ES2197454T3 - Procedimientos y medios relacionados con la integracion de retrovirus y un retrotransposor. - Google Patents

Abstract

KU (KU70 Y KU89) DE LEVADURA Y CELULAS DE MAMIFEROS Y OTROS COMPONENTES INTERVIENEN EN LA REPARACION DEL DNA RELACIONADO CON KU INTERVIENEN EN LA INTEGRACION DE RETROTRANSPOSON Y RETROVIRUS, EN EL ACIDO NUCLEICO CELULAR. LOS AGENTES QUE INHIBEN LA ACTIVIDAD DE ESTA VIA SON UTILES PARA LA INHIBICION DE LOS RETROVIRUS. ESTOS AGENTES PUEDEN OBTENERSE UTILIZANDO ENSAYOS EN LOS QUE INTERVENGA LA VIA DE REPARACION DEL DNA RELACIONADO CON KU Y UNO O MAS DE SUS COMPONENTES.

Description

Procedimientos y medios relacionados con la integración de un retrovirus y un retrotransposón.

La presente invención hace referencia a los procesos por los que retrovirus y retrotransposones (retroposones) insertan su material genético en el genoma de una célula huésped eucariota, con el fin de llevar a cabo un ciclo de infección productiva. Más específicamente, hace referencia a aquellas proteínas de la célula huésped, que recientemente se ha demostrado, que son necesarias para una retrotransposición eficaz y que están altamente conservadas en el reino eucariótico, pero no se necesitan para la función celular en condiciones normales. Estas proteínas representan nuevas dianas para los fármacos anti-retrovirales. Además, se proporcionan los sistemas de ensayo que, junto con los fármacos anti-retrovirales, pueden analizarse y estudiarse in vivo e in vitro.

La invención está basada en el descubrimiento sorprendente, al contrario de los anteriores conocimientos, de que los mecanismos de reparación del DNA asociados a Ku están implicados en la integración del ácido nucleico de retrovirus y retrotransposones. La actividad de retrovirus y/o retrotransposones se muestra mediante el trabajo experimental descrito aquí, dicha actividad se inhibe tanto en células de levaduras como de mamífero cuando la función Ku de las células está reducida.

Retrovirus y retrotransposones

Los retrovirus son virus de RNA que han de insertar una copia de DNA (cDNA) de su genoma en el cromosoma de la célula huésped, con el fin de llevar a cabo una infección productiva. Una vez integrado, el virus se denomina provirus (Varmus, 1988). Algunos elementos de DNA transposables eucarióticos están relacionados con los retrovirus ya que se transponen mediante un RNA intermediario. Estos elementos, denominados retrotransposones o retroposones, se transcriben en RNA, el RNA se copia en DNA de cadena doble (ds) y luego el dsDNA se inserta en el genoma de la célula huésped.

La evidencia disponible indica que la integración de retrovirus y retrotransposones tiene lugar mediante mecanismos totalmente análogos y que los retrovirus pueden considerarse como retrotransposones con una fase extracelular de su ciclo de vida. Por ejemplo, se ha demostrado que los retrotransposones Ty1 y Ty5 de la levadura Saccharomyces cerevisiae se integran en el genoma de la levadura huésped mediante el mismo tipo de mecanismo utilizado por los retrotransposones y retrovirus de mamífero para integrarse en el DNA de la célula huésped de mamífero (Boeke y col., 1985; Garfinkel, 1985; Grandgenett y Mumm, 1990; Boeke y Sandmeyer, 1991).

Los retrovirus representan un riesgo considerable para la salud del hombre y de los animales, tal como evidencia el hecho de que los retrovirus causan enfermedades como el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA; causado por el virus de la inmunodeficiencia humana; VIH-1), diversos cánceres animales y leucemias/linfomas de células T de hombre adulto (Varmus, 1988); también los retrovirus se han asociado a una diversidad de trastornos comunes, incluyendo la diabetes de tipo I y la esclerosis múltiple (Conrad y col., 1997; Perron y col., 1997 y Benoist y Mathis, 1997). En muchos de los casos, pero no en la mayoría, la formación del cáncer por ciertos retrovirus es una consecuencia del transporte de oncogenes por el virus. Además, la integración retroviral y la retrotransposición pueden dar como resultado la inactivación mutagénica de los genes en sus sitios de inserción, o pueden dar como resultado la expresión anómala de genes adyacentes del huésped, pudiendo tener ambos efectos consecuencias perniciosas para el organismo huésped. Los retrovirus también se utilizan cada vez más para liberar genes y por ello desempeñan cada vez más un importante papel en la terapia génica. En consecuencia, el conocimiento de cómo funcionan los retrovirus y cómo pueden ser controlados es de una gran importancia comercial y médica.

En los últimos años, se ha dirigido una gran cantidad de esfuerzo hacia la identificación de inhibidores de la infección retroviral, ya que estos agentes tienen una utilización potencial para combatir las enfermedades de origen retroviral. Hasta ahora, la mayoría de programas de desarrollo de fármacos se ha focalizado en los productos codificados por los virus. Sin embargo, dado el ciclo corto de vida de los retrovirus y de sus elevadas tasas inherentes de cambio genético, se anticipa que un problema frecuente con dichas estrategias será la aparición de derivados de virus, resistentes a fármacos con alteraciones en la molécula diana codificada por el virus (por ejemplo, Sandstrom y FGolks, 1996 y las referencias aquí incluidas). Por ello, muchos de los fármacos anti-retrovirales que interfieren con las proteínas codificadas por los virus pueden tener solamente una duración de vida útil limitada. Otra limitación de los fármacos dirigidos contra proteínas víricas es que muchos no tendrán una amplia aplicabilidad y serán de forma intrínseca altamente específicos contra un virus en particular, o incluso contra una determinada cepa de un virus en particular.

Integración retroviral

A partir de lo que se conoce sobre el ciclo de la vida de los retrovirus, una diana atractiva para la terapéutica anti-retroviral sería la interferencia con la integración del cDNA viral en el genoma del huésped. Además, este suceso es esencial para la propagación viral eficiente (por ejemplo, Sakai y col., 1993; para revisiones, ver Vamus, 1988; Grandgenett y Mumm, 1990). Y, ya que procesos de tipos similar no parecen ser esenciales para el funcionamiento de las células huésped normales en crecimiento, no es de esperar que los inhibidores de la integración retroviral sean tóxicos para el huésped.

A la luz de estas y otras consideraciones, las transcriptasas inversas y las integrasas se consideran dianas adecuadas para el desarrollo de fármacos. Aunque, se ha obtenido cierto éxito, las elevadas tasas de cambio genético dirigido por los virus y las variaciones entre las diferentes cepas virales probablemente limiten el alcance de los fármacos anti-transcriptasa inversa y anti-integrasa, en particular a largo plazo.

Un modo de superar los problemas subrayados anteriormente sería identificar las proteínas de la célula huésped que son necesarias para una integración retroviral eficaz y producir fármacos que inhiban dichas moléculas. En primer lugar, sería muy difícil o imposible para el virus mutar de modo que pueda evadirse de la acción del fármaco. En segundo lugar, dicha proteína de la célula huésped se esperaría que fuera necesaria para la propagación de la mayoría de los retrovirus, lo que significa que los fármacos que interfieran con estos retrovirus serían eficaces contra un amplio espectro de tipos de retrovirus.

Hasta ahora, la idea de utilizar un factor del huésped (o factores del huésped) necesario para la integración retroviral, pero no necesario para el crecimiento normal de la célula parecía improbable. Ello se basaba en que varias líneas de investigación indicaban que todos las etapas necesarias para la unión covalente del cDNA del retrovirus, o del retrotransposón con la molécula de DNA diana podían realizarse in vitro, mediante la proteína integrasa retroviral purificada (por ejemplo, Craigie y col., 1990; Bushman y col., 1990; Katz y col., 1990; Grandgenett y Mumm, 1990). Además, aunque los factores del huésped estaban concebidos para ayudar a la integración viral, se asumía que estos factores correspondían con las proteínas ``de expresión basal'', que son esenciales para la viabilidad celular del huésped. En consecuencia, si las proteínas ``auxiliares'' del huésped existieran, se esperaría que su inhibición con fármacos no merecería la pena utilizar en un contexto terapéutico, ya que ello implicaría también eliminar las células del huésped.

A pesar de estas predicciones, la presente invención se basa sorprendentemente en el descubrimiento de que una serie de proteínas de células huésped son esenciales para la integración de retrotransposones eficientes, a pesar de ser innecesarias para la viabilidad de la célula huésped en muchas circunstancias. Estos factores, que son componentes de un sistema denominado el aparato de reparación del DNA asociado a Ku, son en consecuencia unas dianas altamente atractivas para la terapia anti-retroviral.

El sistema de reparación del DNA asociado a Ku

Trabajos previos han demostrado que la proteína ku es un componente esencial del aparato de reparación del DNA en los organismos, abarcando desde el hombre a Drosophila melanogaster, y la levadura S. Cerevisiae (Jackson y Jeggo, 1995; Boulton y Jackson, 1996; Boulton y Jackson , 1996 y las referencias citadas en estos). Específicamente, el tipo de proceso de reparación del DNA en el que se halla implicado ku se denomina unión ilegítima de extremos de DNA, o reparación de cadena doble de DNA (DSB). Ya que Ku se une al DNA DsBs in vitro, se propuso que el Ku se une al DNA DsBs al igual que sucede in vivo y ayuda a producir una ligación eficaz. Además, Ku se requiere para la recombinación de V(D)J, un proceso de ``corte y pega'' del DNA que genera las moléculas de unión antigénicas del sistema inmune de vertebrados (para revisiones ver, Lewis, 1994; Jackson y Jeggo, 1995).

En todos los organismos en los que se ha identificado, ku existe como un heterodímero de dos polipéptidos de aproximadamente 70 KDa (denominado Ku70 en humanos; YKu70p o Hdf1p en S. cerevisiae) y 80 KDa (Ku 80 o Ku86 en humanos; Yku80 o Hdfp2 en S. cerevisiae). Las referencias para ello se proporcionan más adelante. Las células defectuosas para ku son hipersensibles a la muerte por las radiaciones ionizantes o por los agentes radiomiméticos. Sin embargo, en ambos sistemas de levaduras y mamíferos, la falta de función ku tiene efectos mínimos o indetectables en la viabilidad celular y las tasas de crecimiento celular en condiciones normales (Boulton y Jackson, 1996a; Milne y col., Blunt y col., Jackson y Jeggo y las referencias allí citadas; Nussenzweig y col., Zhu y col.).

Recientemente, se han identificado componentes adicionales de la vía de reparación del DNA asociada a Ku. Una de estas proteínas es la proteína de mamíferos XRCC4, cuyas deficiencias produce defectos en la reparación DBS y la recombinación de V(D)J (Li y col., 1995). Otras proteínas identificadas son los factores de levaduras Rad50p, Mre11p y Xsr2p (ver más adelante) y Lig4p e DNA ligasa (ver más adelante). Ya que las células poseen homólogos de todos estos factores, deberían funcionar en la reparación DSB y en los procesos relacionados en casi todos las células eucariotas.

Reeves y Shoeger, y Chan y col., describen unas secuencias de cDNA y aminoacídicas del ku70 humano. Cai y col., describen la localización cromosómica y la expresión de los genes que codifican para ku70 y ku80 en las líneas celulares humanas y en los tejidos normales, mientras que Yaneva y col. describen la secuencia aminoacídica derivada del cDNA de ku80 humano. El factor ku de Drosophila (Yolk Protein Factor 1) se describe por Jacoby y Wensink. Feldmann y Winnaker, Milne y col., Beall y col., y Boulton y Jackson (1996a, 1996b) proporcionan la secuencia y la información funcional de los factores ku70 y ku80 de levadura (Saccharomyces cerevisiae).

Alani y col., describen el ácido nucleico y las secuencias aminoacídicas de RAD50 de levadura. El RAD50 y el MRE11 humanos se describen por Dolganov y col., y Petrini y col., respectivamente. Ivanov y col., describen el XRS2 de levadura.

La reparación del DNA asociada a Ku, que es un mecanismo de reparación ilegítimo del DNA, necesita un conjunto discreto de productos génicos (tal como se indicó) y es una vía independiente de la otra vía de reparación del DNA que implica la reparación por recombinación homóloga, la reparación por escisión de nucleótidos, la reparación por escisión de bases y la reparación de apareamientos erróneos del DNA.

Base para la aproximación experimental adoptada en la realización de la presente invención.

La presente invención se realizó analizando si ku jugaba un papel positivo o negativo en el ciclo de vida normal de los retrotransposones, a pesar de varias evidencias que sugieren que ello es muy improbables.

Uno de los motivos del interés de los inventores fue que el cDNA lineal se genera como un intermediario durante el ciclo de vida de los retrovirus y retrotransposones, lo que posibilitaría que ku pueda unírsele. El punto de vista predominante, es que ku sea incapaz de unirse al cDNA viral, ya que se asume que está siempre asociado fuertemente con los factores codificados por el virus. No obstante, ya que resultados bioquímicos no publicados por los inventores de la invención, indican que ku es capaz de unirse a los extremos del DNA con una tenacidad incomparable con cualquier otra proteína caracterizada, por lo que no debería descartarse la posibilidad de que ku logre el acceso al cDNA del retrotransposón.

El segundo motivo para las investigaciones fue que los inventores creyeron en la posibilidad de que el aparato de reparación DNA DSB asociado a ku pudiera desempeñar un papel en la integración de retrovirus y retrotransposones. Aunque, la integrasa de retrotransposones o retrovirus lleva a cabo todas las etapas necesarias para unir covalentemente el cDNA con la molécula de DNA diana (por ejemplo, Craigie y col., 1990; Bushman y col., 1990; Katz y col., 1990), se necesitan etapas de ``llenado y ligación de huecos de cadena sencilla'' antes de que el DNA retroviral/retrotransposón pueda incorporarse de forma estable. A pesar del hecho de que no se sepa si el aparato de reparación del DNA asociado a Ku funciona en reacciones de relleno y ligación de huecos de cadena sencilla, se demuestra más adelante que sí es necesario para la integración eficaz de los retrotransposones de la levadura Ty1 y Ty5 y también afecta la integración del cDNA retroviral en las células de mamífero.

Estos hechos sorprendentes proporcionan una indicación de que el aparato de reparación del DNA asociado a ku juega un papel ubicuo en el proceso de integración de retrotransposones y abre nuevas oportunidades para la acción anti-retroviral, tal como se indicó.

Otro aspecto de la presente invención proporciona la utilización de una sustancia identificada como un inhibidor de la reparación de DNA asociada a Ku en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad del retrovirus y/o retrotransposón.

Otro aspecto de la presente invención proporciona la sustancia identificada como un inhibidor de la reparación del DNA asociada a ku en la inhibición de la actividad del retrovirus y/o retrotransposón en una célula.

El procedimiento incluye proporcionar una composición que incluya por lo menos otro componente, por ejemplo un excipiente aceptable farmacéuticamente, tal como se discute más adelante.

La sustancia puede proporcionarse in vio a las células de un cuerpo humano o animal, mediante terapia (incluyendo la profilaxis), o in planta, ex vivo o in vitro. Todo se discute también más adelante.

La integración de un retrovirus y/o un retrotransposón en el genoma de una célula puede inhibirse con una sustancia que sea un inhibidor de la reparación del DNA asociada a ku. Ejemplos de dichas sustancias incluyen wortmannin y LY294002 (Hartley y col., 1995).

La inhibición de la reparación del DNA asociada a ku puede lograrse mediante cualquiera de las numerosas formas diferentes existentes, sin limitación de la naturaleza y ámbito de la presente invención.

En algunas realizaciones de la presente invención, el propio ku es la diana de inhibición, lo que quiere decir que se inhibe la implicación de ku en la reparación del DNA asociada a ku, con el fin de inhibir la reparación del DNA asociada a ku. Ku sólo es funcional como un heterodímero (de subunidades ku70 y ku80). Sin embargo, una vía de inhibición de la actividad de ku es inhibir la interacción entre las dos subunidades. Otra vía es utilizar una sustancia que inhiba la interacción de ku con el DNA, u otro componente de la vía de reparación del DNA asociada a ku. Por lo demás, ku propiamente no necesita ser la diana y puede inhibirse la función de uno o más componentes de la vía de reparación del DNA asociada a ku (se discute más adelante). Obviamente, una sustancia puede inhibir la actividad de un componente de la vía como ku (o no únicamente ku) inhibiendo la interacción física entre éste y otro componente, pero uniéndolo a un sitio activo o uniéndolo de modo que tenga un efecto estérico sobre la conformación de un sitio activo y en consecuencia actividad del componente. Precisamente al inhibirse la actividad o la función de un componente de la vía, éste componente no debe ser importante para la práctica de la presente invención.

Las secuencias de varios componentes de la vía de reparación del DNA asociada a ku en humanos y levaduras están disponibles a partir del banco de datos GenBank, con los números de acceso siguientes: ku70 humano- J04611; ku80 humano- M30938; ku70 S. cerevisiae- X70379; ku80 S. cerevisiae-Z49702; ligasa humana IV-X83441; ligasa IV de S. cerevisiae-YOR005c en el brazo derecho del cromosoma XV de S. cerevisiae, número de acceso Z74913; Rad50 humano-U63139; Rad50p S. cerevisiae-X14814; Mre11 humano-U37359; Mre11 S. cerevisiae-D11463; XRCC4 humano-U40622 (marco abierto de lectura de 334 residuos aminoacídicos); Xrs2p S. cerevisiae -L22856.

La actividad o función de un componente de la vía de reparación del DNA asociada a Ku (como ku) puede inhibirse, tal como se indicó, mediante una sustancia que interactúe de cierta manera con el componente. Una alternativa utiliza la regulación a nivel de ácido nucleico para inhibir la actividad o función mediante la regulación negativa de la producción del componente.

Por ejemplo, se puede lograr la infra-expresión de un gen utilizando la tecnología anti-sentido. La utilización de genes anti-sentido o secuencias génicas parciales para regular negativamente la expresión génica, actualmente, está bien consolidada.

Los oligonucleótidos anti-sentido se pueden diseñar para hibridarse con la secuencia complementaria del ácido nucleico, el pre-mRNA o el mRNA maduro, interfiriendo con la producción de un componente de la vía de reparación del DNA asociada a ku, o una subunidad de lo mismo, codificada por una secuencia dada de DNA, de modo que su expresión se reduzca o se anule completamente. Las técnicas antisentido pueden utilizarse para, además de dirigirse a secuencias codificantes, dirigirse a secuencias control de un gen, p.ej., en la secuencia flanqueante 5', por lo que los oligonucleótidos antisentido pueden interferir con la expresión de las secuencias control. La construcción de secuencias antisentido y su utilización se describe por ejemplo en Peyman y Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990) y Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992).

Los oligonucleótidos pueden generarse in vitro o in vivo para su administración, o el RNA anti-sentido puede generarse in vivo dentro de las células en las que se desee una regulación negativa.

Así, el DNA de cadena doble se puede colocar bajo el control de un promotor en una ``orientación inversa'', de modo que la transcripción de la cadena anti-sentido del DNA proporciona el RNA complementario al mRNA transcrito por la cadena sentido del gen diana. La secuencia de RNA anti-sentido complementaria se cree que se une con el mRNA para formar un dúplex, inhibiendo la traducción del mRNA endógeno del gen diana en una proteína. Si este es o no el modo exacto de acción, todavía no se sabe. Sin embargo, es un hecho establecido el que la técnica funciona.

No necesita utilizarse la secuencia completa correspondiente con la secuencia codificante en la orientación inversa. Pueden utilizarse, por ejemplo, fragmentos de longitud suficiente. Es una cuestión de rutina para la persona experta en la materia el analizar fragmentos de diversos tamaños y procedentes de diversas partes de la secuencia codificante o de las secuencias flanqueantes de un gen para optimizar el nivel de inhibición anti-sentido. Puede ser ventajoso incluir el codón ATG de la metionina iniciadora y quizás uno o más nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación. Un fragmento adecuado puede tener aproximadamente 14-23 nucleótidos, p.ej., aproximadamente 15, 16 ó 17.

Muchas de las técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción del DNA en las células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, 1992, y Molecular Cloning: A Laboratory Manual:2ª ed., Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Otra posibilidad es que se utilice un ácido nucleico, cuya transcripción produzca una ribozima capaz de cortar el ácido nucleico en un sitio específico- por lo tanto también útil en la manipulación de la expresión génica. Referencias sobre los ribozimas incluyen Kashani-Sabet y Scanlon, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(3):213-223 y Mercola y Cohen, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(1), 47-59.

Es bien conocido que la investigación farmacéutica que conduce a la identificación de un nuevo fármaco puede implicar el rastreo de un amplio número de sustancias candidatas, antes y después de hallar un compuesto líder. Este es uno de los factores que pueden hacer que la investigación farmacéutica sea muy cara y necesite de mucho tiempo. Los procedimientos de ayuda en el proceso de cribaje pueden tener una importancia y utilidad comercial considerables. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan los procedimientos mencionados para el cribaje de sustancias de utilidad potencial en la inhibición de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones. Las sustancias identificadas como moduladores de la reparación del DNA asociada a ku representan un avance en la lucha contra las enfermedades retrovirales (por ejemplo), ya que proporcionan la base para el diseño y la investigación de fármacos terapéuticos para utilizar in vivo.

Un procedimiento de cribaje para una sustancia que inhibe la actividad de retrovirus y/o retrotransposones puede incluir el contacto de una o más sustancias objeto de ensayo con uno o más compuestos de la vía de reparación del DNA asociada a ku de un organismo de interés en un medio de reacción adecuado y el análisis para la interacción de sustancia/componente, p.ej., valorando la actividad de la vía de reparación del DNA asociada a Ku, o de un componente de lo mismo y comparando esta actividad con la actividad en el medio de reacción no tratado comparable con la sustancia o sustancias objeto de ensayo. Una diferencia en la actividad entre las muestras tratadas y las no tratadas es indicativa de un efecto modulador de la sustancia, o sustancias, objeto de ensayo relevantes . Puede ser suficiente, por lo menos en un principio, valorar la interacción meramente física entre la sustancia objeto de ensayo y el componente o subunidad de la vía en las muestras a analizar, en lugar de la actividad bioquímica actual.

En otros aspectos, la presente invención hace referencia al cribaje de sustancias candidatas como inhibidores potenciales de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones. En particular, proporciona un procedimiento mediante el cual las sustancias se pueden seleccionar según su capacidad para influir en la reparación del DNA asociada a Ku. Estas sustancias se pueden analizar para conocer su capacidad de inhibición o activación de la vía, aunque los inhibidores de la vía sean claramente los de principal interés.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de cribaje para una sustancia que es un inhibidor de la actividad de un retrovirus y/o retrotransposón, en particular la integración de ácido nucleico o la transposición del retrovirus y/o retrotransposón, que incluye:

proporcionar una vía de reparación del DNA asociada a Ku;

exponer la vía a una sustancia objeto de ensayo en condiciones que conducen normalmente a la activación de la vía de reparación del DNA asociado a Ku; y

búsqueda de un indicativo del punto final de la activación de la vía de reparación del DNA asociada a Ku;

en donde la inhibición de este punto final indica la inhibición de la vía de reparación del DNA asociada a Ku por la sustancia objeto de ensayo.

La vía podría realizarse en una célula expuesta a la sustancia objeto de ensayo, o el ensayo se podría realizar en un sistema de reparación del DNA asociado a Ku que cuantifique la exactitud y eficacia de la unión de las roturas del DNA creadas al tratar el DNA con endonucleasas de restricción, agentes químicos o radiación.

La activación de la vía de reparación del DNA asociada a Ku puede causar roturas de cadena doble en el DNA (DsBs), brechas de cadena sencilla en la doble hélice del DNA y otras interrupciones de la doble hélice del DNA. Estas estructuras existen en los extremos del DNA de retrovirus y retrotransposones y tienen lugar como intermediarios en la integración retroviral y procesos de retrotranposición. Para analizar la reparación asociada a Ku, se puede proporcionar el DNA de retrovirus o retroviral, los intermediarios de la integración retroviral o la integración de retrotransposones, o preparaciones sintéticas del DNA que mimeticen cualquiera de los anteriores. La activación de la vía de reparación del DNA asociada a Ku conduce a la protección del DNA de una degradación excesiva y comporta perturbaciones en la doble hélice del DNA mediante la ligación de las DsBS de DNA, o de las roturas de cadena sencilla.

El punto final del análisis puede ser en consecuencia la reparación de dichas perturbaciones. Que una sustancia sea inhibidora de la vía de reparación del DNA asociada a Ku puede verificarse mediante la hipersensibilidad de las células de mamífero a radiaciones ionizantes (p.ej., Kackson y Jeggo, y las referencias incluidas), o mediante la unión de las roturas de cadena doble (p.ej., en un plásmido) in vivo (Boulton y Jackson, 1996a, 1996b). Los procedimientos bioquímicos, como la PCR o la hibridación/detección de ácidos nucleicos pueden utilizarse, p.ej., para detectar la estructura química de los productos de integración. La integración retroviral y/o la retrotransposición se puede valorar por ejemplo mediante su detección utilizando técnicas genéticas, bioquímicas o histológicas estándares.

Se debería tener en cuenta que en el ensayo de la capacidad de una sustancia objeto del ensayo para influenciar la vía de reparación del DNA asociada a Ku, el punto final elegido para ser determinado en el ensayo no tiene porque ser el punto final real de la vía de reparación del DNA (la reparación del DNA), pero puede ser la actividad que presenta un componente de la vía. Por ello, por ejemplo, se pueden analizar las sustancias para conocer su capacidad para influenciar la fosforilación DNA-PK de otros componentes de la vía, como el XRCC4.

Desde luego, como se citó con anterioridad, la referencia a un componente de al vía de reparación del DNA asociada a Ku puede referirse a un derivado, variante o análogo del componente relevante que tenga la propiedad o actividad de ensayo requerida (p.ej., la capacidad de unirse con otro componente de la vía).

Dados las indicaciones aquí proporcionadas sobre la capacidad de inhibir la actividad de retrovirus y/o retrotransposones mediante la manipulación de la vía de reparación del DNA asociada a Ku, aquellos expertos en la materia pueden diseñar los ensayos para los agentes anti-retrovirales utilizando proteínas o fragmentos de lo mismo, homólogos a un componente de la vía de reparación del DNA asociada a Ku en la expectativa de que las sustancias que afectan la actividad del homólogo serán capaces de afectar la actividad del componente.

Antes de, al mismo tiempo, o en lugar de analizar la capacidad real de la actividad de reparación del DNA asociada a Ku, las sustancias objeto del ensayo se pueden analizar por su capacidad para interactuar con un componente de la vía (como ku o una o ambas subunidades de lo mismo), p.ej., en un sistema de levaduras del doble híbrido (que requiere que tanto el componente polipeptídico como la sustancia objeto del ensayo puedan expresarse en levaduras a partir del ácido nucleico que los codifica). Esto se puede utilizar, por ejemplo, como un cribaje previo general para analizar la capacidad de una sustancia objeto del ensayo para modular la actividad real.

Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de cribaje para una sustancia que es un inhibidor de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones, en particular de la integración del ácido nucleico del retrovirus y/o retrotransposón, que incluye:

proporcionar un componente de una vía de reparación del DNA asociada a Ku;

exposición del componente a una sustancia objeto del ensayo;

determinar la interacción entre el componente y la sustancia objeto del ensayo.

El sistema del doble híbrido en levaduras (p.ej., Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5, 3610-3616 (1985); Fields & SongNature 340, 245-246 (1989)) se puede utilizar para identificar sustancias que interactúan con un componente de la vía de reparación del DNA asociada a Ku o con una subunidad de lo mismo. Este sistema utiliza a menudo una levadura que contiene un promotor sensible a GAL4 unido al gen de la \beta-galactosidasa y a un gen (HIS3) que permite crecer la levadura en ausencia del aminoácido histidina y en presencia del componente tóxico 3-aminotriazol. El componente de la vía o subunidad puede clonarse en un vector de levaduras que expresará la proteína como una función con el dominio de unión del DNA de GAL4. Las levaduras se pueden así transformar con las librerías de DNA diseñadas para expresar los polipéptidos o péptidos objetos de ensayo como fusiones con el activador GAL4. Las levaduras que presenten coloración azul en las placas indicadoras (debido a la activación de la \beta-galactosidasa) y que crezcan en ausencia de histidina (y en presencia de 3-aminotriazol) se pueden seleccionar, aislándose de esta manera la librería plasmídica. La librería plasmídica codifica para una sustancia que puede interactuar con el componente de la vía de reparación del DNA asociada a Ku, o con una subunidad de éste.

Se puede utilizar una variación de lo anterior para seleccionar las sustancias capaces de interrumpir la interacción entre dos componentes de la vía de reparación del DNA asociada a Ku, o las subunidades de un tal componente (p.ej., las subunidades Ku70 y Ku80 de Ku - Ku es únicamente funcional como un heterodímero). Por ejemplo, los dos componentes o subunidades se pueden expresar en un sistema de doble híbrido de levaduras (p.ej., uno como la fusión del dominio de unión de DNA GAL4, la otra como una fusión con el activador GAL4), que se trata con las sustancias objeto del ensayo. La ausencia del punto final, que normalmente indica la interacción entre los componentes o las subunidades (p.ej., la ausencia de un color en el sistema del ejemplo indicado anteriormente), cuando una sustancia objeto del ensayo se aplica indica que la sustancia interrumpe la interacción entre dos componentes o subunidades y puede, en consecuencia, inhibir la reparación del DNA asociada a Ku, lo que es indicativo del potencial inhibidor de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones.

Para propósitos terapéuticos potenciales, la vía de reparación del DNA asociada a Ku o de uno o más componentes (o subunidades) utilizados en el ensayo pueden ser humanos, o mamíferos o de aves según las aplicaciones veterinarias. Sin embargo, dada la facilidad de manipulación de las levaduras y la buena conservación entre los componentes de reparación del DNA asociada a Ku en los diferentes eucariotas, un ensayo de acuerdo con la presente invención puede implicar la utilización de sustancias objeto del ensayo a un sistema de levaduras, esperando que se obtendrán resultados similares utilizando las sustancias en sistemas de mamíferos, p.ej., en humanos. En otras palabras, una sustancia identificada como capaz de inhibir la reparación del DNA asociada a Ku en levaduras es posiblemente capaz de inhibir la reparación del DNA asociada a Ku en otros eucariotas. Otro aspecto es la utilización de células de levadura que expresan uno o más componentes (p.ej., Ku) o subunidades (p.ej., Ku70/Ku80) o la vía de reparación del DNA asociada a Ku de otros organismos eucariotas, p.ej., el humano. Una vía de reparación asociada a Ku de plantas, o uno o más componentes de lo mismo se puede utilizar en un ensayo de acuerdo con la presente invención, para analizar la utilidad de las sustancias en la inhibición de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones en plantas.

Después de identificar una sustancia que modula o afecta la interacción entre los componentes de la vía o las subunidades de éste, se puede investigar la sustancia para conocer su capacidad de inhibición de la actividad de retrovirus y/o de retrotransposones. Además, dicha sustancia se puede fabricar y/o utilizar en una preparación, es decir, fabricación o formulación, de una composición como un medicamento, composición farmacéutica o fármaco, que puede administrarse a los individuos.

Así, la presente invención abarca diversos aspectos, no sólo una sustancia identificada como inhibidora de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones de acuerdo con lo descrito aquí, sino también una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición comprendiendo dicha sustancia, un procedimiento que comprende la administración de dicha composición a un paciente, p.ej., para el tratamiento (que puede incluir el tratamiento preventivo) de una enfermedad retroviral, la utilización de dicha sustancia en la fabricación de una composición para la administración, p.ej., para el tratamiento de una enfermedad retroviral y un procedimiento de fabricación de la composición que comprende la mezcla de dicha sustancia con un excipiente, vehículo o transportador aceptable farmacéuticamente y opcionalmente otros ingredientes.

Una sustancia que de positivo en un ensayo de acuerdo con la presente invención, o que inhiba la actividad de retrovirus y/o retrotransposones inhibiendo la reparación del DNA asociada a Ku, puede ser en la naturaleza un péptido o una sustancia no peptídica. Generalmente, se prefieren las ``moléculas pequeñas'' no-peptídicas para muchas utilizaciones farmacéuticas in vivo. Según ello, se puede diseñar para uso farmacéutico un mimético o simulador de la sustancia (especialmente si es un péptido).

El diseño de miméticos de un conocido compuesto activo farmacéuticamente es una aproximación conocida en el desarrollo de fármacos basado en un compuesto ``principal''. Esto puede ser deseable si el compuesto activo es difícil o caro de sintetizar, o si es inadecuado para cualquier procedimiento de administración, p.ej., los péptidos son agentes activos inadecuados para las composiciones orales ya que tienden a ser degradados rápidamente por las proteasas en el canal alimentario. El diseño de miméticos, su síntesis y análisis se realiza generalmente para evitar el cribaje aleatorio de un gran número de moléculas con una propiedad determinada.

Existen diversas etapas comunes en el diseño de un mimético de un compuesto con una propiedad determinada. En primer lugar, se determinan las partes del compuesto que son críticas y/o importantes para la determinación de la propiedad determinada. En el caso de un péptido, esto se puede realizar sistemáticamente variando los residuos aminoacídicos en el péptido, p.ej., sustituyendo cada residuo sucesivamente. Generalmente, se utilizan los cribajes de alaninas del péptido para afinar dichos motivos peptídicos. Estas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto son conocidos como sus ``farmacóforos''.

Una vez se ha hallado el farmacóforo, se modela su estructura de acuerdo con sus propiedades físicas, p.ej., estereoquímica, enlaces, tamaño y/o carga, utilizando los resultados a partir de fuentes, p.ej., técnicas espectroscópicas, difracción por rayos X y RMN. En este proceso de modelación, se pueden emplear el análisis computacional, el mapeo por similitud (que modela la carga y/o el volumen de un farmacóforo, en lugar de los enlaces entre átomos) y otras técnicas más.

En una variante de esta aproximación, se modela la estructura tridimensional del ligando y su pareja de unión. Esto puede ser de especial utilidad si el ligando y/o la pareja de unión cambian su conformación al unirse, lo que permite que el modelo tenga en cuenta dicho cambio en el diseño del mimético.

Se selecciona entonces una molécula molde en donde se injertarán los grupos químicos que mimetizan el farmacóforo. La molécula molde y los grupos químicos injertados se pueden seleccionar de forma conveniente de modo que el mimético sea fácil de sintetizar, sea aceptable farmacológicamente y no se degrade in vivo, reteniendo la actividad biológica del compuesto líder, Alternativamente, si el mimético está basado en un péptido, la estabilidad se puede lograr circularizando el péptido con los que se incrementa su rigidez. El mimético o miméticos hallados mediante esta aproximación se pueden entonces analizar para ver si poseen la propiedad diana, o en cuanta magnitud la presentan. Luego, se puede realizar una optimización o modificación con el fin de lograr uno o más miméticos finales para el ensayo in vivo o clínico.

En una composición, se puede formular una sustancia para la inhibición de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención. Una composición puede incluir, además de la mencionada sustancia, un excipiente farmacéuticamente aceptable, transportador, estabilizante o uno o más materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deberían ser tóxicos ni deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza concreta del transportador u otro material puede depender de la vía de administración, p.ej., vía oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular e intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para la administración pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, polvo o líquido. Una tableta puede incluir un transportador sólido como la gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas incluyen generalmente un transportador líquido como el agua, petróleo, aceites vegetales o animales, aceite mineral o sintético. También pueden incluir una solución salina fisiológica, solución de dextrosa u otro sacárido o glicoles como el etilén glicol, el propilén glicol o el polietilén glicol.

Para una inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o una inyección de un sitio determinado de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente, apirógena y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia estarán bien capacitados para preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como soluciones inyectables de cloruro sódico, de Ringer y Ringer lactato. También se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones antioxidantes y/o otros aditivos, según se necesite.

Si lo que se administra a un individuo es un polipéptido, un péptido, una molécula de ácido nucleico, una molécula pequeña u otro compuesto de utilidad farmacéutica, de acuerdo con la presente invención, la administración se realiza preferentemente con ``una cantidad eficaz profilácticamente'' o ``una cantidad eficaz terapéuticamente'' (según el caso, aunque la profilaxis puede considerarse como una terapia), suficiente para producir un provecho en el individuo. La cantidad real administrada y la tasa y tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se trate. La prescripción del tratamiento, p.ej., las decisiones sobre la dosificación, etc., se halla dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos especialistas, y típicamente tienen en cuenta la enfermedad a tratar, la condición del paciente, el sitio de administración, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los clínicos. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente se pueden hallar en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.) 1980.

Las terapias dirigidas contra una diana se pueden utilizar para liberar el agente activo de modo más específicamente a ciertos tipos de células, mediante la utilización de sistemas como un anticuerpo o ligandos específicos de células. Dicho procedimiento puede ser deseable por una variedad de razones, por ejemplo si el agente es inaceptablemente tóxico, o si requiere una dosis muy elevada, o si por otra parte no es capas de penetrar en las células diana.

En lugar de administrar estos agentes directamente, se pueden producir en las células diana mediante expresión de un gen codificante introducido en las células. El vector puede dirigirse a las células específicas a tratar, o puede contener elementos expresados más o menos selectivamente por las células diana.

El agente puede administrarse en forma de un precursor, para la conversión de la forma activa por un agente activador producido en, o dirigido contra, las células a tratar.

Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la condición a tratar.

Las bases experimentales para la invención y las realizaciones ilustrativas de la invención se describirán en adelante con mayor detalle, acompañándose de figuras. Todas las publicaciones mencionadas en el texto se han incorporado aquí como referencias.

La Figura muestra que la inactivación de YKU70o de YKU80 conduce a las frecuencias reducidas de la transposición de Ty1.

La Figura 1A muestra las frecuencias de transposiciones de Ty1 en la cepa de tipo salvaje de Saccharomyces cerevisiae W303-1A (tipo salvaje), en una cepa de levadura mutante W303-1A derivada de la cepa de levadura mutante yku70, y en la cepa mutante yku70 que contiene un plásmido episómico que expresa el gen de tipo salvaje YKU70 (yku70/pYKU70), calculado en relación con la levadura de tipo salvaje (para detalles de las cepas de levadura y del plásmido YKU70, ver Boulton y Jackson, 1996).

La Figura 1B muestra que la inactivación de YKU80, pero no RAD52 o SGS1 produce frecuencias reducidas de la transposición Ty1. La cepa W303-1A de tipo salvaje (tipo salvaje) o las cepas derivadas de W303-1A en YKU80 (yku80), RAD52(rad52) o SG1(sgs1) se analizaron para conocer su capacidad de soportar la retrotransposición Ty1. Las frecuencias de transposición se muestran normalizadas en relación con la cepa de tipo salvaje.

La Figura 1C muestra las frecuencias de transposición en yku70, yku70/rad52 y yku70/rad 52 con Ty1-in2600 en relación con la de tipo salvaje.

La Figura 1D muestra las frecuencias de transposición en las cepas mutantes rad50 y lig4 en relación con la de tipo salvaje.

La Figura 2 muestra que la transposición por Ty5 se debilita por mutaciones en YKU70, pero no en RAD52. Las frecuencias relativas de transposición se muestran para las células de tipo salvaje yku70, rad52 y yku70/rad52 que se transformaron en cada caso con un plásmido (pSZ152, Zou y col., 1996) que contenía el retrotransposón Ty5 y contenía la misma construcción de intrón artificial HIS3 que el pGTyH3mHIS3AI (Curcio y Garfinkel, 1991). Las frecuencias se proporcionan relativas al tipo salvaje, que presentaba una frecuencia de transposición de Ty5 de 3,2x10^{-4}.

La Figura 3 muestra que ku no parece que afecte la generación de Ty1 VLPs. El gráfico muestra la actividad de transcriptasa inversa (P32 incorporado; cpm) para fracciones del gradiente de sacarosa. El trazado de la actividad de las células yku70+Ty1 (triángulos) muestran ser similares a las células que son de tipo salvaje + Ty1 (óvalos). La actividad para los controles de tipo salvaje (no Ty1) se indica con cuadrados.

La Figura 4 muestra que las VLPs aisladas de las levaduras Yku70p-deficientes son competentes para la transposición mediada por integrasa in vitro. La frecuencia de transposición (x10^{-3}) se muestra para las células de tipo salvaje y las yku70.

La Figura 5 muestra los resultados del análisis de degradación-3'-5' del cDNA de Ty1. El DNA de Ty1 VLP aislado de las células de levadura de tipo salvaje o yku70 se incubó con Klenow (ausencia de actividad exonucleasa) y dNTPs radioactivos. La incorporación de nucleótidos (5'-3') mediada por Klenow se cuantificó mediante contaje por centelleo y los resultados se muestran como cuentas de P32 incorporadas en relación con el de tipo salvaje.

La Figura 6 muestra que la actividad de degradación para el DNA asociado a VLP es inferior en VLPs aisladas de cepas de tipo salvaje que la de cepas yku70.

La Figura 6a muestra la cuantificación del cDNA de Ty1 aislado de las cepas de tipo salvaje o yku70 (% del elemento Ty1 de tamaño completo) en diferentes tiempos (min). Las VLPs, normalizadas por su actividad RT, se incubaron a temperatura ambiente a las longitudes de tiempo indicadas. Para cada punto, el histograma de la izquierda corresponde a las células de tipo salvaje y el histograma de la derecha corresponde a las células yk70.

La Figura 6b muestra que las preparaciones de VLPs de las cepas de tipo salvaje y mutantes yku70 tienen niveles equivalentes de actividad nucleasa intrínseca. El DNA plasmídico con extremos romos se incubó únicamente con tampón (histograma izquierdo para cada punto) o VLPs de las células de tipo salvaje (histograma central para tiempo), o de las células yku70 (histograma derecho para cada tiempo). El % de DNA plasmídico de tamaño completo se muestra para cada tiempo.

La Figura 7 muestra los números de colonias de diversos tipos de células que se colorean de forma positiva para la actividad \beta-galactosidasa 48 horas después de la infección con el vector retroviral basado en MoMLV pseudotipado de glicoproteína VSV G y que expresa Lac Z.

Trabajo experimental Células de levadura

Para probar la implicación potencial de Ku en la retrotransposición, se utilizó la levadura S. cerevisiae como un sistema modelo. En particular, estudios recientes han demostrado que el sistema de reparación DSB DNA asociado a ku está altamente conservado entre levaduras y humanos (Boulton y Jackson, 1996a; Boulton y Jackson, 1996b y las referencias allí citadas). Además, está claro que los retrotransposones Ty1 y Ty5 a través de mecanismos altamente relacionados con los de retrotransposones y retrovirus en otros organismos, incluyendo humanos (Boeke y col., Garfinkel, 1985; Boeke y Sandmeyer, 1991).

Para valorar la eficiencia de la retrotransposición, se utilizó inicialmente el sistema de transposición Ty1 galactosa-inducible (Curcio y Garfinkel, 1991). En este sistema, se generó un mutante his3 derivado de la cepa de levadura en investigación, de modo que contenía un plásmido de replicación episómica que dirigía la expresión del RNA Ty1 a partir de un promotor galactosa-inducible. Además, el elemento Ty1 contenía el gen HIS3 de S. cerevisiae interrumpido por un intrón en orientación inversa (anti-sentido). Así, la cepa de levadura es fenotípicamente his- y no puede crecer en ausencia de histidina en el medio de cultivo. Sin embargo, ya que el intrón está en la orientación sentido respecto al retroelemento Ty1, puede ser eliminado mediante corte y empalme del RNA de Ty1 cuando se realiza en presencia de galactosa. Si, a continuación, este RNA se retro-transcribe y se integra mediante la integrasa de Ty1 en el genoma de la levadura, el gen actual HIS3 sin el intrón puede ahora expresarse, dando como resultado la conversión del fenotipo de la cepa de levadura a HIS+. En consecuencia, este sistema de ensayo permite determinar la eficiencia de retrotransposición, mediante cuantificación de la capacidad de la cepa de levadura a analizar de generar colonias HIS+ después de la inducción por galactosa.

Se realizaron ensayos de transposición de la manera siguiente. Se transformaron las cepas de levaduras con pGTy1-H3mHIS3AI (Curcio y Garginkel, 1991), o con pSZ152 y se plaquearon para seleccionar el gen URA3 en este plásmido (con medio sintético sin uracilo, SC-ura). Estos plásmidos contienen un elemento Ty1 o Ty5 galactosa-inducibles, bajo el control del promotor GAL-10 galactosa-inducible y un gen HIS3 con un intrón artificial en la orientación inversa. La expresión del gen HIS3 es dependiente de la transcripción y transposición del elemento Ty1 (Curcio y Garfinkel, 1991). Se repicaron colonias individuales y se crecieron en medio con galactosa durante toda la noche a 30ºC. La densidad óptica de los cultivos se cuantificó a 595 nm para determinar la densidad celular. A continuación, se plaquearon en medio completo sintético carente de uracilo para determinar la viabilidad celular. También, se plaquearon las células en medio completo sintético que contenía glucosa y carecía de histidina. Se contó el número de colonias que crecieron y se dividió por el número de células totales, obteniéndose así una medida de la frecuencia de transposición de Ty1 en cada cepa analizada. Las frecuencias se muestran (en las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D) con respecto a la de tipo salvaje, que tiene una frecuencia de transposición de 1,5x10^{-4}. Todos los ensayos se realizaron como mínimo tres veces.

Yku70p se requiere para la transposición eficaz por Ty1.

Tal como se muestra en la Figura 1A, una cepa de levadura deficiente en el gen para la levadura ku70 (YKU70) proporciona tasas de retrotransposición que son 5-10 veces inferiores (es decir, disminución de <80%) a las de la cepa de levadura control. El hecho que este defecto sea debido a la inactivación de YKU70, se demuestra porque dicho defecto se observa en algunas cepas mutantes derivadas de yku70 independientemente (resultados no mostrados). Además, el defecto de retrotransposón se complementa totalmente cuando la cepa yku70 contiene un plásmido episómico con el gen YKU70 (Figura 1A). Esto demuestra que el Yku70p desempeña un papel importante en la retrotransposición de Ty1.

El Yku80p también se necesita para una transposición eficaz por Ty1, pero así los componentes de otras vías de reparación del DNA analizado.

Para ver si el defecto de transposición observado anteriormente es específico de las mutaciones en YKU70, se analizaron levaduras defectuosas en otros componentes de reparación del DNA mediante transposición de Ty1. Tal como se muestra en la Figura 1B, la inactivación de YKU80, el gen para Ku80 de levaduras, también conduce a una disminución dramática en las frecuencias de retrotransposición. En cambio, la inactivación del gen de reparación del DNA RAD52 o del gen para el factor de reparación del DNA putativo SgsIp no presenta un efecto significativo sobre la frecuencia de retrotransposición.

Se concluye en consecuencia que la retrotransposición de Ty1 está afectada negativamente por mutaciones en los genes de Yku70p e Yku80p, pero no por mutaciones en otras vías de reparación del DNA analizadas.

La integración residual en las cepas yku70 no está mediada por recombinación homóloga.

Trabajos previos han mostrado que el DNA de Ty1 se integra a niveles bajos en el genoma de levadura mediante recombinación homóloga (Melamed, y col., 1992; Sharon y col., 1994). Sin embargo, la retrotransposición en cepas del mutante yku70 no se reduce después de la inactivación de RAD52 (Figura 1C), lo que indicaba que la integración residual en las cepas de yku70 no está mediada por recombinación homóloga. También se ha demostrado que el fenotipo His+ en el ensayo de retrotransposición Ty1 se puede lograr mediante un mecanismo independiente de la integrasa y de la recombinación homóloga y con ello, a partir de este mecanismo, se obtienen muchas colonias His+ que contienen HIS3 en el plásmido (Sharon y col., 1994). Sin embargo, cuando las células His+ residuales que se producen en las levaduras mutantes yku70 se inducen a perder el plásmido que contiene Ty1 mediante selección con ácido fluorótico, todas las colonias supervivientes son todavía His+ (120/120 para las de tipo salvaje, 118/118 para yky70, demostrando que HIS se insertó en el genoma. Además, los ensayos de retrotransposones se realizaron utilizando un elemento integrasa-deficiente Ty1 [en 2600; (Sharon y col., 1994)]. En particular, en las cepas mutantes de yku70, la pérdida de RAD52 y una integrasa funcional da como resultado la pérdida de sitios de retrotransposición en el ensayo utilizado (figura 1C). En consecuencia, la gran mayoría de células His+ generadas en las cepas yku70 resultan de los eventos mediados por la integrasa.

Ku se requiere para una transposición eficaz de otros tipos de retrotransposones.

Para ver si el efecto de Ku sobre la retrotransposición es específica para Ty1, o si se extiende a otros elementos retrotransposables, también se valoró la transposición del retrotransposón divergente Ty5. Se transformaron cepas de levadura con un plásmido que contenía el elemento Ty5 bajo el control del promotor GAL1 y con la misma construcción de intrón artificial HIS3 que pGTy1-H3mHIS3AI (plásmido psz152, Zou y col., 1996) y los ensayos se realizaron tal como se describió anteriormente con la referencia de la Fig.1.

Sorprendentemente, la eficiencia de transposición de Ty5 se redujo aproximadamente unas 100 veces cuando las cepas de levaduras presentaban mutaciones, tanto en YKU70 como en YKU80 (Figura 2). Por el contrario, la inactivación del gen de reparación del DNA RAD52 no tiene un efecto significativo sobre las tasas de transposición de Ty5, en un contexto de tipo salvaje o de mutante yku70. Otros estudios indican que la mutación en YKU80 o la mutación en SIR2,SIR3 o SIR4 deprime esencialmente la retrotransposición de Ty5, y que YKU70 o YKU80 también impiden la transposición del retrotransposón Ty3 de levaduras (resultados no mostrados). Tomándolos juntos, dichos resultados demuestran que estos defectos en Ku conducen a frecuencias reducidas dramáticamente de tres retrotransposones divergentes. Esto demuestra en consecuencia que ku afecta a un aspecto fundamental del ciclo vital de retrotransposones.

Ku de levaduras no afecta la formación de partículas similares a virus funcionales

Existen varias estrategias en el ciclo celular de Ty en donde Ku podría funcionar. En primer lugar, Ku afecta la síntesis de partículas víricas similares a virus (VLPs) afectando la síntesis del RNA Ty, la síntesis de otros componentes víricos, o la transcripción inversa del RNA y su ensamblamiento en una VLP infecciosa. En segundo lugar, ku afectaría la estabilidad de la VLP o del cDNA que contiene. En tercer lugar, ku afectaría la capacidad de la VLP a integrarse en el DNA diana. En cuarto lugar, Ku podría estar implicado en las etapas de reparación del DNA que tienen lugar después de la reacciones iniciales de corte transferencia de la cadena de DNA mediadas por la integrasa.

Para investigar el mecanismo por el que ku afecta la retrotransposición para Ty1, se aislaron y analizaron Ty1 VLPs de células de transposición activa. En particular, las VLPs aisladas de células de tipo salvaje y de ku70 tenían unos perfiles de actividad RT similares en un gradiente de sacarosa utilizado para su aislamiento (Figura 3; también se aislaron células de tipo salvaje sin el elemento Ty1, para proporcionar los niveles de actividad basal RT). Ya que Ku se une a los extremos del DNA, podría significar que ku puede unirse al cDNA Ty1 lineal en las VLPs. Para determinar si ku está asociada con las VLPs, se realizaron análisis de transferencia de Western con las fracciones del gradiente de sacarosa utilizando un anticuerpo anti-Yku70p. El Yku70p se detectó en las fracciones 1 y 2 del extracto de las células de tipo salvaje con o sin transposición de Ty1 activa. Sin embargo, también se detectó yku70p en la fracción 8 de los extractos de tipo salvaje que contenían Ty1 y presentaban un pico de actividad RT, pero no se detectaron en la fracción equivalente derivada de las células carentes de Ty1. La presencia de Yku70p en las fracciones que contenían picos con niveles de RT fue consistente en tres preparaciones independientes de VLP. Además, los análisis de Western de preparaciones similares de células con transposición activa de Ty5 también mostraron una asociación de Yku70p con picos de niveles RT. Estos resultados juntos sugieren fuertemente que Yku70p se asocia con las Ty1 VLPs.

Los extractos celulares preparados a partir de las cepas de levaduras indicadas se fraccionaron en un gradiente de sacarosa y se analizaron para conocer su actividad RT. El aislamiento de las VLPs se adaptó de Eichinger y Boeke (1988). Brevemente, se sedimentaron mediante centrifugación 5 ml del cultivo de levaduras durante toda la noche que contenía pGTyH1mHIS3AI (crecimiento en SC-ura que contiene glucosa), a continuación el sedimento se lavó con agua y se utilizó para inocular 50 ml de SC-ura con galactosa. Las células de tipo salvaje que no contenían plásmido crecieron en SC (con glucosa o galactosa, igual que antes) y se procesaron en paralelo. Después del crecimiento durante 24 horas a 22ºC, las células se recogieron, se lavaron con agua y se lisaron con bolas de vidrio en presencia de 1 ml del tampón B/Mg (HEPES 10 mM, pH7,6, KCl 15 mM, DTT 3 mM, aprotinina 0,01 mg/ml, MgCl_{2} 5 mM). El lisado se centrifugó a 12.000 g y el sobrenadante se cargó en un gradiente de sacarosa (1 ml de sacarosa al 70% en tampón B sin MgCl_{2} y con EDTA 10 mM, 1 ml del 30% y 4 ml del 20%). Los gradientes se centrifugaron en un rotor Beckman SW-40 a 4ºC durante 4 horas. Las fracciones (0,75 ml) se recogieron y analizaron para determinar su actividad RT. Las fracciones positivas se sedimentaron a 50.000 g durante toda la noche a 4ºC, se resuspendieron en 10 \mul de tampón B/Mg y se guardaron a 4ºC.

Con las fracciones del gradiente de sacarosa, se realizaron análisis de transferencia de Western con el anticuerpo anti-Yku70p. También se analizaron los extractos nucleares de las cepas de tipo salvaje o yku70. Los extractos de levadura se recogieron y fraccionaron en gradientes de sacarosa como antes. Todas las fracciones se sedimentaron centrifugando a 100.000 g durante toda la noche a 4ºC y se resuspendieron en 10 \mul de tampón B/Mg^{2+}. Se analizaron 5 \mul de cada fracción en SDS PAGE al 8% y se transfirieron a una membrana de nylon. La membrana se incubó con antisuero policlonal anti-Yku70p y se visualizó con IgG anti-conejo conjugadas con peroxidasa de rábano y quimioluminiscencia (Amersham).

Yku70p es una proteína de ^{E}x67 KDa observada en extractos de tipo salvaje pero no en los extractos yku70.

Para ver si las VLPs aisladas de las células de levadura Ku positivas y Ku negativas diferían funcionalmente, se compararon las capacidades de las dos preparaciones de VLP para integrarse en una molécula de DNA plasmídico in vitro. Como se muestra en la Figura 4, las VLPs aisladas de las células Ku deficientes no son menos activas en la mediación de la integración del cDNA que las VLPs aisladas de las levaduras ku positivas.

La transposición in vitro se analizó utilizando VLPs que se habían purificado a partir de una cepa de levadura de tipo salvaje o mutante yku70 (yku70), tal como se describió anteriormente respecto a la Figura 3. Las reacciones contenían 3 ml de VLPs o tampón B/Mg^{2+} (control negativo), Tris 10 mM pH 8,0, MgCl_{2} 15 mM, DTT 1 mM, polietilén glicol al 5% y 1 mg del DNA plasmídico super-enrrollado (pRS416; Stratagene). Las reacciones se incubaron durante 30 min a 25ºC y se pararon mediante adición de proteinasa K a 0,5 mg/ml y SDS al 1,4% seguido por una incubación posterior a 25ºC durante 3 horas. Luego, se extrajo el DNA con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 10 ml de Tris 10 mM pH 8,0 y se transformó en las células XL-1 (Stratagene). La hibridación se realizó utilizando una sonda marcada por ``random priming'' que correspondía al gen HIS3. Se realizó un contaje de las colonias positivas en relación con el total para proporcionar la frecuencia media de transposición. Las colonias positivas se repicaron para asegurarse que contenían el elemento Ty1; como se esperaba las reacciones que no contenían VLPs no produjeron colonias de hibridación positiva.

Estos resultados, considerándolos en su conjunto, proporcionan la indicación de que Ku no afecta la síntesis, la estabilidad ni la actividad catalítica de las VLPs con el elemento Ty.

Identificación de la etapa del ciclo vital del retrotransposón/retrovirus que se ve afectada por el sistema de reparación del DNA asociado a Ku

Existen diversas posibilidades para explicar como Ku potencia la retrotransposición, siendo todas ellas analizables.

(1) Es posible que Ku se una al cDNA del retrotransposón o retrovirus en las VLPs o partícula retroviral (RP) como medio de incrementar la estabilidad de la partícula, o la tasa de ensamblamiento. Esta posibilidad puede analizarse utilizando anticuerpos contra las subunidades Ku en estudios de inmunoprecipitación y de transferencia de Western con las VLPs y partículas víricas.

(2) Ku podría proteger los extremos del cDNA de las nucleasas u otras enzimas modificadoras del DNA. Esto podría ocurrir cuando el cDNA se halla en las VLPs o RP (partícula viral) y puede analizarse simplemente mediante determinación de la secuencia precisa de los extremos del cDNA de Ty mediante clonaje y secuenciación de los extremos del cDNA derivado de las VLPs o RPs, o de ensayos como la extensión del cebador, procedimientos de mapeo con la nucleasa S1 o ribonucleasa (Ausubel y col., 1991).

(3) Ku puede prevenir los procesos de ``auto-integración'' conduciendo a una destrucción del cDNA de VLP o RP mediante la integración de una molécula en otra. Los sucesos de auto-integración se han demostrado previamente (Lee y Craigie, 1994 y las referencias allí citadas), con lo que será fácilmente posible analizar si Ku es capaz de afectar este proceso. Dichos ensayos utilizarán la sVLPs o las RPs infectivas en reacciones de transposición in vitro en presencia o ausencia de Ku de levaduras purificado (Feldmann y Winnacker, 1993) o Ku humano (Dvir y col., 1993; Hartley y col., 1995).

(4) Ku podría funcionar in vivo para amarrar la maquinaria de integración a los sitios en el DNA cromosómico (este tipo de proceso ha demostrado afectar la eficiencia de transposición; Bushman, 1994). Para analizar esto, la capacidad de Ku para interactuar con las VLPs o las RPs pueden valorarse in vitro mediante ensayos bioquímicos estándares o mediante procedimientos de cromatografía de afinidad proteica (p.ej., unir Ku a un soporte insoluble y ver si éste retiene las VLPs o RPs).

(5) Ku podría afectar a la eficiencia de integración o podría conducir a la finalización de la reacción evitando que se produzcan reacciones inversas (la inversión de la integración puede tener lugar in vitro; por ejemplo, Chow y col., 1992). Esto puede analizarse valorando el efecto de adición de Ku de levaduras purificadas o de mamíferos para las reacciones de transposición in vitro utilizando proteínas integrasas purificadas o con VLPs o RPs (por ejemplo, Brown y col., 1987; Eichinger y Boeke, 1988; Fujiwara y Mizuuchi 1998; Fijiwara y Craigie 1989; Craigie y col., 1990; Bushman y col., 1990; Katz y col., 1990; Bushman y Craigie, 1991; Pryciak y col., 1992; Moore y Garfinkel, 1994; y las referencias allí citadas). Además, los efectos de Ku sobre las reacciones de integración pueden investigarse analizando los efectos de los extractos de células de mamífero o de levadura que contienen o carecen de Ku en ensayos de integración in vitro.

(6) Ku podría estar implicado en la reparación de los productos integrados. La integrasa es capaz de unir el cDNA viral con otra molécula de DNA, pero estos productos retienen roturas y/o brechas que deben ser procesadas antes de que el DNA se propague (por ejemplo, Busman y col., 1990; Carigie y col., 1990). Es posible que el aparato de reparación del DNA asociado a Ku realice estas funciones. Dichos modelos se pueden analizar introduciendo los intermediarios que contienen roturas de reacciones de integración de retrotransposones/retrovirus in vitro en células de levaduras o humanas Ku positivas o Ku negativas, y luego analizando su reparación in vivo. Este tipo de análisis puede también ser conducido con sustratos artificiales que mimetizan los intermediarios de integración de retrovirus/retrotransposones con roturas generadas por la integrasa. Otro modo de realizar un ensayo de este tipo es analizar el procesamiento de los sustratos con roturas naturales o artificiales in vitro utilizando extractos de células humanas o de levaduras, que son competentes o deficientes en los componentes del sistema de reparación del DNA asociado a Ku, o utilizando (parte) componentes purificados del sistema de reparación del DNA asociado a Ku.

Es importante remarcar que para la realización de la presente invención, en varios aspectos no es necesario conocer como está implicado Ku en el ciclo de vida de los retrovirus/retrotransposones. Simplemente, se puede remarcar que está tan implicado y que, tal como se demostró aquí, la interrupción de la función de Ku tiene un efecto anti- retrovírico/retrotransposón.

La inhibición de la actividad de Ku de levaduras conduce a frecuencias de transposición de Ty reducidas.

La pérdida de la función Ku de levaduras afecta las tasas de transposición de Ty (establecidas anteriormente), lo que proporciona una indicación de que las frecuencias de transposición de Ty podrán reducirse en las células Ku positivas con ayuda de inhibidores de la acción de Ku.

Una aproximación para demostrar este principio implica la introducción en las cepas YKU70/YKU80 de moléculas plasmídicas que dirigen la expresión de derivados mutados de Yku70p o Yku80p (utilizando vectores como los descritos previamente); Boulton y Jackson, 1996a; Boulton y Jackson, 1996b). Los mutantes Ku estudiados pueden incluir por ejemplo mutantes de deleción N-terminal, mutantes de deleción C-terminal y mutantes puntuales en las regiones de la proteína que están conservados evolutivamente (p.ej., Feldmann y Winnacker, 1993; Boulton y Jackson, 1996b). Ya que las subunidades de Ku funcionan como un heterodímero y trabajan en asociación con otras proteínas, diversas moléculas Ku mutadas capaces de interactuar con su pareja o con otros componentes del sistema formarán complejos no funcionales. Estas mutaciones dominantes negativas, cuando se utilizan en estudios de transposición Ty, proporcionan una indicación de que la inhibición de la función Ku puede perjudicar la retrotransposición de Ty.

Definición de las regiones de Yku70p y Yku80p que funcionan en la integración de Ty.

Las regiones de las dos subunidades Ku que funcionan en la retrotransposición de Ty se pueden definir valorando las capacidades de los derivados mutados de YKu70 y YKU80 para complementar las deficiencias de transposición de las cepas mutantes de yku70 y yku80, respectivamente (utilizando vectores como los descritos anteriormente; Boulton y Jackson, 1996a; Boulton y Jackson, 1996b). La capacidad de los derivados de Yku70p y Yku80p mutados para complementar la reparación del DNA, la radiosensibilidad y los fenotipos de pérdida telomérica de las levaduras Ku-deficientes pueden también analizarse utilizando procedimientos estándares (Boulton y Jackson, 1996a; Boulton y Jackson, 1996b; Porter y col., 1996). Aproximaciones similares también se pueden utilizar para definir las regiones funcionales importantes de Kut0 y Ku80 de mamíferos y para definir las regiones funcionales de otros componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku (ver más adelante).

La identificación de las regiones que afectan la retrotransposición selectivamente, puede dirigirse al desarrollo de fármacos que interfieren con la retrotransposición, pero que no afectan otros procesos dependientes de Ku.

Efectos de otros componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku en la retrotransposición

Los resultados obtenidos con Ku, conducen a esperar que otras proteínas que funcionan en los procesos asociados a Ku desempeñarán un papel en la integración de retrotransposones y retrovirus. Resultados no publicados del laboratorio de los inventores indican que los productos de los genes de levaduras RAD50, XRS2 y MRE11 funcionan con Yku70p e Yku80p en la unión de DNA DSB. En consecuencia, la interrupción de los genes MRE11, XRS2, O RAD50 produce defectos en la unión de extremos ilegítima, tal como se demostró por los ensayos de reparación plasmídica y en experimentos de radiosensibilidad como los descritos anteriormente (Boulton y Jackson, 1996a, 1996b). Estos defectos son los mismos que los observados en las cepas interrumpidas por YKU70 o YKU80 (Boulton y Jackson, 1996a y 1996b). Además, no se observó ningún defecto adicional en la reparación del DNA en las cepas doble-mutantes deficientes en Ku y en cualquiera de uno de estos otros genes: MRE11, XRS2, RAD50. Estos resultados indican que MRE11, XRS2 y RAD50 funcionan en la misma vía de reparación de DNA DSB que Ku. Resultados adicionales demuestran que el gen de levadura que se denominó LIG4 (Teo y col., 1997) es también parte del aparato de reparación de DNA asociado a Ku. Esto corresponde con el marco abierto de lectura YOR005c en el brazo derecho del cromosoma de S. cerevisiae XV, número de acceso Z74913 de la base de datos del genoma de levadura y codifica para una proteína con una similitud de secuencia con la ligasa IV de mamífero (Wei y col., 1995). La interrupción de los resultados LIG4 en los defectos en la unión de extremos ilegítima, tal como se demuestra en los ensayos de reparación de plásmidos y en los experimentos de radiosensibilidad, siendo estos defectos los mismos que los observados en las cepas interrumpidas por YKU80 (Boulton y Jackson, 1996a, 1996b). Además, no se observó ningún otro defecto adicional en la reparación del DNA en las cepas doble-mutantes deficientes en Ku más LIg4, lo que indicaba que estos genes funcionan en la misma vía. El efecto de mutar estos genes sobre las frecuencias de retrotransposición de Ty se puede analizar utilizando ensayos similares a los descritos para ku.

Por ejemplo, la Figura 2D muestra cierta disminución en las tasas de retrotransposición en las cepas interrumpidas en sus genes RAD50 o LIG4. Estos demostraron que trabajaban en la misma vía que Ku en la reparación de roturas ds en levaduras (Milne y col., 1996; Tsukamoto y col., 1996; Teo y col., 1997; Shar y col., 1997; Wilson y col., 1997). Las disminuciones no fueron tan importantes como se esperaba, lo que sugiere que Ku podría facilitar la retrotransposición de una forma distinta de su papel en la reparación de las roturas ds del DNA. En otros estudios, la interrupción de SRI2, SIR3 O SIR4, que también funciona en la vía asociada a Ku de la reparación de DNA DSB (Tsukamoto y col., 1997; Jackson, 1997) conduce a tasas de retrotransposición disminuidas. Así, la inhibición de homólogos de mamífero como dichos factores (Baker y col., 1995) proporciona una alternativa para el desarrollo de agentes retrovirales.

Debería identificarse un homólogo de levadura de la proteína XRCC4 de mamífero (Li y col., 1995), que también se esperaría que estuviera implicado en la transposición de Ty, ya que el factor de mamíferos funciona como parte del aparato de reparación del DNA asociada a Ku (ver más adelante) y los defectos en XRCC4 afectan negativamente la integración del retrovirus (ver más adelante). Si se definiera cualquier otro de los componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku de levadura, también se analizarán para conocer su papel en la retrotransposición. La mutación de cualquiera de estos genes debería conducir a una reducción de la retrotransposición, por lo que estos factores, y sus homólogos en otros organismos, son dianas atractivas para el desarrollo de nuevos agentes anti-retrovirales.

Las etapas para determinar el sitio(s) de implicación de los factores adicionales en la retrotransposición y el desarrollo de las estrategias para el cribaje del fármaco, etc., serán análogas a las descritas anteriormente y más adelante para las subunidades de Ku.

Ku protege el DNA del retroelemento de las nucleasas celulares

A la luz del efecto de Ku sobre la retrotransposición y ya que Ku se une a los extremos del DNA, una posibilidad es que Ku incremente la retrotransposición uniéndose al cDNA del retrotransposón y protegiéndolo del ataque de las nucleasas. También, mientras la transcripción inversa del RNA del elemento retroviral y de Ty tiene lugar dentro de las partículas virales o VLPs (Garfinkel y col., 1985; Zang, 1995; Mellor 1985), es evidente que el DNA contenido dentro de estas partículas es susceptible a las nucleasas (Boweman, 1989). Para establecer si la falta de Ku conduce a la degradación del cDNA del retrotransposón, se aisló el DNA de preparaciones de Ty1 VLP, se digirió con SpeI y las moléculas resultantes se incubaron con Klenow y dNTPs radioactivos. Los productos SpeI incluyen un fragmento de 287 pb correspondientes con el extremo 3' del elemento Ty1. Si los extremos se degradan de forma significativa en las VLPs derivadas de las células yku70, se esperaría que esta banda migre más deprisa o aparezca con cierta borrosidad en relación con el fragmento correspondiente a las VLPs de tipo salvaje. Sin embargo, no se detectaron diferencias entre los productos de cDNAs derivados de células yku70 de tipo salvaje.

Para análisis de Southern del cDNA de Ty1, se normalizaron las VLPs de cepas de tipo salvaje o de yku70 por su actividad RT y se incubaron a temperatura ambiente en tampón B/Mag2+ (HEPES 10 mM, pH 7,6, KCl 15 mM, DTT 3 mM, aprotinina 10 mg/ml, Cl_{2}Mg 5 mM). Se aisló el DNA mediante extracción fenol/cloroformo a diferentes tiempos y se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%. El gel se transfirió mediante transferencia de Southern, se hibridó y se autorradiografió posteriormente.

Para los análisis del DNA de Ty1, se utilizaron cantidades equivalentes de las preparaciones de VLPs determinadas por su actividad RT. El DNA se aisló mediante incubación con 50 ng/ml de proteinasa K, EDTA 12,5 mM y SDS al 0,5% a 25ºC durante 2 horas seguido por dos extracciones con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Para el análisis de Southern, se analizó el DNA de Ty1 mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana GeneScreen Plus (DuPont/NEN). La membrana se hibridó con un fragmento BamHI/HindIII de pGTyH3mHIS3AI marcada mediante ``nick translation'' (Promega).

Aunque los resultados anteriores demostraron que no sucedía una degradación a gran escala del DNA de VLP en ausencia de Ku, pequeñas cantidades de productos de degradación podían haber pasado desapercibidas. Para detectar niveles bajos de degradación, el DNA de VLP se incubó con dNTPs radioactivos y con la fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli, luego se analizó mediante contaje por centelleo. Mientras que Klenow polimeriza en dirección 5' a 3', la cantidad de incorporación es una relación de las roturas del DNA o del acortamiento de los extremos en 3'. En particular, el cDNA aislado de VLPs yku70 incorporó ^{E}x2 veces más marcaje radioactivo que el cDNA de las VLPs de tipo salvaje (Figura 5). Estos resultados sugieren que el cDNA de Ty1 acumula niveles aumentados de roturas de DNA en ausencia de Ku y/o expresa degradación 3' a 5' de los extremos del cDNA. Ya que la integrasa de Ty1 requiere extremos romos o un extremo cohesivo 3'-OH para catalizar en intercambio de cadenas (Eichinger y Boeke, 1990), dicha degradación 3' a 5' podría afectar de forma negativa a la eficiencia de retrotransposición.

Existe una actividad nucleasa que se co-purifica con las VLPs en los gradientes de sacarosa (Braiteman y Boeke, 1994). Las preparaciones de VLP derivadas de células de levadura Ku positivas y Ku negativas se incubaron a temperatura ambiente durante diversos periodos de tiempo, luego se analizó el DNA de Ty1 para conocer su degradación mediante análisis de hibridación de Southern. En particular, estos resultados demostraron que el DNA de Ty1 asociado a VLP derivado de las células yku70 se degrada mucho más rápidamente que el obtenido a partir de las células de tipo salvaje (Figura 6a). En cambio, el DNA del plásmido se degradó con la misma rapidez cuando se añadió a las dos preparaciones de VLPs (Figura 6b). La baja tasa de degradación en las células de tipo salvaje, no parece en consecuencia ser debida a la ausencia de nucleasa activa en las preparaciones de VLP derivadas de las células mutantes yku70. En su lugar, estos resultados sugieren fuertemente que la asociación de Ku con y1 VLPs protege al cDNA de Ty1 del ataque de nucleasas. El DNA plasmídico con extremos romos (pRS416; 2 \mug) se incubó solamente con tampón o con VLPs de tipo salvaje o de yku70 (la cantidad de VLPs utilizada en las reacciones se normalizó por su actividad RT). El DNA se incubó durante el tiempo indicado, se migró en una electroforesis en gel de agarosa al 1%, se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio y se cuantificó.

Los resultados anteriores indican una función para Ku en la retrotransposición y sugieren que funciona, por lo menos en parte, uniéndose a y protegiendo el DNA del retroelemento de las nucleasas celulares. De acuerdo con este modelo, Ku ha demostrado que funciona en la reparación exacta de roturas de cadena doble del DNA (DSBS) en levaduras, y el DNA lineal reparado en ausencia de ku contiene deleciones (Mages y col., 1996; Boulton y Jackson, 1996a; Boulton y Jackson, 1996b; Milne y col., 1996; Siede y col., 1996; Tsukamoto y col., 1996). Ya que la asociación de Ku con los extremos del DNA es altamente estable, es posible que Ku permanezca asociado con el cDNA de Ty1 durante el transporte al núcleo y funcione en las etapas siguientes en el proceso de retrotranscripción. Por ejemplo, como Ku se une a las brechas ss del DNA con afinidad comparable a la de los extremos ds del DNA (Paillard y Strauss, 1991; Falson y col., 1993), puede facilitar la reparación de las brechas del DNA de cadena sencilla que se producen como intermediarias de la retrotransposición. Gracias a la unión con dichas estructuras y la expresión de la integrasa, Ku podría también evitar la inversión de la reacción de transposición, un proceso denominado desintegración (Moores y col., 1995; Dotan y col., 1995).

Células de mamífero Defectos en el sistema de reparación del DNA asociado a Ku condujeron a una infectividad reducida de los retrovirus en células de mamífero

Para ver si Ku afecta la propagación de retrotransposones y de retrovirus en sistemas animales, se analizó la capacidad de un retrovirus de mamífero para integrarse en el genoma de células de mamífero que son competentes o deficientes en el aparato de reparación del DNA asociado a Ku. Para estos estudios, se utilizó un derivado del virus de la leucemia murina Moloney (Mo-MLV) para infectar las líneas celulares de diversos roedores (para permitir la infección, el virus se ``pseudotipó'' con la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, produciendo sobrenadantes de un título aproximado de 1x107; Burns y col., 1993; Hopkins, 1993; Yee y col., 1994; y las referencias allí incluidas).

Se utilizaron diversas diluciones para infectar monocapas de líneas celulares y, 48 horas después de la infección, se fijaron las células, se tiñeron para conocer su actividad \beta-galactosidasa y se contaron las colonias resultantes LacZ positivas coloreadas de azul. Las células que se utilizaron en estos estudios fueron de la línea celular K1 de ovario de hámster chino (CHO) de tipo salvaje, su derivada xrs-6 ku80-deficiente (por ejemplo, Taccioli y col., 1994), las células XR-1 deficientes en XRCC4 (XRCC4 funciona junto con Ku en la vía de reparación de DSB del DNA; Li y col., 1995; Critchlow y col., 1997; Grawunder y col., 1997), y la línea 3T3 de células murinas de tipo salvaje.

Como se muestra en la Figura 7, las células deficientes en Ku o XRCC4 generaron menos colonias azules significativamente que las células de tipo salvaje, lo que indicaba que Ku e XRCC4 afectan la infección retroviral. Además, De las colonias que se colorearon de azul, las que se procedían de células Ku-deficientes o XRCC4-deficientes contenían significativamente menos células coloreadas de azul que las colonias producidas a partir de células de tipo salvaje. En consecuencia, además de disminuir el número global de los clones de células infectadas, la falta de Ku o XRCC4 también parece causar un retraso en la división de las células infectadas, o un retraso en el propio proceso de integración retroviral. Estos resultados en conjunto indican que la inhibición de Ku y sus componentes de reparación del DNA servirán para inhibir la infección retroviral en sistemas de mamífero.

Dado que sucede lo mismo en las levaduras, puede ser razonable concluir que el requisito para el aparato de reparación del DNA asociado a Ku en la integración eficaz de retrovirus y retrotransposones está omnipresente en el reino eucariótico.

De acuerdo con los resultados anteriores, la implicación de otros componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku en la integración eficaz de retrovirus y retrotransposones puede establecerse valorando la eficiencia de la integración retroviral en las líneas celulares deficientes en otros componentes de este sistema. Por ejemplo, existen líneas celulares de hámster y humanas que son deficientes en la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de DNA (DNA-PKcs), que es parte de la maquinaria de reparación del DNA asociada a Ku en las células de mamífero (ver, por ejemplo, Blunt y col., 1995; Lees-Miller y col., 1995; para revisiones, ver Jackson y Jeggo, 1995; Jackson, 1996).

Si todavía no se conocieran los mutantes de mamífero naturales, se podrían utilizar aproximaciones estándares de interrupción dirigida de los loci mediante ``knock-outs génicos'' para obtener el tipo celular deseado (por ejemplo, defectuoso en ligasa IV de mamíferos, o defectuoso en los genes homólogo de levaduras: Rad50p, Mre11p, Xrs2p, Sir2p, Sir3p y Sir4p). Alternativamente, se realizaron estudios en células convertidas en deficientes en la reparación debido a la expresión de mutantes dominantes negativos de factores como la ligasa IV, Rad50p, Mre11p y Xrs2p. Ya que la ligasa III de mamíferos tiene una secuencia probablemente muy parecida con la de la ligasa IV, las células deficientes en ligasa III o en la proteína XRCC1 asociada se pueden analizar para conocer su capacidad para mediar la integración de retrovirus o retrotransposones (las líneas derivadas del ovario de hámster chino EM-9 y EM-C11 carecen de XRCC1 funcional; Thompson y col., 1990; Caldecott y col., 1996; y las referencias que allí se incluyen).

Utilizando diversos tipos de retrovirus de mamíferos, será sencillo demostrar que, al igual que en la levadura, el aparato de reparación del DNA asociado a Ku de mamíferos desempeña un papel importante en la integración de una gran variedad de retrovirus en las células de mamífero. Los virus a analizar incluyen otros retrovirus de tumores animales, los virus de la leucemia de células T en humanos y el VIH, que causa el SIDA (VIH puede utilizarse para infectar células humanas o puede derivatizarse para infectar células de roedor; p.ej., Naldini y col., 1996).

Tal como se describió anteriormente para el sistema de levaduras, los estudios in vivo e in vitro pueden utilizarse para asegurar de forma precisa en qué etapa(s) funciona la maquinaria de reparación del DNA asociada a Ku en la integración de retrovirus y retrotransposones en de mamíferos. Además, se pueden utilizar ensayos ya disponibles para definir las funciones realizadas por los componentes individuales de la maquinaria y definir las regiones precisas de los diversos polipéptidos que son críticos para la función. Ello facilitaría el diseño de los ensayos para las sustancias que interrumpen esta función y por lo tanto están indicadas para utilizar como agentes anti-retrovirales.

Los inhibidores del aparato de reparación del DNA asociadoa Ku protegen contra la infección retroviral

Tal como se describió anteriormente para el sistema de levaduras, los derivados dominantes negativos de las subunidades de Ku y de otros componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku puede utilizarse para mostrar que la inhibición de este aparato de reparación en las células normales resulta en una capacidad disminuida para integrar establemente el retrovirus en el genoma de la célula huésped. Para estos estudios, se generaron líneas celulares estables de mamíferos que expresan las proteínas mutantes dominantes negativas. Las líneas celulares de mamífero de tipo salvaje también se trataron con diversos fármacos para mostrar que ello da como resultado la inhibición de la integración retroviral.

De acuerdo con ello, los componentes wortmannin y el LY294002 mostraron que inhibían la actividad de proteína quinasa dependiente de DNA asociada a Ku (DNA-PK)(Hartley y col., 1995; Vlahos y col., 1994; también resultados no publicados del laboratorio de los inventores). Otros inhibidores de DNA-PK que se identifiquen, deben analizarse para conocer sus efectos. Aunque, es más sencillo analizar los agentes inicialmente en las células del cultivo de tejidos, los estudios preliminares se pueden extender a animales como los ratones (se utilizarán ratones deficientes o competentes para los componentes del aparato de reparación del DNA asociado a Ku) y, por último, a individuos humanos.

Desarrollo de procedimientos de ensayo por agentes que reducen la infectividad retroviral interrumpiendo el aparato de reparación del DNA asociado a Ku

La determinación del mecanismo mediante el cual funciona la maquinaria de reparación del DNA asociada a Ku en la integración de retrovirus y retrotransposones facilita el diseño de ensayos que resumen estas funciones en los ensayos definidos in vivo o in vitro. Dichos ensayos se hallan dentro de los que pueden utilizarse para el cribaje de inhibidores e identificación de sustancias como agentes anti-retrovirales potenciales.

Los ensayos incluyen aquellos que cuantifican la integración retroviral completa o solamente cuantifican la etapa(s) del procedimiento afectada por la maquinaria asociada a Ku. Aunque, los ensayos in vitro pueden ser los más sencillos de utilizar en los cribajes, las líneas celulares de levaduras o mamíferos pueden proporcionar sistemas in vivo de utilidad para analizar los efectos. En este aspecto, se pueden expresar el Ku70 y Ku80 humanos en células de levadura para valorar la transposición de Ty1 u otros aspectos de los eventos dependientes de Ku. Se puede utilizar un sistema de levaduras ``humanizado'' para cribar las moléculas que interfieren con la función de Ku humana.

Otro cribaje que puede utilizarse para identificar los agentes nuevos anti-retrovirales es uno que identifique los inhibidores de la actividad DNA-PK asociada a Ku (por ejemplo, Divr y col., 1992; Gottlieb y Jackson, 1993; Finnie y col., 1995; y las referencias allí citadas).

Otros cribajes pueden utilizarse para los compuestos que inhiben las actividades enzimáticas asociadas con las ligasas III o IV, Rad50p y Mre11p (ambas nucleasas putativas), interfieren con las interacciones proteína-proteína dentro del aparato de reparación asociado a Ku (por ejemplo, entre Ku y otros componentes del aparato, entre Rad50p, Mre11p y Xrs2p, entre XRCC1 y la ligasa III, o entre XRCC4 y la ligasa IV),j o interfieren con las asociaciones entre la maquinaria de reparación y el sustrato de DNA. Además de los fármacos de moléculas pequeñas, se pueden analizar los péptidos o miméticos peptídicos que parecen importantes para las regiones de los componentes del sistema de reparación asociado a Ku.

Una vez identificadas las vías, se pueden analizar los fármacos (y sus derivados) en sistemas celulares, animales y por último en humanos para ver los efectos sobre la integración de retrovirus y retrotransposones y sobre la infección retroviral.

Otras aplicaciones para los activadores o inhibidores del aparato de reparación del DNA asociado a Ku.

Además de ser de utilidad en la identificación y diseño de los fármacos anti-retrovirales a utilizar en sistemas de vertebrados, los activadores o inhibidores de los procesos asociados a Ku también serán de utilidad en otros sistemas.

Por ejemplo, los retrotransposones son muy abundantes en los genomas de muchas plantas superiores y muchos se transponen con relativa frecuencia (Wessler, 1996). En efecto, una gran parte de la variación somaclonal problemática que sucede después de regenerar las plantas a partir de cultivos de tejido protoplástico parece proceder de sucesos de retrotransposición (Wessler, 1996). Los aspectos de la presente invención se pueden utilizar para suprimir la generación de la variación somaclonal en las plantas inhibiendo el aparato de reparación del DNA asociado a Ku.

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Claims (9)

1. Procedimiento de cribaje para un agente que es un inhibidor de la actividad de retrovirus o retrotransposón, que incluye:

proporcionar una sustancia que incluya un componente de una vía de reparación del DNA dependiente de Ku, o un fragmento de dicho componente;

exponer la sustancia a un compuesto objeto de análisis; y

determinar la interacción entre la sustancia y el compuesto objeto de análisis.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye la determinación de la capacidad de un compuesto objeto de análisis que interactúa con dicho componente o fragmento del mismo, para inhibir la vía de reparación del DNA dependiente de Ku y/o para inhibir la actividad del retrovirus y/o el retrotransposón.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en donde dicho componente es Ku, o la subunidad Ku70 o la Ku80 de dicho componente.

4. Procedimiento de cribaje para un agente que es un inhibidor de la actividad del retrovirus y/o retrotransposón, que incluye:

proporcionar las sustancias primera y segunda, incluyendo la sustancia primera un primer componente de una vía de reparación del DNA dependiente a Ku o un fragmento peptídico, derivado, variante, o análogo del mismo capaz de unir un segundo componente de la vía de reparación del DNA dependiente de Ku, incluyendo la segunda sustancia el segundo componente de la vía de reparación del DNA dependiente de Ku o un fragmento peptídico, derivado, variante, o análogo del mismo capaz de unirse a dicho primer componente, en las condiciones en las que normalmente interactúa el componente;

exponer las sustancias a un compuesto objeto de análisis; y,

determinar la interacción entre las dos sustancias en presencia del compuesto objeto de análisis.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, que incluye la determinación de la capacidad de un compuesto objeto de análisis que interrumpe la interacción entre los dos componentes, para inhibir la vía de reparación del DNA dependiente de Ku y/o para inhibir la actividad del retrovirus y/o retrotransposón.

6. Procedimiento de cribaje para un agente, que es un inhibidor de la actividad de retrovirus y/o retrotransposones, que incluye:

proporcionar una vía de reparación del DNA dependiente de Ku;

exponer la vía a un compuesto objeto de análisis en las condiciones que normalmente conducen a la activación de la vía de reparación del DNA dependiente de Ku; y

buscar un indicativo del punto terminal de la activación de la vía de reparación del DNA dependiente de Ku;

por lo que la inhibición de dicho punto terminal indique la inhibición de la vía de reparación del DNA dependiente de Ku por el compuesto objeto de análisis.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que incluye la determinación de la capacidad de un compuesto objeto de análisis para inhibir la actividad de retrovirus y/o del retrotranspón.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende la realización de las etapas citadas en la mencionada reivindicación para obtener un agente que es un inhibidor de la actividad de retrovirus y/o retrotransposón y que comprende además en la formulación del inhibidor en una composición que comprende un excipiente aceptable farmacéuticamente.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende la realización de las etapas citadas en dicha reivindicación para obtener un agente que es un inhibidor de la actividad de retrovirus y/o retrotransposón y que comprende además proporcionar el inhibidor a una célula que no forma parte de un cuerpo humano o animal, para inhibir la actividad de retrovirus y/o retrotransposón en la célula.