a 52ºC. La reacción se detuvo por ebullición durante 5 minutos.

Los productos de amplificación se detectaron en un ensayo de quimioluminiscencia esencialmente como el descrito por C. A. Spargo y otros (Molec. Cell. Probes 7, 395-404, 1993). Se añadieron sondas de detector etiquetadas con fosfatasa alcalina para M. tb, MAC e IAC, sondas de captura biotiniladas para M. tb, MAC e IAC, y las muestras al pocillo de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se incubaron durante 50 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron entonces tres veces con tampón astringente. Se añadió LUMIPHOS (Lumigen, Inc.) y se incubó la reacción durante 30 minutos a 37ºC. Se detectó la luminiscencia en un luminómetro (Dynatech) y se registraron las unidades de luz relativas (RLUs).

Resultados

Los resultados se proporcionan en la tabla a continuación, como los valores medios de M. tb, MAC e IAC para las diez muestras, y en forma gráfica en la figura 1.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
  Caótropo  \+ TB (RLU)  \+ MAC (RLU)  \+ IAC (RLU) \\\hline 
NaClO _{4}  2 M  \+ 0,42  \+ 189,1  \+ 157,4 \\\hline  NaSCN 3 M  \+
0,42  \+ 166,6  \+ 122,5 \\\hline  GuSCN 4 M  \+ 0,5; 11,91*  \+
196,1  \+ 87,7 \\\hline  Control  \+ 0,6; 2,33*  \+ 36,2  \+ 54,1
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

* Ambos métodos de lavado tenían la misma muestra con valores de M. tb. positivos, lo que indica un posible diagnóstico erróneo en el centro clínico.

Conclusiones

Los datos de este ejemplo indican que, estadísticamente, no hay diferencia en los valores de IAC para ninguna de las condiciones de lavado; no obstante, resulta interesante el que los valores medios de todas las condiciones de agente sean más altos que los del procedimiento de lavado de control. Los datos muestran también estadísticamente que la condición de GuSCN 4 M produjo valores de RLU de MAC específicamente más altos que ninguna de las otras tres condiciones. Eso indica que el método de la presente invención como se practicó aquí no daña a la micobacteria y, de hecho, en el caso del GuSCN 4 M, mejora la recuperación del organismo MAC y subsiguientemente el ADN blanco.

Ejemplo 2 Cribado de muestras clínicas en función de la inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos

El propósito de este ejemplo era cribar muestras clínicas en función de la inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos.

Materiales Reactivos de procesado de la muestra

\bullet: Reactivo MycoPrep

\bullet: Tampón fosfato BBL, pH 6,8

\bullet: Diluyente de muestras TB/MAC

\bullet: Esputos de cultivo negativo y frotis negativo procedentes de N. Carolina Public Health [Salud Pública de Carolina del Norte], identificadores de muestra 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243 y 103

\bullet: Cápsulas que contienen perlas de circonio

Reactivos de amplificación

Los mismos que para el ejemplo 1 y un plásmido IN2 de control.

Reactivos de ensayo

Los mismos que para el ejemplo 1.

Procedimiento

Se descongelaron hasta temperatura ambiente veintitrés muestras de esputo clínicas. Cualquier esputo con más de 12 ml de esputo se dividió a un tubo separado, de modo que el rango de volúmenes de una cualquiera de las muestras de esputo procesadas fuera 7,5 y 12 ml.

Se añadió reactivo MycoPrep a las muestras de esputo en un volumen igual al volumen de esputo. Las muestras se sometieron a vórtice y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. El volumen de cada disolución de esputo se ajustó a 50 ml con tampón fosfato.

Se centrifugaron las disoluciones con una FCR de 3.000 durante 20 minutos. Se decantó el sobrenadante de cada pastilla de muestra y se añadieron 2,0 ml de tampón fosfato a cada tubo. Las muestras se dividieron en alícuotas de 500 ul en tubos LabCraft® de 2,0 ml. Una muestra de cada tipo se mantuvo a temperatura ambiente y las muestras restantes se almacenaron a -70ºC.

Se añadió un ml de tampón de muestra MAC/TB a cada muestra mantenida a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante, se añadió 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB a cada tubo y se centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante, se añadió una cápsula que contenía perlas de circonio a cada tubo y dispensaron 400 ul de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo. Los tubos se calentaron en un horno de aire caliente forzado a 105ºC durante 30 minutos para producir la lisis de las células micobacterianas y convertir cualquier organismo micobacteriano en no infeccioso. Se agitaron los tubos en un instrumento Savant CellPrep™ usando el parámetro de 5,0 m/s durante 45 segundos. Se usaron un ensayo de desplazamiento de hebra termofílica (tSDA) usando el líquido de triple MAC/TB y procedimientos de detección como los descritos en el ejemplo 1 para generar los resultados de este experimento en unidades de luz relativas (RLUs).

Resultados

Los resultados se presentan en la tabla a continuación.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
 ID de muestra  \+ M TB (RLU)  \+ MAC (RLU)  \+ IAC (RLU) \\\hline 
8207  \+ 0,3  \+ 5,3  \+ 0,3 \\\hline  13506  \+ 0,3  \+ 3,8  \+ 0,7
\\\hline  13472  \+ 0,3  \+ 3,9  \+ 12 \\\hline  14199  \+ 0,3  \+
2,1  \+ 44 \\\hline  13847  \+ 0,3  \+ 2,9  \+ 116 \\\hline  3675 
\+ 0,3  \+ 2,4  \+ 24 \\\hline  6401  \+ 0,4  \+ 0,9  \+ 0,7
\\\hline  4691  \+ 0,4  \+ 1,3  \+ 2 \\\hline  13545  \+ 0,4  \+ 4,0
 \+ 16 \\\hline  13711  \+ 0,3  \+ 2,3  \+ 69 \\\hline  9939  \+ 0,3
 \+ 2,0  \+ 10 \\\hline  1514  \+ 0,3  \+ 2,7  \+ 50 \\\hline  12228
 \+ 0,3  \+ 0,7  \+ 7 \\\hline  12161  \+ 0,2  \+ 3,5  \+ 6 \\\hline
 8406  \+ 0,4  \+ 1,6  \+ 8 \\\hline  782  \+ 0,3  \+ 1,5  \+ 0,4
\\\hline  13547  \+ 0,6  \+ 2,4  \+ 41 \\\hline  13319  \+ 0,9  \+
3,0  \+ 10 \\\hline  243  \+ 0,5  \+ 0,7  \+ 106 \\\hline  13448  \+
0,4  \+ 1,1  \+ 0,8 \\\hline  13420  \+ 0,4  \+ 1,2  \+ 54 \\\hline 
103  \+ 0,8  \+ 0,5  \+ 123 \\\hline  12227  \+ 0,5  \+ 1,4  \+ 66
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Conclusiones

De las veintitrés muestras clínicas ensayadas en el sistema MAC/TB, nueve produjeron valores de IAC de menos de 10 RLUs, lo que indica una severa inhibición de la reacción de amplificación/detección por parte de la muestra clínica. Estos especímenes inhibidores producidos bajo condiciones de lavado ``estándar'' de la muestra se procesaron adicionalmente como se muestra en los ejemplos a continuación.

Ejemplo 3 Ajustes del pH y la molaridad de una disolución caotrópica

El propósito de este ejemplo era determinar si se podían ajustar el pH y la molaridad del lavado con GuSCN para eliminar más inhibidores de las muestras clínicas.

Materiales Reactivos de procesado de la muestra

\bullet: Muestras apastilladas tratadas con NALC negativas, nºs. 6401, 8406, 782, 13448 y 13506 del ejemplo 2

\bullet: Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL

\bullet: Tampón de muestra MAC/TB

\bullet: Cápsulas que contienen perlas de circonio

\bullet: Fosfato potásico (KPO_{4}) 500 mM

\bullet: NaOH 5 N Ricca

\bullet: Células micobacterianas M. tb.

Reactivos de amplificación

Los mismos que para el ejemplo 1.

Reactivos de ensayo

Los mismos que para el ejemplo 1.

Procedimiento

Se preparó una mezcla inhibidora tratada con NALC negativa dispensando 1,0 ml de la muestra 782 y 500 ul de las muestras 6401, 8406, 13448 y 13506 en un tubo de polipropileno de 2 ml. La mezcla inhibidora se dopó con organismos M. tb a razón de 200 partículas/ml (7,5 partículas/reacción tSDA final). Las disoluciones de GuSCN se prepararon como se resume en la tabla a continuación. Las disoluciones de pH 7,0 y 9,0 se ajustaron al pH indicado con NaOH 5 N.

Disoluciones caotrópicas

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline
 GuSCN 6,0 M, pH 4,9  \+ GuSCN 4,0 M, pH 5,6 \\\hline  GuSCN 6,0 M,
pH 7,0  \+ GuSCN 4,0 M, pH 7,0 \\\hline  GuSCN 6,0 M, pH 9,0  \+
GuSCN 4,0 M, pH 9,0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Se dispensó cada disolución de GuSCN en un tubo LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0 ml/tubo. La mezcla inhibidora tratada con NALC negativa dopada se dispensó en cada tubo que contenía GuSCN a razón de 500 ul/tubo.

Se sometieron a vórtice brevemente los tubos y se centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo y se centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo. Se centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se insertó una cápsula que contenía circonio en cada tubo.

Se decantó tampón de muestra MAC/TB en cada tubo a razón de 400 ul/tubo. Se calentaron los tubos en un horno de aire caliente forzado a 105ºC durante 30 minutos. Se agitaron los tubos en un instrumento Savant CellPrep™ utilizando el parámetro de 5,0 m/s durante 45 segundos. Se utilizaron un ensayo tSDA usando el líquido de triple MAC/TB y los procedimientos de detección descritos en el ejemplo 1 para generar los resultados de este experimento en unidades de luz relativas (RLUs).

Resultados

Los resultados se presentan en la tabla a continuación y en forma gráfica en la figura 2.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  GuSCN (M)  \+ pH  \+ RLUs M TB  \+ RLUs MAC  \+ RLUs IAC \\\hline 
4  \+ 5,7  \+ 2,4  \+ 0,3  \+ 1,9 \\\hline  6  \+ 4,9  \+ 1,5  \+
0,4  \+ 0,7 \\\hline  4  \+ 7  \+ 2,4  \+ 0,4  \+ 1,3 \\\hline  6 
\+ 7  \+ 32,8  \+ 0,4  \+ 6,6 \\\hline  4  \+ 9  \+ 2,6  \+ 0,4  \+
5,3 \\\hline  6  \+ 9  \+ 1022,7  \+ 0,4  \+ 320,4
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Nota: los valores de M.tb., MAC e IAC son las medias de cinco muestras de amplificación/detección replicadas.

Conclusión

La condición de GuSCN 6,0 M de pH 9,0 produjo valores de RLU para M. tb. e IAC estadísticamente mejores que las otras condiciones, sin producir valores de MAC no específicos. Eso indica que se elimina una mayor cantidad de inhibidores de la hibridación de ácidos nucleicos usando la disolución de GuSCN 6,0 M de pH 9,0, sin liberar ácido nucleico blanco de las micobacterias.

Ejemplo 4 Lavado con GuSCN (a 6 M y pH 9,0) usando muestras clínicas negativas dopadas con M.tb.

El propósito de este ejemplo era determinar si muestras clínicas dopadas con M.tb. y lavadas con la disolución de GuSCN 6 M de pH 9,0 eliminarían los inhibidores de la hibridación de ácidos nucleicos no deseados y permitirían la amplificación y detección del ADN específico de M. tb. blanco.

Materiales Reactivos de procesado de la muestra

\bullet: Muestras apastilladas tratadas con NALC negativas, nºs. 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243 y 103

\bullet: Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL

\bullet: Tampón de muestra MAC/TB

\bullet: Cápsulas que contienen perlas de circonio

\bullet: Fosfato potásico (KPO_{4}) 500 mM

\bullet: NaOH 5 N Ricca

Reactivos de amplificación

Los mismos que para el ejemplo 1.

Reactivos de ensayo

Los mismos que para el ejemplo 1.

Procedimiento

Se preparó una disolución de GuSCN en concentración 6 M con KPO_{4} 200 mM y se ajustó a pH 9,0 con NaOH 5 N como en el ejemplo 3. Se doparon con organismos M. tb. 500 ul de cada muestra clínica de la sección Materiales del ejemplo 2 a razón de 200 partículas/ml (7,5 partículas/reacción de amplificación). Algunas de estas muestras del ejemplo 2 eran inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos. Se doparon con M. tb 500 ul de tampón MAC/TB a razón de 200 partículas/ml y se etiquetaron como ``control de procesado de la muestra''.

Se dispensó la disolución de GuSCN en un tubo LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0 ml y se etiquetó el tubo como ``control negativo de GuSCN''. Se dispensó un ml de la disolución GuSCN 6 M de pH 9,0 en cada tubo de muestra clínica.

Los tubos se sometieron a vórtice y se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón MAC/TB en cada tubo y los tubos se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo; los tubos se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se añadió una cápsula de circonio a cada tubo. Se añadió tampón de muestra MAC/TB a cada tubo a razón de 400 ul/tubo. Los tubos se calentaron y agitaron como se describió en los ejemplos anteriores. Se utilizaron un ensayo tSDA usando el líquido de triple MAC/TB y procedimientos de detección descritos en el ejemplo 1 para generar los resultados de este experimento en unidades de luz relativas (RLUs).

\newpage

Resultados

Los resultados se presentan en una tabla a continuación como la media de tres réplicas de amplificación para cada muestra procesada y en forma gráfica en las figuras 3A y 3B.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
 ID Muestra clínica  \+ M TB (RLUs)  \+ IAC (RLUs) \\\hline  8207 
\+ 1515,7  \+ 298,9 \\\hline  1514  \+ 1290,5  \+ 200,8 \\\hline 
13472  \+ 223,5  \+ 79,6 \\\hline  14199  \+ 1004,8  \+ 263,4
\\\hline  13847  \+ 1342,1  \+ 154,3 \\\hline  3675  \+ 294,7  \+
20,2 \\\hline  6401  \+ 279,5  \+ 71,6 \\\hline  13545  \+ 396,5  \+
43,6 \\\hline  13711  \+ 275,5  \+ 32,8 \\\hline  9939  \+ 335  \+
134,6 \\\hline  12227  \+ 1144,1  \+ 185,4 \\\hline  12228  \+ 297,7
 \+ 43,6 \\\hline  12161  \+ 778,1  \+ 66,6 \\\hline  8406  \+ 478,6
 \+ 90,9 \\\hline  4691  \+ 344,6  \+ 15,3 \\\hline  13547  \+
1271,9  \+ 188 \\\hline  13448  \+ 358,5  \+ 16,3 \\\hline  13506 
\+ 1470,4  \+ 101,8 \\\hline  13319  \+ 993,7  \+ 88 \\\hline  13420
 \+ 1490,5  \+ 305 \\\hline  243  \+ 1406,2  \+ 117,9 \\\hline  103 
\+ 1052,2  \+ 132,5 \\\hline  782  \+ 158,9  \+ 171,3 \\\hline 
Control negativo GuSCN  \+ 1,8  \+ 91,7 \\\hline  Control M. tb y
tampón  \+ 568,5  \+ 37,9
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Conclusión

Veintitrés valores de IAC dieron valores de tSDA aceptables superiores a 10 RLUs, lo que indica que no se inhibió la reacción de amplificación. Además, se detectó M.tb. a razón de 7,5 partículas/reacción de amplificación en todas las muestras dopadas, como evidencian la relaciones de las RLU específicas con las de fondo menores de 88,2:1 para cada muestra. En el ejemplo 2, se demostró que cinco de las muestras clínicas con las que no se usaba lavado con GuSCN tenían valores de IAC inhibidores de menos de 10 RLUs. Se consiguieron mejoras en casi todas las muestras (incluso en las que se mostraron como inhibidoras por la baja generación de señal en el ejemplo 2) con el método de la presente invención como se practica en este ejemplo.

Si bien se ha descrito la invención con cierta especificidad, pueden realizarse modificaciones patentes para quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica sin salirse del alcance de la invención. Varias características de la invención se exponen en las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un método para reducir la cantidad de sustancias que son inhibidoras de procesos de hibridación de ácidos nucleicos en una muestra que contiene células seleccionadas del grupo consistente en complejo M. avium y células de M. tuberculosis que comprende los pasos de:

(a): previamente a la lisis de las células, poner en contacto dichas células con un agente caótropo, seleccionado de entre el grupo consistente en NaClO_{4}, NaSCN y/o isotiocianato de guanidina, que (i) solubiliza dichas sustancias y (ii) no efectúa la liberación del ácido nucleico de dichas células; y

(b): separar dichas células de dicho agente.

2. El método de la reivindicación 1 en el que el caótropo es isotiocianato de guanidina.

3. El método de la reivindicación 2 en el que el isotiocianato de guanidina está presente en una disolución con un pH básico.

4. El método de la reivindicación 3 en el que el pH es aproximadamente 9,0.

5. El método de la reivindicación 3 en el que la concentración de isotiocianato de guanidina es aproximadamente 6 M.

6. El método de la reivindicación 1 en el que la separación es mediante lavado y centrifugación.

7. El método de la reivindicación 1 en el que previamente al paso (a) se apastillan las células.